RU2528061C1 - Способ получения цитохрома с - Google Patents
Способ получения цитохрома с Download PDFInfo
- Publication number
- RU2528061C1 RU2528061C1 RU2013124436/10A RU2013124436A RU2528061C1 RU 2528061 C1 RU2528061 C1 RU 2528061C1 RU 2013124436/10 A RU2013124436/10 A RU 2013124436/10A RU 2013124436 A RU2013124436 A RU 2013124436A RU 2528061 C1 RU2528061 C1 RU 2528061C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cytochrome
- nuvia
- cation exchanger
- sorption
- extract
- Prior art date
Links
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу получения цитохрома С. Способ предусматривает обезжиривание сердец свиней, крупного рогатого скота или лошадей. Подготовленное сырье измельчают с получением фарша, затем экстрагируют 2,5% раствором трихлоруксусной кислоты при температуре 10-15°С и рН 3,9-4,2. Отделяют экстракт и осуществляют его сорбцию на катионите Nuvia™ S, уравновешенном дистиллированной водой. После завершения сорбции катионит Nuvia™ S промывают дистиллированной водой и аммиачно-аммонийным буферным раствором. Затем проводят элюцию цитохрома C с катионита Nuvia™ S раствором сульфата аммония с последующей очисткой его диафильтрацией до полного удаления ионов сульфата аммония и концентрированием цитохрома С ультрафильтрацией. Изобретение позволяет увеличить выход продукта, повысить его чистоту и сократить технологический процесс. 2 з.п. ф-лы, 1 табл., 3 пр.
Description
Настоящее изобретение относится к биотехнологии, к области получения лекарственных белковых препаратов, а именно к способу получения цитохрома С из мышц сердца млекопитающих - свиней, крупного рогатого скота и лошадей.
Цитохром С представляет собой фермент с молекулярной массой около 12700 Да, в качестве простетической группы содержит гематом железа, катализирует окислительно-восстановительные реакции и служит переносчиком электронов (Ю.А. Овчинников. Биоорганическая химия. М.: Химия, 1987, с.815).
Цитохром С широко используется в медицине и ветеринарии в качестве лекарственного препарата, а также в виде реактива в биохимии и биотехнологии.
Изобретение может использоваться при получении цитохрома С в промышленных масштабах.
Цитохром С может быть выделен из разнообразных видов природного сырья: дрожжей, риса, мышц сердца млекопитающих (лошадей, крупного рогатого скота, свиней, собак, кроликов, человека), птиц (голубей, пингвинов), сердец лососевых и других. Известны способы получения цитохрома С, включающие выделение из мышц сердца млекопитающих, предпочтительно крупного рогатого скота, путем экстракции и сорбционной очистки экстракта с использованием алюмосиликата магния (F. Okumura and al. Chem. Soc. Japan. V.49, №1, p.65, 1975) или карбоксильных катионитов типа Амберлит ХЕ - 64 (В. Hagihara and al. J. Biochem. V. 45, №8, p.551, 1975) и КМДМ (Л.К. Шатаева, H.H. Кузнецова, Г.Э. Елькин. Карбоксильные катиониты в биологии. Л.: Наука, 1979, с.285).
Данные сорбенты характеризуются малой емкостью и сложностью при промышленном применении, особенно карбоксильных катионитов из-за разницы в степени набухания в H+ и Na+-форме.
Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ получения цитохрома С из мышц сердца млекопитающих - свиней, крупного рогатого скота и лошадей (Патент RU 2435597, опубл. 10.12.2011, бюл. №34), включающий обезжиривание сердец свиней крупного рогатого скота или лошадей, удаление из них связок и сосудов, измельчение и экстракцию 2,5% раствором кислоты трихлоруксусной при температуре 10-15°C, при pH 3,9-4,2, отделение экстракта от фарша. Сорбцию целевого продукта проводят непосредственно из отфильтрованного экстракта при pH экстракта на катионите UNOsphere™ S, уравновешенном стартовым буферным раствором, содержащий 2 мМ лимонной кислоты и 1,5 мМ трис (трис (гидроксиметил) аминометан) при pH 3,9-4,2, после завершения сорбции катионит промывают стартовым буферным раствором, балластные белки удаляют с катионита UNOsphere™ S 80 мМ раствором трис и затем проводят элюцию цитохрома С раствором сульфата аммония с концентрацией 0,3 М, после стадии элюции осуществляют осаждение балластных белков путем добавления сухого сульфата аммония из расчета 0,270 г\мл.
В прототипе используют катионит UNOsphere™ S (UNOsphere Polymer Technology, производства «Bio-Rad» USA) - имеющий в качестве функциональных групп - SO3-группы.
Недостатком указанного способа получения цитохрома С является невысокая степень чистоты цитохрома С, показатель чистоты (E550\280) цитохрома С в элюате (отношение экстинкции раствора цитохрома С при длине волны 550 нм и раствора цитохрома С при длине волны 280 нм) составляет 0,92-0,93, что требует для осаждения балластных белков из элюата использование повышенного количества сульфата аммония (0,27 г\мл), также к существенным недостаткам указанного способа получения цитохрома С является использование растворов, в состав которых входят дорогостоящие реактивы, такие как лимонная кислота и трис(гидроксиметил) аминометан. Вышеуказанные недостатки значительно сокращают эффективность и экономичность технологического процесса.
Таким образом, задача настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить способ получения цитохрома С из экстракта с использованием катионитов нового поколения, обеспечивающих высокую емкость сорбции и обратимость сорбции с применением недорогих реактивов, обеспечивающих высокую степень чистоты целевого продукта, что делает их наиболее предпочтительными при использовании в промышленных масштабах.
Техническим результатом настоящего изобретения является: увеличение емкости по целевому продукту, повышение степени чистоты цитохрома С, сокращение технологического процесса.
Согласно настоящему изобретению предложен сорбционный способ получения цитохрома С из экстракта с использованием катионита нового поколения Nuvia™ S (Nigh - Capacity Cation Exchange Media, производства «Bio-Rad» USA) - содержащий в качестве функциональных групп - сульфогруппы. На заключительных стадиях получения цитохрома С применяют диафильтрацию (для удаления ионов сульфата аммония) и ультрафильтрацию (для концентрирования цитохрома С) в тангенциальном потоке на мембранах с пределом исключения по молекулярной массе 5 кДа фирмы Millipore или Sartorius.
Для достижения указанного технического результата предложен способ, который включает в себя следующие стадии:
Из сердец свиней, крупного рогатого скота или лошадей после обезжиривания и удаления из них связок, сосудов, путем измельчения получают фарш. Полученный фарш экстрагируют 2,5% раствором кислоты трихлоруксусной при температуре 10-15°C, при pH 3,9-4,2. После отделения от фарша непосредственно ведут сорбцию целевого продукта из отфильтрованного экстракта на катионите Nuvia™ S, катионит предварительно уравновешивают дистиллированной водой. После завершения сорбции катионит Nuvia™ S промывают дистиллированной водой. Удаление балластных белков с колонки проводят 0,075 М аммиачно-аммонийным буферным раствором pH=10,5. Элюцию цитохрома C с катионита Nuvia™ S проводят раствором сульфата аммония с концентрацией 0,25 М. Для отделения цитохрома С от сульфата аммония проводят диафильтрацию в тангенциальном потоке на мембранах с пределом исключения 5 кДа, на этих же мембранах ультрафильтрацией осуществляют концентрирование цитохрома С.
Для уравновешивания и промывки колонки наиболее оптимальной является дистиллированная вода. Для удаления балластных белков с катионита оптимальным является 0,075 М аммиачно-аммонийный буферный раствор pH=10,5, при более низких концентрациях и pH буферного раствора не полностью вымываются балластные белки, более высокие концентрации и pH не оказывают существенного влияния на количество удаленных балластных белков. Для элюции цитохрома C с катионита наиболее оптимальным является раствор сульфата аммония с концентрацией 0,25 М, низкие концентрации сульфата аммония не полностью элюируют целевой продукт с катионита, при более высоких концентрациях с катионита частично элюируются примесные белки, что существенно снижает степень чистоты целевого продукта.
Использование катионита Nuvia™ S позволяет непосредственно вести сорбцию цитохрома С из экстракта (при pH экстракта), использовать меньший объем катионита за счет большей его емкости, существенно повысить степень чистоты цитохрома С. Повышение степени чистоты цитохрома С на стадии десорбции с катионита Nuvia™ S делает возможным исключение стадии осаждения балластных белков, что значительно повышает эффективность и экономичность технологического процесса как за счет уменьшения расхода реактивов, так и за счет сокращения времени проведения процесса.
Настоящее изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1.
2,6 кг фарша, полученного из сердечных мышц свиней после удаления сосудов, связок и измельчения, отмывают водой от остатков крови, экстрагируют 2,5% кислоты трихлоруксусной. Экстракцию ведут 2 ч при 10-15°C. Экстракт отделяют от исходного сырья фильтрованием через ватно-марлевый фильтр с последующим центрифугирование при n=3000 об\мин в течение 10 мин. pH полученного экстракта 4,1. Всего получают 2750 мл экстракта. Полученный экстракт пропускают через катионит Nuvia™ S, уравновешенным дистиллированной водой. Объем колонки 49 мл (диаметр 2,5 см, высота слоя сорбента 3,8 см, количество сорбента 19 мл). Сорбцию ведут при скорости пропускания раствора 2240 мл/ч. Время сорбции около 1,2 ч. Затем катионит Nuvia™ S промывают 200 мл дистиллированной воды. Время промывки 0,09 ч. Для удаление балластных белков с колонки пропускают 400 мл 0,075 М аммиачно-аммонийный буферный раствор pH=10,5 при скорости 750 мл\час. Время промывки 0,53 ч.
Элюцию цитохрома С проводят раствором сульфата аммония с концентрацией 0,25 М. Скорость подачи элюирующего раствора 75 мл/ч. Время элюции 0,5 ч. Элюат отбирают фракциями. Фракции, окрашенные в красный цвет, объединяют. Объем фракций около 25 мл. Показатель чистоты цитохрома С (E550\280) составляет 1,15. Выход 245 мг цитохрома С или 94,6 мг\кг исходного сырья.
Пример 2.
Выполняется в условиях примера 1. Для отделения цитохрома С от ионов сульфата аммония проводят диафильтрацию. Для этого раствор цитохрома С в количестве 125 мл (объединенные фракции 5х загрузок) пропускают на ультрафильтрационной установке в режиме диафильтрации в тангенциальном потоке через мембраны фирмы Millipore (кассета типа Pellicon XL) или Sartorius (кассета типа Vivaflow 50) с пределом исключения по молекулярной массе 5 кДа. Собирают 135 мл раствора, содержащий целевой продукт.
Показатель чистоты цитохрома С (E550\280) - 1,24. Выход 232 мг цитохрома С или 89,2 мг\кг исходного сырья (в пересчете на одну загрузку).
Пример 3.
Выполняется в условиях примера 1 и 2. Цитохром С после диафильтрации концентрируют методом ультрафильтрации. 135 мл раствор цитохрома С (объединенные фракции 5x загрузок после диафильтрации) пропускают на ультрафильтрационной установке в тангенциальном потоке через мембраны фирмы Millipore (кассета типа Pellicon XL) или Sartorius (кассета типа Vivaflow 50) с пределом исключения по молекулярной массе 5 кДа. Получают 45 мл раствора, содержащий целевой продукт.
Показатель чистоты цитохрома С (E550\280) - 1,26. Выход 225,7 мг цитохрома С или 86,8 мг\кг исходного сырья (в пересчете на одну загрузку).
Примеры 4-9 по стадиям выполнены в условиях примера 1, 2 и 3. Все экспериментальные данные представлены в таблице.
При этом индекс А означает сырье из сердечных мышц свиньи по примеру 1, 2 и 3;
Б - сырье из сердечных мышц крупного рогатого скота; В - сырье из сердечных мышц лошади.
Claims (3)
1. Способ получения цитохрома С, включающий обезжиривание сердец свиней, крупного рогатого скота или лошадей, удаление из них связок и сосудов, измельчение и экстракцию 2,5% раствором кислоты трихлоруксусной при температуре 10-15°C, при pH 3,9-4,2, отделение экстракта от фарша, сорбцию и элюцию на катионите, удаление балластных белков, концентрирование и очистку диафильтрацией и ультрафильтрацией до полного удаления ионов сульфата аммония, отличающийся тем, что сорбцию целевого продукта проводят непосредственно из отфильтрованного экстракта при pH экстракта на катионите Nuvia™ S, уравновешенном дистиллированной водой, после завершения сорбции катионит промывают дистиллированной водой, балластные белки удаляют с катионита Nuvia™ S 0,075 М аммиачно-аммонийным буферным раствором рН 10,5 и затем проводят элюцию цитохрома C с катионита Nuvia™ S раствором сульфата аммония с концентрацией 0,25 М.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что очистку цитохрома С от ионов сульфата аммония проводят диафильтрацией в тангенциальном потоке через мембраны с пределом исключения по молекулярной массе 5 кДа.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что концентрирование цитохрома С проводят ультрафильтрацией в тангенциальном потоке через мембраны с пределом исключения по молекулярной массе 5 кДа.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2013124436/10A RU2528061C1 (ru) | 2013-05-29 | 2013-05-29 | Способ получения цитохрома с |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2013124436/10A RU2528061C1 (ru) | 2013-05-29 | 2013-05-29 | Способ получения цитохрома с |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2528061C1 true RU2528061C1 (ru) | 2014-09-10 |
Family
ID=51540227
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2013124436/10A RU2528061C1 (ru) | 2013-05-29 | 2013-05-29 | Способ получения цитохрома с |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2528061C1 (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2745443C1 (ru) * | 2020-06-10 | 2021-03-25 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Московский эндокринный завод" | Способ получения средства, обладающего антигипоксической, регенеративной активностью |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
SU654612A1 (ru) * | 1977-01-10 | 1979-03-30 | Московский технологический институт мясной и молочной промышленности | Способ выделени цитохрома |
SU1297278A1 (ru) * | 1984-11-10 | 1994-04-30 | Ленинградское производственное объединение мясной промышленности | Способ получения цитохрома с |
RU2096464C1 (ru) * | 1994-09-27 | 1997-11-20 | Акционерное общество "Самсон" | Способ получения цитохрома с |
RU2105559C1 (ru) * | 1995-01-17 | 1998-02-27 | Тихоокеанский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства и океанографии | Способ получения цитохрома с |
RU2435597C1 (ru) * | 2010-05-27 | 2011-12-10 | Хамзат Хамидович Арсамаков | Способ получения цитохрома с |
-
2013
- 2013-05-29 RU RU2013124436/10A patent/RU2528061C1/ru active
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
SU654612A1 (ru) * | 1977-01-10 | 1979-03-30 | Московский технологический институт мясной и молочной промышленности | Способ выделени цитохрома |
SU1297278A1 (ru) * | 1984-11-10 | 1994-04-30 | Ленинградское производственное объединение мясной промышленности | Способ получения цитохрома с |
RU2096464C1 (ru) * | 1994-09-27 | 1997-11-20 | Акционерное общество "Самсон" | Способ получения цитохрома с |
RU2105559C1 (ru) * | 1995-01-17 | 1998-02-27 | Тихоокеанский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства и океанографии | Способ получения цитохрома с |
RU2435597C1 (ru) * | 2010-05-27 | 2011-12-10 | Хамзат Хамидович Арсамаков | Способ получения цитохрома с |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2745443C1 (ru) * | 2020-06-10 | 2021-03-25 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Московский эндокринный завод" | Способ получения средства, обладающего антигипоксической, регенеративной активностью |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5908496B2 (ja) | トランスジェニックイネの子実からヒト血清アルブミンを抽出する方法 | |
CN104072636B (zh) | 肝素钠的制备工艺 | |
CN103789373B (zh) | 一种利用固定化酶提取肝素钠的方法 | |
RU2435597C1 (ru) | Способ получения цитохрома с | |
RU2528061C1 (ru) | Способ получения цитохрома с | |
US10377812B2 (en) | Method for efficient purification of human serum albumin | |
TW202012433A (zh) | 一種重組人胰島素或其類似物的前驅物的製備方法 | |
CN103667223B (zh) | 一种氯化钠-氨水、丙酮协同纯化激肽释放酶的方法 | |
CN107033237B (zh) | 一种人血浆载脂蛋白a-i的分离纯化方法 | |
CN105837703A (zh) | 一种提取螺旋藻多糖的方法 | |
CN103740686B (zh) | 一种用醋酸提取激肽释放酶的方法 | |
CN110183550B (zh) | 一种精品肝素钠的制备工艺 | |
CN103408625B (zh) | 一种纯化dna的方法 | |
RU2230325C2 (ru) | Способ приготовления очищенного препарата ботулинического токсина типа а | |
CN1918289A (zh) | 生产乳过氧化物酶的方法 | |
CN1250567C (zh) | 钙离子结合蛋白的提纯方法 | |
CN107602664A (zh) | 一种源于鮸鱼鱼鳔的降血脂五肽及其应用 | |
RU2612813C1 (ru) | Способ получения гепарина | |
Safarik et al. | Large scale magnetic separation of Solanum tuberosum tuber lectin from potato starch waste water | |
CN101073666A (zh) | 一种制备高纯度胰激肽原酶原料药的方法 | |
KR20160092134A (ko) | 미세조류 유래 피코시아닌의 생산 방법 | |
RU2603098C1 (ru) | Способ выделения циркулирующих днк из плазмы или сыворотки крови | |
EP2511288B1 (en) | Method of obtaining inhibitors of cysteine peptidases with an electrophoretic purity from biological materials | |
RU2745443C1 (ru) | Способ получения средства, обладающего антигипоксической, регенеративной активностью | |
CN104789554B (zh) | 从猪小肠黏膜肝素提取后废弃液中制备脱氧核糖核酸的方法 |