CN100537755C - 从红细胞中提取超氧化物歧化酶的方法 - Google Patents
从红细胞中提取超氧化物歧化酶的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN100537755C CN100537755C CNB2007100708138A CN200710070813A CN100537755C CN 100537755 C CN100537755 C CN 100537755C CN B2007100708138 A CNB2007100708138 A CN B2007100708138A CN 200710070813 A CN200710070813 A CN 200710070813A CN 100537755 C CN100537755 C CN 100537755C
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sod
- red corpuscle
- dismutase
- add
- concentration
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 102000019197 Superoxide Dismutase Human genes 0.000 title claims abstract description 50
- 108010012715 Superoxide dismutase Proteins 0.000 title claims abstract description 50
- 229940032362 superoxide dismutase Drugs 0.000 title claims abstract description 50
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 26
- 239000000284 extract Substances 0.000 title claims description 4
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 52
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims abstract description 22
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims abstract description 12
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims abstract description 11
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims abstract description 10
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims abstract description 10
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 claims abstract description 8
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 claims abstract description 8
- 239000012043 crude product Substances 0.000 claims abstract description 7
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 32
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 27
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 22
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 20
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 16
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 15
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 13
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 claims description 12
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 claims description 12
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 12
- 238000013016 damping Methods 0.000 claims description 11
- 238000010612 desalination reaction Methods 0.000 claims description 11
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 11
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 11
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims description 11
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims description 11
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 claims description 10
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 10
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 claims description 9
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 claims description 9
- DPDMMXDBJGCCQC-UHFFFAOYSA-N [Na].[Cl] Chemical compound [Na].[Cl] DPDMMXDBJGCCQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 9
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 claims description 9
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- -1 transition metal salt Chemical class 0.000 claims description 9
- 229910052723 transition metal Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 230000010748 Photoabsorption Effects 0.000 claims description 6
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 claims description 5
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 claims description 5
- 238000009413 insulation Methods 0.000 claims description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 5
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 claims description 2
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 150000001340 alkali metals Chemical class 0.000 claims description 2
- 150000002696 manganese Chemical class 0.000 claims description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 2
- 239000002893 slag Substances 0.000 claims description 2
- 150000003751 zinc Chemical class 0.000 claims description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 14
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 6
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 abstract description 4
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 abstract description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 5
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 4
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 4
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 4
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 3
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 2
- ORTQZVOHEJQUHG-UHFFFAOYSA-L copper(II) chloride Chemical compound Cl[Cu]Cl ORTQZVOHEJQUHG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- MPTQRFCYZCXJFQ-UHFFFAOYSA-L copper(II) chloride dihydrate Chemical compound O.O.[Cl-].[Cl-].[Cu+2] MPTQRFCYZCXJFQ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229910000366 copper(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 2
- CNFDGXZLMLFIJV-UHFFFAOYSA-L manganese(II) chloride tetrahydrate Chemical compound O.O.O.O.[Cl-].[Cl-].[Mn+2] CNFDGXZLMLFIJV-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- IOLCXVTUBQKXJR-UHFFFAOYSA-M potassium bromide Chemical compound [K+].[Br-] IOLCXVTUBQKXJR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- WQGWDDDVZFFDIG-UHFFFAOYSA-N pyrogallol Chemical compound OC1=CC=CC(O)=C1O WQGWDDDVZFFDIG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JHJLBTNAGRQEKS-UHFFFAOYSA-M sodium bromide Chemical compound [Na+].[Br-] JHJLBTNAGRQEKS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N sodium nitrate Chemical compound [Na+].[O-][N+]([O-])=O VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 230000004304 visual acuity Effects 0.000 description 2
- JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L zinc dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Zn+2] JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 229910021591 Copper(I) chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 238000006701 autoxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 229910000365 copper sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- OXBLHERUFWYNTN-UHFFFAOYSA-M copper(I) chloride Chemical compound [Cu]Cl OXBLHERUFWYNTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229960003280 cupric chloride Drugs 0.000 description 1
- 229940045803 cuprous chloride Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 229960003511 macrogol Drugs 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 238000007750 plasma spraying Methods 0.000 description 1
- 229940093916 potassium phosphate Drugs 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 229940079877 pyrogallol Drugs 0.000 description 1
- 230000004223 radioprotective effect Effects 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 238000001577 simple distillation Methods 0.000 description 1
- 229940001516 sodium nitrate Drugs 0.000 description 1
- 235000010344 sodium nitrate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004317 sodium nitrate Substances 0.000 description 1
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 229910001428 transition metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011592 zinc chloride Substances 0.000 description 1
- 235000005074 zinc chloride Nutrition 0.000 description 1
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开的从红细胞中提取超氧化物歧化酶的方法，步骤包括动物新鲜血液抗凝处理后，离心收集红细胞，经溶血，热变性，丙酮分级沉淀，冻干得SOD粗品。粗品经离子交换层析和/或分子筛层析得SOD精品。本发明彻底摒弃了氯仿乙醇，只采用热变性和丙酮分级沉淀的方法，简便的分离出具有较高活力的粗品SOD。本发明的从红细胞中提取超氧化物歧化酶的方法，能最大限度的保持原有的SOD活力，得率比传统的氯仿乙醇法更高。本发明操作简单，适合于工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种从红细胞中提取超氧化物歧化酶的方法，属于生物技术领域。
背景技术
超氧化物歧化酶(SOD)是普遍存在于生物体内的一种能清除超氧阴离子自由基的金属酶，具有抗炎症、抗辐射、抗肿瘤等多种功能，现已被广泛应用于医药、食品、保健食品和化妆品中。
现行的从红细胞中提取超氧化物歧化酶的方法主要是取血，抗凝，用生理盐水洗涤，低温溶血，氯仿乙醇抽提血红蛋白，磷酸钾萃取，热变性，丙酮沉淀，再离子交换层析，分子筛柱层析。该工艺缺点是流程复杂，成本高昂，且氯仿具有较强的毒性。另外单纯用氯仿乙醇抽提血红蛋白，由于SOD吸附于血红蛋白之上，造成SOD的得率减小。
发明内容
本发明的目的是提供一种工艺简单，成本低廉，适合于工业化生产的从红细胞中提取超氧化物歧化酶的方法。
本发明的从红细胞中提取超氧化物歧化酶的方法，其步骤如下：
1)取动物新鲜血液，搅拌下加入柠檬酸钠溶液抗凝，离心收集红细胞；
2)向步骤1)收集的红细胞中加入1～5倍体积的蒸馏水，搅拌，使红细胞破碎，得红细胞溶血液；
3)向红细胞溶血液中加入单价中性金属盐，至单价中性金属盐终浓度为0.01M～3M，再加入过渡金属盐，至过渡金属盐终浓度为0.1mM～10mM；
4)加热至50～85℃，保温20～120min后，过滤或离心去渣，得到SOD粗提液；
5)搅拌下，向SOD粗提液加入0.7～1.1倍体积的经预冷的丙酮，离心取上清；
6)搅拌下，向步骤5)所得的上清中加入1.3～1.6倍体积的经预冷的丙酮，离心取沉淀，用缓冲液溶解，脱盐后冷冻干燥，获得SOD粗品；或者将沉淀经缓冲液溶解脱盐后，经过阴离子交换层析和/或分子筛柱层析，冷冻干燥，获得SOD精品。
本发明中，所用的柠檬酸钠溶液为质量浓度10％的柠檬酸钠溶液，柠檬酸钠溶液的加入量为血液体积的1～10％；
本发明中，所说的单价中性金属盐可以是碱金属的氯化物、溴化物、硝酸盐和硫酸盐中的任一种或几种的混合物。例如氯化钠、氯化钾、溴化钠、溴化钾、硝酸钠、硫酸钠中的一种或几种的混合物。由于氯化钠、氯化钾成本低廉，容易获取，且无毒无害，优选氯化钠、氯化钾作为中性金属盐。
本发明中，所说的过渡金属盐可以是铜盐、锌盐和锰盐中的一种或几种的混合物。如氯化铜、氯化亚铜、氯化锰、氯化锌、硫酸铜等。
本发明中，步骤6)所说的缓冲液可为pH7.2～8.0的2.5mM的磷酸缓冲液。
为了有更好的纯化效果，本发明中所说的阴离子交换层析一般采用DEAE阴离子交换层析，层析柱先用pH7.2～8.0的2.5mM的磷酸缓冲液平衡，然后上样，用相同缓冲液洗脱至280nm无光吸收，然后换用单一浓度的洗脱液洗脱至280nm无光吸收，收集SOD活力峰。所指的单一浓度的洗脱液为以下任意一种，1)与平衡层析柱的缓冲液pH、浓度相同的磷酸缓冲液中加入0.004～0.01M氯化钠；2)与平衡层析柱的缓冲液pH相同、浓度为5～10mM的磷酸缓冲液。为了降低成本，优选DEAE阴离子交换层析为可以重复使用且流速较快的DEAESepharose Fast Flow(DEAE快速流琼脂糖)。
本发明中所说的分子筛柱层析，可以采用Sephadex G100(葡聚糖凝胶G100)或Sephadex G75(葡聚糖凝胶G75)柱层析，层析柱先用蒸馏水平衡，然后上样，以蒸馏水洗脱，收集SOD活力峰。
本发明的有益效果在于：
本发明彻底摒弃了氯仿乙醇，只采用热变性和丙酮分级沉淀的方法，简便的分离出具有较高活力的粗品SOD，这是对SOD生产的革命性的改进。由于丙酮可以通过简单的蒸馏法回收，因此该方法成本低廉，更适合于工业化生产。本发明由于采用热变性除血红蛋白，因此可以在常温下溶血，使操作更简便，降低能耗。
本发明在热变性中同时加入中性金属盐和过渡金属盐，使得热变性更彻底，杂蛋白去除更完全，同时最大限度的保持原有的SOD活力，得率比传统的氯仿乙醇法更高。中性单价金属盐在热变性对SOD有保护作用，中性金属盐的加入，增加了红细胞溶血液的离子强度，适当的离子强度可以抑制变性的血红蛋白沉淀吸附SOD，使SOD抽提更完全，同时高盐浓度对SOD有一定的保护作用，上述两大优势提高了SOD的得率。过渡金属盐，特别是Cu2+，一方面对SOD有很好的保护作用，另一方面过渡金属离子可以使杂蛋白对热更敏感，这就提高了热变性对SOD跟杂蛋白的分辨率。
本发明改进了原有的丙酮一次沉淀的方法为丙酮分级沉淀，提高了丙酮沉淀的分辨率，使得丙酮沉淀更加有效。由于SOD对丙酮不敏感而一般的杂蛋白对有机溶剂都比较敏感。本发明在结合一般SOD提取中丙酮沉淀的方法，摸索出丙酮分级沉淀的方法。沉淀的范围跟前面加入的中性盐的量有一定的关联，由于盐析作用的存在，随着中性金属盐的浓度增大，丙酮用量减少。
本发明在DEAE离子交换层析中摸索出了两个行之有效的单一浓度洗脱液，避免了连续梯度洗脱，省却了梯度装置来产生梯度的麻烦，使离子交换更稳定，操作更简单，在生产中更容易被操作工人所掌握。
本发明在G100/75分子筛柱层析过程中，采用蒸馏水作为洗脱液，可以一步达到分离跟脱盐的目的，省去了后续脱盐的操作。
具体实施方式
以下通过实施例进一步对本发明进行阐释。本发明中涉及的SOD活力和蛋白浓度测定分别使用国内通用的邻苯三酚自氧化法和folin—酚法。
实施例1
新鲜猪血200L加入10L浓度为10％的柠檬酸钠溶液抗凝，用管式离心机分离得90L红细胞和120L血浆。血浆喷雾干燥成为血浆蛋白粉。红细胞泵入反应罐中，同时加入180L的蒸馏水搅拌30min。继续搅拌下加入10.2Kg氯化钾和300g二水氯化铜，加热到65℃并保温60min，迅速水冷至30℃以下，板框式压滤机压滤得浅蓝色SOD粗提液共190L，单位活力210U/ml。搅拌下加入190L的4℃预冷丙酮，继续搅拌15min。管式离心机离心，上清液在搅拌下加入76L的预冷丙酮，继续搅拌15min后离心，得浅蓝绿色沉淀。沉淀用1L的pH7.2浓度2.5mM的磷酸缓冲液溶解，得1.2L浅蓝绿色溶液，溶解液对相同的缓冲液透析脱盐，总共5次，每次5小时。脱盐后冷冻干燥得到比活3300U/mg蛋白的SOD粗品7.27g，密封包装后-20℃冷冻保存。
实施例2
新鲜猪血14L用140ml浓度为10％的柠檬酸钠溶液抗凝，用管式离心机分离得6L红细胞和8.14L血浆。将红细胞置于反应罐中，加入10L蒸馏水，室温搅拌30min。继续搅拌下加入氯化钠80g、氯化钾112g和五水硫酸铜2.5g，加热到68℃保温一个小时，压滤得蓝绿色澄清溶液12L，单位活力230U/ml。搅拌下加入8.4L的4℃预冷丙酮，继续搅拌15min。管式离心机离心，上清液在搅拌下加入9.6L的预冷丙酮，继续搅拌15min后离心，得浅蓝绿色沉淀。沉淀用100ml左右pH为7.6的浓度2.5mM磷酸缓冲液溶解，溶解液上sephadex G25柱层析(
)脱盐，装好的G25柱子用2.5mM的磷酸钾缓冲液平衡至少两个体积，上样后用该缓冲液洗脱，收集蛋白质峰部分层析液，得大约150ml溶液。
脱盐后的样品上DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析(
)。层析柱装好以后用pH为7.6的2.5mM的磷酸缓冲液平衡至少三倍柱体积，上样后用该缓冲液淋洗至280nm无光吸收，换含0.004M氯化钠的pH7.6、浓度2.5mM的磷酸缓冲液洗脱，收集SOD活力峰，体积400ml左右SOD液，活力5500U/ml，比活力5200U/mg蛋白。
离子交换洗脱的SOD样品液用聚乙二醇20000浓缩至30ml左右，上分子筛Sephadex G75(
)，用蒸馏水平衡，用蒸馏水洗脱。收集活性峰部分，得100ml左右SOD样品液，单位活力21000U/ml。冻干得浅蓝绿色SOD冻干粉320mg，比活力6700U/mg蛋白，密封包装后-20℃冷冻保存。
实施例3
取新鲜猪血10L，加入300ml浓度为10％的柠檬酸钠溶液抗凝，离心得红细胞4.5L，加入20.5L蒸馏水，室温搅拌30min。继续搅拌下加入氯化钠4.3Kg，五水硫酸铜62.5g，加热到83℃保温20min，压滤得蓝绿色澄清溶液21L，单位活力60U/ml。滤液中加入丙酮分级沉淀，搅拌下加入16.8L预冷丙酮，继续搅拌15min，离心取上清；上清继续加入14.7L预冷丙酮，继续搅拌15min，离心取沉淀。沉淀用100ml左右的pH8.0的浓度2.5mM磷酸缓冲液溶解，溶解液对相同的缓冲液透析脱盐，总共5次，每次5小时。
脱盐后的样品上DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析(
)。层析柱装好以后用pH为8.0的2.5mM的磷酸缓冲液平衡至少三倍柱体积，上样后用该缓冲液淋洗至280nm无光吸收，换pH8.0的10mM的磷酸缓冲液洗脱，得到单一的蛋白峰即为SOD活力峰，体积400ml左右SOD液，活力2500U/ml。层析液对蒸馏水透析，每次5小时，总共5次。透析后冻干，得浅蓝绿色SOD冻干粉220mg，比活力4500U/mg蛋白，密封包装后-20℃冷冻保存。
实施例4
取新鲜猪血2L，加入200ml浓度为10％柠檬酸钠溶液抗凝，离心得红细胞900ml，加入900ml蒸馏水，室温搅拌30min。继续搅拌下加入氯化钠1.5g，氯化锰0.356g和二水氯化铜0.25g，加热到60℃保温2小时，离心得溶液1.2L，单位活力260U/ml。滤液中加入丙酮分级沉淀，搅拌下加入1.08L预冷丙酮，继续搅拌15min，离心取上清；上清继续加入720ml预冷丙酮，继续搅拌15min，离心取沉淀。沉淀用20ml左右pH为7.8的浓度2.5mM磷酸缓冲液溶解，溶解液对相同的缓冲液透析脱盐，总共5次，每次5小时，脱盐后得浅蓝色溶液30ml。
脱盐液上分子筛柱层析，分子筛Sephadex G100()，用蒸馏水平衡，用蒸馏水洗脱。收集活性峰部分，得100ml左右SOD样品液，单位活力2700U/ml。冻干得浅蓝绿色SOD冻干粉66mg，比活力4100U/mg蛋白，密封包装后-20℃冷冻保存。
Claims (7)
1.从红细胞中提取超氧化物歧化酶的方法，其步骤如下：
1)取动物新鲜血液，搅拌下加入柠檬酸钠溶液抗凝，离心收集红细胞；
2)向步骤1)收集的红细胞中加入1～5倍体积的蒸馏水，搅拌，使红细胞破碎，得红细胞溶血液；
3)向红细胞溶血液中加入单价中性金属盐，至单价中性金属盐终浓度为0.01M～3M，再加入过渡金属盐，至过渡金属盐终浓度为0.1mM～10mM；
4)加热至50～85℃，保温20～120min后，过滤或离心去渣，得到SOD粗提液；
5)搅拌下，向SOD粗提液加入0.7～1.1倍体积的经预冷的丙酮，离心取上清；
6)搅拌下，向步骤5)所得的上清中加入1.3～1.6倍体积的经预冷的丙酮，离心取沉淀，用缓冲液溶解，脱盐后冷冻干燥，获得SOD粗品；或者将沉淀经缓冲液溶解脱盐后，经过阴离子交换层析和/或分子筛柱层析，冷冻干燥，获得SOD精品。
2.根据权利要求1所述的从红细胞中提取超氧化物歧化酶的方法，其特征是柠檬酸钠溶液为质量浓度为10％的柠檬酸钠溶液，柠檬酸钠溶液的加入量为血液体积的1～10％。
3.根据权利要求1所述的从红细胞中提取超氧化物歧化酶的方法，其特征是单价中性金属盐为碱金属的氯化物、溴化物、硝酸盐和硫酸盐中的任一种或几种的混合物。
4.根据权利要求1所述的从红细胞中提取超氧化物歧化酶的方法，其特征是所说的过渡金属盐为铜盐、锌盐和锰盐中的一种或几种的混合物。
5.根据权利要求1所述的从红细胞中提取超氧化物歧化酶的方法，其特征是步骤6)所说的缓冲液为pH7.2～8.0的2.5mM的磷酸缓冲液。
6.根据权利要求1所述的从红细胞中提取超氧化物歧化酶的方法，其特征在于阴离子交换层析是DEAE阴离子交换层析，层析柱先用pH7.2～8.0的2.5mM的磷酸缓冲液平衡，然后上样，用相同缓冲液洗脱至280nm无光吸收，然后换用单一浓度的洗脱液洗脱至280nm无光吸收，收集SOD活力峰，所指的单一浓度的洗脱液为以下任意一种，1)与平衡层析柱的缓冲液pH、浓度相同的磷酸缓冲液中加入0.004～0.01M氯化钠；2)与平衡层析柱的缓冲液pH相同、浓度为5～10mM的磷酸缓冲液。
7.根据权利要求1所述的从红细胞中提取超氧化物歧化酶的方法，其特征在于分子筛柱层析是Sephadex G100或Sephadex G75柱层析，层析柱先用蒸馏水平衡，然后上样，以蒸馏水洗脱，收集SOD活力峰。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNB2007100708138A CN100537755C (zh) | 2007-08-17 | 2007-08-17 | 从红细胞中提取超氧化物歧化酶的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNB2007100708138A CN100537755C (zh) | 2007-08-17 | 2007-08-17 | 从红细胞中提取超氧化物歧化酶的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101139576A CN101139576A (zh) | 2008-03-12 |
| CN100537755C true CN100537755C (zh) | 2009-09-09 |
Family
ID=39191680
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CNB2007100708138A Expired - Fee Related CN100537755C (zh) | 2007-08-17 | 2007-08-17 | 从红细胞中提取超氧化物歧化酶的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN100537755C (zh) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101353370B (zh) * | 2008-09-09 | 2011-04-13 | 浙江大学 | 从禽畜血中提取血红蛋白和超氧化物歧化酶的方法 |
| CN102181411A (zh) * | 2011-04-01 | 2011-09-14 | 黑龙江宝迪肉类食品有限公司 | 一种从猪血红细胞中提取超氧化物歧化酶sod的方法 |
| CN102250851A (zh) * | 2011-08-10 | 2011-11-23 | 天津宝迪农业科技股份有限公司 | 从动物血球液中提取超氧化物歧化酶sod的新工艺 |
| CN103397004A (zh) * | 2013-07-25 | 2013-11-20 | 天津核生科技生物工程有限公司 | 一种从高寒灵芝中提取sod的方法 |
| CN103436500A (zh) * | 2013-08-22 | 2013-12-11 | 慈溪市迈康生物科技有限公司 | 一种从动物血液中提取超氧化物歧化酶的方法 |
| CN104450636A (zh) * | 2014-12-29 | 2015-03-25 | 成都市真阳子生物科技有限公司 | 一种超氧化物歧化酶的制备方法 |
| CN106434580A (zh) * | 2016-10-21 | 2017-02-22 | 南阳理工学院 | 一种植物超氧化物歧化酶提取的新方法 |
| CN109055325B (zh) * | 2018-08-28 | 2022-08-16 | 佛山科学技术学院 | 一种鸭血红细胞sod的分离纯化方法 |
-
2007
- 2007-08-17 CN CNB2007100708138A patent/CN100537755C/zh not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 羊红细胞铜锌超氧化物歧化酶的纯化及部分性质研究. 张彩莹等.中国生化药物杂志，第24卷第1期. 2003 |
| 羊红细胞铜锌超氧化物歧化酶的纯化及部分性质研究. 张彩莹等.中国生化药物杂志，第24卷第1期. 2003 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN101139576A (zh) | 2008-03-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN100537755C (zh) | 从红细胞中提取超氧化物歧化酶的方法 | |
| CN101353370B (zh) | 从禽畜血中提取血红蛋白和超氧化物歧化酶的方法 | |
| CN101182495B (zh) | 以猪小肠为原料联产生产碱性磷酸酶和肝素钠的联产工艺 | |
| CN102181411A (zh) | 一种从猪血红细胞中提取超氧化物歧化酶sod的方法 | |
| CN103436500A (zh) | 一种从动物血液中提取超氧化物歧化酶的方法 | |
| JPH0133158B2 (zh) | ||
| CN110606900B (zh) | 一种具有抗氧化作用的木枣多糖的分离纯化方法 | |
| CN107033237B (zh) | 一种人血浆载脂蛋白a-i的分离纯化方法 | |
| EP0019477B1 (en) | Process for isolating cu, zn-superoxide dismutase from aqueous solutions, and enzyme obtained | |
| NO178882B (no) | Fremgangsmåte for separasjon av vitamin K-avhengige blodkoagulerende faktorer | |
| CN102628036A (zh) | 一种生产超氧化物歧化酶sod的除杂纯化新工艺 | |
| JPH0151997B2 (zh) | ||
| CN109438585A (zh) | 一种b型嗜血杆菌多糖的纯化工艺 | |
| CN108191958B (zh) | 一种亚麻籽粕抗氧化六肽及其制备方法与应用 | |
| CN102925416A (zh) | 从哺乳动物血液中提取超氧化物歧化酶的方法 | |
| CN102250851A (zh) | 从动物血球液中提取超氧化物歧化酶sod的新工艺 | |
| JPH05117303A (ja) | ヤマブシタケ由来の水溶性多糖類及び該水溶性多糖類を主剤とする抗腫瘍剤 | |
| CN101073666B (zh) | 一种制备胰激肽原酶原料药的方法 | |
| CN109055325B (zh) | 一种鸭血红细胞sod的分离纯化方法 | |
| CN103397003A (zh) | 一种动物血液中超氧化物歧化酶提取技术新工艺 | |
| CN1428422A (zh) | 超氧化物歧化酶大规模生产新工艺 | |
| Morrison et al. | The isolation of cytochrome c by salt extraction | |
| CN108822205A (zh) | 一种羊血清白蛋白的提取方法 | |
| CN103665181A (zh) | 一种简易制备条斑紫菜粗多糖的方法 | |
| RU2528061C1 (ru) | Способ получения цитохрома с |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: FUSHUN DANYANG BIOTECHNOLOGY CO., LTD. Free format text: FORMER OWNER: ZHEJIANG UNIVERSITY Effective date: 20130123 |
|
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: ADDRESS; FROM: 310027 HANGZHOU, ZHEJIANG PROVINCE TO: 113109 FUSHUN, LIAONING PROVINCE |
|
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20130123 Address after: 113109 Fushun City, Liaoning province Dongzhou District Pan Xiang Shi Fu Cun Patentee after: Fushun Danyang biological science and Technology Co Ltd Address before: 310027 Hangzhou, Zhejiang Province, Xihu District, Zhejiang Road, No. 38, No. Patentee before: Zhejiang University |
|
| C56 | Change in the name or address of the patentee | ||
| CP01 | Change in the name or title of a patent holder |
Address after: 113109 Fushun City, Liaoning province Dongzhou District Pan Xiang Shi Fu Cun Patentee after: Danyang biological Polytron Technologies Inc of Fushun Address before: 113109 Fushun City, Liaoning province Dongzhou District Pan Xiang Shi Fu Cun Patentee before: Fushun Danyang biological science and Technology Co Ltd |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20090909 Termination date: 20160817 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |