CN118086404A - 重组慢病毒Lenti-shRRP15的制备和特异性应用杀伤神经胶质瘤细胞 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及重组慢病毒Lenti‑shRRP15的制备和特异性应用杀伤神经胶质瘤细胞。以一种siRNA序列为靶点的shRRP15引物进行化学合成，将引物等比例混和退火后，得到shRRP15序列，使用引物对慢病毒质粒pLKO.1进行PCR扩增，并进行琼脂糖凝胶回收，使用无缝克隆试剂盒连接shRRP15和质粒pLKO.1，得到慢病毒载体质粒pLKO‑shRRP15，应用细胞转染试剂盒SuperFect转染慢病毒质粒pLKO‑shRRP15和辅助载体质粒共转染293T细胞，细胞转染12小时后，更换细胞培养液；细胞培养24小时后，收集细胞培养上清，细胞继续培养24小时，再次收集细胞培养上清，离心收集病毒浓缩液，得到重组慢病毒Lenti‑shRRP15，利用慢病毒作为载体感染神经胶质瘤细胞，以核仁蛋白分子RRP15作为特异性抗肿瘤治疗的靶标，制备慢病毒Lenti‑shRRP15制剂进行神经胶质瘤治疗，具有高效、高特异、低副作用等巨大优势。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及重组慢病毒Lenti-shRRP15的制备和特异性应用杀伤神经胶质瘤细胞。
背景技术
核糖体RNA加工蛋白RRP15是一种参与核糖体RNA加工的蛋白质，核糖体RNA加工是指在核糖体合成过程中，对核糖体RNA进行修饰和加工的过程，RRP15在这一过程中起到了重要的作用，它参与了核糖体RNA的修饰和加工，确保核糖体的正常合成和功能，核仁蛋白RRP15对核糖体大亚基的成熟至关重要，抑制细胞内RRP15的表达，导致肿瘤细胞死亡，而正常细胞仅发生周期阻滞，间歇性抑制细胞内RRP15基因表达，最终导致所有肿瘤细胞死亡，相反不影响正常细胞的生长，因此，核仁蛋白RRP15可以作为特异性抗肿瘤治疗的靶标；
目前尚不清楚核糖体RNA加工蛋白RRP15与神经胶质瘤之间是否存在直接的关联，然而，生物信息学研究显示RRP15在神经胶质瘤发生和发展中可能起到重要的作用，RRP15蛋白的异常表达与神经胶质瘤的发生和预后密切相关，因此，进一步研究核糖体RNA加工蛋白RRP15与神经胶质瘤之间的关系可能有助于我们更好地理解神经胶质瘤的发生机制，并为其治疗提供新的靶点；
慢病毒治疗是一种基因治疗方法，可以用于治疗神经胶质瘤，神经胶质瘤是一种恶性肿瘤，通常难以完全切除，并且对传统的放疗和化疗方法反应有限，慢病毒治疗利用慢病毒作为载体，将特定的基因导入肿瘤细胞中，以达到治疗的目的，这些基因可以通过不同的机制来抑制肿瘤细胞的生长和扩散，或者增强免疫系统对肿瘤的攻击能力，慢病毒治疗的优势在于它可以通过基因导入来实现针对性治疗，避免了传统治疗方法对正常细胞的损伤，此外，慢病毒治疗还可以通过改变肿瘤细胞的基因表达，使其对传统治疗方法更敏感，然而，慢病毒治疗也存在一些挑战和风险，首先，慢病毒治疗需要有效地将基因导入肿瘤细胞中，这可能受到肿瘤组织的限制和免疫系统的排斥，其次，慢病毒治疗可能引起免疫反应，导致治疗效果不佳或不可预测的副作用，总的来说，慢病毒治疗是一种有潜力的治疗神经胶质瘤的方法，但仍需要进一步的实验室基础研究和临床实践来验证其安全性和有效性。
发明内容
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
重组慢病毒Lenti-shRRP15的制备，其特征在于一种靶向RRP15基因的siRNA序列为5’-CCAGAATCTGCAAGTGACTCTGATA-3’(844—869碱基)；重组慢病毒Lenti-shRRP15的制备步骤为：
1)设计以上述siRNA序列为靶点的shRRP15引物，并进行化学合成：
引物1:5’
-GATAGAGACACCGGTGTGCCAGAATCTGCAAGTGACTCTCTCGAGAGAGTCACTTGCAGATTCTGGTTTTTGTAGAATTCTC-3’；
引物2:5’
-GAGAATTCTACAAAAATCTCAGTGAACGTCTAAGACCCTCGAGGGTCTTAGACGTTCACTGAGACACACCGGTGTCTCTATC-3’；
2)将上述2个引物等比例混和退火后，得到shRRP15序列；
3)使用下述引物对慢病毒质粒pLKO.1进行PCR扩增，并进行琼脂糖凝胶回收；
引物1：5’-TTTTTGTAGAATTCTC-3’；
引物2：5’-CACACCGGTGTCTCTATC-3’；
4)使用无缝克隆试剂盒连接shRRP15和质粒pLKO.1，得到慢病毒载体质粒pLKO-shRRP15；
5)应用细胞转染试剂盒SuperFect转染慢病毒质粒pLKO-shRRP15和辅助载体质粒(pMD2.G和psPAX2)共转染293T细胞(各质粒质量比3：2：2)；细胞转染12小时后，更换细胞培养液；
6)细胞培养24小时后，收集细胞培养上清；
7)细胞继续培养24小时，再次收集细胞培养上清，离心收集病毒浓缩液，得到重组慢病毒Lenti-shRRP15。
2.所述重组慢病毒Lenti-shRRP15在杀伤神经胶质瘤细胞的特异性应用。本发明的有益效果：
本发明利用慢病毒(lentivirus)作为载体感染神经胶质瘤细胞，以核仁蛋白分子RRP15作为特异性抗肿瘤治疗的靶标，制备慢病毒Lenti-shRRP15制剂进行神经胶质瘤治疗，具有高效、高特异、低副作用等巨大优势。
附图说明
图1为本发明设计高效抑制RRP15基因表达的siRNA序列示意图；
图2为本发明重组慢病毒Lenti-shRRP15抑制神经胶质瘤细胞U87MG和正常细胞RPE1内RRP15蛋白的表达的示意图；
图3为本发明重组慢病毒Lenti-shRRP15对神经胶质瘤细胞的特异性杀伤作用示意图；
图4为本发明重组慢病毒Lenti-shRRP15抑制神经胶质瘤在裸鼠体内生长每周记录裸鼠内肿瘤体积大小记录图；
图5为本发明重组慢病毒Lenti-shRRP15抑制神经胶质瘤在裸鼠体内生长中肿瘤组织的体积、重量检测图；
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明的描述中，需要说明的是，术语“中心”、“上”、“下”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”、“第三”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。此外，下面所描述的本发明不同实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合。
实施例1
1.设计高效抑制RRP15基因表达的siRNA序列
1)使用BLOCK-iTTMRNAi Designer软件，搜索靶向RRP15基因的siRNA序列，并筛选最高分值靶向序列。选取前3个序列，设计siRNA并进行合成；
I 5’-CCAAACAGACTGAAGTGAAATCAGA-3’(722—747碱基)
II 5’-CAAACAGACTGAAGTGAAATCAGAA-3’(723—748碱基)
III 5’-CCAGAATCTGCAAGTGACTCTGATA-3’(844—869碱基)
2)使用细胞转染试剂Lipo8000,分别转染上述3个siRNA至神经胶质瘤细胞株U87MG；
3)结果显示，III号siRNA抑制RRP15基因表达效果最佳。后续选择以III号序列为靶点构建敲降RRP15表达的慢病毒。
2.重组慢病毒Lenti-shRRP15的制备
1)设计以上述III号序列为靶点的shRRP15引物，并进行化学合成：
引物1:5’
-GATAGAGACACCGGTGTGCCAGAATCTGCAAGTGACTCTCTCGAGAGAGTCACTTGCAGATTCTGGTTTTTGTAGAATTCTC-3’；
引物2:5’
-GAGAATTCTACAAAAATCTCAGTGAACGTCTAAGACCCTCGAGGGTCTTAGACGTTCACTGAGACACACCGGTGTCTCTATC-3’；
2)将上述2个引物等比例混和退火后，得到shRRP15序列；
3)使用下述引物对慢病毒质粒pLKO.1进行PCR扩增，并进行琼脂糖凝胶回收；
引物1：5’-TTTTTGTAGAATTCTC-3’；
引物2：5’-CACACCGGTGTCTCTATC-3’；
4)使用无缝克隆试剂盒连接shRRP15和质粒pLKO.1，得到慢病毒载体质粒pLKO-shRRP15；
5)应用细胞转染试剂盒SuperFect转染慢病毒质粒pLKO-shRRP15和辅助载体质粒(pMD2.G和psPAX2)共转染293T细胞(各质粒质量比3：2：2)；细胞转染12小时后，更换细胞培养液；
6)细胞培养24小时后，收集细胞培养上清；
7)细胞继续培养24小时，再次收集细胞培养上清，离心收集病毒浓缩液，得到重组慢病毒Lenti-shRRP15。
3.重组慢病毒Lenti-shRRP15抑制神经胶质瘤细胞U87MG和正常细胞RPE1内RRP15蛋白的表达
1)体外培养神经胶质瘤细胞U87MG和正常二倍体非转化细胞RPE1；
2)以1:100比例稀释病毒液加入上述细胞，培养2天；
3)收集细胞，裂解后进行蛋白电泳，转膜后应用特异性面抗RRP15抗体进行Western Blot。
结果显示RRP15蛋白在细胞内的表达发生抑制。
4.重组慢病毒Lenti-shRRP15对神经胶质瘤细胞的特异性杀伤作用
1)以1:100比例稀释病毒液分别神经胶质瘤细胞U87MG和正常细胞RPE1；
2)3天后，收集细胞，进行70％乙醇固定，ANNEXIN V-PI共染色后应用流式细胞仪检测分析细胞凋亡情况。
结果显示，重组慢病毒Lenti-shRRP15感染导致神经胶质瘤细胞发生凋亡，相反正常细胞没有明显死亡。
5.重组慢病毒Lenti-shRRP15抑制神经胶质瘤在裸鼠体内生长
1)收集1×106神经胶质瘤细胞，植入裸鼠腋窝皮下；
2)2周后，在神经胶质瘤细胞成瘤部位注射Lenti-shRRP15病毒液(以正常生理盐水作为对照)；
3)继续饲养小鼠2周，每周记录裸鼠内肿瘤体积大小；
4)处死小鼠，取出肿瘤组织，进行体积、重量检测。
结果显示，重组慢病毒Lenti-shRRP15显著抑制神经胶质瘤的生长。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本发明提到的各个部件为现有领域常见技术，本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (2)
1.重组慢病毒Lenti-shRRP15的制备，其特征在于一种靶向RRP15基因的siRNA序列为5’-CCAGAATCTGCAAGTGACTCTGATA-3’(844—869碱基)；重组慢病毒Lenti-shRRP15的制备步骤为：
1)设计以上述siRNA序列为靶点的shRRP15引物，并进行化学合成：
引物1:5’
-GATAGAGACACCGGTGTGCCAGAATCTGCAAGTGACTCTCTCGAGAGAGTCACTTGCAGATTCTGGTTTTTGTAGAATTCTC-3’；
引物2:5’
-GAGAATTCTACAAAAATCTCAGTGAACGTCTAAGACCCTCGAGGGTCTTAGACGTTCACTGAGACACACCGGTGTCTCTATC-3’；
2)将上述2个引物等比例混和退火后，得到shRRP15序列；
3)使用下述引物对慢病毒质粒pLKO.1进行PCR扩增，并进行琼脂糖凝胶回收；引物1：5’-TTTTTGTAGAATTCTC-3’；
引物2：5’-CACACCGGTGTCTCTATC-3’；
4)使用无缝克隆试剂盒连接shRRP15和质粒pLKO.1，得到慢病毒载体质粒pLKO-shRRP15；
5)应用细胞转染试剂盒SuperFect转染慢病毒质粒pLKO-shRRP15和辅助载体质粒(pMD2.G和psPAX2)共转染293T细胞(各质粒质量比3：2：2)；细胞转染12小时后，更换细胞培养液；
6)细胞培养24小时后，收集细胞培养上清；
7)细胞继续培养24小时，再次收集细胞培养上清，离心收集病毒浓缩液，得到重组慢病毒Lenti-shRRP15。
2.根据权利要求1中所述的重组慢病毒Lenti-shRRP15在杀伤神经胶质瘤细胞的特异性应用。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| CN202410117883.8A CN118086404A (zh) | 2024-01-29 | 2024-01-29 | 重组慢病毒Lenti-shRRP15的制备和特异性应用杀伤神经胶质瘤细胞 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410117883.8A CN118086404A (zh) | 2024-01-29 | 2024-01-29 | 重组慢病毒Lenti-shRRP15的制备和特异性应用杀伤神经胶质瘤细胞 |
Publications (1)
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2024
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