SU654612A1 - Способ выделени цитохрома - Google Patents

Description

1

Изобретение относитс  к улучшенному способу вьщелени  цитохрома С биологически активного соединени , который может найти применение в медицине дл  лечени  различных нарушений окислительнЕзЖ процессов в организме .

Известный способ выделени  цитохрома С 1 состоит в кислой экстракции (трихлоруксусной кислотой) сердец крупного рогатого скота, отделении балластных белков сульфатом аммони , осаждении цитохрома С раство-; ром трихлоруксусной кислоты, очистке от примесей насыщенным раствором сульфата аммони , диализе водного раствора продукта, деминерализации раствора цитохрома С с помощью катионита СДВ-ЗТ и анионита ЭДЭ-10П и, наконец, лиофильной сушке. Основные недостатки известного метода состо т в том, что диализ продолжаетс  в течение 2-3 суток , при этом потери цитохрома С составл ют до 25%; кроме того, весь процесс выделени  состоит из большего количества технологических операций, обща  продолжительность которых составл ет 120 ч.

Цель насто щего изобретени  - повышение выхода целевого продукта и упрощение процесса.

Поставленна  цель достигаетс  описываемым способом выделени  цитохрома С из сердец крупного рогатого скота , заключающимс  в том, что сердца крупного рогатого скота экстрагируют трихлоруксусной кислотой, от экстракта отдел ют балластные белки обработкой сульфатом аммони , затем полученный экстракт обрабатывают макропористым сульфокатионитом, содержащим дивинилбензол в пределах 15-100%, с последующим элюированием раствором хлористого натри  или ацетатным буфером при рН 5,8, после чего провод т деминерализацию электродиализом с использованием ионообменных мембран

Отличительными признаками способа  вл ютс  обработка экстракта после отделени  балластных белков макропористым сульфокатионитом, содержащим дивинилбензол в пределах 15-100%, последующее элюирование раствором хлористого натри  или ацетатным буфером при рН 5,8 и проведение деминерализации элюата электродиализом с использованием ионообменных мембран. Предпочтительными вариантами спос ба  вл ютс  многократна  (преимущественно двухкратна ) сорбци  цитохро ма С с помощью макропористых сульфокатионитов и осуществление электроди ализа в течение 4-6 ч при плотности тока 1-2 А/дм Применение описываемого способа вьщелени  цитохрома С из сердец круп ного рогатого скота позвол ет сократить врем  проведени  процесса со 12 до 60 ч и повысить выход целевого продукта на . Пример 1. Свежие сердца, крупного рогатого скота дефростируют измельчают, промывают водой дл  удалени  крови, а затем экстрагируют 2,5%-ной трихлоруксусной кислотой течение 2 ч. Дл  экстракции на 1 вес.ч. фарша берут 1 объем экстрагента .Перед осаждением балластных белков рН в экстракте устанавливают 7,0-7,2. Балластные белки отдел ют при добавлении 550 г (Ш1)2 30 на 1л жидкости. Дл  хроматографического отделени  цитохрома С используют колонку 10 X 200 мм, в которую загружают 10,0+0,1 г (в пересчете на сухое вещество) макропористого катионита КУ-23 30/100. Скорость пропускани  исходного раствора и элюента 2мл/см мин, через колонку пропускают 150 мл экстракта, освобожденного от белков. Цитохром элюируют 0,55 М раствором NaC (40 мл). Параметры ионообмена приведены в табл.1. Таблица 1

Выход цитохрома С в этом опыте составил 62% от условного содержани  в экстракте. В результате проведени  10 опытов было получено 10 фракций с содержанием цитохрома С

1.4мг/мл. Объединенные фракции (100 мл) подвергают повторной хроматографической очистке на колонке (10 X 200 мм). Дл  этого макропористый катионит КУ-23 30/100 предварительно перевод т в Н-форму, последовательно промыва,ют 1 н. раствором NaOH-- -Hj, н. раствором Параметры ионообмена аналогичны описанным . В результате получено 25 мл раствора, имеющего следующие характеристики: концентраци  цитохрома С

4.5мг/мл, концентраци  (NH4)2 SO 2,4 г-экв/л. Потери составл ют 20%, выход 80%. Таким образом, общий выход цитохрома после 2-кратной очистки на сульфокатионите составил 50%. Полученную фракцию цитохрома С подвергают деминерализации в аппарате АО-1, предназначенном дл  обессоливани  биологических жидкостей. Объем рабочей камеры 5 мл, электроды платиновые . В аппарате используют ионообменные мембраны f-lA-40 и МК-40 с рабочей поверхностью 5,5 см .Мембраны предварительно перевод т в рабочую форму и привод т в равновесие с раствором цитохрома С. В качестве каталиГта используют 0,2 н. раствор NaOH, а аналита - 0,02 н. раствор Н SO,, Деминерализацию провод т в течение 4 ч при плотности тока 2,0 А/дм В результате концентраци  (NH) ЗО снижаетс  до 0,1 г-экв/л. Потери цитохрома С на этой стадии составл ют 15%. Полученный раствор подвергают лиофильной сушке. Идентификацию и количественное определение осуществл ют спектрофотометрическим методом. Обилий выход

. Е цитохрома С 42,5%, -S . О , 9 .

с 2QO ОКИСЛ

Пример 2. Подготовку сырь , экстракцию и удаление балластных белков провод т по методике, описанной в примере 1. В качестве сорбента используют макропористый сульфокатионит КУ 23 40/100 в количестве 10,0± iO,1 г (в пересчете на сухое вещество ) . Параметры ионообмена в данном случае аналогичны параметрам, описанным в примере 1. Кроме того, дл  данной смолы исследовали вли ние раз .личных видов элюента на процесс десорбции (табл.2).

Таблица 2

дистиллированна 

0,55 М раствор NaC6

0,55 50,0

В данном примере оптимальные результаты (учитыва  степень чистоты и вьоход) получают при использовании в качестве элюента раствора NaCe.

Повторное хроматографирование объединенных фракций, содержащих 3,3 мг/мл цитохрома С, на катионйте 40/100 позволило получить фракцию цитохрома С, котора  имеет следующие характеристики: концентраци  цитохрома 5,0 мг/мл, концентраци  (NH ,)2 SO 2,3 Г--ЭКВ/Л. Общий выход цитохрома С после 2-кратной хроматографической очистки составил 50% Полученный раствор цитохрома С подвергают деминерализации в аппарате АО-1 с помощью ионообменных мембран и . Параметры ионообмена аналогичны параметрам, приведенным

в примере 1, Потери цитохрома С на этой стадии составл ют 12%. Общий выход цитохрома С по предлагаемой

,96

вьвделени  44%,

ОКИСА Пример 3.

Подготовку сырь .

экстракцию и удаление балластных белков провод т по методике, описанной в примере 1. В качестве сорбента используют сульфокатионит, полученный в результате полимеризации дивинилбензола , 100/100 в количест:ве 10,0±0,1 г (в пересчете на сухое вещество). В качестве элюента используют ацетатный буфер с рН 5,8. Параметры 2-кратного ионообмена на данной смоле аналогичны параметрам, описанным в примерах 1 и 2. Выход цитохрома С равен 55%. Электродиализ провод т при параметрах, описанных в примерах , 1 и 2. Выход на этой стадии 85%. Общий выход цитохрома С по предg 550

лагаемой схеме 47%,

-Ic 2 во

ОКИСЛ

Пример 4. Подготовку сырь , экстракцию и удаление балластных белков провод т по методике, описанной в примере 1. В качестве сорбента используют сульфокатионит КУ-23 15/100.Параметры сорбции и десорбции аналогичны примерам 1,2,3. В качестве элюента используют ацетатный буфер с рН 5,8. Катионит КУ-23 15/100 примен ют в

П-, Na- и формах. Ионообмен провод т двухкратно. Наибольший выход цитохрома С (21%) получен при использовании NHx- формы. Услови  электродиализа и выход цитохрома С аналогичны описанным в примере 1 и 2.

Общий выход гемопротеида с использованиеи данного катионита 17%,

550

Е Восст

- П 5

280 -°0Е;

очисд

Claims (2)

1. Формула изобретени 

   1 . Способ выделени  цитохрома С из сердец крупного рогатого скота путем , экстракции последних трихлоруксусной кислотой, отделени  балластных белков , последующей деминерализации и лиофильной сушки, о т л и ч аю щ и и с   тем, что, с целью увеличени  выхода и упрощени  процесса, экстракт, полученный после отделени  балластных белков, обрабатывают макропористым сульфокатионитом, содержащим дивинилбензол в пределах 15-100%, с последующим элюированием водным раствором хлористого натри  или ацетатным буфером при рН 5,8 и деминерализацией полученного раствора электролизом с использованием ионообменных мембран.

   76546128
2. 2.Способ поп.1,отлича ю-осуществл ют в течение 4-6 ч при щ и и с   тем, что сорбцию с помо-плотности тока 1-2 А/дм.

   щью макропористого сульфокатионита Источники информации, прин тые во

   провод т двухкратно, .внимание при экспертизе

   3,Способ поп.1|Отличаю- 1. Авторское свидетельство СССР ад и и с   тем, что электродиалиэ№ 351546, кл. А 61 К 35/34, 1Г71.