CN111704674A

CN111704674A - 一种靶向c-Met且自分泌PD-L1 scFv的嵌合抗原受体及其应用

Info

Publication number: CN111704674A
Application number: CN202010648546.3A
Authority: CN
Inventors: 郭娇娇; 蒋伟; 杨婷婷; 季国忠; 冯振卿; 唐奇; 毛圆; 常新霞
Original assignee: Nanjing Medical University
Current assignee: Nanjing Medical University
Priority date: 2020-07-07
Filing date: 2020-07-07
Publication date: 2020-09-25
Anticipated expiration: 2040-07-07
Also published as: CN111704674B

Abstract

本发明公开了一种靶向c‑Met且自分泌PD‑L1 scFv的嵌合抗原受体，本发明的嵌合抗原受体修饰的T细胞在自身活化的情况下，还可特异杀伤c‑Met高表达的肿瘤细胞，并自分泌PD‑L1 scFv抗体，减弱肿瘤微环境的免疫抑制作用，促进CD8+T细胞对肿瘤的杀伤作用。

Description

一种靶向c-Met且自分泌PD-L1 scFv的嵌合抗原受体及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种靶向c-Met且自分泌PD-L1 scFv的嵌合抗原受体及其应用。

背景技术

随着肿瘤免疫学的快速发展，近年来嵌合抗原受体T细胞免疫治疗(chimericantigen receptor T-cell immunotherapy,CAR-T)为代表的肿瘤免疫治疗引起了广泛关注，有望成为肿瘤治疗的新突破。CAR-T细胞疗法是通过基因修饰使T细胞表达一种嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)，这种嵌合抗原受体是采用肿瘤特异性单克隆抗体的单链可变区 (scFv)，并将scFv区直接和共刺激分子(如CD28)及T细胞信号传导区CD3-ζ连接。因为scFv可以以MHC非限制性方式识别并结合抗原，因此CAR与相应的肿瘤抗原结合后能以MHC非限制性方式使T细胞活化并靶向结合肿瘤细胞，通过诱导细胞凋亡、裂解性杀伤等方式杀伤肿瘤细胞。目前依据CAR-T细胞胞内信号的组成可分为三代。第一代CAR的胞内区仅含有CD3ζ，形成scFv-CD3ζ结构。第一代CAR-T细胞因缺乏共刺激信号，进入机体后很快便凋亡，因此其在体内抗肿瘤活性受到了限制。第二代CAR在胞内区增加一个免疫共刺激信号分子CD28，形成scFv-CD28-CD3ζ结构，第二代CAR-T细胞的增殖和细胞因子分泌能力提高。第三代CAR则是在胞内区再增加一个免疫共刺激信号分子CD134或CD137，形成scFv-CD28-CD134-CD3ζ或scFv-CD28-CD137-CD3ζ结构，从而可以提供长时间的T 细胞扩增信号，延长CAR-T细胞在体内的存活时间。

目前在血液病的治疗上，CAR-T细胞疗法取得了良好的临床治疗效果，但对于实体瘤的治疗，目前仍处于研究阶段，而CAR-T细胞疗法效果不佳的重要原因就是肿瘤免疫抑制性微环境的影响，即肿瘤自身可利用肿瘤微环境营造出适合其生长的环境进而加速肿瘤进程，逃避免疫检查的效果。因此仅使用针对某一肿瘤抗原的CAR-T细胞往往效果不佳。c-Met也被称为肝细胞生长因子受体(HGFR)或酪氨酸蛋白激酶Met，研究表明在HCC患者中，c-Met表达量普遍异常升高，且抑制c-Met的活化可以抑制肿瘤细胞增殖、侵袭和上皮-间质转化等多种生物学过程。此外，c-Met过表达常导致患者的预后不良。程序性死亡受体1(PD-1)是由活化的T细胞和B细胞表达的一种关键的免疫检查点受体，可以介导免疫负调控。PD-1细胞表面的糖蛋白配体PD-L1，在肝癌、黑色素瘤等恶性肿瘤中高表达，与T细胞上的PD-1结合后在肿瘤微环境中产生免疫抑制性的负调控信号、下调T细胞的功能、诱导产生免疫抑制性Treg细胞，从而抑制抗肿瘤免疫应答。此外对PD-1/PD-L1相互作用的抗体抑制剂用于肿瘤治疗在临床试验阶段也取得较理想的效果。目前，FDA已批准部分PD-1/PD-L1抗体抑制剂用于治疗相关肿瘤，而我国国家药品监督局也于6月15日批准了首个PD-1抗体药物纳武利尤单抗注射液(Nivolumab Injection)的进入。

目前针对肿瘤抗原c-Met及同时将免疫抑制调控点整合入CAR结构，使其自分泌抗PD-L1 scFv抗体从而构建而成的CAR-T细胞及细相关免疫疗法尚未有研究报道。

发明内容

基于此，本发明的研究目的在于提供一种可靶向c-Met且自分泌PD-L1 scFv的嵌合抗原受体，制备可靶向c-Met且自分泌PD-L1 scFv的嵌合抗原受体的重组慢病毒载体，在于利用所获得的慢病毒制备可靶向c-Met且自分泌PD-L1 scFv的嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞，以及前述抗原受体、载体、T细胞的应用。本发明所得的嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞可以特异性识别并杀伤c-Met阳性的肿瘤细胞，同时自分泌PD-L1 scfv，加强了对肿瘤细胞的杀伤功能。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种靶向c-Met且自分泌PD-L1 scFv的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体为CD8αSP—c-Met Vk—c-Met Vh—CD8αHinge—CD137—CD3ζ—T2A—VH3-3—PD-L1Vh —PD-L1 Vk—HA tag，重链、轻链片段的连接通过Linker连接，所述的嵌合抗原受体CD8α SP—c-Met Vk—c-Met Vh—CD8αHinge—CD137—CD3ζ—T2A—VH3-3—PD-L1 Vh— PD-L1 Vk—HA tag的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。

优选的，所述的嵌合抗原受体的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。

优选的，所述的嵌合抗原受体通过其编码的核酸序列转染到T细胞中表达。

优选的，所述转染的方式为通过病毒载体、真核表达质粒或mRNA序列中的任意一种或至少两种的组合转染到T细胞。

优选的，所述病毒载体为质粒载体和/或慢病毒载体和/或逆转录病毒载体和/或腺病毒载体。

一种重组慢病毒，包括如前述方案中任一项所述的嵌合抗原受体的病毒载体与包装辅助质粒pSPAX2和pMD2G共转染哺乳细胞得到的重组慢病毒。

优选的，所述哺乳细胞为293细胞。

一种组合物，所述组合物包括如前述方案中任一项所述的嵌合抗原受体和/或前述方案中任一方案所述的重组慢病毒。

前述方案中任一项所述的嵌合抗原受体和/或前述方案中任一方案所述的重组慢病毒或前述方案中所述的组合物在制备嵌合抗原受体T细胞及其在制备肿瘤疾病治疗药物中的应用。

优选的，所述肿瘤疾病为肝癌、结肠癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌。

有益效果

本发明可靶向c-Met且自分泌PD-L1 scFv抗体的嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞(简称命名为CSPCAR-T)，所述的可靶向c-Met且自分泌PD-L1 scFv抗体的嵌合抗原受体修饰的T 淋巴细胞可以特异识别和杀伤c-Met抗原高表达的肿瘤细胞，同时自分泌PD-L1scfv，到达肿瘤组织周围，进而对肿瘤组织的免疫负调控微环境起到有效的作用，降低了肿瘤抗原逃逸的几率，增强了杀伤了效果，而且分泌型可以克服现有CAR-T细胞疗法由于免疫抑制性信号所带来的肿瘤免疫逃避问题，更好的杀伤肿瘤细胞。

附图说明

图1为本专利实施方案中CAR的结构示意图；

图2为本专利实施方案中CAR质粒的核酸电泳图；

图3为本专利实施方案中CAR质粒的表达验证图；

图4为本专利实施方案CAR质粒中分泌抗PD-L1 scFv的检测；

图5A～图5D为本专利实施方案CAR-T细胞的感染效率检测图；

图6A～图6C为本专利实施方案CAR-T细胞对不同靶细胞的杀伤作用；

图7A～图7F为本专利实施方案CAR-T细胞对不同靶细胞的IL-2和IFN-γ的细胞因子分泌情况。

具体实施方式

下面结合具体实施方式及附图详细阐述本发明。以下实施方式用于说明本发明，不用于限制本发明的范围。本领域技术人员在不违背本发明内涵的情况下可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样在本申请所附权利要求书所限范围。

实施例1：CAR表达基因的合成

本发明提供的嵌合抗原受体，由CD8α信号肽(CD8αSP)、c-MetscFv、CD8跨膜区(CD8αHinge)、CD137胞内信号区、CD3ζ胞内信号区、T2A自剪切序列、VH3-3信号肽、 PD-L1 scFv和HA tag串联而成，结构如图1所示；抗c-Met scFv及PD-L1 scFv基因序列来自本实验室所构建的单克隆抗体序列并进行了密码子优化，各基因或氨基酸序列信息如SEQ ID NO.1～18所示。

本发明中，SEQ ID NO.1～26分别为：

编码的嵌合抗原受体氨基酸序列为SEQ ID NO.1；编码嵌合抗原受体的核苷酸序列为 SEQ ID NO.2；CD8α信号肽(CD8αSP)的氨基酸残基序列为SEQ ID NO.3；c-Met scFvVk 的氨基酸残基序列为SEQ ID NO.4；linker的氨基酸残基序列为SEQ ID NO.5；c-MetscFv Vh 的氨基酸残基序列为SEQ ID NO.6；CD8α跨膜区(CD8αHinge)的氨基酸残基序列为SEQ ID NO.7；CD137胞内信号区的氨基酸残基序列为SEQ ID NO.8；CD3ζ的氨基酸残基序列为SEQ ID NO.9；T2A的氨基酸残基序列为SEQ ID NO.10；VH3-3的氨基酸残基序列为SEQ IDNO.11；PD-L1 Vh的氨基酸残基序列为SEQ ID NO.12；PD-L1 Vk的氨基酸残基序列为SEQ IDNO.13；HA tag的氨基酸残基序列为SEQ ID NO.14；编码CD8α信号肽(CD8αSP)的核苷酸残基序列为SEQ ID NO.15；编码c-Met Vk的核苷酸序列为SEQ ID NO.16；编码linker的核苷酸序列为SEQ ID NO.17；编码c-Met scFv Vh的核苷酸序列为SEQ ID NO.18；编码CD8跨膜区(CD8αHinge)的核苷酸序列为SEQ ID NO.19；编码CD137胞内信号区的核苷酸序列为SEQ IDNO.20；编码CD3ζ的核苷酸序列为SEQ ID NO.21；编码T2A的核苷酸序列为SEQ ID NO.22；编码VH3-3的核苷酸序列为SEQ ID NO.23；编码PD-L1 vh的核苷酸序列为SEQ ID NO.24；编码PD-L1 vk的核苷酸序列为SEQ ID NO.25；编码HA tag的核苷酸序列为SEQ ID NO.26。

实施实施例2：CAR质粒的构建

采用Infusion PCR完成实施例1中CAR各核苷酸结构片段的拼接，获得CAR_CSP、CAR_c-Met及CAR_Unrelated，如图1所示。

在上述三种CAR结构的5’端添加Xba I酶切位点，3’端添加Not I酶切位点，T2A 5’端添加EcoR I酶切位点。慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1a-CopGFP用Xba I/Not I进行双酶切，然后采用In-fusion PCR方式分别将CAR_CSP片段、CAR_c-Met及对照CAR_Unrelated片段分别与PCDH-CMV-MCS-EF1a-CopGFP载体连接。

将连接所得产物分别转化E.coli(DH5α)感受态，挑取单克隆培养后，提取质粒并进行测序，获得pCDH-CAR_CSP、pCDH-CAR_c-Met及pCDH-CAR_Unrelated质粒,CAR_CSP质粒的核酸电泳图见图2，结果提示CAR_CSP质粒构建成功。

实施例3：分泌型特异性CAR的结合能力及外源性CD3ζ表达鉴定

转染前24h收集对数生长期的293T(GP2)细胞，将293T(GP2)细胞接种于10cm的细胞培养皿中并在DMEM培养(含有10％FBS)中生长，置于37℃、5％CO2细胞培养箱培养，待细胞密度达到60-80％即可进行转染。

分别将pCDH-CAR_CSP、pCDH-CAR_c-Met及pCDH-CAR_Unrelated质粒转染至293T(GP2)细胞。转染24h和48h，使用荧光显微镜观察转染后GFP荧光表达情况，并于转染48h后收集 293T(GP2)细胞并提取细胞总蛋白。Western Blot法检测外源性CD3ζ表达，如图3所示，各CAR质粒均有外源性CD3ζ表达，结果表明所制备的CAR质粒可以成功在细胞内表达。

实施例4：分泌型特异性CAR分泌PD-L1 scFv的检测

分别将pCDH-CAR_CSP、pCDH-CAR_c-Met及pCDH-CAR_Unrelated质粒转染至293T(GP2) 细胞。48h后收集培养后的细胞上清，1000r/min离心去掉细胞沉淀后的上清通过HA tag磁珠进行吸附免疫共沉淀实验，洗脱产物收集进行Western Blot以此来检测上清中HA tag的存在，进而检测抗PD-L1 scFv的存在。如图4所示，仅在pCDH-CAR_CSP中检测到了HA ta g标签的存在，结果显示pCDH-CAR_CSP可以分泌出抗PD-L1 scFv。

实施例5：慢病毒的包装、浓缩与滴度测定

慢病毒的包装:转染前24h收集对数生长期的293T(GP2)细胞，将293T(GP2)细胞接种于10cm的细胞培养皿中并在DMEM培养(含有10％FBS)中生长，置于37℃、5％CO2 细胞培养箱培养，待细胞密度达到60-80％即可进行转染。

分别将pCDH-CAR_CSP、pCDH-CAR_c-Met及pCDH-CAR_Unrelated质粒和包装质粒pSPAX2、pMD2G共转染至293T(GP2)细胞。转染48h后荧光显微镜观察转染后GFP荧光表达情况，分别于转染48h和72h后收集X-293T的上清。用0.45μm滤器过滤上清，分别获得 pCDH-CAR_CSP、pCDH-CAR_c-Met及pCDH-CAR_Unrelated病毒溶液。

慢病毒的浓缩:收集细胞培养上清，使用Lenti-X浓缩病毒，按1：3的比例向病毒溶液中加入PEG8000/NaCl溶液(25％PEG8000+4.4％NaCl)，混匀后4℃静置6-8小时；4℃，4500rpm 离心40分钟。弃上清，取1：100的DMEM溶解慢病毒沉淀，分装并于-80℃储存，得慢病毒浓缩液。

慢病毒滴度测定：预先接种10³/孔的293细胞至96孔板，置于37℃、5％CO2细胞培养箱培养24小时；

准备从10^-2到10^-7的10倍稀释病毒样品，去除细胞培养液，加入含有不同病毒量的细胞培养液，并在培养液液中加入1:1000的聚凝胺(polybrene)，置于37℃5％CO2细胞培养箱培养48小时；荧光显微镜计数被染色细胞数，使用LASER法进行病毒滴度的监测。

实施例5：T细胞的分离培养及慢病毒转导

Ficoll淋巴分离液使用密度梯度离心法获得人PBMC细胞。将PBMC细胞置于CD3/CD28 抗体预包被的24孔板置于37℃，5％CO₂培养24小时。将慢病毒浓缩液按MOI＝20感染T细胞，然后加入IL-2,7,和15继续培养。感染72h后通过流式细胞仪检测T细胞表面GFP的表达(见图5A～图5D，其中，图5A为Activated T细胞的感染效率；图5B为Unrelated CAR-T 细胞的感染效率；图5C为c-Met CAR-T细胞的感染效率；图5D为CSP CAR-T细胞的感染效率)，结果显示GFP在45.8％-51.8％，表明所制备的CAR慢病毒可以成功的感染T细胞。

实施例6：CAR-T细胞体外杀伤活性

HepG2 c-Met稳定敲减细胞株HepG2^lo使用特异性shRNA转染制备。将肝癌细胞MHCC97、HepG2以及HepG2^lo细胞以2×10⁴/孔接种于96孔板，设置3个复孔，待细胞贴壁后按效靶比为10：1、5:1及2:1加入CAR-T细胞。共培养18小时后，加入Working solution 并采用LDH释放法检测CAR-T细胞特异性杀伤作用(见图6，其中，图6A为CSP、c-Met 和UnrelatedCAR-T细胞或活化的T细胞对MHCC97肝癌细胞的杀伤效率；图6B为CSP、 c-Met和UnrelatedCAR-T细胞或活化的T细胞对HepG2肝癌细胞的杀伤效率；图6C为各 CSP、c-Met和UnrelatedCAR-T细胞或活化的T细胞对HepG2^lo肝癌细胞的杀伤效率)，结果显示CSP CAR-T细胞可以较高效并特异的杀伤c-Met高表达的肝癌细胞。

1)靶细胞(T)：消化MHCC97、HepG2、HepG2^lo肝癌细胞进行细胞计数，调整细胞浓度为10⁵个/ml，吸取100μl用培养基稀释过的细胞悬液至平底96孔板中，过夜培养。

2)效应细胞(E)：取制备好的CSP CAR及其他组CAR-T细胞，使用完全培养基重悬并计数，调整细胞密度分别为A管：10⁶个/ml(10:1)、B管：5×10⁵个/ml(5:1)和 C管：2×10⁵个/ml(2：1)，以备后续使用。

3)在样品组中，将效应细胞悬液中配置的ABC管各取100ul,加入到第一步骤中96孔的靶细胞中，接着将96孔板放置在5％CO₂，37℃培养箱中培养18h；

4)加入10μl Lysis Buffer后，在5％CO₂，37℃培养箱内培养30min。

5)100μl Working Solution加入每孔，避光孵育30min。

6)提前打开并调整酶标仪检测490nm的吸光度，50μl Stop Solution加入每孔进行检测。

7)杀伤值计算：A:(样品孔-样品Blank孔)、B：(高对照孔-高对照Blank孔)和C：(低对照孔-背景Blank孔)的数值后，算出平均值。公式如下：细胞杀伤率(％)＝ [(A-C)/(B-C)]×100％。

实施例7：CAR-T细胞IL-2、IFN-γ分泌量测定

MHCC97、HepG2及HepG2^lo细胞以10⁴个/孔接种于96孔板，待细胞贴壁后以效靶比为10：1分别加入CAR-T细胞。共培养48小时后，收取共培养上清，采用ELISA法加测各组上清中IL-2和IFN-γ含量(见图7A～图7F，图7A、7D分别为CSP、c-Met和Unrelated CAR-T 细胞或活化的T细胞与MHCC97肝癌细胞共培养后培养上清中的IFN-γ和IL-2水平；图7B、 7E分别为CSP、c-Met和Unrelated CAR-T细胞或活化的T细胞对HepG2肝癌细胞共培养后培养上清中的IFN-γ和IL-2水平；图7C、7F分别为各CSP、c-Met和Unrelated CAR-T 细胞或活化的T细胞对HepG2^lo肝癌细胞共培养后培养上清中的IFN-γ和IL-2水平)，结果显示与c-Met高表达肝癌细胞共培养后，CSP CAR-T细胞分泌出了较高的IL-2和IFN-γ细胞因子，也提示CSPCAR-T细胞可高效杀伤c-Met表达阳性的肝癌细胞。

1)靶细胞：消化MHCC97、HepG2和HepG2^lo肝癌细胞，调整细胞浓度至1x10⁵个/ml，吸取100μl用培养基稀释过的细胞悬液至平底96孔板中，设置3个复孔，96孔板置于5％CO₂、37℃培养箱培养。

2)效应细胞：效应细胞：取制备好的CSP CAR-T及其他组CAR-T细胞，1500rpm，5min，弃上清，使用完全培养基重悬后进行细胞计数，调整细胞密度分别为1×10⁶个/ml；将CAR-T细胞以100ul/孔加入第一步骤中以加好靶细胞的96孔板，置于5％CO₂、37℃培养箱培养；收取细胞培养上清，1000rpm/min，5min去掉沉淀，收取上清。

3)使用1×coating buffer将capture antibody稀释，100ul/孔加入96孔板，封口膜封住，4℃过夜。

4)吸弃液体，用配置好的PBST溶液清洗96孔板，每孔250ul，浸泡1min，吸弃液体，吸水纸吸干残余液体，共漂洗3次。

5)ELISA ELISPOT Diulent用DW稀释至1×加入到96孔板，200ul/孔，室温放置1h。

6)吸弃ELISA ELISPOT Diulent，PBST溶液清洗3遍。

7)溶解标准品并用1×diulent倍比稀释，100ul加至第一孔，倍比稀释共加8孔。同时将上清以100ul/孔加入96孔板，每组3个复孔，室温避光孵育2h。

8)吸弃液体，重复第d步。96孔板中加入detection antibody,100ul/孔，室温孵育1h。

9)重复第4步，96孔板中加入Avidin-HRP，100ul/孔，室温孵育30min。

10)重复第4步，每次浸泡2min，清洗6次。

11)吸弃液体，96孔板中加入TMB,100ul/孔，室温孵育15min。

12)打开并设置酶标仪检测吸光度为450nm，加入Stop solution，50ul/孔，上机检测。

上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

说明书中所涉及序列如下所示：

SEQ ID NO.1嵌合抗原受体氨基酸序列为：

MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQSPSLLSASTGDRVTISCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYA ASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPHTFGQGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKYYA DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDNWGFDYWGQGTLVTVSSFWVLVVVGGVLA CYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSKRGRKKLLYIFKQP FMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRG RDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHM QALPPRPEFPGSGEGRGSLLTCGDVEENPGPMEFGLSWLFLVAILKGVQCEVQLLESGGGLVQPGGSLRL SCAASGFTFSSYIMMWVRQAPGKGLEWVSSIYPSGGITFYADTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAED TAVYYCARIKLGTVTTVDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQSALTQPASVSGSPGQSIT ISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADY YCSSYTSSSTRVFGTGTKVTVLYPYDVPDYA

SEQ ID NO.2嵌合抗原受体核苷酸序列为：

ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGGATATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTTACTCTCTGCATCTACAGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGTCGGG CAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTG ATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGA TTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTTACA GTACCCCTCACACTTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAAGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGG TGGTTCTGGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGATCCCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGG CGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATG CTATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATGGTATGATGGA AGTAATAAATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACAC GCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGATAACTGGGGATTTGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCTTTTTGGGTGCTGGTGGTGGT TGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAA GAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAG CATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAAACGGGGCAGAAAGAAAC TCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCT GCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACG CCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTA CGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCC TCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATG AAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAG GACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCCCGGAATTCCCGGGAAGCGGAGAGG GCAGAGGAAGTCTTCTAACATGCGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGCCCTATGGAGTTTGGGCTGAG CTGGCTTTTTCTTGTGGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGCGAGGTGCAGCTGCTGGAATCCGGCGGAG GACTGGTGCAGCCTGGCGGCTCCCTGAGACTGTCTTGCGCCGCCTCCGGCTTCACCTTCTCCAGCTAC ATCATGATGTGGGTGCGACAGGCCCCTGGCAAGGGCCTGGAATGGGTGTCCTCCATCTACCCCTCCGG CGGCATCACCTTCTACGCCGACACCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGGGACAACTCCAAGAAC ACCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGGATCA AGCTGGGCACCGTGACCACCGTGGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGTGTCCTCCGGTG GTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGTTCGCAGTCCGCCCT GACCCAGCCTGCCTCCGTGTCCTGGCTCCCTGGCCAGTCCATCACCATCAGCTGCACCGGCACCTCCA GCGACGTGGGCGGCTACAACTACGTGTCCTGGTATCAGCAGCACCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGAT GATCTACGACGTGTCCAACCGGCCCTCCGGCGTGTCCAACAGATTCTCCGGCTCCAAGTCCGGCAAC ACCGCCTCCCTGACCATCAGCGGACTGCAGGCAGAGGACGAGGCCGACTACTACTGCTCCTCCTACA CCTCCTCCAGCACCAGAGTGTTCGGCACCGGCACAAAAGTGACCGTGCTGTACCCATACGATGTTCC AGATTACGCT

SEQ ID NO.3CD8α信号肽(CD8αSP)的氨基酸残基序列为：MALPVTALLLPLALLLHAARP

SEQ ID NO.4c-Met scFv Vk的氨基酸残基序列为：

DIQMTQSPSLLSASTGDRVTISCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFT LTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPHTFGQGTKLEIK

SEQ ID NO.5linker的氨基酸残基序列为：GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS

SEQ ID NO.6c-Met scFv Vh的氨基酸残基序列为：

QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDNWGFDYWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO.7CD8跨膜区(CD8αHinge)的氨基酸残基序列为：

FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS

SEQ ID NO.8CD137胞内信号区的氨基酸残基序列为：

KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL

SEQ ID NO.9CD3ζ的氨基酸残基序列为：

RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

SEQ ID NO.10T2A的氨基酸残基序列为:PEFPGSGEGRGSLLTCGDVEENPGP

SEQ ID NO.11VH3-3的氨基酸残基序列为:MEFGLSWLFLVAILKGVQC

SEQ ID NO.12PD-L1Vh的氨基酸残基序列为：

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYIMMWVRQAPGKGLEWVSSIYPSGGITFYADTVKGRFTI SRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARIKLGTVTTVDYWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO.13PD-L1 Vk的氨基酸残基序列为：

QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSG NTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTRVFGTGTKVTVL

SEQ ID NO.14HAtag的氨基酸残基序列为：YPYDVPDYA

SEQ ID NO.15编码CD8α信号肽(CD8αSP)的核苷酸残基序列为：

ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCG

SEQ ID NO.16编码c-MetVk的核苷酸序列为：

GATATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTTACTCTCTGCATCTACAGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGTCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTA AGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATC TGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAA CAGAGTTACAGTACCCCTCACACTTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAA

SEQ ID NO.17编码linker的核苷酸序列为：

GGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGATCC

SEQ ID NO.18编码c-MetscFvVh的核苷酸序列为：

CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGT GCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGCTATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGC TGGAGTGGGTGGCAGTTATATGGTATGATGGAAGTAATAAATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCC GATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCG AGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGATAACTGGGGATTTGACTACTGGGGCCAGGGCACCC TGGTCACCGTCTCCTCT

SEQ ID NO.19编码CD8跨膜区(CD8αHinge)的核苷酸序列为：

TTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGC CGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCT CC

SEQ ID NO.20编码CD137胞内信号区的核苷酸序列为：

AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACT CAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG

SEQ ID NO.21编码CD3ζ的核苷酸序列为：

AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAAC GAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAG ATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAA GATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATG GCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCC CCCTCGC

SEQ ID NO.22编码T2A的核苷酸序列为：

CCGGAATTCCCGGGAAGCGGAGAGGGCAGAGGAAGTCTTCTAACATGCGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGCCCT

SEQ ID NO.23编码VH3-3的核苷酸序列为：

ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGCTTTTTCTTGTGGCTATTTTAAAAGGTGTCCAGTGC

SEQ ID NO.24编码PD-L1vh的核苷酸序列为:

GAGGTGCAGCTGCTGGAATCCGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCTCCCTGAGACTGTCTTGC GCCGCCTCCGGCTTCACCTTCTCCAGCTACATCATGATGTGGGTGCGACAGGCCCCTGGCAAGGGCC TGGAATGGGTGTCCTCCATCTACCCCTCCGGCGGCATCACCTTCTACGCCGACACCGTGAAGGGCCG GTTCACCATCTCCCGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGCGGGCCGAG GACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGGATCAAGCTGGGCACCGTGACCACCGTGGACTACTGGGGC CAGGGCACCCTGGTGACAGTGTCCTCC

SEQ ID NO.25编码PD-L1vk的核苷酸序列为:

CAGTCCGCCCTGACCCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGCTCCCCTGGCCAGTCCATCACCATCAGCTGCACCGGCACCTCCAGCGACGTGGGCGGCTACAACTACGTGTCCTGGTATCAGCAGCACCCCGGCAAGG CCCCCAAGCTGATGATCTACGACGTGTCCAACCGGCCCTCCGGCGTGTCCAACAGATTCTCCGGCTC CAAGTCCGGCAACACCGCCTCCCTGACCATCAGCGGACTGCAGGCAGAGGACGAGGCCGACTACTA CTGCTCCTCCTACACCTCCTCCAGCACCAGAGTGTTCGGCACCGGCACAAAAGTGACCGTGCTG

SEQ ID NO.26编码HAtag的核苷酸序列为:

TACCCATACGATGTTCCAGATTACGCT。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京医科大学

<120> 一种靶向c-Met且自分泌PD-L1 scFv的嵌合抗原受体及其应用

<130> 20200706

<160> 26

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 789

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 1

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Leu Leu

20 25 30

Ser Ala Ser Thr Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln

35 40 45

Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala

50 55 60

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro

65 70 75 80

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

85 90 95

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser

100 105 110

Tyr Ser Thr Pro His Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

130 135 140

Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val

145 150 155 160

Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr

165 170 175

Phe Ser Ser Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly

180 185 190

Leu Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr

195 200 205

Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys

210 215 220

Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala

225 230 235 240

Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Asn Trp Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

245 250 255

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly

260 265 270

Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile

275 280 285

Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met

290 295 300

Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro

305 310 315 320

Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Lys Arg Gly Arg

325 330 335

Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln

340 345 350

Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu

355 360 365

Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala

370 375 380

Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu

385 390 395 400

Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp

405 410 415

Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu

420 425 430

Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile

435 440 445

Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr

450 455 460

Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met

465 470 475 480

Gln Ala Leu Pro Pro Arg Pro Glu Phe Pro Gly Ser Gly Glu Gly Arg

485 490 495

Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met

500 505 510

Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly Val

515 520 525

Gln Cys Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro

530 535 540

Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser

545 550 555 560

Ser Tyr Ile Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu

565 570 575

Trp Val Ser Ser Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Ile Thr Phe Tyr Ala Asp

580 585 590

Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr

595 600 605

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

610 615 620

Tyr Cys Ala Arg Ile Lys Leu Gly Thr Val Thr Thr Val Asp Tyr Trp

625 630 635 640

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

645 650 655

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser

660 665 670

Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser Ile

675 680 685

Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr

690 695 700

Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met Ile

705 710 715 720

Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly

725 730 735

Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Ala

740 745 750

Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Ser Thr

755 760 765

Arg Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Tyr Pro Tyr Asp

770 775 780

Val Pro Asp Tyr Ala

785

<210> 2

<211> 2367

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccggatatcc agatgaccca gtctccatcc ttactctctg catctacagg agacagagtc 120

accatcagtt gtcgggcaag tcagagcatt agcagctatt taaattggta tcagcagaaa 180

ccagggaaag cccctaagct cctgatctat gctgcatcca gtttgcaaag tggggtccca 240

tcaaggttca gtggcagtgg atctgggaca gatttcactc tcaccatcag cagtctgcaa 300

cctgaagatt ttgcaactta ctactgtcaa cagagttaca gtacccctca cacttttggc 360

caggggacca agctggagat caaaggtggt ggtggttctg gtggtggtgg ttctggcggc 420

ggcggctccg gtggtggtgg atcccaggtg cagctggtgg agtctggggg aggcgtggtc 480

cagcctggga ggtccctgag actctcctgt gcagcctctg gattcacctt cagtagctat 540

gctatgcact gggtccgcca ggctccaggc aaggggctgg agtgggtggc agttatatgg 600

tatgatggaa gtaataaata ctatgcagac tccgtgaagg gccgattcac catctccaga 660

gacaattcca agaacacgct gtatctgcaa atgaacagcc tgagagccga ggacacggct 720

gtgtattact gtgcgagaga taactgggga tttgactact ggggccaggg caccctggtc 780

accgtctcct ctttttgggt gctggtggtg gttggtggag tcctggcttg ctatagcttg 840

ctagtaacag tggcctttat tattttctgg gtgaggagta agaggagcag gctcctgcac 900

agtgactaca tgaacatgac tccccgccgc cccgggccca cccgcaagca ttaccagccc 960

tatgccccac cacgcgactt cgcagcctat cgctccaaac ggggcagaaa gaaactcctg 1020

tatatattca aacaaccatt tatgagacca gtacaaacta ctcaagagga agatggctgt 1080

agctgccgat ttccagaaga agaagaagga ggatgtgaac tgagagtgaa gttcagcagg 1140

agcgcagacg cccccgcgta caagcagggc cagaaccagc tctataacga gctcaatcta 1200

ggacgaagag aggagtacga tgttttggac aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg 1260

ggaaagccga gaaggaagaa ccctcaggaa ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag 1320

atggcggagg cctacagtga gattgggatg aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac 1380

gatggccttt accagggtct cagtacagcc accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg 1440

caggccctgc cccctcgccc ggaattcccg ggaagcggag agggcagagg aagtcttcta 1500

acatgcggtg acgtggagga gaatcccggc cctatggagt ttgggctgag ctggcttttt 1560

cttgtggcta ttttaaaagg tgtccagtgc gaggtgcagc tgctggaatc cggcggagga 1620

ctggtgcagc ctggcggctc cctgagactg tcttgcgccg cctccggctt caccttctcc 1680

agctacatca tgatgtgggt gcgacaggcc cctggcaagg gcctggaatg ggtgtcctcc 1740

atctacccct ccggcggcat caccttctac gccgacaccg tgaagggccg gttcaccatc 1800

tcccgggaca actccaagaa caccctgtac ctgcagatga actccctgcg ggccgaggac 1860

accgccgtgt actactgcgc ccggatcaag ctgggcaccg tgaccaccgt ggactactgg 1920

ggccagggca ccctggtgac agtgtcctcc ggtggtggtg gttctggtgg tggtggttct 1980

ggcggcggcg gctccggtgg tggtggttcg cagtccgccc tgacccagcc tgcctccgtg 2040

tcctggctcc ctggccagtc catcaccatc agctgcaccg gcacctccag cgacgtgggc 2100

ggctacaact acgtgtcctg gtatcagcag caccccggca aggcccccaa gctgatgatc 2160

tacgacgtgt ccaaccggcc ctccggcgtg tccaacagat tctccggctc caagtccggc 2220

aacaccgcct ccctgaccat cagcggactg caggcagagg acgaggccga ctactactgc 2280

tcctcctaca cctcctccag caccagagtg ttcggcaccg gcacaaaagt gaccgtgctg 2340

tacccatacg atgttccaga ttacgct 2367

<210> 3

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 3

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro

20

<210> 4

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 4

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Leu Leu Ser Ala Ser Thr Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro His

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 5

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 5

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser

20

<210> 6

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 6

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Asn Trp Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 7

<211> 68

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 7

Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu

1 5 10 15

Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser

20 25 30

Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly

35 40 45

Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala

50 55 60

Ala Tyr Arg Ser

65

<210> 8

<211> 42

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 8

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40

<210> 9

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 9

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 10

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 10

Pro Glu Phe Pro Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys

1 5 10 15

Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro

20 25

<210> 11

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 11

Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly

1 5 10 15

Val Gln Cys

<210> 12

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 12

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ile Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Tyr Pro Ser Gly Gly Ile Thr Phe Tyr Ala Asp Thr Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ile Lys Leu Gly Thr Val Thr Thr Val Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 13

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 13

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr

20 25 30

Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser Ser

85 90 95

Ser Thr Arg Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu

100 105 110

<210> 14

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 14

Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala

1 5

<210> 15

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 15

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccg 63

<210> 16

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 16

gatatccaga tgacccagtc tccatcctta ctctctgcat ctacaggaga cagagtcacc 60

atcagttgtc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120

gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180

aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240

gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta cccctcacac ttttggccag 300

gggaccaagc tggagatcaa a 321

<210> 17

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 17

ggtggtggtg gttctggtgg tggtggttct ggcggcggcg gctccggtgg tggtggatcc 60

<210> 18

<211> 348

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 18

caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agctatgcta tgcactgggt ccgccaggct 120

ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatggtatg atggaagtaa taaatactat 180

gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagataac 300

tggggatttg actactgggg ccagggcacc ctggtcaccg tctcctct 348

<210> 19

<211> 204

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 19

ttttgggtgc tggtggtggt tggtggagtc ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg 60

gcctttatta ttttctgggt gaggagtaag aggagcaggc tcctgcacag tgactacatg 120

aacatgactc cccgccgccc cgggcccacc cgcaagcatt accagcccta tgccccacca 180

cgcgacttcg cagcctatcg ctcc 204

<210> 20

<211> 126

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 20

aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60

actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120

gaactg 126

<210> 21

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 21

agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc 60

tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120

cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180

gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240

cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300

tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336

<210> 22

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 22

ccggaattcc cgggaagcgg agagggcaga ggaagtcttc taacatgcgg tgacgtggag 60

gagaatcccg gccct 75

<210> 23

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 23

atggagtttg ggctgagctg gctttttctt gtggctattt taaaaggtgt ccagtgc 57

<210> 24

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 24

gaggtgcagc tgctggaatc cggcggagga ctggtgcagc ctggcggctc cctgagactg 60

tcttgcgccg cctccggctt caccttctcc agctacatca tgatgtgggt gcgacaggcc 120

cctggcaagg gcctggaatg ggtgtcctcc atctacccct ccggcggcat caccttctac 180

gccgacaccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgggaca actccaagaa caccctgtac 240

ctgcagatga actccctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc ccggatcaag 300

ctgggcaccg tgaccaccgt ggactactgg ggccagggca ccctggtgac agtgtcctcc 360

<210> 25

<211> 330

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 25

cagtccgccc tgacccagcc tgcctccgtg tctggctccc ctggccagtc catcaccatc 60

agctgcaccg gcacctccag cgacgtgggc ggctacaact acgtgtcctg gtatcagcag 120

caccccggca aggcccccaa gctgatgatc tacgacgtgt ccaaccggcc ctccggcgtg 180

tccaacagat tctccggctc caagtccggc aacaccgcct ccctgaccat cagcggactg 240

caggcagagg acgaggccga ctactactgc tcctcctaca cctcctccag caccagagtg 300

ttcggcaccg gcacaaaagt gaccgtgctg 330

<210> 26

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 26

tacccatacg atgttccaga ttacgct 27

Claims

1.一种靶向c-Met且自分泌PD-L1 scFv的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体为CD8αSP—c-Met Vk—c-Met Vh—CD8αHinge—CD137—CD3ζ—T2A—VH3-3—PD-L1Vh—PD-L1 Vk—HAtag，所述的嵌合抗原受体CD8αSP—c-Met Vk—c-Met Vh—CD8αHinge—CD137—CD3ζ—T2A—VH3-3—PD-L1 Vh—PD-L1 Vk—HAtag的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。

2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，编码所述的嵌合抗原受体的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。

3.根据权利要求2所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述的嵌合抗原受体通过将编码其的核苷酸序列转染到T细胞中表达。

4.根据权利要求3所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述转染的方式为通过病毒载体、真核表达质粒或mRNA序列中的任意一种或至少两种的组合转染到T细胞。

5.根据权利要求4所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述病毒载体为质粒载体和/或慢病毒载体和/或逆转录病毒载体和/或腺病毒载体。

6.一种重组慢病毒，其特征在于，包括如权利要求1-5中任一项所述的嵌合抗原受体的病毒载体与包装辅助质粒pSPAX2和pMD2G共转染哺乳细胞得到的重组慢病毒。

7.根据权利要求6所述的重组慢病毒，其特征在于，所述哺乳细胞为293细胞。

8.一种组合物，其特征在于，所所述组合物包括如权利要求1-5中任一项所述的嵌合抗原受体和/或如权利要求6或7任一项所述的重组慢病毒。

9.权利要求1-5中任一项所述的嵌合抗原受体、权利要求6或7任一项所述的重组慢病毒或如权利要求8所述的组合物在制备嵌合抗原受体T细胞及其在制备肿瘤疾病治疗药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述肿瘤疾病为肝癌、结肠癌、胃癌、肺癌、乳腺癌或卵巢癌。