CN109776673B - 一种适合中试量产的高纯度牛血清白蛋白纯化工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种适合中试量产的高纯度牛血清白蛋白提纯方法，旨在解决现有牛血清白蛋白生产工艺较复杂且产品纯度不高的技术难题。本发明建立了一步色谱层析技术，建立了从购买的低纯度牛血清白蛋白原料经过阴离子交换层析、超滤凝缩、冷冻干燥得到纯度为99.5％的产品。本发明工艺步骤少，流程短,操作简单,利于工业化生产且产品纯度高。

Description

一种适合中试量产的高纯度牛血清白蛋白纯化工艺
技术领域
本发明涉及白蛋白的制备方法,具体涉及一种适合中试量产的高纯度牛血清白蛋白纯化工艺。
背景技术
白蛋白(Albumin)是一类能溶于水中、仅在高盐浓度下才能沉淀的蛋白质，又称清蛋白。它是血清(或血浆)含量中最为丰富的蛋白质，约占其总蛋白质含量的55-63％。由于其在脊椎动物血浆中含量最丰富且又极易纯化，在过去30年的时间里，它也是血浆中所有蛋白质中被研究的最早和最为清楚的一种。其中人的血清白蛋白(human serum albumin,HAS)以及牛的血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)的氨基酸序列已于1975年获得。
工业生产白蛋白仍以冷乙醇沉淀的工艺为主。工艺相对繁琐，纯度只能到达97％左右，血浆资源并不能得到很好的利用。目前关于白蛋白的层析工艺大多都是以阴离子交换和阳离子交换的方式，周期较长，耗费大量缓冲液。
发明内容
为解决现有技术问题，本发明提供了一种适合中试量产的高纯度牛血清白蛋白的纯化工艺。
为实现上述目的,本发明是通过以下技术方案实现的一种适合中试量产的高纯度牛血清白蛋白提纯方法,包括以下步骤：
一种适合中试量产的高纯度牛血清白蛋白纯化工艺，包括以下步骤：
(1)上样样品的制备
称取5～10g牛血清白蛋白原料，溶于800～100ml 20～50mM NaAc+HAc中，调至pH4～9；
(2)缓冲液的配制：配制3～4L平衡缓冲液A:10～20mMNaAc+HA2～4L洗脱缓冲液B:20～30mMNaAc+HAc 5～10L洗脱缓冲液C：3～10MNaCl 2～4L；
(3)平衡与上样：在层析柱内装入填料，装好层析柱后用平衡液A平衡，流速为2～45ml/min，平衡约3～9个柱体积后，开始上样。继续用A液淋洗，淋洗至检测线平缓；
(4)洗脱：用B液进行洗脱，收集洗脱峰并确定目标峰。紫外吸收降低至基线之后停止收峰，改用C液清洗柱子。最后用去离子水冲洗柱子，在将柱子保存在乙醇中。
(5)置换与浓缩：用20～80kD 100～300cm2膜包将收集到的蛋白溶液进行浓缩与置换。
(6)冷冻干燥为晶体状干粉。
而且，所述步骤(1)中，配成牛血清白蛋白的浓度为10～20mg/ml。
而且，所述步骤(2)中，配制平衡缓冲液A的pH为2～6。
而且，所述步骤(2)中，配制平衡缓冲液B的pH为2～6。
而且，所述步骤(4)中，将柱子保存在20％～50％乙醇中。
而且，所述膜包为超滤膜的物理改性膜,通过将膜浸入丙烯酸溶液,形成吸附以阻止牛血清白蛋白在膜面的污染。
而且，改性方法为：将PS膜放入辐照管中，加入5-25wt％浓度的丙烯酸单体的水溶液，该溶液中含有0.02mol/L CuSO4，辐照管经冷冻真空脱氧，充氮密封后放入Co-60r辐照室中，将膜浸泡在1mol/l NaOH水溶液中(40℃)10h以上，以除去残留的均聚物。
而且，所述层析柱的填料的制备方法为：
将Bestarose 4FF琼脂糖凝胶基质用二甲亚砜水溶液、烯丙基溴、氢氧化钠进行活化，然后用N-溴代丁二酰亚胺与丙酮的水溶液进行溴代醇化，将溴代活化的基质氨基活化并进行洗涤，将活化后的基质中加入DMF，HATU，DIPEA进行反应，并将得到的介质进行洗涤，洗涤后加入乙酸钠和乙酸酐的混合液中反应，反应后即为所需填料。
本发明的优点和经济效果是：
本发明建立了一种基于层析技术的纯化工艺，将购买的纯度较低的白蛋白通过阴离子层析方法提纯到纯度为99.5％，并且得到较高的收率。设计的工艺可以达到克级的生产规模，可用于大批量牛血清白蛋白高纯物质的制备。本发明工艺步骤少，流程短,操作简单,利于工业化生产且产品纯度高。
附图说明
图1为实例1中牛血清白蛋白原料纯化的层析图。其中箭头为牛血清白蛋白目标峰，A280nm曲线为牛血清白蛋白在离子交换过程中的分离变化情况；Cond曲线为溶液中电导的变化情况。
图2为实例1中目标峰经过凝胶渗透色谱法检测的谱图，纯度为99.5％。
图3为实例1中纯化的牛血清白蛋白，牛血清白蛋白对照品和原料的SDS-PAGE检测图；1：标准蛋白质Maker；2：牛血清白蛋白原料；3：牛血清白蛋白对照品；4：纯化出的牛血清白蛋白产品。
图4为实例1中纯化的牛血清白蛋白与对照品的圆二色光谱检测图，其中样品曲线为纯化后牛血清白蛋白的圆二色光谱图；标品曲线为对照品的圆二色光谱图，两者基本重合，证明纯化后的蛋白二级结构没有发生改变。
图5为利用MALDI-TOF-MS对纯化的牛血清白蛋白的分子量进行检测，分子量为66423.235与理论值66kD基本一致。证明纯化后的产品结构没有发生改变。
图6为实施例2中牛血清白蛋白原料纯化的层析图,其中箭头为牛血清白蛋白目标峰，A280nm曲线为牛血清白蛋白在离子交换过程中的分离变化情况；Cond曲线为溶液中电导的变化情况。
图7为牛血清白蛋白原料经过凝胶渗透色谱测定的色谱图，经过面积归一化法计算得出纯度为94.0％。
具体实施方式
以下结合具体实施例进一步阐述本发明。下述实施例中所用的原料及设备,如无特别说明,均为市售。
实施例1
一种适合中试量产的高纯度牛血清白蛋白的纯化工艺，包括以下步骤：
(1)称取8g白蛋白成品，溶于100ml 20mM NaAc+HAc中，调至pH5.2。
(2)缓冲液的配制：配制4L平衡缓冲液A:20mMNaAc+HAC,7L洗脱缓冲液B:20mMNaAc+HAc，1L洗脱缓冲液C：1MNaCl。
(3)平衡与上样：在层析柱内装入填料，装好层析柱后用平衡液A平衡，流速为20ml/min，平衡约3个柱体积后，开始上样。继续用A液淋洗，淋洗至检测线平缓。
(4)洗脱：用B液进行洗脱，收集洗脱峰并确定目标峰。紫外吸收降低至50mAU之后停止收峰，改用C液清洗柱子。最后用去离子水冲洗柱子，在将柱子保存在乙醇中，层析图见图1。
(5)置换与浓缩：用30kD 200cm2膜包将收集到的蛋白溶液进行浓缩与置换。
(6)冷冻干燥为晶体状干粉即为牛血清白蛋白粉。
(7)产品的HPSEC检测为图2。电泳图为图3，圆二色谱图为图4，如图5为利用MALDI-TOF-MS对牛血清白蛋白进行分子量的鉴定。
实施例2
一种适合中试量产的高纯度牛血清白蛋白的纯化工艺，包括以下步骤：
(1)称取4g白蛋白成品，溶于40ml 20mM NaAc+HAc中，调至pH 6。
(2)缓冲液的配制：配制3L平衡缓冲液A:20mMNaAc+HA,3L洗脱缓冲液B:20mMNaAc+HAc，1L洗脱缓冲液C：1MNaCl
(3)平衡与上样：在层析柱内装入填料，装好层析柱后用平衡液A平衡，流速为12ml/min，平衡约3个柱体积后，开始上样。继续用A液淋洗，淋洗至检测线平缓
(4)洗脱：用B液进行洗脱，收集洗脱峰并确定目标峰。紫外吸收降低至60mAU之后停止收峰，改用C液清洗柱子。最后用去离子水冲洗柱子，在将柱子保存在乙醇中。层析图为图6。
(5)置换与浓缩：用30kD 200cm2膜包将收集到的蛋白溶液进行浓缩与置换。
(6)冷冻干燥为晶体状干粉即为牛血清白蛋白粉。
上述实施例1、2中所制得的牛血清白蛋白的主要性能指标如下：
①外观灰白色疏松固体,无融化现象；复溶后为淡黄色澄明液体,无浑浊现象
②目标产物白蛋白的液相纯度在99％以上。总工艺收率在60％以上。
上述实施例中使用所述层析填料为以Ac-NH-Aro-Ali-OH为配基通过空间臂己二胺偶联到琼脂糖凝胶基质上制备的层析介质，在制备工程中为防止配基之间或者自身发生偶联，影响反应效率，对N端进行了乙酰化。具体操作步骤分为基质活化、基质溴化、己二胺空间臂偶联和配基偶联。首先用去离子水冲洗适量Bestarose 4FF琼脂糖凝胶基质，用抽滤瓶将基质抽干。置于锥形瓶中依次加入10～20mL体积比20％二甲亚砜水溶液，抽干的琼脂糖凝胶基质Bestarose 4FF5～20g，10～20mL烯丙基溴(AB)以及5～20gNaOH，置于摇床(30℃,180rpm)反应48h反应后，抽滤，用去离子水清洗后再用无水乙醇梯度洗涤得到活化基质。将活化得到的基质用5gN－溴代丁二酰亚胺混合于40～60％(v/v)丙酮水溶液中进行溴代醇化，置于摇床(30℃,180rpm)中反应1～2h。反应后，抽滤，用去离子水清洗后再用丙酮梯度洗涤，得到溴代活化基质。将得到溴代活化基质与5～8mL己二胺以及浓度为1M的碳酸钠缓冲液(pH10～12)混合，置于摇床(30℃,180rpm)反应24～48h，得到氨基活化基质。将反应得到的氨基活化基质，依次用去离子水、无水乙醇和无水N,N－二甲基甲酰胺(DMF)洗涤，抽干。在锥形瓶中依次加入DMF，HATU，DIPEA，抽干氨基活化基质，水浴摇床(25℃,180rpm)反应8h。将反应得到的介质依次用无水DMF、无水乙醇和去离子水洗涤，抽干，加入到乙酸钠和乙酸酐的混合液中反应(30℃,180rpm)1h，以钝化未反应的氨基，得到的介质用去离子水洗涤，保存在20％的乙醇水溶液中。
上述两个实施例采用的膜包材料为超滤膜的物理改性膜,通过将膜浸入丙烯酸溶液,形成吸附以阻止牛血清白蛋白在膜面的污染。
具体制备方法为：将PS膜放入辐照管中，加入5-25wt％浓度的丙烯酸单体的水溶液，该溶液中含有0.02mol/L CuSO4，辐照管经冷冻真空脱氧，充氮密封后放入Co-60r辐照室中，将膜浸泡在1mol/l NaOH水溶液中(40℃)10h以上，以除去残留的均聚物。

Claims (5)

1.一种适合中试量产的高纯度牛血清白蛋白纯化工艺，其特征在于：包括以下步骤：
⑴上样样品的制备
称取5~10 g牛血清白蛋白原料，溶于800~100ml 20~50mM NaAc+HAc中，调至pH4~9；
⑵缓冲液的配制：配制3~4L平衡缓冲液A:10~20mMNaAc+HA2~4L洗脱缓冲液B :20~30mMNaAc+HAc5~10L洗脱缓冲液C：3~10MNaCl2~4L；
⑶平衡与上样：在层析柱内装入填料，装好层析柱后用平衡液A平衡，流速为2~45ml/min，平衡3~9个柱体积后，开始上样，继续用A液淋洗，淋洗至检测线平缓；
⑷洗脱：用B液进行洗脱，收集洗脱峰并确定目标峰，紫外吸收降低至基线之后停止收峰，改用C液清洗柱子，最后用去离子水冲洗柱子，在将柱子保存在乙醇中；
⑸置换与浓缩：用20~80kD100~300cm2膜包将收集到的蛋白溶液进行浓缩与置换；
⑹冷冻干燥为晶体状干粉；
所述膜包为超滤膜的物理改性膜,通过将膜浸入丙烯酸溶液,形成吸附以阻止牛血清白蛋白在膜面的污染；
所述层析柱内的层析填料的制备方法为：将Bestarose 4FF琼脂糖凝胶基质用二甲亚砜水溶液、烯丙基溴、氢氧化钠进行活化，然后用N-溴代丁二酰亚胺与丙酮的水溶液进行溴代醇化，将溴代活化的基质氨基活化并进行洗涤，将活化后的基质中加入DMF，HATU，DIPEA进行反应，并将得到的介质进行洗涤，洗涤后加入乙酸钠和乙酸酐的混合液中反应，反应后即为所需填料；
所述膜包的改性方法为：将PS膜放入辐照管中，加入5-25wt%浓度的丙烯酸单体的水溶液，该溶液中含有0.02mol/L CuSO4，辐照管经冷冻真空脱氧，充氮密封后放入Co-60r辐照室中，将膜浸泡在1mol/L NaOH水溶液中10h以上，水温40℃，以除去残留的均聚物。
2.根据权利要求1所述适合中试量产的高纯度牛血清白蛋白纯化工艺，其特征在于：所述步骤⑴中，配成牛血清白蛋白的浓度为10~20mg/ml。
3.根据权利要求1所述适合中试量产的高纯度牛血清白蛋白纯化工艺，其特征在于：所述步骤⑵中，配制平衡缓冲液A 的pH为2~6。
4.根据权利要求1所述适合中试量产的高纯度牛血清白蛋白纯化工艺，其特征在于：所述步骤⑵中，配制平衡缓冲液B 的pH为2~6。
5.根据权利要求1所述适合中试量产的高纯度牛血清白蛋白纯化工艺，其特征在于：所述步骤⑷中，将柱子保存在20%~50%乙醇中。
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