CN105424929B - 一种铜绿假单胞菌抗体检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

一种铜绿假单胞菌抗体检测试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种铜绿假单胞菌抗体检测试剂盒，包括：酶标板、包被于酶标板固相载体的铜绿假单胞菌外膜蛋白；阳性血清、阴性血清、洗涤液、显色液、酶标试剂以及终止液。同时，本发明还提供了检测方法，包括将稀释后的待检血清加入到酶标板孔内，反应完毕后加入洗涤液静置洗涤；在酶标板中加入稀释后的酶标试剂，于37℃条件下作用0.5h~3h；加入洗涤液静置3min~10min后再洗涤；洗涤完毕后加入显色剂反应10min~20min，显色反应完毕后加入终止液终止；并使用酶标仪检测在450nm和参考波长630nm下的读数。本发明的试剂盒以及检测方法，可以检测麝血清中的抗体，高效迅速，不仅具有良好的特异性，而且操作简单，成本低廉。

Description

一种铜绿假单胞菌抗体检测试剂盒及检测方法
技术领域
本发明涉及抗体检测方法，具体涉及到一种铜绿假单胞菌抗体检测试剂盒及检测方法。
背景技术
ELISA(Enzyme-linked Immunosorbent Assay)为酶联免疫吸附试验的缩写，该方法是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的分析技术。其基本原理是：①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，被检样品(含有受检的抗体或抗原)和酶标抗原或抗体与固相载体表面的抗原或抗体结合。通过洗涤除去未结合的游离反应物，最后，结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与样品中受检物质的量直接相关，使用酶标仪即可定性或定量分析。
铜绿假单胞菌(P.Aeruginosa)原称绿脓杆菌。在自然界分布广泛，为土壤中存在的最常见的细菌之一。各种水、空气、正常人的皮肤、呼吸道和肠道等都有本菌存在。铜绿假单胞菌是一种常见的条件致病菌，属于非发酵革兰氏阴性杆菌；是引发麝出现化脓性疾病的主要菌株。因此通过对麝血清中是否含有抗体进行检测，以进行科研是非常必要的。
发明内容
本发明的目的是提供一种铜绿假单胞菌抗体检测试剂盒，以及使用抗体检测试剂盒检测麝血清中抗体的方法。
为达上述目的，本发明的一个实施例中提供了一种铜绿假单胞菌抗体检测试剂盒，包括：
酶标板，用于提供固相载体；
包被于所述酶标板固相载体的铜绿假单胞菌外膜蛋白；
阳性血清、阴性血清、洗涤液、显色液、酶标试剂以及终止液。
进一步的，阳性血清为免疫铜绿假单胞菌的家兔血清，阴性血清为健康麝血清；洗涤液为PBST溶液，显色液为TMB试剂；酶标试剂为HRP-SPA辣根过氧化物酶-金黄色葡萄球菌蛋白A；终止液为2mol/L的硫酸溶液。
本发明的另一个目的是提供一种铜绿假单胞菌抗体的检测方法，包括以下步骤：
1)、将稀释后的待检血清加入到酶标板孔内，于37℃条件下作用0.5h～3h，反应完毕后加入洗涤液静置3min～10min，然后洗涤；
2)、在酶标板中加入稀释后的酶标试剂HRP-SPA辣根过氧化物酶-金黄色葡萄球菌蛋白A，于37℃条件下作用0.5h～3h；加入洗涤液静置3min～10min后再洗涤；
3)、洗涤完毕后加入显色剂反应10min～20min，显色反应完毕后加入终止液终止；并使用酶标仪检测在450nm和参考波长630nm下的读数。
进一步的，待检血清的加入量为50μL/孔～200μL/孔。
进一步的，洗涤时间为3min～10min。
进一步的，酶标试剂的加入量为50μL/孔～200μL/孔；酶标试剂的稀释度为1:64000。
进一步的，显色剂的加入量为50μL/孔～200μL/孔，显示反应的温度为37℃。
进一步的，终止液的加入量为50μL/孔～200μL/孔。
进一步的，第一种洗涤液为PBST溶液，每升PBST溶液中含有KH2PO4 0.27g，Na2HPO4·12H2O 3.58g，NaCl 8.0g，KCl 0.2g，吐温-20 0.5mL。
进一步的，第二种洗涤液为PBST溶液，每升PBST溶液中含有KH2PO4 0.27g，Na2HPO4·12H2O 3.58g，NaCl 8.0g，KCl 0.2g，吐温-20 0.5mL，庆大霉素0.02g，硫酸铵0.05g。
本发明的反应机理
本研究采用间接ELISA方法检测血清标本中的铜绿假单胞菌抗体。以提取的铜绿假单胞菌Sp-1株的外膜蛋白作为包被抗原，包被酶标板，制成固相抗原。往包被抗原的孔中加入待检血清，如果血清中有该抗体，则与随后加入的辣根过氧化物酶(HRP)标记的葡萄球菌A蛋白(SPA)结合，形成抗原-抗体-HRP-SPA复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。用酶标仪在450nm和630nm的双波长下测定吸光度(OD值)。
本发明的试剂盒以及检测方法，可以准确的检测麝血清中的抗体，高效迅速，不仅具有良好的特异性，而且操作简单，成本低廉。
具体实施方式
免疫原的制备
将铜绿假单胞菌Sp-1菌株复壮培养后，挑取单个菌落接种于100mL普通肉汤培养基，于37℃160r/min摇床振荡培养16h后作为种子液，此种子液按1％的体积比接种于新鲜普通肉汤中进行增菌培养12～18h。
按培养基总体积加入终浓度为0.4％的甲醛灭活，37℃温箱培养24h，期间拿出摇晃几次。将灭活后菌液6000r/min离心15min，弃上清，用灭菌的0.1mol/L、PH7.4的PBS洗涤3次，调节菌含量至1.0×1010CFU/mL，备用。然后釆用注射器混匀法，取上述菌液和等量的弗氏完全佐剂分别加入小瓶中，反复抽吸吹打注射器，直至形成油包水乳剂为止，滴在水中不立即扩散，4℃保存情况下不分层即可，并以此作为首免抗原。另取上述部分灭活菌液加入弗氏不完全佐剂制成后续免疫抗原。
免疫程序
a.基础免疫：首次免疫用弗氏完全佐剂抗原在4只健康家兔的背部皮下多点注射，2.5mL/只；第二次免疫和第三次免疫用弗氏不完全佐剂抗原，剂量同前，每次免疫间隔14d。在第三次免疫前采取少量耳缘静脉血，检测血清抗体效价。
b.加强免疫：三次免疫后一周，每只家兔再用3mL未灭活的等量浓度菌液进行加强免疫，一周后采血检验血清效价。
Sp-1株抗血清的分离
采集的血液置37℃1h后转入4℃冰箱过夜，小心吸取析出的血清，经3000r/min离心15min，分装于1.5mL的EP管，存于-80℃备用。
双向琼脂扩散试验测免疫血清效价
以提取的铜绿假单胞菌外膜蛋白作为抗原，将分离的Sp-1株抗血清以2倍比稀释，采用双向琼脂扩散试验检测抗体效价，同时设阴性对照和生理盐水的空白对照。效价达到1:8倍的可作为本试验中的阳性血清。
本发明提供一种铜绿假单胞菌抗体检测试剂盒，包括：
酶标板，用于提供固相载体；
包被于所述酶标板固相载体的铜绿假单胞菌外膜蛋白；
阳性血清、阴性血清、洗涤液、显色液、酶标试剂以及终止液。
其中，阳性血清为免疫铜绿假单胞菌的家兔血清，阴性血清为健康麝血清；洗涤液为PBST溶液，显色液为TMB试剂；酶标试剂为HRP-SPA辣根过氧化物酶-金黄色葡萄球菌蛋白A；终止液为2mol/L的硫酸溶液。
铜绿假单胞菌抗体ELISA的检测方法
1)、将待检血清加入到酶标板孔内，每孔100μL，于37℃条件下作用1.5h，反应完毕后加入洗涤液静置5min，然后洗涤3次；
2)、在酶标板中加入稀释后的酶标试剂HRP-SPA辣根过氧化物酶-金黄色葡萄球菌蛋白A，酶标试剂的稀释度为1:64000，每孔100μL，于37℃条件下作用1.5h；加入洗涤液静置5min后再洗涤；
3)、洗涤完毕后加入显色剂在37℃下反应15min，每孔100μL，显色反应完毕后加入终止液2mol/L的硫酸终止；并使用酶标仪检测在450nm和参考波长630nm下的读数。
其中，洗涤液为PBST溶液，每升PBST溶液中含有KH2PO4 0.27g，Na2HPO4·12H2O3.58g，NaCl 8.0g，KCl 0.2g，吐温-20 0.5mL；庆大霉素0.02g，硫酸铵0.05g。
实施例1：检测条件的选择
抗原包被条件的优化
以确定的外膜蛋白浓度包被酶标板，将包被条件设为4℃条件下分别放12h、24h，37℃条件下分别放1h、2h、3h、4h，共6组，每组做两个重复。以确定的最佳稀释倍数稀释血清，HRP-SPA做1:2000稀释，其余按常规间接ELISA程序进行试验。以P/N值最大的一组为抗原最适包被条件。
从表1可以看出，37℃包被条件下的P/N值明显大于4℃包被条件下的P/N值。在37℃条件下，阳性血清的OD值随着包被时间的延长而增加，在37℃包被4h时，P值为1.824，N值为0.051，P/N值达到最大，为35.758。因此，本试验的抗原包被的最佳温度为37℃，最佳包被时间为4h。
表1包被条件优化试验结果
HRP-SPA最适工作浓度及最适作用时间的确定
根据已确定的最佳条件试验，将HRP-SPA的稀释度分别设为:1:8000、1:16000、1:32000、1:64000、1:128000、1:256000、1:512000，其余按常规间接ELISA程序操作，以P/N值最大的一组为HRP-SPA最佳工作浓度。
根据已确定的HRP-SPA最适工作浓度，根据其作用时间将试验分成37℃条件下0.5h、1h、1.5h和37℃2h共4组。其余按常规间接ELISA程序操作，以P/N值最大的一组为HRP-SPA最适作用时间。
由表2可知，随着HRP-SPA稀释倍数的增加，阳性血清和阴性血清的OD值呈递减趋势。当HRP-SPA稀释64000倍时，P值为1.264，N值为0.029，P/N最大，为43.091。本试验HRP-SPA的最佳稀释倍数为64000倍。
表2HRP-SPA稀释倍数的选择
以HRP-SPA稀释64000倍进行HRP-SPA最佳反应时间试验，结果见表3。在0.5h到1.5h之间，随着反应时间的延长，P值呈增加的趋势，反应时间为2h时，P值已趋于平缓。当HRP-SPA反应1.5h时，P值为1.267，N值为0.032，P/N值最大，为39.594。本试验HRP-SPA的最佳工作时间为37℃孵育1.5h。
表3HRP-SPA反应时间的选择
TMB显色时间的选择
根据已确定的最佳条件进行试验，将显色时间设为37℃条件下5min、10min、15min和20min，其余按常规间接ELISA程序操作，以P/N值最大的一组为底物最适显色时间。
由表4可以看出，随着显色时间的延长，P值呈先升后降的趋势，当显色15min时，P值为1.200，N值为0.020，P/N最大，为59.975。TMB的最佳显色时间为15min。
表4TMB显色时间的选择
实施例2：特异性实验
2.1交叉试验
用大肠杆菌、不动杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的18h培养菌液，分别制备免疫原，按基础免疫程序免疫小鼠，每组5只，共20只。分离血清，用建立的间接ELISA方法检测，并设立阳性对照和林麝阴性血清对照。根据P/N值判定这四种菌的血清是否呈铜绿假单胞菌抗体阳性。交叉试验检测结果见表5，分别含有金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌和不动杆菌的P/N值均小于2，判为阴性，即该方法与上述血清无交叉反应。本试验建立的间接ELISA方法特异性较好。
表5交叉试验结果
*“-”表示阴性，“+”表示阳性。
2.2阻断试验
取Sp-1株阳性血清作2倍比稀释，从1:250到l:8000，共6个稀释度，将每个稀释度的阳性血清都分为两份，一份加等体积的最佳稀释倍数的外膜蛋白，此为阻断组；另一份加等体积的包被缓冲液，此为阻断对照组。将处理后的血清在37℃孵育1.5h后，10000rpm离心20min。阴性血清也作2倍比稀释，从1:500到1:16000，共6个稀释度。按已确定的最佳反应条件进行试验，采用双波长法测定结果，计算阻断率。阻断率的计算方法如下：
阻断试验结果
由表6可以看出，血清稀释倍数一定时，阻断组的OD值显著低于阻断对照组，阻断率在60％以上，说明外膜蛋白能阻断阳性血清与它的反应。本试验建立的间接ELISA方法特异性较好。
表6阻断试验
实施例3
采用本发明记载的方法检测32份阳性麝血清，32份阳性麝血清为相同血清。检测方法和实验参数步骤为：按1.5μg/mL包被外膜蛋白，包被温度和时间为37℃4h；洗涤2次后，以5％脱脂奶粉在37℃封闭2h；洗涤3次后，加入待检血清，与外膜蛋白37℃条件下作用1.5h；洗涤3次后，加入HRP-SPA(稀释倍数为64000倍)，在37℃条件下作用1.5h；洗涤4次后加入显色液，37℃作用15min，终止读数，其中1～16份采用第一种洗涤液洗涤，17～32份采用第二种洗涤液进行洗涤。本次实验的检测结果如下表7。
表7：麝血清检测结果
由此可见，本发明的抗体检测试剂盒具有较高的特异性，检测结果可靠，误差率低。从表7的统计结果分析得知，采用第二种洗涤液的检测灵敏度和特异性要高于采用第一种洗涤液，且误差率也要相对较少；说明采用第二种洗涤液时具有更优的特异性效果和可靠性。

Claims (7)

1.一种铜绿假单胞菌抗体检测试剂盒，包括：
酶标板，用于提供固相载体；
包被于所述酶标板固相载体的铜绿假单胞菌外膜蛋白；
阳性血清、阴性血清、洗涤液、显色液、酶标试剂以及终止液；
所述阳性血清为免疫铜绿假单胞菌的家兔血清，所述阴性血清为健康麝血清；所述洗涤液为PBST溶液，所述显色液为TMB试剂；所述酶标试剂为HRP-SPA辣根过氧化物酶-金黄色葡萄球菌蛋白A；所述终止液为2mol/L的硫酸溶液；所述洗涤液为PBST溶液，每升PBST溶液中含有KH2PO4 0.27 g，Na2HPO4•12H2O 3.58 g，NaCl 8.0 g，KCl 0.2 g，吐温-20 0.5 mL，庆大霉素0.02g，硫酸铵0.05g。
2.一种铜绿假单胞菌抗体的检测方法，包括以下步骤：
1）、将稀释后的待检血清加入到酶标板孔内，于37℃条件下作用0.5h~1.5h，反应完毕后加入洗涤液静置3min~10min，然后洗涤；
2）、在酶标板中加入稀释后的酶标试剂HRP-SPA辣根过氧化物酶-金黄色葡萄球菌蛋白A，于37℃条件下作用0.5h~1.5h；加入洗涤液静置3min~10min后再洗涤；所述洗涤液为PBST溶液，每升PBST溶液中含有KH2PO4 0.27 g，Na2HPO4•12H2O 3.58 g，NaCl 8.0 g，KCl 0.2 g，吐温-20 0.5 mL，庆大霉素0.02g，硫酸铵0.05g；
3）、洗涤完毕后加入显色剂反应10min~20min，显色反应完毕后加入终止液终止；并使用酶标仪检测在450nm和参考波长630nm下的读数。
3.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于：所述待检血清的加入量为50µL/孔~200µL/孔。
4.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于：所述洗涤时间为3min~10min。
5.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于：所述酶标试剂的加入量为50µL/孔~200µL/孔；酶标试剂的稀释度为1:64000。
6.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于：所述显色剂的加入量为50µL/孔~200µL/孔，显示反应的温度为37℃。
7.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于：所述终止液的加入量为50µL/孔~200µL/孔。
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