CN101454446A - 绿脓杆菌的外膜蛋白pa0427 - Google Patents

绿脓杆菌的外膜蛋白pa0427 Download PDF

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Abstract

本发明的目的旨在提供用于诊断、预防或治疗与绿脓杆菌相关的疾病的蛋白质抗原或肽抗原和抗所述抗原的抗体。根据本发明，提供了衍生自绿脓杆菌外膜蛋白PA0427的蛋白质或肽和针对它们的抗体，用于诊断、预防或治疗与绿脓杆菌相关的疾病。

Description

绿脓杆菌的外膜蛋白PA0427
技术领域
本发明涉及衍生自绿脓杆菌外膜蛋白PA0427的蛋白质抗原或肽抗原和针对该抗原的抗体。本发明也涉及包含该抗原的疫苗组合物。本发明还涉及包含所述抗体的药物组合物、用于绿脓杆菌感染的诊断剂和用于检测绿脓杆菌的试剂盒。
背景技术
绿脓杆菌(铜绿假单孢菌(Pseudomonas aeruginosa))是广泛分布于自然环境例如土壤和水中的革兰氏阴性杆菌，引起抵抗治疗的严重致命感染。绿脓杆菌的主要感染对象是通常称作易感染性宿主的、宿主防御功能减弱的易感患者，包括烧伤、器官移植和癌症患者。绿脓杆菌是院内感染的主要病原菌。此外，由这种细菌引起的肺部感染对囊性纤维化患者是致命的。对这些患者主要施用具有抗绿脓杆菌活性的抗菌剂，而众多病例则因绿脓杆菌耐药性而未能获得充分的治疗效果。另外，也已经长时间地研究针对绿脓杆菌的疫苗或抗体。然而，直接使用该细菌灭活形式的方法具有缺点，即必须根据绿脓杆菌的不同血清型制备不同类型的疫苗或抗体。
在这种情况下，期待利用具有绿脓杆菌菌株间共同氨基酸序列的绿脓杆菌蛋白的被动免疫或主动免疫来预防或治疗绿脓杆菌感染。例如，已知其中外膜蛋白OprF和OprI的部分相互融合的重组蛋白(日本特开第245699/1996号公报)和IV型菌毛蛋白(WO2004/099250)作为此种绿脓杆菌蛋白应用于疫苗的情形。
另外，已经报道抗IV型菌毛蛋白抗体(WO2004/099250)、抗PA1706(或PcrV)抗体(美国专利号6309561和6827935)等作为靶向绿脓杆菌蛋白的抗体药物。
然而，在显示多样血清型的绿脓杆菌临床分离株间共同拥有的细菌蛋白可以作为“绿脓杆菌共同抗原”应用于预防、诊断或治疗绿脓杆菌感染，并且因此一直是需要的。
已经报道由PA0427(或oprM)基因编码的PA0427(也称作OprM)蛋白是构成作为绿脓杆菌细胞密度感受的信号分子的高丝氨酸内酯的分泌装置的外膜蛋白，并且作为构成用于排出四环素、氯霉素、喹诺酮(quinolone)和β-内酰胺抗生素的多组分生物异源物质排出泵的外膜蛋白，还直接参与针对这些抗生素的耐药性(Journal of Bacteriology，1998，180，5443-5447和Antimicrobial Agents and Chemotherapy，1995，39，1948-1953)。此外，已经对该蛋白质的三维结构实施了X射线晶体结构分析，显示具有四个跨外膜区的三维结构(Journal of Biological Chemistry，2004，279，52816-52819)。另一方面，也已经报道在动物实验中与野生菌株相比，在编码含有该蛋白质的生物异源物质排出泵的mexA-mexB-oprM操纵子缺损的绿脓杆菌中病原性显著降低，而在仅PA0427基因缺损的变体中病原性不降低(Journal of Experimental Medicine，2002，196，109-118)。还报道将通过该蛋白质免疫获得的抗血清用作免疫印迹中检测蛋白质的试剂(FEMS Microbiology Letters，1994，122，267-274)。然而，靶向PA0427蛋白的抗绿脓杆菌药物是未知的。另外，使用该蛋白质作为疫苗组分和使用由其产生的抗体组合物作为用于绿脓杆菌感染的治疗剂或诊断剂是未知的。
发明简述
本发明人已经尝试从绿脓杆菌外膜蛋白中鉴定新的和有用的“绿脓杆菌共同抗原”。在多次研究后，本发明人已经通过基因芯片分析发现编码存在于绿脓杆菌外膜中的PA0427(也称作OprM)蛋白的基因稳定地表达，无论人血清存在或不存在(实施例1)。另外，本发明人也已经通过对95株绿脓杆菌临床分离株的基因分析发现PA0427蛋白的2个推定胞外区不存在可检测的氨基酸突变并且完全是保守的(实施例2)。此外，本发明人还已经证实用含有PA0427重组蛋白或推定胞外区的肽免疫获得的抗血清或抗体与PA0427蛋白结合(实施例7和8)，该抗体具有调理作用(实施例9)以及该抗体在绿脓杆菌感染的模型小鼠上显示强效的抗感染保护作用(实施例11-13)。本发明基于这些发现。
本发明的目的是提供具有实质的预防或治疗绿脓杆菌感染的能力并且可以对源自绿脓杆菌感染患者的多种临床分离株反应的、能用作疫苗组合物的蛋白质抗原或肽抗原，或是提供针对所述抗原的抗体。
根据本发明，提供了包含可诱导产生抗绿脓杆菌PA0427蛋白抗体的蛋白质抗原或肽抗原的抗原组合物。
根据本发明，提供了选自下列的蛋白质(本文中此后称作“本发明的蛋白质”)：
(i)包含序列编号4的氨基酸序列的蛋白质；
(ii)蛋白质，包含序列编号4中缺失、替换、插入或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列，并且与由序列编号4的氨基酸序列组成的蛋白质功能等同；
(iii)蛋白质，由在严格条件下与编码序列编号4的氨基酸序列的多核苷酸杂交的多核苷酸编码，并且与由序列编号4的氨基酸序列组成的蛋白质功能等同；和
(iv)蛋白质，包含与序列编号4的氨基酸序列具有70％或更大同一性的氨基酸序列，并且与由序列编号4的氨基酸序列组成的蛋白质功能等同。
根据本发明，提供了包含序列编号5的氨基酸序列或序列编号5的含有一个至数个保守性替换的氨基酸序列的肽(本文中此后称作“本发明第一实施方案的肽”)。
根据本发明，提供了包含序列编号6的氨基酸序列或序列编号6的含有一个至数个保守性替换的氨基酸序列的肽(本文中此后称作“本发明第二实施方案的肽”)(本文中此后有时将本发明第一实施方案的肽和本发明第二实施方案的肽统称为“本发明的肽”)。
根据本发明，提供了包含本发明的蛋白质或本发明肽的抗原组合物(本文中此后将这种抗原组合物和包含可诱导产生抗绿脓杆菌PA0427蛋白抗体的蛋白质抗原或肽抗原的抗原组合物统称为“本发明的抗原组合物”)。
根据本发明，提供了用于预防或治疗与绿脓杆菌相关的疾病的疫苗组合物，包含本发明的抗原组合物和任选地一种或多种可药用的载体、稀释剂和/或佐剂。
根据本发明，提供了针对绿脓杆菌PA0427蛋白或其部分的抗体，或其功能性片段(本文中此后称作“本发明的抗体”)。
根据本发明，提供了在保藏号FERM BP-10782下保藏的杂交瘤。
根据本发明，提供了用于预防或治疗与绿脓杆菌相关的疾病的药物组合物，包含本发明的抗体和任选地一种或多种可药用的载体和/或稀释剂。
根据本发明，提供了用于绿脓杆菌感染的诊断剂，包含本发明的抗体。
根据本发明，提供了用于检测绿脓杆菌的试剂盒，包含本发明的抗体。
本发明提供具有实质的预防或治疗绿脓杆菌感染的能力并且还对源自绿脓杆菌感染患者的多种临床分离株反应的疫苗组合物和多克隆抗体或单克隆抗体。它们可以应用于针对绿脓杆菌感染的预防剂或治疗剂或针对绿脓杆菌感染的诊断剂。
此外，本发明的抗体与在绿脓杆菌外膜中或在绿脓杆菌胞外存在的PA0427蛋白的胞外区结合。此外，据估计这些区域是在菌株间极端高度保守的，与血清型等无关，并且与多种临床分离株反应。因此，本发明的抗体预期对绿脓杆菌感染具有高的治疗效果。
附图简述
图1显示pET15b质粒(pET-PA0427-2)。
发明详述
[PA0427蛋白]
PA0427蛋白是衍生自绿脓杆菌的外膜PA0427蛋白。该蛋白质的氨基酸序列和编码该蛋白质的多核苷酸的核苷酸序列分别在序列编号3和序列编号1中描述。
在本上下文中，基于绿脓杆菌PA0427(OprM)蛋白(J.Biol.Chem.，2004，279，52816-52819)的二级结构和三维结构信息、有关大肠杆菌(E.coli)TolC蛋白的三维结构信息(Nature，2000，405，914-919)，估计在作为核苷酸序列序列编号1的氨基酸编码区的1458个核苷酸中第340位至1017位核苷酸的核苷酸序列编码PA0427蛋白的细胞表面暴露部分(序列编号2)。
PA0427蛋白的细胞表面暴露部分是选自下列的蛋白质：
(i)包含序列编号4的氨基酸序列的蛋白质；
(ii)蛋白质，包含序列编号4中缺失、替换、插入或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列，并且与由序列编号4的氨基酸序列组成的蛋白质功能等同；
(iii)蛋白质，由在严格条件下与编码序列编号4的氨基酸序列的多核苷酸杂交的多核苷酸编码，并且与由序列编号4的氨基酸序列组成的蛋白质功能等同；和
(iv)蛋白质，包含与序列编号4的氨基酸序列具有70％或更大同一性的氨基酸序列，并且与由序列编号4的氨基酸序列组成的蛋白质功能等同。
在本说明书中，表述“缺失、替换、插入或添加一个或多个氨基酸”意指已经根据熟知技术方法例如位点定向诱变或通过替换多个氨基酸至天然产生的程度实施了修饰。待修饰氨基酸的数目可以优选地是1-50个、更优选是1-30个，仍更优选是1-10个，仍就更优选是1-5个并且最优选地是1个或2个。
PA0427蛋白的修饰的氨基酸序列可以优选地是序列编号4的氨基酸序列中具有一个或多个(优选地，一个至几个或1、2、3或4个)保守性替换的氨基酸序列。
在本说明书中，术语“保守性替换”意指一个或多个氨基酸残基用化学相似的其它氨基酸残基替换。此类保守性替换的实例包括其中某个疏水性残基用另一个疏水性残基替换的情况，和其中某个极性残基用带相同电荷的另一个极性残基替换的情况。对于每种类型的氨基酸，可以按照如此方式进行替换的功能相似氨基酸是本技术领域已知的。非极性(疏水性)氨基酸的实例包括丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸。极性(中性)氨基酸的实例包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺和半胱氨酸。正电荷(碱性)氨基酸的实例包括精氨酸、组氨酸和赖氨酸。负电荷(酸性)氨基酸的实例包括天冬氨酸和谷氨酸。
在本说明书中，术语“在严格条件下”意指其中杂交后的膜洗涤过程在高温度于具有低盐浓度的溶液中实施的条件。此类洗涤条件可以例如是在60℃的0.5×SSC(1×SSC：15mM柠檬酸三钠和150mM氯化钠)持续15分钟，并且优选地是在60℃的0.5×SSC，0.1％ SDS持续15分钟。
可以根据已知方法实施杂交。在使用商业可获得文库的情况下，可以根据随该文库所包括的说明书中描述的方法实施杂交。
在本说明书中，术语“同一性”就核苷酸序列或氨基酸序列而言，意指所比较的序列间在构成该序列的核苷酸残基或氨基酸残基方面的一致性程度。在本说明书中所述的这种同一性的数值可以使用本领域技术人员已知的同源性检索程序进行计算。例如，这种数值如同一性可以容易地使用FASTA或BLAST中的默认(初始设定)参数进行计算。
与序列编号4的氨基酸序列具有70％或更大同一性的氨基酸序列可以是与前述氨基酸序列具有优选80％或更大、更优选85％或更大、仍更优选90％或更大、仍就更优选95％或更大、特别优选98％或更大和最优选99％或更大同一性的氨基酸序列。
在本发明中，若给出序列编号4的氨基酸序列，则可以容易地确定编码该氨基酸序列的核苷酸序列。因此，可以选择编码序列编号4的氨基酸序列的多种核苷酸序列。
因此，编码包含序列编号4的氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸不仅意指序列编号2所示DNA序列的部分或全部，还意指编码同一氨基酸的DNA序列，其具有以简并关系的密码子作为DNA序列的序列。本发明还包括与这些DNA序列相对应的RNA序列。
编码包含序列编号4的氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸的优选实例包括包含序列编号2的核苷酸序列的多核苷酸。
在本说明书中，某种蛋白质是否与由序列编号4的氨基酸序列组成的蛋白质功能等同可以通过评估生物学现象或功能而确定，其中所述的生物学现象或功能与由序列编号4的氨基酸序列组成的蛋白质的表达相关。例如，这可以通过基因重组技术使这种蛋白质表达并随后评估是否可以制备抗PA0427蛋白的抗体而确定。
因为本发明的蛋白质暴露在绿脓杆菌的细胞表面上，因而该蛋白质可以作为用于制备抗绿脓杆菌抗体的抗原(蛋白质抗原)使用。
在PA0427蛋白的细胞表面暴露部分中，鉴定了不存在可检测的氨基酸突变的以下两个部分(本文中此后称作推定胞外区)：
包含序列编号5的氨基酸序列的肽，或包含序列编号5的含有一个至数个保守性替换的氨基酸序列的肽；和
包含序列编号6的氨基酸序列的肽，或包含序列编号6的含有一个至数个保守性替换的氨基酸序列的肽。
因为本发明的肽暴露在绿脓杆菌的细胞表面上并且在绿脓杆菌中保守，因而该肽可以用作制备抗绿脓杆菌抗体的抗原(肽抗原)。
已经证实该肽在众多的绿脓杆菌临床分离株中不存在可检测的氨基酸突变并且因此有利的之处就在于它们用作绿脓杆菌共同抗原。
对于本发明的肽而言，可以将封闭基团例如添加至肽的氨基末端或羧基末端以防止因电荷所致的聚集。常分别对氨基末端使用乙酰化和和羧基末端使用酰胺化，但不限于这些。本发明的肽可以例如通过对其添加半胱氨酸残基而修饰以增强与间隔物的结合。
DMS(辛二亚氨酸二甲酯)、DMA(己二亚氨酸二甲酯)、磺基-SMCC(磺基琥珀酰亚胺基-4-[N-马来酰亚胺基甲基]环己烷-1-羧酸酯)、MBS(间-马来酰亚胺基苯甲酸-N-羟琥珀酰亚胺酯)、磺基-MBS等通常用作间隔物，但不限于此。可以使用起到间隔物作用的化合物。
对于本发明的肽，载体蛋白例如牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、人血清白蛋白(HSA)、或钥孔血蓝蛋白(KLH)可以用作载体，但不限于这些。
[抗原组合物]
本发明的蛋白质或本发明的肽可以用作蛋白质抗原或肽抗原。因此，根据本发明，提供了包含可诱导产生抗绿脓杆菌外膜PA0427蛋白抗体的蛋白质抗原或肽抗原的抗原组合物。
在本上下文中，蛋白质抗原或肽抗原可以优选地通过根据本领域技术人员众所周知的方法纯化本发明的蛋白质或本发明肽而使用。
在本说明书中，术语“抗原组合物”可以是仅由所述蛋白质抗原或肽抗原组成的组合物或包含这种抗原和其它组分的组合物。
根据本发明，提供了包含可诱导产生抗绿脓杆菌PA0427蛋白抗体的蛋白质抗原或肽抗原的抗原组合物。
[疫苗组合物]
本发明的抗原组合物可以用作疫苗。因此，根据本发明，提供了包含可诱导产生抗绿脓杆菌外膜PA0427蛋白抗体的抗原组合物的疫苗组合物。
根据本发明，可以制备用于预防或治疗与绿脓杆菌相关的疾病的疫苗组合物，包含本发明的抗原组合物和任选地一种或多种可药用的载体、稀释剂和/或佐剂。
在本发明的疫苗组合物中使用的载体基于施用模式和途径和实际的标准药物制剂进行选择，并且可以例如是载体蛋白(例如牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、人血清白蛋白(HSA)和匙孔血蓝蛋白(KLH))、增溶剂(例如乙醇、聚山梨酸酯、和Cremophor ELTM)、等渗剂、防腐剂、抗氧化剂、赋形剂(例如乳糖、淀粉、微晶纤维素、甘露醇、麦芽糖、磷酸氢钙、轻质无水硅酸和碳酸钙)、粘合剂(例如淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素和阿拉伯胶)、润滑剂(例如硬脂酸镁、滑石和氢化油)和稳定剂(例如乳糖、甘露醇、麦芽糖、聚山梨酸酯、Macrogol和聚氧乙烯氢化蓖麻油)。可以根据需要添加甘油、二甲基乙酰胺、70％乳酸钠、表面活性剂或碱性物质(例如氢氧化钠、乙二胺、乙醇胺、碳酸氢钠、精氨酸、葡甲胺、或三氨基甲烷)等。
特别地，本发明的肽可以与作为载体蛋白的已知KLH溶液(Calbiotec公司制，每毫升50％甘油溶液溶解125mg)偶联，以增强本发明疫苗组合物的抗原性。
在本发明疫苗组合物中使用的稀释剂基于施用模式和途径和实际的标准药物制剂而选择。稀释剂的实例包括水、生理盐水、磷酸盐缓冲生理盐水和碳酸氢盐溶液。
在本发明疫苗组合物中使用的佐剂基于施用模式和途径和实际的标准药物制剂而选择。佐剂的实例包括霍乱毒素、大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)、脂质体和免疫刺激性复合体(ISCOM)。
施用途径可以根据具有绿脓杆菌感染风险的受者的年龄、体重、性别和总体健康而不同，但是施用可以通过经口施用和肠胃外施用(例如静脉内注射、动脉内注射和局部施用)的任一途径而实施。在它们当中，优选肠胃外施用。
用于经口施用和肠胃外施用的剂型及其制备方法是本领域技术人员众所周知的。用于经口施用和肠胃外施用的剂型可以通过常规方法，例如通过将本发明的抗原组合物与例如前述可药用的载体混合而制备。
用于经口施用的剂型实例包括固体和液体剂型如溶液剂、片剂、颗粒剂、散剂或胶囊剂。
用于肠胃外施用的剂型实例包括溶液剂、混悬剂、软膏剂、乳膏剂、栓剂、眼药剂、滴鼻剂和滴耳剂。
若需要本发明制剂的持续释放，则可以添加生物可降解聚合物(例如聚-D，L-丙交酯共乙交酯或聚乙交酯)作为增容基质(见例如美国专利号5,417,986、4,675,381和4,450,150)。
在经口施用的情况下，也可以添加香味剂和着色剂。
合适的药物载体和稀释剂等以及为了使用它们所需的物质在Remington’s Pharmaceutical Sciences中描述。
本发明疫苗组合物的剂量由本发明人基于疫苗抗原的类型、本发明的抗原是否与佐剂组合施用、与本发明抗原共同施用的佐剂的类型、施用模式和频率以及希望的效果(例如预防或治疗效果)而确定，并且通常可以是每个成人1μg/剂量-100mg/剂量。当本发明疫苗与佐剂一起施用时，剂量可以通常是每个成人1ng/剂量-1mg/剂量。这种剂量可以根据本发明人的决定按照需要施用数次。例如，可以实施初始接种和间隔1周时间的后续3次加强接种。另外，加强注射和第二次加强注射可以使用相同制剂距离初次免疫第8至第12周以及第16至第20周分别实施。
[抗体]
本发明的抗体可以识别绿脓杆菌外膜PA0427蛋白或其部分，并且与绿脓杆菌结合。
根据本发明，提供了本发明的抗体或其功能性片段，其中绿脓杆菌PA0427蛋白的部分是绿脓杆菌PA0427蛋白的细胞表面暴露部分。
根据本发明，提供了本发明的抗体(本文中此后称作“本发明第一实施方案的抗体”)，其中绿脓杆菌PA0427蛋白的部分是本发明的蛋白质。
根据本发明，提供了本发明的抗体(本文中此后称作“本发明第二实施方案的抗体”)，其中绿脓杆菌PA0427蛋白的部分是本发明第一实施方案的肽。
根据本发明，提供了本发明的抗体(本文中此后称作“本发明第三实施方案的抗体”)，其中绿脓杆菌PA0427蛋白的部分是本发明第二实施方案的肽。
此种抗体包括识别本发明的蛋白质并与绿脓杆菌结合的抗体。该抗体还包括识别本发明肽的抗体。
本发明的抗体优选地通过用包含纯化的本发明蛋白质抗原或肽抗原的抗原组合物免疫实验动物而获得，其中所述的抗原组合物以可以诱导抗体的量施用。这种抗体可以通过从心脏或动脉收集血液、从中分离抗血清并纯化获得的抗血清而作为纯抗体使用。
本发明的抗体包括：使用PA0427蛋白或肽作为抗原并用所述抗原来免疫哺乳动物例如小鼠而获得的多克隆抗体或单克隆抗体(其包括由产生本发明单克隆抗体的杂交瘤所产生的单克隆抗体)；由基因重组技术制备的嵌合抗体和人源化抗体；和使用产生人抗体的转基因动物等制备的人抗体。
当本发明的抗体作为药物施用至人时，人抗体因副作用降低而优选地使用。
“人抗体”意指其中全部区域衍生自人的抗体。本发明的人抗体可以使用本领域技术人员众所周知的方法制备(见例如Intern.Rev.Immunol，1995，13，65-93；J.Mol.Biol，1991，222，581-597；日本特开第146194/1998号公报；日本特开第155492/1998号公报；日本专利号2938569；日本特开第206387/1999号公报；日本特表第509612/1996号公报；和日本特表第505107/1999号公报)。
“人源化抗体”是通过仅植入小鼠抗体的抗原结合位点(CDR；互补决定区)的基因序列至人抗体基因(CDR移植)而制备的抗体。本发明的人源化抗体可以使用本领域技术人员众所周知的方法(见例如EP239400和WO90/07861)制备。
“嵌合抗体”是这样的抗体，其通过连接某种抗体的可变区至不同物种抗体的恒定区而制备。具体地，小鼠用抗原免疫，并且与该抗原结合的抗体可变区(V区)从小鼠单克隆抗体的基因中被切下。随后使如此获得的V区连接至衍生自人骨髓的抗体恒定区(C区)基因，以制备嵌合抗体。本发明的嵌合抗体可以使用本领域技术人员众所周知的方法(见例如日本特开第280387/1996号公报和美国专利号4816397、4816567和5807715)制备。
本发明单克隆的抗体可以使用本领域技术人员众所周知的方法制备(见例如抗体：实验手册(Antibodies：A Laboratory Manual)，编者Harlow和David Lane，冷泉港实验室(Cold Spring Harbor Laboratory)(1988)；单克隆抗体：实验手册(Experimental Manual for Monoclonal Antibody)，Sakuji Toyama等编辑，Kodansha(1987)；和单克隆抗体：杂交瘤和ELISA(Monoclonal Antibody：Hybridoma and ELISA)，Tatsuo Iwasaki等编辑，Kodansha(1987))。
本发明的多克隆抗体可以使用本领域技术人员众所周知的方法制备。
“功能性片段”根据本发明意指抗体的部分(部分片段)，其特异性地识别本发明的蛋白质。这种功能性片段的具体实例包括Fab、Fab’、F(ab’)2、可变区片段(Fv)、二硫键连接的Fv和单链抗体(scFv)及它们的聚合物。
本发明第一实施方案的抗体的优选实例包括针对这样的蛋白质的抗体和其功能性片段，其中所述的蛋白质包含序列编号4的氨基酸序列或包含了含有一个至数个保守性替换的序列编号4的氨基酸序列。
本发明第二实施方案的抗体的优选实例包括针对这样的肽的抗体及其功能性片段，其中所述的蛋白质包含序列编号5的氨基酸序列或包含序列编号5的含有一个至数个保守性替换的氨基酸序列。
本发明第三实施方案的抗体的优选实例包括通过在FERM BP-10782下保藏的杂交瘤产生的单克隆抗体。
因此，根据本发明，提供了于2007年2月8日保藏在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(
Figure A200780019805D0016102545QIETU
305-8566，日本茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)的保藏号为FERM BP-10782的杂交瘤(0427-L2-1)。
本发明的抗体优选是单克隆抗体。
根据本发明，提供了这样的单克隆抗体，其与由本发明杂交瘤产生的单克隆抗体所针对的同一抗原发生交叉反应。
根据本发明，提供了可以与绿脓杆菌结合的抗体，其由动物自身的免疫系统应答本发明的抗原组合物而产生。
[抗体的用途和药物组合物]
与绿脓杆菌相关的疾病
绿脓杆菌是因宿主抵抗力降低而造成致命后果的机会感染病原体。另外，绿脓杆菌耐受抗生素并且因此是医院内感染的主要病原菌。如稍后在实施例中显示，证实本发明的第三实施方案的抗体具有调理作用(实施例9)。还证实本发明的抗血清在巨噬细胞功能因施用粘蛋白而降低的绿脓杆菌易感性小鼠模型上确实具有抗感染保护作用(实施例11)，并且在嗜中性粒细胞水平因施用一水合环磷酰胺而降低的绿脓杆菌易感性小鼠模型上确实具有抗感染保护作用(实施例12)。还证实本发明的第三实施方案的抗体在多药耐药性绿脓杆菌易感性小鼠模型上确实具有抗感染保护作用(实施例13)。因此，本发明用于预防或治疗与绿脓杆菌相关的疾病。
与绿脓杆菌相关的疾病的实例包括由绿脓杆菌感染包括多药耐药性绿脓杆菌感染引起的全身感性疾病，例如败血症、脑膜炎和心内膜炎。与绿脓杆菌相关的疾病的其它实例包括：耳鼻喉学领域的中耳炎和鼻窦炎；肺脏学领域的肺炎、慢性呼吸道感染和气管感染；外科领域的术后腹膜炎和胆管术后感染等；眼科领域的眼睑脓肿、泪囊炎、结膜炎、角膜溃疡、角膜脓肿、全眼球炎和眼眶感染；和泌尿外科学领域的泌尿道感染(包括复杂的泌尿道感染)、导管感染和肛周脓肿。其它实例包括烧伤(包括重度烧伤和呼吸道烧伤)、褥疮感染和囊性纤维化。
本发明第三实施方案的抗体是特别有用的，因为预期它有效地预防或治疗难以治疗的多药耐药性绿脓杆菌感染。还证实本发明第一实施方案的抗体与本发明第二实施方案的肽结合(实施例7和8)。因此，本发明第一实施方案的抗体可以预期具有相同的作用。
根据本发明，提供了本发明抗体的用途，用于产生针对与绿脓杆菌相关的疾病的预防剂或治疗剂。
根据本发明，提供了用于预防或治疗与绿脓杆菌相关的疾病的方法，包括施用预防性或治疗性有效量的本发明抗体至哺乳动物(包括人)的步骤。
用于绿脓杆菌感染的诊断剂
如稍后在实施例中所示，证实本发明第一实施方案的抗体分别与本发明的蛋白质、本发明第一实施方案的肽、本发明第二实施方案的肽结合(实施例7)。也证实本发明的第二实施方案的抗体与本发明的蛋白质及本发明第一实施方案的肽结合(实施例7)。还证实本发明的第三实施方案的抗体与本发明的蛋白质及本发明第二实施方案的肽结合(实施例7)。另外，证实本发明的第一至第三实施方案的抗体与暴露在绿脓杆菌细胞表面上的PA0427蛋白的胞外区结合(实施例8)。
这些结果表明本发明的抗体可以用来检测绿脓杆菌的存在。因此，本发明的抗体用于诊断绿脓杆菌感染。
根据本发明，提供了使用本发明抗体用于诊断绿脓杆菌感染的方法。
本发明的诊断方法可以通过如此方式实施，即收集生物样本，例如来自哺乳动物(包括具有绿脓杆菌感染风险的人)的痰、肺洗出液、脓、泪、血液或尿，随后将收集的样品与本发明的抗体接触，以及确定是否发生抗原-抗体反应。
用于绿脓杆菌感染的诊断药试剂盒
根据本发明，提供了用于检测绿脓杆菌存在的试剂盒，其至少包含本发明的抗体。
本发明的抗体可以被标记。该检测试剂盒通过检测抗原-抗体反应而检测绿脓杆菌的存在。
因此，本发明的检测试剂盒还可以含有多种类型的用于实施抗原-抗体反应的试剂、所用的二次抗体(例如在ELISA中)、生色试剂、缓冲液、说明书和/或根据需要的仪器。
药物组合物
本发明的药物组合物或药剂可以组合物的形式使用，其中所述的组合物包含本发明的抗体作为活性成分，优选地含有纯化的抗体和任选地含有其它成分，例如生理盐水、葡萄糖水溶液或磷酸盐缓冲液。
本发明的药物组合物可以根据需要配制成液体或冷冻干燥的形式。此种药物组合物可以任选地含有可药用的载体，例如稳定剂、防腐剂和等渗剂。
可药用载体的实例可以包括：用于冷冻干燥制剂的甘露醇、乳糖、蔗糖和人白蛋白；和用于液体制剂的生理盐水、注射用水、磷酸盐缓冲液和氢氧化铝，但不限于这些实例。
施用途径可以根据受者的年龄、体重、性别和总体健康而不同，但是施用可以通过经口施用和肠胃外施用(例如静脉内注射、动脉内注射和局部施用)途径而实施。在它们当中，优选肠胃外施用。
药物组合物的剂量根据患者的年龄、体重、性别和总体健康、绿脓杆菌感染的严重性和待施用的抗体组合物的成分而不同。本发明抗体组合物的日剂量对于静脉内注射通常是0.1-1000mg/kg每个成人体重、优选地1-100mg/kg每个成人体重。
优选本发明的药物组合物应当事先施用至具有绿脓杆菌感染风险的患者。
当药物组合物制备为诊断剂时，这种诊断剂可以通过采用适合此目的的任意手段以任意剂型获得。例如对腹水、含有目的抗体的培养液或经纯化抗体测量抗体滴度并且以PBS(含有生理盐水的磷酸缓冲液)等适度地稀释，并且随后对其添加防腐剂例如0.1％叠氮钠。另外，还对吸附至乳胶等的本发明抗体测定抗体滴度并且适度地稀释，并对其添加防腐剂以便使用。这种与乳胶粒子结合的本发明抗体是作为诊断剂的优选剂型之一。在这种情况下，适宜的树脂材料例如聚苯乙烯、聚甲基苯乙烯或聚丁二烯是作为乳胶而适用的。
实施例
本文中此后，本发明将参考用于促进理解本发明的实施例而描述。然而，本发明将不限于这些实施例。
实施例1：基因芯片(R)分析
使用基因芯片表达分析系统(Affymetrix，基因芯片绿脓杆菌基因组阵列)作为用于鉴定在补充了人血清的培养基中所表达基因的方法。使用绿脓杆菌PAO1株(ATCC BAA-47)在3种不同培养条件即在补充0％、20％和50％人血清的Luria-Bertani(LB)培养基(Nacalai Tesque)(LB培养基的最终组成在它们之间相同)中在37℃实施振荡培养直至吸光度在595nm处达到1.0。使用RNeasy Protect Bacteria Mini试剂盒(QIAGEN GmbH)，总RNA根据在该试剂盒所包括的文件中描述的方法提取并使用2100生物分析仪(Agilent Technologies)定量。随后，实验根据随基因芯片包括的文件中所述的方法进行。使用Microarray Suite 5.0(Affymetrix)分析基因表达数据，并且计算信号及检测。在此时，实施校正，使来自全部探针组的信号的平均值是1000。实施了两个独立的实验。
作为结果，在全部培养条件下，无论添加的血清存在或不存在，将显示检测到转录产物确定为：作为持家蛋白的PA4761蛋白(DnaK或HSP70)是“存在”的，并且因此证实该基因表达。另外，确定作为与PAS158(OprM)和PA2019(MexX)蛋白结合以构成药物排出泵的内膜跨越蛋白并受到核糖体抑制剂例如四环素或氨基糖苷类抗生素诱导的PA2018蛋白(MexY)(J.Bacteriology，2005，187，5341-5346)在没有前述那些药物的这些条件下是“不存在”的，并且因此证实该基因不表达。相反，在全部培养条件下，无论添加的血清存在或不存在，确定PA0427基因是“存在”的。
因此，PA0427基因必定表达，并且提出这样的可能，即PA0427基因产物PA0427蛋白在细菌表面上恒定存在。这提示绿脓杆菌PA0427蛋白可用作疫苗成分。
实施例2：分析临床分离株中的PA0427基因
所用的细菌菌株是95株绿脓杆菌菌株(保管于横滨研究所，Meiji SeikaKaisha)，分离自日本各地临床机构的多种类型临床材料并进行测试。这些菌株源自血液、尿、痰、脓、咽粘液等，并且基于根据日本绿脓杆菌协会(1975)所赞助的血清分型委员会决定，进行血清学分类法，它们的血清型包括A、B、E、F、G、I、M等组。
(1)基因组DNA的制备
95株绿脓杆菌临床分离株的每一株在37℃在Mueller-Hinton培养基(Becton Dickinson)中培养过夜并通过低速离心加以收集。使用DNeasy组织试剂盒(QIAGEN GmbH)，根据随该试剂盒所包括的文件中描述的方法，从获得的细菌细胞中制备基因组DNA。
(2)通过PCR方法扩增DNA片段
使用制备的基因组DNA作为模板，通过PCR扩增了含有PA0427基因的区域。具体而言，用于特异性扩增每一基因的引物组(序列编号7和序列编号8)基于绿脓杆菌PAO1菌株基因组的序列(NCBI登录号NC_002516)设计。使用GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystems)，使用Takara ExTaq(Takara Bio)根据其中所包括的说明书实施PCR。如此由PCR扩增的DNA片段通过琼脂糖凝胶电泳证实具有目的大小(1628bp)。
(3)使用DNA测序仪分析多核苷酸序列
PCR产物使用MultiScreen PCR板(Millipore Corporation)纯化并且随后进行测序反应。能够对每种PCR产物测序的引物(序列编号9至序列编号13)基于PAO1菌株的基因组序列(NC_002516)设计。在测序反应中使用BigDye Terminator vl.1循环测序试剂盒(Applied Biosystems)。使用GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystems)根据其中所包括的说明书实施测序反应。使用事先以水溶胀的Sephadex G-50Fine DNAGrade(Amersham Biosciences AB)所填充的MultiScreen-HV板(MilliporeCorporation)纯化测序反应产物。随后，使用Applied Biosystems 3730 DNA分析仪(Applied Biosystems)分析多核苷酸序列。
将临床分离株中通过所述分析而测定的多核苷酸序列转换成多肽序列，并且这些多肽序列与来自PAO1菌株的多肽序列进行比较。作为结果，在PA0427蛋白的全长序列中观察到3处突变(表1)。
不过，独自地推测的推定胞外区(序列编号5和序列编号6)证实不存在可检测的氨基酸突变，其中所述的推定胞外区由本发明人基于有关绿脓杆菌PA0427蛋白的二级结构和三维结构信息(J.Biol.Chem.，2004，279，52816-52819)以及有关大肠杆菌TolC蛋白的三维结构信息(Nature，2000，405，914-919)而预测。这提示绿脓杆菌PA0427蛋白可用作“绿脓杆菌共同抗原”。
[表1]
临床分离株中的PA0427蛋白的突变形式
Figure A200780019805D00221
“-”代表与PAO1菌株中氨基酸相同的氨基酸。
实施例3：PA0427基因DNA片段的克隆
使用载体pIVEX2.4d(Roche Diagonstics)来克隆在作为绿脓杆菌PA0427基因(序列编号1)的氨基酸编码区的1458个核苷酸中第340位至1017位核苷酸的DNA片段(序列编号2)并且通过以下方法整合入表达载体pET15b(Novagen)。
基于有关与PA0427蛋白同源的大肠杆菌TolC蛋白的结构分析信息(Nature，2000，405，914-919)，估计所述氨基酸编码区中第1至第339位核苷酸和第1018至第1458位核苷酸的核苷酸序列编码细胞表面非暴露区域，因此，将这些核苷酸序列从克隆对象中排除。
待克隆的DNA片段从绿脓杆菌PAO1菌株的基因组DNA中通过PCR(DNA Thermal Cycler 480；Perkin-Elmer)扩增。使用Pyrobest(TakaraShuzo)作为DNA聚合酶。反应溶液补充以5％二甲基亚砜。含有用于添加限制性位点NcoI(CCATGG)和PstI(CTGCAG)及终止子的核苷酸的引物(序列编号14和序列编号15)用作PCR引物。
PCR温度条件包括在94℃加热2分钟，随后是由94℃30秒、60℃1分钟和72℃2分钟构成的30次循环。PCR产物使用GenElute PCR DNA纯化试剂盒(Sigma)加以纯化，并且纯化产物用NcoI和PstI(均来自NewEngland Biolabs)消化。PIVEX2.4d用NcoI和PstI消化。这些DNA片段在琼脂糖凝胶上电泳，并且使用QIA快速凝胶提取试剂盒(Qiagen)提取和纯化。使用T4DNA连接酶(Invitrogen)连接如此以NcoI-PstI消化的PCR产物和pIVEX2.4d，并且大肠杆菌DH5α菌株(高感受态DH5α，Toyobo)以连接产物转化。使用QIAprep Spin Miniprep试剂盒(Qiagen)纯化其中已经掺入PA0427基因片段的pIVEX2.4d质粒(pIVEX-PA0427-1)，并且使用BigDye Terminator v1.1循环测序试剂盒(Applied Biosystems)，通过循环测序反应而证实插入物的核苷酸序列(3730DNA分析仪，AppliedBiosystems/HITCHI)。
接下来，pET15b用NdeI(New England Biolabs)和BamHI(Toyobo)消化。另外，使用pIVEX-PA0427-1作为模板，使用与位于插入物上游的区域配对的PCR引物(序列编号16)和含有用于添加限制性位点BglII(AGATCT)和终止密码子的核苷酸的PCR引物(序列编号17)扩增插入片段，并将PCR产物用紧邻NcoI位点上游的NdeI以及用BglII(Toyobo)消化。用BamHI及用BglII消化后的突出末端是彼此互补的。因此，将这些消化的DNA片段连接，用连接产物转化大肠杆菌，以获得其中已经掺入PA0427基因片段的pET15b质粒(pET-PA0427-2)(图1)。
实施例4：PA0427重组蛋白的表达和纯化
在重组蛋白的表达中使用其中已经并入T7RNA聚合酶基因的大肠杆菌BL21(DE3)菌株和具有T7启动子的pET载体表达系统(Novagen)。大肠杆菌表达载体pET-PA0427-2是编码在T7启动子下游融合有His标签(6个连续组氨酸)的PA0427部分蛋白的质粒(见实施例3)。BL21(DE3)菌株用氯化钙处理(见分子克隆(Molecular Cloning)，第二版，Sambrook等(1989))并以pET-PA0427-2转化。转化体在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中培养过夜，并将它们悬浮(稀释200倍)于新鲜培养基内并且在37℃培养4小时。随后，通过添加终浓度0.5mM的IPTG而诱导表达，并继续培养额外3小时。通过离心收集细胞并将其冷冻在-20℃。将细胞溶解于B-PER细菌蛋白提取试剂(Pierce)中，并且将含有已表达蛋白质的不溶性部分收集并以终浓度100μg/ml的溶菌酶(卵清溶菌酶，SeikagakuCorporation)处理，随后用补充以1％ Triton X-100的Dulbecco′s磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)洗涤。
在蛋白质纯化中使用了利用His-标签的Ni螯合层析。如此表达和制备的的不溶性蛋白质用溶解缓冲液(补充有8M尿素、5mM咪唑、200mMNaCl和0.05％NP-40的PBS)增溶。溶解的蛋白质结合至Ni-NTA琼脂糖(Qiagen)并用40体积的溶解缓冲液洗涤。蛋白质进一步用40体积的洗涤缓冲液(除NP-40外，具有如溶解缓冲液那样的相同组成)洗涤。随后，His-标签-融合蛋白用洗脱缓冲液(补充有8M尿素、300mM咪唑和200mMNaCl的PBS)洗脱，随后收集。
作为结果，最终从115ml大肠杆菌培养物中获得2.0mg蛋白质。
实施例5：用抗原免疫和制备抗血清
绿脓杆菌PA103菌株(ATCC29260)在37℃在Mueller-Hinton琼脂培养基上培养过夜。将几个菌落在LB培养基中悬浮并且随后在37℃振荡培养过夜，并将它们用PBS洗涤，随后重悬。随后，通过添加1％福尔马林进行灭活处理24小时或更长时间，并且使用如此灭活的菌株(本文此后有时称作“福尔马林灭活的PA103菌株＂)。
为在免疫中使用，将PA0427重组蛋白溶解在8M尿素溶液中，产生100μg/ml的浓度。
PA0427蛋白中胞外区的氨基酸序列由本发明人基于有关绿脓杆菌PA0427蛋白的二级结构和三维结构信息(J.Biol.Chem.，2004，279，52816-52819)以及有关大肠杆菌TolC蛋白的三维结构信息(Nature，2000，405，914-919)而推测。
含有所推测的氨基酸序列(序列编号5和序列编号6)的肽通过使用Fmoc的固相合成法合成。由序列编号5的氨基酸序列组成的肽(本文此后有时称作“0427L1”)作为含有序列编号5的氨基酸序列的合成肽而合成。其中半胱氨酸残基添加至序列编号6的氨基酸序列羧基末端的肽(本文此后有时称作“0427L2Q”)作为含有序列编号6的氨基酸序列的合成肽(序列编号18)。通过质谱在由序列编号5的氨基酸序列组成的合成肽0427L1中观察到[M+1]m/z1592.94(计算值：m/z1591.77)，并且由HPLC分析对这种合成肽给出在13.199分钟保留时间处具有面积比71.1％的峰。另外，通过质谱在含有序列编号6的氨基酸序列的合成肽0427L2Q中观察到[M+1]m/z1615.51(计算值：m/z1613.84)，并且由HPLC分析对这种合成肽给出在16.75分钟保留时间处具有面积比74.7％的峰。每种合成肽通过间隔物与钥孔血蓝蛋白(KLH)偶联，以制备KLH缀合的肽，并且这些KLH缀合的肽分别命名为0427L1-KLH和0427L2Q-KLH。使用DMS(辛二亚氨酸二甲酯.2HCl，Pierce，目录号20700)或磺基-MBS(间-马来酰亚胺基苯甲酸-N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯，Pierce，目录号22312)作为间隔物。委托ThermoELECTRON进行肽的合成。
对每只动物分别免疫与佐剂联合的20μg的福尔马林灭活PA103菌株、PA0427重组蛋白和KLH缀合肽。在对动物的施用方法中，雄性BN大鼠(从日本Charles River实验室购买)以总计6次注射进行皮下或肌内免疫，首次注射联合使用弗氏完全佐剂并且后续注射联合使用不完全佐剂，间隔时间2周。最后一次免疫1周后，从腹主动脉收集全血，并且全血在室温下搁置1小时并随后在1500G离心20分钟，以获得具有约5ml/大鼠的血清的上清液。
实施例6：从抗血清中纯化IgG级分
根据例如McCauley R & Racker，E；Molecular and CellularBiochemistry 1，73-81(1973)的方法从大鼠抗血清中纯化IgG级分。添加冰冷的饱和硫酸铵溶液(pH8)以制备43(v/v)％混悬液，并且获得的混悬液在室温搅拌15分钟。沉淀物通过在10,000×g离心20分钟而收集并且在补充有10％甘油的10mM磷酸钾缓冲液(pH8)中溶解。随后，沉淀物通过添加冰冷的饱和硫酸铵溶液(pH 8)以制备50(v/v)％溶液而再次沉积，从而完成2次洗涤。沉淀物在补充有10％甘油的10mM磷酸钾缓冲液(pH8)中溶解，并且随后对该缓冲液透析过夜。将透析液离心并且随后进行阴离子交换层析(DEAE-Toyopearl650M(Tosoh))。将流过的体积通过测定在280nm的紫外吸收而作为IgG级分收集。收集的级分使用AmiconUltra-15(Millipore)予以浓缩，并且缓冲液最终与PBS(-)溶液交换，以获得最终样品。通过纯化而从5ml的PA0427重组蛋白免疫的大鼠抗血清中收集14.5mg蛋白质作为IgG级分，并且该级分命名为抗PA0427IgG。蛋白质根据基于Lowry法的DC蛋白质测定法(Bio-Rad)定量，并且通过SDS-PAGE评估IgG纯度。
例如，使用Harlow和Lane等人于抗体：实验手册(Antibodies，ALaboratory Manual)，冷泉港(Cold Spring Harbor)(1988)第8章288-318的方法作为简单的备选方法。向其中已经通过在10,000×g离心20分钟而除去不溶物质的大鼠抗血清的上清液添加2体积的60mM乙酸钠(pH4.0)，并且pH随后以1N盐酸调节至4.8。在室温逐步添加相对于该抗血清的0.06体积辛酸，并将混合物搅拌30分钟，以产生不溶物质。通过在13,000×g离心10分钟，然后将所获得的溶液通过0.45μm滤器。所获得的样品使用Amicon Ultra-15(Millipore)浓缩，并将缓冲液最终与PBS(-)溶液交换，以获得最终样品。根据这种方法，通过纯化而从KLH缀合肽(即0427L1-KLH或0427L2Q-KLH)免疫的大鼠血清各30ml中分别收集68mg和27mg蛋白质作为IgG级分，并且这些级分分别命名为抗0427L1IgG和抗0427L2Q IgG。蛋白质根据基于Lowry法的DC蛋白质测定法(Bio-Rad)定量，并且通过SDS-PAGE评估IgG纯度。
实施例7：ELISA试验
为了通过ELISA方法检测与PA0427重组蛋白或每一合成肽0427L1和0427L2Q结合的抗体，将PA0427重组蛋白溶解在补充有8M尿素的PBS中，并且合成肽0427L1和0427L2Q各自溶解在碳酸盐缓冲液(0.15％Na2CO3，0.3％NaHCO3)中。所述蛋白质或肽置于96孔ELISA板(MaxiSorp Type，NUNC)内。该板置于4℃过夜，以引起固定。板随后用PBS洗涤并以补充有0.5％ BSA的PBS封闭。随后，将实施例6中获得的每种纯化的IgG级分作为样品添加至孔内并且允许在室温反应。该板用含有0.05％吐温20的PBS洗涤。随后向该板添加二次抗体(过氧化物酶标记的山羊抗大鼠IgG抗体，10000倍稀释，Sigma)添加并且允许其在室温与该板反应，并且随后洗涤该板。酶反应通过添加显色底物(TMB微孔过氧化物酶底物系统，KPL公司制)而实施，并且随后用1M磷酸溶液终止酶反应。测定在450nm处的吸光度。
作为结果，当PA0427重组蛋白被固定时，抗PA0427IgG级分的吸光度是0.961。相反，作为阴性对照的假大鼠IgG级分的吸光度是0.080。这表明在抗PA0427IgG级分中含有与作为免疫原的PA0427重组蛋白相结合的抗体(IgG)。另外，抗PA0427L1IgG级分和抗PA0427L2Q IgG级分的吸光度分别是0.353和0.751。
备选地，当合成肽0427L1被固定时，抗PA0427IgG级分的吸光度是0.750。相反，作为阴性对照的假大鼠IgG级分的吸光度是0.015。这表明在抗PA0427IgG级分中含有与由推定胞外区之一的氨基酸序列(序列编号5)组成的合成肽0427L1相结合的抗体(IgG)。抗PA0427L1 IgG级分的吸光度是0.117，并且这表明在该级分中也含有与合成肽0427L1相结合的抗体(IgG)。相反，抗PA0427L2Q IgG级分的吸光度是0.034，并且这表明在该级分中不含与合成肽0427L1相结合的抗体(IgG)。
另外，当合成肽0427L2Q被固定时，抗PA0427IgG级分的吸光度是0.569。相反，作为阴性对照的假大鼠IgG级分的吸光度是0.063。这表明在抗PA0427IgG级分中含有与包含推定胞外区之一的氨基酸序列(序列编号6)的合成肽0427L2Q相结合的抗体(IgG)。抗PA0427L2Q IgG级分的吸光度是0.361，并且这表明在该级分中也含有与合成肽0427L2Q相结合的抗体(IgG)。相反，抗PA0427L1 IgG级分的吸光度是0.101，并且这表明在该级分中不含与合成肽0427L2Q相结合的抗体(IgG)。
实施例8：完整细胞ELISA(whole cell ELISA)试验
对于完整细胞ELISA，在LB培养基中过夜培养的PA103菌株的细菌溶液以浓度100μL/孔分配至96孔ELISA板(MaxiSorp Type，NUNC)，随后在4℃固定1小时。该板随后用洗涤缓冲液(含有0.05％吐温20的TBS)洗涤并以封闭缓冲液(含有2％牛血清白蛋白的TBS)封闭。此后，将实施例6中获得的每种纯化的IgG级分添加至孔内并且允许其在37℃反应1小时。洗涤后，向其添加二次抗体(过氧化物酶标记的山羊抗大鼠IgG抗体，5000倍稀释，Sigma)添加并且允许在室温与其反应30分钟，并且随后洗涤该板。酶反应通过添加显色底物(TMB微孔过氧化物酶底物系统，KPL公司制)而实施，并且随后用1M磷酸溶液终止酶反应。测定在450nm处的吸光度。
作为结果，抗PA0427IgG级分的吸光度是0.713，而作为阴性对照的假大鼠IgG级分的吸光度是0.240。这表明在抗PA0427IgG中含有识别暴露在绿脓杆菌细胞表面上的PA0427蛋白胞外区的抗体(IgG)。另外，抗PA0427L1IgG级分和抗PA0427L2Q IgG级分的吸光度分别是0.555和0.596。这表明在这些样品中也含有识别暴露在绿脓杆菌细胞表面的PA0427蛋白胞外区的抗体(IgG)。
实施例9：调理作用证实试验
使用小鼠嗜中性粒细胞对绿脓杆菌的吞噬作用作为指标，研究实施例6中从0427L2Q-KLH免疫的大鼠血清获得的纯化IgG级分(抗0427L2QIgG)的调理作用
腹膜内施用8％酪蛋白溶液至雄性BALB/c小鼠(从日本Charles River实验室购买)。6小时后，收集腹腔细胞。腹腔细胞通过离心进行洗涤并随后以浓度2×106个细胞/mL悬浮在RPMI-1640培养基(Gibco)中。将该细胞和经4％多聚甲醛处理的荧光标记的绿脓杆菌PA103菌株以25:1的比例在大鼠补体(ICN Biomedicals)和抗0427L2Q IgG存在下或从仅施用佐剂而获得的对照大鼠血清中纯化的IgG存在下混合培养1.5小时。在如此培养后，用流式细胞仪(Epics LX II，Coulter)测量吞噬的绿脓杆菌。嗜中性粒细胞区域是门控的，并且测定10,000个细胞的荧光强度。使用平均荧光强度作为调理作用的指标。
作为结果，在100μg/mL和200μg/mL抗0427L2Q IgG存在下，与绿脓杆菌一起培养的嗜中性粒细胞的平均荧光强度分别是0.39和0.52，而在100μg/mL和200μg/mL对照IgG存在下，与绿脓杆菌一起培养的嗜中性粒细胞的平均荧光强度分别是0.36和0.41，因而证实抗0427L2Q IgG的调理作用。
实施例10：单克隆抗体(MAb)的制备
在实施例5中用含有推定胞外区(SEQ ID NO：6)的KLH缀合肽0427L2Q-KLH初次免疫后1周，联合不完全佐剂进行加强免疫，其中所述的推定胞外区由本发明人基于有关绿脓杆菌PA0427蛋白的二级结构和三维结构信息(J.Biol.Chem.，2004，279，52816-52819)以及有关大肠杆菌TolC蛋白的三维结构信息(Nature，2000，405，914-919)而预测。三日后，在麻醉下无菌地取出膝下淋巴结。获得的淋巴结用RPMI-1640培养基(Gibco)洗涤，并将它们随后夹入载玻片的磨砂部分之间并压碎，以便获得作为微小片的淋巴结细胞样品。获得的淋巴结细胞通过使用RPMI-1640培养基于1000转/分钟离心5分钟而洗涤。另一方面，骨髓瘤细胞(P3X63Ag8U1细胞)在5％ CO2、相对湿度100％和37℃下在含有10％FCS(胎牛血清)的RPMI-1640培养基中预培养，并且如此培养的在对数生长期间的骨髓瘤细胞通过使用RPMI-1640培养基离心而洗涤并且与前述淋巴结细胞混合，以至于使淋巴结细胞数对骨髓瘤细胞数的比例变成约4:1。混合的细胞在1000转/分钟离心5分钟。弃去上清液并充分地使细胞疏松。对含有细胞的离心管，温和地添加1mL由2g聚乙二醇(分子量1000，WakoPure Chemical Industries)、2mL RPMI-1640培养基和0.2mLDMSO(Nacalai Tesque)组成的溶液。细胞通过缓慢地旋转离心管而混合。1分钟后，缓慢地旋转离心管，同时15mL RPMI-1640培养基经3分钟添加至该离心管。细胞在1000转/分钟离心5分钟。随后，弃去上清液并充分地使细胞疏松。此后，将细胞悬浮在50mL的HT培养基(Gibco)中并培养过夜。此后，细胞通过在1000转/分钟离心10分钟而收集并悬浮在10mL的RPMI培养基中，并且细胞溶液随后添加至含有90mL甲基纤维素HAT选择培养基(Stem Cell Technologies公司制)的瓶中并充分地混合。在这种甲基纤维素培养基中的混合细胞以浓度10mL/皿接种至9cm培养皿中。细胞在5％CO2、相对湿度100％和37℃下培养。在10-14日后，观察到在甲基纤维素培养基上培育的杂交瘤集落。挑出这些集落并在96孔微量培养板中进一步培养几日。
(1)筛选目的抗体
与PA0427重组蛋白或含有推定胞外区(序列编号6)的合成肽(序列编号18)结合的抗体通过实施例7中描述的ELISA而检测。另外，与绿脓杆菌细胞表面结合的抗体通过实施例8中描述的完整细胞ELISA而检测。
(2)克隆产生目的抗体的细胞
使用含有5％ BM-Condimed H1杂交瘤克隆补充物(RocheDiagnostics)的10％ FCS/HT(Gibco)培养基将通过筛选确定产生目的抗体的杂交瘤调整至1个杂交瘤/0.2mL，并以浓度0.2mL/孔分配至96孔板的孔内，随后培养。1至2周后，克隆通过在“筛选”项目中所述的方法分析，以选出产生目的抗体的单克隆。作为结果，获得保藏在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心的保藏号为FERM BP-10782的杂交瘤。
(3)细胞的体外培养和MAb的产生
在96孔微量板中充分增殖的目的克隆在24-孔板、50-mL烧瓶和250-mL烧瓶逐阶段放大并在10％ FCS-RPMI培养基中培养。对如此所获细胞的培养上清中产生的MAb由实施例7中描述的ELISA检测。
在用于检测与其上未吸附肽、吸附合成肽0427L1(序列编号5)或合成肽0427L2Q(SEQ ID NO：18)的孔相结合的这种ELISA中，以保藏号FERMBP-10782保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心的杂交瘤的培养上清的吸光度分别是0.049、0.049和0.610，这证实产生了与合成肽0427L2Q(序列编号18)特异性结合的MAb。
(4)在体内细胞的腹水化和MAb的产生
向BALB/c-nu/nu小鼠(从日本Charles River实验室购买)以浓度1×107个杂交瘤/小鼠腹膜内施用以保藏号FERM BP-10782保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心的杂交瘤。1至2周后，收集腹水。在腹水中含有的MAb通过实施例6中所述的方法纯化，并将获得的纯化IgG级分命名为抗0427L2Q(48-5)IgG。使用单克隆抗体同种型分型试剂盒(RMT1，Dainippon Pharmaceutical)，确定这种大鼠MAb的IgG亚类对于重链和轻链分别是IgG2a和κ。
与PA0427重组蛋白或合成肽(序列编号18)结合的抗体通过实施例7中所述的ELISA方法检测。
作为结果，在用于检测与其上已经吸附PA0427重组蛋白的孔相结合的这种ELISA中，抗0427L2Q(48-5)的吸光度是0.906，而作为阴性对照的假大鼠IgG的吸光度是0.080，证实产生了与该蛋白质结合的MAb。
另外，在用于检测与其上已经吸附合成肽0427L2Q(序列编号18)的孔相结合的ELISA中，抗0427L2Q(48-5)的吸光度是0.585，而作为阴性对照的假大鼠IgG的吸光度是0.063，证实产生了与该肽结合的MAb。
实施例11：PA0427重组蛋白免疫的大鼠血清在正常小鼠中防御PA103菌株全身感染的能力
在用正常小鼠全身感染模型的评估中，将悬浮在500μ1含有5％粘蛋白的生理盐水中的PA103菌株以剂量7.0×104cfu/小鼠(14LD50)腹膜内施用至4周龄雄性CD-1小鼠(从日本Charles River实验室购买)。此后立即，按照剂量10ml/kg从尾静脉施用以生理盐水稀释5倍的血清样品。7天后，基于存活而确定抗感染的保护性活性。
作为结果，在作为阴性对照的仅施用佐剂而获得的假大鼠血清的组中7只小鼠有5只死亡，并且剩余的2只小鼠存活。相反，在已经施用了实施例5获得的福尔马林灭活的PA103菌株免疫血清的组中全部小鼠存活，因此证实经福尔马林灭活的PA103菌株免疫的大鼠血清具有抗感染的保护性活性。在这种条件下，在已经施用了实施例5获得的PA0427重组蛋白免疫的大鼠血清的组中7只小鼠有6只存活，因此证实PA0427重组蛋白免疫的大鼠血清具有抗感染的保护性活性。
实施例12：PA0427重组蛋白免疫的大鼠血清和纯化IgG级分在中性白细胞减少的小鼠中防御PA103菌株全身感染的能力
在用中性白细胞减少的小鼠的全身感染模型进行的评估中，制备12.5mg/mL(生理盐水)环磷酰胺(本文此后称作CY，Sigma-Aldrich)并将其以125mg/kg剂量在第-5、-2和0日(总计3次投药)腹膜内施用至4周龄雄性CD-1小鼠，以降低外周血中的嗜中性粒细胞水平。随后，悬浮在250μ1生理盐水中的PA103菌株以剂量1.0×105cfu/小鼠(74LD50)腹膜内施用至小鼠。此后立即，从尾静脉以剂量10ml/kg或20ml/kg施用每种样品(血清样品用生理盐水稀释5倍，并且每种纯化的IgG级分用生理盐水调整至2.5mg/ml)。7天后，基于存活而确定抗感染的保护性活性。
作为结果，当大鼠血清用作样品时，在已经施用作为阴性对照的通过仅施用佐剂所获得的假大鼠血清的组中全部小鼠死亡。相反，在已经施用了实施例5中获得的福尔马林灭活的PA103菌株免疫的大鼠血清的组中全部小鼠存活，因此证实经福尔马林灭活的PA103菌株免疫的大鼠血清具有抗感染的保护性活性。在这种条件下，在已经施用在实施例5中获得的PA0427重组蛋白免疫的大鼠血清的组中7只小鼠有5只存活。因此证实PA0427重组蛋白免疫的大鼠血清具有抗感染的保护性活性。
另外，当纯化的IgG级分用作样品(0.5mg/小鼠)时，在施用作为阴性对照的假大鼠IgG的组中7只小鼠中6只死亡，并且剩余的1只小鼠存活。相反，在已经施用抗PA103IgG的组内7只小鼠有5只存活，其中所述的抗PA103IgG从福尔马林灭活的PA103菌株免疫的大鼠血清获得。因此证实这种抗PA103IgG具有抗感染的保护性活性。在这种条件下，在已经施用在实施例6中获得的抗0427L1IgG的组中7只小鼠有5只存活。因此证实抗0427L1IgG具有抗感染的保护性活性。另外，在已经施用在实施例6中获得的抗0427L2Q IgG的组中7只小鼠有4只存活。因此证实抗0427L2Q IgG具有抗感染的保护性活性。进一步地，在施用实施例10中获得的作为大鼠MAb的抗0427L2Q(48-5)IgG的组中7只小鼠有4只存活。因此证实抗0427L2Q(48-5)IgG具有抗感染的保护性活性。
实施例13：纯化的IgG级分对中性白细胞减少的小鼠防御多药耐药性绿脓杆菌全身感染的能力
多种类型抗菌剂对多药耐药性绿脓杆菌MSC06120菌株的最小生长抑制浓度是：亚胺青霉烯(imipenem)：32μg/ml，丁胺卡那霉素：64μg/ml，和环丙沙星：>256μg/ml。制备12.5mg/ml(生理盐水)的CY并以剂量125mg/kg在第-5、-2和0天共三次腹膜内施用至4周龄雄性CD-1小鼠，以降低外周血的中性白细胞水平。随后，悬浮在250μl生理盐水中的MSC06120菌株以剂量0.925×105cfu/小鼠(8.3LD50)腹膜内接种至所述小鼠。此后，每种纯化的IgG样品立即以剂量20ml/kg(0.5mg/小鼠)从尾静脉施用。7天后，基于存活而确定抗感染的保护性活性。
作为结果，作为阴性对照的7只施用大鼠假IgG的小鼠中有4只死亡，并且剩余的3只小鼠存活。但是，施用抗PA103 IgG的组中7只小鼠有6只存活，其中所述的抗PA103IgG从福尔马林灭活的PA103菌株免疫的大鼠血清中获得。因此证实抗PA103IgG具有抗感染的保护性活性。在这种条件下，施用实施例6中获得的抗0427L2Q IgG的组中7只小鼠有5只存活。因此证抗0427L2Q IgG具有抗感染的保护性活性。
序列表
<110>明治制果株式会社
<120>绿脓杆菌的外膜蛋白PA0427
<130>165648PX
<150>JP 2006-095996
<151>2006-03-30
<160>18
<170>PatentIn版本3.4
<210>1
<211>1458
<212>DNA
<213>绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)
<400>1
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<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成肽
<400>18

Claims (20)

1.抗原组合物，其包含能够诱导产生抗绿脓杆菌PA0427蛋白抗体的蛋白质抗原或肽抗原。
2.蛋白质，其选自：
(i)包含序列编号4的氨基酸序列的蛋白质；
(ii)蛋白质，包含序列编号4中缺失、替换、插入或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列，并且与由序列编号4的氨基酸序列组成的蛋白质功能等同；
(iii)蛋白质，由在严格条件下与编码序列编号4的氨基酸序列的多核苷酸杂交的多核苷酸编码，并且与由序列编号4的氨基酸序列组成的蛋白质功能等同；和
(iv)蛋白质，包含与序列编号4的氨基酸序列具有70％或更大同一性的氨基酸序列，并且与由序列编号4的氨基酸序列组成的蛋白质功能等同。
3.肽，其包含序列编号5的氨基酸序列或序列编号5的含有一个至数个保守性替换的氨基酸序列。
4.肽，其包含序列编号6的氨基酸序列或序列编号6的含有一个至数个保守性替换的氨基酸序列。
5.抗原组合物，其包含根据权利要求2所述的蛋白质或根据权利要求3或4所述的肽。
6.用于预防或治疗与绿脓杆菌相关的疾病的疫苗组合物，其包含根据权利要求1或5所述的抗原组合物，和任选地一种或多种可药用的载体、稀释剂和/或佐剂。
7.针对绿脓杆菌PA0427蛋白或其部分的抗体或抗体的功能性片段。
8.根据权利要求7所述的抗体或抗体的功能性片段，其中绿脓杆菌PA0427蛋白的部分是绿脓杆菌PA0427蛋白的细胞表面暴露部分。
9.根据权利要求8所述的抗体或抗体的功能性片段，其中绿脓杆菌PA0427蛋白的细胞表面暴露部分选自：
(i)包含序列编号4的氨基酸序列的蛋白质；
(ii)蛋白质，包含序列编号4中缺失、替换、插入或添加一个或多个氨基酸的氨基酸序列，并且与由序列编号4的氨基酸序列组成的蛋白质功能等同；
(iii)蛋白质，由在严格条件下与编码序列编号4的氨基酸序列的多核苷酸杂交的多核苷酸编码，并且与由序列编号4的氨基酸序列组成的蛋白质功能等同；和
(iv)蛋白质，包含与序列编号4的氨基酸序列具有70％或更大同一性的氨基酸序列，并且与由序列编号4的氨基酸序列组成的蛋白质功能等同。
10.根据权利要求8所述的抗体或抗体的功能性片段，其中绿脓杆菌PA0427蛋白的细胞表面暴露部分是包含序列编号5的氨基酸序列的肽或包含序列编号5的含有一个至数个保守性替换的氨基酸序列的肽。
11.根据权利要求8所述的抗体或抗体的功能性片段，其中绿脓杆菌PA0427蛋白的细胞表面暴露部分是包含序列编号6的氨基酸序列的肽或包含序列编号6的含有一个至数个保守性替换的氨基酸序列的肽。
12.根据权利要求11所述的抗体或抗体的功能性片段，其通过在保藏号FERM BP-10782下保藏的杂交瘤产生。
13.根据权利要求7至12任一项中所述的抗体或抗体的功能性片段，其中抗体是单克隆抗体。
14.在保藏号FERM BP-10782下保藏的杂交瘤。
15.根据权利要求7所述的抗体或抗体的功能性片段，其是与由权利要求14所述杂交瘤产生的单克隆抗体的相同抗原发生交叉反应的单克隆抗体。
16.用于预防或治疗与绿脓杆菌相关的疾病的药物组合物，其包含根据权利要求7至13和15中任一项所述的抗体或抗体的功能性片段，和任选地一种或多种可药用的载体和/或稀释剂。
17.根据权利要求6所述的疫苗组合物或根据权利要求16所述的药物组合物，其中与绿脓杆菌相关的疾病是由绿脓杆菌感染所引起的全身性感染疾病。
18.根据权利要求17所述的疫苗组合物或药物组合物，其中绿脓杆菌感染是多药耐药性绿脓杆菌感染。
19.绿脓杆菌感染的诊断剂，其包含根据权利要求7至13和15任一项中所述的抗体或抗体的功能性片段。
20.用于检测绿脓杆菌的试剂盒，其包含根据权利要求7至13和15任一项中所述的抗体或抗体的功能性片段。
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