CN108993456B - 一种狂犬病毒吸附层析介质及其制备方法 - Google Patents

一种狂犬病毒吸附层析介质及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种狂犬病吸附层析介质，以多糖微球为内核，在内核表面键合环氧氯丙烷，环氧氯丙烷偶联硫酸多糖配基。还提供了一种上述狂犬病吸附层析介质的制备方法。该狂犬病吸附层析介质对狂犬病毒的纯化效率高，效果好，极大的降低了狂犬病毒分离纯化的成本。

Description

一种狂犬病毒吸附层析介质及其制备方法
技术领域
本发明涉及分离纯化技术领域，具体涉及一种狂犬病毒吸附层析介质及其制备方法。
背景技术
狂犬病毒(RV)是高度嗜神经病毒，是弹状病毒科弹状病毒属中的不分段负链RNA病毒，外形呈弹状，核衣壳呈螺旋对称，表面具有包膜，包膜组分由跨膜糖蛋白G和基质M蛋白组成，内含有单链RNA，是引起狂犬病的病原体。目前在研究水平的病毒纯化一般使用基于密度的超速离心法进行，虽然该方法已经证明作为研究手段使用是有效的，但是它太昂贵、费时且不易放大用于工业规模的生产，所以在实验室研究规模纯化病毒的方法显然不适于治疗大量患者而会需要的大规模生产。工业上现在替代超速离心的方法是通过凝胶过滤层析介质进行层析纯化，单独的大小排阻层析或与密度梯度离心相联合已经用于纯化某些植物病毒、牛乳头瘤病毒、蜱传脑炎病毒和重组逆转录病毒。现有狂犬病毒在大规模细胞培养后，将狂犬病毒灭活，得到狂犬疫苗原液，然后将原液用超滤浓缩成高倍浓缩疫苗，再经过蔗糖密度梯度离心和分子筛凝胶过滤层析纯化，得到高纯度疫苗，最后加入佐剂制成狂犬疫苗成品。当然也开始出现使用弱阴离子交换层析来纯化狂犬病毒和腺病毒。但是这两种分离方式都不是对病毒吸附层析作用，凝胶过滤层析是将病毒与小分子杂质进行分离，上样量只有柱体积的10％不到，纯化效率低；阴离子交换层析主要是对狂犬病毒中的杂质和内毒素进行吸附，应用在分子筛凝胶过滤层析之后，一步的纯化效果较差。
发明内容
本发明所针对现有技术的不足，提供了一种纯化效率高效果好的狂犬病毒吸附层析介质。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种狂犬病毒吸附层析介质，以多糖微球为内核，内核表面键合环氧氯丙烷，环氧氯丙烷偶联硫酸多糖配基。
进一步，所述多糖微球为琼脂糖微球、葡聚糖微球、纤维素微球中的一种。
进一步，所述多糖微球的粒径为5μm-300μm。
进一步，所述硫酸多糖为聚戊糖多硫醇、蔗糖六硫酸钾、蔗糖八硫酸酯钠中的任一种。
本发明的狂犬病毒吸附层析介质能够根据狂犬病毒的大小、等电点和囊膜结构将狂犬病毒吸附于狂犬病毒吸附层析介质上，而不吸附蛋白质和其他杂质。
另一方面，本发明还提供了上述狂犬病毒吸附层析介质的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备环氧基活化多糖微球；
(2)将硫酸多糖与所述环氧基活化多糖微球反应制得狂犬病毒吸附层析介质。
进一步，所述步骤(1)的具体步骤为：将多糖微球加入水中混匀，再依次加入环氧氯丙烷、氢氧化钠和硼氢化钠，所述水、环氧氯丙烷、氢氧化钠和硼氢化钠与所述多糖微球的质量比分别为200～1000:100～500:10～100:1～10:1000，于20～60℃的摇床中震荡反应1-24h，所述摇床的转速为100rpm～200rpm，纯水洗涤获得环氧基活化多糖微球。
进一步，所述步骤(2)的具体步骤为：将所述环氧基活化多糖微球加入水中混匀，再加入硫酸多糖，所述硫酸多糖、水与所述环氧基活化多糖微球的质量比分别为1～10:20～50:100，调节pH为8～12，于20～60℃的摇床中震荡反应16-24h，所述摇床的转速为100rpm～200rpm，纯水洗涤获得狂犬病毒吸附层析介质。
本发明的所提供的狂犬病毒吸附层析介质具有以下优点：
1、本发明对狂犬病毒的分离纯化效率更高，纯化效果更好，本发明具将凝胶过滤、离子交换和吸附层析结合于一体，只用进行一步纯化过程，狂犬病毒通过配基吸附于层析介质上，传统凝胶过滤层析的上样体积只有介质体积的10％左右，而本发明的狂犬病毒吸附层析介质的上样量可以达到介质体积的30倍以上，上样量体积可以达到传统狂犬病毒凝胶过滤层析介质的数百倍，纯化效率相比传统分子筛纯化效率提高数百倍，对狂犬病毒的特异性强，降低了杂质的吸附，提高了狂犬病毒样品吸附结合的纯度。
2、传统凝胶过滤层析介质对狂犬病毒进行纯化前，需要进行样品前处理，将样品浓缩10～50倍左右，本发明的狂犬病毒吸附层析介质对狂犬病毒进行分离纯化前不需要浓缩，时间可缩短至8小时内，极大的降低了狂犬病毒分离纯化的成本，提高企业经济效益。
3、该产品除了用于狂犬病毒的分离纯化外，还可用于含有囊膜的全病毒的分离纯化，包括乙肝病毒等。
本发明所提供的狂犬病毒吸附层析介质的制备方法具有以下优点：
产品制备工艺简单稳定，生产周期短，过程容易控制，适合大规模生产。
附图说明
图1为本发明实施例1制备的狂犬病毒层析介质分离纯化狂犬病毒的吸附图谱图；
图2为使用本发明实施例1制备的狂犬病毒吸附层析介质分离纯化后的狂犬病毒的分析图谱图；
图3为本发明实施例2制备的狂犬病毒层析介质分离纯化狂犬病毒的吸附图谱图；
图4为使用本发明实施例2制备的狂犬病毒吸附层析介质分离纯化后的狂犬病毒的分析图谱图；
图5为本发明实施例3制备的狂犬病毒层析介质分离纯化狂犬病毒的吸附图谱图；
图6为使用本发明实施例3制备的狂犬病毒吸附层析介质分离纯化后的狂犬病毒的分析图谱图。
具体实施方式
以下结合附图及具体实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1狂犬病毒吸附层析介质的制备
称取10g Focurose HPL微球加入250mL锥形瓶中，加入10g纯水，100rpm振荡摇匀，分别称取2g环氧氯丙烷、0.5g氢氧化钠和0.1g硼氢化钠加入锥形瓶中，置于30℃的摇床中反应2h，摇床的转速为100～200rpm，用10倍体积的纯水真空抽滤洗涤得到环氧基活化多糖微球，取样检测环氧基浓度。
称取10g环氧基活化多糖微球加入250mL锥形瓶中，加入5g纯水100rpm搅拌，称取0.1g聚戊糖多硫醇加入250ml锥形瓶中，调节pH至11.5，在40℃摇床中振荡反应18h，摇床的转速为200rpm，然后用10倍体积的纯水抽真空抽滤清洗，得到狂犬病毒吸附层析介质，将制得的狂犬病毒吸附层析介质放置在20％的乙醇保存液中，4～8℃保存，取样检测离子载量和溶菌酶吸附载量。装1mL预装柱，分离纯化细胞培养狂犬病毒样品，检测狂犬病毒的吸附和蛋白去除率。
实施例2狂犬病毒吸附层析介质的制备
称取10g Focurose HPL微球加入250mL锥形瓶中，加入10g纯水，100rpm振荡摇匀，分别称取5g环氧氯丙烷、1g氢氧化钠和0.1g硼氢化钠加入锥形瓶中，置于30℃的摇床中反应2h，摇床的转速为100～200rpm，用10倍体积的纯水真空抽滤洗涤得到环氧基活化多糖微球，取样检测环氧基浓度。
称取10g环氧基活化多糖微球加入250mL锥形瓶中，加入5g纯水100rpm搅拌，称取1g蔗糖六硫酸钾加入250ml锥形瓶中，调节pH至11.5，在40℃摇床中振荡反应18h，摇床的转速为200rpm，然后用10倍体积的纯水抽真空抽滤清洗，得到狂犬病毒吸附层析介质，将制得的狂犬病毒吸附层析介质放置在20％的乙醇保存液中，4～8℃保存，取样检测离子载量和溶菌酶吸附载量。装1mL预装柱，分离纯化细胞培养狂犬病毒样品，检测狂犬病毒的吸附和蛋白去除率。
实施例3狂犬病毒吸附层析介质的制备
称取10g Focurose HPL微球加入250mL锥形瓶中，加入10g纯水，100rpm振荡摇匀，分别称取5g环氧氯丙烷、0.5g氢氧化钠和0.1g硼氢化钠加入锥形瓶中，置于30℃的摇床中反应2h，摇床的转速为100～200rpm，用10倍体积的纯水真空抽滤洗涤得到环氧基活化多糖微球，取样检测环氧基浓度。
称取10g环氧基活化多糖微球加入250mL锥形瓶中，加入5g纯水100rpm搅拌，称取0.5g蔗糖八硫酸酯钠加入250ml锥形瓶中，调节pH至11.5，在40℃摇床中振荡反应18h，摇床的转速为200rpm，然后用10倍体积的纯水抽真空抽滤清洗，得到狂犬病毒吸附层析介质，将制得的狂犬病毒吸附层析介质放置在20％的乙醇保存液中，4～8℃保存，取样检测离子载量和溶菌酶吸附载量。装1mL预装柱，分离纯化细胞培养狂犬病毒样品，检测狂犬病毒的吸附和蛋白去除率。
实施例4环氧基活化多糖微球环氧基浓度、狂犬病毒吸附层析介质离子载量和溶菌酶吸附载量检测
环氧基活化多糖微球环氧基浓度检测
配制AgNO3标准溶液、硫氰酸铵标准溶液、HCl标准溶液，取干净的PD10柱子装有下膜，取约3mL胶到PD10柱中，用去离子水洗涤2个柱体积，自然沉降，将胶转至烧杯中，称取胶的重量计算胶的体积，标定pH计，往装有胶的玻璃烧杯中，加入5倍胶体积的去离子水，用稀盐酸或稀碱溶液调pH为7.0，称10倍胶体积重量的固体硫代硫酸钠，加入10倍胶体积的去离子水，用稀盐酸或稀碱溶液调pH为7.0，将上述配好的30ml硫代硫酸钠溶液全部加入装胶的烧杯中，混匀，开始计时，用10mM标准盐酸逐渐滴定该溶液，计时30min，直至最后pH为7.0，读数：VHCl，，每mL填料ECH含量(mmol/mL)＝CHCl·VHCl/V胶，其中CHCl为HCl标准溶液的浓度，VHCl为消耗的HCl标准溶液的体积，V胶为所用的胶的体积。
狂犬病毒吸附层析介质离子载量检测
取一个空的PD—10称重，然后将4g左右的胶加入其中沉降，准确称重计算介质的沉降质量m，装柱，1.0M NaCl饱和柱子，去离子水洗掉介质中残留的Cl－离子，1M KNO3替换介质吸附的Cl－,5×10mL，并收集流穿液，然后用3×10mL的纯水洗涤介质并收集流穿液，加入两滴铬酸钾指示剂，用AgNO3标准液滴定流穿液中的Cl－离子，记录达到滴定终点时所用的AgNO3体积，每mL填料中[Cl－]载量(mmol/mL)＝CAgNO3·VAgNO3/V胶，CAgNO3为标准AgNO3的浓度(M)，VAgNO3为记录达到滴定终点时所用的AgNO3体积(ml)，V胶为填充的介质的体积(mL)。
狂犬病毒吸附层析介质溶菌酶吸附载量鉴定
量取1.2ml的介质装入HT-1.2ml的层析空柱中，用5-10倍柱体积的平衡液以1ml/min流速平衡层析柱至UV平衡，用1ml溶菌酶上样到层析柱中，并用5-10柱体积的平衡液清洗至UV平衡，用3-5柱体积的洗脱液洗脱至UV平衡，收集洗脱液，用分光光度计测定稀释后的洗脱液在280nm的吸光值，标记为A280，根据以下公式计算每mL介质结合溶菌酶的载量(mg/mL)＝C×V/Vc，其中：C＝A280×n×ε(mg/mL)，A280＝洗脱液UV280的吸光值，n＝洗脱液的稀释倍数，ε＝溶菌酶的吸光系数(mg/mL)，V＝洗脱液的体积(mL)，Vc＝介质的体积(mL)。
检测结果
表1中分别为实施例1-3的狂犬病毒吸附层析介质的环氧基、离子载量和溶菌酶吸附载量的检测结果
Figure BDA0001743850070000071
表1
表2为实施例1-3中狂犬病毒吸附层析介质分离纯化狂犬病毒的蛋白去除率结果。
Figure BDA0001743850070000072
Figure BDA0001743850070000081
表2
图1、图3和图5分别为实施例1-3中狂犬病毒吸附层析介质分离纯化狂犬病毒的吸附图谱，图2、图4、图6分别为实施例1-3中狂犬病毒吸附层析介质分离纯化后狂犬病毒的分析图谱。
传统狂犬病毒的纯化主要是采用凝胶过滤层析，蛋白去除率为90％，而本发明制备的狂犬病毒吸附层析介质对狂犬病毒纯化过程中蛋白去除率明显高于传统的凝胶过滤层析介质。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种狂犬病毒吸附层析介质，其特征在于，以多糖微球为内核；所述内核表面键合环氧氯丙烷，所述环氧氯丙烷偶联硫酸多糖配基，所述硫酸多糖为聚戊糖多硫醇、蔗糖六硫酸钾、蔗糖八硫酸酯钠中的任一种。
2.根据权利要求1所述的狂犬病毒吸附层析介质，其特征在于，所述多糖微球为琼脂糖微球、葡聚糖微球、纤维素微球中的一种。
3.根据权利要求2所述的狂犬病毒吸附层析介质，其特征在于，所述多糖微球的粒径为5μm-300μm。
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