CN114920828B - 一种制备细胞色素c的方法 - Google Patents
一种制备细胞色素c的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114920828B CN114920828B CN202210688842.5A CN202210688842A CN114920828B CN 114920828 B CN114920828 B CN 114920828B CN 202210688842 A CN202210688842 A CN 202210688842A CN 114920828 B CN114920828 B CN 114920828B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cytochrome
- buffer solution
- cation exchange
- filtering
- solution
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108010052832 Cytochromes Proteins 0.000 title claims abstract description 72
- 102000018832 Cytochromes Human genes 0.000 title claims abstract description 72
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 51
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims abstract description 22
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 claims abstract description 15
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims abstract description 10
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims abstract description 10
- 239000000945 filler Substances 0.000 claims abstract description 6
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 claims abstract description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 32
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 29
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 27
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 24
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 23
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 19
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 16
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 claims description 13
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 13
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 13
- 239000012557 regeneration buffer Substances 0.000 claims description 11
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 claims description 11
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 9
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 9
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 9
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 9
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 7
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 claims description 7
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims description 7
- 239000003480 eluent Substances 0.000 claims description 6
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims description 6
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 6
- 238000011068 loading method Methods 0.000 claims description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 5
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 claims description 4
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 4
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims description 4
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 claims description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 claims description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 claims 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 abstract description 16
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 10
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 abstract description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 8
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 4
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 4
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- WDIHJSXYQDMJHN-UHFFFAOYSA-L barium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ba+2] WDIHJSXYQDMJHN-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 229910001626 barium chloride Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 3
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 3
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 3
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 3
- 206010002660 Anoxia Diseases 0.000 description 2
- 241000976983 Anoxia Species 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 230000007953 anoxia Effects 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000012797 qualification Methods 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 208000007333 Brain Concussion Diseases 0.000 description 1
- 208000001408 Carbon monoxide poisoning Diseases 0.000 description 1
- 206010008190 Cerebrovascular accident Diseases 0.000 description 1
- 102100025287 Cytochrome b Human genes 0.000 description 1
- 102000000634 Cytochrome c oxidase subunit IV Human genes 0.000 description 1
- 108050008072 Cytochrome c oxidase subunit IV Proteins 0.000 description 1
- 108010075028 Cytochromes b Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 208000000059 Dyspnea Diseases 0.000 description 1
- 206010013975 Dyspnoeas Diseases 0.000 description 1
- 108091006149 Electron carriers Proteins 0.000 description 1
- 208000019693 Lung disease Diseases 0.000 description 1
- 206010028923 Neonatal asphyxia Diseases 0.000 description 1
- 208000005374 Poisoning Diseases 0.000 description 1
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 1
- 206010056697 Tissue anoxia Diseases 0.000 description 1
- JQRLYSGCPHSLJI-UHFFFAOYSA-N [Fe].N1C(C=C2N=C(C=C3NC(=C4)C=C3)C=C2)=CC=C1C=C1C=CC4=N1 Chemical group [Fe].N1C(C=C2N=C(C=C3NC(=C4)C=C3)C=C2)=CC=C1C=C1C=CC4=N1 JQRLYSGCPHSLJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000009098 adjuvant therapy Methods 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 208000026106 cerebrovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 208000029039 cyanide poisoning Diseases 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 150000003278 haem Chemical class 0.000 description 1
- 208000019622 heart disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000147 hypnotic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 1
- 210000001700 mitochondrial membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000008811 mitochondrial respiratory chain Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000002107 myocardial effect Effects 0.000 description 1
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 231100000572 poisoning Toxicity 0.000 description 1
- 230000000607 poisoning effect Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 238000000870 ultraviolet spectroscopy Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/795—Porphyrin- or corrin-ring-containing peptides
- C07K14/80—Cytochromes
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明提供了一种制备细胞色素C的方法，属于制药领域。所述方法包括以下步骤：(1)取猪心，搅碎，提取，过滤，得到细胞色素C提取液；(2)将细胞色素C提取液经阳离子交换层析法纯化，收集洗脱液；其中，阳离子交换层析法采用的填料为SP‑琼脂糖凝胶FF树脂。利用本发明的方法制得的细胞色素C具有高纯度和高生物活性，其中的铁含量、菌内毒素含量均符合药典标准。本发明制备细胞色素C的方法工艺简单、条件温和，适合工业化应用。
Description
技术领域
本发明属于制药领域，具体涉及一种制备细胞色素C的方法。
背景技术
细胞色素C又被称为血红素，是一种含铁卟啉基团的蛋白质，在线粒体呼吸链上位于细胞色素b和细胞色素aa3之间。细胞色素C广泛存在于动物的需氧组织中，集中分布于动物心肌细胞质内的线粒体膜的外表面。它在生物氧化过程中，是一个非常重要的电子传递体，可加速酶促作用的进行。细胞色素C溶液可用于各种组织缺氧急救的辅助治疗，如一氧化碳中毒、催眠药中毒、氰化物中毒、新生儿窒息、严重休克期缺氧、脑血管意外、脑震荡后遗症、麻醉及肺部疾病引起的呼吸困难和各种心脏疾患引起的心肌缺氧的治疗。尤其在病情恶化抢救时，静脉注射细胞色素C有较好的效果。
细胞色素C易溶于水，对热、干燥、酸比较稳定，细胞色素C与线粒体内膜结合较松，较易提取。肖云(武汉职业技术学院学报，2015年，第14卷，第1期)公开了以猪心为原料提取细胞色素C的方法，该文献研究了不同的料液比、提取温度、pH、提取时间对提取效果的影响，结果表明最佳提取条件为：料液比为1:2，温度为30℃，pH为4.0条件下，提取2h，在此条件下提取率可达2.98％。但是，利用该方法所制备的细胞色素C纯度不高，达不到细胞色素C医药级的要求。
申请号为CN109694408A的中国专利申请公开了一种细胞色素C的离子交换纯化方法，包括以下工艺步骤：A、将大孔弱酸阳离子交换树脂填装于离子交换柱内，用酒精洗至流出液于水中不产生白色浑浊；用去离子水洗净层析柱中大孔弱酸阳离子交换树脂内的酒精；B、采用1N HCl 400ml、1NNaOH 400ml交替对大孔弱酸阳离子交换树脂进行转型处理；用去离子水将大孔弱酸阳离子交换树脂洗至中性，备用；C、以5-10ml/min的流速使细胞色素C提取液通过树脂交换柱；待细胞色素C提取液全部通过去离子交换柱后，用去离子水洗去层析柱内残留的细胞色素C提取液；D、用1N NaOH洗脱树脂吸附的细胞色素C；收集流出液并浓缩即得精制细胞色素C产品。但是，该方法存在以下问题：(1)细胞色素C提取液含有大量的细菌内毒素，该方法高效地去除细菌内毒素，所得细胞色素C产品中的细菌内毒素不符合药典标准(即每1mg细胞色素C中含内毒素的量应小于5.0EU)；(2)该方法所得细胞色素C产品的纯度较低，有待进一步提高。
研究出一种制备具有高纯度和低细菌内毒素含量的细胞素C成品具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种制备具有高纯度和低细菌内毒素含量的细胞色素C的方法。
本发明提供了一种制备细胞色素C的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)取猪心，搅碎，提取，过滤，得到细胞色素C提取液；
(2)将细胞色素C提取液经阳离子交换层析法纯化，收集洗脱液；
其中，阳离子交换层析法采用的填料为SP-琼脂糖凝胶FF树脂。
进一步地，步骤(1)中，所述提取的方式为：加水，搅拌均匀，加酸调节pH至3.5-4.3，于10-20℃下提取1-3小时，调节pH至5.7-6.5。
进一步地，步骤(1)中，所述水与猪心的体积重量比为2：1ml/mg；所述加酸调节pH至3.8-4.0，所述提取的温度为15-20℃，时间为2小时；所述加碱调节pH至6.0-6.2。
进一步地，步骤(1)中，所述过滤的方式为：先用60～80目尼龙网过滤，然后将滤液经板框过滤。
进一步地，步骤(2)中，所述阳离子交换层析法中，上样样品的制备方法为：将细胞色素C提取液调节pH至6.0-8.0，加水稀释至电导率为2-8ms/cm，得到上样样品。
进一步地，所述上样样品的pH为7.0，电导率为6ms/cm。
进一步地，步骤(2)中，所述阳离子交换层析法包括以下步骤：依次用平衡缓冲液、洗杂缓冲液、再生缓冲液冲洗阳离子交换层析柱，然后上样，先用平衡缓冲液冲洗，再用洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱液；
其中，所述平衡缓冲液为20-50mM磷酸缓冲液，pH为6.0-8.0；
洗杂缓冲液为含0.8-1.2M NaCl的20-50mM磷酸缓冲液，pH为6.0-8.0；
再生缓冲液为0.3-0.7M NaOH水溶液；
洗脱缓冲液为含0.3-0.7M NaCl的20-50mM磷酸缓冲液，pH为6.0-8.0。
进一步地，所述平衡缓冲液为50mM磷酸缓冲液，pH为6.8-7.0；
洗杂缓冲液为含1M NaCl的50mM磷酸缓冲液，pH为6.8-7.0；
再生缓冲液为0.5M NaOH水溶液；
洗脱缓冲液为含0.5M NaCl的50mM磷酸缓冲液，pH为6.8-7.0。
进一步地，所述方法还包括以下步骤：
(3)将洗脱液通过超滤膜浓缩，然后于水中透析；
(4)将透析后的液体用过滤除菌，得到细胞色素C成品。
进一步地，步骤(3)中，所述超滤膜的截留分子量为5-15kd，优选为10kd。
本发明提供了一种制备细胞色素C的新方法，利用本发明的方法制得的细胞色素C具有高纯度和高生物活性，其中的铁含量、细菌内毒素含量均符合药典标准。
与现有技术中制备细胞色素C的方法相比，本发明的方法以SP-琼脂糖凝胶FF树脂为填料，具有离子交换容量高、非特异性吸附少、制得的产品纯度和生物活性高等优点，而且，本发明的方法去除细菌内毒素效果好，制得的细胞色素C成品内毒素一次合格率100％。
本发明制备细胞色素C的方法工艺简单、条件温和，适合工业化应用。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为SP-Berpharose FF树脂纯化图谱。
图2为电泳测试结果。点样顺序：第1泳道：SP FF上样液；第2泳道：SP FF-FT1；第3泳道：SP FF-FT3；第4泳道：SP FF-E2(0.5M NaCl洗脱峰)；第5泳道：SP FF-FT7；第6泳道：SPFF-E2(0.5M NaCl洗脱峰)；第7泳道：SP FF-E4(1M NaCl洗峰)；第8泳道：SP FF-E6(0.5MNaOH洗峰)；第9泳道：细胞色素C标品(13ug)；第10泳道：Marker。
具体实施方式
本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。
实施例1：细胞色素C的制备与纯化方法
1、前处理：
称取猪心，脱包放置解冻，6mm筛板搅碎，加入2倍(水：猪心＝2:1；V/m)的水，搅拌均匀。
2、提取：
用稀硫酸(其中浓硫酸与水的体积比为1:8)调pH至3.8-4.0，保持温度为15-20℃，以恒定pH提取两个小时，然后用氨水(其中浓氨水与水的体积比为1:7)调节pH至6.0-6.2，用60～80目尼龙网过滤，滤液用板框过滤澄清。
3、阳离子交换层析：
取步骤2板框过滤后所得的澄清液，0.45um膜过滤，调pH至7.0，加水稀释至电导率为6ms/cm，所得液体作为上样样品。
依次用表1所示平衡缓冲液、洗杂缓冲液、再生缓冲液冲洗阳离子交换层析柱，然后上样，先用平衡缓冲液冲洗，再用洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱液。
表1.柱层析条件
注：PB表示磷酸缓冲液。
4、超滤：
采用10kd超滤膜浓缩洗脱液，料液温度控制在10℃以下，再加入纯化水透析至无硫酸根离子(取料液向其中滴加氯化钡溶液后料液不变浑浊即可)。
5、除菌过滤：
采用0.22um滤膜过滤除菌即得细胞色素C成品。
实施例2、细胞色素C的制备与纯化方法
1、前处理：
称取猪心，脱包放置解冻，6mm筛板搅碎，加入2倍(水：猪心＝2:1；V/m)的水，搅拌均匀。
2、提取：
用稀硫酸(其中浓硫酸与水的体积比为1:8)调pH至3.8-4.0，保持温度为15-20℃，以恒定pH提取两个小时，然后用氨水(其中浓氨水与水的体积比为1:7)调节pH至6.0-6.2，用60～80目尼龙网过滤，滤液用板框过滤澄清。
3、阳离子交换层析：
取步骤2板框过滤后所得的澄清液，0.45um膜过滤，调pH至7.0，加水稀释至电导率为6ms/cm，所得液体作为上样样品。
依次用表2所示平衡缓冲液、洗杂缓冲液、再生缓冲液冲洗阳离子交换层析柱，然后上样，先用平衡缓冲液冲洗，再用洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱液。
表2.柱层析条件
| 介质名称 | SP-Berpharose FF树脂 |
| 层析设备 | AKTA Explorer 100 |
| 层析柱 | Ezfast 1ml 1根 |
| 平衡缓冲液 | 20mM PB，pH7.0 |
| 洗脱缓冲液 | 0.5M NaCl，20mM PB，pH7.0 |
| 洗杂缓冲液 | 平衡缓冲液+1M NaCl |
| 再生缓冲液 | 0.5M NaOH |
| 上样体积 | 60ml |
| 流速 | 1ml/min |
| 洗脱方式 | 洗脱缓冲液一步洗脱 |
4、超滤：
采用10kd超滤膜浓缩洗脱液，料液温度控制在10℃以下，再加入纯化水透析至无硫酸根离子(取料液向其中滴加氯化钡溶液后料液不变浑浊即可)。
5、除菌过滤：
采用0.22um滤膜过滤除菌即得细胞色素C成品。
以下通过实验例证明本发明的有益效果。
实验例1：细胞色素C成品的质量检测
1、SP-Berpharose FF树脂纯化图谱
在实施例1上样、洗涤及洗脱过程中，采用紫外－可见分光光度法连续监测层析柱流出液在280nm和549nm处的吸收度值。
结果如图1所示，可以看出，利用本发明实施例1的方法纯化细胞色素C提取液分离度良好。
2、电泳结果(SDS-PAGE)
收集实施例1所得细胞色素C成品用于电泳测试分析，采用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法进行纯度鉴定。
结果如图2所示，可看出，利用本发明实施例1的方法纯化细胞色素C提取液，采用0.5M NaCl溶液(图2电泳条带4及条带6)洗脱均得单一条带，分子量约为13Kd，与细胞色素C标准品对应条带一致，分类纯化效果良好。细胞色素C洗脱回收率99％以上。
细胞色素C洗脱回收率计算方法为：洗脱液细胞色素C总量(mg)/上样液细胞色素C总量(mg)×100％。
3、其它质量指标
测试样品：实施例1所得细胞色素C成品。
测试方法：参照《中国药典》2020版细胞色素C溶液测试方法。
实施例1所得细胞色素C成品的测试结果如表3所示。
表3.其它质量指标
从表3可以看出，利用本发明的方法去除细菌内毒素的效果好，制得的细胞色素C成品内毒素一次合格率100％；同时，本发明的方法所得细胞色素C成品的纯度高达99.5％。
实验例2、细胞色素C的制备与纯化方法筛选实验
按照实施例1步骤1和步骤2的方法进行前处理和提取，并且按照实施例1步骤3的方法制备得到上样样品。
依次用表4所示平衡缓冲液、洗杂缓冲液、再生缓冲液冲洗阳离子交换层析柱，然后上样，先用平衡缓冲液冲洗，再用洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱液。
表4.柱层析条件
| 介质名称 | CM-32阳离子交换树脂 |
| 层析设备 | AKTA Explorer 100 |
| 层析柱 | Ezfast 1ml 1根 |
| 平衡缓冲液 | 20mM PB，pH7.0 |
| 洗脱缓冲液 | 0.5M NaCl，20mM PB，pH7.0 |
| 洗杂缓冲液 | 平衡缓冲液+1M NaCl |
| 再生缓冲液 | 0.5M NaOH |
| 上样体积 | 60ml |
| 流速 | 1ml/min |
| 洗脱方式 | 洗脱缓冲液一步洗脱 |
采用10kd超滤膜浓缩洗脱液，料液温度控制在10℃以下，再加入纯化水透析至无硫酸根离子(取料液向其中滴加氯化钡溶液后料液不变浑浊即可)。采用0.22um滤膜过滤除菌即得细胞色素C成品。
按照实验例1的方法，检测上述细胞色素C成品的质量指标，结果如表5所示。
表5.其它质量指标
可以看出，此实验例以CM-32阳离子交换树脂作为填料的提纯方法去除细菌内毒素的效果较差，制得的细胞色素C成品中的细菌内毒素不符合药典标准；除此之外，该方法所得细胞色素C成品中的铁含量也不符合药典标准。
与此实验例的方法相比，本发明实施例1以SP-Berpharose FF树脂作为填料的提纯方法所得细胞色素C成品的铁含量、内毒素含量、纯度指标均更优。
综上，本发明提供了一种制备细胞色素C的方法。利用本发明的方法制得的细胞色素C具有高纯度和高生物活性，其中的铁含量、菌内毒素含量均符合药典标准。本发明制备细胞色素C的方法工艺简单、条件温和，适合工业化应用。
Claims (6)
1.一种制备细胞色素C的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：
（1）取猪心，搅碎，提取，过滤，得到细胞色素C提取液；
（2）将细胞色素C提取液经阳离子交换层析法纯化，收集洗脱液；
（3）将洗脱液通过超滤膜浓缩，然后于水中透析；所述超滤膜的截留分子量为5-15kd；
（4）将透析后的液体用过滤除菌，得到细胞色素C成品；
其中，阳离子交换层析法采用的填料为SP-琼脂糖凝胶FF树脂；
步骤（2）所述阳离子交换层析法中，上样样品的制备方法为：将细胞色素C提取液调节pH至6.0-8.0，加水稀释至电导率为2-8 ms/cm，得到上样样品；所述阳离子交换层析法包括以下步骤：依次用平衡缓冲液、洗杂缓冲液、再生缓冲液冲洗阳离子交换层析柱，然后上样，先用平衡缓冲液冲洗，再用洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱液；其中，所述平衡缓冲液为20-50mM磷酸缓冲液，pH为6.0-8.0；洗杂缓冲液为含0.8-1.2M NaCl的20-50mM 磷酸缓冲液，pH为6.0-8.0；再生缓冲液为0.3-0.7M NaOH水溶液；洗脱缓冲液为含0.3-0.7M NaCl的20-50mM磷酸缓冲液，pH为6.0-8.0。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，所述提取的方式为：加水，搅拌均匀，加酸调节pH至3.5-4.3，于10-20℃下提取1-3小时，调节pH至5.7-6.5。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，所述水与猪心的体积重量比为2：1 ml/mg；所述加酸调节pH至3.8-4.0，所述提取的温度为15-20℃，时间为2小时；所述调节pH至6.0-6.2。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，所述过滤的方式为：先用60~80目尼龙网过滤，然后将滤液经板框过滤。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述上样样品的pH为7.0，电导率为6 ms/cm。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述平衡缓冲液为50mM磷酸缓冲液，pH为6.8-7.0；
洗杂缓冲液为含1M NaCl的50mM 磷酸缓冲液，pH为 6.8-7.0；
再生缓冲液为0.5M NaOH水溶液；
洗脱缓冲液为含0.5M NaCl的50mM 磷酸缓冲液，pH为6.8-7.0。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210688842.5A CN114920828B (zh) | 2022-06-17 | 2022-06-17 | 一种制备细胞色素c的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210688842.5A CN114920828B (zh) | 2022-06-17 | 2022-06-17 | 一种制备细胞色素c的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114920828A CN114920828A (zh) | 2022-08-19 |
| CN114920828B true CN114920828B (zh) | 2024-02-02 |
Family
ID=82814770
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210688842.5A Active CN114920828B (zh) | 2022-06-17 | 2022-06-17 | 一种制备细胞色素c的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114920828B (zh) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU654612A1 (ru) * | 1977-01-10 | 1979-03-30 | Московский технологический институт мясной и молочной промышленности | Способ выделени цитохрома |
| CN102206265A (zh) * | 2011-04-15 | 2011-10-05 | 安徽宏业药业有限公司 | 一种细胞色素c溶液的生产工艺 |
| CN106977597A (zh) * | 2017-05-24 | 2017-07-25 | 四川德博尔制药有限公司 | 一种细胞色素c及其精制方法 |
| CN107118272A (zh) * | 2017-05-24 | 2017-09-01 | 四川德博尔制药有限公司 | 一种细胞色素c及其内毒素的去除方法 |
| CN109694408A (zh) * | 2017-10-20 | 2019-04-30 | 中蓝晨光化工研究设计院有限公司 | 一种细胞色素c的离子交换纯化方法 |
-
2022
- 2022-06-17 CN CN202210688842.5A patent/CN114920828B/zh active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU654612A1 (ru) * | 1977-01-10 | 1979-03-30 | Московский технологический институт мясной и молочной промышленности | Способ выделени цитохрома |
| CN102206265A (zh) * | 2011-04-15 | 2011-10-05 | 安徽宏业药业有限公司 | 一种细胞色素c溶液的生产工艺 |
| CN106977597A (zh) * | 2017-05-24 | 2017-07-25 | 四川德博尔制药有限公司 | 一种细胞色素c及其精制方法 |
| CN107118272A (zh) * | 2017-05-24 | 2017-09-01 | 四川德博尔制药有限公司 | 一种细胞色素c及其内毒素的去除方法 |
| CN109694408A (zh) * | 2017-10-20 | 2019-04-30 | 中蓝晨光化工研究设计院有限公司 | 一种细胞色素c的离子交换纯化方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| A tool for selective inline quantification of co-eluting proteins in chromatography using spectral analysis and partial least squares regression;Nina Brestric等;Biotechnology and Bioengineering;第111卷(第7期);1365-1373 * |
| SP-sephadex C25离子交换层析纯化细胞色素C的工艺研究;吴世斌!221002, 李显林!221002, 乔德水!221002;中国生化药物杂志(04);39-40 * |
| 人源细胞色素C在大肠杆菌中的重组表达和分离纯化;蔡华伟等;生物医学工程学杂志(第3期);第620页引言和第621页方法2.2.2-2.2.4 * |
| 重组人脑利钠肽制备中内毒素的去除工艺;朱重悦等;科学技术与工程;第18卷(第10期);第190页左栏第1段 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114920828A (zh) | 2022-08-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FR2461500A1 (fr) | Procede de production d'une substance capable de stimuler la proliferation et la differenciation des cellules souches granulopoietiques humaines | |
| Lauceri et al. | Purification of phycocyanin from Arthrospira platensis by hydrophobic interaction membrane chromatography | |
| DE3039566A1 (de) | Verfahren zur reinigung von interferon | |
| DE2640387C3 (de) | Gewebespezifisches Protein und Verfahren zu dessen Herstellung | |
| JPS58201794A (ja) | ヒトインターフェロンβの濃縮精製法 | |
| JP5908496B2 (ja) | トランスジェニックイネの子実からヒト血清アルブミンを抽出する方法 | |
| JPH0533239B2 (zh) | ||
| US7303773B2 (en) | Process for enriching extracts of natural theanine | |
| CN114920828B (zh) | 一种制备细胞色素c的方法 | |
| US20190367582A1 (en) | Novel method for efficient purification of human serum albumin | |
| CN112111004B (zh) | 一种兔免疫球蛋白的生产工艺 | |
| CN109929027B (zh) | 采用线性洗脱步骤的重组融合蛋白纯化方法 | |
| Barteling | A simple method for the preparation of agarose | |
| DE2616984C3 (de) | Verfahren zur Isolierung und Reinigung eines plazentenspezifischen Glycoproteins | |
| CN112625110A (zh) | 一种牛乳中β-酪蛋白的纯化制备方法 | |
| CN112979785B (zh) | 一种制备高纯度乳铁蛋白的方法 | |
| EP1132129A1 (de) | Verfahren zum Herstellen eines Adsorbens zum Absenken der Konzentration von Fibrinogen und/oder Fibrin, Adsorbens und Verwendung des Adsorbens zur Herstellung eines Adsorbers | |
| CN109107536A (zh) | 一种以卞胺为配基的高效疏水相互作用色谱介质及其制备方法与应用 | |
| US20230079633A1 (en) | Optimized method for bevacizumab purification | |
| CN107033236A (zh) | 一种从酵母发酵液中分离人血白蛋白的混合模式层析方法 | |
| CN1250567C (zh) | 钙离子结合蛋白的提纯方法 | |
| DE2014957C2 (de) | Verfahren zur Reinigung von Proteinen des Blutserums oder -plasmas | |
| US3634196A (en) | Process for the separation of pyrogens from crude preparations of l-asparaginase | |
| CN110951813A (zh) | 一种金枪鱼蛋白肽提取方法 | |
| CN110172094B (zh) | 一种从口虾蛄中提取高纯度金属硫蛋白的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |