CN106191036A - Rna结合蛋白在提取核酸中的应用及提取方法 - Google Patents

Rna结合蛋白在提取核酸中的应用及提取方法 Download PDF

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周燕
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Abstract

本发明提供了RNA结合蛋白在提取核酸中的应用及提取方法，该方法操作简单方便、样本需求量低、质量稳定可靠、且安全无害，采用磁珠法提取核酸，包括裂解、结合、洗涤、洗脱的步骤，还包括将所述RNA结合蛋白黏附于磁珠表面的步骤。本发明的RNA提取技术预先将RNA结合蛋白黏附于氧化硅纳米磁珠表面，保证了氧化硅纳米磁珠能够高效地结合RNA核酸分子；本发明操作简单方便，样本需求量低，质量稳定可靠，且避免使用氯仿等有毒溶剂，安全无害，为提取高浓度、高质量RNA作出保障。

Description

RNA结合蛋白在提取核酸中的应用及提取方法
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种利用RNA结合蛋白交联磁珠提取RNA的技术。
背景技术
对核酸的提取方法一直是生物学领域研究者不断努力探索的内容。传统的核酸提取方法主要有：CTAB抽提法、酚抽提法和梯度离心法，传统离心法操作步骤复杂、成本高、回收率低且涉及多数有毒试剂，不具环保性质。随着科学技术的发展，传统的核酸提取技术逐步为新型核酸提取技术所取代，新型核酸提取技术主要表现为固相载体吸附。常见有：离子交换法、离心柱提取法、磁珠法、玻璃珠吸附法以及二氧化硅基质法。虽然核酸提取技术有了很大的进步，但随着市场应用的越来越广泛，一些新型核酸提取技术的缺点日益显著。如离心柱法提取核酸，提取过程需反复离心，损失多，难以实现高通量自动化。
为了顺应高通量自动化的发展需要，磁珠提取核酸法越发深入人心，其原理是磁珠表面带有特定的活性基团，能够特异地结合核酸分子，并在外部磁场的作用下，有效地分离核酸，但磁珠法普遍见于对DNA的提取，对RNA的提取效果不佳。
有鉴于上述的缺陷，本设计人，积极加以研究创新，以期创设一种RNA结合蛋白在提取核酸中的应用及提取方法，使其更具有产业上的利用价值。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明的目的是提供RNA结合蛋白在提取核酸中的应用及提取方法，该方法操作简单方便、样本需求量低、质量稳定可靠、且安全无害。
本发明的RNA结合蛋白在提取核酸中的应用，所述RNA结合蛋白具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的DNA分子具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
进一步的，所述RNA结合蛋白在提取RNA中的应用。
本发明的一种提取核酸的方法，利用RNA结合蛋白、采用磁珠法提取核酸，包括裂解、结合、洗涤、洗脱的步骤，所述RNA结合蛋白具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的DNA分子具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
进一步的，还包括将所述RNA结合蛋白附于磁珠表面的步骤。
进一步的，利用RNA结合蛋白、采用磁珠法提取RNA，包括以下步骤：
(1)向待提取RNA的样品中添加RNA裂解液并混匀、静置，取其上清液；
(2)将已经活化偶联氨基酸的氨基磁珠做无菌处理，将纯化好的RNA结合蛋白透析备用；将经过无菌处理的氨基磁珠放置于磁力架上，以便分离；将透析后的RNA结合蛋白加入到氨基磁珠中，混合均匀后在16℃摇床中反应3h；置于磁力架分离，取上清，跑RNA结合蛋白结合反应前后SDS胶、检测结合反应前后蛋白浓度，以计算结合效率；已黏附RNA结合蛋白的氨基磁珠在4℃(冰浴)条件下，用含有PBS及0.1％TritonX的洗涤缓冲液洗涤，并于磁力架分离，弃上清；再用PBS洗涤缓冲液洗涤，于磁力架分离，弃上清；黏附RNA结合蛋白的氨基磁珠置于1ml PBS(磷酸缓冲盐溶液)，0.5％BSA(牛血清白蛋白)，2mM EDTA，0.05％Proclin，pH7.4保存液中，得到氨基磁珠悬浮液，并4℃无菌储存；
(3)向步骤(1)中的上清液添加到步骤(2)中的氨基磁珠悬浮液，并进行磁吸附，然后去除其清液，得沉淀；
(4)步骤(3)中的沉淀经洗涤、磁吸附、洗脱、磁吸附后，取其上清液，得到目标产物。
进一步的，步骤(1)中，所述RNA裂解液为RNAiso Plus。
进一步的，步骤(2)中，所述氨基磁珠悬浮液中包括偶联Protein A的氨基磁珠、2mg/ml的RNA结合蛋白，其中氨基磁珠含量为40mg/ml，直径为1.5mm。
更进一步的，所述磁珠为氧化硅纳米磁珠。
进一步的，步骤(4)中，洗涤液分别是0.02mol/L Tris DEPC水，pH6.8以及75％的无水乙醇，两者均以DEPC水为溶剂。
进一步的，步骤(4)中，洗脱液为DEPC水。
借由上述方案，本发明至少具有以下优点：
本发明提供的一种高质量、简便、低成本的RNA提取技术；RNA结合蛋白预先黏附于氧化硅纳米磁珠表面，保证了氧化硅纳米磁珠能够高效地结合RNA核酸分子；本发明操作简单方便，样本需求量低，质量稳定可靠，且避免使用氯仿等有毒溶剂，安全无害；用磁珠法专一性地提取RNA，氧化硅纳米磁珠能特异地识别且高效结合核酸分子，并在磁场等作用下，从各组织中抽离出RNA，高效结合RNA核酸分子，为提取高浓度、高质量RNA作出保障。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
附图说明
图1是本发明中RNA结合蛋白成功黏附于氨基磁珠上的示意图；
图2是本发明的实施例一中琼脂糖凝胶电泳跑胶检测示意图；
图3是本发明的实施例二中琼脂糖凝胶电泳跑胶检测示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例一
氨基磁珠黏附RNA结合蛋白得到氨基磁珠悬浮液，所述RNA结合蛋白具有如SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列，编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的DNA分子具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，包括以下步骤：
(1)将1ml已经活化偶联好Protein A的氨基磁珠，用无菌缓冲液PBS，20％乙醇，pH7.4浸泡16h，然后用无菌结合缓冲液PBS，PH7.4洗涤3次，做无菌处理；
(2)将纯化好的RNA结合蛋白透析至结合缓冲液PBS，PH7.4，备用；
(3)将经过无菌处理的氨基磁珠用磁力架分离10min，丢弃上清；
(4)将2mg透析后的RNA结合蛋白加入到氨基磁珠中，混合均匀后在16℃摇床中反应3h；
(5)用磁力架分离10min，取上清，跑RNA结合蛋白结合反应前后SDS胶、检测结合反应前后蛋白浓度，以计算结合效率；
(6)已结合RNA结合蛋白的磁珠在4℃(冰浴)条件下，用1ml PBS，0.1％TritonX，pH7.4洗涤缓冲液洗涤两次，用磁力架分离10min，弃上清；
(7)黏附RNA结合蛋白的氨基磁珠在4℃(冰浴)条件下，用1ml PBS，pH7.4洗涤缓冲液洗涤两次，用磁力架分离10min，弃上清；
(8)黏附RNA结合蛋白的氨基磁珠用1ml PBS(磷酸缓冲盐溶液)，0.5％BSA(牛血清白蛋白)，2mM EDTA，0.05％Proclin，pH7.4保存液4℃储存，如图1所示，RNA结合蛋白已成功黏附于氨基磁珠上。
提取细胞液中的RNA，包括以下步骤：
(1)取1ml HEK293细胞(转染腺病毒E1A基因的人肾上皮细胞系)液样本于1.5ml经DEPC水处理的EP管，添加400μl Takara公司提供的裂解液RNAiso Plus，震荡混匀，静置3min，4000rpm，离心6min，取上清液；
(2)向步骤(1)的上清液中添加35μl的氧化硅纳米氨基磁珠悬浮液(其中氨基磁珠含量为40mg/ml，直径为1.5mm)，12000rpm，离心3min，放置于磁力架上，磁吸附1min，吸弃上清液；
(3)将经步骤(2)处理的离心管从磁力架上取下，加入500μl洗涤液Ⅰ(0.02mol/LTris DEPC水溶液，pH 6.8)，混合均匀，静置3min，12000rpm，离心3min，放置于磁力架上，磁吸附1min，吸弃上清液体；
(4)将步骤(3)处理的离心管置于磁力架上取下，加入600μl洗涤液Ⅱ(75％的无水乙醇)，混合均匀，静置3min，12000rpm，离心3min，放置于磁力架上，磁吸附1min，吸弃上清液体；
(5)将经步骤(4)处理的离心管从磁力架上取下，打开管盖，在室温(28℃)下放置3min后，加入30μl洗脱液(DEPC水)，上下翻转洗脱5min；
(6)将步骤(5)处理的离心管置于磁力架上，磁吸附1min，吸取上清液，并置于-80℃保存备用。同时，进行琼脂糖凝胶电泳跑胶检测，查看结果，如图2所示，从图2中可以看出：由上而下共呈现三条完整条带，分别为：28s、18s、5s，无拖尾等现象，说明细胞液RNA提取质量较好。
实施例二
氨基磁珠黏附RNA结合蛋白得到氨基磁珠悬浮液的具体步骤同实施一。
提取动物组织中的RNA，包括以下步骤：
(1)充分研磨小鼠脾脏组织至粉末状，并置于1.5ml经DEPC水处理的EP管中，添加800μl Takara公司提供的裂解液RNAiso Plus，震荡混匀，静置3min，10000rpm，离心8min，取上清液；
(2)向步骤(1)的上清液的混合液中，添加50μl的氨基磁珠悬浮液(其中氨基磁珠含量为40mg/ml，直径为1.5mm，)，12000rpm，离心3min，放置于磁力架上，磁吸附1min，吸弃上清液；
(3)将经步骤(2)处理的离心管从磁力架上取下，加入500μl洗涤液Ⅰ(0.02mol/LTrisDEPC水溶液，pH6.8)，混合均匀，静置3min，12000rpm，离心3min，放置于磁力架上，磁吸附1min，吸弃上清液体；
(4)将步骤(3)处理的离心管置于磁力架上取下，加入600μl洗涤液Ⅱ(75％的无水乙醇)，混合均匀，静置3min，12000rpm，离心3min，放置于磁力架上，磁吸附1min，吸弃上清液体；
(5)将经步骤(4)处理的离心管从磁力架上取下，打开管盖，在室温(28℃)下放置3min后，加入40μl洗脱液(DEPC水)，上下翻转洗脱8min；
(6)将步骤(5)处理的离心管置于磁力架上，磁吸附1min，吸取上清液，并置于-80℃保存备用。同时，进行琼脂糖凝胶电泳跑胶检测，查看结果，如图3所示，从图3中可以看出：由上而下共呈现三条完整条带，分别为：28s、18s、5s，无拖尾等现象，说明动物组织样RNA提取质量较好。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.RNA结合蛋白在提取核酸中的应用，所述RNA结合蛋白具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的DNA分子具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述RNA结合蛋白在提取RNA中的应用。
3.一种提取核酸的方法，其特征在于：利用RNA结合蛋白、采用磁珠法提取核酸，包括裂解、结合、洗涤、洗脱的步骤，所述RNA结合蛋白具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的DNA分子具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
4.根据权利要求3所述的提取核酸的方法，其特征在于：还包括将所述RNA结合蛋白附于磁珠表面的步骤。
5.根据权利要求3或4所述的提取核酸的方法，其特征在于，利用RNA结合蛋白、采用磁珠法提取RNA，包括以下步骤：
(1)向待提取RNA的样品中添加RNA裂解液并混匀、静置，取其上清液；
(2)将RNA结合蛋白加入到活化偶联氨基酸的氨基磁珠中混匀反应，经洗涤后得到表面黏附有RNA结合蛋白的氨基磁珠，并置于保存液中，得到氨基磁珠悬浮液；
(3)向步骤(1)中的上清液添加到步骤(2)中的氨基磁珠悬浮液中，并进行磁吸附，然后去除其清液，得沉淀；及
(4)步骤(2)中收集的沉淀经洗涤、磁吸附、洗脱、磁吸附后，取其上清液，得到目标产物。
6.根据权利要求5所述的提取核酸的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述RNA裂解液为RNAiso Plus。
7.根据权利要求5所述的提取核酸的方法，其特征在于：步骤(2)和(3)中，所述氨基磁珠悬浮液中包括偶联Protein A的氨基磁珠、2mg/ml的RNA结合蛋白。
8.根据权利要求5所述的提取核酸的方法，其特征在于：步骤(4)中，洗涤液分别为0.02mol/L Tris DEPC水溶液，pH6.8，和75％的无水乙醇。
9.根据权利要求5所述的提取核酸的方法，其特征在于：步骤(4)中，洗脱液为DEPC水。
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