CN103864937A

CN103864937A - 一种用于小rna转染的重组融合蛋白及其制备方法

Info

Publication number: CN103864937A
Application number: CN201210538985.4A
Authority: CN
Inventors: 亓卫东; 丁剑锋; 张清仪; 王爽; 孙艳君
Original assignee: WUJIANG NOVOPROTEIN TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: WUJIANG NOVOPROTEIN TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2012-12-13
Filing date: 2012-12-13
Publication date: 2014-06-18

Abstract

本发明公开了一种用于小RNA转染的重组融合蛋白及其制备方法，该重组融合蛋白含有蛋白转导结构域（PTD）和dsRNA结合结构域（DRBD）。此重组融合蛋白可介导dsRNA转入到细胞质内，发挥RNA干扰作用（RNAi），用来基于RNAi技术的生物医学研究与药物开发。

Description

一种用于小RNA转染的重组融合蛋白及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种重组融合蛋白，具体地涉及一种用于小RNA转染的重组融合蛋白；此外，本发明还涉及该重组融合蛋白的制备方法。

背景技术

1、siRNA

RNA干扰（RNA interference，RNAi），是将与特定mRNA对应的正义RNA和反义RNA组成的双链RNA(dsRNA)导入细胞，dsRNA经酶切后会形成很多小片段，称为小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)，这些小片段与mRNA中的同源序列互补结合后，会导致mRNA失去功能，也就是使基因“沉默”。

siRNA最早是由英国的David Baulcombe团队发现，是植物中的后转录基因沉默（post-transcriptional gene silencing；PTGS）现象的一部分，其研究结果发表于《科学》。2001年，Thomas Tuschl团队发现合成的siRNA，可诱导哺乳动物体内的RNA干扰作用，结果发表于《自然》。这项发现引发了利用可控制的RNA干扰作用，来进行生物医学研究与药物开发的方法。

目前用于siRNA转染的主要有磷酸钙共沉淀、电穿孔法、DEAE-葡聚糖和polybrene、机械法、阳离子脂质体试剂等。其中电穿孔法、机械法、DEAE-葡聚糖和polybrene只适合用少量的细胞体外转染，磷酸钙共沉淀对于实验技术要求极为苛刻，阳离子脂质体试剂通常只用于大片段的DNA质粒的转染，并且对细胞具有很高的毒性，需要在转染后更换培养基去除脂质体。用于哺乳动物细胞转导siRNA的高效、低毒、简便的方法尚需进一步探索，目前还没有通过使用蛋白质介导转入DNA或RNA等核酸分子的报道。

2、蛋白质的转导

蛋白转导最初来自于对HIV TAT蛋白的研究，人们发现全长HIV TAT蛋白能够进入细胞激活病毒基因的转录。进一步研究表明，HIV TAT蛋白的一个区域（TAT PTD）负责进入细胞的功能。人们发现将TATPTD与大分子偶联或融合能将大分子的蛋白送入细胞。研究表明带正电荷的精氨酸对于TATPTD穿膜进入细胞质是必须的，任何一个精氨酸的突变都会导致转导功能的丧失。在此基础上，人们发现多聚精氨酸同样具有转导的功能。利用TATPTD和其他蛋白转导多肽的蛋白质转导技术在解决大分子药物进入细胞发挥功能方面具有巨大的潜力。

3、双链RNA结合蛋白

双链RNA结合蛋白（dsRNA-binding protein,dsRBP）是一类含有dsRNA结合域（dsRNA-binding domain,DRBD）的蛋白质，广泛存在于真核细胞、细菌、病毒中，参与从RNA加工到翻译的调控等过程。根据有无催化结构域，可将dsRBP分为两类。一类是含有催化结构域的dsRBP，如作用于RNA的腺苷酸脱氨酶、双链RNA依赖的蛋白激酶等。另一类不含催化结构域，如TAR RNA结合蛋白、非洲爪蟾RNA结合蛋白等。

DRBD的氨基酸序列具有种属保守性，一般有65-70个氨基酸残基组成，其结构一般为αβββα组成，能特异识别并结合dsRNA。根据与dsRNA亲和力的不同，可将DRBD分为A型和B型。通常情况下，A型比B型对dsRNA的亲和力高，A型的整个结构域都包含保守性的氨基酸残基，而B型只在C-端分布保守的氨基酸残基。在含有多个DRDB结构域的蛋白质中，DRBD之间存在相互协作的关系。例如前面的DRBD可将结构不规范的RNA矫正，从而使矫正后的RNA更易于同后面的DRBD结合，或通过改变同一蛋白质中的DRBD的距离，提高dsRBP与dsRNA的亲和力。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供一种用于小RNA转染的重组融合蛋白，该蛋白质能够特异性结合dsRNA，并介导通过细胞膜转入到细胞质中。此外，本发明还提供了该重组融合蛋白的制备方法。

为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了一种用于小RNA转染的重组融合蛋白，该重组融合蛋白由具有转导功能的蛋白转导结构域（PTD）和具有与dsRNA结合功能的RNA结合域（简称dsRNA结合结构域，DRBD）构成，即PTD-DRBD。

所述重组融合蛋白的PTD为HIV TAT蛋白的TATPTD区域，或者其他具有蛋白转导功能的氨基酸序列；该蛋白的PTD使该重组融合蛋白能进入到细胞内。

所述重组融合蛋白的DRBD为人干扰素诱导的双链RNA激活蛋白激酶（Interferon-induced，double-stranded RNA-activated protein kinase）的DRBD结构域，或者其他具有dsRNA结合功能的氨基酸序列，该蛋白的DRBD使该重组融合蛋白结合dsRNA并进入到细胞内。

所述的PTD-DRBD重组融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，其编码的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。

此外，本发明还提供了此融合蛋白的制备方法，其步骤包括：

1）PTD-DRBD重组融合蛋白表达质粒的构建:全基因合成如SEQ ID NO.1所示的DNA序列，PCR扩增引入NdeI和xhoI酶切位点，酶切回收片段并装pET30a载体上，转化DH5a，测序获得正确的阳性表达质粒；

2）PTD-DRBD重组融合蛋白的表达：将步骤1）中获得的正确质粒转化的BL21（DE3）宿主菌中，将带有质粒的宿主菌接种于摇瓶中培养，在菌体浓度达到OD为0.2-0.6时，加入0.1-1mM IPTG诱导表达，继续培养2-4小时后收集菌体；

3）PTD-DRBD重组融合蛋白的分离纯化：将步骤2）中收获的菌体破碎后收集包涵体，包涵体经变复性获得折叠正确的融合蛋白，再通过离子交换和疏水层析获得高纯度的PTD-DRBD重组融合蛋白。

步骤1）中，所述PCR扩增采用如下引物：

PTD nde F引物：5’-ccg CATATGGGTCGTAAAAAACGTC-3’，如SEQ ID NO.3所示；

DRBD xho R引物：5’-ccgCTCGAGTTCTTTGTTCAGGATTTC-3’，如SEQ ID NO.4所示。

步骤1）中，所述PCR扩增的反应条件为：步骤①95摄氏度5分钟；步骤②94摄氏度45秒，55摄氏度45秒，72摄氏度55秒，30个循环；步骤③72摄氏度7分钟。

本发明的PTD-DRBD重组融合蛋白能有效的介导dsRNA转入到细胞内，创造性的使用蛋白质作为转导物转入dsRNA，发挥RNAi的作用（即RNA干扰作用）。为生物医学研究和RNAi药物开发、使用提供了一种高效、低毒、简便的dsRNA转导方法。

附图说明

图1：本发明实施例1中PTD-DRDB重组融合蛋白表达质粒的构建示意图。

图2：本发明实施例3中纯化后的PTD-DRDB蛋白SDS-PAGE电泳图。

图3：本发明实施例4中转染实验组照片。

图4：本发明实施例4中转染对照组照片。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、PTD-DRBD重组融合蛋白表达质粒的设计、构建

在本发明中，全基因合成如SEQ ID NO.1所示的DNA序列模板，利用合成的PTD ndeF引物和DRBD xhoR引物进行PCR扩增并引入NdeI和xhoI酶切位点。PCR采用Roche公司的高保真扩增系统，反应体系按照说明书的要求配置。PCR反应条件为：步骤①95摄氏度5分钟；步骤②94摄氏度45秒，55摄氏度45秒，72摄氏度55秒，30个循环；步骤③72摄氏度7分钟。回收PCR产物，用NdeI和xhoI酶切并连接到pET30a载体上，转化DH5a，测序获得正确的阳性表达质粒pET30a-PTD-DRDB（见图1）。

PTD nde F引物：5’-ccg CATATGGGTCGTAAAAAACGTC-3’（如SEQ ID NO.3所示）；

DRBD xho R引物：5’-ccgCTCGAGTTCTTTGTTCAGGATTTC-3’（如SEQ ID NO.4所示）。

实施例2、PTD-DRBD蛋白的表达

1）表达菌株的筛选：将实施例1中获得的正确的阳性表达质粒pET30a-PTD-DRDB转化到BL21(DE3)宿主菌中，小量培养筛选高表达克隆。在5支装有3ml LB培养基的试管中接种转化后的单克隆菌体，37摄氏度摇床中培养4小时后加入1mM IPTG诱导PTD-DRBD融合蛋白表达，继续培养3小时后收集菌体。各取少量菌体，加入100μl电泳上样缓冲液煮沸5分钟，冷却后12000rpm离心5min，取上清液进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，考马斯亮蓝染色。根据电泳的检测，其中3号克隆表达最好，选择3号克隆作为大规模表达用菌种。

2）融合蛋白的大规模表达：将上述步骤1）筛选得到的表达菌种接种于100ml的LB培养基中37摄氏度摇床中培养过夜，第2天用过夜的100ml菌种转接于10LLB培养基中，37摄氏度培养至OD为0.6，加入1mM IPTG诱导3小时，此时菌液OD为2.2，离心收集菌体共36g。

实施例3、PTD-DRBD蛋白的纯化

1）将实施例2中收集的36g菌体重悬于360ml破菌缓冲液（20mM PB,150M NaCl,pH7.4）中，4摄氏度500W间歇超声20min裂解菌体，6000rpm离心10min后收集沉淀。沉淀重悬于200ml包涵体洗涤液（20mM PB,150mM NaCl,2M Urea,pH7.4）中，4摄氏度500W间歇超声5min后同样条件离心，收集沉淀。如此再重复洗涤包涵体1次，共获得PTD-DRBD融合蛋白的包涵体12g。

2）将上述步骤1）中收集的12g包涵体重悬于120ml包涵体溶解液（20mM PB,150mMNaCl,8M Urea,10mM DTT，pH7.4）中，室温搅拌溶解3小时，使包涵体全部溶解。12000RPM（转/分）室温离心20min，收集上清液共110ml。

3）复性：将上述步骤2）中获得的110ml包涵体溶解液缓慢地加入到5500ml预冷的复性缓冲液（50mM TrisHCl,150mM NaCl,10mM KCl,1mM EDTA,0.05%PEG4000,1mMDT T,pH8.2）中，将该复性液静置复性4摄氏度环境中48小时。

4）离子交换层析：将上述步骤3）的复性液用1M盐酸调节pH至7.5，用蠕动泵上样于含有100ml的SP Fast Flow填料（离子交换填料）的层析柱中，用洗涤缓冲液（20mMTrisHCl,200mM NaCl,pH7.5）洗去杂蛋白和其他杂质，再用洗脱缓冲液（20mM TrisHCl,350mMNaCl,pH7.5）洗脱PTD-DRBD融合蛋白。共获得PTD-DRBD蛋白130ml，浓度为0.65mg/ml，蛋白总量共84.5mg，纯度为83%。

5）疏水层析：往上述步骤4）中的130ml洗脱液中加入3M的硫酸铵溶液65ml，用蠕动泵上样与含20ml的Phenyl HP填料的层析柱中，上样结束后用洗涤缓冲液（20mM PB，0.6M（NH4）2SO4，pH7.2）洗去杂蛋白，再用洗脱液（20mM PB，0.3M（NH4）2SO4，pH7.2）洗脱PTD-DRBD融合蛋白。共获得PTD-DRBD蛋白42ml，浓度为1.2mg/ml，蛋白总量共50.4mg，纯度为93%。将这部分洗脱液于4L的透析缓冲液（20mM PB，150mM NaCl，pH7.2）中透析4摄氏度透析过夜，无菌过滤并分装冻存于-80摄氏度冰箱中，共获得PTD-DRBD融合蛋白53ml，蛋白浓度为0.8mg/ml，共42.4mg（见图2）。

实施例4.PTD-DRBD融合蛋白介导dsRNA经灰鼠圆窗膜耳蜗转染

1）离体灰鼠耳蜗器官培养：

a)预先制备胶原凝胶（Collagen Gel）。A溶液：0.02摩尔／升)醋酸溶液7.8μl、50X胶原溶液130μl、水6.3ml。B溶液：10XBME培养基（Basal Medium Eagle）。C溶液:2%（W/V）碳酸钠溶液。临用前按体积比例将A溶液9份与B溶液1份和C溶液1份混合均匀（A:B:C＝9:1:1）。

b)选择出生后2－3天的大鼠，用75％的酒精喷洒消毒动物的头颈部，断头后剪开顶骨，去除脑组织暴露颅底。

c)用尖镊挑开内听道骨壁以暴露耳蜗底回的基底膜，用游丝镊沿蜗壳环形分离耳蜗螺旋韧带，取出整个耳蜗膜迷路立即浸入Hanks溶液中。

d）将10μl胶原凝胶滴在培养皿中央。

e）将基底膜浸入胶原凝胶并铺放平整，然后将培养皿移入CO₂培养箱在37℃条件下温育20分钟。

f）待胶原凝胶凝聚成果冻状时，向培养皿中加入适量培养液，在CO₂培养箱中培养24h即可用于实验。

2）转染及效果评价：于转染前将PTD-DRBD融合蛋白与dsRNA水溶液（红色荧光信号：Cy3-labeled dsRNA，广州锐博）混合；具体方法为：取10μl dsRNA水溶液（5μM）与10μl PTD-DRBD融合蛋白PBS-10%甘油液（30μM）混合，加入4μl PBS-10%甘油于0℃环境中放置30min,使用时稀释使dsRNA浓度在250nM。设置阴性对照组，取10μl dsRNA水溶液（5μM）与10ul PBS-10%甘油液混合，加入4μl PBS-10%甘油于0℃环境中放置30min,使用时稀释使dsRNA浓度在250nM。

分别向离体培养的耳蜗器官加入20μl实验组混合物和20μl对照组混合物进行转染，于转染后的24小时在激光共聚焦显微镜下观察Cy3显色以评价转染效率。可以观察到实验组转染后24小时，红色荧光信号已遍布整个耳蜗基底膜内、外毛细胞中（见图3，图3中白色三角标注的是红色荧光信号位置）。而对照组则未观察到红色荧光信号（见图4）。可见，本发明的PTD-DRBD融合蛋白能有效的介导dsRNA转入到细胞内，创造性的使用蛋白质作为转导物转入dsRNA，发挥RNAi的作用。为生物医学研究和RNAi药物开发、使用提供了一种高效、低毒、简便的dsRNA转导方法。

Claims

1.一种用于小RNA转染的重组融合蛋白，其特征在于，该重组融合蛋白含有蛋白转导结构域PTD和dsRNA结合结构域DRBD，即该重组融合蛋白具有以下构成：PTD-DRBD。

2.如权利要求1所述的重组融合蛋白，其特征在于，所述的蛋白转导结构域PTD为HIVTAT蛋白的TAT PTD区域，或者其他具有蛋白转导功能的氨基酸序列；该蛋白转导结构域PTD使该重组融合蛋白能进入到细胞内。

3.如权利要求1所述的重组融合蛋白，其特征在于，所述的dsRNA结合RNA结构域DRBD为人干扰素诱导的双链RNA激活蛋白激酶的DRBD结构域，或者其他具有dsRNA结合功能的氨基酸序列；该dsRNA结合结构域DRBD使该重组融合蛋白结合dsRNA并进入到细胞内。

4.如权利要求1所述的重组融合蛋白，其特征在于，所述的重组融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，其编码的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。

5.一种如权利要求1所述的重组融合蛋白的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：

1）PTD-DRBD重组融合蛋白表达质粒的构建：全基因合成如SEQ ID NO.1所示的DNA序列，PCR扩增引入NdeI和xhoI酶切位点，酶切回收片段并装pET30a载体上，转化DH5a，测序获得正确的阳性表达质粒；

2）PTD-DRBD重组融合蛋白的表达：将步骤1）中获得的正确质粒转化到BL21宿主菌中，将带有质粒的宿主菌接种于摇瓶中培养，在菌体浓度达到OD为0.2-0.6时，加入0.1-1mMIPTG诱导表达，继续培养2-4小时后收集菌体；

3）PTD-DRBD重组融合蛋白的分离纯化：将步骤2）中收获的菌体破碎后收集包涵体，包涵体经变复性获得折叠正确的融合蛋白，再通过离子交换和疏水层析获得高纯度的PTDDRBD重组融合蛋白。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤1）中，所述PCR扩增采用如下引物：

DRBD xhoR引物：5’-ccgCTCGAGTTCTTTGTTCAGGATTTC-3’，如SEQ ID NO.4所示。

7.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于，步骤1）中，所述PCR扩增的反应条件为：步骤①95摄氏度5分钟；步骤②94摄氏度45秒，55摄氏度45秒，72摄氏度55秒，30个循环；步骤③72摄氏度7分钟。