KR20080113239A

KR20080113239A - 녹농균의 외막 단백질 ｐａ0427

Info

Publication number: KR20080113239A
Application number: KR1020087025207A
Authority: KR
Inventors: 지로 타나카; 후쿠이치 오사와; 타카후미 오쿠토미; 히로시 나가소; 마사시 쿠마가이; 타카히사 스즈키; 케이코 오오츠카
Original assignee: 메이지 세이카 가부시키가이샤
Priority date: 2006-03-30
Filing date: 2007-03-30
Publication date: 2008-12-29
Also published as: SG170804A1; AU2007232894A1; US8084044B2; WO2007114340A1; US20090117121A1; EP2011867A1; AU2007232894B2; CN101454446A; EP2011867A4; JPWO2007114340A1; CA2645904A1

Abstract

본 발명의 목적은 녹농균과 관련된 질환의 진단, 예방 또는 치료에 사용하기 위한 녹농균에 대한 단백질 또는 펩티드 항원 및 항체를 제공하는 것이다. 본 발명에 따르면, 녹농균과 관련된 질환의 진단, 예방 또는 치료에 사용하기 위한 녹농균 외막 단백질 PA0427로부터 유도된 단백질 또는 펩티드 및 녹농균에 대한 항체가 제공된다.

녹농균, 감염, 항체, 백신

Description

녹농균의 외막 단백질 ＰＡ0427{PSEUDOMONAS AERUGINOSA OUTER MEMBRANE PROTEIN PA0427}

본 발명은 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)의 외막 단백질 PA0427로부터 유래된 단백질 항원 또는 펩티드 항원 및 당해 항원에 대한 항체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 당해 항원을 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 당해 항체를 포함하는 약제학적 조성물, 녹농균 감염 진단제, 녹농균 검출 키트에 관한 것이다.

토양 및 물과 같은 자연 환경에 널리 분포된 그램 음성 간균인 녹농균은 치료에 저항하는 심각한 치사성 감염을 야기한다. 그 주된 표적은 열상, 장기-이식 및 암 환자를 포함하는 일반적으로 결함 숙주(compromised host)라 불리는 감독된 숙주 방어 기능을 가진 결함 환자이다. 녹농균은 병원내 감염의 주요 원인균이다. 또한, 이 균에 의한 폐 감염은 낭포성 섬유증 환자에게 치사성이다. 이들 환자에게 주로 항-녹농균 활성을 가진 항균제가 투여되지만, 많은 경우 녹농균의 약제 내성으로 인해 충분한 치료효과가 얻지 못한다. 대안적으로, 녹농균에 대한 백신 또는 항체에 대해서도 오래전부터 검토되어 왔다. 그러나, 비활성형 균을 직접 사용하는 방법은 다양한 유형의 백신 또는 항체를 녹농균의 혈청형별로 제조해야만 하는 단 점이 있다.

이와 같은 상황에서, 녹농균 균주 중 공통 아미노산 서열을 갖는 녹농균 단백질로 능동 면역 또는 수동 면역을 이용하는 녹농균 감염의 예방 또는 치료가 기대되고 있다. 예를 들면, 외막 단백질 OprF 및 OprI의 일부분을 서로 융합시킨 재조합 단백질(일본 특허 공개공보 제1996-245699호) 및 유형 IV 필린 단백질(W02004/099250)이 녹농균 단백질을 백신에 적용하는 것으로 알려져있다.

또한, 항-유형 IV 필린 항체(W02004/099250), 항-PA1706(또는 PcrV) 항체(미국특허 제6309651호, 제6827935호) 등이 녹농균 단백질을 표적으로 하는 항체 약물이라고 보고되어 있다.

그러나, 다양한 혈청형을 나타내는 녹농균의 임상 분리체 중 일반적으로 존재하는 균체 단백질은 "녹농균 공통항원"으로서 녹농균 감염의 예방, 진단 또는 치료에 적용될 수 있기 때문에 항상 요구되고 있다.

PA0427(또는 oprM) 유전자로 코드화된 PA0427(OprM 라고도 알려짐) 단백질은 녹농균 정족수 감지에서 시그널 분자 역할을 하는 호모세린 락톤의 분비기관을 구성하는 외막 단백질이며, 테트라사이크린, 클로람페니콜, 뉴키노론계 및 베타-락탐계 항생물질을 배출하는 다성분 생체이물질 배출 펌프를 구성하는 외막 단박질로서, 이들 항생물질에 대한 내성 직접 관여한다고 보고되어 있다(Journal of Bacteriology, 1998, 180, 5443-5447; and Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1995, 39, 1948-1953). 또한, 그 입체 구조에 관해서는 X-선 결정 구조 분석이 수행되었고, 4개의 막 관통부위를 갖는 3차원 구조를 나타냈 다(Journal of Biological Chemistry, 2004, 279, 52816-52819). 한편, 동물실험에서, 당해 단백질을 함유하는 생체이물질 배출 펌프를 코드화하는 mexA-mexB-oprM 오페론이 결실된 녹농균은 야생 균주와 비교하면 병원성이 현저히 저하되지만, PA0427 유전자만이 결실된 변이체에서는 병원성이 저하되지 않는다고 보고되어 있다(Journal of Experimental medicine, 2002, 196, 109-118). 또한, 단백질로 면역화해서 얻어진 항혈청은 면역블럿(immunoblot)에서 단백질 검출 시약으로 사용된다고 보고되어 있다(FEMS Microbiology Letters, 1994, 122, 267-274). 그러나, PA0427 단백질을 표적으로 하는 항-녹농균 약물은 알려져 있지 않다. 게다가, 단백질이 백신 성분으로 사용되는지, 그것으로부터 생성되는 항체 조성물이 녹농균 감염 치료약 또는 진단약으로 사용되는지 알려져 있지 않다.

발명의 요약

본 발명자들은 녹농균의 외막 단백질로부터 신규하고 유용한 "녹농균 공통항원"을 동정하는 것을 시도하였다. 여러 가지로 검토한 결과, 본 발명자들은 GeneChip 분석으로 녹농균 외막에 존재하는 PA0427 단백질(또한 OprM라 불림)을 코드화하는 유전자가 인간혈청의 존재 여부에 관계없이 정상적으로 발현된다는 것을 발견하였다(실시예 1). 본 발명자는 또한 95 녹농균 임상 분리체에 대한 유전자 분석을 통하여, PA0427 단백질의 2개의 추정 세포 외 영역은 감지할 수 있는 아미노산 돌연 변이가 없으며, 완전히 보존된다는 것을 발견하였다(실시예 2). 본 발명자들은 또한 PA0427 재조합 단백질 또는 각 추정 세포 외 영역을 함유하는 펩티드로 면역화하여 얻은 항혈청 또는 항체가 PA0427 단백질에 결합하하고(실시예 7 및 8), 당해 항체는 옵소닌 작용을 갖고(실시예 9), 그리고 당해 항체가 녹농균-감염된 모델 마우스의 감염에 대한 강력한 방어효과(실시예 11 내지 13)를 나타내는 것을 확인하였다. 본 발명은 이러한 발견에 기초하였다.

본 발명의 목적은 녹농균 감염을 실질적으로 예방 또는 치료할 수 있고, 녹농균 감염 환자로부터 유래된 임상 분리체의 다양성에 반응할 수 있는 백신 조성물로서 사용되는 단백질 항원 또는 펩티드 항원을 제공하고, 또는 당해 항원에 대한 항체를 제공하는 것이다.

본 발명에 따르면, 녹농균 PA0427 단백질에 대한 항체의 생산을 유도할 수 있는 단백질 항원 또는 펩티드 항원을 포함하는 항원 조성물이 제공된다.

본 발명에 따르면, 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질(이하 "본 발명에 따른 단백질"이라 함)이 제공된다:

(i) SEQ ID NO:4의 아미노산 서열을 포함하는 단백질;

(ii) 하나 이상의 아미노산이 결실, 치환, 또는 삽입된 SEQ ID NO:4의 아미노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO:4의 아미노산 서열로 이루어진 단백질과 기능적으로 동등한 단백질;

(iii) SEQ ID NO:4의 아미노산 서열을 코드화하는 폴리뉴클레오티드와 가혹한(stringent) 조건하에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코드화되고, SEQ ID NO:4의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질과 기능적으로 동등한 단백질; 및

(iv) SEQ ID NO:4의 아미노산 서열과 70% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO:4의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질과 기능적으로 동등한 단백질.

본 발명에 따르면, SEQ ID NO:5의 아미노산 서열 또는 하나 이상의 보존적 치환을 함유하는 SEQ ID NO:5의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드(이하, "본 발명에 따른 제1 태양의 펩티드"라 함)가 제공된다.

본 발명에 따르면, SEQ ID NO:6의 아미노산 서열 또는 하나 이상의 보존적 치환을 함유하는 SEQ ID NO:6의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드(이하, "본 발명에 따른 제2 태양의 펩티드"라 함)가 제공된다(이하, 본 발명에 따른 제1 태양의 펩티드 및 본 발명에 따른 제2 태양의 펩티드를 일괄적으로 "본 발명에 따른 펩티드"라 함).

본 발명에 따르면, 본 발명에 따른 단백질 또는 본 발명에 따른 펩티드를 포함하는 항원 조성물이 제공된다(이하, 이 항원 조성물 및 녹농균 PA0427 단백질에 대한 항체의 생산을 유도할 수 있는 단백질 항원 또는 펩티드 항원을 포함하는 항원 조성물을 일괄적으로 "본 발명에 따른 항원 조성물"이라 함).

본 발명에 따르면, 본 발명에 따른 항원 조성물 및 선택적으로 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 및/또는 보강제를 포함하는 녹농균에 관련된 질환의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 백신 조성물이 제공된다.

본 발명에 따르면, 녹농균 PA0427 단백질 또는 그것의 부분에 대한 항체 또는 그것의 기능적 단편(이하, "본 발명에 따른 항체"라 함)이 제공된다.

본 발명에 따르면, 수탁번호 제FERM BP-10782호에 기탁된 하이브리도마(hybridoma)가 제공된다.

본 발명에 따르면, 본 발명에 따른 항체 및 선택적으로 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석제를 포함하는 녹농균에 관련된 질환의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 약제학적 조성물이 제공된다.

본 발명에 따르면, 본 발명에 따른 항체를 포함하는 녹농균 감염 진단제가 제공된다.

본 발명에 따르면, 본 발명에 따른 항체를 포함하는 녹농균을 검출 키트(kit)가 제공된다.

본 발명은 녹농균 감염을 실질적으로 예방 또는 치료할 수 있고 또한 녹농균 감염 환자로부터 유래된 임상 분리체의 다양성에 반응하는 백신 조성물 및 다클론성 항체 또는 단일클론성 항체를 제공한다. 그것들은 녹농균 감염 예방 또는 치료제 또는 녹농균 감염 진단제에 적용될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 항체는 녹농균의 외막 또는 세포 외에 존재하는 PA0427 단백질의 세포 외 영역에 결합한다. 게다가, 이들 영역은 혈청형 등에 관계 없이 균주에서 보존성이 매우 높고 다양한 임상 분리체와 반응한다고 생각된다. 따라서, 본 발명에 따른 항체는 녹농균 감염에 대해 높은 치료효과를 가지는 것으로 예상된다.

발명의 상세한 설명

[PA0427 단백질]

PA0427 단백질은 녹농균으로부터 유래된 외막 PA0427 단백질이다. 단백질의 아미노산 서열 및 단백질을 코드화하는 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 염기서열은 각각 SEQ ID NO:3 및 SEQ ID NO:1에 기재된다.

여기서, 녹농균 PA0427(OprM) 단백질의 2차 구조 및 3차 구조 정보(J. Biol. Chem., 2004, 279, 52816-52819)와 E. coli TolC 단백질의 3차 구조 정보(Nature, 2000, 405, 914-919)을 기초로, SEQ ID NO:1의 뉴클레오티드 염기서열의 아미노산 코드 영역으로서 1458 뉴클레오티드에 있는 340 내지 1017 뉴클레오티드 염기서열이 PA0427 단백질의 세포 표면-노출 부분을 코드화한다고 생각된다(SEQ ID NO:2).

PA0427 단백질의 세포 표면-노출 부분은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질이다:

(i) SEQ ID NO:4의 아미노산 서열을 포함하는 단백질;

본 명세서에서, 표현 "하나 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 또는 부가됨"이란 부위 특이적 돌연변이 유발법(site directed mutagenesis)과 같은 주지의 방법에 따라서 또는 자발적으로 발생되는 범위까지 다수의 아미노산의 치환에 의해 변형이 이루어진 것을 의미한다. 변형될 아미노산의 개수는 바람직하기는 1 내지 50, 보다 바람직하기는 1 내지 30, 더 바람직하기는 1 내지 10, 보다 더 바람직하기는 1 내기 5 및 가장 바람직하기는 1 또는 2개일 수 있다.

PA0427 단백질의 변형된 아미노산 서열은 바람직하기는 아미노산 서열의 하나 이상의 보존적 치환을 갖는(바람직하기는 하나 이상, 또는 1, 2, 3 또는 4 개) SEQ ID NO:4의 아미노산 서열일 수 있다.

본 명세서에서, 용어 "보존적 치환"이란, 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 화학적으로 유사한 아미노산 잔기와 치환되는 것을 의미한다. 그러한 보존적 치환의 예시는 어떤 소수성 잔기가 다른 소수성 잔기와 치환되는 경우, 그리고 어떤 극성 잔기가 같은 전하를 가진 다른 극성 잔기와 치환되는 경우를 포함한다. 모든 아미노산 유형의 경우, 이와 같은 방법으로 치환될 수 있는 기능적으로 유사한 아미노산이 당해 기술분야에서 공지되어 있다. 비극성(소수성) 아미노산의 예시는 알라닌, 발린, 아이소루신, 루신, 프롤린, 트립토판, 페닐알라닌 및 메티오닌을 포함한다. 극성(중성) 아미노산의 예시는 글리신, 세린, 트레오닌, 티로신, 글루타민, 아스파라긴 및 시스테인을 포함한다. 양전하(염기성) 아미노산의 예시는 알지닌, 히스티딘 및 라이신을 포함한다. 음전하(산성) 아미노산의 예시는 아스파라긴산 및 글루타민산을 포함한다.

본 명세서에서, 용어 "가혹한 조건"이란 상기 혼성화 이후의 막 세정 단계가 고온에서 저염 농도를 갖는 용액에서 실행된다는 것을 의미한다. 그러한 세정 조건은 예를 들면, 15분간 60℃에서 0.5 x SSC 농도(l x SSC: 15mM 구연산 삼나트륨 및 150mM 염화나트륨)및 바람직하기는 15분간 60℃에서 0.5 x SSC 농도인 0.1% SDS일 수 있다.

혼성화는 공지의 방법에 따라 수행될 수 있다. 시판중인 라이브러리(library)를 사용하는 경우, 혼성화는 사용설명서에 기재된 방법에 따라서 수행될 수 있다.

본 명세서에서, 뉴클레오티드 염기서열 또는 아미노산 서열에 대한 "동일성"은 비교되는 염기서열 사이에 뉴클레오티드 잔기 또는 그러한 염기서열을 구성하는 아미노산 잔기가 일치되는 정도를 의미한다. 본 명세서에서 나타낸 "동일성"의 수치는 당업자에게 공지된 상동성 검색 프로그램을 사용하여 계산될 수 있다. 예를 들면, 동일성과 같은 그러한 수치는 FASTA 또는 BLAST의 디폴트(초기 설정) 변수를 이용하여 쉽게 계산될 수 있다.

SEQ ID NO:4의 아미노산 서열과 70% 이상의 동일성을 가진 아미노산 서열은 앞서 말한 아미노산 서열과 바람직하기는 80% 이상, 보다 바람직하기는 85% 이상, 더 바람직하기는 90% 이상, 보다 더 바람직하기는 95% 이상, 특히 바람직하기는 98% 이상 또는 가장 바람직하기는 99% 이상의 동일성을 가진 아미노산 서열일 수 있다.

본 발명에서, SEQ ID NO:4의 아미노산 서열이 주어지면 그것을 코드화하는 뉴클레오티드 염기서열은 쉽게 결정될 수 있다. 그러므로, SEQ ID NO:4의 아미노산 서열을 코드화하는 다양한 뉴클레오티드 염기서열이 선택될 수 있다.

따라서, SEQ ID NO:4의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 코드화하는 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:2의 일부 또는 전체 DNA 염기서열뿐 아니라, DNA 염기서열로서 그것과 함께 퇴화(degeneracy)관계에 있는 코돈을 가지는 동일한 아미노산을 코드화하는 DNA 염기서열도 의미한다. 본 발명은 또한 그러한 DNA 염기서열에 대응되는 RNA 염기서열도 포함한다.

SEQ ID NO:4의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 코드화하는 폴리뉴클레오티드의 바람직한 예시는 SEQ ID NO:2의 뉴클레오티드 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

본 명세서에서, 어떤 단백질이 SEQ ID NO:4의 아미노산 서열로 이루어진 단백질과 기능적으로 동등한지 여부는 SEQ ID NO:4의 아미노산 서열로 이루어진 단백질의 발현과 관련된 생체현상 또는 기능을 평가함으로써 결정될 수 있다. 예를 들면, 어떤 단백질을 유전자 재조합기술에 의해 발현시켜 PA0427 단백질에 대한 항체가 만들어 지는지 여부에 따라 평가하여 결정할 수 있다.

본 발명에 따른 단백질은 녹농균의 세포 표면에 노출되기 때문에, 당해 단백질은 녹농균에 대한 항체를 제조기 위한 항원(단백질 항원)으로 사용될 수 있다.

PA0427 단백질의 세포 표면 노출-부분에서 감지할 수 있는 아미노산 돌연변이가 없는 하기의 두 부분이 동정되었다(이하, " 추정 세포 외 영역"이라 함):

SEQ ID NO:5의 아미노산 서열 또는 하나 이상의 보존적 치환을 함유하는 SEQ ID NO:5의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드; 및

SEQ ID NO:6의 아미노산 서열 또는 하나 이상의 보존적 치환을 함유하는 SEQ ID NO:6의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드.

본 발명에 따른 펩티드는 녹농균의 세포 표면에 노출되고 녹농균에 보존되므로, 당해 펩티드는 녹농균에 대한 항체를 제조하기 위한 항원(펩티드 항원)으로 사용될 수 있다.

당해 펩티드는 다수의 녹농균 임상 분리체에서 감지할 수 있는 아미노산 돌연 변이가 없는 확인되었었으며, 그것들은 녹농균 공통항원으로서 유용한 점에서 유리하다.

본 발명에 따른 펩티드의 경우 예를 들면, 전하에 의한 응집을 막기 위하여 그것들의 N- 또는 C- 말단에 차단기(blocking group)를 부가할 수 있다. 아세틸화(acetylation) 및 아미드화(amidation)가 각각 N- 및 C- 말단에 종종 사용되지만 이것들에 한정되지는 않는다. 본 발명에 따른 펩티드는 스페이서(spacer)와의 결합을 강화시키기 위하여 예를 들면, 거기에 시스테인 잔기를 부가하여 변형될 수 있다.

DMS(디메틸 수베리미데이트), DMA(디메틸 아디피미데이트), Sulfo-SMCC(설포숙시니미딜-4-[N-말레이미도메틸]시클로헥산-l-카복실레이트), MBS(m-말레이미도벤조일-N-하이드록시숙시니미드 에스터), Sulfo-MBS 등이 일반적으로 스페이서로서 사용되나 이에 한정되는 것은 아니다. 스페이서로서 기능을 하는 화합물이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 펩티드의 경우 소혈청 알부민(BSA), 난백 알부민(OVA), 인간혈청 알부민(HSA) 또는 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH: Keyhole limpet hemocyanin)과 같은 담체 단백질이 담체로서 사용될 수 있으나, 이것들에 제한되지 않는다.

[항원 조성물]

본 발명에 따른 단백질 또는 본 발명에 따른 펩티드는 단백질 항원 또는 펩티드 항원으로 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따르면 녹농균 외막 PA0427 단백질에 대한 항체의 생산을 유도할 수 있는 단백질 항원 또는 펩티드 항원을 포함하는 항원 조성물이 제공된다.

여기서, 단백질 항원 또는 펩티드 항원은 바람직하기는 본 발명에 따른 단백질 또는 본 발명에 따른 팹티드를 당업자에게 주지한 방법에 따라 정제하여 사용될 수 있다.

본 명세서에서, 용어 "항원 조성물"이란 단백질 항원 또는 펩티드 항원만으로 이루어진 조성물 또는 그러한 항원 및 다른 성분을 포함하는 조성물일 수 있다.

[백신 조성물]

본 발명에 따른 항원 조성물은 백신으로 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따르면, 녹농균 외막 PA0427 단백질에 대한 항체의 생산을 유도할 수 있는 항원 조성물을 포함하는 백신 조성물이 제공된다.

본 발명에 따르면, 본 발명에 따른 항원 조성물 및 선택적으로 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 및/또는 보강제를 포함하는 녹농균과 관련된 질환의 예방 또는 치료에 사용하는 백신 조성물이 제조될 수 있다.

본 발명에 따른 백신 조성물에 사용되는 담체는 투여 방법 및 경로, 그리고 표준 약물 조성물을 기초로 선택되고 예를 들면, 담체 단백질(즉, 소혈청 알부민(BSA), 난백 알부민(OVA), 인간혈청 알부민(HSA) 및 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH)), 용해제(즉, 에탄올, 폴리솔베이트 및 Cremophor EL^TM), 등장화제, 보존제, 항산화제, 부형제(즉, 락토스, 전분, 결정성 셀룰로오스, 만니톨, 말토스, 인산 수소 칼슘, 경무수 규산 및 탄산칼슘), 결합제(즉, 전분, 폴리비닐피로리돈, 히드록시프로필셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 카복시메틸셀룰로오스 및 아라비아검), 윤활제(즉, 스테아린산 마그네슘, 탈크, 및 경화유 등) 및 안정화제(즉, 락토스, 만니톨, 말토스, 폴리솔베이트, 마크로졸, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유)일 수 있다. 필요에 따라, 글리세린, 디메틸아세트아미드, 70% 젖산 나트륨, 계면활성제 또는 염기성 물질(즉, 수산화 나트륨, 에틸렌디아민, 에탄올 아민, 중탄산 나트륨, 알기닌, 메글루민 또는 트리스아미노메탄) 등을 부가할 수 있다.

구체적으로, 본 발명에 따른 펩티드는 본 발명에 따른 백신 조성물의 항원성을 강화하기 위하여, 담체 단백질로서 공지의 KLH 용액(Calbiotec, 50% 글리세롤 용액 1ml 당 125mg를 용해시킴)과 결합될 수 있다.

본 발명에 따른 백신 조성물에 사용되는 희석제는 투여 방법 및 경로, 그리고 실제 표준 약물 조성물을 기초로 하여 선택될 수 있다. 희석제의 예시는 물, 생리식염수, 인산염 완충 생리식염수 및 중탄산염 용액을 포함한다.

본 발명에 따른 백신 조성물에 사용되는 보강제는 투여 방법 및 경로, 그리고 실제 표준 약물 조성물을 기초로 선택된다. 보강제의 예시는 콜레라 독소, 대장균의 이열성 장독소(LT), 리포좀 및 면역 자극성 복합체(ISCOM)를 포함한다.

투여 경로는 녹농균 감염의 염려가 있는 투여대상의 연령, 체중, 성별 및 일반적인 건강상태에 따라 다를 수 있으나, 투여는 경구투여 및 비경구투여(예를 들면, 정맥 투여, 동맥 투여 및 국소 투여) 경로중 어느 것으로도 투여될 수 있다. 그중에서도, 비경구투여가 바람직하다.

경구투여 및 비경구투여용 제형 및 그것의 제조방법은 당업자에게 주지되어 있다. 경구투여 및 비경구투여용 제형은 통상적인 공정 예를 들면, 발명에 따른 항원 조성물을 예를 들면, 앞서 언급한 약학적으로 허용가능한 담체와 혼합하여 제조될 수 있다.

경구투여용 제형의 예시는 용제, 정제, 과립제, 가루약 또는 캡슐제와 같은 고체 또는 액체 제형을 포함한다.

비경구투여용 제형의 예시는 용제, 현탁제, 연고제, 크림, 좌제, 안제, 점비제 및 점이제를 포함한다.

본 제제의 서방을 원하면, 생물 분해성 폴리머(예를 들면, 폴리-D,L-락티드-코-그리코시드 또는 폴리글리코시드)를 버크 기재에 첨가할 수 있다(예를 들면, 미국특허 제5,417,986호, 제4,675,381호 및 제4,450,150호 참조).

경구투여의 경우, 풍미제 및 착색료가 첨가될 수 있다.

적절한 약제학적 담체 및 희석제 등, 그리고 그것의 사용을 위한 약제학적 필요한 물질은 Remington's Pharmaceutical Sciences에 기재되어 있다.

본 발명에 따른 백신 조성물의 투여량은 백신 항원의 종류, 보강제와 결합된 본 항원의 투여 가능성, 거기에 함께 투여되는 보강제의 종류, 투여 방법 및 빈도, 및 원하는 효과(예를 들면, 예방 또는 치료 효과)를 기초로 본 발명자에 의해 결정되며 일반적으로 성인당 1회 투여시 1㎍ 내지 100mg일 수 있다. 본 백신이 보강제와 함께 투여될 때, 투여량은 일반적으로 성인당 1회 투여시 1㎍ 내지 1mg일 수 있다. 그러한 투여는 필요한 경우 본 발명자의 결정에 따라 수회 투여될 수 있다. 예를 들면, 1 주일 간격으로 초기 백신접종 및 그 다음 3회 보강 백신접종이 수행될 수 있다. 선택적으로, 보강 주사 및 두번째 보강 백신접종은 각각 동일한 제제를 사용하여 첫번째 면역화로부터 8 내지 12번째 주 및 16 내지 20번째 주에 수행될 수 있다.

[항체]

본 발명에 따른 항체는 녹농균 외막 PA0427 단백질 또는 그것의 일부를 인식하고, 녹농균에 결합할 수 있다.

본 발명에 따르면, 녹농균 PA0427 단백질의 일부가 녹농균 PAO427 단백질의 세포 표면-노출 부분인 본 발명에 따른 항체 또는 그것의 기능적 단편이 제공된다.

본 발명에 따르면, 녹농균 PA0427 단백질의 일부가 본 발명에 따른 단백질인본 발명에 따른 항체(이하, "본 발명에 따른 제1 태양의 항체"라 함)가 제공된다.

본 발명에 따르면, 녹농균 PA0427 단백질의 일부가 본 발명에 따른 제1 태양의 펩티드인 본 발명에 따른 항체(이하, "본 발명에 따른 제2 태양의 항체"라 함)가 제공된다.

본 발명에 따르면, 녹농균 유래의 PA0427 단백질의 일부가 본 발명에 따른 제2 태양의 펩티드인 본 발명에 따른 항체(이하, "본 발명에 따른 제3 태양의 항체" 라 함)가 제공된다.

그러한 항체는 본 발명에 따른 단백질을 인식하고 녹농균에 결합하는 항체를 포함한다. 또한, 본 발명에 따른 펩티드를 인식하는 항체를 포함한다.

본 발명에 따른 항체는 바람직하기는 실험동물에 항체를 유도할 수 있는 양으로 투여된 본 발명에 따른 정제된 단백질 항원 또는 펩티드 항원을 포함하는 항원 조성물로 면역화하여 얻어진다. 그러한 항체는 심장 또는 동맥으로부터 추출하고, 항혈청을 분리한 다음, 획득한 항혈청은 정제하여 순수 항체로서 사용될 될 수 있다.

본 발명에 따른 항체는 하기를 포함한다: 항원으로서 PA0427 단백질 또는 펩티드를 사용하여 마우스와 같은 포유동물을 상기 항원으로 면역화하여 얻어진 다클론성 항체 또는 단일클론성 항체(본 발명의 단일클론성 항체를 생산하는 하이브리도마에 의해 생성된 단일클론성 항체를 포함함); 유전자 재조합기술로 제조된 키메라 항체 및 인간화 항체; 및 인간 항체-생성 트랜스제닉(transgenic) 동물 등을 사용하여 제조된 인간 항체.

본 발명에 따른 항체를 약물로서 인간에 투여할 때, 인간 항체는 부작용을 감소시킨다는 면에서 바람직하게 사용된다.

"인간항체"란 모든 영역이 인간으로부터 유래한 항체이다. 본 발명에 따른 인간항체는 당업자에게 주지된 방법(예를 들면, Intern. Rev. ImmunoI, 1995, 13, 65-93; J. Mol. Biol, 1991, 222, 581-597; 일본 특허 공개공보 제1998-146194호; 일본 특허 공개공보 제1998-155492호; 일본 특허 제2938569호; 일본 특허 공개공보 제1999-206387호; 일본 특허 공개공보 제1996-509612호; 및 일본 특허 공개공보 제1999-505107호 참조)으로 제조될 수 있다.

"인간화 항체"는 마우스항체의 항원-결합부위(CDR; 상보성 결정영역)의 유전자 염기서열만 인간항체 유전자에 이식(CDR grafting)하여 제조된 항체이다. 본 발명에 따른 인간화 항체는 당업자로에게 주지된 방법으로 제조될 수 있다(예를 들면, EP239400 및 WO 90/07861호 참조).

"키메라 항체"는 어떤 항체의 가변영역을 그것으로부터 이종 항체의 불변영역에 연결하여 제조된 항체이다. 구체적으로는, 마우스는 항원으로 면역화되고, 항원에 결합하는 항체 가변영역(V 영역)은 마우스 단일클론성 항체의 유전자로부터 절단된다. 이렇게 얻어진 V 영역을 그 다음 키메라 항체를 제조하기 위해, 인간 골수로부터 유래된 항체 불변영역(C 영역)에 결합시킨다. 본 발명에 따른 키메라 항체는 당업자에게 주지된 방법으로 제조될 수 있다(예를 들면, 일본 특허 공개공보 제1996-280387 및 미국 특허 제4816397호, 제4816567호 및 제5807715호 참조).

본 발명에 따른 단일클론성 항체는 당업자에게 주지한 방법으로 제조될 수 있다(예를 들면, Antibodies: A Laboratory Manual, Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory(1988); Experimental Manual for Monoclonal Antibody, edited by Sakuji Toyama et al., Kodansha, (1987); and Monoclonal Antibody: Hybridoma and ELISA, edited by Tatsuo Iwasaki, et al., Kodansha(1987) 참조).

본 발명에 따른 다클론성 항체는 당업자에게 주지된 방법으로 제조될 수 있다.

본 발명에 따른 "기능적 단편"이란 본 발명에 따른 단백질을 특이적으로 인식하는 항체의 일부분(부분 단편)을 의미한다. 그러한 기능적 단편의 구체적인 예시는 Fab, Fab', F(ab')₂, 가변영역 단편(Fv), 디설피드-결합 Fv 및 단일-사슬 항체(scFv) 및 그것들의 중합체를 포함한다.

본 발명에 따른 제1 태양의 항체의 바람직한 예시는 SEQ ID NO:4의 아미노산 서열 또는 하나 이상의 보존적 치환을 함유하는 SEQ ID NO:4의 아미노산 서열을 포함하는 단백질에 대한 항체 및 그것의 기능적 단편을 포함한다.

본 발명에 따른 제2 태양의 항체의 바람직한 예시는 SEQ ID NO:5의 아미노산 서열 또는 하나 이상의 보존적 치환을 함유하는 SEQ ID NO:5의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 대한 항체 및 그것의 기능적 단편을 포함한다.

본 발명에 따른 제3 태양의 항체의 바람직한 예시는 FERM BP-10782에 기해 수탁된 하이브리도마로 제조된 단일클론성 항체를 포함한다.

따라서, 본 발명에 따르면, 2007년 2월 8일자로 일본의 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터(AIST Tsukuba Central 6, Higashi 1-1-1, Tsukuba, Ibaraki, 305-8566, Japan)에 기탁된 수탁번호 FERM BP-10782의 하이브리도마(0427-L2-1)가 제공된다.

본 발명에 따른 항체는 단일클론성 항체가 바람직하다.

본 발명에 따르면, 본 발명에 따른 하이브리도마로 생성된 단일클론성 항체와 같은 항원과 교차반응하는 단일클론성 항체가 제공된다.

본 발명에 따르면, 본 발명에 따른 항원 조성물에 반응하는 동물 자신의 면역계로 생성된 녹농균에 결합할 수 있는 항체가 제공된다.

[항체의 용도 및 약제학적 조성물]

녹농균과 관련된 질병

녹농균은 숙주의 저항력 저하에 따라 치명적인 결과를 야기하는 기회(opportunistic) 감염 병원균이다. 더욱이, 녹농균은 항생물질에 저항성이 있기 때문에 병원내 감염의 주요한 원인균이다. 하기의 실시예에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 제3 태양의 항체는 옵소닌 작용을 가진다는 것이 확인되었다(실시예 9). 또한, 본 발명에 따른 항혈청은 실제로 무신(mucin) 투여로 저하된 마크로파지(macrophage)기능을 가진 녹농균 이감염성 뮤린(murine) 모델에서 감염에 대한 보호 효과를 가지고(실시예 11), 본 발명에 따른 항체는 실제로 시클로포스파마이드 모노하드레이트 투여로 감소된 호중구를 가진 녹농균 이감염성 뮤린 모델에서 감염에 대한 보호 효과를 가진다(실시예 12)는 것이 확인되었다. 또한 본 발명에 따른 제3 태양의 항체는 실제로 다제 내성(multidrug resistant) 녹농균 이감염성 뮤린 모델에서 감염에 대한 보호 효과를 가진다는 것이 확인되었다(실시예 13). 따라서, 본 발명에 따른 항체는 녹농균과 관련된 질환의 예방 또는 치료에 유용하다.

녹농균과 관련된 질환의 예시는 다제내성 녹농균 감염 예를 들면, 패혈증, 수막염 및 심내막염을 포함하는 녹농균 감염에 의한 전신성 감염 질환을 포함한다. 녹농균과 관련된 질환의 선택적인 예시는: 이비인후과 분야의 중이염 및 부비강염; 호흡기과 영역의 폐렴, 만성 기도 감염 및 카테터(catheter) 감염; 외과 분야의 담관 등의 수술후 복막염 및 수술후 감염; 안과 분야의 안검농양, 누농염, 결막염, 각막 궤양, 각막 농양, 전안구염 및 안와 감염; 그리고 비뇨기과 분야의 요도 감염(복합성 요도 감염 포함), 카데텔 감염 및 항문주변 농양을 포함한다. 그것의 또다른 예시는 열상(중증 열상 및 기도 열상을 포함), 욕창 감염 및 낭포성 섬유증을 포함한다.

본 발명에 따른 제3 태양의 항체는 특히 치료가 어려운 다제 내성 녹농균 감염의 예방 또는 치료에 효과적이라고 기대되는 점에서 유용하다. 또한 본 발명에 따른 제1 태양의 항체는 본 발명에 따른 제2 태양의 펩티드에 결합하는 것이 확인되었다(실시예 7 및 실시예 8). 따라서, 본 발명에 따른 제1 태양의 항체는 동일한 효과를 갖는 것을 기대할 수 있다.

본 발명에 따르면, 녹농균에 관련된 질환 예방제 또는 치료제를 제조하기 위한 본 발명에 따른 항체의 용도가 제공된다.

본 발명에 따르면, 본 발명에 따른 항체의 예방상 또는 치료상의 유효량을 인간을 포함한 포유류에 투여하는 단계를 포함하는 녹농균과 관련된 질환의 예방 또는 치료방법이 제공된다.

녹농균 감염 진단제

하기의 실시예에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 제1 태양의 항체는 본 발명에 따른 단백질, 본 발명에 따른 제1 태양의 펩티드 및 본 발명에 따른 제2 태양의 펩티드에 각각 결합하는 것이 확인되었다(실시예 7). 또한, 본 발명에 따른 제2 태양의 항체는 본 발명에 따른 단백질 및 본 발명에 따른 제1 태양의 펩티드에 결합하는 것이 확인되었다(실시예 7). 또한, 본 발명에 따른 제3 태양의 항체는 본 발명에 따른 단백질 및 본 발명에 따른 제2 태양의 펩티드에 결합하는 것이 확인되었다(실시예 7). 게다가, 본 발명에 따른 제1 내지 제3 태양의 항체는 녹농의 세포 표면에 노출된 PA0427 단백질의 세포 외 영역에 결합하는 것이 확인되었다(실시예 8).

이러한 결과는 본 발명에 따른 항체가 녹농균의 존재를 검출하는데 사용될 수 있다는 것을 암시한다. 따라서, 본 발명에 따른 항체는 녹농균 감염 진단제로 사용될 수 있다.

본 발명에 따르면, 본 발명에 따른 항체를 사용하는 녹농균 감염의 진단방법이 제공된다.

본 발명에 따른 진단방법은 녹농균 감염의 위험이 있는 인간을 포함한 포유동물로부터 객담, 폐 세정액, 농, 눈물, 혈액 또는 뇨와 같은 생체 시료를 채취하고, 이어서 채취한 시료와 본 발명에 따른 항체를 접촉시켜, 항원-항체반응이 발생하는지 여부를 판단함으로써 수행될 수 있다.

녹농균 감염 진단제 키트

본 발명에 따르면, 적어도 본 발명에 따른 항체를 포함하는 녹농균의 존재를 검출하기 위한 키트가 제공된다.

본 발명에 따른 항체는 라벨이 붙여질 수 있다. 이 검출 키트는 항원-항체반응을 검출하여 녹농균의 존재를 검출한다.

따라서, 본 발명에 따른 검출 키트은 원한다면 추가적으로 항원-항체반응을 실시하기 위한 여러 가지 시약 예를 들면, ELISA법에 사용되는 2차 항체, 발색시약, 완충액, 설명서 및/또는 기구 등을 함유할 수 있다.

약제학적 조성물

본 발명에 따른 약제학적 조성물 또는 용제는 유효 성분으로서 본 발명에 따른 항체 포함하고, 바람직하기는 정제한 항체 및 임의의 다른 성분 예를 들면, 생리식염수, 포도당 수용액 및 인산염 완충액을 포함하는 조성물의 형태로 사용될 수 있다.

본 발명에 약제학적 조성물은 필요에 따라 액체 또는 동결건조한 형태로 제형화될 수 있다. 그러한 약제학적 조성물은 임의적으로 약학적으로 허용가능한 담체 예를 들면, 안정화제, 방부제 및 등장화제(isotonic agent)를 함유할 수 있다.

약학적으로 허용가능한 담체의 예시는 동결건조한 제제의 경우 만니톨, 락토스, 사카로스 및 인간 알부민; 및 액상 제제의 경우 생리식염수, 주사용수, 인산염 완충액 및 수산화 알미늄을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

투여 경로는 투여 대상의 연령, 체중, 성별 및 일반적인 건강상태에 따라 다를 수 있으나, 투여는 경구투여와 비경구투여(예를 들면, 정맥 투여, 동맥 투여 및 국소 투여)중 어떤것으로도 수행될 수 있다. 그 중에서도, 비경구투여가 바람직하다.

약제학적 조성물의 투여량은 환자의 연령, 체중, 성별 및 일반적인 건강상태, 녹농균 감염의 정도 및 투여되는 항체 조성물의 성분에 따라 다양하다. 본 발명에 따른 항체 조성물의 하루 투여량은 일반적으로 정맥 투여의 경우, 성인 체중의 0.1 내지 1000mg/kg, 바람직하기는 체중의 1 내지 100mg/kg이다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물은 녹농균 감염의 위험이 있는 환자에게 미리 투여되는 것이 바람직하다.

약제학적 조성물이 진단제로 제조될 때, 이 진단제는 목적에 적합한 어느 수단을 선택하여 어느 제형으로 얻어질 수 있다. 예를 들면, 복수(ascites), 목적 항체를 함유한 배양액 또는 정제한 항체는 그 항체의 역가를 측정하고 적당하게 PBS 등(생리 식염수을 함유한 인산 완충액)으로 희석한 후, 0.1% 나트륨 아지드를 그 다음 거기에 첨가한다. 선택적으로, 라텍스 등을 흡착시킨 본 발명의 항체는 또한 그것의 항체 역가가 결정되고 적당하게 희석해서, 사용하기 위해 방부제를 거기에 첨가한다. 그러한 라텍스 입자와 결합된 본 발명의 항체는 진단제로서 바람직한 제형 형태 중 하나이다. 이러한 경우, 적당한 수지 재료 예를 들면, 폴리스티렌, 폴리비닐톨루엔 또는 폴리부타디엔이 라텍스로서 적합하다.

도 1은 pET15b 플라스미드(pET-PA0427-2)를 나타낸다.

이하, 본 발명은 이해를 돕기 위해 실시예를 참고로 설명될 것이다. 그러나, 본 발명이 이러한 실시예에 한정되는 것을 의도하는 것은 아니다.

실시예 1:GeneChip ^(R) 분석

인간혈청을 첨가한 배지에서 발현되는 유전자를 동정하는 방법으로서 GeneChip^(R) 발현 분석 시스템(Affymetrix, GeneChip^(R) 녹농균 게놈 배열)을 사용하였다. 녹농균 PA01 균주(ATCC BAA-47)를 사용하여 3가지 배양 조건 즉, 37℃에서 0%, 20% 및 50% 인간혈청이 첨가된 Luria-Bertani(LB) 배지(Nacalai Tesque)(LB 배지의 최종 조성물은 균일)의 흡광도가 595nm에서 1.0으로 될때까지 진탕 배양을 수행하였다. RNeasy Protect Bacteria Mini 키트(QIAGEN GmbH)를 사용하여, 첨부문서에 기재된 방법에 따라, 전체 RNA를 추출하고, 2100 생물분석기(Agilent Technologies)를 사용하여 정량하였다. 그 후, GeneChip^(R)에 첨부된 문서에 기재된 방법에 따라 실험을 실시하였다. 유전자 발현 데이타를 Microarray Suite 5.0(Affymetrix)으로 분석하였고, 시그널 및 디텍션을 계산하였다. 이때, 모든 프로브 세트(probe set)로부터 시그널의 평균치가 1000이 되도록 보정을 실시하였다. 실험은 독립해서 2회 실시되었다.

그 결과, 하우스 키핑(house keeping) 단백질인 PA4761 단백질(DnaK 또는 HSP70)은 혈청의 첨가 유무에 관계없이 모든 배양조건하에서 전사 산물이 검출되었다는 것을 나타내는 "존재"로 판명되어 당해 유전자가 발현되어 있다는 것을 나타냈다. 게다가, 약물 배출 펌프를 구성하도록 PA5158 단백질(OpmG) 및 PA2019 단백 질(MexX)과 결합하는 내막 관통 단백질로 테트라사이클린 또는 아미노글리코시드계 항생물질와 같은 리보솜 저해제에 의해 유도되는 PA2018 단백질(MexY)(J. Bacteriology, 2005, 187, 5341-5346)은 약물이 없는 조건 하에서는 "부재"로 판정되어 당해 유전자가 발현되지 않았다는 것을 나타냈다. 한편, PA0427 유전자에 관해서는, 혈청 첨가 유무에 관계없이 모든 조건 하에서 "존재"로 판정되었다.

또한, PA0427 유전자가 확실하게 발현하여, 그 유전자 산물인 PAO427 단백질이 균체 표면에 정상적으로 존재하고 있을 가능성이 암시되었다. 이것은 녹농균 PA0427 단백질이 백신 성분으로서 유용하다는 것을 제시하였다.

실시예 2: 임상 분리체의 PA0427 유전자의 분석

사용된 균주는 전 일본 임상시설에서 각종 임상재료로부터 분리된 95 녹농균 균주(Meiji Seika Kaisha, Yokohama Research Lab에 보관)로 시험대상으로 하였다. 이러한 균주는 혈액, 뇨, 객담, 고름, 인두 점액 등으로부터 유래되었고, 혈청형은 녹농균연구회 주최의 형별 검토위원회의 결정(1975년)에 의한 혈청학적 분류에 기초하여 A군, B군, E군, F군, G군, I군, M군 등을 포함한다.

(1) 게놈 DNA의 제조

각각의 녹농균 95 임상 분리체를 뮐러 힌톤(Mueller-Hinton) 배지(Becton Dickinson)에서 37℃에서 하룻밤 배양하였고 저속 원심분리로 회수하였다. DNeasy Tissue 키트(QIAGEN GmbH)를 사용하여, 거기에 함께 첨부된 문서에 기재된 방법에 따라 얻어진 균체로부터 게놈 DNA를 제조하였다.

(2) PCR법에 의한 DNA 단편의 증폭

제조된 게놈 DNA를 주형으로하여, PA0427 유전자를 함유하는 영역을 PCR에 의해 증폭시켰다. 구체적으로는, 녹농균 PA01 게놈 염기서열(NCDI의 데이터 베이스에서의 억세션(accession) No. NC_002516)을 기초로, PA0427 유전자를 특이적으로 증폭하는 프라이머 세트(SEQ ID NO:7 및 SEQ ID NO:8)를 설계하였다. GeneAmp PCR System 9700(Applied BioSystems)을 이용해서, 거기에 첨부된 설명서에 따라 Takara ExTaq(Takara Bio)를 사용하여 PCR를 수행하였다. 또한 PCR로 증폭된 DNA 단편은 아가로스-겔(agarose-gel) 전기영동에 의해 목적하는 크기(1628 bp)를 갖는다는 것이 확인되었다.

(3) DNA 시퀀서(sequencer)를 이용하여 폴리뉴클레오티드 염기서열의 분석

PCR 산물을 MultiScreen PCR 플레이트(Millipore Corporation)를 사용하여 정제한 후, 시퀀싱 반응에 제공하였다. PA01 게놈 염기서열(NC_002516)을 기초로 각 PCR 산물을 시퀀싱할 수 있는 프라이머(SEQ ID NO:9 내지 SEQ ID NO:13)를 설계하였다. 시퀀싱 반응에는 BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing 키트(Applied BioSystems)가 사용되었다. 시퀀싱 반응은 첨부된 설명서에 따라 GeneAmp PCR System 9700(Applied BioSystems)을 사용하여 수행되었다. 시퀀싱 반응 산물을 미리 물로 팽창시킨 Sephadex G-50 Fine DNA Grade(Amersham Biosciences AB)로 채운 MultiScreen-HV 프레이트(Millipore Corporation)를 사용하여 정제하였다. 그 다음, Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer(Applied BioSystems)를 사용하여 폴리뉴클레오티드 염기서열을 분석하였다.

상기 분석에 의해 판명된 임상 분리체의 폴리뉴클레오티드 염기서열을 폴리 펩티드 염기서열로 치환시키고, 이러한 폴리펩티드 염기서열을 PA01 균주의 염기서열과 비교하였다. 그 결과, PA0427 단백질의 전장 염기서열에서 3개의 돌연변이가 발견되었다(표 1).

그러나, 녹농균 PA0427 단백질에 대한 2차 구조 및 3차 구조 정보(J. Bio1. Chem., 2004, 279, 52816-52819)와 대장균의 TolC 단백질에 대한 3차 구조 정보(Nature, 2000, 405, 914-919)를 기초로 본 발명자들이 예상한 한 추정 세포 외 영역(SEQ ID NO:5 및 SEQ ID NO:6)은 감지되는 돌연변이가 없다는 것이 확인되었다. 이것은 녹농균 PA0427 단백질이 "녹농균 공통항원"으로서 유용하다는 것을 암시한다.

[표 1]

임상 분리체의 PA0427 단백질의 돌연변이 패턴

"-"는 PA01 균주의 아미노산과 동일한 아미노산을 나타낸다.

실시예 3: PA0427 유전자 DNA 단편의 클로닝

녹농균 PA0427 유전자(SEQ ID NO:1)의 아미노산 코드 영역 1458 뉴클레오티드 중 뉴클레오티드 340 내지 1017 DNA 단편(SEQ ID NO:2)을 하기의 방법에 따라 벡터 pIVEX2.4d(Roche Diagnostics)를 이용해서 클로닝하고, 발현 벡터 pET15b(Novagen)에 결합시켰다.

PA0427 단백질과 상동성인 대장균 TolC 단백질에 대한 구조 분석 정보(Nature, 2000, 9405,914-919)을 기초로, 아미노산 코드 영역의 뉴클레오티드 1 내지 339 및 1018 내지 1458의 뉴클레오티드 염기서열은 세포 표면에 노출되지 않은 부분을 코드화한다고 생각되었다. 따라서, 이런 뉴클레오티드 염기서열을 클로닝에서 제외시켰다.

클로닝할 DNA 단편을 녹농균 PAO1 게놈 DNA로부터 PCR(DNA Thermal Cycler 480; Perkin-Elmer)로 증폭하였다. DNA 폴리머라제로서 Pyrobest(Takara Shuzo)를 사용하였다. 반응액에 5% 디메틸 술폭사이드를 첨가하였다. PCR 프라이머는 제한효소 부위 NcoI(CCATGG) 및 PstI(CTGCAG) 및 종결 코돈(codon)을 부가하기 위한 뉴클리오티르를 함유한 프라이머(SEQ ID NO:14 및 SEQ ID NO:15)를 이용하였다.

PCR의 온도조건은 94℃에서 2분간의 가열 후, 94℃에서 30초간, 60℃에서 1분간 및 72℃에서 2분간으로 이루어진 30 사이클을 포함하였다. PCR 산물을 GenElute PCR DNA Purification 키트(Sigma)을 사용하여 정제하고, 정제된 산물을 NcoI 및 PstI(모두 New England Biolabs)로 절단하였다. pIVEX2.4d를 NcoI 및 PstI로 절단하였다. 이 DNA 단편을 아가로스겔에서 전기영동시켜, QIAquick Gel Extraction 키트(Qiagen)로 추출하고 정제하였다. 또한 NcoI-PstI로 절단된 PCR 산물 및 pIVEX2.4d를 T4 DNA 리가제(Invitrogen)로 연결하고, 대장균 DH5α 균주(Competent High DH5α, Toyobo)를 연결 산물로 형질전환하였다. PA0427 유전자 단편이 결합된 pINEX2.4d 플라스미드(pIVEX-PA0427-1)를 QIAprep Spin Miniprep 키트(Qiagen)로 정제하고, 삽입부분의 뉴클레오티드 염기서열을 BigDye Terminator vI. 1 Cycle Sequencing 키트(Applied Biosystems)로 확인하였다(3730 DNA Analyzer, Applied Biosystems/HITCHI).

다음에, pET15b를 NndeI(New England Biolabs) 및 BamHI(Toyobo)로 절단하였다. 게다가, pIVEX-PA0427-1을 주형으로 하여, 삽입부분의 상류에 위치하는 영역과 맞는 PCR 프라이머(SEQ ID NO:16) 및 제한효소 부위 BglII(AGATCT) 및 종결 코돈을 부가하기 위한 뉴클레오티드를 함유하는 PCR 프라이머(SEQ ID NO:17)로 삽입 단편을 증폭하고, PCR 산물을 NncoI 부위 상류에 인접하는 NdeI 및 BglII(Toyobo)로 절단하였다. BamHI 및 BglII로 절단한 후 돌출 말단은 서로 상보적이다. 따라서, 이 절단 DNA 단편을 연결시켰다. 대장균을 PA0427 유전자 단편이 결합된 pET15b 플라스미드(pET-PA0427-2)를 얻기 위하여 연결 산물과 형질전환하였다(도 1).

실시예 4: PA0427 재조합 단백질의 발현 및 정제

재조합 단백질의 발현에는 T7 RNA 폴리머라제 유전자가 결합된 대장균 BL21(DE3) 균주와 T7 프로모터를 가진 pET 벡터 발현 시스템(Novagen)을 사용하였다. 대장균 발현벡터 pET-PA0427-2는 T7 프로모터의 하류에 His-태그(6 개의 연속된 히스티딘)가 융합된 PA0427 부분 단백질을 코드화하는 플라스미드이다(실시예 3 참조). BL21(DE3) 균주를 염화칼슘으로 처리(Molecular Cloning 2nd ed., Sambrook et al.(1989) 참조)하고, pET-PA0427-2와 형질전환하였다. 형질전환체를 50㎍/ml 암피실린을 함유하는 LB 배지에서 하룻밤 배양하고, 새로운 배지에 현탁(200배 희 석)시켜 37℃에서 4시간 배양하였다. 그 다음, 0.5mM의 최종 농도에서 IPTG를 첨가하여 발현을 유도하고, 다시 3시간 배양하였다. 세포를 원심분리로 회수하고, -20℃에서 동결하였다. 세포를 B-PER Bacterial 단백질 추출 시약(Pierce)로 용해시키고, 발현 단백질을 함유하는 불용성 단편을 회수하여, 100㎍/ml의 최종 농도에서 리조자임(난백 리조자임, Seikagaku Corporation)로 처리한 후, 1% Triton X-100을 첨가한 Dulbecco's 완충염류 용액(PBS)으로 세정하였다.

단백질의 정제에는, His-태그를 이용하는 Ni 킬레이트 크로마토그래피를 사용하였다. 또한 발현되고 제조된 불용성 단백질을 용해 버퍼(8M 요소, 5mM 이미다졸, 200mM NaCl 및 0.05% NP-40을 첨가한 PBS)로 용해시켰다. 용해된 단백질을 Ni-NTA Agarose(Qiagen)에 결합시키고, 40 용량의 용해 버퍼로 세정하였다. 또한, 단백질을 40 용량의 세정 버퍼(NP-40을 제외한 용해 버퍼의 구성과 같음)로 세정하였다. 그 후, His-태그 부착 단백질을 용출버퍼(8M 요소, 300mM 이미다졸 및 200mM NaCl를 첨가한 PBS)로 용출하여 회수하였다.

그 결과, 115ml의 대장균을 배양하여 최종적으로 2.0mg의 단백질이 얻어졌다.

실시예 5: 항원의 면역화 및 항혈청의 제조

녹농균은 PA103 균주(ATCC29260)를 뮤라-힌톤 한천 배지에서 하룻밤 37℃에서 배양하였다. 몇몇 코로니를 LB 배지에 현탁한 후, 하룻밤 37℃에서 진탕 배양하고, PBS로 세정하여 재현탁하였다. 그 다음, 1% 포르말린을 첨가하여 24시간 이상 불활성화 처리를 수행하여 균주를 불활화시켰다(이하, "포르말린-불활성 PA103 균 주"라고도 함).

면역화에서 이용하는 경우, PA0427 재조합 단백질을 최종 농도가 100㎍/ml가 되도록 8M 요소 용액에 용해하였다.

PA0427 단백질의 세포 외 영역의 아미노산 서열을 녹농균 PA0427 단백질에 대한 2차 구조 및 3차 구조 정보(J. Biol. Chem., 2004, 279,52816-52819)와 대장균 TolC 단백질에 대한 3차 구조 정보(Nature, 2000,405, 914-919)를 기초로 본 발명자이 예측하였다.

예측된 아미노산 서열(SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6)을 함유하는 펩티드는 Fmoc을 이용하는 고상합성법으로 합성되었다. SEQ ID NO:5의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드는 SEQ ID NO:5의 아미노산 서열를 함유하는 합성 펩티드(이하, "0427L1"라고도 함)로 합성되었다. SEQ ID NO:6의 아미노산 서열을 함유하는 합성 펩티드로서 SEQ ID NO:6의 아미노산 서열의 카복실 말단에 시스테인 잔기를 부가시킨 펩티드(이하, "0427L2Q"라고도 함)가 합성되었다(SEQ ID NO:18). SEQ ID NO:5의 아미노산 서열로 이루어진 합성 펩티드 0427L1의 질량분석에 의해 [M+1] m/z 1592.94(계산치 m/z 1591. 77)를 발견하였고, 합성 펩티드의 경우 HPLC 분석에서 유지시간 13.199 분에서 면적비 71.1% 최대치를 나타냈다. 선택적으로, SEQ ID NO:6의 아미노산 서열을 함유하는 합성 펩티드 0427L2Q는 질량분석에서 [M + 1] m/z 1615.51(계산치 m/z 1613.84)가 나왔고, 합성 펩티드의 경우 HPLC 분석에서 유지시간 16.75 분에서 면적비 74.7% 최대치가 관측되었다. KLH-결합 펩티드를 제조하기 위하여 상기 합성 펩티드를 스페이서를 거쳐 KLH와 결합시키고, 이 KLH-결합 펩티드를 각각 0427L- KLH 및 0427L2Q-KLH로 명명하였다. 스페이서로는 DMS(Dimethyl suberimide·2HCI, Pierce, catalog No.20700) 또는 sulfo-MBS(m-Maleimidobenzoyl-N-hydoxysulfosuccinimide ester: Pierce, catalog No.22312)를 이용하였다. 펩티드 합성은 Thermo Electron에 위탁하였다.

면역화의 경우, 각 동물당 보강제와 함께 포르말린-불활성 PA103 균주, PA0427 재조합 단백질 및 KLH-결합 펩티드 20㎍가 사용되었다. 동물에의 투여방법은 숫 BN 랫(일본 Charles River Laboratories로부터 구입)의 피하 또는 근육 내로 처음에는 완전한 Freud 보강제와 함께, 2회째 이후는 불완전 보강제와 함께 2주 간격으로 총 6회 실시하였다. 최종 면역화로부터 1주일 후, 복부 대동맥으로부터의 전채혈을 채취하였고, 혈청으로부터 약 5ml/랫을 갖는 상청액을 얻기 위하여 1시간 동안 실온에 방치한 후 20분 동안 1500G에서 원심분리하였다.

실시예 6: 항혈청으로부터의 IgG 단편의 정제

랫 항혈청으로부터의 IgG 단편의 정제는 예를 들면, McCauley R & Racker, E; Molecular and Cellular Biochemistry 1, 73-81(1973)의 방법에 따라 수행되었다. 43(v/v)% 현탁액을 제조하기 위하여 얼린 포화 황산 암모늄 용액(pH8)을 첨가하고 얻어진 현탁액을 실온에서 15분간 교반하였다. 10,00Oxg에서 20분간 원심분리하여 침전을 회수하고, 10% 글리세롤을 첨가한 10mM 인산 칼륨 완충액(pH8)에 용해하였다. 그 후, 50(v/v)% 용액을 제조하기 위하여 얼린 포화 황산 안모늄 용액(pH8)을 첨가하고 다시 침전을 석출시켜줌으로써 2회 세정을 실행하였다. 침전을 10% 글리세롤을 첨가한 10mM 인산 칼륨 완충액(pH8)에 용해하고, 이어 당해 완충액 을 하룻밤 투석하였다. 투석액을 원심분리하고 그 다음 음이온교환 크로마토그래피(DEAE-Toyopearl 650m(TOSOH))에 적용하였다. 280nm에서 자외선흡수를 측정함으로써 IgG 단편으로서 관통 용적을 회수하였다. 회수된 단편을 Amicon Ultra-15(Millipore)를 이용하여 농축하고, 최종 시료를 얻기 위하여 버퍼를 최종적으로 PBS(-) 용액과 교환하였다. IgG 단편으로서 5ml의 PA0427 재조합 단백질-면역 랫 혈청으로부터 정제하여 14.5mg의 단백질을 회수하였고, 이 단편을 항-PA0427 IgG로 명명하였다. 단백질을 Lowry 방법을 기초로 DC Protein Assay(Bio-Rad)를 따라 정량화하고, IgG의 순도는 SDS-PAGE로 평가하였다.

시료 구별법으로서 Harlow & Lane, 288-318, Chapter 8, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor(1988) 방법이 사용되었다. 랫 항혈청을 10,00Oxg에서 20분간 원심분리하여 불용물을 제거한 상청액에, 2 용량의 60mM 초산나트륨(pH4.0)을 첨가한 후, 1N 염산으로 pH4.8로 조정하였다. 항혈청에 0.06 용량의 카프릴산을 실온에서 서서히 첨가하고, 불용물이 생성되도록 혼합물을 30분간 교반하였다. 13,00Oxg에서 10분간 원심분리하여 침전을 제거한 후, 결과 용액을 0.45-㎛ 필터에 통과시켰다. 얻어진 시료를 Amicon Ultra-15(Millipore)를 이용하여 농축한 후, 최종 시료를 얻기 위하여 버퍼를 최종적으로 PBS(-) 용액과 교환하였다. IgG 단편으로서 본 방법에 따른 각 30ml의 KLH-결합 펩티드(즉, 0427L1-KLH 및 0427L2Q-KLH)-면역 랫 혈청을 정제하여 68 내지 27mg 단백질을 회수하였고, 이 단편들을 각각 항-0427L1 IgG 및 항-0427L2Q IgG로 명명하였다. 단백질을 Lowry 방법에 기초한 DC Protein Assay(Bio-Rad)로 정량화하고, IgG의 순도는 SDS-PAGE로 평가하였다.

실시예 7: ELISA 시험

PA0427 재조합 단백질 또는 각 합성 펩티드 0427L1 및 0427L2Q에 결합하는 항체를 ELISA법으로 검출하기 위해, PA0427 재조합 단백질을 8M 요소를 첨가한 PBS에 용해시키고, 각 합성 펩티드 0427L1 및 0427L2Q를 탄산 버퍼(0.15% Na₂C0₃, 0.3% NaHC0₃)에 용해시켰다. 단백질 또는 펩티드를 96-웰 ELISA 플레이트(MaxiSorp Type, NUNC)에 넣었다. 플레이트를 부동화시키기 위해 4℃에서 하룻밤 동안 두었다. 플레이트를 PBS으로 세정하고, 0.5% BSA를 첨가한 PBS에서 브로킹(blocking)하였다. 그 후, 시료로서 실시예 6에서 얻어진 각 정제 IgG 단편을 웰(well)에 가하고, 실온에서 반응시켰다. 플레이트를 0.05% Tween 20을 함유한 PBS로 세정하였다. 그 다음, 2차 항체(퍼옥시다제-라벨 염소 항-랫 IgG 항체, 10000배 희석, Sigma)를 거기에 첨가하고, 실온에서 그것과 함께 반응시킨 후에 세정하였다. 발색 기질(TMB Microwell Peroxidase substrate System, KPL)을 첨가하여 효소 반응을 수행한 후, 1M 인산 용액으로 정지시켰다. 450nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, PA0427 재조합 단백질을 부동화했을 경우, 항-PA0427 IgG 단편의 흡광도는 0.961였다. 반면, 음성대조 sham 랫 IgG 단편의 흡광도는 0.080였다. 이는 항-PA0427 IgG 단편 중에 항원으로 사용된 PA0427 재조합 단백질에 결합하는 항체(IgG)가 함유되어 있음을 나타낸다. 게다가, 항-PA0427L1 IgG 및 항-PA0427L2Q IgG 단편의 흡광도는 각각 0.353 및 0.751이다. 이것은 이들 단편 중에도 PA0427 재조합 단백질에 결합하는 항체(IgG)가 함유되어 있음을 나타낸다.

선택적으로, 합성 펩티드 0427L1를 부동화했을 경우, 항-PA0427 IgG 단편의 흡광도는 0.750였다. 반면, 음성 대조 sham 랫 IgG 단편의 흡광도는 0.015였다. 이것은 항-PA0427 IgG 단편에 추정 세포 외 영역 중 하나인 아미노산 서열(SEQ ID NO:5)로 이루어진 합성 펩티드 0427L1에 결합하는 항체(IgG)가 포함되어 있음을 나타낸다. 항-PA0427L1 IgG 단편의 흡광도는 0.117이고, 이것은 당해 단편 중에도 합성 펩티드 0427L1에 결합하는 항체(IgG)가 포함되어 있음을 나타낸다. 반면, 항-PA0427L2Q IgG 단편의 흡광도는 0.034이고, 이것은 당해 단편 중에 합성 펩티드 0427L1에 결합하는 항체(IgG)가 포함되어 있지 않음을 나타낸다.

또한, 합성 펩티드 0427L2Q를 부동화했을 경우, 항-PA0427 IgG 단편의 흡광도는 0.569였다. 반면, 음성 대조 sham 랫 IgG 단편의 흡광도는 0.063였따. 이것은 항-PA0427 IgG 단편에는 추정 세포 외 영역 중 하나인 아미노산 서열(SEQ ID NO:6)을 포함하는 합성 펩티드 0427L2Q에 결합하는 항체(IgG)가 포함되어 있음을 나타낸다. 항-PA0427L2Q IgG의 흡광도는 0.361이고, 이것은 당해 단편 중에도 합성 펩티드 0427L2Q에 결합하는 항체(IgG)가 포함되어 있음을 낸다. 한편, 항-PA0427L1 IgG 단편의 흡광도는 0.101이고, 이것은 당해 단편 중에는 합성 펩티드 0427L2Q에 결합하는 항체(IgG)가 포함되어 있지 않음을 나타낸다.

실시예 8: 전 세포 ELISA 시험

전 세포(whole cell) ELISA의 경우, LB 배지에서 밤에 배양된 PA103 균주의 균액을 96-웰 ELISA 플레이트(MaxiSorp Type, NUNC)에 100μL/웰 농도로 분배하고, 4℃에서 1시간 동안 부동화시켰다. 그 후 플레이트를 세정 버퍼(0.05% Tween 20 함유 TBS)로 세정하고, 브로킹 버퍼(2% 소혈청 알부민 함유 TBS)로 브로킹하였다. 그 이후, 실시예 6에서 얻어진 각 정제 IgG 단편을 웰에 가하고, 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 세정한 후, 2차 항체(펠옥시다제-라벨 염소 항 랫 IgG 항체, 5000배 희석, Sigma)를 거기에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 반응시킨 후, 플레이트를 세정하였다. 발색 기질(TMB Microwell Peroxidase substrate System, KPL)을 첨가하여 어두운 곳에서 반응시킨 후, 1M 인산 용액으로 효소반응을 정지시켰다. 450nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 항-PA0427 IgG의 흡광도는 0.713이었으나, 음성 대조 sham 랫 IgG의 흡광도는 0.240이었다. 이것은 항-PA0427 IgG의 중에 녹농균의 세포 표면에 노출되는 PA0427 단백질의 세포 외 영역을 인식하는 항체(IgG)가 포함되어 있음을 나타낸다. 선택적으로, 항-PA0427L1 IgG 및 항 PA0427L2Q IgG의 흡광도는 각각 0.555 및 0.596였다. 이것은 이들의 시료 중에도 녹농균의 세포 표면에 노출되는 PA0427 단백질의 세포 외 영역을 인식하는 항체(IgG)가 포함되어 있음을 나타낸다.

실시예 9: 옵소닌 활성 확인 시험

실시예 6에서 얻어진 0427L2Q-KLH-면역 랫 혈청으로부터 얻은 정제 IgG 단편(항-0427L2Q IgG)에 대해, 무린 호중구에 의한 녹농균의 탐식작용 지표로 옵소닌 활성(opsonic activity)을 검토하였다.

숫 BALB/c 마우스(일본 Charles River Laboratories로부터 구입) 복강 내에 8% 카제인 용액을 투여하였다. 6시간 후, 복강 세포를 회수하였다. 복강 세포를 원 심분리하여 세정한 후, RPMI-1640 배지(Gibco)에 2 x 10⁶cells/mL 농도로 현탁하였다. 당해 세포와 4% 파라포름알데히드로 처리한 형광-라벨 P. aeruginosa PA103 균주를 랫 보체(ICN Biomedicals) 및 항-0427L2Q IgG 또는 보강제만을 투여하여 얻은 대조 랫 혈청으로부터 정제한 IgG의 존재 하에 25:1의 비율로 1.5시간 혼합배양하였다. 배양 후, 탐식된 P. aeruginosa를 유식세포분석기(Epics LXII, Coulter)로 측정하였다. 호중구 영역에 게이트(gate)를 실시하여 1 만개 세포의 형광도를 측정하였다. 평균 형광도를 옵소닌 작용의 지표로 사용하였다.

그 결과, 100㎍/mL 및 200㎍/mL의 항-0427L2Q IgG 존재 하에 P. aeruginosa와 배양된 호중구의 평균 형광도는 각각 0.39 및 0.52이었으나, 100㎍/mL 및 200㎍/mL의 대조 IgG 존재 하에 P. aeruginosa와 배양된 호중구의 평균 형광도는 각각 0.36 및 0.41로서 항-0427L2Q IgG의 옵소닌 활성이 판정되었다.

실시예 10: 단일클론성 항체(MAb)의 제조

녹농균 PA0427 단백질에 대한 2차 구조 및 3차 구조 정보(J. Biol. Chem., 2004, 279, 52816-52819)와 대장균에 대한 TolC 단백질의 3차 구조 정보(Nature, 2000,405, 914-919)를 기초로 본 발명자들이 예측한 추정 세포 외 영역(SEQ ID NO:6)을 포함하는 KLH-결합 펩티드 0427L2Q-KLH의 실시예 5에서의 첫회 면역화 1주 후에, 불완전 보강제와 함께 추가 면역을 수행하였다. 그로부터 3일 후, 마취 하에 무균적으로 슬하 임파절을 적출하였다. 얻은 임파절을 RPMI-1640 배지(Gibco)로 세정한 후, 미세한 조각으로 림프절 세포 시험 용액을 얻기 위하여 얼린 슬라이드 글 라스 사이에 임파절을 넣고서 분절하였다. 얻어진 임파절 세포를 RPMI-1640 배지에서 1000rpm으로 5분간 원심분리하여 세정하였다. 한편, 골수 세포(P3X63Ag8U1 세포)를 10% FCS(우태아 혈청)를 함유하는 RPMI-1640 배지에서 5% CO₂, 상대습도 100%, 37℃에서 미리 배양하고, 골수 세포를 대수 증식기 동안 RPMI-1640 배지에서 원심분리로 세정하고, 상기 임파절 세포와 골수 세포의 비가 약 4:1이 되도록 혼합하였다. 혼합한 세포를 1000rpm에서 5분간 원심분리하였다. 상청액을 버려 세포를 충분히 풀어지게 하였다. 이 세포를 함유한 원심관에 2g 폴리에틸렌 글리콜(M. W. 1000, Wako Pure Chemical Industries), 2mL RPMI-1640 배지 및 0.2mL DMSO(Nacalai Tesque)로 이루어진 용액 1mL를 천천히 첨가하였다. 원심관을 천천히 회전하여 세포를 혼합하였다. 1분 후, 15mL의 RPMI-1640 배지를 거기에 3분 이상 가하면서, 원심관을 천천히 회전시켰다. 세포를 1000rpm에서 5 분간 원심분리하였다. 그 후, 상청액을 버리고 세포를 충분히 풀어지게 하였다. 그 다음, 50mL의 HT 배지(Gibco)에 현탁하고 하룻밤 배양하였다. 그 후, 세포를 100rpm으로 10분간 원심분리하여 회수하고 10mL의 RPMI 배지에서 현탁 후, 90mL의 메틸셀룰로오스 HAT 선택 배지(Stem Cell Technologies)를 함유한 병에 세포액을 가해 충분히 혼합하였다. 메틸셀룰로오스 배지에서 혼합한 세포를 9cm 디시(dish)에 10mL/디시 농도로 뿌렸다. 5% CO₂, 상대습도 100%, 37℃에서 세포를 배양하였다. 약 10 내지 14일 후, 메틸셀룰로오스 배지 상에 생육하고 있는 하이브리도마의 콜로니가 관찰되었다. 이들 코로니를 주워, 96-웰 마이크로 플레이트에서 다시 수일간 배양하였다.

(1) 목적 항체의 검사

PA0427 재조합 단백질 또는 추정 세포 외 영역(SEQ ID NO:6)을 포함한 합성 펩티드(SEQ ID NO:18)에 결합하는 항체를 실시예 7에 기재된 ELISA법으로 검출하였다. 또한, 녹농균의 세포 표면에 결합하는 항체를 실시예 8에 기재된 whole cell ELlSA법으로 검출하였다.

(2) 목적 항체를 생성하는 세포의 클로닝

검사 결과, 목적 항체를 생성하고 있다고 판정된 하이브리도마를 5% BM-Condimed H1 Hybridoma Cloning Supplement(Roche Diagnostics)를 함유하는 10% FCS/HT(Gibco) 배지에서 1 하이브리도마/0.2mL가 되도록 조정하고, 96-웰 플레이트의 각 웰에 0.2mL씩 분주해서 배양하였다. 1 내지 2주 후에, 상기 검사 단락에 기제된 방법으로 분석하여 목적하는 항체를 생성하는 단일 크론을 선택하여 일본국 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터의 수탁번호가 FERM BP-I0782인 하이브리도마를 얻었다.

(3) 인 비트로에서 세포의 배양 및 MAb의 제조

96-웰 마이크로플레이트에서 충분히 증식된 목적 클론을 24-웰 플레이트, 50mL 플라스크 및 250mL 플라스크에 서서히 정률 증가시키고 10% FCS-RPMI 배지에서 배양하였다. 또한 얻어진 세포의 배양 상청액에 생성된 MAb를 실시예 7에 기재된 ELISA법으로 검출하였다.

펩티드 부존재, 합성 펩티드 0427Ll(SEQ ID NO:5) 및 합성 펩티드 0427L2Q(SEQ ID NO:18)를 각각 웰에 결합하여 검출하는 ELISA에서 흡착되어 있었 고, 흡광도가 일본국 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터의 수탁번호가 FERM BP-I0782인 하이브리도마의 배양 상청액에서 0.049, 0.049 및 0.610이었기 때문에, 합성 펩티드 0427L2Q(SEQ ID NO:18)에 특이적으로 결합하는 MAb가 생성되었다는 것이 판정되었다.

(4) 인 비보에서 세포의 복수화 및 MAb의 제조

BALB/c-nu/nu 마우스(일본 Charles River Laboratories로부터 구입)에 일본국 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터의 수탁번호가 FERM BP-I0782인 하이브리도마를 1 x 10⁷/mouse가 되도록 복강 내 투여하였다. 1 내지 2주 후, 복수(ascites)를 채취하였다. 복수에 함유된 MAb를 실시예 6에 기재된 방법으로 정제하고, 얻어진 정제 IgG 단편을 항-0427L2Q(48-5) IgG로 명명하였다. 이 랫 MAb의 IgG의 부분족은 단일클론성 항체 아소타이핑 키트(RMTI, Dainippon Pharmaceutical)로 중쇄는 IgG2a이고 경쇄는 κ라는 것이 확인되었다.

PA0427 재조합 단백질 및 합성 펩티드(SEQ ID NO:18)에 결합하는 항체를 실시예 7에 기재된 ELISA법으로 검출하였다.

그 결과, PA0427 재조합 단백질이 흡착된 웰에 결합하는 것을 검출하는 ELlSA에서, 항-0427L2Q(48-5)의 흡광도는 0.906인데 반해, 음성 대조 sham 랫 IgG의 흡광도는 0.080이므로, 당해 단백질에 결합하는 MAb가 생성된다는 것이 확인되었다.

또한, 합성 펩티드 0427L2Q(SEQ ID NO:18)가 흡착된 웰에의 결합을 검출하는 ELISA에서의 흡광도가 항-0427L2Q(48-5)에서는 0.585인데 반해, 음성 대조 sham 랫 IgG의 흡광도는 0.063이므로, 당해 펩티드에 결합하는 MAb가 생성된다는 것이 확인되었다.

실시예 11: 정상 마우스의 PA103 균주 전신감염에 대한 PA0427 재조합 단백질-면역 랫 혈청의 감염 방어능력

정상 마우스 전신 감염 모델에서의 평가는, 4주령 CD-1 숫 마우스(일본 Charles River Laboratories로부터 구입)에 5% 무신 함유 생리식염수 500㎕에서 현탁한 PA103 균주의 7.0 x 10⁴cfu/마우스(14LD₅₀)를 복강 내에 접종하였다. 직후, 생리 식염수로 5배 희석한 혈청 시료를 미정맥으로부터 10ml/kg으로 투여하였다. 7일 후, 생사를 기초로 감염 방어 활성을 확인하였다.

그 결과, 보강제만을 투여해서 얻은 음성 대조 sham 랫 혈청을 투여한 군에서는, 7마리 중 5마리의 마우스가 사망하고 2마리 마우스가 생존하였다. 반면, 실시예 5에서 얻은 포르말린-불활성화 PA103 균주-면역 랫 혈청을 투여한 군에서는 모든 마우스가 생존하였다. 따라서 포르말린-불활성화 PA103 균주-면역 랫 혈청은 감염에 대한 방어 활성을 가진다는 것이 확인되었다. 이 조건 하에서, 실시예 5에서 얻은 PA0427 재조합 단백질 면역 랫 혈청을 투여한 군은 7마리 중 6마리가 생존하였다. 따라서 PA0427 재조합 단백질 면역 랫 혈청은 감염에 대한 방어 활성을 가진다는 것이 확인되었다.

실시예 12: 호중구 감소성 마우스의 PA103 균주 전신감염에 대한 PA0427 재 조합 단백질-면역 랫 혈청 및 정제 IgG 단편의 감염 방어 능력

호중구 감소성 마우스 전신감염 모델에서의 평가에서는, 12.5mg/mL(생리식염수)의 시클로포스파미드(이하, "CY"라 함, Sigma-Aldrich)를 제조하고, 4주령 CD-1 숫 마우스에 125mg/kg의 투여량으로 day-5, -2, 0에 합계 3회 복강 내 투여하여 말초혈중의 호중구를 감소시켰다. 그 후, 생리식염수 250㎕에 현탁한 PA103 균주를 1.0 x 10⁵cfu/마우스(74LD₅₀) 투여량으로 마우스에 복강 내 접종하였다. 직후, 시료(혈청을 각 생리 식염수로 5배 희석하고 각 정제 IgG 단편을 생리 식염수로 2.5mg/mL로 조정함)를 미정맥으로부터 10 또는 20mL/kg의 투여량으로 투여하였다. 7일 후, 생사를 기초로 감염 방어 활성을 판정하였다.

그 결과, 랫 혈청을 시료로 한 경우, 보강제만을 투여 해서 얻은 음성 대조 sham 랫 혈청을 투여한 군에서는 모든 마우스가 사망하였다. 반면, 실시예 5에서 얻은 포르말린 불활성 PAI03 균주 면역 혈청을 투여한 군에서는 모든 마우스가 생존하였다. 따라서 포르말린 불활성 PAI03 균주 면역 혈청은 감염에 대한 방어 활성이 판정되었다. 이 조건 하에서, 실시예 5에서 얻은 PA0427 재조합 단백질 면역 랫 혈청을 투여한 군은 7마리 중 5마리 생존하였다. 따라서, PA0427 재조합 단백질 면역 랫 혈청은 감염에 대한 방어이 판정되었다.

선택적으로, 정제 IgG 단편을 시료로 사용한 경우(0.5mg/마우스), 음성 대조 sham 랫 IgG를 투여한 군은 7마리 중 6마리의 마우스가 사망하고 1마리 만 생존하였다. 반면, 포르말린-불활성 PAI03 균주 면역 혈청으로부터 얻은 항-PAI03 IgG를 투여한 군에서는 7마리 중 5마리가 생존하였다. 따라서, 항-PAI03 IgG은 감염에 대한 방어 활성을 갖는다는 것이 판정되었다. 이 조건 하에서, 실시예 6에서 얻은 항-0427L1 IgG를 투여한 군에서는 7마리 중 5마리가 생존하였다. 따라서, 항-0427L1 IgG는 감염에 대한 방어 활성을 갖는다는 것이 판정되었다. 또한, 실시예 6에서 얻은 항-0427L2Q IgG를 투여한 군에서는 7마리 중 4마리가 생존하였다. 따라서, 항-0427L2Q IgG는 감염에 대한 방어 활성을 갖는다는 것이 판정되었다. 또한, 실시예 10에서 얻은 랫 MAb으로서 항-0427L2Q(48-5) IgG를 투여한 군은 7마리 중 4마리가 생존 하였다. 따라서, 항-0427L2Q(48-5)는 감염에 대한 방어 활성을 갖는다는 것이 판정되었다.

실시예 13: 호중구 감소 마우스의 다제 내성 녹농균 전신 감염에 대한 정제 IgG 단편의 감염 방어능력

다제 내성 녹농균 MSC06120 균주에 대한 각종 항균제의 최소 발육 저지 농도는 이미페넴: 32㎍/ml, 아미카신:64㎍/ml, 시프로프록사신: >256㎍/ml였다. 본 균주를 이용한 호중구 감소 마우의의 전신 감염 모델에서의 평가는 12.5mg/mL(생리식염수)의 CY를 제조하고, 4주령의 CD-1 숫 마우스에 125mg/kg의 투여량으로 day-5, -2, 0에 합계 3회 복강 내 투여하여 말초혈중의 호중구를 감소시켰다. 그 후, 250㎕의 생리식염수에 현탁한 MSC06120 균주의 0.925 x 10⁵cfu/마우스(8.3LD₅₀)를 복강 내에 접종하였다. 직후, 정제 IgG 샘플을 미정맥으로부터 20mL/kg(0.5mg/마우스)으로 투여하였다. 7일 후, 생사를 기초로 감염 방어 활성을 판정하였다.

그 결과, 음성대조군인 sham 랫 IgG를 투여한 군은 7마리 중 4마리의 마우스가 사망하고 3마리가 생존하였다. 반면, 포르말린-불활성화 PA103 균주 면역 혈청으로부터 얻은 항-PA103 IgG를 투여한 군에서는 7마리 중 6마리가 생존하였다. 따라서, 항-PA103 IgG는 감염에 대한 방어 활성을 갖는다는 것이 판정되었다. 이 조건 하에서, 실시예 6에서 얻은 항-0427L2Q IgG를 투여한 군은 7마리 중 5마리가 생존하였다. 따라서, 항-0427L2Q IgG은 감염에 대한 방어 활성을 갖는다는 것이 판정되었다.

SEQUENCE LISTING <110> Meiji Seika Kaisha Ltd. <120> Pseudomonas aeruginosa outer membrane protein PA0427 <130> 165648PX <150> JP 2006-095996 <151> 2006-03-30 <160> 18 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 1458 <212> DNA <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 1 atgaaacggt ccttcctttc cctggcggta gccgctgtcg ttctgtccgg ctgctcgctg 60 atccccgact accagcgccc cgaggcgccg gtagccgcgg cctacccgca agggcaggcc 120 tacgggcaga acaccggcgc ggcggccgtt ccggccgccg acatcggctg gcgcgagttc 180 ttccgcgacc cgcagttgca gcaactgatc ggcgtggcgc tggaaaacaa ccgcgacctg 240 cgggtcgccg cgctgaacgt cgaggccttc cgggcgcagt accgcatcca gcgggccgac 300 ctgttcccgc ggatcggcgt ggacggtagc ggcacccgcc agcgtttgcc gggcgacctg 360 tcgaccaccg gcagtccggc gatttccagc cagtacgggg tgaccctggg cactaccgcc 420 tgggaactcg atctcttcgg ccgcctgcgc agcctgcgcg accaggccct ggagcagtac 480 ctggcgaccg aacaggcgca gcgcagcgcg cagaccaccc tggtggccag cgtggcgacc 540 gcctacctga cgctgaaggc cgaccaggcg cagttgcagc tgaccaagga caccctgggc 600 acctaccaga agagtttcga cctgacccag cgcagctacg acgtcggcgt cgcctccgcg 660 ctcgacctgc gccaggcgca gaccgccgtg gaaggcgccc gcgcgaccct ggcgcagtac 720 acccgcctgg tagcccagga ccagaatgcg ctggtcctgc tgctgggctc cgggatcccg 780 gcgaacctgc cgcaaggcct gggcctggac cagaccctgc tgaccgaagt gccggcgggt 840 ctgccgtcgg acctgctgca acggcgcccg gacatcctcg aggccgagca ccagctcatg 900 gctgccaacg ccagcatcgg cgccgcgcgc gcggcgttct tcccgagcat cagcctgacc 960 gccaacgccg gcaccatgag ccgccaactg tccggcctgt tcgacgccgg ttcgggttcc 1020 tggttgttcc agccgtcgat caacctgccg atcttcaccg ccggcagcct gcgtgccagc 1080 ctggactacg cgaagatcca gaaggacatc aacgtcgcgc agtacgagaa ggcgatccag 1140 acggcgttcc aggaagtcgc cgacggcctg gccgcgcgcg gtaccttcac cgagcagttg 1200 caggcgcagc gcgatctggt caaggccagc gacgagtact accagctcgc cgacaagcgc 1260 tatcgcacgg gggtggacaa ctacctgacc ctgctcgacg cgcaacgctc gctgttcacc 1320 gcgcagcagc aactgatcac cgaccgcctc aatcagctga ccagcgaggt caacctgtac 1380 aaggccctcg gcggcggctg gaaccagcag accgtgaccc agcagcagac cgcgaagaag 1440 gaagatcccc aggcttga 1458 <210> 2 <211> 678 <212> DNA <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 2 cagcgtttgc cgggcgacct gtcgaccacc ggcagtccgg cgatttccag ccagtacggg 60 gtgaccctgg gcactaccgc ctgggaactc gatctcttcg gccgcctgcg cagcctgcgc 120 gaccaggccc tggagcagta cctggcgacc gaacaggcgc agcgcagcgc gcagaccacc 180 ctggtggcca gcgtggcgac cgcctacctg acgctgaagg ccgaccaggc gcagttgcag 240 ctgaccaagg acaccctggg cacctaccag aagagtttcg acctgaccca gcgcagctac 300 gacgtcggcg tcgcctccgc gctcgacctg cgccaggcgc agaccgccgt ggaaggcgcc 360 cgcgcgaccc tggcgcagta cacccgcctg gtagcccagg accagaatgc gctggtcctg 420 ctgctgggct ccgggatccc ggcgaacctg ccgcaaggcc tgggcctgga ccagaccctg 480 ctgaccgaag tgccggcggg tctgccgtcg gacctgctgc aacggcgccc ggacatcctc 540 gaggccgagc accagctcat ggctgccaac gccagcatcg gcgccgcgcg cgcggcgttc 600 ttcccgagca tcagcctgac cgccaacgcc ggcaccatga gccgccaact gtccggcctg 660 ttcgacgccg gttcgggt 678 <210> 3 <211> 485 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 3 Met Lys Arg Ser Phe Leu Ser Leu Ala Val Ala Ala Val Val Leu Ser 1 5 10 15 Gly Cys Ser Leu Ile Pro Asp Tyr Gln Arg Pro Glu Ala Pro Val Ala 20 25 30 Ala Ala Tyr Pro Gln Gly Gln Ala Tyr Gly Gln Asn Thr Gly Ala Ala 35 40 45 Ala Val Pro Ala Ala Asp Ile Gly Trp Arg Glu Phe Phe Arg Asp Pro 50 55 60 Gln Leu Gln Gln Leu Ile Gly Val Ala Leu Glu Asn Asn Arg Asp Leu 65 70 75 80 Arg Val Ala Ala Leu Asn Val Glu Ala Phe Arg Ala Gln Tyr Arg Ile 85 90 95 Gln Arg Ala Asp Leu Phe Pro Arg Ile Gly Val Asp Gly Ser Gly Thr 100 105 110 Arg Gln Arg Leu Pro Gly Asp Leu Ser Thr Thr Gly Ser Pro Ala Ile 115 120 125 Ser Ser Gln Tyr Gly Val Thr Leu Gly Thr Thr Ala Trp Glu Leu Asp 130 135 140 Leu Phe Gly Arg Leu Arg Ser Leu Arg Asp Gln Ala Leu Glu Gln Tyr 145 150 155 160 Leu Ala Thr Glu Gln Ala Gln Arg Ser Ala Gln Thr Thr Leu Val Ala 165 170 175 Ser Val Ala Thr Ala Tyr Leu Thr Leu Lys Ala Asp Gln Ala Gln Leu 180 185 190 Gln Leu Thr Lys Asp Thr Leu Gly Thr Tyr Gln Lys Ser Phe Asp Leu 195 200 205 Thr Gln Arg Ser Tyr Asp Val Gly Val Ala Ser Ala Leu Asp Leu Arg 210 215 220 Gln Ala Gln Thr Ala Val Glu Gly Ala Arg Ala Thr Leu Ala Gln Tyr 225 230 235 240 Thr Arg Leu Val Ala Gln Asp Gln Asn Ala Leu Val Leu Leu Leu Gly 245 250 255 Ser Gly Ile Pro Ala Asn Leu Pro Gln Gly Leu Gly Leu Asp Gln Thr 260 265 270 Leu Leu Thr Glu Val Pro Ala Gly Leu Pro Ser Asp Leu Leu Gln Arg 275 280 285 Arg Pro Asp Ile Leu Glu Ala Glu His Gln Leu Met Ala Ala Asn Ala 290 295 300 Ser Ile Gly Ala Ala Arg Ala Ala Phe Phe Pro Ser Ile Ser Leu Thr 305 310 315 320 Ala Asn Ala Gly Thr Met Ser Arg Gln Leu Ser Gly Leu Phe Asp Ala 325 330 335 Gly Ser Gly Ser Trp Leu Phe Gln Pro Ser Ile Asn Leu Pro Ile Phe 340 345 350 Thr Ala Gly Ser Leu Arg Ala Ser Leu Asp Tyr Ala Lys Ile Gln Lys 355 360 365 Asp Ile Asn Val Ala Gln Tyr Glu Lys Ala Ile Gln Thr Ala Phe Gln 370 375 380 Glu Val Ala Asp Gly Leu Ala Ala Arg Gly Thr Phe Thr Glu Gln Leu 385 390 395 400 Gln Ala Gln Arg Asp Leu Val Lys Ala Ser Asp Glu Tyr Tyr Gln Leu 405 410 415 Ala Asp Lys Arg Tyr Arg Thr Gly Val Asp Asn Tyr Leu Thr Leu Leu 420 425 430 Asp Ala Gln Arg Ser Leu Phe Thr Ala Gln Gln Gln Leu Ile Thr Asp 435 440 445 Arg Leu Asn Gln Leu Thr Ser Glu Val Asn Leu Tyr Lys Ala Leu Gly 450 455 460 Gly Gly Trp Asn Gln Gln Thr Val Thr Gln Gln Gln Thr Ala Lys Lys 465 470 475 480 Glu Asp Pro Gln Ala 485 <210> 4 <211> 226 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 4 Gln Arg Leu Pro Gly Asp Leu Ser Thr Thr Gly Ser Pro Ala Ile Ser 1 5 10 15 Ser Gln Tyr Gly Val Thr Leu Gly Thr Thr Ala Trp Glu Leu Asp Leu 20 25 30 Phe Gly Arg Leu Arg Ser Leu Arg Asp Gln Ala Leu Glu Gln Tyr Leu 35 40 45 Ala Thr Glu Gln Ala Gln Arg Ser Ala Gln Thr Thr Leu Val Ala Ser 50 55 60 Val Ala Thr Ala Tyr Leu Thr Leu Lys Ala Asp Gln Ala Gln Leu Gln 65 70 75 80 Leu Thr Lys Asp Thr Leu Gly Thr Tyr Gln Lys Ser Phe Asp Leu Thr 85 90 95 Gln Arg Ser Tyr Asp Val Gly Val Ala Ser Ala Leu Asp Leu Arg Gln 100 105 110 Ala Gln Thr Ala Val Glu Gly Ala Arg Ala Thr Leu Ala Gln Tyr Thr 115 120 125 Arg Leu Val Ala Gln Asp Gln Asn Ala Leu Val Leu Leu Leu Gly Ser 130 135 140 Gly Ile Pro Ala Asn Leu Pro Gln Gly Leu Gly Leu Asp Gln Thr Leu 145 150 155 160 Leu Thr Glu Val Pro Ala Gly Leu Pro Ser Asp Leu Leu Gln Arg Arg 165 170 175 Pro Asp Ile Leu Glu Ala Glu His Gln Leu Met Ala Ala Asn Ala Ser 180 185 190 Ile Gly Ala Ala Arg Ala Ala Phe Phe Pro Ser Ile Ser Leu Thr Ala 195 200 205 Asn Ala Gly Thr Met Ser Arg Gln Leu Ser Gly Leu Phe Asp Ala Gly 210 215 220 Ser Gly 225 <210> 5 <211> 14 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 5 Thr Arg Gln Arg Leu Pro Gly Asp Leu Ser Thr Thr Gly Ser 1 5 10 <210> 6 <211> 15 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 6 Ala Gly Thr Met Ser Arg Gln Leu Ser Gly Leu Phe Asp Ala Gly 1 5 10 15 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 caaggacgag gcgtccaagc agcag 25 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 cgcactgctg acccgcaacc gctaa 25 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 cgcagttgca gcaactgatc 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 acctaccaga agagtttcga 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 tggttgttcc agccgtcgat 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 ccgaagagat cgagttccca 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 acatcggctg gcgcgagttc 20 <210> 14 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 gactccatgg gccagcgttt gccgggcg 28 <210> 15 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 aagtctgcag tcaacccgaa ccggcgtcga a 31 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 taatacgact cactataggg 20 <210> 17 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 aagtagatct caacccgaac cggcgtcgaa 30 <210> 18 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 18 Ala Gly Thr Met Ser Arg Gln Leu Ser Gly Leu Phe Asp Ala Gly Cys 1 5 10 15

Claims

녹농균 PA0427 단백질에 대한 항체의 생성을 유도할 수 있는 단백질 항원 또는 펩티드 항원을 포함하는 항원 조성물.
하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질:

(i) SEQ ID NO:4의 아미노산 서열을 포함하는 단백질;

(ii) 하나 이상의 아미노산이 결실, 치환, 또는 삽입된 SEQ ID NO:4의 아미노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO:4의 아미노산 서열로 이루어진 단백질과 기능적으로 동등한 단백질;

(iii) SEQ ID NO:4의 아미노산 서열을 코드화하는 폴리뉴클레오티드와 가혹한 조건하에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코드화되고, SEQ ID NO:4의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질과 기능적으로 동등한 단백질; 및

(iv) SEQ ID NO:4의 아미노산 서열과 70% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO:4의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질과 기능적으로 동등한 단백질.
SEQ ID NO:5의 아미노산 서열 또는 하나 이상의 보존적 치환을 함유하는 SEQ ID NO:5의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드.
SEQ ID NO:6의 아미노산 서열 또는 하나 이상의 보존적 치환을 함유하는 SEQ ID NO:6의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드.
제2항에 따른 단백질 또는 제3항 또는 제4항에 따른 펩티드를 포함하는 항원 조성물.
제1항 또는 제5항에 기재된 항원 조성물 및 선택적으로 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 및/또는 보강제를 포함하는, 녹농균과 관련된 질환의 예방 또는 치료용 백신 조성물.
녹농균 PA0427 단백질 또는 그것의 일부에 대한 항체, 또는 그것의 기능적 단편에 대한 항체.
제7항에 있어서, 상기 녹농균 PA0427 단백질의 일부가 녹농균 PA0427 단백질의 세포-표면 노출부분인, 항체 또는 그것의 기능적 단편.
제8항에 있어서, 상기 녹농균 PA0427 단백질의 세포-표면 노출부분이 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체 또는 그것의 기능적 단편:

(i) SEQ ID NO:4의 아미노산 서열을 포함하는 단백질;

(ii) 하나 이상의 아미노산이 결실, 치환, 또는 삽입된 SEQ ID NO:4의 아미 노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO:4의 아미노산 서열로 이루어진 단백질과 기능적으로 동등한 단백질;

(iii) SEQ ID NO:4의 아미노산 서열을 코드화하는 폴리뉴클레오티드와 가혹한 조건하에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코드화되고, SEQ ID NO:4의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질과 기능적으로 동등한 단백질; 및

(iv) SEQ ID NO:4의 아미노산 서열과 70% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, SEQ ID NO:4의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질과 기능적으로 동등한 단백질.
제8항에 있어서, 상기 녹농균 PA0427 단백질의 세포 표면 노출 부분이 SEQ ID NO:5의 아미노산 서열 또는 하나 이상의 보존적 치환을 함유하는 SEQ ID NO:5의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드인, 항체 또는 그것의 기능적 단편.
제8항에 있어서, 상기 녹농균 PA0427 단백질의 세포 표면 노출 부분이 SEQ ID NO:6의 아미노산 서열 또는 하나 이상의 보존적 치환을 함유하는 SEQ ID NO:6의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드인, 항체 또는 그것의 기능적 단편.
제11항에 있어서, 수탁번호 FERM BP-10782로 기탁된 하이브리도마에 의해 생성되는 항체 또는 그것의 기능적 단편.
제7항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 단일클론성 항체인 항체 또는 그것의 기능적 단편.
수탁번호 FERM BP-10782로 기탁된 하이브리도마.
제7항에 있어서, 제14항에 기재된 하이브리도마에 의해 생성된 단일클론성 항체와 동일한 항원과 교차반응을 하는 단일클론성 항체인, 항체 또는 그것의 기능적 단편.
제7항 내지 제13항 및 제15항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그것의 기능적 단편 및 선택적으로 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석제를 포함하는 녹농균과 관련된 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
제6항 또는 제16항에 있어서, 상기 녹농균과 관련된 질환이 녹농균 감염에 의한 전신성 감염 질환인 백신 조성물 또는 약제학적 조성물.
제17항에 있어서, 상기 녹농균 감염이 다제 내성 녹농균 감염인 백신 조성물 또는 약제학적 조성물.
제7항 내지 제13항 및 제15항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그것의 기능 적 단편을 포함하는 녹농균 감염용 진단제.
제7항 내지 제13항 및 제15항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그것의 기능적 단편을 포함하는 녹농균 검출용 키트.