CN104792996A - 一种狂犬病毒抗体(IgG)酶联免疫检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents
一种狂犬病毒抗体(IgG)酶联免疫检测试剂盒及其检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种检测狂犬病毒抗体（IgG）酶联免疫检测试剂盒及其检测方法，其特点是;检测试剂盒由纯化的狂犬病毒抗原包被的微孔板、酶标记的SPA及其他试剂配套组成；检测方法应用间接法原理检测人或动物血清或血浆中的狂犬病毒IgG抗体，适用于狂犬疫苗免疫后血清学效果评价及流行病学调查。本发明应用的酶标抗体是金黄色葡萄球菌A蛋白（StaphylococalProteinA，SPA），其优点在于SPA能与人及多种哺乳动物血清IgG分子中的Fc片段结合，因此，本发明在具有ELISA试剂盒的全部特点的同时，不仅可以用于人的狂犬病毒抗体检测，还可以用于多种动物的免疫效果检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测狂犬病毒抗体（IgG）的方法,特别是涉及一种狂犬病毒抗体（IgG）酶联免疫检测试剂盒及其检测方法，属于酶联免疫检测技术领域。本发明所述的试剂盒采用间接法测定样品中的狂犬病毒抗体（IgG）含量，可用于狂犬疫苗免疫效果的监控、个体免疫状态的确定。
背景技术
狂犬病（Rabies）俗称疯狗症，是一种人畜共患的传染病，病原体为狂犬病病毒；所有温血动物包括人类，都可能被感染。它会导致动物的急性脑炎和周围神经炎症，发病后死亡率高达百分之百。没有接受疫苗免疫的感染者，当神经症状出现后几乎必然死亡，通常的死亡原因都是由于中枢神经（脑-脊髓）被病毒破坏，最终死于自主神经系统受损导致的脏器衰竭、呼吸衰竭。但是只要及时的接种疫苗，一般都能诱发机体产生足够的免疫力消灭病毒。因而对已注射过疫苗的人或动物进行狂犬病毒抗体（IgG）的检测，是一种有效的评估免疫效果的手段。
目前市场上有类似的相关用于检测狂犬病毒抗体的试剂盒，多数是ELISA方法，例如。
公开号为CN 101936997A的中国发明给出的一种《 人用抗狂犬病毒IgG抗体ELISA检测试剂盒》，所述检测试剂盒包含有：预包被狂犬病毒抗原酶标板、封闭液、样品稀释液、阳性对照、阴性对照、酶结合物、浓缩洗涤液、酶底物溶液和终止液，其特征在于：酶标板预先包被抗狂犬病毒单克隆抗体,包被缓冲液0.05M pH9.6的碳酸盐缓冲液,包被量为每孔0.1-1μg;封闭液为质量浓度是1-10%的BSA或脱脂牛奶;封闭完再包被狂犬病毒纯化抗原,包被量为每孔0.1-1μg;样品稀释液为含有质量浓度0.1-10%牛血清白蛋白BSA和含有质量浓度0.01-0.05%NaN3的0.01mol/L及pH7.2-7.4的磷酸盐缓冲液(PBS);酶结合物为辣根过氧化物酶-小鼠抗人IgG酶结合物;浓缩洗涤液为含体积浓度0.05%吐温-20的0.01mol/L及pH7.2-7.4的PBS;酶底物A溶液为3,3’-5,5’-四甲基联苯胺溶液,酶底物B溶液为双氧水溶液;终止液为1mol/L H2SO4溶液,阳性对照、阴性对照放置在盒内。
公开号为CN101936998A的中国发明给出的一种《犬用抗狂犬病毒IgG抗体ELISA检测试剂盒》，试剂盒内:酶标板预先包被抗狂犬病毒单克隆抗体,包被缓冲液为0.05M pH9.6的碳酸盐缓冲液,包被量为每孔0.1-1μg;封闭液为质量浓度是1-10%的BSA或脱脂牛奶;封闭完再包被狂犬病毒纯化抗原,包被量为每孔0.1-1μg;样品稀释液为含有质量浓度0.1-10%BSA和含有质量浓度0.01-0.05%NaN3的0.01mol/L及pH7.2-7.4的PBS;酶结合物为辣根过氧化物酶-兔抗犬IgG酶结合物;浓缩洗涤液为含体积浓度0.05%吐温-20的0.01mol/L及pH7.2-7.4的PBS;酶底物A溶液为3,3’-5,5’-四甲基联苯胺溶液,酶底物B溶液为双氧水溶液;终止液为1mol/L H2SO4溶液,阳性对照、阴性对照放置在盒内。
公开号为CN 102175867A的中国发明给出的《一种检测狂犬病毒抗体的酶联免疫试剂盒》，其特征在于，其包括：1)包被有0.05μg/ml～0.1μg/ml重组狂犬病病毒G蛋白的酶标板；2)样品稀释液：含有0.5‰～1‰酪蛋白钠盐的磷酸盐缓冲液；3)洗涤液：含有0.5‰～1‰吐温的磷酸盐缓冲液；4)酶标记物：用辣根过氧化物酶标记的鼠抗人IgGFc片段单克隆抗体；5)显色剂A：含有0.4‰～0.6‰过氧化氢脲的柠檬酸盐缓冲液；6)显色剂B：含有0.2‰～0.25‰四甲基联苯胺的柠檬酸盐缓冲液；7)终止液：1.5mol/L～2mol/L硫酸溶液；8)阴性对照：正常人血清；9)阳性对照：含有狂犬病毒抗体的人血清。
公开号为CN 103323588A的中国发明给出的《一种犬狂犬病毒抗体的检测方法及检测试剂盒》，这种犬狂犬病毒抗体的检测方法，其特征在于包括下述步骤：（1）确定标准点：通过中和实验用标准品进行标定本方法的标准点，其抗体效价为0.5IU/mL；（2）编号：每次试验应在包被板上设空白对照孔1孔，标准孔3孔，阴性对照孔1孔，阳性对照孔1孔，其余为待检样品孔；（3）加样品稀释液：用加样器在包被板的标准空与待检样品孔加入样品稀释液，每孔100ul；空白对照孔、阴性对照孔及阳性对照孔不加样品稀释液；（4）加样：分别于标准孔加入标准品10μl，各待检样品孔加入待检样品10μl，阴性对照孔加入阴性对照血清100μl，阳性对照孔加入阳性对照血清100μl；空白对照孔不加样；（5）温育（一）：充分混匀，贴上封板膜，37±2℃温育60分钟；（6）洗板（一）：洗板机洗或手洗5次；（7）加酶标结合物：除空白对照孔以外，各孔中加入酶标结合物100μl；（8）温育（二）：贴上封板膜，37±2℃温育30分钟；（9）洗板（二）：方法同洗板（一）；（10）加显色剂：每孔加入显色剂A 50μl，全部加完后再在每孔中加入显色剂B 50μl，混匀；（11）温育（三）：37±2℃显色10分钟，显色10分钟指从开始加显色剂B 到开始加终止液的间隔时间；（12）终止：显色完毕后立即于每孔加50μl终止液， 混匀；（13） 测定： 终止后应在10分钟内完成判读，对空白对照调零，用酶标仪在450nm波长处测定吸光值，或使用双波长测定吸光值，测定波长为450nm，参考波长可选630nm或655nm；（14）结果判定：若待测样品的OD值≥标准品OD值，结果判阳性且具备免疫保护水平；若待测样品的OD值＜标准品OD值，结果为样品不具备免疫保护水平，个体需进行进一步的免疫。
以上技术方案因为其操作简便、灵敏度高、结果稳定、准确度好等特点，得到广泛认可及应用。但是，这些试剂盒所具有的应用面较窄，针对每一类动物的IgG抗体的检测，均需要制备对应的二抗及抗酶标结合物，使用起来并不方便；同时，在试剂盒灵敏度上，仍有提高的空间，可以进行更精准的检测，使得假阳性、假阴性结果出现的几率大大下降。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的上述不足,经过深入研究和大量试验后，提供一种检测狂犬病毒抗体（IgG）酶联免疫检测试剂盒及其检测方法，由纯化的狂犬病毒抗原包被的微孔板、酶标记的SPA及其他试剂配套组成，应用间接法原理检测人或动物血清或血浆中的狂犬病毒IgG抗体。适用于狂犬疫苗免疫后血清学效果评价及流行病学调查。
本发明试剂盒应用的酶标抗体是金黄色葡萄球菌A蛋白（Staphylococal Protein A，SPA），其优点在于SPA能与人及多种哺乳动物血清IgG分子中的Fc片段结合，这种特点使得其较之其他酶结合物，具有更高的灵敏度、低干扰等特点，同时具有广泛的应用面，结合的亲和性次序依次是猪、狗、兔、人、猴、鼠、小鼠及牛；对大白鼠、绵羊的亲和力差；对马、犊牛、山羊等无亲和力。因此，本发明试剂盒在具有ELISA试剂盒的全部特点同时，不仅可以用于人的狂犬病毒抗体检测，还可以用于多种动物的免疫效果检测。
为实现上述目的，本发明采用如下原理：先确定RV-Ag包被浓度后包被于微孔板中，加入标准样品或待测样品，孵育后，再加入酶标记的SPA与待测样品结合，反应后加入底物进行显色反应加以测定，根据标准品的吸光度值与其浓度的关系作标准曲线，即可测定待测样品的含量。
本发明给出的技术解决方案是：这种狂犬病毒抗体（IgG）酶联免疫检测试剂盒，主要有纯化的狂犬病毒抗原包被板、浓缩稀释液、酶结合物工作液、底物显色液A、底物显色液B、浓缩洗涤液、阴阳性对照、终止液，包括如下：
1）96孔酶标板，用0.05mol/L的pH9.6碳酸盐碳酸氢盐缓冲液，稀释狂犬病毒纯化液进行包被，终浓度的蛋白含量为0.1-5μg/ml；
2）10倍浓缩稀释液： KH2PO4：0.4g；Na2HPO412H2O：5.8g；NaCl：16.0g；KCl：0.4g；溶于100ml蒸馏水中，调节pH至7.2。加入Tween 20 0.5ml，用0.22μm滤膜过滤；
3）酶结合物工作液：辣根过氧化物酶标记蛋白A结合物，使用稀释液进行5000-20000倍稀释；
4）显色液：柠檬酸盐缓冲液150ml ，H2O2 300μl，小心混匀，作为A液；柠檬酸盐缓冲液150ml，加入OPD 600mg，小心混匀，作为B液，由于OPD的光解性，配制时应注意避光，使用棕色瓶配制；
5）20倍浓缩洗液：KH2PO4：0.4g；Na2HPO412H2O：5.8g；NaCl：16.0g；KCl：0.4g；溶于50ml蒸馏水中，加入10ml Tween 20，调节pH值到7.0；
6）阳性对照液：取2 IU/ml的人免疫球蛋白，进行400倍稀释；
7）阴性对照液：人阴性血清稀释100倍；
8）终止液：2mol/L硫酸。
所述的狂犬病毒抗体（IgG）酶联免疫检测试剂盒选用抗原RV-Ag来源于辽宁成大动物药业有限公司。制造本品用的毒种为巴斯德固定病毒PV2061株接种Vero细胞毒，由辽宁成大动物药业有限公司鉴定、保管和供应。将毒种接种Vero单层细胞扩培后，进行灌流培养。72h后收获病毒液，经浓缩灭活后，进行纯化。将灭活的病毒液经层析柱纯化，灭活后的病毒液按不高于10%凝胶体积上样，进行凝胶层析纯化，收获层析首峰。抗原检定：纯化蛋白抗原活性峰与狂犬病毒抗体阳性血清呈特异性反应。
所述的辣根过氧化物酶标记蛋白A结合物，其制备方法如下。
1）肉汤培养基：蛋白胨10g，氯化钠5g，葡萄糖5g，牛肉浸膏3g加蒸馏水1000ml调节pH7.4）；琼脂培养基：肉汤培养基+2%琼脂粉；金黄色葡萄球菌1800标准菌株：购自中国科学院微生物研究所，溶菌酶：北京鼎国生物技术有限公司。
2）培养方法。
将金黄色葡萄球菌用肉汤培养基溶解后扩培，37℃恒温培养24h，菌体呈均匀混浊状即可。再将此培养基传代两次后，将其均匀涂布于琼脂平板上37℃恒温培养24h，细菌均匀生长于琼脂平板上即可收集菌体。
生理盐水洗下琼脂平板上的菌苔，离心洗涤三次，收集菌体。加入0.02mol/L，pH8.0的tris缓冲液溶解菌体，使菌体浓度为15%。再加入溶菌酶，使溶菌酶与菌悬液质量比为5%，混匀后置于37℃水浴恒温箱内震荡消化36h。冷却后以12000r/min，4℃离心30min，共收集上清液20ml。用氨水调节pH至7.0，加入0.01mol/L pH7.4的PBS液80ml，使其饱和度为80%，4℃下静置盐析过夜。次日10000r/min -15000r/min，4℃离心30min，弃去上清。沉淀用0.01mol/L，pH7.4的PBS液15ml溶解，装入预先处理好的透析袋内，4℃下透析24h，收集透析袋内的液体，此为SPA的粗提品。
预先处理好葡聚糖凝胶Sephadex G-200并装柱，上样SPA粗提品。待样品完全进入Sephadex G-200后，加入缓冲液，并与装缓冲液瓶连接。调节柱底与瓶内缓冲液液面之间的距离，使此密闭系统中流体静水压大约是6-12cm，流速调节到大约4-6ml/h。以1ml/份收集洗脱液，用紫外分光光度计测蛋白浓度，将蛋白质浓度对管数在坐标纸上作图，绘出峰位，收集主峰液各管并合并。收集的样品-20℃保存备用。
3）标记步骤。
(a) 称取适量HRP溶解于1ml 0.3mol/L NaHCO3中，加体积分数为0.01二硝基氟苯无水乙醇溶液0.1ml，室温避光搅拌1小时。
(b) 上述液体中加入1.0 ml新配的0.06 mol/L NaIO4溶液，继续搅拌30分钟。
(c) 加0.16 mol/L乙二醇1.0ml继续搅拌1小时，加pH9.0-9.5的0.01 mol/L CB溶液， 4℃透析过夜。
(d) 加入SPA，室温避光轻轻搅拌2小时。
(e) 加0.1ml新配的4mg/ml NaBH4液，混匀，再置4℃2小时。
(f) 在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，沉淀HRP-SPA除去未结合游离物，或用Sephadex G-200柱纯化酶结合物。
(g) 加0.02 mol/L pH7.2 PBS，4℃透析去除NH4 +和SO4 2-。
(h) 加等量甘油分装低温保存。
试剂盒的制备程序包括。
1）RV-Ag和酶标抗体浓度的选择，采用方阵滴定法选择最佳RV-Ag的包被浓度和酶标抗体的工作浓度。
2）包被酶标板，用0.05mol/L的pH9.6碳酸盐碳酸氢盐缓冲液，稀释狂犬病毒纯化液，配制包被液100ml，终浓度的蛋白含量为0.1-5μg/ml。酶标板每孔加包被液200μl，用封口膜封好，4℃包被12小时。弃去包被液，加封闭液300μl/孔，再用封口膜封好置于湿盒中37℃ 1小时，最后倒空板，并作封闭、干燥和密封等处理，保存于2-8℃。对包被板须抽样做37℃放置6天的稳定性试验，并进行检定，合格后方可使用。
使用操作方法：
1）平衡：将试剂盒从冷藏环境中取出，置室温平衡30分钟后使用；
2）配洗液：将浓缩洗液用蒸馏水或去离子水20倍稀释备用；
3）洗板：每孔加入稀释后的洗液300μl，静置数秒，弃去洗液，重复4次，拍干；
4）加样：将阴性对照，阳性对照和空白（样品稀释液）加入到酶标板内，200μl/孔，均设1孔。取1ml稀释液，加入10μl待检样品，充分混合，按顺序各加入稀释后的待检标本200μl/孔。振荡混匀后贴上封口膜，置37℃温育30分钟；
5）洗板：弃去反应液，每孔加入稀释后的洗液300μl，静置数秒，弃去洗液，重复5次，拍干；
6）加酶标记物：每孔加入200μl酶结合物，加盖封板膜，振荡混匀。置37℃温箱中，温育30分钟；
7）洗板：弃去反应液，每孔加入稀释后的洗液300μl，静置数秒，弃去洗液，重复6次，拍干；
8）显色：每孔依次加入底物A、B液各100μl，加盖封板膜，振荡混匀，37℃避光显色15分钟；
9）终止：每孔加入终止液各50μl，振荡混匀终止反应；
10）测定：用空白对照孔调零，并于30分钟内用酶标仪单波长450nm测定各孔OD值；
11）结果判定。
每个试验结果独立使用，通过（Cut off）值判定结果。
计算临界值：
Cut off（C.0）=0.10＋阴性对照平均值（NC）A450值（当阴性平均值A450值小于0.1时，按0.1计算；当阴性平均值A450值大于或等于0.1时按实际值计算）
阴性结果：标本吸光度值＜临界值为阴性
阳性结果：标本吸光度值≥临界值为阳性。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于。
本发明采用酶联免疫吸附法，应用间接法原理对试剂盒的标准品和样品的测定，以此检测人或动物的血清或血浆中狂犬病毒IgG抗体的含量。本发明所述的试剂盒由纯化的狂犬病毒抗原包被的微孔板、酶标记的SPA及其他试剂配套组成，适用于狂犬疫苗免疫后血清学效果评价及流行病学调查。本发明所述的试剂盒应用的酶标抗体是金黄色葡萄球菌A蛋白（Staphylococal Protein A，SPA），其优点在于SPA能与人及多种哺乳动物血清IgG分子中的Fc片段结合，因此，本发明所述的试剂盒在具有ELISA试剂盒的全部特点同时，不仅可以用于人血清中狂犬病毒IgG抗体的含量检测，还可以用于多种动物血清中狂犬病毒IgG抗体的含量检测。
附图说明
图1为IgG标准品曲线。
具体实施方式
以下的实施例详细说明了本发明，但不用于限制本发明的范围。
实施例1： 检测狂犬病毒抗体（IgG）酶联免疫检测试剂盒的制备与人血清检测。
狂犬病毒抗体（IgG）酶联免疫检测试剂盒，主要由纯化的狂犬病毒抗原包被板、浓缩稀释液、酶结合物工作液、底物显色液A、底物显色液B、浓缩洗涤液、阴阳性对照、终止液。包括如下：
1）96孔酶标板，用0.05mol/L的pH9.6碳酸盐碳酸氢盐缓冲液，稀释狂犬病毒纯化液进行包被，终浓度的蛋白含量为0.3μg/ml；
2）10倍浓缩稀释液： KH2PO4：0.4g；Na2HPO412H2O：5.8g；NaCl：16.0g；KCl：0.4g；溶于100ml蒸馏水中，调节pH至7.2。加入Tween 20 0.5ml，用0.22μm滤膜过滤；
3）酶结合物工作液：辣根过氧化物酶标记蛋白A结合物，使用稀释液进行10000倍稀释；
4）显色液：柠檬酸盐缓冲液150ml ，H2O2 300μl，小心混匀，作为A液；柠檬酸盐缓冲液150ml，加入OPD 600mg，小心混匀，作为B液，由于OPD的光解性，配制时应注意避光，使用棕色瓶配制；
5）20倍浓缩洗液：KH2PO4：0.4g；Na2HPO412H2O：5.8g；NaCl：16.0g；KCl：0.4g；溶于50ml蒸馏水中，加入10ml Tween 20，调节pH值到7.0；
6）阳性对照液：取2 IU/ml的人免疫球蛋白，进行400倍稀释；
7）阴性对照液：人阴性血清稀释100倍；
8）终止液：2mol/L硫酸。
狂犬病毒抗体（IgG）酶联免疫检测试剂盒选用抗原RV-Ag来源于辽宁成大动物药业有限公司。制造本品用的毒种为巴斯德固定病毒PV2061株接种Vero细胞毒，由辽宁成大动物药业有限公司鉴定、保管和供应。将毒种接种Vero单层细胞扩培后，进行灌流培养。72h后收获病毒液，经浓缩灭活后，进行纯化。将灭活的病毒液经层析柱纯化，灭活后的病毒液按不高于10%凝胶体积上样，进行凝胶层析纯化，收获层析首峰。
所述的辣根过氧化物酶标记蛋白A结合物，其制备方法如下。
1）肉汤培养基：蛋白胨10g，氯化钠5g，葡萄糖5g，牛肉浸膏3g加蒸馏水1000ml调节pH7.4）；琼脂培养基：肉汤培养基+2%琼脂粉；金黄色葡萄球菌1800标准菌株：购自中国科学院微生物研究所，溶菌酶：北京鼎国生物技术有限公司。
2）培养方法。
将金黄色葡萄球菌用肉汤培养基溶解后扩培，37℃恒温培养24h，菌体呈均匀混浊状即可。再将此培养基传代两次后，将其均匀涂布于琼脂平板上37℃恒温培养24h，细菌均匀生长于琼脂平板上即可收集菌体。
生理盐水洗下琼脂平板上的菌苔，离心洗涤三次，收集菌体。加入0.02mol/L，pH8.0的tris缓冲液溶解菌体，使菌体浓度为15%。再加入溶菌酶，使溶菌酶与菌悬液质量比为5%，混匀后置于37℃水浴恒温箱内震荡消化36h。冷却后以12000r/min，4℃离心30min，共收集上清液20ml。用氨水调节pH至7.0，加入0.01mol/L pH7.4的PBS液80ml，使其饱和度为80%，4℃下静置盐析过夜。次日12000r/min，4℃离心30min，弃去上清。沉淀用0.01mol/L，pH7.4的PBS液15ml溶解，装入预先处理好的透析袋内，4℃下透析24h，收集透析袋内的液体，此为SPA的粗提品。
预先处理好葡聚糖凝胶Sephadex G-200并装柱，上样SPA粗提品。待样品完全进入Sephadex G-200后，加入缓冲液，并与装缓冲液瓶连接。调节柱底与瓶内缓冲液液面之间的距离，使此密闭系统中流体静水压大约是6-12cm，流速调节到大约4-6ml/h。以1ml/份收集洗脱液，用紫外分光光度计测蛋白浓度，将蛋白质浓度对管数在坐标纸上作图，绘出峰位，收集主峰液各管并合并。收集的样品-20℃保存备用。
3）标记步骤。
(a) 称取适量HRP溶解于1ml 0.3mol/L NaHCO3中，加体积分数为0.01二硝基氟苯无水乙醇溶液0.1ml，室温避光搅拌1小时。
(b) 上述液体中加入1.0 ml新配的0.06 mol/L NaIO4溶液，继续搅拌30分钟。
(c) 加0.16 mol/L乙二醇1.0ml继续搅拌1小时，加pH9.0-9.5的0.01 mol/L CB溶液， 4℃透析过夜。
(d) 加入SPA，室温避光轻轻搅拌2小时。
(e) 加0.1ml新配的4mg/ml NaBH4液，混匀，再置4℃2小时。
(f) 在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，沉淀HRP-SPA除去未结合游离物，或用Sephadex G-200柱纯化酶结合物。
(g) 加0.02 mol/L pH7.2 PBS，4℃透析去除NH4 +和SO4 2-。
(h) 加等量甘油分装低温保存。
制备程序包括。
1）RV-Ag和酶标抗体浓度的选择，采用方阵滴定法选择最佳RV-Ag的包被浓度和酶标抗体的工作浓度。
2）包被酶标板，用0.05mol/L的pH9.6碳酸盐碳酸氢盐缓冲液，稀释狂犬病毒纯化液，配制包被液100ml，终浓度的蛋白含量为0.3μg/ml。酶标板每孔加包被液200μl，用封口膜封好，4℃包被12小时。弃去包被液，加封闭液300μl/孔，再用封口膜封好置于湿盒中37℃ 1小时，最后倒空板，并作封闭、干燥和密封等处理，保存于2-8℃。对包被板须抽样做37℃放置6天的稳定性试验，并进行检定，合格后方可使用。
使用操作方法：
1）平衡：将试剂盒从冷藏环境中取出，置室温平衡30分钟后使用；
2）配洗液：将浓缩洗液用蒸馏水或去离子水20倍稀释备用；
3）洗板：每孔加入稀释后的洗液300μl，静置数秒，弃去洗液，重复4次，拍干；
4）加样：将阴性对照，阳性对照和空白（样品稀释液）加入到酶标板内，200μl/孔，均设1孔。取1ml稀释液，加入10μl待检样品，充分混合，按顺序各加入稀释后的待检标本200μl/孔。振荡混匀后贴上封口膜，置37℃温育30分钟；
5）洗板：弃去反应液，每孔加入稀释后的洗液300μl，静置数秒，弃去洗液，重复5次，拍干；
6）加酶标记物：每孔加入200μl酶结合物，加盖封板膜，振荡混匀。置37℃温箱中，温育30分钟；
7）洗板：弃去反应液，每孔加入稀释后的洗液300μl，静置数秒，弃去洗液，重复6次，拍干；
8）显色：每孔依次加入底物A、B液各100μl，加盖封板膜，振荡混匀，37℃避光显色15分钟；
9）终止：每孔加入终止液各50μl，振荡混匀终止反应；
10）测定：用空白对照孔调零，并于30分钟内用酶标仪单波长450nm测定各孔OD值；
11）结果判定。
每个试验结果独立使用，通过（Cut off）值判定结果。
计算临界值：
Cut off（C.0）=0.10＋阴性对照平均值（NC）A450值（当阴性平均值A450值小于0.1时，按0.1计算；当阴性平均值A450值大于或等于0.1时按实际值计算）
阴性结果：标本吸光度值＜临界值为阴性
阳性结果：标本吸光度值≥临界值为阳性。
实施例2： 狂犬病毒抗体（IgG）酶联免疫检测试剂盒的制备与狗血清的检测。
狂犬病毒抗体（IgG）酶联免疫检测试剂盒，主要由纯化的狂犬病毒抗原包被板、浓缩稀释液、酶结合物工作液、底物显色液A、底物显色液B、浓缩洗涤液、阴阳性对照、终止液。包括如下：
1）96孔酶标板，用0.05mol/L的pH9.6碳酸盐碳酸氢盐缓冲液，稀释狂犬病毒纯化液进行包被，终浓度的蛋白含量为0.1μg/ml；
2）10倍浓缩稀释液： KH2PO4：0.4g；Na2HPO412H2O：5.8g；NaCl：16.0g；KCl：0.4g；溶于100ml蒸馏水中，调节pH至7.2。加入Tween 20 0.5ml，用0.22μm滤膜过滤；
3）酶结合物工作液：辣根过氧化物酶标记蛋白A结合物，使用稀释液进行20000倍稀释；
4）显色液：柠檬酸盐缓冲液150ml ，H2O2 300μl，小心混匀，作为A液；柠檬酸盐缓冲液150ml，加入OPD 600mg，小心混匀，作为B液，由于OPD的光解性，配制时应注意避光，使用棕色瓶配制；
5）20倍浓缩洗液：KH2PO4：0.4g；Na2HPO412H2O：5.8g；NaCl：16.0g；KCl：0.4g；溶于50ml蒸馏水中，加入10ml Tween 20，调节pH值到7.0；
6）阳性对照液：取2 IU/ml的犬免疫球蛋白，进行400倍稀释；
7）阴性对照液：犬阴性血清稀释100倍；
8）终止液：2mol/L硫酸。
狂犬病毒抗体（IgG）酶联免疫检测试剂盒选用抗原RV-Ag来源于辽宁成大动物药业有限公司。制造本品用的毒种为巴斯德固定病毒PV2061株接种Vero细胞毒，由辽宁成大动物药业有限公司鉴定、保管和供应。将毒种接种Vero单层细胞扩培后，进行灌流培养。72h后收获病毒液，经浓缩灭活后，进行纯化。将灭活的病毒液经层析柱纯化，灭活后的病毒液按不高于10%凝胶体积上样，进行凝胶层析纯化，收获层析首峰。
所述的辣根过氧化物酶标记蛋白A结合物，其制备方法如下。
1）肉汤培养基：蛋白胨10g，氯化钠5g，葡萄糖5g，牛肉浸膏3g加蒸馏水1000ml调节pH7.4）；琼脂培养基：肉汤培养基+2%琼脂粉；金黄色葡萄球菌1800标准菌株：购自中国科学院微生物研究所，溶菌酶：北京鼎国生物技术有限公司。
2）培养方法。
将金黄色葡萄球菌用肉汤培养基溶解后扩培，37℃恒温培养24h，菌体呈均匀混浊状即可。再将此培养基传代两次后，将其均匀涂布于琼脂平板上37℃恒温培养24h，细菌均匀生长于琼脂平板上即可收集菌体。
生理盐水洗下琼脂平板上的菌苔，离心洗涤三次，收集菌体。加入0.02mol/L，pH8.0的tris缓冲液溶解菌体，使菌体浓度为15%。再加入溶菌酶，使溶菌酶与菌悬液质量比为5%，混匀后置于37℃水浴恒温箱内震荡消化36h。冷却后以12000r/min，4℃离心30min，共收集上清液20ml。用氨水调节pH至7.0，加入0.01mol/L pH7.4的PBS液80ml，使其饱和度为80%，4℃下静置盐析过夜。次日12000r/min，4℃离心30min，弃去上清。沉淀用0.01mol/L，pH7.4的PBS液15ml溶解，装入预先处理好的透析袋内，4℃下透析24h，收集透析袋内的液体，此为SPA的粗提品。
预先处理好葡聚糖凝胶Sephadex G-200并装柱，上样SPA粗提品。待样品完全进入Sephadex G-200后，加入缓冲液，并与装缓冲液瓶连接。调节柱底与瓶内缓冲液液面之间的距离，使此密闭系统中流体静水压大约是6-12cm，流速调节到大约4-6ml/h。以1ml/份收集洗脱液，用紫外分光光度计测蛋白浓度，将蛋白质浓度对管数在坐标纸上作图，绘出峰位，收集主峰液各管并合并。收集的样品-20℃保存备用。
3）标记步骤。
(a) 称取适量HRP溶解于1ml 0.3mol/L NaHCO3中，加体积分数为0.01二硝基氟苯无水乙醇溶液0.1ml，室温避光搅拌1小时。
(b) 上述液体中加入1.0 ml新配的0.06 mol/L NaIO4溶液，继续搅拌30分钟。
(c) 加0.16 mol/L乙二醇1.0ml继续搅拌1小时，加pH9.0-9.5的0.01 mol/L CB溶液， 4℃透析过夜。
(d) 加入SPA，室温避光轻轻搅拌2小时。
(e) 加0.1ml新配的4mg/ml NaBH4液，混匀，再置4℃2小时。
(f) 在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，沉淀HRP-SPA除去未结合游离物，或用Sephadex G-200柱纯化酶结合物。
(g) 加0.02 mol/L pH7.2 PBS，4℃透析去除NH4 +和SO4 2-。
(h) 加等量甘油分装低温保存。
制备程序包括。
1）RV-Ag和酶标抗体浓度的选择，采用方阵滴定法选择最佳RV-Ag的包被浓度和酶标抗体的工作浓度。
2）包被酶标板，用0.05mol/L的pH9.6碳酸盐碳酸氢盐缓冲液，稀释狂犬病毒纯化液，配制包被液100ml，终浓度的蛋白含量为0.1μg/ml。酶标板每孔加包被液200μl，用封口膜封好，4℃包被12小时。弃去包被液，加封闭液300μl/孔，再用封口膜封好置于湿盒中37℃ 1小时，最后倒空板，并作封闭、干燥和密封等处理，保存于2-8℃。对包被板须抽样做37℃放置6天的稳定性试验，并进行检定，合格后方可使用。
使用操作方法：
1）平衡：将试剂盒从冷藏环境中取出，置室温平衡30分钟后使用；
2）配洗液：将浓缩洗液用蒸馏水或去离子水20倍稀释备用；
3）洗板：每孔加入稀释后的洗液300μl，静置数秒，弃去洗液，重复4次，拍干；
4）加样：将阴性对照，阳性对照和空白（样品稀释液）加入到酶标板内，200μl/孔，均设1孔。取1ml稀释液，加入10μl待检样品，充分混合，按顺序各加入稀释后的待检标本200μl/孔。振荡混匀后贴上封口膜，置37℃温育30分钟；
5）洗板：弃去反应液，每孔加入稀释后的洗液300μl，静置数秒，弃去洗液，重复5次，拍干；
6）加酶标记物：每孔加入200μl酶结合物，加盖封板膜，振荡混匀。置37℃温箱中，温育30分钟；
7）洗板：弃去反应液，每孔加入稀释后的洗液300μl，静置数秒，弃去洗液，重复6次，拍干；
8）显色：每孔依次加入底物A、B液各100μl，加盖封板膜，振荡混匀，37℃避光显色15分钟；
9）终止：每孔加入终止液各50μl，振荡混匀终止反应；
10）测定：用空白对照孔调零，并于30分钟内用酶标仪单波长450nm测定各孔OD值；
11）结果判定。
每个试验结果独立使用，通过（Cut off）值判定结果。
计算临界值：
Cut off（C.0）=0.10＋阴性对照平均值（NC）A450值（当阴性平均值A450值小于0.1时，按0.1计算；当阴性平均值A450值大于或等于0.1时按实际值计算）
阴性结果：标本吸光度值＜临界值为阴性
阳性结果：标本吸光度值≥临界值为阳性
结果。
1）狂犬病毒抗体（IgG）酶联免疫检测试剂盒检测人免疫组与非免疫组的结果。
表1 免疫组与非免疫组的结果对比。
由表1结果所示，本试剂盒有较强的特异性，灵敏度高，符合临床使用要求。
2）狂犬病毒抗体（IgG）酶联免疫检测试剂盒检测狗免疫组与非免疫组的结果。
表2 免疫组与非免疫组的结果对比。
由表2结果所示，本试剂盒有较强的特异性，灵敏度高，符合临床使用要求。
3）标准曲线（图1 IgG标准品曲线）。
从图1可以看出，各个标准品线性关系良好，回归曲线Y=0.0010X+0.0126，R2=0.9952，因此计算出的样品IgG含量，非常接近真实值。
4）样品回收率实验。
表3 不同样品的回收率。
由表3可知，该试剂盒的灵敏度可以达到4mIU/mL，优于市场销售的同类产品，使用该试剂盒测得的样品回收率平均值为101.17%，当样品浓度降至2 mIU/mL时，其回收率结果较大，不具有参考价值。
Claims (5)
1.一种狂犬病毒抗体（IgG）酶联免疫检测试剂盒，主要有纯化的狂犬病毒抗原包被板、浓缩稀释液、酶结合物工作液、底物显色液A、底物显色液B、浓缩洗涤液、阴阳性对照、终止液，其特征在于包括有：
1）96孔酶标板，用0.05mol/L的pH9.6碳酸盐碳酸氢盐缓冲液，稀释狂犬病毒纯化液进行包被，终浓度的蛋白含量为0.1-5μg/ml；
2）10倍浓缩稀释液： KH2PO4：0.4g；Na2HPO4·12H2O：5.8g；NaCl：16.0g；KCl：0.4g；溶于100ml蒸馏水中，调节pH至7.2，加入Tween 20 0.5ml，用0.22μm滤膜过滤；
3）酶结合物工作液：辣根过氧化物酶标记蛋白A结合物，使用稀释液进行5000-20000倍稀释；
4）显色液：柠檬酸盐缓冲液150ml ，H2O2 300μl，小心混匀，作为A液；柠檬酸盐缓冲液150ml，加入OPD 600mg，小心混匀，作为B液，由于OPD的光解性，配制时应注意避光，使用棕色瓶配制；
5）20倍浓缩洗液：KH2PO4：0.4g；Na2HPO4·12H2O：5.8g；NaCl：16.0g；KCl：0.4g；溶于50ml蒸馏水中，加入10ml Tween 20，调节pH值到7.0；
6）阳性对照液：取2 IU/ml的人免疫球蛋白，进行400倍稀释；
7）阴性对照液：人阴性血清稀释100倍；
8）终止液：2mol/L硫酸；
9）其灵敏度可达到4mIU/mL 。
2.根据权利要求1所述的狂犬病毒抗体（IgG）酶联免疫检测试剂盒，其特征在于选用的狂犬病毒抗原RV-Ag来源于辽宁成大动物药业有限公司，制造本品用的毒种为由辽宁成大动物药业有限公司鉴定、保管和供应的巴斯德固定病毒PV2061株接种Vero细胞毒，将毒种接种Vero单层细胞扩培后，进行灌流培养，72h后收获病毒液，经浓缩灭活后，进行纯化，将灭活的病毒液经层析柱纯化，灭活后的病毒液按不高于10%凝胶体积上样，进行凝胶层析纯化，收获层析首峰，抗原检定：纯化蛋白抗原活性峰与狂犬病毒抗体阳性血清呈特异性反应。
3.根据权利要求1所述的狂犬病毒抗体（IgG）酶联免疫检测试剂盒，其特征在于所述的辣根过氧化物酶标记蛋白A结合物的制备方法如下：
1）肉汤培养基：蛋白胨10g，氯化钠5g，葡萄糖5g，牛肉浸膏3g加蒸馏水1000ml调节pH7.4）；琼脂培养基：肉汤培养基+2%琼脂粉；金黄色葡萄球菌1800标准菌株：购自中国科学院微生物研究所，溶菌酶：北京鼎国生物技术有限公司；
2）培养方法：
将金黄色葡萄球菌用肉汤培养基溶解后扩培，37℃恒温培养24h，菌体呈均匀混浊状即可，再将此培养基传代两次后，将其均匀涂布于琼脂平板上37℃恒温培养24h，细菌均匀生长于琼脂平板上即可收集菌体；
生理盐水洗下琼脂平板上的菌苔，离心洗涤三次，收集菌体，加入0.02mol/L，pH8.0的tris缓冲液溶解菌体，使菌体浓度为15%，再加入溶菌酶，使溶菌酶与菌悬液质量比为5%，混匀后置于37℃水浴恒温箱内震荡消化36h，冷却后以12000r/min，4℃离心30min，共收集上清液20ml，用氨水调节pH至7.0，加入0.01mol/L pH7.4的PBS液80ml，使其饱和度为80%，4℃下静置盐析过夜，次日12000r/min，4℃离心30min，弃去上清，沉淀用0.01mol/L，pH7.4的PBS液15ml溶解，装入预先处理好的透析袋内，4℃下透析24h，收集透析袋内的液体，此为SPA的粗提品；
预先处理好葡聚糖凝胶Sephadex G-200并装柱，上样SPA粗提品，待样品完全进入Sephadex G-200后，加入缓冲液，并与装缓冲液瓶连接，调节柱底与瓶内缓冲液液面之间的距离，使此密闭系统中流体静水压大约是6-12cm，流速调节到大约4-6ml/h，以1ml/份收集洗脱液，用紫外分光光度计测蛋白浓度，将蛋白质浓度对管数在坐标纸上作图，绘出峰位，收集主峰液各管并合并，收集的样品-20℃保存备用；
3）标记步骤：
(a) 称取适量HRP溶解于1ml 0.3mol/L NaHCO3中，加体积分数为0.01二硝基氟苯无水乙醇溶液0.1ml，室温避光搅拌1小时；
(b) 上述液体中加入1.0 ml新配的0.06 mol/L NaIO4溶液，继续搅拌30分钟；
(c) 加0.16 mol/L乙二醇1.0ml继续搅拌1小时，加pH9.0-9.5的0.01 mol/L CB溶液， 4℃透析过夜；
(d) 加入SPA，室温避光轻轻搅拌2小时；
(e) 加0.1ml新配的4mg/ml NaBH4液，混匀，再置4℃2小时；
(f) 在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，沉淀HRP-SPA除去未结合游离物，或用Sephadex G-200柱纯化酶结合物；
(g) 加0.02 mol/L pH7.2 PBS，4℃透析去除NH4 +和SO4 2；
(h) 加等量甘油分装低温保存。
4.权利要求1或2所述的狂犬病毒抗体（IgG）酶联免疫检测试剂盒的制备过程，其特征在于包括有：
1）RV-Ag和酶标抗体浓度的选择，采用方阵滴定法选择最佳RV-Ag的包被浓度和酶标抗体的工作浓度；
2）包被酶标板，用0.05mol/L的pH9.6碳酸盐碳酸氢盐缓冲液，稀释狂犬病毒纯化液，配制包被液100ml，终浓度的蛋白含量为0.1-5μg/ml，酶标板每孔加包被液200μl，用封口膜封好，4℃包被12小时，弃去包被液，加封闭液300μl/孔，再用封口膜封好置于湿盒中37℃ 1小时，最后倒空板，并作封闭、干燥和密封等处理，保存于2-8℃，对包被板须抽样做37℃放置6天的稳定性试验，并进行检定，合格后方可使用。
5.根据权利要求1或2或3所述的狂犬病毒抗体（IgG）酶联免疫检测试剂盒，其特征在于其使用操作方法：
1）平衡：将试剂盒从冷藏环境中取出，置室温平衡30分钟后使用；
2）配洗液：将浓缩洗液用蒸馏水或去离子水20倍稀释备用；
3）洗板：每孔加入稀释后的洗液300μl，静置数秒，弃去洗液，重复4次，拍干；
4）加样：将阴性对照，阳性对照和空白（样品稀释液）加入到酶标板内，200μl/孔，均设1孔，取1ml稀释液，加入10μl待检样品，充分混合，按顺序各加入稀释后的待检标本200μl/孔，振荡混匀后贴上封口膜，置37℃温育30分钟；
5）洗板：弃去反应液，每孔加入稀释后的洗液300μl，静置数秒，弃去洗液，重复5次，拍干；
6）加酶标记物：每孔加入200μl酶结合物，加盖封板膜，振荡混匀，置37℃温箱中，温育30分钟；
7）洗板：弃去反应液，每孔加入稀释后的洗液300μl，静置数秒，弃去洗液，重复6次，拍干；
8）显色：每孔依次加入底物A、B液各100μl，加盖封板膜，振荡混匀，37℃避光显色15分钟；
9）终止：每孔加入终止液各50μl，振荡混匀终止反应；
10）测定：用空白对照孔调零，并于30分钟内用酶标仪单波长450nm测定各孔OD值；
11）结果判定
每个试验结果独立使用，通过（Cut off）值判定结果；
计算临界值：
Cut off（C.0）=0.10＋阴性对照平均值（NC）A450值（当阴性平均值A450值小于0.1时，按0.1计算；当阴性平均值A450值大于或等于0.1时按实际值计算）
阴性结果：标本吸光度值＜临界值为阴性
阳性结果：标本吸光度值≥临界值为阳性 。
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