CN102858974A

CN102858974A - 抗铜绿假单胞菌e血清型脂多糖的抗体

Info

Publication number: CN102858974A
Application number: CN2011800102442A
Authority: CN
Inventors: 田中二朗; P·S·安德森; 奥富隆文; 稻叶常良; 大冢圭子; 赤羽宏友; 星名由佳利; 斋藤淳; 长曽宏; 熊谷正志; 荻原康世
Original assignee: Symphogen AS; Meiji Seika Pharma Co Ltd
Current assignee: Symphogen AS; Meiji Seika Kaisha Ltd; Meiji Seika Pharma Co Ltd
Priority date: 2010-02-18
Filing date: 2011-02-18
Publication date: 2013-01-02
Also published as: EP2536759A1; JP2013521758A; EP2536835A4; WO2011102552A1; KR20120128687A; JP2013520161A; US20130004500A1; CA2790290A1; US20130004499A1; EP2536833A1; JP2013520159A; US20130045207A1; US20130022604A1; EP2536835A1; KR20120128688A; CA2790232A1; EP2536759A4; EP2536834A4; WO2011102553A1; KR20130048199A

Abstract

本发明提供了一种新的抗体，其具有优良的抗铜绿假单胞菌的抗菌活性。通过用获自患有慢性铜绿假单胞菌肺部感染的囊性纤维化病患者的成浆细胞作为起始材料，成功获得结合于E血清型铜绿假单胞菌菌株的LPS且具有优良的体外和体内抗菌活性的抗体。

Description

抗铜绿假单胞菌E血清型脂多糖的抗体

技术领域

本发明涉及一种抗铜绿假单胞菌E血清型脂多糖的抗体及其应用。更具体地，本发明涉及一种特异性地结合于铜绿假单胞菌菌株E血清型脂多糖的抗体，以及各自均包括任意所述抗体的一种药物组合物、一种用于铜绿假单胞菌感染的诊断剂和一种铜绿假单胞菌检测试剂盒。

背景技术

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aerugiNOsa）是一种革兰氏阴性需氧杆菌，其广泛而普遍地分布于自然环境中，例如土壤和水中。铜绿假单胞菌是一种通常对健康受试者来说是非致病性的无致病力细菌（avirulentbacterium），所述健康受试者对铜绿假单胞菌具有适度的抗体效价以及足够的免疫功能。然而，一旦体弱患者感染了铜绿假单胞菌，铜绿假单胞菌可引起严重的症状，这可导致所述患者死亡。为此，铜绿假单胞菌作为医院感染和机会感染的一种主要致病细菌已引起关注，并因此对铜绿假单胞菌感染的预防和治疗已经是医疗领域的重要问题。

为了预防或治疗铜绿假单胞菌感染，已主要使用了抗生素或合成抗菌剂。但是，铜绿假单胞菌对此类药物产生了抗药性，因此此类药物在许多情况下不能提供足够的治疗作用。具体而言，用抗生素等治疗耐多药铜绿假单胞菌（MDRP）的感染很难，且具有局限性。为此，作为其替代方法，已实施使用免疫球蛋白制剂的治疗。

同时，已检验了使用抗铜绿假单胞菌的抗体预防或治疗铜绿假单胞菌感染。例如，已开发了每种均特异性地结合特定血清型的铜绿假单胞菌菌株的抗体（专利文献1-5，以及非专利文献1和2）。然而，迄今为止所开发的铜绿假单胞菌抗体在预防或治疗铜绿假单胞菌感染中尚不能提供足够的作用。

[引用列表]

[专利文献]

[专利文献1]日本未审查专利申请公开号平成6-178688

[专利文献2]日本未审查专利申请公开号平成6-178689

[专利文献3]日本未审查专利申请公开号平成7-327677

[专利文献4]国际公开号WO2004/101622

[专利文献5]国际公开号WO2006/084758

[非专利文献]

[非专利文献1]The Journal of Infectious Diseases,152,6,1985,1290-1299.

[非专利文献2]Journal of General Microbiology,133,1987,3581-3590.

发明内容

[技术问题]

鉴于上述情况而做出本发明，并且本发明的一个目标是提供一种对铜绿假单胞菌具有优良抗菌活性的新型抗体。本发明的一个主要目标是提供一种特异性地结合铜绿假单胞菌菌株E血清型脂多糖的抗体。

[技术方案]

为实现上述目标，本发明采用了以下方法。首先，自患有慢性铜绿假单胞菌肺部感染的囊性纤维化病患者和健康志愿者中收集血液样本。具有高比例的特异性针对脂多糖（下文有时简称为“LPS”）的成浆细胞的供体样本用以下方式鉴定：(1)FACS分析，其测定循环血液中成浆细胞和浆细胞的量；(2)ELISPOT分析，其测定循环血液中产生特异性针对特定LPS抗原的抗体的细胞的量；(3)ELISA分析，其测定存在或不存在特异性针对特定LPS抗原的免疫球蛋白。之后，从由此鉴定的供体样本制备识别LPS的抗体。

具体而言，存活的成浆细胞是通过使CD19、CD38、λ轻链和死细胞染色而选择。在选出的成浆细胞上，通过包括多重重叠延伸RT-PCR和后续巢式PCR的两步PCR将来源自相同B细胞的编码重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）的DNA序列（图1）结合起来。之后，将扩增的DNA插入筛选载体，然后转化到大肠杆菌（Escherichia coli）中。从大肠杆菌中纯化全部扩增载体。所得抗体库在动物培养细胞中表达。编码结合于纯化LPS分子的抗体的克隆是通过ELISA来筛选，并选出LPS-特异性的克隆。然后，测定所选出克隆的碱基序列。之后，检验由此获得的克隆所编码的抗体的各种活性、其血清型特异性和抗原表位。

结果，发现所鉴定的抗体结合铜绿假单胞菌E血清型LPS，并具有优良的体外和体内抗菌活性。

具体而言，本发明涉及结合于铜绿假单胞菌E血清型LPS的抗体，其显示出优良的抗菌活性。本发明还涉及所述抗体的应用。更具体地，本发明提供了：

[1]一种抗体，其识别铜绿假单胞菌脂多糖的B-带LPS，并牢固地（substantially）结合于E血清型铜绿假单胞菌菌株的表面，但不与A、B、C、D、F、G、H、I和M血清型铜绿假单胞菌菌株的表面中的任一种牢固地结合。

[2]条款1所述的抗体，其对E血清型铜绿假单胞菌菌株具有调理素活性。

[3]条款2所述的抗体，其中对标识为ATCC29260的铜绿假单胞菌菌株的调理素活性的EC50为1μg/ml或以下。

[4]条款1至3中任一项所述的抗体，其对E血清型铜绿假单胞菌菌株具有凝集活性。

[5]条款4所述的抗体，其中单位量（μg）IgG对标识为ATCC29260的铜绿假单胞菌菌株的凝集效价为100或以上。

[6]条款1至5中任一项所述的抗体，其对E血清型铜绿假单胞菌菌株的全身性感染具有抗菌作用。

[7]条款6所述的抗体，其中对全身感染的中性白细胞减少症小鼠模型的抗菌作用的ED50不大于Venilon的1/30，所述全身感染是标识为ATCC29260的铜绿假单胞菌菌株的全身感染。

[8]条款1至7中任一项所述的抗体，其对E血清型铜绿假单胞菌菌株的肺部感染具有抗菌作用。

[9]条款8的抗体，其中对肺部感染的小鼠模型的抗菌作用具有至少一种选自以下的性质，所述肺部感染是标识为ATCC29260的铜绿假单胞菌菌株的肺部感染：

(a)当给小鼠接种标识为ATCC29260的铜绿假单胞菌菌株后立即给予小鼠所述抗体时，对所述小鼠的抗菌作用的ED50不大于Venilon的1/500；和

(b)当给小鼠接种标识为ATCC29260的铜绿假单胞菌菌株8小时后给予小鼠所述抗体时，对所述小鼠的抗菌作用的ED50不大于Venilon的1/3000。

[10]条款1至9中任一项所述的抗体，其对E血清型铜绿假单胞菌菌株引起的烧伤创面感染（burn wound infection）具有抗菌作用。

[11]条款10所述的抗体，其中对创面感染的小鼠模型的抗菌作用具有至少一种选自以下的性质，所述烧伤创面感染为标识为ATCC29260的铜绿假单胞菌菌株的烧伤创面感染：

(a)当给小鼠接种标识为ATCC29260的铜绿假单胞菌菌株后立即给予小鼠所述抗体时，对所述小鼠的抗菌作用的ED50不大于Venilon的1/1500；和

(b)当给小鼠接种标识为ATCC29260的铜绿假单胞菌菌株后25小时给予小鼠所述抗体时，对所述小鼠的抗菌作用的ED50不大于Venilon的1/2000。

[12]具有以下(a)和(b)特征中任一项的抗体：

(a)包含

一个轻链可变区，其包括SEQ ID NO:1-3中所述的氨基酸序列，或其中在至少一个序列中置换、缺失、增加和/或插入一个或多个氨基酸的SEQ ID NO:1-3中所述的氨基酸序列，和

一个重链可变区，其包括SEQ ID NO:4-6中所述的氨基酸序列，或其中在至少一个序列中置换、缺失、增加和/或插入一个或多个氨基酸的SEQ ID NO:4-6中所述的氨基酸序列，和

(b)包含

一个轻链可变区，其包括SEQ ID NO:9-11中所述的氨基酸序列，或其中在至少一个序列中置换、缺失、增加和/或插入一个或多个氨基酸的SEQ ID NO:9-11中所述的氨基酸序列，和

一个重链可变区，其包括SEQ ID NO:12-14中所述的氨基酸序列，或其中在至少一个序列中置换、缺失、增加和/或插入一个或多个氨基酸的SEQ ID NO:12-14中所述的氨基酸序列。

[13]具有以下(a)和(b)特征中任一项的抗体：

(a)包含

一个轻链可变区，其包括SEQ ID NO:7中所述的氨基酸序列，或其中置换、缺失、增加和/或插入一个或多个氨基酸的SEQ ID NO:7中所述的氨基酸序列，和

一个重链可变区，其包括SEQ ID NO:8中所述的氨基酸序列，或其中置换、缺失、增加和/或插入一个或多个氨基酸的SEQ ID NO:8中所述的氨基酸序列，和

(b)包含

一个轻链可变区，其包括SEQ ID NO:15中所述的氨基酸序列，或其中置换、缺失、增加和/或插入一个或多个氨基酸的SEQ ID NO:15中所述的氨基酸序列，和

一个重链可变区，其包括SEQ ID NO:16中所述的氨基酸序列，或其中置换、缺失、增加和/或插入一个或多个氨基酸的SEQ ID NO:16中所述的氨基酸序列。

[14]一种肽，包含所述抗体的轻链或轻链可变区，所述肽具有以下(a)和(b)特征中任一项：

(a)包含SEQ ID NO:1-3中所述的氨基酸序列或其中在至少一个序列中置换、缺失、增加和/或插入一个或多个氨基酸的SEQ ID NO:1-3中所述的氨基酸序列；和

(b)包含SEQ ID NO:9-11中所述的氨基酸序列或其中在至少一个序列中置换、缺失、增加和/或插入一个或多个氨基酸的SEQ ID NO:9-11中所述的氨基酸序列。

[15]一种肽，包含所述抗体的轻链或轻链可变区，所述肽具有以下(a)和(b)特征中任一项：

(a)包含SEQ ID NO:7中所述的氨基酸序列或其中置换、缺失、增加和/或插入一个或多个氨基酸的SEQ ID NO:7中所述的氨基酸序列；和

(b)包含SEQ ID NO:15中所述的氨基酸序列或其中置换、缺失、增加和/或插入一个或多个氨基酸的SEQ ID NO:15中所述的氨基酸序列。

[16]一种肽，包含所述抗体的重链或重链可变区，所述肽具有以下(a)和(b)特征中任一项：

(a)包含SEQ ID NO:4-6中所述的氨基酸序列或其中在至少一个序列中置换、缺失、增加和/或插入一个或多个氨基酸的SEQ ID NO:4-6中所述的氨基酸序列；和

(b)包含SEQ ID NO:12-14中所述的氨基酸序列或其中在至少一个序列中置换、缺失、增加和/或插入一个或多个氨基酸的SEQ ID NO:12-14中所述的氨基酸序列。

[17]一种肽，包含所述抗体的重链或重链可变区，所述肽具有以下(a)和(b)特征中任一项：

(a)包含SEQ ID NO:8中所述的氨基酸序列或其中置换、缺失、增加和/或插入一个或多个氨基酸的SEQ ID NO:8中所述的氨基酸序列；和

(b)包含SEQ ID NO:16中所述的氨基酸序列或其中置换、缺失、增加和/或插入一个或多个氨基酸的SEQ ID NO:16中所述的氨基酸序列。

[18]一种抗体，其与以下(a)和(b)中任一项所述的抗体的表位结合，所述表位是E血清型铜绿假单胞菌菌株的脂多糖的B-带LPS中的：

(a)一种包括轻链可变区和重链可变区的抗体，其中所述轻链可变区包括SEQ ID NO:7中所述的氨基酸序列，所述重链可变区包括SEQ IDNO:8中所述的氨基酸序列；和

(b)一种包括轻链可变区和重链可变区的抗体，其中所述轻链可变区包括SEQ ID NO:15中所述的氨基酸序列，所述重链可变区包括SEQ IDNO:16中所述的氨基酸序列。

[19]一种DNA，其编码条款1至18中任一项所述的抗体或肽。

[20]一种杂交瘤，其产生条款1-13和18中任一项所述的抗体。

[21]一种用于与铜绿假单胞菌有关的疾病的药用组合物，所述药用组合物包含：

条款1-13和18中任一项的抗体，和任选地

至少一种可药用载体和/或稀释剂。

[22]条款21所述的药用组合物，其中所述与铜绿假单胞菌有关的疾病是由铜绿假单胞菌感染引起的全身感染性疾病。

[23]条款21所述的药用组合物，其中所述与铜绿假单胞菌有关的疾病是由铜绿假单胞菌感染引起的肺部感染性疾病。

[24]条款21所述的药用组合物，其中所述与铜绿假单胞菌有关的疾病是由铜绿假单胞菌感染引起的烧伤创面感染性疾病。

[25]一种用于检测铜绿假单胞菌的诊断剂，所述诊断剂包含：条款1、12、13和18中任一项所述的抗体。

[26]一种用于检测铜绿假单胞菌的试剂盒，所述试剂盒包含：条款1、12、13和18中任一项所述的抗体。

[有益效果]

本发明涉及一种结合铜绿假单胞菌E血清型LPS并显示出优良的抗菌活性的抗体。本发明的抗体可对铜绿假单胞菌引起的全身感染、肺部感染或烧伤创面感染显示出优良的调理素作用和优良的抗菌作用。此外，由于本发明的抗体来源自患有慢性铜绿假单胞菌肺部感染的囊性纤维化病患者，可预期对临床铜绿假单胞菌菌株的优良作用。本发明的抗体可被制备为人类抗体的形式，因此是高度安全的。使用本发明的抗体使得可有效地治疗或预防由铜绿假单胞菌（包括耐多药铜绿假单胞菌）引起的感染，例如HAP/VAP、菌血症、败血症和烧伤创面感染。

附图说明

图1是显示为获得编码本发明抗体的DNA而实施的两步PCR的图。

图2是显示用于结合编码重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）的序列的OO-VP-002载体的图，所述重链可变区和轻链可变区源自相同的B细胞。

图3是显示通过SPR测量获得的对抗体“2459”与抗体“1656”的加合性效应的分析结果的曲线。

具体实施方式

本发明提供一种结合铜绿假单胞菌E血清型LPS的新型抗体。本发明中的“抗体”包括免疫球蛋白的所有类和所有子类。“抗体”包括多克隆抗体和单克隆抗体，还包括抗体的功能性片段形式。“多克隆抗体”指的是包含针对不同表位的不同种类抗体的抗体制剂。同时，“单克隆抗体”表示由基本上同质的抗体群获得的抗体（包括抗体片段）。与多克隆抗体相比，单克隆抗体识别抗原上的单一决定簇。本发明中的多克隆抗体还包括能够识别抗原上多种表位的多种单克隆抗体的结合物。本发明的抗体为分离的抗体，即，自自然环境中的组分中分离和/或回收的抗体。

本发明的抗体结合的“脂多糖（LPS）”是指革兰氏阴性菌细胞壁外膜的成分，是由脂质和多糖（糖脂）形成的物质。糖链由称为核心多糖（或核心寡糖）的部分，和称为O抗原（O侧链多糖）的部分形成。“A-带LPS”是其多糖形成的O抗原具有以下结构的LPS。具体而言，在所述结构中，重复每个均由“3)-α-D-Rha-(1→2)-α-D-Rha-(1→3)-α-D-Rha-(1”组成的单元。在这些单元中，D-鼠李糖由α-1,2键和α-1,3键连接。其结构式如下所示；然而，由α-1,2键连接的D-鼠李糖和α-1,3键连接的D-鼠李糖的支化模式不限于如下所示的模式。

同时，“B-带LPS”为一种具有以下结构的血清型特异性LPS，所述结构中重复每个均由形成O抗原的多糖中2-5个糖的键组成的单元。正如下文将要描述的，铜绿假单胞菌菌株的B-带LPS中重复单元的结构彼此不同，取决于其血清型（参考Microbiol.Mol.Biol.Rev.63 523-553(1999)）。

[化学式2]

本发明中的“血清型”表示铜绿假单胞菌的任何已知的血清型。表1显示了根据日本铜绿假单胞菌协会（Japan P.aerugiNOsa Society）发起的血清型委员会（serotyping committee）的类群与根据IATS（国际抗原分类系统，International Antigenic Typing System）的类型的对应关系，二者目前均用于不同血清型的铜绿假单胞菌菌株。铜绿假单胞菌菌株的血清型可通过使用市售可得的用于铜绿假单胞菌分类的免疫血清测定。

[表1]

JPAS：日本铜绿假单胞菌协会

IATS：国际抗原分类系统

参考文件：Microbiology 17 273-304(1990)

本发明中确定的抗体中，抗体“1656”和抗体“1640”显示出对E血清型铜绿假单胞菌菌株的优良特异性。因此，本发明抗体的另一个实施方案是特异性地结合E血清型铜绿假单胞菌菌株的脂多糖的抗体（下文称为“抗E血清型LPS的抗体”）。本发明的抗E血清型LPS的抗体优选地为一种这样的抗体，其识别铜绿假单胞菌的脂多糖，并牢固地结合于E血清型铜绿假单胞菌菌株表面，但不与A、C、D、F、G、H、I和M血清型铜绿假单胞菌菌株表面中的任何一个牢固地结合。对于本发明的抗E血清型LPS的抗体，短语“牢固地结合于”是指，例如，当用本申请的实施例中所述的全细胞ELISA法检测时，指示结合能力的吸光度为0.25或以上。与此同时，短语“不牢固地结合于”是指，例如，当用本申请的实施例中所述的全细胞ELISA法检测时,，指示结合能力的吸光度小于0.25。

A血清型铜绿假单胞菌菌株的实例包括具有ATCC登录号27577和33350的那些。B血清型铜绿假单胞菌菌株的实例包括具有登录号27578、33349、BAA-47、33352、33363和43732的那些。C血清型铜绿假单胞菌菌株的实例包括具有登录号33353、27317和33355的那些。D血清型铜绿假单胞菌菌株的实例包括具有登录号27580和33356的那些。E血清型铜绿假单胞菌菌株的实例包括具有登录号29260和33358的那些。F血清型铜绿假单胞菌菌株的实例包括具有登录号27582和33351的那些。G血清型铜绿假单胞菌菌株的实例包括具有登录号27584和33354的那些。H血清型铜绿假单胞菌菌株的实例包括具有登录号27316和33357的那些。I血清型铜绿假单胞菌菌株的实例包括具有登录号27586和33348的那些。J血清型铜绿假单胞菌菌株的实例包括具有登录号33362的那个。K血清型铜绿假单胞菌菌株的实例包括具有登录号33360和33361的那些。L血清型铜绿假单胞菌菌株的实例包括具有登录号33359的那个。M血清型铜绿假单胞菌菌株的实例包括具有登录号21636的那个。N血清型铜绿假单胞菌菌株的实例包括具有登录号33364的那个。

其它血清型（O18型和O19型）的铜绿假单胞菌菌株的实例包括登录号为43390和43731的那些。E血清型铜绿假单胞菌菌株的实例包括MEIJI SEIKA KAISHA,LTD.拥有的耐多药性E/O11血清型铜绿假单胞菌（MDRP）菌株（MSC 06120、MSC 17660、MSC 17661、MSC 17662、MSC 17667、MSC 17671、MSC 17693、MSC 17727、MSC 17728等）。要注意本发明中耐多药性定义为根据CLSI折点（CLSI breakpoint），对以下试剂中的至少三种的抗性：亚胺青霉烯（imipenem，≥16μg/ml）、头孢他啶（ceftazidime，≥32μg/ml）、妥布拉霉素（tobramycin，≥16μg/ml）、环丙沙星（ciprofloxacin，≥4μg/ml）（参考：National Surveillance ofAntimicrobial Resistance in Pseudomonas aerugiNOsa Isolates Obtainedfrom Intensive Care Unit Patients from 1993 to 2002,Marilee D.Obritsch,Douglas N.Fish,Robert MacLaren,and Rose Jung,ANTIMICROBIALAGENTS AND CHEMOTHERAPY,48.12.2004,4606-4610）。

本发明的抗E血清型LPS的抗体优选地为一种这样的抗体，其在由上文实例所示的ATCC登录号标识的铜绿假单胞菌菌株中，仅牢固地结合E血清型铜绿假单胞菌，但不与其它血清型的铜绿假单胞菌菌株中的任何一种牢固地结合。此外，本发明的抗E血清型LPS的抗体优选地为一种这样的抗体，其牢固地结合MEIJI SEIKA KAISHA,LTD.拥有的E/O11血清型MDRP。更优选地，本发明的抗E血清型LPS的抗体为一种这样的抗体，其在由上文实例所示ATCC登录号标识的铜绿假单胞菌菌株中，牢固地结合所有E血清型铜绿假单胞菌菌株，但不与任何其它血清型的铜绿假单胞菌菌株牢固地结合。

根据一个优选的实施方案，本发明的抗E血清型LPS的抗体对铜绿假单胞菌具有调理素活性。本发明的抗E血清型LPS的抗体可对E血清型铜绿假单胞菌菌株具有调理素活性，反映出对E血清型铜绿假单胞菌菌株的结合活性。特别是，本发明的抗体“1656”和抗体“1640”均对E血清型铜绿假单胞菌菌株显示出高的调理素活性。特别明显的是，当如本申请的实施例中所述，通过使用E血清型铜绿假单胞菌菌株（ATCC29260）并通过采用检测法（其使用纳入了FITC标记的铜绿假单胞菌的人多形核白细胞的荧光强度作为量度）来评价本发明的抗体“1656”和抗体“1640”的调理素活性时，抗体“1656”和抗体“1640”的EC50分别为0.11和0.64μg/ml。本发明的抗E血清型LPS的抗体优选地具有这种优良的调理素活性，并且例如，是对E血清型铜绿假单胞菌菌株（ATCC29260）的调理素活性的EC50为1μg/ml或以下（例如，0.8μg/ml或以下、0.6μg/ml或以下、0.4μg/ml或以下、或0.3μg/ml或以下、0.2μg/ml或以下）的抗体。

此外，当如本申请的实施例中所述，通过使用E血清型铜绿假单胞菌菌株（ATCC29260）并通过采用检测法（其使用纳入了FITC标记的铜绿假单胞菌的人多形核白细胞的荧光强度作为量度）来评价本发明的抗E血清型LPS的抗体的调理素活性时，所述抗E血清型LPS的抗体在30μg/ml下的平均荧光强度（MFI）值优选不小于Venilon的平均荧光强度（MFI）值——1000μg/ml——的0.5倍，例如，不小于0.8倍、不小于1倍或不小于1.2倍。

根据另一个优选实施方案，本发明的抗E血清型LPS的抗体对铜绿假单胞菌具有凝集活性。当使用E血清型铜绿假单胞菌菌株（ATCC29260）时，本发明的抗体“1656”显示出优良的单位量（μg）IgG的凝集效价——190。由于具有如此优良的凝集活性，作为药物使用的本发明的抗E血清型LPS的抗体甚至在低剂量下也可诱导有效的调理素活性，并因此可预期具有预防感染的作用。当使用E血清型铜绿假单胞菌菌株（ATCC29260）时，本发明抗E血清型LPS抗体所具有的单位量（μg）IgG的凝集效价优选地为100或以上（例如，150或以上、170或以上或190或以上）。

根据另一个优选实施方案，本发明的抗E血清型LPS的抗体对铜绿假单胞菌的全身感染、肺部感染和烧伤创面感染具有抗菌作用。本发明的抗体“1656”和抗体“1640”对E血清型铜绿假单胞菌菌株引起的肺部感染表现出抗菌活性。令人惊讶地，当使用E血清型铜绿假单胞菌菌株（ATCC29260）进行肺部感染后立即给予所述抗体的小鼠模型，并用Venilon作为对照进行比较时，抗体“1656”和抗体“1640”的抗菌作用的ED50值均为Venilon的ED50值的1/500或以下。特别是，抗体“1656”表现出如此优良的作用使得其ED50为Venilon的ED50的1/1000或以下。因此，当使用肺部感染的小鼠模型时，本发明的抗E血清型LPS的抗体的ED50值优选地为Venilon的ED50值的1/500或以下（例如，1/600或以下、1/800或以下或者1/1000或以下）。此外，当使用在以E血清型铜绿假单胞菌菌株（ATCC29260）进行肺部感染8小时后给予所述抗体的小鼠模型并用Venilon作为对照进行比较时，抗体“1656”的抗菌作用的ED50值为Venilon的ED50值的1/3000或以下。因此，当使用肺部感染的小鼠模型时，本发明的抗E血清型LPS的抗体的ED50值优选地为Venilon的ED50值的1/3000或以下（例如，1/4000或以下或者1/5000或以下）。

此外，当使用在以E血清型铜绿假单胞菌菌株（MSC 06120）进行肺部感染后立即给予所述抗体的小鼠模型并用Venilon作为对照进行比较时，抗体“1656”的抗菌作用的ED50值为Venilon的ED50值的1/500或以下。因此，当使用肺部感染的小鼠模型时，本发明的抗E血清型LPS的抗体的ED50值优选地为Venilon的ED50值的1/500或以下（例如1/600或以下或者1/700或以下）。此外，当使用在以E血清型铜绿假单胞菌菌株（MSC 06120）进行肺部感染8小时后给予所述抗体的小鼠模型并用Venilon作为对照进行比较时，抗体“1656”的抗菌作用的ED50值为Venilon的ED50值的1/50或以下。因此，当使用肺部感染的小鼠模型时，本发明的抗E血清型LPS的抗体的ED50值优选地为Venilon的ED50值的1/50或以下（例如，1/60或以下或者1/70或以下）。

本发明的抗体“1656”和抗体“1640”进一步表现出对E血清型铜绿假单胞菌菌株的全身感染的抗菌活性。令人惊奇的是，当使用全身感染（所述全身感染是标识为E血清型铜绿假单胞菌菌株（ATCC29260）的铜绿假单胞菌的全身感染）的中性白细胞减少症小鼠模型并用Venilon作为对照进行比较时，这些抗体中每一种的抗菌作用的ED50值均如此优良，使得所表现出的ED50值均为Venilon的ED50值的1/30或以下。具体而言，对于全身感染（所述全身感染是标识为ATCC29260的铜绿假单胞菌菌株的全身感染）的小鼠模型，抗体“1656”表现出如此优良的作用，使得抗体“1656”的ED50值为Venilon的ED50值的1/140或以下。因此，当使用全身感染的中性白细胞减少症小鼠模型时，本发明的抗E血清型LPS的抗体的ED50值优选地为Venilon的ED50值的1/30或以下（例如，1/40或以下、1/70或以下、1/100或以下、1/130或以下或者1/140或以下）。此外，当使用全身感染（所述全身感染是标识为E血清型铜绿假单胞菌菌株（MSC 06120）的铜绿假单胞菌的全身感染）的中性白细胞减少症小鼠模型并用Venilon作为对照进行比较时，抗体“1656”的抗菌作用的ED50值为Venilon的ED50值的1/120或以下。因此，当使用全身感染的中性白细胞减少症小鼠模型时，本发明的抗E血清型LPS的抗体的ED50值优选地为Venilon的ED50值的1/120或以下（例如，1/150或以下或者1/180或以下）。

本发明的抗体“1656”进一步表现出对E血清型铜绿假单胞菌菌株的烧伤创面感染的抗菌活性。令人惊奇的是，当使用在以E血清型铜绿假单胞菌菌株（ATCC29260）进行烧伤创面感染后立即给予所述抗体的小鼠模型并用Venilon作为对照进行比较时，抗体“1656”的抗菌作用的ED50值为Venilon的ED50值的1/1500或以下。因此，当使用烧伤创面感染的小鼠模型时，本发明的抗E血清型LPS的抗体的ED50值优选地为Venilon的ED50值的1/1500或以下（例如，1/2000或以下或者1/2500或以下）。此外，当使用在以E血清型铜绿假单胞菌菌株（ATCC29260）进行烧伤创面感染25小时后给予所述抗体的小鼠模型并用Venilon作为对照进行比较时，抗体“1656”的抗菌作用的ED50值为Venilon的ED50值的1/2000或以下。因此，当使用烧伤创面感染的小鼠模型时，本发明的抗E血清型LPS的抗体的ED50值优选地为Venilon的ED50值的1/2000或以下（例如，1/2500或以下或者1/3000或以下）。

本发明的抗E血清型LPS的抗体可以单独地具有上述活性中的任意一种，但优选同时具有多种活性。

本发明的抗E血清型LPS的抗体的另一个优选实施方案为一种这样的抗体，其含有本发明中鉴定的抗体（1656或1640）的轻链可变区（包括轻链CDR 1-3）和重链可变区（包括重链CDR 1-3）。其具体实例包括以下抗体(i)和(ii)：

(i)一种含有轻链可变区和重链可变区的抗体，其中所述轻链可变区包括轻链CDR 1-3（SEQ ID NO:1-3中所述的氨基酸序列），所述重链可变区包括重链CDR 1-3（SEQ ID NO:4-6中所述的氨基酸序列），例如，其中轻链可变区包括SEQ ID NO:7中所述的氨基酸序列且重链可变区包括SEQ ID NO:8中所述的氨基酸序列的抗体；并且

(ii)一种含有轻链可变区和重链可变区的抗体，其中所述轻链可变区包括轻链CDR 1-3（SEQ ID NO:9-11中所述的氨基酸序列），所述重链可变区包括重链CDR 1-3（SEQ ID NO:12-14中所述的氨基酸序列），例如，其中轻链可变区包括SEQ ID NO:15中所述的氨基酸序列且重链可变区包括SEQ ID NO:16中所述的氨基酸序列的抗体。

本发明还提供了包含抗体的轻链、重链及其可变区中任一项的肽，该肽包括本发明抗体（1656或1640）中鉴定的CDR。

包含抗体的轻链、重链及其可变区中任一项的肽——该肽包含抗体1656的CDR——的实例，包括以下肽(i)和(ii)：

(i)一种包含本发明抗体的轻链或轻链可变区的肽，所述肽包含SEQID NO:1-3中所述的氨基酸序列，例如包含SEQ ID NO:7中所述的氨基酸序列的肽；和

(ii)一种包含本发明抗体的重链或重链可变区的肽，所述肽包含SEQID NO:4-6中所述的氨基酸序列，例如包含SEQ ID NO:8中所述的氨基酸序列的肽。

包含抗体的轻链、重链及其可变区中任一项的肽——该肽包含抗体1640的CDR——的实例，包括以下肽(i)和(ii)：

(i)一种包含本发明抗体的轻链或轻链可变区的肽，所述肽包含SEQID NO:9-11中所述的氨基酸序列，例如，包含SEQ ID NO:15中所述的氨基酸序列的肽；和

(ii)一种包含本发明抗体的重链或重链可变区的肽，所述的肽包含SEQ ID NO:12-14中所述的氨基酸序列，例如，包含SEQ ID NO:16中所述的氨基酸序列的肽。

例如，功能性抗体可通过用连接物连接此类肽来制备。

一旦获得特异性抗E血清型LPS的抗体（1656或1640），本领域技术人员可鉴定由所述抗体识别的表位，并制备结合所述表位的多种抗体。本发明还提供一种抗体，其识别与抗体“1656”和抗体“1640”中任一种识别的表位相同的表位。可以想象，这样一种抗体具有抗体“1656”和抗体“1640”之一的上述特征（对铜绿假单胞菌的结合活性的血清型特异性、对全身感染和肺部感染的调理素活性、凝集活性和抗菌活性）。

抗体对铜绿假单胞菌的结合可通过，例如，本申请的实施例中所述的全细胞ELISA法来评价。因此，可测定所述抗体对其表现出结合活性的铜绿假单胞菌菌株的血清型范围。调理素活性可，例如如本申请的实施例中所述，通过使用纳入了FITC标记的铜绿假单胞菌的人多形核白细胞的荧光强度作为量度的检测法来评价。同时，凝集活性可，例如如本申请的实施例中所述，作为单位量IgG的凝集效价，通过检测抗体对连续稀释的细菌细胞的凝集能力来评价。同时，例如如本申请的实施例中所述，由给予了抗体的模型小鼠的存活率，可评价对全身感染和肺部感染的抗菌活性。

本发明的抗体通常为人抗体。然而，通过使用关于本发明中鉴定的表位的信息或通过使用本发明中鉴定的人类抗体的CDR区或可变区，本领域技术人员可制备各种抗体，例如除了人抗体外，嵌合抗体、人源化抗体和小鼠抗体，还可制备这些抗体的功能性片段。为了将本发明的抗体作为药物给予人，从减少副作用的观点来看，本发明的抗体最优选地为人抗体。

在本发明中，“人抗体”指的是所有的区都源自人的抗体。对于人抗体的制备，可采用本发明实施例中所述的方法。作为其它方法，例如，可使用其中使用了能够通过免疫接种来产生全部人抗体的转基因动物（例如小鼠）的方法。此类人抗体的制备方法是已知的（例如Nature,362:255-258(1992);Intern.Rev.Immunol,13:65-93(1995);J.Mol.Biol,222:581-597(1991);Nature Genetics,15:146-156(1997);Proc.Natl.Acad.Sci.USA,97:722-727(2000)；日本未审查专利申请公开号平成10-146194；日本未审查专利申请公开号平成10-155492；日本专利号2938569；日本未审查专利申请公开号平成11-206387；国际申请日本阶段公开号平成8-509612；和国际申请日本阶段公开号平成11-505107）。

在本发明中，“嵌合抗体”指的是通过将一个物种的抗体的可变区与另一个物种的抗体的恒定区连接获得的抗体。例如，可如下文所述获得此类嵌合抗体。用抗原免疫接种小鼠。将编码结合所述抗原的抗体可变部分（可变区）的部分从编码小鼠单克隆抗体的基因中切出。将该部分与编码人骨髓源性抗体恒定部分（恒定区）的基因连接。将这些连接的基因纳入表达载体。然后将所述表达载体引入产生嵌合抗体的宿主（参考，例如，日本未审查专利申请公开号平成8-280387，美国专利号4816397，美国专利号4816567和美国专利号5807715）。同时，在本发明中，“人源化抗体”指的是通过将非人源抗体的抗原结合位点（CDR）的基因组序列移植到人抗体的基因上（CDR移植）获得的抗体。此类嵌合抗体的制备方法是已知的（参考，例如，EP239400、EP125023、WO90/07861和WO96/02576）。在本发明中，抗体的“功能性片段”表示抗体的一部分（部分片段），其保留了产生该部分的抗体的特异性地识别抗原的能力。功能性片段的具体实例包括Fab、Fab’、F(ab’)2、可变区片段（Fv）、二硫键连接的Fv、单链Fv（scFv）、sc(Fv)2、双价抗体（diabody）、多特异性抗体及其聚合物。

本文中，“Fab”表示免疫球蛋白的单价抗原结合片段，由一条轻链的一部分和一条重链的一部分形成。Fab可通过对抗体的木瓜蛋白酶消化法或重组法得到。“Fab’”与“Fab”的区别在于，在Fab’中，包括一个或多个来自抗体铰链区的半胱氨酸的少量残基被加至重链CH1结构域的羧基末端。“F(ab’)2”表示免疫球蛋白的二价抗原结合片段，由全部两条轻链的一部分和全部两条重链的一部分构成。

“可变区片段（Fv）”是具有完整的抗原识别和结合位点的最小抗体片段。Fv是一个二聚体，其中重链可变区和轻链可变区通过非共价键牢牢地连接。“单链Fv（scFv）”包括抗体的重链可变区和轻链可变区，并且在“单链Fv（scFv）”中，这些区域存在于单条多肽链中。“sc(Fv)2”是通过用连接物等使两个重链可变区和两个轻链可变区键合而获得的单链。“双价抗体”是具有两个抗原结合位点的小抗体片段。该片段包括在单条多肽链中键合至轻链可变区的重链可变区，并且所述区域中的每一个均与另一条链中的互补区域成对。“多特异性抗体”是一种单克隆抗体，其特异性地结合至少两种不同抗原。例如，这样的多特异性抗体可通过两个免疫球蛋白重链/轻链对的共表达来制备，其中所述两条重链具有相互不同的特异性。

本发明的抗体包括其氨基酸序列被修饰但不损害所需活性（对铜绿假单胞菌的结合活性及其广泛性或其特异性，对全身感染或肺部感染的调理素活性、凝集活性、抗菌活性，和/或其它生物学特征）的抗体。本发明抗体的氨基酸序列变体可通过将突变引入编码本发明抗体链的DNA中或通过肽合成来制备。此类修饰包括，例如在本发明抗体的氨基酸序列中置换、缺失、增加和/或插入一个或多个残基。所述抗体氨基酸序列的修饰区可为所述抗体的重链或轻链的恒定区或其可变区（骨架区或CDR），只要所得抗体具有与未经修饰的抗体等价的活性。可以想象，对非CDR中氨基酸的氨基酸的修饰对抗原结合亲和力具有相对较小的影响。到目前为止，存在对下述抗体的筛选方法，所述抗体对抗原的亲和力通过修饰CDR中的氨基酸而得到增强（PNAS,102:8466-8471(2005),ProteinEngineering,Design&Selection,21:485-493(2008),InternationalPublication NO.WO2002/051870,J.Biol.Chem.,280:24880-24887(2005),和Protein Engineering,Design&Selection,21:345-351(2008)）。

被修饰的氨基酸数量优选地为10个氨基酸或更少，更优选地5个氨基酸或更少，最优选地3个氨基酸或更少（例如，2个氨基酸或更少，或1个氨基酸）。对氨基酸的修饰优选地为保守性置换。在本发明中，术语“保守性置换”表示用具有化学上类似的侧链的不同氨基酸残基进行的置换。具有化学上类似的氨基酸侧链的氨基酸组是本发明所属技术领域中公知的。例如，氨基酸可分组成酸性氨基酸（天门冬氨酸和谷氨酸）、碱性氨基酸（赖氨酸、精氨酸和组氨酸）和中性氨基酸。中性氨基酸可细分成具有烃基基团的氨基酸（甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和脯氨酸）、具有羟基的氨基酸（丝氨酸和苏氨酸）、含硫氨基酸（半胱氨酸和甲硫氨酸）、具有酰胺基的氨基酸（天冬酰胺和谷氨酰胺）、具有亚氨基的氨基酸（脯氨酸）；和具有芳基的氨基酸（苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸）。

对本发明抗体的修饰可以是对抗体的翻译后过程的修饰，例如改变糖基化位点的数量或糖基化的位置。这可改进，例如，抗体的ADCC活性。抗体的糖基化通常是N-连接的或O-连接的糖基化。抗体的糖基化极大地取决于用于表达所述抗体的宿主细胞。糖基化模式的改变可通过已知方法进行，例如引入或缺失某种与碳水化合物生成有关的酶（日本未审查专利申请公开号2008-113663、美国专利号5047335、美国专利号5510261、美国专利号5278299、国际公开号WO99/54342）。在本发明中，为了增加抗体稳定性的目的或其它目的，经受脱酰胺作用的氨基酸或与经受脱酰胺作用的氨基酸相邻的氨基酸可用不同的氨基酸置换以防止脱酰胺作用。此外，谷氨酸可用不同氨基酸置换，借此增加抗体的稳定性。本发明还提供因此稳定的抗体。

本发明抗体的多克隆抗体可如下文所述获得。具体而言，免疫动物是用抗原（LPS、具有LPS的部分结构的分子、表面上暴露有LPS和具有LPS部分结构的分子的任一种的铜绿假单胞菌等）免疫。多克隆抗体可通过纯化以常规方法（例如，盐析、离心、透析、柱色谱法等）由动物获得的抗血清来获得。同时，除了本发明实施例中所述的方法以外，单克隆抗体可用常规杂交瘤法或常规重组DNA法制备。

杂交瘤法的一个典型实例为Kohler&Milstein法（Kohler&Milstein,Nature,256:495(1975)）。该方法的细胞融合过程中所用的抗体生成细胞是用抗原（LPS、具有LPS的部分结构的分子、表面上暴露有LPS和具有LPS部分结构的分子的任一种的铜绿假单胞菌等）免疫接种的动物（例如，小鼠、大鼠、仓鼠、兔、猴或山羊）的脾细胞、淋巴结细胞、外周血白细胞等。可使用抗体生成细胞，所述细胞是在上述类型的任何细胞和提前从未免疫接种的动物中分离出的淋巴结细胞上通过引发抗原作用——在培养基中——而获得的。可使用各种已知的细胞株作为骨髓瘤细胞。抗体生成细胞和骨髓瘤细胞可源自不同动物物种，只要所述抗体生成细胞和所述骨髓瘤细胞可融合。然而，抗体生成细胞和骨髓瘤细胞优选地来源自相同动物物种。杂交瘤可通过，例如，由经抗原免疫接种的小鼠获得的脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞之间的融合而产生。因此，通过筛选所述杂交瘤，可获得产生LPS抗原特异性单克隆抗体的杂交瘤。抗LPS抗原的单克隆抗体可通过培养所述杂交瘤获得，或由注入所述杂交瘤的哺乳动物的腹水获得。

重组DNA法是一种这样的方法，其中将本发明的上述抗体作为如下重组抗体形式来产生。编码本发明的抗体或肽的DNA克隆自杂交瘤、B细胞等。将所克隆的DNA纳入适当的载体，并将该载体导入宿主细胞（例如，哺乳动物细胞株、大肠杆菌、酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞等）（例如，P.J.Delves,Antibody Production:Essential Techniques,1997WILEY,P.Shepherd and C.Dean MoNOclonal Antibodies,2000 OXFORDUNIVERSITY PRESS,Vandamme A.M.et al.,Eur.J.Biochem.192:767-775(1990)）。为了表达编码本发明抗体的DNA，可将编码重链和轻链的DNA分别纳入表达载体，并用其转化宿主细胞。或者，可将编码重链和轻链DNA纳入单个表达载体，并用其转化宿主细胞（参考WO94/11523）。可通过以下方式获得基本上纯净且同质的形式的本发明的抗体：培养上述宿主细胞，并从所述宿主细胞或培养基中分离和纯化。为了分离和纯化抗体，可使用用于多肽的常规纯化的任何方法。当其中钠入抗体基因的转基因动物（牛、山羊、绵羊、猪等）是用转基因动物生产技术产生时，大量源自所述抗体基因的单克隆抗体也可由所述转基因动物的乳获得。

本发明还提供编码本发明的上述抗体或肽的DNA、含有所述DNA的载体、含有所述DNA的宿主细胞，以及产生抗体的方法，所述方法包括培养宿主细胞和收集抗体。

由于本发明的抗体具有上述活性，本发明的抗体可用于预防或治疗与铜绿假单胞菌有关的疾病。因此，本发明还提供用于预防或治疗与铜绿假单胞菌有关的疾病的药物组合物，所述药物组合物包含作为活性成分的本发明的抗体，和预防或治疗与铜绿假单胞菌有关的疾病的方法，该方法包括将治疗或预防有效量的本发明抗体给予哺乳动物（包括人类）的步骤。除了人类外，本发明的治疗或预防方法还可用于各种哺乳动物，包括，例如狗、猫、牛、马、绵羊、猪、山羊和兔。

与铜绿假单胞菌有关的疾病的实例包括由铜绿假单胞菌感染（包括耐多药铜绿假单胞菌感染）引发的全身感染性疾病，例如败血症、脑膜炎和心内膜炎。其其它实例包括：耳鼻喉领域的中耳炎和鼻窦炎；肺部领域的肺炎、慢性呼吸道感染和导管感染；外科领域的术后腹膜炎和胆管中的术后感染等；眼科领域的眼睑脓肿、泪囊炎、结膜炎、角膜溃疡、角膜脓肿、全眼球炎和眼眶感染；以及泌尿外科领域中的尿路感染，包括复杂的尿路感染、导尿管感染和肛门周围脓肿。此外，所述实例还包括烧伤（包括严重烧伤和呼吸道烧伤）、褥疮感染和囊性纤维化病。

本发明的药物组合物或试剂可以组合物的形式使用，所述组合物使用本发明的抗体作为活性成分，并优选地含有纯化的抗体组合物和另一种组分，例如盐水、葡萄糖水溶液或磷酸盐缓冲剂。

必要时可将本发明的药物组合物配制成液体或冻干形式的制剂，并可任选地包含可药用载体，例如稳定剂、防腐剂和等渗剂。可药用载体的实例包括：甘露醇、乳糖、蔗糖和用于冻干制剂的人白蛋白；和盐水、注射用水、磷酸盐缓冲剂和用于液体制剂的氢氧化铝。然而，所述实例不限于此。

给药可因给药目标的年龄、重量、性别和一般健康状态而异。给药可通过口服给药和肠胃外给药（例如静脉内给药、动脉内给药和局部给药）中的任意给药途径进行。然而，优选肠胃外给药。

药物组合物的剂量随患者的年龄、重量、性别和一般健康状态，以及铜绿假单胞菌感染的严重度和待给予的抗体组合物的组分而变化。静脉内给药时，对成人而言，本发明的抗体组合物的剂量通常为每kg体重每天0.1-1000mg，优选1-100mg，。

优选地将本发明的药物组合物提前给予可能发生铜绿假单胞菌感染的患者。

由于本发明的抗体结合于暴露在铜绿假单胞菌细胞表面上的LPS，本发明的抗体也可用作铜绿假单胞菌感染的诊断剂。

当本发明的抗体被制备作为诊断剂时，所述诊断剂可通过采用适于此目的的任何方式以任何剂型获得。例如，对腹水——含有目的抗体或纯化的抗体的培养基——测量抗体效价，并用PBS（含磷酸盐缓冲剂的盐水）等适当稀释；之后，向其中加入防腐剂，例如0.1%叠氮化钠。或者，对吸收至胶乳等的本发明抗体测量抗体效价并适当稀释，并向其中加入防腐剂以备用。如上所述结合于胶乳颗粒的本发明抗体是作为诊断剂的优选剂型之一。该情况下合适作为胶乳的有，适合的树脂材料，例如，聚苯乙烯、聚甲基苯乙烯或聚丁二烯的胶乳。

根据本发明，提供了一种用本发明的抗体诊断铜绿假单胞菌感染的方法。本发明的诊断方法可通过如下方法进行：收集生物样本例如来自哺乳动物（包括人）的痰、肺灌洗液、脓、眼泪、血液或尿液，所述哺乳动物可能已患有铜绿假单胞菌感染；随后使所收集的样本与本发明的抗体接触；并且测定是否发生抗原-抗体反应。

根据本发明，提供了一种用于检测铜绿假单胞菌的存在情况的试剂盒，所述试剂盒至少包含本发明的抗体。

可标记本发明的抗体。这种检测用试剂盒通过检测抗原-抗体反应来检测铜绿假单胞菌的存在情况。

因此，如果需要，本发明的检测试剂盒可进一步包括用于进行抗原-抗体反应的各种试剂，例如ELISA法中所用的第二抗体、显色剂、缓冲剂、说明书和/或仪器等。

[实施例]

下文中，将在实施例的基础上更具体地描述本发明。然而，本发明不限于这些实施例。

[实施例1]抗-LPS的抗体的克隆

(1)血液捐献者招募

从患有慢性PA肺感染的囊性纤维化病患者和健康志愿者采集250ml血液样本。捐献者通常很健康并且在年龄、慢性PA感染年数以及免疫响应状态方面呈现较宽的范围。其他准入标准是年龄18岁以上，体重50千克以上并有正常血红蛋白水平。所有捐献都通过了丹麦国家生物医学研究伦理委员会（Danish National Committee on Biomedical ResearchEthics）的批准。

对每种血液样本进行以下类型的分析：(i)FACS分析，测定循环成浆细胞和浆细胞的量；(ii)ELISPOT分析，测定对特定LPS抗原特异的循环抗体生成细胞的量；(iii)ELISA分析，测定对特定LPS抗原的特异性免疫球蛋白的存在情况。

选择了具有高百分比的特异性针对LPS抗原的成浆细胞的捐献者样本用于下述Symplex过程（参考WO2005/042774）。

(2)人成浆细胞的FACS分选

用于此过程的起始材料为MACS纯化的CD19阳性B细胞。这些细胞通常冷冻储存，然后在每次分选前解冻一部分。活的成浆细胞通过以下方式鉴定，针对CD19、CD38、λ-轻链和死细胞对所述细胞进行染色。

将刚解冻的细胞用4ml FACS PBS洗涤两次，稀释至每40μl FACSPBS含有1x10⁶个细胞。于4℃下向每1x10⁶个细胞中加入以下试剂：10μl CD19-FITC，20μl CD38APC和10μl λ-PE，并在黑暗中于冰上放置20分钟。样本用2ml FACS缓冲液洗涤两次，并重悬浮于1ml FACSPBS中，之后加入碘化丙锭（1:100）。该细胞悬浮液通过50μm的falcon针头过滤器（FACS过滤器）过滤，并准备直接分选至Symplex PCR板中（参见下一部分）。分选之后，将所述PCR板于300xg离心1分钟并保存于-80℃下以备用。

(3)同源VH和VL对的连接

为了将编码源自相同B细胞的重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）的序列结合，将编码VH和VL的序列连接在分选为浆细胞的单个细胞上。该过程采用了基于一步多重重叠延伸RT-PCR继以巢式PCR的两步PCR过程。本实施例中所用的引物混合物仅扩增κ轻链。同源VH和VL序列的连接原理显示在图1中。

将所产生的96孔PCR板解冻，并将分选的细胞用作所述多重重叠延伸RT-PCR的模板。在所述单细胞分选前加入每个孔中的分选缓冲液含有反应缓冲液（OneStep RT-PCR缓冲剂；Qiagen）、用于RT-PCR的引物（参考表2）和RNase抑制剂（RNasin，Promega）。在其中补充一步RT-PCR酶混合液(25x稀释液；Qiagen）和dNTP混合液(每种200μM）以在20-μl反应体积中获得给定的最终浓度。

[表2]

使所述板于55℃下孵育30分钟以允许每个细胞的RNA逆转录。逆转录之后，使所述板进行以下PCR循环：94℃下10分钟，35个循环（94℃下40秒，60℃下40秒，72℃下5分钟），72℃下10分钟。

所述PCR反应在配有用于24个96孔板的剥离密封篮（Peel SealBasket）的H20BIT热循环仪（ABgene）中进行以有利于实现高通量。循环之后将所述PCR板保存于-20℃。

对于巢式PCR步骤，96孔PCR板在各个孔（20-μl反应体系）中用以下混合物制备以获得给定的最终浓度：1xFastStart缓冲液（Roche）、dNTP混合液（各200μM）、巢式引物混合液（见表1）、Phusion DNA聚合酶（0.08U;Finnzymes）和FastStart高保真酶混合液（FastStart HighFidelityBlend）（0.8U;Roche）。从所述多重重叠延伸PCR反应体系中转移出1μl作为所述巢式PCR的模板。使所述巢式PCR板进行以下热循环：35个循环（95℃下30秒，60℃下30秒，72℃下90秒），72℃10分钟。

将随机选择的反应产物用1%琼脂糖凝胶分析以验证约1050个碱基对（bp）的重叠延伸片段的存在情况。将所述板保存于-20℃直到进一步加工所述PCR片段。将全部来自所述巢式PCR的经连接的VH和VL编码对合并——但不混合来自不同捐献者的VH和VL对——并通过制备型1%琼脂糖凝胶电泳纯化。

(4)将同源VH和VL编码序列对插入筛选载体

为了确定对LPS具有结合特异性的抗体，将所得VH和VL编码序列表达为全长抗体。这包括将全部所述VH和VL编码对插入表达载体并转染到宿主细胞中。

采用两步克隆法以生成含有所连接的VH和VL编码对的全部表达载体的集合。统计学上，如果表达载体的集合含有重组质粒的数量是用于生成所述筛选集合的同源配对VH和VL PCR产物数量的10倍，则有99%的可能性出现所有独特的基因对。例如，如果获得400个重叠延伸V-基因片段，则生成至少4000个克隆的集合用于筛选。

简言之，将连接的VH和VL编码对的集合的纯化PCR产物用XhoI和NOtI DNA核酸内切酶于引入到所述PCR产物末端的识别位点处切割。将所述经切割并纯化的片段通过常规连接过程连接到XhoI/NOtI消化的哺乳动物IgG表达载体OO-VP-002（图2）中。将所述连接混合物电穿孔入大肠杆菌并加入含有适当抗生素的2xYT板中，并于37℃孵育过夜。用常规DNA纯化法（Qiagen）从回收自所述板的细胞中纯化扩增的载体集合。

通过用AscI和NheI核酸内切酶切割来处理所述质粒以插入启动子-前导序列片段。这些酶的限制性酶切位点位于VH和VL编码基因对之间。纯化所述载体后，将AscI-NheI消化的双向哺乳动物启动子-前导序列片段通过常规连接过程插入至所述AscI和NheI限制性酶切位点。在大肠杆菌中扩增所述连接载体并用常规方法纯化所述质粒。将生成的筛选载体集合通过常规过程转化到大肠杆菌中。将所得的菌落置于384孔主平板（master plate）中并保存。转移到384孔板的菌落数量超出所用PCR产物数量至少3倍，因此，有95%的可能性存在所有独特的所获得的V-基因对。

M166表达为嵌合IgG抗体。M166的可变基因氨基酸序列源自特异性针对铜绿假单胞菌PcrV蛋白的鼠抗体，如专利WO2002/064161所述。可变基因合成于GENEART AG（BioPark,Josef-Engert-Str.11,93053Regensburg,Germany）并且在该过程中将鼠的轻链可变基因连接至人κ恒定基因。将鼠的重链可变基因和嵌合轻链基因插入含有人重链恒定基因剩余部分以及哺乳动物细胞中进行基因表达所需元件的表达载体中。

(5)Symplex集合的表达

将主平板上的细菌菌落接种于384孔板中的培养基中，并培养过夜。从各个孔用TempliPhi DNA扩增试剂盒（Amersham Biosciences）根据其手册制备用于转染的DNA。转染前一天，将Flp-In^TM-CHO细胞（Invitrogen）以3000个细胞/孔接种于384孔板（在20μl培养基中）。用FuGENE 6（Roche）根据其手册将扩增的DNA导入细胞中。培养3天后，收集含有全长抗体的上清液，并保存用于抗原特异性筛选。

(6)筛选对LPS的结合

通过ELISA法，使用对分离自相关铜绿假单胞菌型菌株的纯化LPS分子混合物的结合作为指标而进行抗体文库的筛选。Nunc MaxiSorp 384孔板于4℃下用LPS混合物（每次分析最多含有6个血清型，该混合物是通过用50mM碳酸盐缓冲剂（pH：9.6）稀释纯化LPS分子的混合物而获得）包被过夜，以便含有10μg/ml的每种LPS血清型的纯化LPS。将所述孔板用50μl含有2%脱脂乳（SM）的PBS-T（PBS+0.05%吐温）封闭，然后用PBS-T洗涤一次。将15μl抗体上清液加入每个孔中并于室温下孵育1.5小时。然后，将所述板用PBS-T洗涤一次。为了检测结合于所述孔的抗体，将用2%SM-PBS-T稀释10,000倍的第二抗体（HRP-山羊-抗-人IgG,Jackson）加入每个孔中，然后于室温下孵育1小时。将所述板用PBS-T洗涤一次，然后将25μl培养基（Kemen-tec DiagNOstics，商品目录号4390）加入每个孔。然后孵育5分钟。孵育之后，加入25μl的1M硫酸以终止所述反应。用450nm-ELISA酶标仪检测特异性信号。

(7)序列分析和克隆选择

将ELISA中鉴定为LPS特异性的克隆从原始主平板（384孔式）中回收并置于新板中。从所述克隆中分离出DNA并提交用于V-基因的DNA测序。比对所述序列并选择所有独特的克隆。对所获得序列的多重比对揭示了每种特定克隆的唯一性并确定独特的抗体。鉴定了多个遗传上不同的抗体序列簇。每个相关序列的簇可能源自对常规前体克隆的体细胞超突变。总之，从每一簇选择1-2个克隆用于验证序列和特异性。

(8)序列和特异性验证

为了验证所述抗体编码克隆，制备DNA质粒并以2ml的规模进行FreeStyle CHO-S细胞(Invitrogen)的转染，用于表达。转染96小时后收集上清液。用常规抗-IgG ELISA评估表达水平，并通过LPS-特异性ELISA测定特异性。

(9)鉴定的抗体

由此，鉴定的抗-LPS的抗体和CDR序列以及所鉴定的抗-LPS的抗体的可变区如下。注意所鉴定的抗-LPS的抗体的恒定区序列如WO2005/042774中所述。

<抗E血清型LPS的抗体>

“1656”

SEQ ID NO:1-3··轻链CDR 1-3的氨基酸序列

SEQ ID NO:4-6··重链CDR 1-3的氨基酸序列

SEQ ID NO:7··轻链可变区的氨基酸序列

SEQ ID NO:8··重链可变区的氨基酸序列

SEQ ID NO:25··轻链可变区的碱基序列

SEQ ID NO:26··重链可变区的碱基序列

“1640”

SEQ ID NO:9-11··轻链CDR 1-3的氨基酸序列

SEQ ID NO:12-14··重链CDR 1-3的氨基酸序列

SEQ ID NO:15··轻链可变区的氨基酸序列

SEQ ID NO:16··重链可变区的氨基酸序列

SEQ ID NO:27··轻链可变区的碱基序列

SEQ ID NO:28··重链可变区的碱基序列

<广泛反应性的抗-LPS的抗体>

“2459”

SEQ ID NO:17-19··轻链CDR 1-3的氨基酸序列

SEQ ID NO:20-22··重链CDR 1-3的氨基酸序列

SEQ ID NO:23··轻链可变区的氨基酸序列

SEQ ID NO:24··重链可变区的氨基酸序列

SEQ ID NO:29··轻链可变区的碱基序列

SEQ ID NO:30··重链可变区的碱基序列

[实施例2]抗E血清型LPS的抗体的分析

(1)LPS的纯化

将表3中所示的各种血清型的每种铜绿假单胞菌菌株悬浮于5ml LB培养基中。使用该细菌细胞悬浮液，通过10倍连续稀释来制备1-10⁴倍的稀释液。将这些稀释液于37℃下振荡培养6小时。培养之后，从观察到细菌生长的稀释液中具有最大稀释因子的稀释液中取出菌液。将这种菌液悬浮于单独制备的LB培养基中，稀释因子为1000，然后于37℃下振荡培养过夜。培养之后，将所述液体于5000x g下离心20分钟，从而收集细菌细胞。测量所述细菌细胞的重量，然后向所述细菌细胞加入纯净水至以湿重计120mg/ml。此外，将事先加热至68℃的等量的90%的苯酚溶液（NACALAI TESQUE,IN C.）加入至所述细菌细胞中，将所得混合物搅拌20分钟。之后，在间歇搅拌的情况下将所述混合物于68℃水浴中加热20分钟。然后，冷却之后，将所述混合物于5000x g下离心20分钟。收集水层，用纯净水透析，并冻干。将所得产物用作各LPS。

(2)A-带LPS纯化

将以上(1)中自G血清型的铜绿假单胞菌菌株ATCC 27584提取的LPS G用作原料。将该LPS再次悬浮于水中，用于注射，并重复两次超速离心（4000rpm，3hr）以除去核酸。将所收集的沉淀物冻干。在此获得的LPS G通过凝胶过滤柱（HiPrep 26/60Sephacryl S-200HR，GEhealthcare bioscience,17-1195-01）用于粗分。为进行纯化操作，使用AKTAexplore 10S（GE healthcare bioscience）。作为流动相，使用含有0.2%脱氧胆酸钠（NACALAI TESQUE,INC.,10712-54）、0.2M NaCl（NACALAITESQUE,INC.,31319-45）和5mM EDTA（NACALAI TESQUE,INC.,15105-35）的20mM Tris-HCl缓冲剂（NACALAI TESQUE,IN C.,35406-75）（pH：8.3）。为进行检测，使用差示折光计（SHIMAZU,RID-10A）。将所得粗纯化的级分用纯净水透析过夜，然后冻干。将冻干的材料再次悬浮于0.5M NaCl溶液中，并向其中加入10倍量的乙醇，从而引起LPS沉淀。所得沉淀物再次用70%的乙醇洗涤以除去剩余的表面活性剂。之后，将LPS冻干，悬浮于0.1N NaOH（NACALAI TESQUE,INC.,31511-05）和0.2M NaBH4（NACALAI TESQUE,INC.,31228-22）的溶液中，并于37℃下反应24小时。因此，根据Eur.J.BioChem.167,203-209(1987)中描述的方法,仅所含的B-带LPS被分解。将该反应液用1%乙酸（NACALAI TESQUE,INC.,00211-95）中和，通过超滤（AmiconUltra-15,MWCO 10000,Millipore）浓缩，然后再次通过凝胶过滤柱（Superdex peptide 10/300GL,GE healthcare bioscience,17-5176-01）。收集使用PBS(-)（Sigma-Aldrich Corporation,D1408）作为流动相洗脱的级分。然后，通过超滤将缓冲液替换为纯净水并浓缩。然后，进行冻干以获得纯化的A-带LPS。

(3)蛋白质印迹法和全细胞ELISA

-蛋白质印迹法-

将获自实施例2(1)中制备的各种血清型的ATCC菌株的每种LPS和实施例2(2)中纯化的A-带LPS（其为冻干的），溶解于PBS中以达到1mg/ml。使该溶液与等量的样本缓冲液（62.5mM的Tris-HCl（pH：6.8），5%的2-巯基乙醇，2%的SDS，20%的甘油，0.005%的溴酚蓝）混合，并在使用前于100℃下加热10分钟。将10μl的LPS加入16孔型5-20%或15%的SDS-PAGE（XV PANTERA Gel,DRC）的每个孔中，然后电泳15分钟。在使用半干印迹装置（AE-6677,ATTO corporation）或干凝胶印迹装置（iBlotdry gelblotting system,Invitrogen）转移至硝酸纤维素膜之后，使用ImmuNOblock^TM（Dainippon Sumitomo Pharma Co.,Ltd.）于室温下封闭30分钟。将所述抗体样本用溶于TBST（含0.05%的吐温20的Tris缓冲盐水）中的5%的ImmuNOblock^TM稀释至3μg/ml，并与所述转移膜于4℃下反应一天一夜。用TBST洗涤3次，每次10分钟之后，将所述转移膜浸渍在通过用溶于TBST中的5%的ImmuNOblock^TM稀释山羊抗-人IgG（Fc）抗体HRP缀合物（Kirkegaard&PerryLaboratories,Inc.）获得的反应液（1:5000）中，并于37℃下反应1小时。然后，将所述转移膜用TBST洗涤3次，每次10分钟之后，根据ECL plus蛋白质印迹检测系统（GE Healthcare,Code:RPN2132）的手册，于室温下反应2分钟。用FLA-3000荧光图像分析仪（FUJIFILM Corporation）检测化学发光。

表3显示所得结果。在向其添加抗体1640或抗体1656作为第一抗体的每个膜上，在获自11种血清型的ATCC菌株的LPS中，仅从获自临床上常见的E血清型菌株LPS的低分子量区域至高分子量区域中观察到推定对应于包含O抗原的B-带LPS的多条带。当使用获自另一种E血清型菌株ATCC 33358的LPS时，被看作代表的抗体1656显示出相同的结果。此外，抗体1656对纯化的A-带LPS未显示任何反应活性。因此，可以确认这些抗体特异性地识别E血清型LPS的B-带LPS。

[表3]

ATCC	血清型	1640	1656
				27577	A/O3	ND	ND
27578	B/O2	ND	ND
				BAA-47	B/O5	ND	ND
27317	C/O8	ND	ND
				27580	D/O9	ND	ND
29260	E/O11	B带	B带
				33358	E/O11	NT	B带
27582	F/O4	ND	ND
				27584	G/O6	ND	ND
27316	H/O10	ND	ND
				27586	I/O1	ND	ND

ATCC	血清型	1640	1656
				21636	M	ND	ND

NT：未测试

ND：未检出

LMW：低分子量

-全细胞ELISA(1)-

用于固定的细菌悬液是通过以下方式制备的初始细菌悬液：用PBS洗涤在LB培养基中培养过夜的各种血清型的铜绿假单胞菌菌株的细胞悬液，然后重悬浮洗涤过的材料，使得每种10倍稀释的细菌悬液在595nm处的吸光度为0.20至0.23。将所述细菌悬液以100μl/孔置于96孔ELISA板（F96MaxiSorp Nunc-ImmuNO Plate,Nalge Nunc International K.K.）中，并于4℃下固定过夜。之后，用200μl的TBS洗涤一次。将封闭缓冲液（含2%牛血清蛋白的TBS）加入至每个孔，并于室温下封闭30分钟。然后，将100μl用样本缓冲液（含1%牛血清蛋白的TBS）稀释过的抗E血清型LPS的抗体1640和1656（1μg/ml）加入至每个孔，并于37℃下反应2小时。之后，洗涤3次，每次用200μl洗涤缓冲液（含0.05%的吐温20的TBS）。将100μl用样本缓冲液稀释10000倍的第二抗体——山羊抗人IgG（Fc）抗体HRP缀合物（Kirkegaard&Perry Laboratories,Inc.）加入至每个孔中，并于37℃下反应1小时。之后，用洗涤缓冲液洗涤三次。将100μl显色底物（TMB Microwell Peroxidase substrate System,Kirkegaard&Perry Laboratories,Inc.）加入至每个孔中，于暗处进行反应。然后，用1M的磷酸溶液使酶促反应停止，并测量450nm处的吸光度。表4显示所得结果。可以确认，当认为大于0.25的吸光度为阳性时，抗体1640和抗体1656特异性地结合E血清型菌株。

[表4]

ATCC	血清型	1640	1656	Venilon
					27577	A/O3	0.005	0.005	0.011
27578	B/O2	-0.004	0.000	0.011
					BAA-47	B/O5	-0.013	-0.014	-0.005
33353	C/O7	0.001	0.000	0.003
					27580	D/O9	0.003	0.003	0.006
29260	E/O11	1.245	1.337	0.010
					27582	F/O4	-0.001	0.002	0.009
27584	G/O6	-0.002	-0.004	0.007
					27316	H/O10	0.002	0.001	0.002

ATCC	血清型	1640	1656	Venilon
					27586	I/O1	-0.012	-0.011	-0.010
21636	M	-0.001	0.000	0.011

-全细胞ELISA(2)-

使用总共31个菌株（还包括各种血清型菌株）对抗E血清型LPS的抗体1656（1.0μg/ml）进行全细胞ELISA。表5显示所得结果。标准如下：吸光度小于0.25的情况用-标记，吸光度为0.25或以上但小于0.5的情况用+标记，吸光度为0.5或以上但小于0.75的情况用++标记，吸光度为0.75或以上的情况用+++标记。在此情况下，作为对照的人类免疫球蛋白制剂Venilon（TEIJIN PHARMA LIMITED）对所测的31个菌株均未显示出结合能力。相反，抗体1656只对E血清型菌株为+++和++，而对其它血清型的所有菌株为-，即对E血清型菌株显示出特异性。

[表5]

-全细胞ELISA(3)-

检测本发明的抗E血清型LPS的抗体1656对MEIJI SEIKAKAISHA,LTD.拥有的9个E/O11血清型耐多药铜绿假单胞菌（MDRP）菌株的结合能力。标准如下：吸光度小于0.25的情况用-标记，吸光度为0.25或以上但小于0.5的情况用+标记，吸光度为0.5或以上但小于0.75的情况用++标记，吸光度为0.75或以上的情况用+++标记。作为对照的人免疫球蛋白制剂Venilon（TEIJIN PHARMA LIMITED，1.0μg/ml）对所测的9个菌株均未显示出结合能力。相反，抗体1656（1.0μg/ml）对于两个菌株被评价为+，对于五个菌株被评价为++，对于两个菌株被评价为+++，也对MDRP显示出很强的结合能力，尽管存在抗菌抗性。表6显示所得结果。

[表6]

(4)交叉反应试验

为试验抗E血清型LPS的抗体1656（1.0μg/ml）的交叉反应，以与上述(1)中所述方法相同的方法使用各种革兰氏阴性和革兰氏阳性致病细菌进行全细胞ELISA。表7显示所得结果。抗E血清型LPS的抗体1656特异性地识别并牢固地结合于E/O11血清型ATCC29260菌株，但不与其它细菌菌株反应。

[表7]

(5)凝集活性

使用铜绿假单胞菌ATCC29260菌株(E/O11血清型）测量了抗体1656的凝集活性。将该菌株在胰酶大豆琼脂培养基（tryoticase soy agarmedium）上于37℃下培养过夜。然后，在将一些菌落悬浮于LB培养基中之后，将所述培养基于37℃下振荡培养过夜。将所得细菌培养物用PBS洗涤并重悬浮于PBS中。然后，向其中加入含有4%的低聚甲醛的磷酸盐缓冲液（Wako Pure Chemical Industries,Ltd.），并进行30分钟或以上的灭活处理。将该处理后的产物用于本试验。将灭活的ATCC29260菌株悬浮于PBS中，以达到2mg/ml的蛋白质浓度。抗体1656（IgG在原液中的浓度：2.69mg/ml）用PBS连续稀释。在96孔圆底板上将等量（8μl）灭活的ATCC29260菌株悬浮液与连续稀释的抗体1656彼此混合。每种混合物均于37℃下维持1小时或以上，或于室温下维持过夜或更长。然后，判断细菌细胞的凝集。

结果，抗体1656的凝集效价为64，换言之，在最高达64倍稀释时观察到凝集，并且单位量（μg）IgG的凝集效价为190。同时，作为对照的免疫球蛋白制剂Venilon（50mg/ml，TEIJIN PHARMA LIMITED）根本不引起灭活菌株的凝集。

(6)调理素活性

-试验1-

将E血清型铜绿假单胞菌菌株ATCC29260于LB培养基中培养过夜。所得细菌培养物用4%的低聚甲醛固定，并悬浮在1mM的荧光素-4-异硫氰酸酯（FITC）溶液中，于室温下放置1小时以进行标记。通过使用单-聚分离培养基（Mono-Poly resolving medium，DS Pharma Biomedical Co.Ltd.）的密度梯度离心法，从使用柠檬酸从健康捐献者收集的50ml血液中纯化人多形核白细胞（下文称为PMN），并制成5x10⁶个细胞/ml的浓度。将20μl E血清型特异性抗体1656和FITC标记的铜绿假单胞菌菌株（30μl，5x10⁶个细胞）加入96孔圆底板，并于37℃下孵育15分钟。之后，加入幼兔血清（10μl）和PMN（40μl，2x10⁶个细胞）作为补充物，并将所得混合物再孵育30分钟以进行吞噬。将所述板转移到冰上，并由此终止反应。附着于细胞表面的细菌的荧光通过含有0.2%台盼蓝的PBS（100μl）淬灭，然后用0.5%低聚甲醛固定所述细胞。用流式细胞仪（BECKMAN COULTER）测量所述细胞的荧光（平均荧光强度，下文简称MFI）。调理素活性计算为通过从包含FITC标记的铜绿假单胞菌菌株的PMN的荧光强度中减去因PMN固有荧光引起的荧光强度而获得的值。

结果显示，对于E血清型菌株ATCC29260，未加入抗体的组的MFI值为0.32，而加入抗E血清型LPS的抗体1656的组的MFI值依赖于浓度而增长，其中在30μg/ml下的MFI值为122.87，而EC50为0.11μg/ml。用作对照的免疫球蛋白制剂Venilon（TEIJIN PHARMA LIMITED）在1000μg/ml下的MFI值为97.77。

上述结果显示，抗E血清型LPS的抗体1656对E血清型菌株——其在临床上经常遇到——具有很强的调理素活性。

-试验2-

将E血清型铜绿假单胞菌菌株ATCC29260在Mueller-Hinton琼脂培养基上培养过夜。然后，从中挑选3个菌落，接种在Luria-Bertani培养基中，于37℃下振荡（180rpm）培养16小时。将所述培养基离心（2,000x g，10分钟，室温）。所得材料用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤一次，然后悬浮在1mM的荧光素-4-异硫氰酸酯（FITC）溶液中，于室温下放置1小时以进行标记。通过使用单-聚分离培养基（DS Pharma Biomedical Co.Ltd.）的密度梯度离心法，从使用柠檬酸从健康捐献者收集的50ml血液中纯化人多形核白细胞（下文称为PMN），并制成5x10⁶个细胞/ml的浓度。将20μl抗E血清型LPS的抗体1640和FITC标记的铜绿假单胞菌菌株（30μl，5x10⁶个细胞）加入96孔圆底板，并于37℃下孵育15分钟。之后，加入幼兔血清（10μl）和PMN（40μl，2x10⁶个细胞）作为补充物，并将所得混合物再孵育30分钟以进行吞噬。将该板转移到冰上，并由此终止反应。附着于细胞表面的细菌的荧光通过含有0.2%台盼蓝的PBS（100μl）淬灭，然后用0.5%低聚甲醛固定细胞。用流式细胞仪（BECKMAN COULTER）测量了细胞的荧光（平均荧光强度，下文简称MFI）。调理素活性计算为通过从包含FITC标记的铜绿假单胞菌菌株的PMN的荧光强度减去因PMN固有荧光引起的荧光强度而获得的值。

作为结果，对于E血清型菌株ATCC29260，未加入抗体的组的MFI值为0.44，而加入抗体1640的组的MFI值依赖于浓度而增长，其中在30μg/ml下的MFI值为58.37，而EC50为0.64μg/ml。用作对照的免疫球蛋白制剂Venilon（TEIJIN PHARMA LIMITED）在1000μg/ml下的MFI值为27.07。

上述结果显示，抗E血清型LPS的抗体1640对E血清型铜绿假单胞菌菌株具有调理素活性。

(7)对全身感染模型1的作用

如下文所述准备中性白细胞减少症小鼠。将环磷酰胺（Sigma-Aldrich）以125mg/kg的量在第-5、-2和0天共三次腹腔注射至每只均6周龄的BALB/c雄性小鼠（Charles river laboratories Japan,inc.,n=6），其中感染日标记为第0天。由此，外周血液中的中性白细胞减少。以1.8x10³cfu/小鼠的量（约46LD50）在小鼠腹膜内接种悬浮于250μl盐水中的ATCC29260菌株（E/O11血清型），借此诱发全身感染。之后立即以200μl/小鼠的量经尾部静脉给予抗E血清型LPS的抗体1640，并在接种7天后的存活率的基础上判断对抗所述感染的保护活性。结果显示，在感染后第7天，以5、50、500和2500μg/小鼠的量给予免疫球蛋白制剂Venilon（TEIJIN PHARMA LIMITED）的对照组的存活率分别为0、16.7、33.3和66.7%，并且ED50估算为985.22μg/小鼠。相反，在感染后第7天，以5、10、20、50、100和250μg/小鼠的量给予抗E血清型LPS的抗体1640的组的存活率分别为0、50、100、16.7、66.7和100%，显示出对抗所述感染的强保护活性，并且ED50估算为23.06μg/小鼠。

(8)对全身感染模型2的作用

如下文所述准备中性白细胞减少症小鼠。将环磷酰胺（Sigma-Aldrich）以125mg/kg的量在第-5、-2和0天共三次腹腔注射至每只均6周龄的BALB/c雄性小鼠（Charles river laboratories Japan,inc.,n=6），其中感染日标记为第0天。由此，外周血液中的中性白细胞减少。以1.475x10³cfu/小鼠的量（约38LD50）在小鼠腹膜内接种ATCC29260菌株（E/O11血清型），借此诱发全身感染。之后立即以200μl/小鼠经尾部静脉给予样本，并在接种7天后的存活率的基础上判断对抗所述感染的保护活性。结果显示，在感染后第7天，以40、200、1000和5000μg/小鼠的量给予免疫球蛋白制剂Venilon（TEIJIN PHARMA LIMITED）的对照组的存活率分别为0、16.7、16.7和83.3%，并且ED50估算为1779.93μg/小鼠。在感染后第7天，以1.6、8、40、200和400μg/小鼠的量给予抗-PcrV的抗体M166的组的存活率分别为0、0、0、50和16.7%，并且ED50估算为714.91μg/小鼠或更高。相反，在感染后第7天，以0.32、1.6、8、40和200μg/小鼠的量给予抗E血清型LPS的抗体1656的组的存活率分别为0、50、50、66.7和66.7%，显示出对抗所述感染的强保护活性，并且ED50估算为12.21μg/小鼠。

(9)对全身感染模型3的作用

如下文所述准备中性白细胞减少症小鼠。将环磷酰胺（下文称为CY，Sigma-Aldrich）以125mg/kg的量在第-5、-2和0天三次共腹腔注射至每只均6周龄的BALB/c雄性小鼠（Charles river laboratories Japan,inc.,n=6），其中感染日标记为第0天。由此，外周血液中的中性白细胞减少。以1.575x10⁴cfu/小鼠的量（>1260LD50）在小鼠腹膜内接种悬浮于250μl盐水中的MSC 06120菌株（E/O11血清型，MDRP），借此诱发全身感染。接种之后立即以200μl/小鼠的量经尾部静脉给予样本，并在接种7天后的存活率的基础上评价对抗所述感染的保护活性。结果显示，在感染后第7天，以40、200、1000和5000μg/小鼠的量给予免疫球蛋白制剂Venilon（TEIJIN PHARMA LIMITED）的对照组的存活率分别为16.7、0、33.3和83.3%，并且ED50估算为1498.38μg/小鼠。在感染后第7天，以1.6、8、40和200μg/只小鼠的量给予抗-PcrV的抗体M166的组的存活率分别为0、0、0和16.7%，并且ED50估算为257.71μg/小鼠。相反，在感染后第7天，以0.32、1.6、8和40μg/小鼠的量给予抗体1656的组的存活率分别为16.7、50、16.7和83.3%，显示出对抗所述感染的强保护活性，并且ED50估算为8.05μg/小鼠。

(10)对肺部感染模型的作用

如下文所述在正常小鼠急性肺部感染模型上进行评价。使用5周龄的BALB/c雄性小鼠（Charles River laboratories Japan,inc.,n=6）。在氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉下以2.64x10⁵CFU/20μl/小鼠的量（约13LD50）给所述小鼠经鼻接种悬浮于盐水中的ATCC29260菌株（E/O11血清型）。之后立即以200μl/小鼠的量经尾部静脉给予样本，并在接种7天后的存活率的基础上判断对抗所述感染的保护活性。结果显示，感染对照组中的所有小鼠都在感染后2天内死亡。在感染后第7天，以100、500或2500μg/小鼠的量给予免疫球蛋白制剂Venilon（TEIJIN PHARMA LIMITED）的阳性对照组的存活率分别为33.3、83.3和100%，并且ED50估算为163.53μg/小鼠。在感染后第7天，以0.16、0.8、4和20μg/小鼠的量给予抗-PcrV的抗体M166的组的存活率分别为0、0、16.7和83.3%，并且ED50估算为8.99μg/小鼠。相反，在感染后第7天，以0.032、0.08、0.16、0.8、4和20μg/小鼠的量给予抗E血清型LPS的抗体1640的组的存活率分别为0、33.3、16.7、100、100和100%，显示出对抗所述感染的强保护活性，并且ED50估算为0.19μg/小鼠。同时，在感染后第7天，以0.032、0.08、0.16、0.8、4和20μg/小鼠的量给予抗E血清型LPS的抗体1656的组的存活率分别为0、0、50、100、100和100%，显示出对抗所述感染的强保护活性，并且ED50估算为0.16μg/小鼠。

(11)对肺感染模型2的作用

使用正常小鼠急性肺部感染模型评价抗体的感染后给药对抗感染的保护作用。具体而言，使用5周龄的BALB/c雄性小鼠（Charles Riverlaboratories Japan,inc.,n=12）。在氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉下以2.84或4.49x10⁵CFU/20μl/小鼠的量（约14或22LD50）给每只小鼠经鼻接种悬浮于盐水中的ATCC29260菌株（E/O11血清型）。8小时后，以200μl/小鼠的量经尾部静脉给予样本，并在接种7天后的存活率的基础上判断对抗所述感染的保护活性。结果显示，在感染后第7天，以100、500或2500μg/小鼠的量给予免疫球蛋白制剂Venilon（TEIJIN PHARMA LIMITED）的对照组的存活率分别为0、25和33.3%，并且ED50估算为4650.69μg/小鼠。相反，在感染后第7天，以0.16、0.8、4和20μg/小鼠的量给予抗体1656的组的存活率分别为8.3、58.3、83.3和100%，并且ED50估算为0.80μg/小鼠。感染后给药也显示出对抗所述感染的强保护活性。

对肺进行组织病理学观察。结果显示，感染24小时后，在感染对照组和Venilon处理的组中观察到出血性和化脓性肺炎的组织病理学发现，例如中性白细胞向肺泡、血管壁、支气管和细支气管中的浸润，以及血管周围的强烈水肿。相反，在1656抗体处理的组中，中性白细胞向支气管和血管中的浸润减少，并缓解了肺炎。此外，观察到巨噬细胞的存在，表明向愈合阶段的过渡发生在较早阶段。同时，在感染后第8天，在1656抗体处理的组中肺炎被治愈达到不再观察到肺炎的程度。

(12)对肺部感染模型3的作用

使用以MDRP诱发的正常小鼠急性肺部感染模型评价对抗感染的保护作用。具体而言，使用5周龄的BALB/c雄性小鼠（Charles Riverlaboratories Japan,inc.,n=6）。在氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉下以4.26x10⁶CFU/20μl/小鼠的量（约4.2LD50）对每只小鼠经鼻接种悬浮于盐水中的MSC 06120菌株（E/O11血清型，MDRP）。之后立即以200μl/小鼠的量经尾部静脉给予样本，并在接种7天后的存活率的基础上评价对抗所述感染的保护活性。结果显示，在感染后第7天，以40、200、1000和5000μg/小鼠的量给予免疫球蛋白制剂Venilon（TEIJIN PHARMA LIMITED）的对照组的存活率分别为0、0、0和33.3%，并且ED50估算为5000μg/小鼠。在感染后第7天，以1.6、8和40μg/只小鼠的量给予抗-PcrV的抗体M166的组的存活率分别为0、0和16.7%，并且ED50估算为>40μg/小鼠。相反，在感染后第7天，以0.32、1.6、8、40和200μg/小鼠的量给予抗体1656的组的存活率分别为0、16.7、66.7、83.3和100%，显示出对抗所述感染的强保护活性，并且ED50估算为6.31μg/小鼠。

(13)对肺感染模型4的作用

使用以MDRP诱发的正常小鼠急性肺部感染模型评价抗体的感染后给药对抗感染的保护作用。具体而言，使用5周龄的BALB/c雄性小鼠（Charles River laboratories Japan,inc.,n=6或12）。在氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉下以2.90或3.78x10⁶CFU/20μl/小鼠的量（约2.9或3.7LD50）给每只小鼠经鼻接种悬浮于盐水中的MSC 06120菌株（E/O11血清型）。8小时后，以200μl/小鼠的量经尾部静脉给予样本，并在接种7天后的存活率的基础上评价对抗所述感染的保护活性。结果显示，在感染后第7天，以40、200、1000和5000μg/小鼠的量给予免疫球蛋白制剂Venilon（TEIJIN PHARMA LIMITED）的对照组的存活率分别为0、8.3、25和0%，并且ED50估算为>5000μg/小鼠。在感染后第7天，以1.6、8、40和200μg/小鼠的量给予抗-PcrV的抗体M166的组的存活率分别为0、0、8.3和0%，并且ED50估算为>200μg/小鼠。相反，在感染后第7天，以1.6、8、40和200μg/小鼠的量给予抗体1656的组的存活率分别为25、8.3、58.3和58.3%，并且ED50估算为70.22μg/小鼠。感染后给药也显示出对抗所述感染的强保护活性。

(14)对烧伤创面感染模型1的作用

使用正常小鼠烧伤创面感染模型评价对抗感染的保护作用。具体而言，使用7周龄的C57BL/6J雄性小鼠（Charles River laboratories Japan,inc.,n=8）。在感染的前一天，在异氟烷（isoflurane）麻醉下用动物电动剃刀（National）和除毛膏（Kanebo Cosmetics Inc.）将每只小鼠的背部剃毛。在感染日，在氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉下使已剃毛的背部（2x3cm）与87℃的热水接触8秒，之后立即在室温下于无菌水中浸泡8秒。然后，将0.5ml盐水给予至腹腔中，然后将悬浮于盐水中的ATCC29260菌株（E/O11血清型）以0.86或1.0x10⁴CFU/100μl/小鼠的量（约81或94LD50）接种于伤口部位处的皮下组织，借此诱发感染。之后立即以200μl/小鼠的量经尾部静脉给予样本，并在接种14天后的存活率的基础上评价对抗所述感染的保护活性。结果显示，在感染后第14天，以40、200、1000和5000μg/小鼠的量给予免疫球蛋白制剂Venilon（TEIJINPHARMA LIMITED）的对照组的存活率分别为37.5、87.5、87.5和87.5%，并且ED50估算为37.825μg/小鼠。在感染后第14天，以0.8、4、20和100μg/小鼠的量给予抗-PcrV的抗体M166的组的存活率分别为12.5、50、37.5和50%，并且ED50估算为63.30μg/小鼠。相反，在感染后第14天，以0.0064、0.032、0.16和0.8μg/小鼠的量给予抗体1656的组的存活率分别为37.5、50、100和87.5%，显示出对抗所述感染的强保护活性，并且ED50估算为0.015μg/小鼠。

(15)对烧伤创面感染模型2的作用

用正常小鼠烧伤创面感染模型评价抗体的感染后给药对抗感染的保护作用。具体而言，使用7周龄的C57BL/6J雄性小鼠（Charles Riverlaboratories Japan,inc.,n=8至10）。在感染的前一天，在异氟烷麻醉下用动物电动剃刀（National）和除毛膏（Kanebo Cosmetics Inc.）将每只小鼠的背部剃毛。在感染日，在氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉下使已剃毛的背部（2x3cm）与87℃的热水接触8秒，之后立即在室温下于无菌水中浸泡8秒。然后将0.5ml盐水给予至腹腔中，然后将悬浮于盐水中的ATCC29260菌株（E/O11血清型）以1.23或1.62x10⁴CFU/100μl/小鼠的量（约116或153LD50）接种于伤口部位处的皮下组织，借此诱发感染。25小时后，以200μl/小鼠的量经尾部静脉给予样本，并在接种14天后的存活率的基础上评价对抗所述感染的保护活性。结果显示，在感染后第14天，以200、1000和5000μg/小鼠的量给予免疫球蛋白制剂Venilon（TEIJIN PHARMA LIMITED）的对照组的存活率分别为0、62.5和87.5%，并且ED50估算为1059.51μg/小鼠。在感染后第14天，以4、20和100μg/小鼠的量给予抗-PcrV的抗体M166的组的存活率分别为12.5、12.5和22.2%，并且ED50估算为>100μg/小鼠。相反，在感染后第14天，以0.16、0.8、4和20μg/小鼠的量给予了抗体1656的组的存活率分别为33.3、66.7、88.9和88.9%，并且ED50估算为0.35μg/小鼠。抗体的感染后给药也显示出对抗所述感染的强保护活性。

[实施例3]抗E血清型LPS的抗体1656和具有广泛反应活性的抗-LPS的抗体2459的结合

-对肺部感染模型的作用-

使用正常小鼠急性肺部感染模型评价抗E血清型LPS的抗体1656和具有广泛反应活性的抗-LPS的抗体2459（识别铜绿假单胞菌的脂多糖的A-带LPS并与A、B、C、D、E、G、H、I、M、N、O18和O19血清型的铜绿假单胞菌菌株中至少一个的表面牢固地结合的抗体；记载于SEQ ID NO:17-19中的轻链CDR 1-3的氨基酸序列，记载于SEQ ID NO:20-22中的重链CDR 1-3的氨基酸序列，记载于SEQ ID NO:23中的轻链可变区的氨基酸序列，记载于SEQ ID NO:24中的重链可变区的氨基酸序列，记载于SEQ ID NO:29中的轻链可变区的碱基序列，记载于SEQ IDNO:30中的重链可变区的碱基序列）的结合使用的作用。具体而言，使用5周龄的BALB/c雄性小鼠（Charles River laboratories Japan,inc.,n=6）。在氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉下以3.34x10⁵CFU/20μl/小鼠的量（约9LD₅₀）给所述小鼠经鼻接种悬浮于盐水中的ATCC29260菌株（E/O11血清型）。之后立即以200μl/小鼠的量经尾部静脉给予样本，并在接种7天后的存活率的基础上判断对抗所述感染的保护活性。结果显示，感染对照组中的所有小鼠都在感染后3天内死亡。在感染后第7天，以0.2、0.4和0.8μg/小鼠的量给予抗体2459的组的存活率分别为0、16.7和0%。因此，抗体2459是无效的。在感染后第7天，以0.2μg/小鼠的量给予抗E血清型LPS的抗体1656的组的存活率为33.3%。相反，令人惊奇地，在感染后第7天，共同给予了上述二者的组——即，分别给予0.2、0.4和0.8μg/小鼠的抗体2459与0.2μg/小鼠的抗体1656的组合的组——的存活率分别为66.7、83.3和100%，显示出依赖于抗体2459剂量的改进。发现抗E血清型LPS的抗体1656和具有广泛反应活性的抗-LPS的抗体2459的结合使用提供了协同效应。

-在SPR测量中的作用-

为了确证抗E血清型LPS的抗体1656和具有广泛反应活性的抗-LPS的抗体2459的结合使用的作用，用含有1,2-二肉豆蔻基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱（DMPC）（Sigma,P7331）作为基质磷脂且含有获自铜绿假单胞菌菌株ATCC29260和在实施例2中制备的LPS E/O11的脂质体进行表面等离子共振（SPR）测量。已知SPR测量是一种允许实时分析分子相互作用而不用标记，并且已广泛用于分析抗原-抗体反应的方法。

通过用ProteOn XPR 36系统（Bio-Rad）作为SPR测量装置、ProteOnGLM芯片（Bio-Rad,176-5012）作为传感芯片和pH为7.4的PBS缓冲液（Sigma，D5652）作为流动相进行所述测量。

将DMPC溶解——以达到10mM——于PBS缓冲液或含有0.4mg/ml的LPS E/O11的PBS缓冲液中。在进行冷冻-解冻操作5次后，用Mini-Extruder（Anti Polar Lipids,Inc）使每种混合物通过100-nm滤膜21次，借此制备均匀的脂质体。

为产生固定脂质体所必需的疏水性，将十一胺（Sigma，94200）以1%溶解于二甲基亚砜（nacalai tesque，13445-74），并用pH为5.0的ProteOn Acetate缓冲液（Bio-Rad，176-2122）将所得溶液稀释20倍。然后，用ProteOn胺偶联试剂盒（Bio-Rad，176-2410）将十一胺固定在传感芯片上。在固定有十一胺的芯片上，固定含有LPS E/O11作为配体的脂质体和作为阴性对照的不含LPS的脂质体。使用抗体2459和实施例2中制备的抗体1656作为分析物，其用所述流动相制成具有200nM的相同浓度，以用于测量。将抗体2459或抗体1656注入所述传感芯片，流速设为30μl/分钟，结合时间设为2分钟。之后，将与所述已注射的抗体相同的抗体或其它抗体另外以相同的方式注射。在通过减去所述不含LPS的脂质体的吸收所获得的值和所述流动相单独获得的值而获得的感应图（sensor grams）上进行双参考（double reference）。因此，用仅针对LPSE/O11的特异性结合进行评价。

图3显示所得感应图。即使在抗E血清型LPS的抗体1656或具有广泛反应活性的抗-LPS的抗体2459结合之后，仍观察到所述两种抗体中另一种抗体以与该抗体单独结合时的方式相同的方式结合。

这些结果显示抗体1656识别的表位不同于抗体2459识别的表位，并且抗体1656和抗体2459能够同时结合。

[工业实用性]

本发明的抗体具有优良的对抗铜绿假单胞菌的抗菌活性，并因此可用于治疗或预防铜绿假单胞菌感染。可将本发明的抗体结合以形成对大范围的临床上分离出来的菌株显示出有效抗菌活性的多克隆制剂。此外，本发明的抗体是人抗体，并因此是高度安全的。因此，本发明的抗体极其适用于医疗护理。此外，本发明的单克隆抗体可用于铜绿假单胞菌感染的诊断、各种血清型的铜绿假单胞菌菌株的检测或筛选，等等。