CN109107536A - 一种以卞胺为配基的高效疏水相互作用色谱介质及其制备方法与应用 - Google Patents

一种以卞胺为配基的高效疏水相互作用色谱介质及其制备方法与应用 Download PDF

Info

Publication number
CN109107536A
CN109107536A CN201810978259.1A CN201810978259A CN109107536A CN 109107536 A CN109107536 A CN 109107536A CN 201810978259 A CN201810978259 A CN 201810978259A CN 109107536 A CN109107536 A CN 109107536A
Authority
CN
China
Prior art keywords
hydrophobic interaction
silica gel
preparation
interaction chromatograph
efficient hydrophobic
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201810978259.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN109107536B (zh
Inventor
王骊丽
王志颖
李维敏
任怡
王思尧
张念喆
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Northwest University
Original Assignee
Northwest University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Northwest University filed Critical Northwest University
Priority to CN201810978259.1A priority Critical patent/CN109107536B/zh
Publication of CN109107536A publication Critical patent/CN109107536A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109107536B publication Critical patent/CN109107536B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/22—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising organic material
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/281—Sorbents specially adapted for preparative, analytical or investigative chromatography
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/281—Sorbents specially adapted for preparative, analytical or investigative chromatography
    • B01J20/286—Phases chemically bonded to a substrate, e.g. to silica or to polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/76—Albumins
    • C07K14/77—Ovalbumin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/795—Porphyrin- or corrin-ring-containing peptides
    • C07K14/80—Cytochromes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2220/00—Aspects relating to sorbent materials
    • B01J2220/40—Aspects relating to the composition of sorbent or filter aid materials
    • B01J2220/48—Sorbents characterised by the starting material used for their preparation
    • B01J2220/4806—Sorbents characterised by the starting material used for their preparation the starting material being of inorganic character
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2220/00—Aspects relating to sorbent materials
    • B01J2220/40—Aspects relating to the composition of sorbent or filter aid materials
    • B01J2220/48—Sorbents characterised by the starting material used for their preparation
    • B01J2220/4812—Sorbents characterised by the starting material used for their preparation the starting material being of organic character

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
  • Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)

Abstract

本发明公开一种以卞胺为配基的高效疏水相互作用色谱介质，其结构式为：；本发明还公开所述高效疏水相互作用色谱介质的制备方法，包括以下步骤：（1）硅胶活化；（2）制备环氧化硅胶；（3）环氧开环制备高效疏水相互作用色谱介质；同时，本发明还公开将所述高效疏水相互作用色谱介质应用于高效液相色谱中来分离制备天然蛋白卵清蛋白和细胞色素C的应用，回收简单，收回率高，制备的卵清蛋白、细胞色素C纯度高。

Description

一种以卞胺为配基的高效疏水相互作用色谱介质及其制备方 法与应用
技术领域
本发明属于液相色谱技术领域，具体涉及一种以卞胺为配基的高效疏水相互作用色谱介质及其制备方法，和其用于分离天然蛋白的应用。
背景技术
天然蛋白是在自然界中存在的，不经过人工任何修饰或加工直接从天然材料中可以获得的一类蛋白。其生物安全性高，广泛地用于医药、食品等领域。例如，卵清蛋白是一种天然糖蛋白，含有386个氨基酸，相对分子质量为45KDa，其等电点为4.5。卵清蛋白无论从分子结构还是生物学功能上都与人血白蛋白非常类似，是人血白蛋白的潜在替代品。具有广泛的应用，可以经过酶水解加工成低分子活性肽具有强抗氧化活性、血管舒张活性等活性；与三价铁离子结合可作为天然载体用于开发成复合补铁剂。
此外，细胞色素C（Cyt-c）也是从天然材料中提取的一种天然蛋白，临床上用于各种组织缺氧急救的辅助治疗，如一氧化碳中毒、催眠药中毒、氰化物中毒、新生儿窒息、严重休克期缺氧、脑血管意外、脑震荡后遗症、麻醉及肺部疾病引起的呼吸困难和各种心脏疾患引起的心肌缺氧的治疗。与卵清白蛋白不同，分子量较小约为13 KDa，等电点10.6左右。肽链中含有19个赖氨酸残基。鸡蛋清和各类动物心脏分别富含卵清蛋白和细胞色素CC，所以其来源很方便。
目前，卵清蛋白和细胞色素C的分离主要采用多步盐析沉淀分离-离子交换色谱纯化的方法。例如，将鸡蛋清和猪心处理的样品用不同的盐（硫酸铵、硫酸钠和氯化钠等）粗分离，然后再结合离子交换层析法纯化。这类方法的缺点是前者产品含盐量高，需要多次脱盐和离心等操作才能获得较高纯度的卵清白蛋白，而后者增加了纯化的步骤。有报道利用硫酸溶液提取、沸石捕集、硫酸铵分级、三氯乙酸沉淀以及离子交换色谱纯化等五大步骤提取细胞色素C，不仅整个过程繁琐，而且提取条件较剧烈，耗时长，收率也不高。
近年来，通过化学改性，使用具有两种以上的官能团的配基分子合成MMC（混合模式色谱）固定相，并将其用于蛋白质分离的研究越来越受到了关注。
发明内容
针对现有技术的缺陷，本发明提供一种以卞胺为配基的高效疏水相互作用色谱（HPHIC）介质及其制备方法，同时提供将所述介质用于天然蛋白分离的应用，分离工艺简单，分离回收率高，分离回收得到的蛋白质纯度高。
一种以卞胺为配基的高效疏水相互作用色谱介质，所述高效疏水相互作用色谱介质的结构式如下：
。
上述以卞胺为配基的高效疏水相互作用色谱介质的制备方法，包括以下步骤：
（1）硅胶活化；
（2）制备环氧化硅胶：按照1g：50mL将步骤（1）得到的活化硅胶加入无水甲苯中，超声处理3-5min，然后在搅拌条件下向其中缓慢加入硅烷偶联剂，所述活化硅胶和硅烷偶联剂的质量体积比为1g:1mL~1g:2 mL，升温至90-120 ℃，回流并搅拌9-12h，然后用甲醇、水、甲醇洗涤抽滤，重复洗涤抽滤5次，真空干燥，即得到环氧硅胶；
（3）环氧开环制备高效疏水相互作用色谱介质：按照体积比1:200，将苄胺加入干燥的1，4-二氧六环溶液中，超声处理3-5min，向其中加入环氧硅胶，所述环氧化硅胶和卞胺的质量比为1:2~1:4，超声处理，然后在80 ℃下回流并搅拌7h，然后用甲醇、水、甲醇洗涤抽滤，重复洗涤抽滤5次，真空干燥，即可。
优选地，步骤（1）所述硅胶活化的步骤具体如下：按照质量体积比1g:10mL ~1g:20mL将未活化的硅胶加入质量浓度为20%的盐酸溶液中，在120℃下回流并搅拌2-6h，用蒸馏水洗涤抽滤至中性，在100~150℃真空干燥箱中干燥12~24h，即得到活化硅胶。
优选地，所述未活化的硅胶孔径为80~200Å、粒径为5~10μm的球状硅胶。
优选地，步骤（2）所述硅烷偶联剂为γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷。
优选地，步骤（2）和步骤（3）中真空干燥的条件均为：在60℃下真空干燥12h。
上述以卞胺为配基的高效疏水相互作用色谱介质的应用，所述应用为将所述高效疏水相互作用色谱介质应用于高效液相色谱中来分离制备天然蛋白。
优选地，所述分离制备天然蛋白具体如下：
（1）将含有天然蛋白的样品进行预处理；
（2）将所述高效疏水相互作用色谱介质装填在高效液相色谱仪的色谱柱中，将步骤（1）处理得到的样品直接进样100μL，进入色谱柱，用流动相A冲洗色谱柱至基线平稳，然后采用流动相B线性从0-100%线性梯度洗脱20-30min，在达到100%时延长洗脱5-10min，流动相A和流动相B的流速均为1.0-2.0 mL/min，检测波长为280nm，收集色谱馏分，经过SDS-15%PAGE分析，即得到天然蛋白；
所述流动相A为2.0~3.0 mol/L (NH4)2SO4和10.0 ~50.0 mmol/L KH2PO4的混合液，且pH为7.5；所述流动相B为10.0 ~50.0 mmol/L KH2PO4，且pH为7.5。
优选地，所述样品为鸡蛋清，分离制备的天然蛋白为卵清蛋白，从鸡蛋清中分离制备卵清蛋白，步骤（1）具体如下：在鸡蛋清中加入5倍体积的20.0 mmol/L、pH=6.5的KH2PO4缓冲溶液，搅拌均匀，在4℃、8000rpm的条件下离心处理20 min，将离心得到的上清液用0.45μm滤膜过滤后，所得滤液为预处理得到的样品，保存在4℃下，备用。
优选地，所述样品为猪心，分离制备的天然蛋白为细胞色素C，从猪心中分离制备细胞色素C，步骤（1）具体如下：将猪心清洗，去除表皮的脂肪和肌腱后，在绞肉机中绞碎至直径小于1cm的颗粒，按照1g：1mL加水稀释，调节pH为4.0，然后搅拌2 h，再调节pH为7.0，过滤，将滤液在4℃下静置12h，然后在4 ℃、8000 rpm条件下离心20 min，留取上清液，将上清液用0.45 μm的滤膜过滤得到的滤液即为预处理得到的样品，保存在4℃下，备用。
本发明中所述SDS-15%PAGE分析，是指现有技术的SDS-PAGE分析，其中，15%代表PAGE的浓度。
本发明的优点：
本发明以苄胺作为配基，制备的高效疏水相互作用色谱介质，该介质的分子结构中既含有较强的疏水作用基团（苯基），又含有弱的静电作用基团，能装填与色谱柱，用于高效液相色谱中天然蛋白质的分离回收，能分离鸡蛋清中的卵清蛋白、猪心中的细胞色素C，回收简单，收回率高，回收制备的卵清蛋白、细胞色素C纯度高。
附图说明
图1 实施例3制备的高效疏水相互作用色谱介质的X射线光电子能谱图（XPS图）；其中，横坐标为结合能（Binding Energy），纵坐标为相对强度（Counts）。
图2 在高效亲水相互作用色谱模式下对鸡蛋清样品的分离色谱图。
图3 鸡蛋清样品的SDS-15%PAGE分析；其中，条带1：鸡蛋清样品；条带2：图2中的馏分1，未知蛋白；条带3：图2中的馏分2混合蛋白；条带4：图2中的馏分3(OVA)，即为卵清蛋白。
图4 在高效亲水相互作用色谱模式下对猪心样品的分离色谱图。
图5 猪心样品的SDS-15%PAGE分析；其中，条带1：标准Cyt-C；条带2：猪心样品；条带3：图4中馏分1（Cyt-C）；条带4：图4中馏分2；条带5：图4中馏分3；条带：图4中馏分4。
具体实施方式
实施例1
一种以卞胺为配基的高效疏水相互作用色谱介质的制备方法，包括以下步骤：
（1）硅胶活化：按照质量体积比1g:15mL将未活化的硅胶加入质量浓度为20%的盐酸溶液中，在120℃下回流并搅拌2h，用蒸馏水洗涤抽滤至中性，在100℃真空干燥箱中干燥24h，即得到活化硅胶；其中，所述未活化的硅胶孔径为80~200Å、粒径为5~10μm的球状硅胶；
（2）制备环氧化硅胶：按照1g：50mL将步骤（1）得到的活化硅胶加入无水甲苯中，超声处理3min，使活化硅胶分散均匀，然后在搅拌条件下向其中缓慢加入硅烷偶联剂，所述活化硅胶和硅烷偶联剂的质量体积比为1g:1mL，升温至90℃，回流并搅拌10h，然后用甲醇、水、甲醇洗涤抽滤，重复洗涤抽滤5次，在60℃下真空干燥12h，即得到环氧硅胶；所述硅烷偶联剂为γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷；
（3）环氧开环制备高效疏水相互作用色谱介质：按照体积比1:200，将苄胺加入干燥的1，4-二氧六环溶液中，超声处理5min，向其中加入环氧硅胶，所述环氧化硅胶和卞胺的质量比为1:3，超声处理5min，然后在80 ℃下回流并搅拌7h，然后用甲醇、水、甲醇洗涤抽滤，重复洗涤抽滤5次，在60℃下真空干燥12h，即可，得到以卞胺为配基的高效疏水相互作用色谱介质。
实施例2
一种以卞胺为配基的高效疏水相互作用色谱介质的制备方法，包括以下步骤：
（1）硅胶活化：按照质量体积比1g:20mL将未活化的硅胶加入质量浓度为20%的盐酸溶液中，在120℃下回流并搅拌6h，用蒸馏水洗涤抽滤至中性，在150℃真空干燥箱中干燥12h，即得到活化硅胶；其中，所述未活化的硅胶孔径为80~200Å、粒径为5~10μm的球状硅胶；
（2）制备环氧化硅胶：按照1g：50mL，将步骤（1）得到的活化硅胶加入无水甲苯中，超声处理5min，使活化硅胶分散均匀，然后在搅拌条件下向其中缓慢加入硅烷偶联剂，所述活化硅胶和硅烷偶联剂的质量体积比为1g:2 mL，升温至120 ℃，回流并搅拌9h，然后用甲醇、水、甲醇洗涤抽滤，重复洗涤抽滤5次，在60℃下真空干燥12h，即得到环氧硅胶；所述硅烷偶联剂为γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷；
（3）环氧开环制备高效疏水相互作用色谱介质：按照体积比1:200，将苄胺加入干燥的1，4-二氧六环溶液中，超声处理超声处理3min，向其中加入环氧硅胶，所述环氧化硅胶和卞胺的质量比为1:4，超声处理3min，然后在80 ℃下回流并搅拌7h，然后用甲醇、水、甲醇洗涤抽滤，重复洗涤抽滤5次，在60℃下真空干燥12h，即可，得到以卞胺为配基的高效疏水相互作用色谱介质。
实施例3
一种以卞胺为配基的高效疏水相互作用色谱介质的制备方法，包括以下步骤：
（1）硅胶活化：按照质量体积比1g:10mL将未活化的硅胶加入质量浓度为20%的盐酸溶液中，在120℃下回流并搅拌5h，用蒸馏水洗涤抽滤至中性，在120℃真空干燥箱中干燥18h，即得到活化硅胶；其中，所述未活化的硅胶孔径为80~200Å、粒径为5~10μm的球状硅胶；
（2）制备环氧化硅胶：按照1g：50mL，将步骤（1）得到的活化硅胶加入无水甲苯中，超声处理4min，使活化硅胶分散均匀，然后在搅拌条件下向其中缓慢加入硅烷偶联剂，所述活化硅胶和硅烷偶联剂的质量体积比为1g:1mL，升温至110 ℃，回流并搅拌12h，然后用甲醇、水、甲醇洗涤抽滤，重复洗涤抽滤5次，在60℃下真空干燥12h，即得到环氧硅胶；所述硅烷偶联剂为γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷；
（3）环氧开环制备高效疏水相互作用色谱介质：按照体积比1:200，将苄胺加入干燥的1，4-二氧六环溶液中，超声处理4min，向其中加入环氧硅胶，所述环氧化硅胶和卞胺的质量比为1:2，超声处理4min，然后在80 ℃下回流并搅拌7h，然后用甲醇、水、甲醇洗涤抽滤，重复洗涤抽滤5次，在60℃下真空干燥12h，即可，得到以卞胺为配基的高效疏水相互作用色谱介质。
XPS检测
将实施例3制备的高效疏水相互作用色谱介质做XPS检测，结果见图1，通过图1可以看出：在309.8 eV附近出现了氮元素1s的谱峰，对应为卞胺中的氮元素；在531.1 eV、282.9eV、102.0eV附近分别出现了氧元素ls谱峰、碳元素1s谱峰、硅元素的2p谱峰，证明卞胺基团成功键合于硅胶基质上。
对实施例1、2制备得到物质做XPS检测，出峰位置与实施例3的相同，说明实施例1、2、3制备得到物质的结构式都为：
。
实施例4
从鸡蛋清中分离卵清蛋白的方法，具体如下：
（1）将鸡蛋清样品进行预处理：在鸡蛋清中加入5倍体积的20.0 mmol/L、pH=6.5的KH2PO4缓冲溶液，搅拌均匀，在4℃、8000rpm的条件下离心处理20 min，将离心得到的上清液用0.45μm滤膜过滤后，所得滤液为预处理得到的样品，保存在4℃下，备用；
（2）将实施例3制备得到的高效疏水相互作用色谱介质装填在高效液相色谱仪的色谱柱（100×4.6mm I.D.）中，装填技术采用现有技术，将步骤（1）处理得到的样品直接进样100μL，进入色谱柱，用流动相A冲洗色谱柱至基线平稳，然后采用流动相B线性从0-100%线性梯度洗脱30min，在达到100%时延长洗脱10min，流动相A和流动相B的流速均为1.0mL/min，检测波长为280nm，收集色谱馏分（见图2），经过SDS-15%PAGE分析（见图3），即得到卵清蛋白；
所述流动相A为3.0 mol/L (NH4)2SO4溶液和20mmol/L KH2PO4溶液的混合液，且pH为7.5；所述流动相B为20 mmol/L KH2PO4溶液，且pH为7.5。
在HPHIC模式下，使用卞胺固定相分离鸡蛋清样品，由图2可看出，经该固定相分离的鸡蛋清样品有3个色谱峰，并分别收集色谱馏分1、2、3，相应的记为馏分1、馏分2、馏分3，对其进行SDS-15%PAGE 分析，结果如图3。从电泳结果图3可以看出，条带4为馏分3，经对比是纯度为92.1％的卵清蛋白（OVA）；然后利用 Braford法测定馏分3中OVA 的含量，并计算其质量回收率为93.7％。
图2和图3显示了以卞胺为配基的高效疏水相互作用色谱介质对鸡蛋清中 OVA 有较好的分离效果。
实施例5
从猪心中分离制备细胞色素C的方法，具体如下：
（1）样品预处理：将猪心清洗，去除表皮的脂肪和肌腱后，在绞肉机中绞碎至直径小于1cm的颗粒，按照1g：1mL加水稀释，调节pH为4.0，然后搅拌2 h，再调节pH为7.0，过滤，将滤液在4℃下静置12h，然后在4 ℃、8000 rpm条件下离心20 min，留取上清液，将上清液用0.45 μm的滤膜过滤得到的滤液即为预处理得到的样品，保存在4℃下，备用；
（2）将实施例3制备得到的高效疏水相互作用色谱介质装填在高效液相色谱仪的色谱柱（100×4.6mm I.D.）中，装填技术采用现有技术，将步骤（1）处理得到的样品直接进样100μL，进入色谱柱，用流动相A冲洗色谱柱至基线平稳，然后采用流动相B线性从0-100%线性梯度洗脱30min，在达到100%时延长洗脱10min，流动相A和流动相B的流速均为1.0mL/min，检测波长为280nm，收集色谱馏分（见图4），经过SDS-15%PAGE分析（见图5），即得到细胞色素C（Cyt-c）；
所述流动相A为3.0 mol/L (NH4)2SO4溶液和20mmol/L KH2PO4溶液的混合液，且pH为7.5；所述流动相B为20 mmol/L KH2PO4溶液，且pH为7.5。
从图4中可看出，经该固定相分离纯化的猪心样品有4个色谱峰，分别为并收集色谱馏分1、2、3、4，对其进行SDS-15%PAGE 分析，结果如图5所示：条带1是标准细胞色素-C（简称Cyt-c）；条带2是猪心样品；条带3、4、5、6分别是色谱馏分1、2、3、4。经过与标准的Cyt-c电泳条带比较发现，馏分1是经过实施例5最终制备的纯化后的Cyt-c；馏分2、3、4都为未知的杂蛋白。通过Cs-930双波长扫描仪扫描可知，馏分1的Cyt-c 的纯度为96.4%。利用Braford法测定色谱峰1，即馏分1中Cyt-c的含量，并计算其质量回收率为97.2％。
由图4和图5结合可以得出：以卞胺为配基的高效疏水相互作用色谱介质对猪心中细胞色素C有较好的分离效果。
实施例6
从鸡蛋清中分离制备卵清蛋白，采用实施例2制备的高效疏水相互作用色谱介质，采用现有技术装填进入色谱柱（10×20 mm I.D.），进样体积1mL，其他同实施例4，分离色谱图和SDS-15%PAGE结果与实施例4中图2和图3类似，采用相同方法进检测，检测其回收率为95.1%，纯度为94.9%。
实施例7
从猪心中分离制备细胞色素C，采用实施例2制备的高效疏水相互作用色谱介质，采用现有技术装填进入色谱柱（10×20 mm I.D.），进样体积1mL，其他同实施例5，分离色谱图和SDS-15%PAGE结果与实施例5中图4和图5类似，采用相同方法进检测，检测其回收率为96.3%，纯度为95.8%。

Claims (10)

1.一种以卞胺为配基的高效疏水相互作用色谱介质，其特征在于：所述高效疏水相互作用色谱介质的结构式如下：
。
2.权利要求1所述高效疏水相互作用色谱介质的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）硅胶活化；
（2）制备环氧化硅胶：按照1g：50mL将步骤（1）得到的活化硅胶加入无水甲苯中，超声处理3-5min，然后在搅拌条件下向其中缓慢加入硅烷偶联剂，所述活化硅胶和硅烷偶联剂的质量体积比为1g:1mL~1g:2 mL，升温至90-120 ℃，回流并搅拌9-12h，然后用甲醇、水、甲醇洗涤抽滤，重复洗涤抽滤5次，真空干燥，即得到环氧硅胶；
（3）环氧开环制备高效疏水相互作用色谱介质：按照体积比1:200，将苄胺加入干燥的1，4-二氧六环溶液中，超声处理3-5min，向其中加入环氧硅胶，所述环氧化硅胶和卞胺的质量比为1:2~1:4，超声处理3-5min，然后在80 ℃下回流并搅拌7h，然后用甲醇、水、甲醇洗涤抽滤，重复洗涤抽滤5次，真空干燥，即可。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤（1）所述硅胶活化的步骤具体如下：按照质量体积比1g:10mL ~1g:20mL将未活化的硅胶加入质量浓度为20%的盐酸溶液中，在120℃下回流并搅拌2-6h，用蒸馏水洗涤抽滤至中性，在100~150℃真空干燥箱中干燥12~24h，即得到活化硅胶。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述未活化的硅胶孔径为80~200Å、粒径为5~10μm的球状硅胶。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤（2）所述硅烷偶联剂为γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤（2）和步骤（3）中真空干燥的条件均为：在60℃下真空干燥12h。
7.权利要求1所述高效疏水相互作用色谱介质的应用，其特征在于：所述应用为将所述高效疏水相互作用色谱介质应用于高效液相色谱中来分离制备天然蛋白。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述分离制备天然蛋白具体如下：
（1）将含有天然蛋白的样品进行预处理；
（2）将所述高效疏水相互作用色谱介质装填在高效液相色谱仪的色谱柱中，将步骤（1）处理得到的样品直接进样100μL，进入色谱柱，用流动相A冲洗色谱柱至基线平稳，然后采用流动相B线性从0-100%线性梯度洗脱20-30min，在达到100%时延长洗脱5-10min，流动相A和流动相B的流速均为1.0-2.0 mL/min，检测波长为280nm，收集色谱馏分，经过SDS-15%PAGE分析，即得到天然蛋白；
所述流动相A为2.0~3.0 mol/L (NH4)2SO4和10.0 ~50.0 mmol/L KH2PO4的混合液，且pH为7.5；所述流动相B为10.0 ~50.0 mmol/L KH2PO4，且pH为7.5。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述样品为鸡蛋清，分离制备的天然蛋白为卵清蛋白，步骤（1）具体如下：在鸡蛋清中加入5倍体积的20.0 mmol/L、pH=6.5的KH2PO4缓冲溶液，搅拌均匀，在4℃、8000rpm的条件下离心处理20 min，将离心得到的上清液用0.45μm滤膜过滤后，所得滤液为预处理得到的样品，保存在4℃下，备用。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述样品为猪心，分离制备的天然蛋白为细胞色素C，步骤（1）具体如下：将猪心清洗，去除表皮的脂肪和肌腱后，在绞肉机中绞碎至直径小于1cm的颗粒，按照1g：1mL加水稀释，调节pH为4.0，然后搅拌2 h，再调节pH为7.0，过滤，将滤液在4℃下静置12h，然后在4 ℃、8000 rpm条件下离心20 min，留取上清液，将上清液用0.45 μm的滤膜过滤得到的滤液即为预处理得到的样品，保存在4℃下，备用。
CN201810978259.1A 2018-08-27 2018-08-27 一种以卞胺为配基的高效疏水相互作用色谱介质及其制备方法与应用 Active CN109107536B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810978259.1A CN109107536B (zh) 2018-08-27 2018-08-27 一种以卞胺为配基的高效疏水相互作用色谱介质及其制备方法与应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810978259.1A CN109107536B (zh) 2018-08-27 2018-08-27 一种以卞胺为配基的高效疏水相互作用色谱介质及其制备方法与应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109107536A true CN109107536A (zh) 2019-01-01
CN109107536B CN109107536B (zh) 2021-06-15

Family

ID=64861033

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810978259.1A Active CN109107536B (zh) 2018-08-27 2018-08-27 一种以卞胺为配基的高效疏水相互作用色谱介质及其制备方法与应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109107536B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109078628A (zh) * 2018-08-27 2018-12-25 西北大学 一种以卞胺为配基的高效疏水相互作用色谱介质、制备方法及其在蛋白质复性与纯化的应用
CN109939659A (zh) * 2019-04-22 2019-06-28 西北大学 一种高效疏水相互作用色谱介质、制备方法及其在提取丹酚酸b中的应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101060931A (zh) * 2004-10-21 2007-10-24 通用电气健康护理生物科学股份公司 色谱配体
CN101694485A (zh) * 2009-09-27 2010-04-14 上海交通大学 利用亲和柱分析全蛋白的方法
CN105148883A (zh) * 2015-09-30 2015-12-16 西北大学 一种从鸡蛋清中分离纯化高纯度溶菌酶的新方法
CN106535931A (zh) * 2014-08-25 2017-03-22 艾慕恩治疗公司 卵蛋白制剂及其制备方法
WO2017103863A1 (en) * 2015-12-18 2017-06-22 University Of Canterbury Separation medium

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101060931A (zh) * 2004-10-21 2007-10-24 通用电气健康护理生物科学股份公司 色谱配体
CN101694485A (zh) * 2009-09-27 2010-04-14 上海交通大学 利用亲和柱分析全蛋白的方法
CN106535931A (zh) * 2014-08-25 2017-03-22 艾慕恩治疗公司 卵蛋白制剂及其制备方法
CN105148883A (zh) * 2015-09-30 2015-12-16 西北大学 一种从鸡蛋清中分离纯化高纯度溶菌酶的新方法
WO2017103863A1 (en) * 2015-12-18 2017-06-22 University Of Canterbury Separation medium

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109078628A (zh) * 2018-08-27 2018-12-25 西北大学 一种以卞胺为配基的高效疏水相互作用色谱介质、制备方法及其在蛋白质复性与纯化的应用
CN109939659A (zh) * 2019-04-22 2019-06-28 西北大学 一种高效疏水相互作用色谱介质、制备方法及其在提取丹酚酸b中的应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN109107536B (zh) 2021-06-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU590046B2 (en) Tangential flow affinity ultrafiltration
CN102532254B (zh) 一种从水稻种子中分离纯化重组人血清白蛋白的方法
CN102250240B (zh) 一种从血浆分离组分ⅰ+ⅲ中纯化人免疫球蛋白的方法
EP2681231B1 (en) Method for isolating osteopontin using concentrated feeds
CA2882552A1 (en) Purification of biological molecules
CN109107536A (zh) 一种以卞胺为配基的高效疏水相互作用色谱介质及其制备方法与应用
CN104610430B (zh) 利用灵芝蛋白制备的抗氧化多肽及其制备方法
JPH02138295A (ja) 回転型カラムを利用した液中蛋白質の回収方法
CN102477094A (zh) 一种合成胸腺肽α1的分离纯化方法
CN109078628A (zh) 一种以卞胺为配基的高效疏水相互作用色谱介质、制备方法及其在蛋白质复性与纯化的应用
CN104327175B (zh) 一种分离抗菌肽的方法
CN104984739B (zh) 一种明胶亲和层析介质的制备方法及其应用
RU2643365C2 (ru) Способ очистки дарбэпоетина альфа
CN108059673B (zh) 一种人血清中分离免疫球蛋白IgG的方法
CN109134622A (zh) 口蹄疫病毒抗原的多步连续集成纯化方法
CN1918289A (zh) 生产乳过氧化物酶的方法
CN103242434B (zh) 无细胞百日咳疫苗的制备方法
US20230079633A1 (en) Optimized method for bevacizumab purification
CN107033236A (zh) 一种从酵母发酵液中分离人血白蛋白的混合模式层析方法
CN109776654A (zh) 一种亲和肽及其应用
JP2007139759A (ja) タンパク質分画デバイスおよびタンパク質の分画・濃縮方法
CN109206476A (zh) 一种蛋白分离纯化的方法
CN106191036A (zh) Rna结合蛋白在提取核酸中的应用及提取方法
CN114920828B (zh) 一种制备细胞色素c的方法
Khodwe et al. Purification of arginine by ion-exchange chromatographic from cottonseed de-oiled cake

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant