CN102174521A - 人核糖体蛋白分子hRrp15p及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了人核糖体蛋白分子hRrp15p具有的特异核苷酸，所述核苷酸包含：a)SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列或者其互补DNA序列；b)上述a)中缺失、替换或插入一个或多个碱基、仍具有所述核苷酸功能的核苷酸序列；所述的SEQ ID NO：1所示的核苷酸，全长为849个碱基。其所对应的氨基酸序列如SEQ ID NO：2具有282个氨基酸。本发明制备了hRrp15p的多克隆抗体并构建该蛋白分子的多种突变体，对hRrp15p的细胞内表达，亚细胞定位以及该蛋白分子对核仁素核仁定位的影响作用进行深入研究。从而解决了核仁素如何定位于核仁结构并促使核仁结构的形成，为细胞内核仁的功能的发挥奠定形态学基础。

Description

人核糖体蛋白分子hRrp15p及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于人核糖体蛋白分子研究技术领域，涉及人核糖体蛋白分子hRrp15p决定核仁素(Nucleolin)的核仁定位。更具体的说是一种人核糖体蛋白分子hRrp15p及其制备方法与应用。

背景技术

随着科学技术的快速发展，人们对生命的探索也快速进步，对生命的发生也进行了很多深入的研究，在生命发生过程中离不开各种物质的重要作用。核仁(nucleolus)是真核细胞间期核中最显著的结构，具有重要功能，是核糖体RNA合成、加工和核糖体亚单位的组装场所。核仁素(Nucleolin，又称C23)是真核细胞核仁中最主要的一种蛋白质，具有多种生物学功能，它不但直接参与核糖体的生物合成与成熟，还直接或间接参与细胞增殖、生长、胚胎发生、胞质分裂、染色质复制与核仁的发生等过程。2007年，Kiichi Fukui实验室研究证实，核仁素是细胞核仁结构形成的决定蛋白分子。应用小分子RNA干扰技术(RNAi)抑制核仁素在细胞内的表达，导致间期细胞核仁结构的消失，最终出现细胞分裂周期阻滞，细胞增殖停滞(Nan Ma，et al.2007)。但核仁素的核仁定位的决定因素仍不清楚。如能发现细胞内核仁素的核仁定位的决定因素，就可以通过这种因素影响核仁素的核仁定位，从而影响间期细胞核仁结构的形成，进而抑制肿瘤细胞的增殖，为探索临床肿瘤治疗方法寻找新的生物分子靶点。

核糖体相关蛋白15(Rrp15p)最早由Alessandro Fatica实验室于2005年发现于酵母细胞中，该实验室研究证实Rrp15p分子是核糖体大亚基(60S)前体的组成成分，并与核糖体大亚基的成熟相关。我们根据蛋白分子氨基酸序列的同源性，对比人基因组，检索出人核糖体相关蛋白15(hRrp15p)的基因序列，然后设计PCR引物，从人子宫颈癌细胞HeLa的cDNA文库中克隆出hRrp15p的cDNA。经DNA测序后，与人GenBank对比，证实该cDNA序列。随后，我们制备了hRrp15p的多克隆抗体并构建该蛋白分子的多种突变体，对hRrp15p的细胞内表达，亚细胞定位以及该蛋白分子对核仁素核仁定位的影响作用进行深入研究。

发明内容

本发明公开了人核糖体蛋白分子hRrp15p核苷酸，所述核苷酸包含：

a)SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列或者其互补DNA序列；

b)上述a)中缺失、替换或插入一个或多个碱基、仍具有所述核苷酸功能的核苷酸序列；所述的SEQ ID NO：1所示的核苷酸，全长为849个碱基。

本发明所述人核糖体蛋白分子hRrp15p核苷酸序列，其所对应的氨基酸序列如SEQID NO：2具有282个氨基酸。

本发明进一步公开了人核糖体蛋白分子hRrp15p在决定核仁素的核仁定位方面的应用，其中hRrp15p的的核仁定位序列为第228至232氨基酸RKKPK。

本发明进一步公开了人核糖体蛋白分子hRrp15p在制备作为核仁素的核仁定位抑制肿瘤细胞的增殖药物方面的应用。

本发明的研究结果充分证明hRrp15p决定核仁素的核仁定位，从而解决了核仁素如何定位于核仁结构并促使核仁结构的形成，为细胞内核仁的功能的发挥奠定形态学基础。

本发明更加详细的制备方法如下：

方法与结果：

1、hRrp15p基因的克隆、特异性抗体的制备以及在细胞周期的表达

在Gene bank中，通过同源蛋白比对，发现人基因组中酵母细胞Rrp15p基因的同源基因序列(命名为hRrp15p，Figure 1A，1B)。根据hRrp15p的基因序列，设计PCR引物如下：

引物1：5’-CCGGAATTCATGGCAGCCGCCGCTCCGGAC-3’；

引物2：5’-CCGCTCGAGTGTATCAGAGTCACTTGC-3’.

以HeLa细胞的cDNA文库为模板，应用上述引物进行PCR扩增反应。将扩增的DNA片段连接至质粒载体pEGFP，进行测序鉴定，与hRrp15p基因序列完全相同。

hRrp15p基因序列(含TAA终止密码子849)：

ATGGCAGCCGCCGCTCCGGACTCACGTGTGAGTGAGGAAGAAAACCTGAAAAAGACCCCAAAGAAGAAGATGAAA

ATGGTAACTGGAGCCGTAGCGTCGGTGCTGGAAGACGAGGCCACAGACACTTCTGATAGTGAAGGAAGCTGTGGA

TCGGAAAAGGACCACTTTTATTCTGATGATGACGCAATAGAAGCTGACAGTGAGGGTGATGCTGAGCCCTGTGAC

AAAGAAAATGAAAATGATGGAGAATCAAGTGTTGGGACTAATATGGGCTGGGCAGATGCTATGGCTAAAGTCCTC

AACAAGAAAACTCCTGAAAGTAAACCTACTATTCTGGTCAAAAATAAGAAGCTGGAAAAGGAAAAAGAAAAGTTA

AAGCAAGAAAGACTAGAGAAAATAAAACAGCGTGATAAGAGGCTGGAGTGGGAAATGATGTGCAGAGTAAAGCCA

GATGTTGTCCAAGACAAAGAGACAGAGAGAAATCTTCAGAGAATTGCAACAAGGGGTGTGGTGCAATTATTTAAT

GCTGTTCAGAAACATCAAAAGAATGTTGATGAAAAGGTTAAGGAAGCTGGAAGTTCTATGAGAAAGCGTGCTAAG

TTGATATCAACTGTTTCCAAGAAAGATTTCATCAGTGTTTTGAGAGGGATGGATGGAAGTACAAATGAGACTGCT

TCAAGCAGGAAGAAACCAAAAGCCAAACAGACTGAAGTGAAATCAGAAGAAGGCCCAGGTTGGACGATCCTACGT

GATGATTTCATGATGGGAGCATCTATGAAAGACTGGGACAAGGAAAGTGATGGGCCAGATGACAGCAGACCAGAA

TCTGCAAGTGACTCTGATACATAA

hRrp15p氨基酸序列(282个氨基酸)：

MAAAAPDSRVSEEENLKKTPKKKMKMVTGAVASVLEDEATDTSDSEGSCGSEKDHFYSDDDAIEADSEGDAEPCD

KENEND(ESSV(TNMGWADAMAKVLNKKTPESKPTILVKNKKLEKEKEKLKQERLEKIKQRDKRLEWEMMCRVKP

DVVQDKETERNLQRIATRGVVQLFNAVQKHQKNVDEKVKEAGSSMRKRAKLISTVSKKDFISVLRGMDGSTNETA

SSRKKPKAKQTEVKSEEGPGWTILRDDFMMGASMKDWDKESDGPDDSRPESASDSDT

应用原核细胞表达载体pHis28a(购自Novagen公司)，构建原核表达His-标记的全长hRrp15p融合蛋白的载体质粒并将该质粒转化到Escherichia coli.BL-21(DE)pLysS菌株(购自Novagen公司)以诱导融合蛋白His-hRrp15p的表达，随后裂解诱导菌株并用Ni-NTA(亚硝基三乙酸镍)-琼脂糖柱层析得到纯化的His-hRrp15融合蛋白。再用纯化的蛋白免疫英格兰大白兔产生兔抗-hRrp15p抗体血清，最后用His-hRrp15p融合蛋白Ni-NTA琼脂糖珠纯化血清中兔抗-hRrp15p抗体。该抗体将来可以应用于阻断肿瘤细胞内源性hRrp15p的正常作用，进而抑制肿瘤细胞的生长(这里预示可以治疗什么病？)。

应用纯化后的hRrp15p抗体对人乳腺癌细胞MCF7的裂解液进行免疫共沉淀实验，随后对沉淀物进行蛋白电泳(SDSPAGE)及印迹杂交(Western Blot)，证实hRrp15抗体只识别细胞裂解液中的一个蛋白分子，分子量约40KDa(Figure 1C)。该蛋白条带可以通过细胞内转染hRrp15p特异性siRNA而降低或消失(Figure 5，6)，证明hRrp15p抗体的特异性。该特异性兔抗hRrp15p抗体为后续研究hRrp15p的定位及功能奠定基础，也为探索以hRrp15p为生物靶点治疗临床肿瘤的研究提供了基本实验材料。

对HeLa细胞进行G₁/S同步化，随后收集各时期的细胞并裂解，应用蛋白印迹杂交实验检测hRrp15p蛋白在细胞周期各时期的表达情况，显示hRrp15p在细胞周期G₁期较高表达，M期较低表达(Figure 1D，1E)。

2、hRrp15p蛋白分子的亚细胞定位

应用特异性hRrp15p抗体进行细胞免疫荧光染色，研究hRrp15p在细胞周期各时期中的亚细胞定位。结果显示，hRrp15p在细胞分裂间期定位于的细胞内并积聚在一起，在细胞有丝分裂过程中，该蛋白伴随染色体运动，并随染色体分离至子细胞中。在胞质分裂期，hRrp15p定位于中间体部位(Figure 2A)。应用核仁素抗体与hRrp15抗体进行共染色，发现hRrp15p与核仁素在细胞核内共定位，表明hRrp15p定位在间期细胞核核仁区域(Figure 2B)。

3、hRrp15p各功能区的亚细胞定位

应用基因工程技术及载体质粒pEGFP(购自Clontech公司)，构建hRrp15p各功能区的真核细胞表达质粒(Figure 3A)，在HeLa细胞内表达hRrp15p各功能区的绿色荧光蛋白(GFP)融合蛋白(Fiugre 3B)，通过细胞免疫荧光染色方法以核仁素为对照检测hRrp15p各功能区的亚细胞定位。结果显示，hRrp15p全长(WT)可以定位于核仁区域；hRrp15p蛋白氨基端150个氨基酸片段(N150)可以定位于细胞核内，但不能聚集在核仁区；hRrp15p羧基端175个氨基酸片段(C175)可以定位于核仁区；而hRrp15p蛋白分子中间107至150氨基酸片段(M43)基本定位于细胞质中(Figure 3C)。上述结果表明hRrp15p蛋白分子的核仁定位序列位于蛋白分子羧基端。

4、hRrp15p蛋白分子核仁定位序列的鉴定

hRrp15p蛋白分子羧基端含有一个核定位序列位于氨基酸228至232(RKKPK)，根据上述结果，应用基因工程技术及载体质粒pEGFP，构建hRrp15p的228-232氨基酸缺失的表达质粒pEGFP-hRrp15pΔ(Figure 4A)，并在HeLa细胞内表达其绿色荧光蛋白(GFP)融合蛋白GFP-hRrp15pΔ(Figure 4B)，经细胞免疫荧光染色，显示该缺失突变体蛋白分子定位于细胞核内，但不能定位于核仁区域(Figure 4C)。该结果表明hRrp15p的第228至232氨基酸(RKKPK)是该蛋白分子的核仁定位序列。该研究方法以及结果可以有助于寻找发现新的具有相似核仁定位序列的其他蛋白，以便进一步研究核仁具体功能。

5、抑制hRrp15p蛋白分子细胞内表达导致核仁素不能在细胞核内聚集形成核仁

分析hRrp15p基因序列，设计以hRrp15p基因74至93碱基(AAATGGTAACTGGAGCCGTA)为靶点的特异性小分子干扰RNA(siRNA)。细胞内转染siRNA，三天后收集细胞并裂解，将细胞裂解液进行Western Blot检测分析，与无意义siRNA对照，hRrp15p特异性siRNA可以有效抑制hRrp15p蛋白分子的表达(Figure 5A)。对siRNA转染的细胞进行免疫荧光染色检测分析，结果显示，没有hRrp15p蛋白染色的细胞内，核仁素在细胞核内弥散分布，不能集聚形成核仁。相反，无意义RNA转染的细胞内，hRrp15p正常表达并与核仁素共定位于核仁区域(Figure 5B)。该实验结果表明核仁素的核仁定位依赖于hRrp15p蛋白的正常表达。

6、外源性表达hRrp15p可以恢复hRrp15p siRNA转染后的核仁素的核仁定位为了验证hRrp15p小分子RNA干扰实验结果的特异性，设计制备针对hRrp15p基因3’端非编码序列(3’-UTR)的大肠杆菌核糖核酸酶III酶切的小分子RNA文库(esiRNAlibrary)。向细胞内共转染esiRNA文库以及质粒pEGFP-hRrp15p或pEGFP-hRrp15pΔ，三天后对细胞裂解液进行Western Blot检测分析，结果显示hRrp15p的siRNA可以有效抑制内源性hRrp15p以及外源性GFP-hRrp15p或的表达，但hRrp15p的esiRNA文库转染的细胞中，内源性hRrp15p的表达明显降低，但外源性表达的GFP-hRrp15p或GFP-hRrp15pΔ不受影响(Figure 6A)。对转染的细胞进行免疫荧光染色检测，发现在表达外源性GFP-hRrp15p的细胞内，核仁素重新聚集在核仁区域。然而，在外源性表达GFP-hRrp15pΔ的细胞内，GFP-hRrp15pΔ定位于细胞核内，但却无法定位于核仁区域，同时核仁素也不能在细胞核内聚集形成核仁结构(Figure 6B)。对上述转染实验的细胞进行统计，结果显示，在hRrp15 esiRNA单独转染的细胞中，只有37.7±7.31％的细胞存在核仁素的核仁定位；在hRrp15esiRNA与质粒pEGFP-hRrp15p共转染的细胞中，66.5±6.19％的GFP-hRrp15p表达(GFP+)的细胞中可检测到核仁素的核仁定位，而没有GFP-hRrp15p表达(GFP-)的细胞，只有44±8.45％的细胞可检测到核仁素的核仁定位；相反，在hRrp15esiRNA与质粒pEGFP-hRrp15pΔ共转染的细胞中，只有47.5±7.64％的GFP-hRrp15pΔ表达的细胞和44.8±8.14％的GFP-hRrp15pΔ无表达的细胞中可检测到核仁素的核仁定位(Figure 6C)。该结果表明，外源性蛋白GFP-hRrp15p可以恢复hRrp15p RNAi细胞中的核仁素的核仁定位，相反外源性蛋白GFP-hRrp15pΔ不能。因此，hRrp15p蛋白分子的核仁定位决定核仁素的核仁定位。

7、抑制肿瘤细胞内hRrp15p蛋白分子的表达导致子宫颈肿瘤细胞HeLa发生凋亡。

在进行hRrp15p小分子RNA干扰试验中，我们发现转染后的很多细胞发生细胞膜皱缩，细胞形态改变，原本粘附生长的细胞脱离培养皿底部，悬浮在培养液中。为进一步证实hRrp15p小分子RNA转染对细胞的作用，我们对转染后的细胞进行Annexin V染色检测。结果显示，没有转染(mock)或转染无意义小分子RNA(nonsence siRNA)的细胞被Annexin V染色的比例分别为5.0％和4.6％，然而，转染hRrp15p小分子RNA的细胞中被Annexin V染色的比例为38.7％(Figure 7A，7B)。该结果表明抑制细胞内hRrp15p蛋白分子的表达可以诱导子宫颈肿瘤细胞HeLa发生凋亡。

结论：

(1)克隆人核糖体相关蛋白15(hRrp15p)的cDNA并制备特异性多克隆抗体证实hRrp15p定位于细胞核仁区；

(2)发现hRrp15p蛋白分子的228-232氨基酸(RKKPK)是该蛋白分子的核仁定位序列；

(3)发现抑制hRrp15p的表达导致核仁素无法在细胞核内集聚形成核仁。

(4)发现抑制hRrp15p的表达导致子宫颈肿瘤细胞HeLa发生凋亡。

附图说明：

图1-A为：hRrp15p蛋白分子理论二级结构模式图(绿色代表α螺旋，黄代表无规则卷曲，红色代表核定位序列)；图1-B为在其他物种中与hRrp15p同源蛋白比对，显示该蛋白在进化上高度保守；图1-C为兔抗hRrp15p抗体的特异性检测；图1-D为流式细胞术检测细胞周期同步化后各时段细胞内DNA含量变化，以反映各时段细胞所处细胞生活时期；图1-E为蛋白免疫印迹分析hRrp15p蛋白在细胞周期各时期蛋白表达变化，PRC1作为周期对照，α-tubulin为蛋白量内参。

图2-A为免疫荧光染色技术检测hRrp15p蛋白分子在MCF7细胞各细胞周期时相中的定位(绿色代表hRrp15p，红色代表α-tublin，蓝色代表核DNA)；图2-B为免疫荧光染色技术检测hRrp15p在MCF7细胞间期的核仁定位(绿色代表hRrp15p，红色代表核仁素Nucleolin，蓝色代表核DNA)。

图3-A为hRrp15p各功能片段模式图(绿色代表α螺旋，黄色代表无规则卷曲，红色代表核定位序列)；图3-B为蛋白免疫印迹检测GFP-标记的hRrp15p各功能片段融合蛋白在MCF7细胞内的表达；图3-C为免疫荧光染色技术检测GFP-标记的hRrp15p各功能片段融合蛋白在MCF7细胞间期细胞内定位(绿色代表hRrp15p，红色代表核仁素Nucleolin，蓝色代表核DNA)；

图4-A为hRrp15p蛋白分子C端核定位序列(228-232氨基酸)缺失突变体模式图；图4-B为蛋白免疫印迹检测GFP-标记的hRrp15p蛋白分子C端核定位序列缺失突变体在MCF7细胞内的表达；图4-C为免疫荧光染色技术检测GFP-标记的hRrp15p蛋白分子C端核定位序列缺失突变体在MCF7细胞间期细胞内定位(绿色代表hRrp15p，红色代表核仁素Nucleolin，蓝色代表核DNA)；

图5-A为蛋白免疫印迹检测对MCF7细胞进行成功hRrp15p RNAi；图5-B为免疫荧光染色技术检测hRrp15p RNAi对MCF7细胞核仁影响(绿色代表hRrp15p，红色代表核仁素Nucleolin，蓝色代表核DNA)。

图6-A为蛋白免疫印迹检测hRrp15p 3’-UTR esiRNA在MCF7细胞中对内源性hRrp15p和外源转入质粒表达的GFP-hRrp15/hRrp15的作用；图6-B为免疫荧光染色技术检测MCF7共转染hRrp15p 3’-UTR esiRNA和GFP-hRrp15/hRrp15Δ表达质粒对细胞核仁影响(绿色代表hRrp15p，红色代表核仁素Nucleolin，蓝色代表核DNA)；图6-C为统计分析各处理组有核仁的细胞所占百分数。

图7-A为Annexin V免疫荧光染色不同小分子RNA转染的细胞。Annexin V染色为绿色，Hoechsst 33342染色为蓝色，PI染色为红色；图7-B为对上述染色的细胞进行统计分析，横坐标为不同处理方法，纵坐标为Annexin V染色的细胞百分比。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件。特别说明：Escherichia coli.BL-21(DE)pLysS与Top10的标准菌株均购自Novagen生物公司。为让本发明之上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。

实施例1

pEGFP-hRrp15载体构建：

1)设计引物：

引物1：5’-CCGGAATTCATGGCAGCCGCCGCTCCGGAC-3’

引物2：5’-CCGCTCGAGTGTATCAGAGT CACTTGC-3’；

2)，以HeLa cDNA文库[Jiang，1998]为模板PCR扩增hRrp15p cDNA全长：(50μl体系)

3)用BioFlux PCR产物纯化试剂盒纯化PCR产物：

-将100μl PCR产物加入200μl Binding buffer混匀；

-将混合液全部转移到Spin Column里：

-6000g，离心1min，并弃去管内液体：

-向Spin Column内加入650μl Wash buffer。12000g，30-60s离心；

-重复上步操作一次；

-再次12000g离心1min，然后将Spin Column转移到无菌的1.5ml EP管中：

-向Spin Column内加42μl 50℃预热的Elution buffer，并于室温静置1min；

-于12000g离心1min；

-1.5％Agrose 100V TAE电泳证明EP管内液体溶有目的片段；

4)酶切纯化产物：50μl体系

5)质粒酶切：

6)用Biomed琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒胶回收酶切质粒和纯化产物

-配制1.5％ Agrose TAE回收片段凝胶

-将酶切样品与loading buffer染液分别全部加入回收凝胶孔中，100V TAE电泳30min

-在长紫外灯下，用干净刀片将所需回收的DNA条带切下，尽量切除不含DNA的凝胶

-将切下DNA条带凝胶放入1.5ml EP管中，称重：

-加三倍体积的溶胶液，即凝胶毫克数的三倍体积；

-56℃放置10mins，并每隔2-3mins震荡一次；

-将上部所得溶液加入吸附柱AC中，室温放置1min，12000g，1min离心，倒掉收集管中的废液；

-加入700μl WB(已加入无水乙醇)，12000g，1min离心，弃掉废液；

-加入500μl WB(已加入无水乙醇)，12000g，1min离心，弃掉废液；

-将吸附柱AC放回空1.5ml EP管中，12000g，2mins离心，尽量弃去漂洗液；

-取出吸附柱放入一个干净的EP离心管，在吸附膜中间部位加50μl 65℃预热的洗脱缓冲液EB，室温静置2mins，12000g，1min离心，得到溶液进行1.5％Agrose 100V TAE电泳30mins，验证得到纯的胶回收酶切片段

7)回收片段连接：10μl体系(设置对照)

8)连接体系转化Top10克隆感受态细菌

-将连接好的体系和50μlTop10克隆感受态细菌放置冰浴1min，

-将连接好的体系冰上加入到50μlTop10克隆感受态细菌，并用手指快速弹EP管混匀，立即放入冰浴30mins；

-42℃，90s热击混合液，并水浴中不断震荡；

-冰浴混合液2mins

-加入LB液体培养基各1ml，37℃，250R/min摇床摇50mins

-将菌液于6000rmp快速离心细菌，弃上清900μl，剩下管内液体用枪头将沉淀重悬

-吸取重悬液分别涂含氨苄的固体LB培养基平板，至液体全部被平板吸收

-倒扣平板37℃，孵箱过夜培养

9)挑单克隆培养

用无菌牙签挑单克降三个分别于5ml含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，250R/min摇床摇过夜

10)用Biomed高纯度质粒小量提取试剂盒抽提转化细菌质粒：

-取1.5-4.5ml过夜培养的细菌菌液，9000g，30s离心，弃掉上请，收集细菌沉淀

-加250μl已加入RNaseA的溶液P1重悬细菌沉淀，直至沉淀彻底悬浮

-加250μl溶液P2温和上下翻转4-7次使菌体充分裂解，室温放置4mins

-加350μl溶液P3立即温和上下翻转4-7次，冰上放置3-5mins，13000rmp离心1min，小心取上清

-将上步上清倒入吸附柱AC中，13000rmp离心1min，倒掉EP管中的废液；

-加入700μl已加入乙醇的漂洗液WB，12000rmp离心1min，倒掉EP管中的废液；

-加入500μl已加入乙醇的漂洗液WB，12000rmp离心1min，倒掉EP管中的废液；

-将吸附柱AC放回空EP管中，3000rmp离心2mins，尽量除去漂洗液；

-将吸附柱放入一个干净的无菌EP管中，在吸附膜中间部位加50μl 65℃预热的洗脱缓冲液EB，室温静置2mins，12000g，1min离心，得到溶液进行1.5％Agrose 100V TAE电泳30mins，验证得到抽提的质粒。

11)酶切鉴定重组质粒(10μl体系)

12)1.5％Agrose 100V TAE电泳30mins分析酶切片段

hRrp15p部分片段N150，C175和M43分别以同样方法通过PCR扩增并构建并以EcoRI-SalI为限制酶插入位点重组到哺乳动物pFLAG or pEGFP表达载体。

实施例2

hRrp15p的Δ228-232缺失突变表达载体用构建

1)设计引物上游：TTCACTTCAGTCTGTTTGGCGCTTGAAGCAGTCTCATTTG，下游：CAAATGAGACTGCTTCAAGCGCCAAACAGACTGAAGTGA；

2)扩增对照反应体系：(50μl体系)

3)扩增反应体系：(50μl体系)

4)PCR反应：

95℃30s

95℃30s

55℃1min

68℃6mins(1minute/kb of plasmid length)

18循环

5)取5ul反应液1％电泳样品检验结果

6)Dpn I消化PCR产物：加1μl DpnI限制酶(10U/μl)至样品管和对照管中，放入37℃，1hr孵育。

7)5ul等量对照和扩增产物转化感受菌TOP-10。

8)挑单克隆提取质粒。(La Jolla，CA).以上所有重组载体均经过基因测序验证。

实施例3

细胞培养及转染实验

1)于37℃、5％CO₂孵箱内用含10％FBS的RPMI-1640培养MCF 7细胞；

2)消化MCF7贴壁细胞，制备细胞悬液1～3×104/500μl移入24孔板各孔并于37℃、5％ CO₂孵箱内培养过夜；

3)501的RPMI-1640无血清培养基中分别加入0.5μg质粒和1μl Lipofectamine2000(Invitrogen，Inc.)，室温静置5分钟；

4)将上述两体系混合并室温静置20分钟；

5)将上步混合体系加入到相应细胞各孔培养，次日用于免疫荧光染色或蛋白免疫印迹实验。

实施例4

蛋白印迹杂交技术(Western Blot)

1)收取蛋白样品：用上样裂解缓冲液裂解转染的各MCF7细胞，于95℃加热5分钟；

2)用1ml针管反复吹打样品数次，快速离心。-20℃冻存或立即用于上样；

3)各样品于10％SDS-PAGE上样并30mA电泳1.5小时；

4)将SDS-PAGE胶在恒流400mA下转到PVDF膜上

5)5％脱脂牛奶封闭PVDF膜30分钟

6)去除脱脂牛奶并加入含兔抗hRrp15抗体(1∶2000)3％脱脂牛奶TBST溶液，室温摇床2小时；

7)去除含兔抗hRrp15抗体(1∶2000)3％脱脂牛奶TBST溶液，加入TBST洗膜5分钟3次；

8)加入dylight680羊抗兔1∶20000稀释的TBST溶液，室温摇床避光1小时；

9)去除dylight680羊抗兔1∶20000稀释的TBST溶液，加入TBST洗膜5分钟3次；

10)用odyssey检测并分析实验结果。

实施例5

细胞免疫荧光染色技术

1)甲醇∶丙酮(V∶V)＝1∶1固定细胞3分钟

2)PBS洗细胞，加入0.4％Triton X-100和10％羊血清的PBS溶液室温封闭20分钟

3)PBST(0.1％Triton X-100的PBS溶液)洗细胞5分钟×3次

4)加入兔抗hRrp15抗体1∶200稀释的PBST溶液室温孵育2小时

5)PBST(0.1％Triton X-100的PBS溶液)洗细胞5分钟×3次

6)加入羊抗兔-FITC抗体1∶200稀释的PBST溶液室温孵育2小时

7)PBST(0.1％Triton X-100的PBS溶液)洗细胞5分钟，并加入DAPI 1∶1000稀释的PBST溶液，室温孵育5分钟

8)PBST(0.1％Triton X-100的PBS溶液)洗细胞5分钟×3次

9)封片，并在荧光显微镜下观察。

实施例6

hRrp15p esiRNA文库制备

1)设计引物扩增目的片段PCR体外转录模板T7-115 3’UTR扩增引物：

上游引物：AGTTAATACGACTCACTATAGGGGTCATCCTCTGATAGTTGGGG

下游引物：AGTTAATACGACTCACTATAGGGAATCATATCTTCCAGATTACC

TTAATACGACTCACTATAGGG为T7promoter

以大肠癌细胞(95℃水浴后)LOVO cell line基因组为模板PCR扩增：(150μl分装三管各50μl)

上下游引物(10μM)各6μl

模板            8μl

Taq酶Mix        75μl

ddH2O           55μl

循环条件：95℃ 5mins，95℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 60s，32cycles，最后72℃延伸5mins

2)对PCR产物胶回收得到纯的体外转录模板目的片段(BioFlux琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒胶回收T7-115 3’UTR纯化产物，操作见说明书，提示加异丙醇步骤最好选做以提高回收率)，将纯化的片段溶于100μl高压三蒸水里并进行1.5％Agrose 75V TAE电泳30mins，验证得到纯的胶回收酶切片段

反应后75℃煮5mins-室温放置20mins-加10μlDNase I 37℃水浴作用60mins

4)LiCl沉淀dsRNA：

①T7-115 3’UTR体外转录200μl体系加入600μl 7.5M LiCl 0.5mM EDTA溶液混匀，于-20℃放置2hr或过夜

②13.2krmp，4℃离心20mins，用枪头轻轻吸取上清并弃掉

③加入冷的75％乙醇13.2krmp，4℃离心20mins洗沉淀，轻轻吸弃上清

④60℃烘箱烘干沉淀

⑤加入150μl高压三蒸水溶解沉淀

⑥1.5％Agrose 100V TAE电泳30mins，设置对照验证得到纯化转录片段

5)选定最佳GST-RNaseIII酶切条件大量制备esiRNA：各20μl体系，共70管

T7-115 3’UTR dsRNA   1μl

10X buffer            2μl

GST-RNaseIII          0.5μl

高压三蒸水            16.5μl

37℃作用1hr后终止反应

4％低熔点琼脂糖TBE 50V 1hr电泳T7-115 3’UTR esiRNA。

6)Phenol/chl抽提纯化esiRNA：

①将70管各反应体系混合一起，并加入等体积的Phenol/chl抽提混合液1400μl，漩涡混合器充分混匀；

②将混合液分装为4管13600rmp，4℃离心10mins，小心取其上层液(注意不要吸入下层液)至新的EP管中，约各管350μl；

③各管加入40μl 3M NaAC以及3.5倍体积冷无水乙醇，充分混匀，并冰浴10mins13600rmp，4℃离心30mins；

④吸弃上清加入1ml 75％乙醇13600rmp，4℃离心30mins；

⑤吸弃上清，并于60℃烘箱烘干沉淀；

⑥将各管沉淀用35μl高压三蒸水溶解，并测其浓度。

实施例7

肿瘤细胞凋亡检测(Annexin V、Hoechsst 33342、PI均购自上海碧云天公司)

1，种细胞于放有多聚赖氨酸处理的载玻片的24孔板，每孔1万/500微升，37℃，5％CO₂孵箱中过夜培养；

2，100nM hRrp15 esiRNA转染细胞，以无血清培养基DMEM做空白对照，100nM nonsensesiRNA作阴性对照，培养三天；

3，2000rpm×5mins，室温离心24孔板；

4，去除培养基，加入500μl PBS/孔，2000rpm×5mins，室温离心24孔板，洗细胞；

5，加入染料混合液(Annexin V-FITC 1∶500、Hoechsst333451∶1000、PI 1∶1000的Annexin V binding buffer溶液)各250μl/孔，37℃静置30mins；

6，取出载玻片于荧光显微镜下直接观察，并采图和统计各处理组三个视野下的细胞总数，早、晚期凋亡细胞数。

Claims (5)

1.人核糖体蛋白分子hRrp15p特异核苷酸，所述核苷酸包含：

a)SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列或者其互补DNA序列；

b)上述a)中缺失、替换或插入一个或多个碱基、仍具有所述核苷酸功能的核苷酸序列；所述的SEQ ID NO：1所示的核苷酸，全长为849个碱基。

2.权利要求1所述人核糖体蛋白分子hRrp15p特异核苷酸，其所对应的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；具有282个氨基酸。

3.一种真核细胞表达质粒，其特征在于含有权利要求1所述人核糖体蛋白分子hRrp15特异核苷酸，各功能区的真核细胞表达质粒如Figure 3A所示。

4.权利要求1所述人核糖体蛋白分子hRrp15p在制备核仁素的核仁定位方面的应用，其中hRrp15p的核仁定位序列为第228至232氨基酸RKKPK。

5.权利要求1所述人核糖体蛋白分子hRrp15p作为核仁素的核仁定位在制备抑制肿瘤细胞增殖药物方面的应用。

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