CN113462652A - 细胞、免疫治疗产品、基因编辑方法、细胞制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及细胞、免疫治疗产品、基因编辑方法、细胞制备方法及应用。本发明公开了细胞，为以RNP复合物对目标位点进行敲除后的CAR‑NK细胞，RNP复合物包括Cas9蛋白和sgRNA，目标位点为PD‑1，sgRNA至少包括核苷酸序列SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:12。本发明方案有效改善了细胞的抗肿瘤活性和对肿瘤细胞的杀伤，可以开发成为有效的抗肿瘤生物制剂。

Description

细胞、免疫治疗产品、基因编辑方法、细胞制备方法及应用
技术领域
本发明是关于生物、免疫技术，特别是关于一种细胞、NK细胞的免疫治疗产品、基因敲除方法、细胞制备方法及应用。
背景技术
肿瘤是危害人类健康的最重要疾病之一。肿瘤的发病率目前一直呈持续增长趋势，现已成为严重的社会负担。到目前为止，肿瘤治疗的发展已经经历了从手术切除、放射性疗法、化疗、靶向药物疗法，直至细胞免疫治疗的突破性发展。
近年来，基于嵌合抗原受体的T细胞免疫疗法(Chimeric Antigen Receptor T-cell immunotherapy, CAR-T)备受关注。作为一种“活”药，CAR-T疗法与传统药物疗法有着很大的区别。该疗法通过基因转导使患者的T细胞表达嵌合抗原受体，使其既能够维持特异性识别并结合肿瘤抗原，又具备自我增殖和杀伤能力，达到治疗肿瘤的目的。2010年，CD19CAR-T成功治疗了一例淋巴瘤患者。此后，CAR-T细胞疗法开始普遍应用于包括急性和慢性淋巴瘤细胞白血病等难治性B细胞恶行肿瘤的临床治疗，并且取得了显著的临床治疗效果。这为工程化T细胞带来了良好的应用前景。截止到2021年5月，共有5款CAR-T细胞药物获批上市。但随着研究的深入和应用的不断增多，CAR-T细胞药物产生的不良反应逐渐被认识和关注，例如CAR-T细胞治疗的毒副作用（细胞因子风暴和神经毒性）、实体肿瘤对其的耐受性与抗性、肿瘤免疫抑制微环境、工艺的复杂性、细胞生产的周期与成本等等已经成为制约CAR-T细胞疗法的瓶颈。积极寻找可以解决目前CAR-T细胞药物缺陷的其它免疫疗法，克服目前CAR-T细胞对实体瘤疗效不佳的挑战显得尤为重要。
然而，肿瘤细胞在长期的进化过程中也形成了一套自身的免疫逃逸机制，其中PD-1/PD-L1免疫检查点路径已经成为肿瘤治疗的研究热点。PD-1 (Programmed cell death1, 也称PDCD1)在20世纪90年代初期就已经被发现报道，而其配体PD-L1(Programmed celldeath 1 ligand 1, 也称PDCD1LG1)在1999年被相继发现。肿瘤细胞在受到免疫细胞进攻以及免疫细胞释放的γ干扰素的影响下，会诱导其表面PD-L1的表达，PD-L1蛋白是PD-1的配体，两者结合后便会向免疫细胞传递抑制信号，导致免疫细胞进入静息状态，使其无法识别肿瘤细胞，同时使免疫细胞自身增殖减少甚至凋亡，有效解除机体的免疫反应。目前，基于PD-1/PD-L1免疫检查点介导的免疫逃逸机制，各大国际制药巨头纷纷致力于PD-1抑制剂和抗体药物的临床研究和开发。自然杀伤(Natural Killer, NK)细胞是机体固有的免疫系统组成部分，在机体抗肿瘤免疫监视过程中发挥着重要作用，其也是用于过继癌症免疫治疗的重要效应细胞。与T细胞一样，NK细胞也可进行修饰以表达嵌合抗原受体(CARs)，以增强识别肿瘤抗原和抗肿瘤活性。
自2013年以来，CRISPR/Cas9已成为目前最有效的基因编辑系统，其具有高效、简便、快速和特异性等特点，被广泛应用于动物、植物、微生物以及细胞等领域。由于CRISPR/Cas9基因编辑技术的有效应用，肿瘤免疫治疗也产生了重大的突破。2021年1月，中国国家药品监督管理局药品审评中心（CDE）批准了针对输血依赖型β地中海贫血的CRISPR/Cas9基因编辑疗法产品的临床试验申请，这是国内首个获国家药监局批准开展临床试验的基因编辑疗法产品和造血干细胞产品。这也为基因治疗产品再细胞免疫疗法的应用打开了新的篇章。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
本发明的目的在于提供一种细胞、NK细胞的免疫治疗产品、基因敲除方法、细胞制备方法及应用，其能够通过基因编辑的手段，在特定位点敲除PD-1，协同改善肿瘤免疫抑制微环境、进而激发机体产生内在的主动抗肿瘤激发免疫效应，从而实现持久缓解。
为实现上述目的，本发明的实施例提供了细胞，为以RNP复合物对目标位点进行敲除后的CAR-NK细胞，RNP复合物包括Cas9蛋白和sgRNA，目标位点为PD-1，sgRNA至少包括核苷酸序列SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:12。
在本发明的一个或多个实施方式中， CAR-NK细胞表达靶向ROBO1的嵌合抗原受体。
在本发明的一个或多个实施方式中，嵌合抗原受体包含抗原结合结构域、跨膜结构域和共刺激信号传导区，抗原结合结构域能够特异性结合肿瘤特异性抗原ROBO1，并通过跨膜结构域和共刺激信号传导区激活CAR-NK细胞。
在本发明的一个或多个实施方式中，抗原结合结构域能够特异性结合肿瘤特异性抗原ROBO1的Ig1、Ig2、Ig3、Ig4、Ig5、FN1、FN2和FN3结构域中的一种或多种。
在本发明的一个或多个实施方式中，抗原结合结构域为Fab或scFv。
在本发明的一个或多个实施方式中，跨膜结构域选自CD28、CD3ζ、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD134、CD137、ICOS和CD154中的一种或多种。
在本发明的一个或多个实施方式中，共刺激信号传导区包含共刺激分子的细胞内结构域，共刺激分子选自：CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD22、CD79a、CD79b、CD66d、CD2、CD4、CD5、CD28、CD134、CD137、ICOS、CD154、4-1BB和OX40中的一种或多种。
在本发明的一个或多个实施方式中，嵌合抗原受体是结构为scFv-CD8-4-1BB-CD3ζ融合蛋白，scFv-CD8-4-1BB-CD3ζ融合蛋白的氨基酸序列为如SEQ ID NO:1所示。
在本发明的一个或多个实施方式中，嵌合抗原受体是结构为scFv-CD8-4-1BB-CD3ζ融合蛋白，scFv-CD8-4-1BB-CD3ζ融合蛋白的核苷酸序列为如SEQ ID NO:2所示。
在本发明的一个或多个实施方式中，NK细胞的免疫治疗产品，包括如前述的细胞。
在本发明的一个或多个实施方式中，基因编辑方法，以CRISPR/Cas9系统对CAR-NK细胞的目标位点进行敲除，目标位点为PD-1。
在本发明的一个或多个实施方式中，RNP复合物中Cas9蛋白和sgRNA的摩尔比为1:（1 ~ 4）。优选的，Cas9蛋白和sgRNA的摩尔比为1：2。
在本发明的一个或多个实施方式中，sgRNA选自核苷酸序列SEQ ID NO:8和SEQ IDNO:12。
在本发明的一个或多个实施方式中，Cas9蛋白带有NLS核定位信号和GFP标签。
在本发明的一个或多个实施方式中，细胞制备方法，包括：获取RNP复合物；将RNP复合物通过电穿孔转染CAR-NK细胞；分选获得目标细胞。
在本发明的一个或多个实施方式中，应用，如前述的细胞或如前述的产品在实体肿瘤治疗中的应用。
与现有技术相比，根据本发明实施方式的优势主要体现在：1）安全性好、有效性强且多功能：NK细胞无移植物抗宿主反应，在体内存活时间较短，无CRS/神经毒性等副作用；且本发明中的CAR-NK 细胞除了可以直接杀伤肿瘤细胞外，裂解的肿瘤细胞释放新的肿瘤抗原，可以进一步激活 DC 细胞、CTL、T 记忆细胞的复合免疫反应，达到类似肿瘤疫苗长期免疫的效果；2）原创性、广谱性适应症：本发明中的CAR-NK设计结合国际研究前沿CAR药物开发思路，以ROBO1蛋白为靶点，遵循着几十年的科研结果以及其本身的生物学功能的选择进化，在整个CAR-NK细胞治疗领域靶点的选择上遥遥领先；且ROBO1靶点在80%以上的实体肿瘤中高表达，大大节省了开发多靶点的研发成本，开启广谱抗癌药物的新时代；3）时效性、可规模化生产：CAR-NK细胞克服了CAR-T细胞治疗需个性化定制的限制和异体免疫排斥的缺点，通过建立稳定细胞株即单克隆细胞系，表型均一，质量可控，进行大规模化生产，达到即时治疗，无需等待，成为“货架型（off-the-shelf）”细胞药物，能够满足随治随用的临床需求；4）改善肿瘤免疫抑制微环境。通过基因编辑的手段，在特定位点敲除PD-1，协同改善肿瘤免疫抑制微环境、进而激发机体产生内在的主动抗肿瘤激发免疫效应，从而实现持久缓解。
本发明利用CRISPR/Cas9技术在靶向ROBO1的CAR-NK细胞中敲除PD-1基因，直接阻断肿瘤细胞对其的逃逸和抑制作用，使得ROBO1-CAR NK细胞能够更加有效得识别和杀伤肿瘤细胞。
本发明通过应用CRISPR/Cas9技术将ROBO1 CAR-NK细胞中的人PD-1基因敲除，直接阻断肿瘤细胞对该细胞的逃逸和免疫抑制作用，得到可靶向ROBO1的新型CAR-NK细胞。相对于ROBO1 CAR-NK细胞，该新型CAR-NK细胞在体外实验中展现出更强的抗肿瘤活性，明显提高了NK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性和在肿瘤微环境下CAR-NK细胞的持续增殖水平，尤其是在PD-L1高表达的肿瘤细胞中。因此，该新型ROBO1 CAR-NK细胞将有望开被发成为安全有效的抗肿瘤生物制剂，具有明显的应用前景和临床应用价值。
附图说明
图1所示为本发明实施例1提供的慢病毒质粒载体PRRLSIN-ScFv (anti ROBO1-FN3)的结构示意图。
图 2 所示为本发明实施例3提供的ROBO1 CAR-NK流式检测CAR细胞阳性率的结果图。
图3 所示为本发明实施例3提供的ROBO1 CAR-NK流式检测CD56分子阳性率的结果图。
图4 所示为本发明实施例4提供的人PD-1基因敲除靶点设计示意图。
图5a-5b所示为本发明实施例5提供的流式细胞仪对GFP阳性细胞进行分群以及单细胞分选示意图。
图6a-6b 所示为本发明实施例5提供的ROBO1 CAR-NK中PD-1基因敲除阳性单克隆测序结果示意图。
图7a-7b 所示为本发明实施例6提供的PD-1-KO ROBO1 CAR-NK单克隆细胞株在PMA刺激条件下，流式检测PD-1表达的示意图。
图8a-8c 所示为本发明实施例6提供的PD-1-KO ROBO1 CAR-NK单克隆细胞株过夜(16h)杀伤靶细胞MDA-MB231-ROBO1后，流式检测PD-1表达示意图。
图9a-9b所示为本发明实施例7提供的PD-1-KO ROBO1 CAR-NK单克隆细胞对T47D、MDA-MB231-ROBO1过夜(16h)的杀伤率。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。
除非特别指明，本文中的“NK细胞”包括“外周血NK细胞、NK92细胞和其他NK细胞”。
除非特别指明，本文中的“NK”为人体正常NK细胞或NKT细胞或NK细胞系，其包括NK-92细胞，YT细胞，NKL细胞，HANK-1细胞系，NK-YS细胞，KHYG-1细胞，SNK-6细胞和IMC-1细胞等。本发明的具体实施例中以NK-92细胞为例进行说明。
除非特别指明，本文中的“ROBO1 CAR-NK”是指“以ROBO1为靶点的嵌合抗原受体细胞，特别是一种以ROBO1为靶点的加强型CAR-NK细胞”,其具体制备过程参照下述实施例及申请号为“201811394153.3”，发明名称为“编码CAR的核苷酸序列、表达该CAR的ROBO1 CAR-NK细胞及其制备和应用”。
除非特别指明，本文中的“PD-1-KO-L4”以及“PD-1-KO ROBO1 CAR-NK-L4”均指从ROBO1 CAR-NK细胞筛选获得的PD-1敲除的细胞克隆4。
除非特别指明，本文中的“PD-1-KO-L30”以及“PD-1-KO ROBO1 CAR-NK-L30”均指从ROBO1 CAR-NK细胞中筛选获得的PD-1敲除的细胞克隆30。
除非特别指明，本文中的“MDA-MB231-ROBO1”指通过慢病毒转染方式获得人ROBO1基因过量表达的MDA-MB231肿瘤细胞。
如图所示，根据本发明优选实施方式对本发明方案进行解释说明，需要注意的是这里的解释说明并非对本申请的保护范围的限定。
实施例1 慢病毒载体的制备
合成ScFv(Anti ROBO1-FN3)-CD8-4-1BB-CD3ζ融合基因序列（其氨基酸序列如SEQID NO：1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示）。通过酶切，将ScFv(Anti ROBO1-FN3)-CD8-4-1BB-CD3ζ融合基因序列转化连接到PRRSLIN载体中，基因上游为EF-1α启动子。载体转化Stbl3大肠杆菌菌株，氨苄青霉素筛选，获得阳性克隆，提取质粒，酶切鉴定克隆，获得PRRLSIN-ScFV(anti ROBO1-FN3)慢病毒转染载体（图1所示）。
实施例2 慢病毒的制备
（1）转染前12小时，以每皿约8×106将293T细胞接种至15cm培养皿中。确保转染时细胞在80%左右的汇合度且均匀分布于培养皿中。
（2）准备溶液A和溶液B
溶液A：6.25ml 2×HEPES buffer缓冲液。
溶液B：分别加入以下质粒的混合物：112.5μg PRRLSIN-ScFv (anti ROBO1-FN3)（target plasmid）；39.5μg pMD2.G (VSV-G envelop)；73μg pCMVR8.74 (gag，pol，tat，rev)；625μl 2M钙离子溶液。溶液B总体积：6.25 ml。
充分混匀溶液B，轻轻涡旋溶液A的同时，逐滴加入溶液B，静置5-15分钟。轻轻涡旋上述A和B的混合溶液，逐滴加入含293T细胞的培养皿中，轻轻前后晃动培养皿使DNA与钙离子的混合物均匀分布。（不要旋转培养皿）放置于培养箱中培养16-18小时。更换新鲜培养基，继续培养，分别在48小时和72小时后收集含病毒的上清液。500g，25℃离心10分钟。PES膜（0.45μm）过滤。以70%乙醇消毒贝克曼库尔特Ultra-clear SW28 centrifuge tubes，并置于紫外灯下消毒30分钟。将已过滤的含慢病毒的上清液转移至离心管中。在离心管底部小心铺上一层20%蔗糖（每8ml上清液加1ml蔗糖）。以PBS平衡离心管，2500rpm，4℃离心2小时。小心取出离心管，倒掉上清液，倒置离心管去掉残余液体。加入100μl PBS，密封离心管，在4℃放置2小时，每20分钟轻轻涡旋一次，500g离心1分钟（25℃），收集病毒上清。冰上冷却后，置于-80℃保存。
实施例3 ROBO1 CAR-NK细胞的制备
将NK-92细胞密度调整至2-3×105/ml，按体积比（V/V）病毒载体：细胞培养基=1:5比例添加病毒载体，同时添加聚凝胺8μg/ml。4h之后，补加等量的新鲜的完全培养基将细胞密度调整至1×105/ml继续培养。次日，将所有的细胞离心，加入新鲜的培养基，继续培养。每隔1-2天进行补液，使维持细胞密度在2-3×105/ml。72h后进行标记CAR的抗体染色，同时流式分选ROBO1 CAR NK-92阳性细胞并扩大培养。每天观察培养基的pH值、细胞密度、细胞活率并作相应记录。
利用流式检测CAR NK-92细胞阳性率，流式检测结果如图2所示。图2中所采用的抗体为APC荧光标记的检测CAR表达的抗体，在横坐标上进行表示，NK-92细胞若成功表达CAR分子，该信号值将显著升高。从图2中可以看出，APC荧光标记的信号值显著升高，表明NK-92细胞成功表达CAR分子，CAR NK-92阳性率为98.89%。
图3为ROBO1 CAR-NK流式检测CD56分子阳性率的结果图。从图中可以看出，CD56分子为阳性，说明制备的CAR-NK92细胞未丢失CD56分子，未发生其它不同细胞类型的分化，保存NK细胞的基本特性。
以同样的方法制备ROBO1M CAR-NK细胞。
实施例4 靶向PD-1基因的sgRNA的设计
在NCBI网站 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov) 中找到人PD-1基因序列(GeneID: 5133)，其中，5个外显子序列如SEQ ID NO：3至SEQ ID NO：7所示，使用CCTop-CRISPR/Cas9 target online predictor网站(https://cctop.cos.uni-heidelberg.de:8043) 在人PD-1基因的靶位点exon2 （SEQ ID NO：4）内设计并挑选5个特异性位点作为sgRNA的靶序列（SEQ ID NO：8至SEQ ID NO：12），最终优先选择sgRNA1（SEQ ID NO：8）和sgRNA2（SEQ IDNO：12）进行化学合成（南京金斯瑞生物科技有限公司订购），PD-1基因敲除打靶位点设计如图4所示。
实施例5 PD-1基因敲除的ROBO1 CAR-NK细胞的制备
1.电穿孔转染ROBO1 CAR-NK细胞
1）预先在T75培养瓶中加入20-25ml MEM-α-Full培养基，CO2恒温培养箱中预热，从4℃冰箱中取出电转缓冲液A液和B液（Celetrix，12-0104）至室温环境，并取60μl电转缓冲液A与60μl电转缓冲液B混合，将其标记为电转缓冲液C，室温放置；
2）按照1：2的摩尔比例将Cas9蛋白(举例地讲，可以为南京金斯瑞生物科技有限公司订购，NLS-Cas9-GFP等)、sgRNA混合，再添加60μl电转缓冲液C混匀；
3）取适量ROBO1 CAR-NK细胞至50ml离心管中，1000rpm离心5min，弃上清；
4）加入20ml PBS重悬细胞沉淀，1000rpm离心5min，弃上清；
5）加入适量PBS重悬细胞沉淀，吹打均匀后细胞计数；
6）取适量细胞至1.5ml离心管中，1500rpm转离心5min，弃上清，加入60μl电转缓冲液C，吹打重悬；
7）将步骤2和6中的溶液轻柔混合，并在室温条件下孵育10-15 min；
8）将步骤7中的细胞悬液转移至120μl电极管（Celetrix，12-0104）中，进行电转（Celetrix电转仪：CTX-1500A-LE）。
电转结束后，转移所有样品至含预热培养基的T75培养瓶中，CO2恒温培养箱中培养。
2.单克隆细胞的流式分选
电转48h后进行细胞的流式分选；
PBS+0.2%FBS分选液配置：取10ml PBS至15ml离心管中，加入20μl FBS后混匀；
转移待分选细胞至50ml离心管中，1200rpm离心5min，弃上清；
加入适量的PBS清洗细胞沉淀并细胞计数，1200rpm离心5min，弃上清；
加入适量PBS+0.2%FBS分选液重悬细胞沉淀，用40μm滤网过滤细胞悬液，转移至新的15ml离心管中，冰上放置，等待分选；
选取FITC通道进行阳性细胞分选，分选结束后，转移细胞至T25培养瓶中，CO2恒温培养箱中培养，阳性细胞流式分选结果如图5a-5b所示。
再参照前述步骤对阳性细胞进行单克隆细胞流式分选，共分选15块96孔培养板，得到单克隆细胞。
PCR方法DNA水平检测单克隆细胞，筛选PD-1基因敲除的ROBO1 CAR-NK单克隆细胞，具体步骤如下：
取适量培养的单克隆ROBO1 CAR-NK细胞，参照细胞基因组抽提试剂盒说明书（天根生化，DP304-03）提取细胞基因组DNA。
将提取的基因组DNA作为模板，进行PCR扩增，所用引物：PD1-ex2-F：5’-CAGGGAGACCCAAGTCAGAG-3’（SEQ ID NO:13）和PD1-ex2-R：5’ - GGCACAAAGGTCAGGGGTTA-3’（SEQ ID NO:14）所示，PCR扩增体系为：（全式金，AS211-02）2×Easypfu PCR Super Mix：25μl，PD1-ex2-F：1.5μl，PD1-ex2-R：1.5μl，基因组DNA： 200-300 ng，补充ddH2O至总体积50μl；PCR程序为：95℃，3min; 95℃，30s，55℃，30s，72℃，1min，32个循环；72℃，5min。
电泳检测PCR产物，若有清晰DNA条带，则取1μl PCR产物进行平末端克隆（全式金，CB101-01），详细步骤如下：pEasy-Blunt vector：1μl；PCR产物：1μl；补充ddH2O至总体积4μl。配置好反应体系后置于室温反应10 min，然后使用热激法转化大肠杆菌态细胞DH5α，涂布于具有卡那霉素抗性的固体LB培养基平板上，置于37℃生化培养箱过夜培养，第二天挑取6-8个单克隆菌落进行测序反应。测序结果如图6a-6b所示，a：PD-1基因敲除的ROBO1CAR-NK单克隆细胞株第4号；b：PD-1基因敲除的ROBO1 CAR-NK单克隆细胞株第30号；经过序列比对，其中第4号单克隆细胞株allele1缺失2个碱基，allele2缺失133个碱基；第30号单克隆细胞株allele1缺失2个碱基，allele2缺失49个碱基。
实施例6 流式细胞术检测PD-1蛋白表达
由于NK细胞在正常培养状态下不表达PD-1，因此本发明通过添加PMA刺激NK细胞诱导PD-1表达或通过对靶细胞进行杀伤诱导NK细胞中PD-1的表达。
PMA刺激NK细胞诱导PD-1表达
调整细胞至适当密度，添加PMA（Sigma，P1585）至终浓度为25 nM，37℃恒温CO2培养箱过夜24 h培养。
取适量细胞于1.5ml离心管中，1500 rpm离心5min。
用PBS清洗一遍，1500 rpm离心5min, 再用100 μl PBS重悬，加入PE anti-humanCD279（PD-1）Antibody（Biolegend，329706），避光，室温孵育20min。
PBS清洗细胞两次后，用100 μl PBS重悬细胞，流式细胞仪检测染色。
检测结果如图7a-7b所示，a为对照组，以不加PMA的ROBO1 CAR-NK细胞为阴性对照组，以加PMA的ROBO1 CAR-NK细胞为阳性对照组，PD-1分子表达阳性率为7.32%；b为实验组，添加了PMA刺激后，PD-1 KO ROBO1 CAR-NK-L4和L30中的PD-1分子几乎不被诱导，说明PD-1已被有效敲除。
2）通过对靶细胞杀伤诱导NK细胞中PD-1分子表达
提前一天对靶细胞进行铺板，取1.2E+6 cells靶细胞置于6孔板中，37℃恒温培养CO2培养箱培养，24h观察靶细胞贴壁状态。
按照0.05：1的效靶比例加入效应细胞，过夜杀伤16h。
取适量上清细胞于1.5 ml离心管中，1500 rpm离心5min。
用PBS清洗一遍，1500 rpm离心5min, 在以100 μl PBS重悬，同时加入PE anti-human CD279（PD-1）Antibody（Biolegend，329706）和APC anti-human CD56 Antibody（Biolegend，362504），避光，室温孵育20min。
PBS清洗细胞两次后，用100 μl PBS重悬细胞，流式细胞仪检测染色。
检测结果如图8a-8c所示，a为对照组，以过夜杀伤MDA-MB231-ROBO1后的ROBO1CAR-NK细胞为阳性对照组，PD-1分子表达阳性率为4.08%；b和c为实验组，过夜杀伤MDA-MB231-ROBO1后，PD-1 KO ROBO1 CAR-NK-L4和L30中的PD-1分子几乎不被诱导，说明PD-1已被有效敲除。
实施例7 细胞杀伤试验
将实施例5制得的PD-1基因敲除的ROBO1 CAR-NK细胞培养一个月后，将其用于对乳腺癌（T47D、MDA-MB231-ROBO1）细胞的杀伤试验。具体地，提前一天将不同的靶细胞以4.5万个/孔均匀铺在96孔板中，待细胞贴壁完全后，按照0.05：1的效靶比例，将效应细胞ROBO1CAR-NK、PD1-KO ROBO1 CAR-NK-L4和L30铺于靶细胞上，16小时后，用CCK8检测OD值，结果如图9a-9b所示，从图中可以看出，本发明的PD-1基因敲除的ROBO1 CAR-NK表现出比ROBO1CAR-NK更强的杀伤活性。
本发明首先提供一种基因编辑技术，可以对ROBO1 CAR-NK细胞特定位点进行敲除，从而获得一株增强型的CAR-NK细胞，该细胞可以解除肿瘤细胞对CAR-NK细胞的免疫抑制作用，使其有更高的靶向肿瘤杀伤活性。
本发明的优选实例中，基因编辑技术为CRISPR/Cas9系统，包括Cas9和sgRNA。Cas9可以对靶基因进行剪切，形成DNA的双链断裂，而sgRNA则引导Cas9对DNA进行定点切割，Cas9和sgRNA组成RNP复合物。
本发明的优选实例用，敲除位点包括AAVS1、PD-1、TIGIT、Tim3、LAG3、CTLA4等。
本发明的优选实例用，当敲除位点为PD-1时，sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO: 8至SEQ ID NO:12所示序列。其中人PD-1基因的mRNA序列由SEQ ID NO：3至SEQ ID NO：7所示的人PD-1基因外显子组成。
本发明提供一种制备PD-1敲除的ROBO1 CAR-NK细胞的方法，方法包括以下步骤：
将用于靶向PD-1的sgRNA和Cas9蛋白按照一定比例（即Cas9蛋白和sgRNA的摩尔比为1:（1 ~ 4））联合使用，形成用于敲除PD-1基因的RNP复合物。
优选的，在靶向时，联合使用的Cas9蛋白和sgRNA的摩尔比还可以为1:1或1:4或1:3以及其它满足本发明实施限定的摩尔比等，以满足对包括而不限于AAVS1、PD-1、TIGIT、Tim3、LAG3、CTLA4等的选择性要求。
将RNP复合物通过电穿孔转染ROBO1-CAR NK细胞，再通过流式细胞仪分选获得PD-1敲除的CAR-NK细胞。
在本发明的优选实例中，一种优选方案，sgRNA为两条sgRNA。
进一步优选方案，sgRNA的序列选自SEQ ID NO: 8和SEQ ID NO: 12。
在本发明的优选实例中，一种优选方案，sgRNA为化学合成。
进一步优选方案，化学合成的sgRNA在3’端和5’端均有硫代甲氧基修饰。
在本发明的优选实例中，一种优选方案，Cas9蛋白具有NLS核定位并带有GFP标签。
本发明的优选实例中，一种优选方案，RNP复合物中Cas9蛋白与sgRNA的摩尔比为1:2。
本发明还提供一种CAR-NK细胞，该NK细胞中PD-1基因被敲除并且表达靶向ROBO1的CAR分子，其中嵌合抗原受体包含抗原结合结构域、跨膜结构域和共刺激信号传导区，抗原结合结构域能够特异性结合肿瘤特异性抗原ROBO1，并通过跨膜结构域和共刺激信号传导区激活该NK细胞。
示例性地，抗原结合结构域能够特异性结合肿瘤特异性抗原ROBO1的Ig1、Ig2、Ig3、Ig4、Ig5、FN1、FN2和FN3结构域中的一种或多种。
示例性地，抗原结合结构域能够特异性结合肿瘤特异性抗原ROBO1的FN3结构域。
示例性地，抗原结合结构域为特异性结合ROBO1的FN3结构域的抗体或其抗原结合片段，抗原结合片段为Fab或scFv。
示例性地，跨膜结构域选自CD28、CD3ζ、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD134、CD137、ICOS和CD154中的一种或多种；优选地，跨膜结构域为CD8跨膜结构域。
共刺激信号传导区包含共刺激分子的细胞内结构域，共刺激分子选自：CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD22、CD79a、CD66d、CD2、CD4、CD5、CD28、CD134、CD137、ICOS、CD154、4-1BB和OX40中的一种或多种；优选地，共刺激信号传导区包含4-1BB和CD3ζ胞内结构域。
示例性地，ROBO1 CAR-NK细胞能够表达scFv-CD8-4-1BB-CD3ζ融合蛋白，该融合蛋白能够特异性识别ROBO1分子，以ROBO1-FN3结构域为靶点。
在本发明的一个优选实例中，scFv-CD8-4-1BB-CD3ζ融合蛋白的氨基酸序列如SEQID NO: 1。
在本发明的一个优选实例中，scFv-CD8-4-1BB-CD3ζ融合蛋白的核苷酸序列如SEQID NO: 2。
在本发明的一个优选实例中，将嵌合抗原受体分子克隆进慢病毒载体，构建单一编码框的全长CAR序列表达框，通过慢病毒转染方式侵染NK92细胞，获得ROBO1 CAR-NK细胞。
本发明还有一个目的是开发在上述ROBO1 CAR-NK细胞中敲除PD-1后所获得的新型CAR-NK细胞及其在肿瘤治疗中的应用，肿瘤细胞为ROBO1阳性且PD-L1高表达的肿瘤细胞。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
序列表
<110> 阿思科力（苏州）生物科技有限公司
<120> 细胞、免疫治疗产品、基因编辑方法、细胞制备方法及应用
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 480
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 1
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser
20 25 30
Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp
35 40 45
Ile Ser Asn Phe Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val
50 55 60
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr Ile Ser
85 90 95
Lys Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn
100 105 110
Thr Leu Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Gln
130 135 140
Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser
145 150 155 160
Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr Met Asn Trp Val
165 170 175
Lys Leu Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile Gly Asp Ile Val Pro
180 185 190
Asn Asn Gly Asp Thr Thr Tyr Asn Gln Asn Phe Arg Gly Lys Ala Thr
195 200 205
Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser
210 215 220
Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Phe Ser Asn
225 230 235 240
Tyr Val Tyr Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Ile Thr Val
245 250 255
Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile
260 265 270
Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala
275 280 285
Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr
290 295 300
Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu
305 310 315 320
Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile
325 330 335
Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp
340 345 350
Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
355 360 365
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
370 375 380
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
385 390 395 400
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
405 410 415
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
420 425 430
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
435 440 445
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
450 455 460
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
465 470 475 480
<210> 2
<211> 1440
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
atggccctgc ctgtgacagc cctgctgctg cctctggctc tgctgctgca tgccgctaga 60
cccatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 120
atcagttgca gggcaagtca ggacattagc aattttttaa actggtatca gcagaaacca 180
gatggaactg ttaaactcct gatctacgcc acatcaagat tacattctgg agtcccatca 240
aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat ttttctctca ccattagcaa actggagcaa 300
gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggtaatacgc ttccacttac gttcggcgct 360
gggacaaagt tggaacttaa aggtggtggt ggttctggcg gcggcggctc cggaggagga 420
ggatcgctgc aacagtctgg acctgagttg gtgaagcctg gggcttcagt gaagatttcc 480
tgcaaggctt ctggatacac attcactgac tactacatga attgggtgaa gcttagccat 540
ggaaagagcc ttgagtggat tggagatatt gttcctaaca atggtgatac tacttacaac 600
cagaatttca gaggcaaggc cacattgact gtagacaagt cctccagcac agcctacatg 660
gagctccgca gcctgacatc tgaggactct gcagtctatt actgtgcaag attcagtaat 720
tacgtttacc cttttgacta ctggggccaa ggcaccacta tcacagtctc caccacgacg 780
ccagcgccgc gaccaccaac accggcgccc accatcgcgt cgcagcccct gtccctgcgc 840
ccagaggcgt gccggccagc ggcggggggc gcagtgcaca cgagggggct ggacttcgcc 900
tgtgatatct acatctgggc gcccttggcc gggacttgtg gggtccttct cctgtcactg 960
gttatcaccc tttactgcaa acggggcaga aagaaactcc tgtatatatt caaacaacca 1020
tttatgagac cagtacaaac tactcaagag gaagatggct gtagctgccg atttccagaa 1080
gaagaagaag gaggatgtga actgagagtg aagttcagca ggagcgcaga cgcccccgcg 1140
taccagcagg gccagaacca gctctataac gagctcaatc taggacgaag agaggagtac 1200
gatgttttgg acaagagacg tggccgggac cctgagatgg ggggaaagcc gagaaggaag 1260
aaccctcagg aaggcctgta caatgaactg cagaaagata agatggcgga ggcctacagt 1320
gagattggga tgaaaggcga gcgccggagg ggcaaggggc acgatggcct ttaccagggt 1380
ctcagtacag ccaccaagga cacctacgac gcccttcaca tgcaggccct gccccctcgc 1440
<210> 3
<211> 76
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 3
atgcagatcc cacaggcgcc ctggccagtc gtctgggcgg tgctacaact gggctggcgg 60
ccaggatggt tcttag 76
<210> 4
<211> 360
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 4
actccccaga caggccctgg aaccccccca ccttctcccc agccctgctc gtggtgaccg 60
aaggggacaa cgccaccttc acctgcagct tctccaacac atcggagagc ttcgtgctaa 120
actggtaccg catgagcccc agcaaccaga cggacaagct ggccgccttc cccgaggacc 180
gcagccagcc cggccaggac tgccgcttcc gtgtcacaca actgcccaac gggcgtgact 240
tccacatgag cgtggtcagg gcccggcgca atgacagcgg cacctacctc tgtggggcca 300
tctccctggc ccccaaggcg cagatcaaag agagcctgcg ggcagagctc agggtgacag 360
<210> 5
<211> 156
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 5
agagaagggc agaagtgccc acagcccacc ccagcccctc acccaggcca gccggccagt 60
tccaaaccct ggtggttggt gtcgtgggcg gcctgctggg cagcctggtg ctgctagtct 120
gggtcctggc cgtcatctgc tcccgggccg cacgag 156
<210> 6
<211> 35
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 6
ggacaatagg agccaggcgc accggccagc ccctg 35
<210> 7
<211> 240
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 7
aaggaggacc cctcagccgt gcctgtgttc tctgtggact atggggagct ggatttccag 60
tggcgagaga agaccccgga gccccccgtg ccctgtgtcc ctgagcagac ggagtatgcc 120
accattgtct ttcctagcgg aatgggcacc tcatcccccg cccgcagggg ctcagctgac 180
ggccctcgga gtgcccagcc actgaggcct gaggatggac actgctcttg gcccctctga 240
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 8
gcagttgtgt gacacggaag 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 9
gcgtgacttc cacatgagcg 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 10
cccttcggtc accacgagca 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 11
gccctgctcg tggtgaccga 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 12
cacgaagctc tccgatgtgt 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 13
cagggagacc caagtcagag 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 14
ggcacaaagg tcaggggtta 20

Claims (17)

1.细胞，为以RNP复合物对目标位点进行敲除后的CAR-NK细胞，所述RNP复合物包括Cas9蛋白和sgRNA，其中在于，所述目标位点为PD-1，所述sgRNA至少包括核苷酸序列SEQ IDNO:8和SEQ ID NO:12。
2.如权利要求1所述的细胞，其特征在于，所述CAR-NK细胞表达靶向ROBO1的嵌合抗原受体。
3.如权利要求2所述的细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体包含抗原结合结构域、跨膜结构域和共刺激信号传导区，所述抗原结合结构域能够特异性结合肿瘤特异性抗原ROBO1，并通过跨膜结构域和共刺激信号传导区激活所述CAR-NK细胞。
4.如权利要求3所述的细胞，其特征在于，所述抗原结合结构域能够特异性结合肿瘤特异性抗原ROBO1的Ig1、Ig2、Ig3、Ig4、Ig5、FN1、FN2和FN3结构域中的一种或多种。
5.如权利要求4所述的细胞，其特征在于，所述抗原结合结构域为Fab或scFv。
6.如权利要求3所述的细胞，其特征在于，所述跨膜结构域选自CD28、CD3ζ、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD134、CD137、ICOS和CD154中的一种或多种。
7.如权利要求3所述的细胞，其特征在于，所述共刺激信号传导区包含共刺激分子的细胞内结构域，所述共刺激分子选自：CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD22、CD79a、CD79b、CD66d、CD2、CD4、CD5、CD28、CD134、CD137、ICOS、CD154、4-1BB和OX40中的一种或多种。
8.如权利要求4所述的细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体是结构为scFv-CD8-4-1BB-CD3ζ融合蛋白，所述scFv-CD8-4-1BB-CD3ζ融合蛋白的氨基酸序列为如SEQ ID NO:1所示。
9.如权利要求4所述的细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体是结构为scFv-CD8-4-1BB-CD3ζ融合蛋白，所述scFv-CD8-4-1BB-CD3ζ融合蛋白的核苷酸序列为如SEQ ID NO:2所示。
10.NK细胞的免疫治疗产品，其特征在于，包括如权利要求1-9任一所述的细胞。
11.一种如权利要求1-9任一所述的细胞的基因编辑方法，其特征在于，以CRISPR/Cas9系统对CAR-NK细胞的目标位点进行敲除，所述目标位点为PD-1。
12.如权利要求11所述的基因编辑方法，其特征在于，所述CRISPR/Cas9系统包括含有Cas9蛋白和sgRNA组成的RNP复合物。
13.如权利要求12所述的基因编辑方法，其特征在于，所述RNP复合物中所述Cas9蛋白和sgRNA的摩尔比为1：（1 ~ 4）。
14.如权利要求12或13所述的基因编辑方法，其特征在于，所述sgRNA为核苷酸序列SEQID NO:8和SEQ ID NO:12。
15.如权利要求12或13所述的基因编辑方法，其特征在于，所述Cas9蛋白带有NLS核定位信号和GFP标签。
16.一种如权利要求1-9任一所述的细胞的制备方法，其特征在于，包括：获取RNP复合物；将所述RNP复合物通过电穿孔转染CAR-NK细胞；分选获得目标细胞。
17.一种如权利要求1-9任一所述的细胞或如权利要求10所述的产品在实体肿瘤治疗中的应用。
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