CN104946667A - 一种柔嫩艾美尔球虫tert相关蛋白基因及医用用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种柔嫩艾美尔球虫TERT相关蛋白基因，特别涉及该蛋白在端粒酶活性调节中的作用，该蛋白对于E. tenella端粒酶活性具有负向调节的作用，为深入研究球虫的细胞和分子生物学特性以及寻找新的防治鸡球虫的药物和疫苗作用靶位等开辟了新的研究领域。本发明具有高效性及实用性的优点，通过酵母双杂交筛选和验证可以获得多个阳性互作蛋白，便于发现新功能蛋白，并且该方法相对于比较分析法、蛋白组学、转录组学等技术更为成熟和益于操作。E. tenella病毒转染载体介导核酶为研究基因在虫体内的功能提供了一种简单易行的方法。

Description

一种柔嫩艾美尔球虫TERT相关蛋白基因及医用用途

技术领域

本发明提供了一种柔嫩艾美尔球虫TERT相关蛋白基因，特别涉及该蛋白在端粒酶活性调节中的作用，该蛋白对于E. tenella端粒酶活性具有负向调节的作用，可能成为控制球虫病的潜在靶点，属于基因工程技术领域。

背景技术

    鸡球虫病是一种呈世界性分布，严重危害养鸡业发展的寄生虫病。艾美耳球虫作为细胞内寄生虫，寄生于鸡肠道内引起是由以肠道病变为主要特征的鸡球虫病并严重危害养禽业的发展。目前控制球虫病还是主要依赖抗球虫药和疫苗的使用，但由于对球虫的细胞和分子生物学等缺乏详尽的了解，迄今尚无理想的控制鸡球虫病的药物和疫苗。因此，寻找新的药物和疫苗靶位防治鸡球虫病成为当前研究的主流。端粒酶及相关蛋白的发现为深入研究球虫的细胞和分子生物学特性以及寻找新的防治鸡球虫的药物和疫苗作用靶位等开辟了新的研究领域。目前，柔嫩艾美尔球虫（E. tenella）TERT序列已经成功克隆出来，而端粒-like序列已被预测出来。这些表明E. tenella利用传统的端粒酶机制合成其端粒DNA维持染色体末端的稳定。但关于E. tenella TERT相关蛋白及功能尚未见报道。

发明内容

本发明提供了一种柔嫩艾美尔球虫TERT相关蛋白基因，为一种E. tenella TERT互作蛋白14-3-3基因，该基因编码的蛋白对于E. tenella端粒酶活性具有负向调节的作用，可能成为控制球虫病的潜在靶点，为球虫病的防治提出新的策略。

本发明所述的一种柔嫩艾美尔球虫TERT相关蛋白基因，如SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 2所示。

该基因编码的蛋白是利用酵母双杂交的方法通过TERT蛋白对E. tenella的cDNA文库进行筛选，获得与TERT有相互作用的蛋白，并通过pull-down的方法进行阳性验证，从而筛选得到与TERT蛋白相互作用的E. tenella蛋白基因。利用E. tenella病毒载体介导的核酶干扰互作蛋白基因在球虫体内的表达，从而研究该基因编码的蛋白在E. tenella体内的功能。

本发明所述的一种柔嫩艾美尔球虫TERT相关蛋白基因的制备方法，包括以下步骤：

（1）TERT片段的克隆和鉴定：从E. tenella cDNA中通过PCR获得TERT序列，与pMD18-T连接后转化至宿主菌中克隆扩增，再通过双酶切及序列测定分析鉴定目的片段；

（2）含有外源目的片段的重组诱饵质粒的构建：回收目的片段，与酶切后的pGBKT7载体连接，并转入大肠杆菌中，筛选阳性克隆，即得到可表达融合蛋白的重组质粒；

（3）将重组诱饵质粒转化入酵母菌株，并进行表达产物、毒性及自激活鉴定；

（4）用酵母双杂交的方法筛选E. tenella cDNA文库中与TRBD相互作用的候选蛋白；

（5）用pull-down的方法进一步验证阳性互作蛋白，从而筛选得到与E. tenella TERT相互作用的蛋白。将TERT基因和候选蛋白基因分别构建到pET-32a和pGEX-4T-1载体上，在BL21(DE3)感受态中诱导表达并纯化可溶性蛋白。将纯化的两种蛋白共孵育，并加入蛋白A磁珠沉淀，最后通过Western blot分析阳性互作的结果；

（6）设计合成针对互作蛋白基因的的锤头状核酶并连接到E. tenella病毒载体上，对该基因切割效率进行体内和体外试验；

（7）TRAP法检测转染株端粒酶活性。

本发明的积极效果在于：

提供一种E. tenella TERT互作蛋白基因，并进行其功能的研究，为深入研究球虫的细胞和分子生物学特性以及寻找新的防治鸡球虫的药物和疫苗作用靶位等开辟了新的研究领域。本发明具有高效性及实用性的优点，通过酵母双杂交筛选和验证可以获得多个阳性互作蛋白，便于发现新功能蛋白，并且该方法相对于比较分析法、蛋白组学、转录组学等技术更为成熟和益于操作。E. tenella病毒转染载体介导核酶为研究基因在虫体内的功能提供了一种简单易行的方法。

附图说明

附图1为pGBKT7-TRBD双酶切鉴定电泳图；

附图2为Western blot鉴定重组pGBKT7-TRBD蛋白在Y187中的表达；

附图3为重组诱饵蛋白对酵母菌毒性及自激活作用的检测；

附图4为α-半乳糖苷酶试验检测TRBD与候选蛋白相互作用；

附图5为SDS-PAGE鉴定His-TRBD和GST-14-3-3纯化效果图；

附图6为pull-down验证TRBD与14-3-3间相互作用；

附图7为E. tenella病毒载体介导的锤头状核酶体外切割效率检测中重组质粒模式图；

附图8为建立的14-3-3-sub标准曲线。

附图9为E. tenella病毒载体介导的锤头状核酶对14-3-3-sub体外切割效果检测；

附图10为RFP在E. tenella中的表达情况；

附图11为流式细胞术检测和分选RFP-Ham-14-3-3株；

附图12为Western blot鉴定各虫株14-3-3表达水平变化；

附图13为TRAP检测各虫株中端粒酶活性的变化。

具体实施方式

为进一步说明本发明在艾美耳属球虫TERT相关蛋白中的应用，以TERT RNA结合域（TRBD）为实施例进行说明。

实施例1：

E. tenella TRBD诱饵表达质粒的构建

一、材料

    Trizol（Invitrogen)；反转录酶试剂盒（Tiangen）；T4 DNA连接酶、Ex Taq、dNTPs、pMD18-T、EcoR I、BamH I（TaKaRa）。

二、方法与结果

1 E. tenella孢子化卵囊总RNA提取

    1.1 器皿的处理：将研钵、研杵洗涤干净后，浸泡在0.1% DEPC-H₂O中过夜。随后用锡纸包好，180℃干烤3h备用；

    1.2 收集的E. tenella孢子化卵囊液氮研磨20min，加入1mL Trizol，室温裂解5min；

    1.3 加入200μL氯仿，混匀，室温放置15min，12000g、4℃离心15min；

    1.4 吸取上层约600μL RNA转移至新的离心管，加入500μL异丙醇，混匀，室温放置15min，12000g、4℃离心15min；

    1.5 去上清，沉淀用75%乙醇洗涤，12000g，4℃离心15min；

    1.6去上清，离心管放入超净台内风干5min。RNase-free ddH₂O溶解沉淀。琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的质量，显示总RNA提取的质量较好。

    2 E. tenella cDNA的合成

10μL RNA和2μL Oligo(dT)₁₅混匀，65℃水浴5min，随后置于冰上2min。加入下列混合物：

    42℃水浴1h，75℃ 10min灭活反转录酶。

3 pGBKT7-TRBD质粒的构建

    3.1 PCR扩增目的基因：根据目的基因设计特异引物，并在上下游引物中分别添加了EcoR I和BamH I 酶切位点。F-TRBD-BK 5’-GAATTCATTACAAGTACTAGAGTAGTAAATT-3’（斜体为EcoR I酶切位点）,下游R-TRBD-BK 5’-GGATCCTCCTTTTAAACTTTCTAGATAC-3’（斜体为BamH I酶切位点）。引物由上海生物工程技术服务公司合成。

以cDNA为模板，进行PCR，PCR体系如下：

反应参数为：95℃ 5min；94℃ 45sec，55℃ 30sec，72℃ 30sec，30 cycles；72℃ 10min。

3.2 目的片段与pMD18-T连接：回收的PCR产物与pMD18-T载体连接，4℃过夜，连接反应体系如下：

3.3 重组克隆质粒的酶切鉴定：将10μL连接产物加入DH5ɑ感受态中，取100μL菌液均匀涂布于含Amp⁺的LB固体培养基上。从LB固体平板上挑取单个克隆置于含50μg/mL Amp⁺的LB液体培养基中，过夜培养。经序列测定获得阳性重组质粒。

3.4 重组诱饵质粒pGBKT7-TRBD的构建

测序正确的克隆质粒以及载体pGBKT7分别经BamH I/EcoR I双酶切后凝胶回收。回收的目的片段和载体片段4℃连接过夜后转化DH5ɑ感受态细胞。经双酶切和序列测定获得阳性重组诱饵质粒（见附图1）。连接体系如下：

。

实施例2：

重组诱饵蛋白对酵母菌株毒性及自激活作用的检测

    一、材料

    X-α-GAL、鲑鱼精DNA（Sigma）；酵母氮源（Biosharp）；c-Myc（Epitomics）；ECL化学发光试剂盒（Thermo）；酵母质粒小提试剂盒（Tiangen）。

二、方法与结果

    1 Y187酵母感受态的制备及重组诱饵质粒pGBKT7-TRBD的转化

    1.1 将冻存的Y187细胞平板划线，30℃温箱培养3~4d至长出直径2~3mm的单克隆；

    1.2 挑取Y187酵母单克隆细胞，接入含10mL YPDA液体培养基的50mL锥形瓶中，并吹打均匀，30°C，210r/min震荡培养至OD₆₀₀>1.5；取4~5mL酵母菌接入50mL YPDA液体培养基中，30°C，210r/min振荡培养至OD₆₀₀=0.4~0.6；

    1.3 50mL离心管收集酵母菌液，700g室温离心5min，弃上清；加入25~50mL ddH₂O重悬洗涤酵母沉淀细胞，700g离心5min，去上清，重复洗涤一次；用1.5mL 1×TE/LiAc（10×TE 150uL，10×LiAc 150uL，ddH₂O 1.20mL）重悬沉淀，重悬液即为酵母感受态细胞；

1.4 转化质粒与鲑鱼精DNA置于1.5mL离心管中，混匀；

组分	用量
		pGBKT7-TRBD/pCL 1/pGBKT7	10μL（约2μg）
鲑精DNA（10μg/μL）	10μL

新鲜配制的鲑精DNA需要水浴煮沸20min并且冰浴后使用；

1.5 每管加入100uL酵母感受态细胞，振荡混匀；

1.6 各加入600uL PEG/LiAc（10×TE 60uL，10×LiAc 60uL，50%PEG 480uL），为了提高转化效率，混合物需剧烈震荡，30°C，210r/min振荡培养30min；

1.7 加入70uL DMSO，缓慢倒置混匀(不能振荡)，42°C水浴15min，迅速插入冰浴冷却1~2min；

1.8 室温离心12000g，5sec，尽量弃尽上清，以0.5mL 1×TE（10×TE 50uL，ddH₂O 450uL）重悬沉淀细胞，取100uL涂布相应的固体培养板，30°C倒置培养3d待菌落长出。

    2 重组诱饵蛋白表达的鉴定

2.1 诱饵菌株酵母蛋白的提取

挑取SD/-Trp琼脂板上的单个酵母菌，接种于5mL SD/-Trp液体培养基中，30℃，210r/min振荡培养2~3d；收集酵母菌液，提取酵母蛋白，方法参照上海生工生物工程股份有限公司酵母蛋白提取试剂盒。

2.2 酵母蛋白的Western blot分析

SDS-PAGE分离酵母蛋白后，凝胶放入半干转膜仪中转膜，转膜结束后，将PVDF膜放入封闭液中，37℃封闭2h；将膜置于1:2000稀释的c-Myc单抗中，4℃孵育过夜；TBST洗涤PVDF膜，洗涤3次，每次10min；洗涤后的PVDF膜与二抗孵育（羊抗兔HRP-IgG，1：2000稀释），37℃孵育45min；孵育结束后，TBST洗膜，洗涤4次，每次15min；ECL化学发光试剂显色表明转化重组质粒的酵母蛋白能在20kDa左右检测到目的条带，而对照组无条带出现（见附图2）。

3 E. tenella TRBD对酵母菌株毒性

比较分别转化pGBKT7-TRBD和pGBKT7后的酵母大小，二者无明显差异，表明诱饵蛋白对酵母无毒性作用（见附图3）。

4 E. tenella TRBD对酵母菌株自激活作用的检测

挑取转化pGBKT7-TRBD和阳性对照pCL1的酵母菌落分别点种于SD/-Trp/X-α-gal和SD/-Leu/X-α-gal琼脂糖平板，30°C温箱培养。结果显示试验组酵母菌落无显色现象，证明诱饵蛋白无法产生自激活活性（见附图3）。

实施例3：

TRBD相互作用蛋白的筛选

一、材料

-Trp/-His/-Leu DO Supplement、-Trp/-His/-Leu/-Ade DO Supplement（Clontech）。

二、方法与结果

1 酵母双杂交cDNA文库中筛选与TRBD相互作用的蛋白

1.1 挑取转化pGBKT7-TRBD的Y187单克隆于50mL SD/-Trp液体培养基；

1.2 30℃，270r/min摇床培养至OD₆₀₀>0.8(16~20h)，常温离心700g，5min，弃上清；

1.3 重悬沉底，并用细胞计数板计数，调整细胞浓度≥1×10⁸细胞/mL；

1.4 混合5mL诱饵菌Y187和1mL文库AH109细胞（≥2×10⁷细胞）在一个1L的无菌烧锥形瓶中；

1.5 在锥形瓶中加入45mL 2×YPDA液体培养基（含Kan⁺ 50μg/mL），文库管用1mL 2×YPDA洗涤2次，洗涤液加入锥形瓶中；

1.6 30℃恒温摇床30~50r/min，培养20~24h；

 1.7 培养20h时，取一滴杂交液在显微镜下查看杂交结果，若杂交液中有三叶草或米老鼠型的杂合子出现则可停止培养，若无则继续培养至杂合子出现4h；

 1.8 室温1000g离心10min，弃上清。同时用50mL Mili-Q水洗涤锥形瓶2次，并重悬沉淀细胞；

 1.9 室温1000g离心10min，弃上清。用10mL Mili-Q水重悬细胞；

1.10 将细胞用玻璃珠涂布于90mm SD/-His/-Trp/-Leu固体培养基上，每板200μL，30℃恒温培养直至克隆出现；

 1.11 复制生长在SD/-His/-Trp/-Leu的克隆到SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp培养基上，30°C培养3~8d；

 1.12 复制SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp克隆到SD/–Ade/–His/–Leu/–Trp/X-α-Gal培养基上并在30°C下生长2~4d。pGBKT7-53/pGADT7-T和pGBKT7-lam/pGADT7-T分别为阳性和阴性对照组。试验组和阳性对照组克隆为蓝色，且阴性对照培养板菌落不生长不显色，初步判断获得的克隆为阳性克隆（见附图4）。

2 阳性酵母质粒DNA的提取及转化

挑取显蓝色的酵母克隆接种于5mL SD/-Leu液体培养基，30°C，210r/min振荡培养1~2d，使其丢失pGBKT7-TRBD质粒；收集5mL酵母菌，3000g离心2min，弃上清；根据天根公司酵母质粒小提试剂盒说明书，采用玻璃珠法提取酵母质粒。将所提蓝斑质粒转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，挑取生长的阳性菌液克隆送至公司测序。将测序结果的基因序列经NCBI上Blast比对，初步证明了14-3-3是一个E. tenella TERT互作蛋白，本研究中E. tenella 14-3-3与LS18 E. tenella 14-3-3 (GenBank: AF055715.1)的核酸同源性为86%，氨基酸同源性为97%。核酸序列见序列表1，氨基酸序列见序列表2。

实施例4

柔嫩艾美尔球虫TERT相关蛋白基因蛋白可以根据传统的制备工艺制备新的防治鸡球虫病的药物和疫苗。

试验例1：

阳性互作蛋白pull-down验证

 一、材料

anti-His单克隆抗体、anti-GST单克隆抗体（Tiangen）；蛋白A磁珠（Millipore）；蛋白酶抑制剂片剂（Roche）；可溶型Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒、GST琼脂糖凝胶。

二、方法与结果

1 引物合成及PCR扩增目的基因

根据TRBD序列设计特异引物，F-TRBD-32a 5‘-GGATCCGACATCAAGACTCTTCGGGA-3‘（斜体为BamH I酶切位点），R-TRBD-32a 5‘-CTCGAGTCCTTTTAAACTTTCTAGATAC-3‘（斜体为XhoI酶切位点）；根据14-3-3基因设计特异引物，F-14-3-3-4T 5‘-GGATCCGACATCAAGACTCTTCGGGA-3‘（斜体为BamH I酶切位点），R-14-3-3-4T 5‘-GTCGACCTGTTGCTCAGTAGCCTCCA-3‘（斜体为Sal I酶切位点）。引物由上海生物工程技术服务公司合成。

2 重组表达质粒pET-32a-TRBD和pGEX-4T-14-3-3的构建

通过PCR方法扩增TRBD片段，其大小为516bp，回收该DNA后连接pMD18-T克隆载体，载体构建完成后经双酶切鉴定及测序比对后确定该基因的克隆载体构建成功后，再将该基因与pET-32a载体连接，构建表达质粒pET-32a-TRBD。

通过PCR方法扩增名称为14-3-3的目的基因，其大小为834bp，回收该DNA后连接pMD18-T克隆载体，载体构建完成后经双酶切鉴定及测序比对后确定该基因的克隆载体构建成功后，再将该基因与pGEX-4T-1载体连接，构建表达质粒pGEX-4T-14-3-3。

3 重组蛋白的诱导表达

取pET-32a-TRBD和pGEX-4T-14-3-3分别转化入BL21（DE3）感受态，加IPTG至终浓度1mM。His-TRBD重组蛋白诱导表达条件为：25^oC，过夜；GST-14-3-3重组蛋白诱导表达条件为：37^oC，5h。8000r/min离心5min收集菌体。

4 重组蛋白的鉴定

将收集的菌液加入800μL PBS，95%功率超声5min，12000g离心5min，分离上清及沉淀进行SDS-PAGE分析，结果表明二者均能用可溶性的形式表达。

5 重组蛋白的纯化

 200mL LB培养基中加入2mL菌液，37^oC 180r/min振荡培养3h，加IPTG至终浓度1mM诱导表达蛋白。8000r/min离心5min收集菌体。

His-TRBD纯化：每100mg菌体（湿重）加入3mL细菌裂解液，95%功率冰上超声裂解菌体至菌液变清；12000g，4℃离心20min，收集上清中的可溶性蛋白；用Binding Buffer将菌体裂解液等倍稀释后上柱并收集流穿液；使用15倍柱体积的Binding Buffer冲洗柱子，洗去杂蛋白；使用Elution Buffer洗脱，收集洗脱液即蛋白。

GST-14-3-3纯化：10mL冰上预冷的1×PBS重悬沉淀，冰上超声破碎菌体至透明状；12000g，4℃离心20min，收集上清中的可溶性蛋白；PBS平衡层析柱，然后加入含目的蛋白的上清，以使目的蛋白与琼脂糖凝胶结合；上样完成后，20倍柱床体积的PBS洗涤凝胶以去除杂蛋白；用10~15倍柱床体积的洗脱缓冲液洗脱GST融合蛋白，并分管收集（GST标签蛋白以相同方法纯化，做对照试验）。

SDS-PAGE分析表明纯化蛋白效果较好，可用于后续试验（见附图5）。

6 pull-down

 6.1 1.5mL离心管中加入20μL蛋白A磁珠，置入磁力架中，lysis buffer洗涤3次；

 6.2 lysis buffer中加入His-TRBD、GST-14-3-3蛋白，并加入蛋白酶抑制剂，4℃摇床孵育过夜。阴性对照组中加入His-TRBD和GST；

 6.3 在混合液中加入预处理的蛋白A磁珠、anti-His单抗和羊抗鼠HRP-IgG，4℃孵育2h；

6.4 lysis buffer洗涤蛋白A磁珠3次；

6.5 加入30μL 1×SDS-loading buffer，沸水煮5min以分离蛋白；

6.6 Western blot分析结果。试验组的Western blot分析，anti-His和anti-GST标签分别能检测到His-TRBD与GST-14-3-3，表明二者有相互作用。而对照组His-TRBD/GST中，Western blot无法检测到GST蛋白，表明GST标签蛋白不能与His-TRBD结合（见附图6）。

试验例2：

E. tenella病毒载体介导锤头状核酶对14-3-3体外切割效果研究

一、材料

T7体外转录试剂盒（Promega）；FastStart Universal SYBR Green Master (Rox)（Roche）；荧光定量PCR仪（ABI）；anti-α-tubulin抗体（碧云天）。

二、方法与结果

1 序列合成

引物名称	引物序列（5’→3’）
		14-3-3-sub-F	GGATCCCTGTTGAGGAGAGGAATC（BamH I）
14-3-3-sub-R	GTCGACCACAGAGTAGTTGAGGGC（Sal I）
		Ham-14-3-3-F	AGCTTAAGTAGAAAACACCTGATGAGTTCCGTGAGGACGAAACTCTCAGAATCCGTGG
Ham-14-3-3-R	TCGACCACGGATTCTGAGAGTTTCGTCCTCACGGAACTCATCAGGTGTTTTCTACTTA
		Ham-MIC-F	AGCTTCAGCAATCAAGGGTACACTGATGAGTTCCGTGAGGACGAAACGGCTTCTCCTG
Ham-MIC-R	TCGACAGGAGAAGCCGTTTCGTCCTCACGGAACTCATCAGTGTACCCTTGATTGCTGA
		Noham-14-3-3-F	AGCTTAAGTAGAAAACACACTCTCAGAATCCGTGG
Noham-14-3-3-R	TCGACCACGGATTCTGAGAGTGTGTTTTCTACTTA
		T7-F	GAATTCTAATACGACTCACTATAGGG
T7-R	CATATGTATCAGGAGCAGTATAGGT

注：其中斜体部分为酶切位点，下划线部分为锤头状核酶。引物由吉林省库美生物科技有限公司合成。

2 重组质粒构建

以E. tenella cDNA为模板、14-3-3-sub-F/14-3-3-sub-R为引物，PCR扩增切割底物，并亚克隆至pEtV-RFP-GFP，构建重组质粒pEtV-14-3-3-sub。将Ham-14-3-3-F/Ham-14-3-3-R、Ham-MIC-F/Ham-MIC-R和Noham-14-3-3-F/Noham-14-3-3-F三对引物95℃变性5min，缓慢退火至室温。将三个片段分别与经Hind III/Sal I酶切后的本实验室保存的pEtV-RFP-GFP载体连接，经改造构建成重组质粒pEtV-RFP-Ham-14-3-3、pEtV-RFP-Ham-MIC和pEtV-RFP-Noham-14-3-3，见附图7。

3 体外切割

将pEtV-14-3-3-sub、pEtV-RFP-Ham-14-3-3、pEtV-RFP-Ham-MIC和pEtV-RFP-Noham-14-3-3经引物T7-F/T7-R PCR扩增。PCR产物凝胶回收后作为模板，用T7体外转录试剂盒进行体外转录。

将pEtV-RFP-Ham-14-3-3、pEtV-RFP-Ham-MIC和pEtV-RFP-Noham-14-3-3的转录产物RNA与pEtV-14-3-3-sub转录的RNA以分子比为5:1的比率混合于Tris-HCl（pH 8.0）的溶液至终浓度为50mM，95℃，3min；37℃，5min；最后加入MgCl₂至终浓度10mM启动切割反应，37℃，3h，每个反应设3个重复。

4 体外切割效率检测

以14-3-3-sub-R为引物，将pEtV-14-3-3-sub转录的产物RNA反转录成cDNA。用RNase-free H₂O将cDNA按10^-2~10^-7梯度稀释后，各取1μL进行Real-time PCR反应，每个梯度样品做3个重复，制作标准曲线。标准曲线的线性关系良好，相关系数为0.994，见附图8。

以pEtV-RFP-Ham-14-3-3、pEtV-RFP-Ham-MIC和pEtV-RFP-Noham-14-3-3切割后的混合物为模板，14-3-3-sub-R为引物进行RT反应。各取1μL cDNA进行Real-time PCR反应，用以检测pEtV-RFP-Ham-14-3-3体外转录体的切割效率。每个梯度样品做3个重复。Real-time PCR结果表明，pEtV-RFP-Ham-14-3-3体外转录RNA对pEtV-14-3-3-sub体外转录体RNA的切割效率显著，达到85.24%。而pEtV-RFP-Noham-14-3-3体外转录体对pEtV-14-3-3-sub体外转录体RNA的影响较小，效率仅为2.5%，pEtV-RFP-Ham-MIC对pEtV-14-3-3-sub外转录体RNA反转录无可见影响，见附图9。

试验例3：

E. tenella病毒载体介导锤头状核酶对14-3-3体内切割效果研究

一、材料

RFP-GFP转染株由本实验室构建并保存；anti-α-tubulin抗体（碧云天）；电转仪及电转杯（BTX）；流式细胞仪FACS Aria II（BD）。

二、方法与结果

1 转基因卵囊的分离

在电转杯中加入20μL pEtV-RFP-Ham-14-3-3体外转录RNA、30μL未孢子化卵囊（1×10⁵个）和50μL电转缓冲液，冰浴15min后进行电转。电转条件：电压500V，时间0.3ms，电击3次，每次间隔100ms。电转完毕后，冰浴15min，转移未孢子化卵囊至6孔细胞培养板中，加入适量K₂Cr₂O₇进行孢子化。

将转染pEtV-RFP-Ham-14-3-3体外转录RNA的孢子化卵囊（定义为RFP-Ham-14-3-3株）接种10日龄雏鸡，收取接种5~7d后的粪便并分离卵囊，共传代3次，以确定病毒载体介导的锤头状核酶的稳定转染。激光共聚焦显微镜观察转染后RFP的表达情况，可见RFP-Ham-14-3-3株可观察到红色荧光，未转染组无荧光，见附图10。

将分离的带有红色荧光卵囊进行流式细胞分选，分选后的卵囊接种10日龄雏鸡，收取接种5~7d后的粪便并分离卵囊。二代、三代和四代卵囊中带红色荧光的卵囊比例逐渐升高，分别为15.9%（见附图11 B），32.1%（见附图11 C）和49.8%（见附图11 D）。将混合的卵囊经过流式细胞分选后，发光卵囊比例为97.9%（见附图11 E）。

2 体内切割效果检测

分别提取野生株、RFP-Ham-14-3-3株以及RFP-GFP株未孢子化卵囊的虫体蛋白，Western blot检测14-3-3表达量，蛋白上样量为20μg。以anti-14-3-3多克隆抗体以及anti-α-tubulin抗体（内参）为一抗，以HRP标记的羊抗兔及羊抗鼠IgG为二抗。相对于野生株，RFP-Ham-14-3-3株以及RFP-GFP株14-3-3表达水平均上调，而RFP-Ham-14-3-3株14-3-3表达水平较RFP-GFP株出现下调，见附图12。结果表明构建的锤头状核酶在E. tenella体内成功的干扰了14-3-3的表达。灰度分析显示，RFP-Ham-14-3-3株14-3-3表达水平较RFP-GFP株降低了11.24%。

试验例4：

TRAP法检测转染株端粒酶活性

一、材料

端粒酶活性检测试剂盒（Millipore）。

二、方法与结果

1 引物合成

根据E. tenella端粒DNA重复序列设计TRAP反应引物；

引物名称	引物序列（5’→3’）
		TS	AATCCGTCGAGCAGAGTT
PR	CAACATCTCCACTACCTTCCCTAAACCCTAAA

2 TRAP方法检测端粒酶活性

RNase-free PBS洗涤未孢子化卵囊后，取1×10⁷个虫体加200μL CHAPS裂解液，用高速组织研磨器冰上研磨35次，每次1~2sec。冰浴裂解20min，然后12000g，4℃离心15min，取上清，分装，-80℃保存。

TRAP反应体系：

端粒酶提取物	2μL（600ng）
		10×TRAP Buffer	5μL
50×dNTP Mix	1μL
		TS引物	1μL
ddH2O	39μL

30℃反应30min，95℃灭活5min。然后加入PR引物1μL，rTaq 1μL进行PCR扩增。

扩增参数为：94℃ 1min，59℃ 1min，72℃ 1min，33 cycles。

12%非变性PAGE凝胶电泳，SYBR Green染色，见附图13。结果表明：当14-3-3基因表达被抑制后，E. tenella端粒酶活性升高，初步表明14-3-3对于端粒酶活性具有负向调节的作用。因此，14-3-3蛋白可能为防治鸡球虫病新的药物和疫苗靶位。

SEQ ID No:1

<110> 吉林大学

<120>

<140>

<160> 2

<210> 1

<211> 834bp

<212> mRNA

<213> 柔嫩艾美尔球虫（Eimeriatenella）

<400> 1

ATGATTGAGG ACATCAAGAC TCTCCGCGAG GAGCATGTGT ACCGCGCCAA GCTCGCTGAG        60

CAGGCGGAGC GCTATGACGA AATGGCGGAG GCGATGAAGA ATTTGGTGGA GAACTGTCTC        120

GACCAGAACA GCTCCACTCC AGGTGGCAAG GGGGACGAGT TGACTGTTGA GGAGAGGAAT        180

CTACTAAGTG TTGCGTACAA GAACGCCGTG GGAGCCCGCC GCGCCAGCTG GCGCATAATT        240

TCTTCTGTTG AGCAGAAGGA GGCCAACAGG AACCACATGA CGAACAAGGC CTTGGCAGCG        300

AGCTACAGAC AGAAGGTTGA AAATGAGCTC AACAAAATCT GCCAGGAGAT CCTGACCCTT        360

CTGACCGACA AGCTGCTGCC CCGCACCACG GATTCTGAGA GTCGTGTTTT CTACTTCAAG        420

ATGAAGGGGG ACTACTACCG TTACATTTCC GAGTTCAGCA ACGAAGAGGG GAAGAAGGCA        480

TCGGCAGAAC AGGCGGAGGA ATCGTACAAG CGTGCGACGG ACACCGCTGA AGCAGAACTA        540

CCATCTACTC ACCCTATCCG CTTGGGTCTG GCCCTCAACT ACTCTGTGTT CTACTACGAA        600

ATTCTCAATC AGCCACAGAA GGCTTGTGAA ATGGCCAAAC TGGCTTTCGA TGATGCAATT        660

ACCGAGTTCG ACAGCGTTTC CGAGGAGTCT TACAAGGATT CCACTCTTAT CATGCAACTG        720

CTACGTGACA ATCTGACTCT CTGGACCAGC GACTTGCAGA CTCAGGAACA GCAGCAGCAG        780

CCCGTGGGCG ATGCCGCCGA GGCGCCGAAG GTGGAGGCTA CTGAGCAACA GTAG              834

SEQ ID No:2

<110> 吉林大学

<120>

<140>

<160> 2

<210> 2

<211> 277aa

<212> PRT

<213> 柔嫩艾美尔球虫（Eimeriatenella）

<400> 1

Met Ile Glu Asp Ile Lys Thr Leu Arg Glu Glu His Val Tyr Arg Ala Lys Leu Ala Glu

1             5               10               15               20

Gln Ala Glu Arg Tyr Asp Glu Met Ala Glu Ala Met Lys Asn Leu Val Glu Asn Cys

               25               30                35

Leu Asp Gln Asn Ser Ser Thr Pro Gly Gly Lys Gly Asp Glu Leu Thr Val Glu Glu Arg

40                45               50               55

Asn Leu Leu Ser Val Ala Tyr Lys Asn Ala Val Gly Ala Arg Arg Ala Ser Trp Arg Ile Ile

60               65               70               75              80

Ser Ser Val Glu Gln Lys Glu Ala Asn Arg Asn His Met Thr Asn Lys Ala Leu Ala Ala

             85               90                95               100

Ser Tyr Arg Gln Lys Val Glu Asn Glu Leu Asn Lys Ile Cys Gln Glu Ile Leu Thr Leu

             105              110              115              120

Leu Thr Asp Lys Leu Leu Pro Arg Thr Thr Asp Ser Glu Ser Arg Val Phe Tyr Phe Lys

              125              130              135              140

Met Lys Gly Asp Tyr Tyr Arg Tyr Ile Ser Glu Phe Ser Asn Glu Glu Gly Lys Lys Ala

              145            150               155              160

Ser Ala Glu Gln Ala Glu Glu Ser Tyr Lys Arg Ala Thr Asp Thr Ala Glu Ala Glu Leu

             165              170              175              180

Pro Ser Thr His Pro Ile Arg Leu Gly Leu Ala Leu Asn Tyr Ser Val Phe Tyr Tyr Glu

             185              190             195              200

Ile Leu Asn Gln Pro Gln Lys Ala Cys Glu Met Ala Lys Leu Ala Phe Asp Asp Ala Ile

             205              210               215              220

Thr Glu Phe Asp Ser Val Ser Glu Glu Ser Tyr Lys Asp Ser Thr Leu Ile Met Gln Leu

              225             230              235              240

Leu Arg Asp Asn Leu Thr Leu Trp Thr Ser Asp Leu Gln Thr Gln Glu Gln Gln Gln Gln

              245              250               255              260

Pro Val Gly Asp Ala Ala Glu Ala Pro Lys Val Glu Ala Thr Glu Gln Gln

             265              270              275

Claims (4)

1.一种柔嫩艾美尔球虫TERT相关蛋白基因，如SEQ ID NO 1所示。

2. 权利要求1所述的一种柔嫩艾美尔球虫TERT相关蛋白基因的制备方法，包括以下步骤：

（1）TERT片段的克隆和鉴定：从E. tenella cDNA中通过PCR获得TERT序列，转化至宿主菌中扩增，再通过双酶切及序列测定分析鉴定目的片段；

（2）含有外源目的片段的重组诱饵质粒的构建：回收目的片段，与酶切后的pGBKT7载体连接，并转入大肠杆菌中，筛选阳性克隆，即得到可表达融合蛋白的重组质粒；

（3）将重组诱饵质粒转化入酵母菌株，并进行表达产物、毒性及自激活鉴定；

（4）用酵母双杂交的方法筛选E. tenella cDNA文库中与TRBD相互作用的候选蛋白；

（5）用pull-down的方法进一步验证阳性互作蛋白，从而筛选得到与E. tenella TERT相互作用的蛋白；将TERT蛋白和候选蛋白分别构建到pET-32a和pGEX-4T载体上，在BL21(DE3)感受态中诱导表达并纯化可溶性蛋白；将纯化的两种蛋白共孵育，并加入蛋白A磁珠沉淀，最后通过Western blot检测分析阳性互作的结果；

（6）设计合成针对互作蛋白基因的的锤头状核酶并连接到E. tenella病毒载体上，对该基因切割效率进行体内和体外试验；

（7）TRAP法检测转染株端粒酶活性。

3. 权利要求1所述基因蛋白的原核表达载体，其特征在于：通过PCR方法扩增名称为14-3-3的目的基因，其大小为834bp，回收该DNA后连接pMD-18T克隆载体，载体构建完成后经双酶切鉴定及测序比对后确定该基因的克隆载体构建成功后，再将该基因与pGEX-4T-1载体连接，构建表达载体。

4. 柔嫩艾美尔球虫TERT相关蛋白基因蛋白在制备新的防治鸡球虫病的药物和疫苗中的用途。