CN102174106A

CN102174106A - 抗Met人源Fab及其阿霉素偶联物和其制法及应用

Info

Publication number: CN102174106A
Application number: CN2011100652092A
Authority: CN
Inventors: 朱进; 冯振卿
Original assignee: Individual
Current assignee: Anhui Sinobioway Cell Therapy Co ltd
Priority date: 2011-03-17
Filing date: 2011-03-17
Publication date: 2011-09-07
Anticipated expiration: 2031-03-17
Also published as: CN102174106B

Abstract

抗Met人源Fab及其阿霉素偶联物和其制法及应用，轻链的氨基酸序列如SEQ ID No：1所示，重链的氨基酸序列如SEQ ID No：2所示。轻链的核苷酸序列如SEQ ID No：3所示，重链的核苷酸序列如SEQ ID No：4所示。体外细胞毒性试验结果表明抗Met人源Fab与阿霉素的偶联物与游离阿霉素均能有效杀伤Met阳性表达肝癌细胞，而偶联物对Met阴性表达细胞的毒性作用明显小于游离阿霉素；体内裸鼠皮下人肝癌细胞移植瘤治疗实验的结果表明抗Met人源Fab与阿霉素的偶联物与游离阿霉素均能有效抑制裸鼠皮下人肝癌移植瘤的生长，且偶联物能明显减轻化疗药物所致的小鼠体重降低的不良反应。

Description

抗Met人源Fab及其阿霉素偶联物和其制法及应用

技术领域

本发明属生物制药领域，涉及一种抗细胞表面Met受体的人源Fab与化疗药物阿霉素的偶联及其制备方法，以及偶联后抗Met人源Fab在肝癌生物靶向治疗中的应用。

背景技术

原发性肝癌(primary hepatocellular carcinoma，PLC)中90％为肝细胞性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)。肝细胞性肝癌是世界第5位高发的肿瘤，由于缺乏有效的治疗手段，目前是致死率第3位的恶性肿瘤，严重威胁着人类的生命和健康。随着现代分子生物学技术和基因工程技术的迅速发展，为肝癌的生物治疗开辟了全新的领域，生物治疗已成为继手术、放疗、化疗后肿瘤治疗的第4种模式，并显示出了良好的应用前景，主要包括：分子靶向治疗、免疫治疗、基因治疗、内分泌治疗、干细胞治疗等。分子靶向治疗是将靶向肿瘤细胞表面特异性分子的配体与药物、放射性核素或生物毒素等偶联，靶向性杀伤肿瘤细胞，由于其能靶向作用于肿瘤局部，具有效率高副作用小等优点。而基于化疗药物偶联的分子靶向肝癌治疗已成为新的研究热点。

HCC的发病机制十分复杂，其发生、发展和转移与多种基因的突变、细胞信号传导通路和新生血管增生异常等密切相关，其中多个关键性环节，是进行分子靶向治疗的理论基础和重要的潜在靶点。现已知肝细胞生长因子(HGF)/Met信号通路在原发性肿瘤的形成及继发转移中起着至关重要的作用。Met是HGF的高亲和性配体，在肺癌、结肠癌、肝癌、直肠癌、胃癌、卵巢癌、肾癌、神经胶质瘤、黑素瘤、乳腺癌、前列腺癌等肿瘤组织中呈现出异常的高表达、突变或活性改变。有研究表明Met在侵袭型HCC组织中高表达，与临床早期复发相关，在判断肝癌预后和早期转移中有重要作用。由于HGF/Met在肝癌的形成，侵袭，转移等过程中都发挥着重要作用，目前已经发现了许多阻断HGF/Met信号转导途径的抑制剂，针对HGF/Met信号通路的各个环节。并且由于Met是许多肿瘤信号通路的交叉点，因此一旦以Met为靶标阻断肝癌细胞中的异常活化的HGF/Met信号通路，可相对较容易地实现对许多通路的同时干扰，使细胞出现形态改变、增殖减缓、成瘤性降低、侵袭能力下降等一系列的变化。因此以Met为靶标制备相应抗体，并将其应用到肝癌的抗体靶向生物治疗中，将成为肝癌治疗的一个新思路。

阿霉素是临床最早使用的肿瘤化疗药物之一，使用范围广，是肝癌化疗的常用药物之一，但是其毒副反应较大，最常见的是心脏毒性和骨髓抑制，限制了其在临床肿瘤治疗中的应用。将阿霉素和抗Met抗体偶联，利用抗体的靶向性，有效的将药物靶向到肿瘤部位，有希望降低阿霉素剂量，减轻化疗不良反应，最终提高化疗效果。

发明内容

解决的技术问题：本发明旨在提供抗Met人源Fab；

本发明的另一目的是制备抗Met人源Fab与阿霉素的偶联物，该偶联物不仅对体外培养的肝癌细胞有杀伤作用，而且对皮下人肝癌细胞移植瘤的裸鼠模型有治疗作用，最终为其应用到肝癌分子靶向治疗提供基础；

本发明的另一目的在于提供抗Met人源Fab与阿霉素的偶联方法，能制备出特异性结合肝癌细胞表面的Met受体蛋白的偶联物。

技术方案：一种抗Met人源Fab，轻链的氨基酸序列如SEQ ID No：1所示，重链的氨基酸序列如SEQ ID No：2所示。

一种抗Met人源Fab，轻链的核苷酸序列如SEQ ID No：3所示，重链的核苷酸序列如SEQ ID No：4所示。

上述抗Met人源Fab与阿霉素偶联后的产物。

制备抗Met人源Fab与阿霉素偶联后产物的方法，步骤为：聚乙二醇100在高锰酸钾酸性溶液的氧化下生成聚乙二醇二酸，然后于80℃下酰氯化，得聚乙二醇酰氯，聚乙二醇酰氯与阿霉素反应，生成聚乙二醇化的DOX；除去有机反应溶剂，用PBS调整反应溶液的pH为7.2，用二氯乙烷活化后，与Met抗体反应24h，透析，浓缩，并用葡聚糖凝胶G100进行分离，既得到抗Met人源Fab与阿霉素偶联后产物。

上述抗Met人源Fab与阿霉素偶联后产物在制备抗肝癌药物中的应用。

本发明从肝癌病人的外周全血中分离的B淋巴细胞中克隆了基因组所有的抗体重、轻链可变区基因，采取基因工程方法，构建库容量为7.8×10⁸的全人源免疫型Fab抗体库，用纯化的人Met蛋白对噬菌体抗体库进行富集筛选，分离筛选出了一株抗Met人源Fab抗体。经过流式检测其能与Met阳性表达的细胞结合，而与Met阴性表达的细胞不结合。此外，该抗体片段具有较好的亲和力并且能有效内化。

大量表达并纯化抗Met人源Fab抗体片段蛋白；通过化学键合的方法与阿霉素偶联；偶联后通过免疫荧光的方法观察到抗Met人源Fab与阿霉素的偶联物与其亲本抗体一样能与表达Met的肝癌细胞特异性的结合，并且能将阿霉素靶向性的带入Met表达的肝癌细胞中。细胞ELISA的结果表明偶联物与其亲本抗体一样能与表达Met的肝癌细胞特异性的结合，而不与Met阴性表达的细胞结合。此为其可能应用到肝癌分子靶向治疗中提供了依据。

有益效果：

体外细胞毒性试验结果表明抗Met人源Fab与阿霉素的偶联物与游离阿霉素均能有效杀伤Met阳性表达肝癌细胞，而偶联物对Met阴性表达细胞的毒性作用明显小于游离阿霉素；体内裸鼠皮下人肝癌细胞移植瘤治疗实验的结果表明抗Met人源Fab与阿霉素的偶联物与游离阿霉素均能有效抑制裸鼠皮下人肝癌移植瘤的生长，且偶联物能明显减轻化疗药物所致的小鼠体重降低的不良反应。

附图说明

图1为人源抗c-Met Fab基因的合成；其中M：DNA Marker，1：Fab，2：Fd，3：L，4：CH1，5：CL，6：VL，7：VH；

图2为SDS-PAGE检测protein L柱纯化MetFab抗体蛋白结果，M：分子量Marker；1：纯化后的MetFab；

图3为免疫荧光实验观察偶联前后的MetFab与sk-Hep-1细胞表面Met蛋白的结合能力(SK-Hep-1-DOX-MetFab)；

图4为免疫荧光实验观察偶联前的MetFab与sk-Hep-1细胞表面Met蛋白的结合能力(SK-Hep-1-MetFab)；

图5为游离DOX和DOX-MetFab随时间延长进入细胞过程的观察结果(30分钟)；

图6为游离DOX和DOX-MetFab随时间延长进入细胞过程的观察结果(1小时)；

图7为游离DOX和DOX-MetFab随时间延长进入细胞过程的观察结果(2小时)；

图8为游离DOX和DOX-MetFab随时间延长进入细胞过程的观察结果(3.5小时)；

图9游离DOX及DOX-MetFab对肝癌细胞HepG2的细胞毒性作用

图10游离DOX及DOX-MetFab对肝癌细胞SMMC7721的细胞毒性作用

图11游离DOX及DOX-MetFab对肝癌细胞sk-Hep-1的细胞毒性作用

图12药物作用24h游离DOX及DOX-MetFab对NIH3T3的细胞毒性作用

图13药物作用48h游离DOX及DOX-MetFab对NIH3T3的细胞毒性作用

图14药物作用24h游离DOX及DOX-MetFab对LO2的细胞毒性作用

图15药物作用48h游离DOX及DOX-MetFab对LO2的细胞毒性作用

图16生理盐水、游离DOX及DOX-MetFab处理后2种肝癌移植瘤的瘤重比较；

图17为DOX-MetFab的裸鼠体内治疗实验，A：HepG2细胞接种裸鼠，各种处理观察对肿瘤体积的影响；

图18为DOX-MetFab的裸鼠体内治疗实验，B：HepG2细胞接种裸鼠，各种处理观察对裸鼠体重的影响；

图19为DOX-MetFab的裸鼠体内治疗实验，C：sk-Hep-1细胞接种裸鼠，各种处理观察对肿瘤体积的影响；

图20为DOX-MetFab的裸鼠体内治疗实验，D：sk-Hep-1细胞接种裸鼠，各种处理观察对裸鼠体重的影响；

图21小鼠肺脏的病理学观察(HE，X200)，游离DOX处理组肺泡腔充血出血严重；

图22小鼠肺脏的病理学观察(HE，X200)，DOX-MetFab处理组，肺泡结构正常，无明显充血出血表现；

图23小鼠肺脏的病理学观察(HE，X200)，生理盐水处理组，肺泡结构正常，无明显充血出血表现；

图24小鼠肾脏的病理学观察(HE，X200)，游离DOX处理组肾小球萎缩，可见萎缩变性的肾小球；

图25小鼠肾脏的病理学观察(HE，X200)，DOX-MetFab处理组肾小球结构基本正常。无明显萎缩变性表现；

图26小鼠肾脏的病理学观察(HE，X200)，生理盐水处理组肾小球结构基本正常。无明显萎缩变性表现。

图27为MetFab与阿霉素通过化学键合的方法偶联反应式。

具体实施方式

1.全人源免疫型Fab噬菌体抗体库的构建

从肝癌病人的外周全血中分离的B淋巴细胞中克隆了基因组所有的抗体重、轻链可变区基因，采取基因工程方法，构建库容量为7.8×10⁸的全人源免疫型Fab抗体库

2.抗Met人源Fab抗体筛选表达及活性鉴定

用纯化的Met蛋白对构建的噬菌体抗体库进行富集筛选，分离并纯化了1株抗Met人源Fab。流式细胞实验观察该Fab抗体与Met阳性及阴性表达细胞的结合能力的差异。

3.抗Met人源Fab抗体分子与阿霉素的偶联

化学键合的方法将抗Met人源Fab抗体分子与阿霉素的偶联，分离纯化得到了抗Met人源Fab抗体分子与阿霉素的偶联物。

4.偶联后抗体活性的鉴定

免疫荧光的方法及细胞ELISA观察抗Met人源Fab与阿霉素的偶联物是否与其亲本抗体一样能与表达Met的肝癌细胞特异性的结合，并且能将阿霉素靶向性的带入Met表达的肝癌细胞中。

5.抗Met人源Fab抗体与阿霉素偶联物对肿瘤细胞的体外杀伤作用

将偶联物及游离的阿霉素分别作用与Met阳性表达的肝癌细胞和Met阴性表达的细胞，观察偶联物是否同游离阿霉素一样具有细胞毒性作用，并观察二者对不同Met表达水平细胞的毒性作用的差异。

6.抗Met人源Fab抗体与阿霉素偶联物对裸鼠人肝癌移植瘤模型的体内治疗作用

建立裸鼠的人肝癌移植瘤模型，分别应用偶联物和游离阿霉素进行治疗，观察偶联物与游离的阿霉素对肿瘤的体内治疗作用，比较二者化疗不良反应的差异。

实施例1全人源免疫型Fab噬菌体抗体库的构建

采集肝癌病人外周全血40份，分离淋巴细胞，采用Invitrogen公司的Trizol抽提总RNA，用oligo(dT)₂₀为引物，逆转录生成cDNA。然后利用特异性引物PCR分别扩增其重、轻链可变区基因。经Overlap PCR合成Fab基因(图1)，与经相同酶切的表达载体pComb3XSS连接，构建Fab的原核重组表达载体；电转化感受态大肠杆菌XL1-Blue，构建构建了容量为6.5×10⁸的全人源免疫型Fab抗体库。

所述构建的Fab基因与pComb3xSS载体连接是指：将纯化定量后的Fab基因分别以SfiI内切酶进行双酶切消化；纯化、定量后与同样双酶切pComb3xSS载体连接；所述的转化是指：a)0.2cm电转杯，25μF，2.5kV，200Ω的电转条件转化感受态大肠杆菌XL1-Blue；b)转化产物加入LB培养基后37℃振荡培养2h，10倍梯度稀释将菌液涂布于SOBAG琼脂板上，30℃过夜培养；c)次日计算平板上的克隆数，估算库容为6.5×10⁸；d)将电转化后菌液加入辅助噬菌体M13K07超感染，离心沉淀菌体，用LB培养基重悬，37℃振荡过夜，离心沉淀菌体，吸取上清即为Fab噬菌体表面展示文库。

实施例2抗Met人源Fab的筛选，表达及纯化

(1)噬菌体抗体库的富集筛选：用纯化的人Met重组蛋白包被固相筛选ELISA板，每孔1μg，洗涤，加封闭液，洗涤，加入噬菌体抗体库抗体，洗涤去除未结合的噬菌体抗体；加入胰蛋白酶，洗脱特异性结合的噬菌体抗体，感染增值，辅助噬菌体M13K07超感染；重复以上筛选步骤，共进行三轮“吸附-洗脱-扩增”富集筛选；

(2)ELISA鉴定阳性克隆：将最后一轮筛选且增值得到的噬菌体稀释后铺于培养板上培养过夜，挑取564个单菌落于细胞培养板中，振摇培养过夜；从第一块板各孔中分别转移5μl菌液至第二块板，振摇培养；加辅助噬菌体M13K07超感染，振摇培养；离心，培养基重悬沉淀，振摇培养过夜。离心取上清进行ELISA检测，测定每孔450nm和650nm吸光值，按A450nm-A650nm计算每孔吸光值；当P/N值(Positive/Negative)大于2.1时，该菌株为阳性单克隆噬菌体菌株；共得到32个阳性克隆。阳性克隆经核酸序列分析后，发现有1株Fab克隆与人Met重组蛋白有较强的结合活性，Fab重、轻链可变区基因序列分析应用以下两个服务器：

http://imgt.cines.fr/IMGT_vquest/vquest？livret＝0&Option＝mouseIg

http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi

核酸序列及氨基酸序列

VH

CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGCTA TGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATGGTATGATGGAAGTAATAAATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCC G ATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGATA

EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDNWGFDYWGQGTLVTVSP

VL

GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTTACTCTCTGCATCTACAGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGTCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGTTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGCAGAGTTACAGTACCCCTCACACTTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGA

ELQMTQSPSLLSASTGDRVTISCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPHTFGQGTKLEIKR

(3)阳性克隆的大量表达和纯化：选择ELISA检测中吸光值最高的1株阳性克隆噬菌体感染非抑制型Top10F’，含有重组质粒pComb3x-Fab的菌株接种10mL的SB液体培养基中(含有100μg/mL的氨苄青霉素)，37℃摇床培养至OD600nm至0.4-0.6时，加入终浓度为1mM的IPTG，25℃诱导过夜。12000rpm离心收集菌体，超声破菌后收集超声裂解上清，用0.2μm滤膜过滤后，采用AKTA的FPLC蛋白纯化仪，Protein L柱纯化。该条件下，能从细菌超声裂解上清中纯化得到纯度较高的MetFab，产率较高。

所述的纯化是指a)把ProteinL亲和层析柱安装至蛋白质纯化仪上，b)用10个柱床体积的结合缓冲液(0.05mol/L Na₂HPO₄，0.05mol/L NaH₂PO₄，0.35mol/LNaCl，pH 7.2)平衡柱床，c)上样品，流速为1mL/分钟。d)用结合缓冲液洗涤柱床至A280nm吸光度到基线，用5-10个柱床体积的洗脱缓冲液(0.1mol/LGlycine，0.15mol/LNaCl，pH 2.7)洗脱目的蛋白，用SDS-PAGE鉴定(图2)。

实施例3MetFab与阿霉素偶联

MetFab与阿霉素通过化学键合的方法偶联。首先，PEG100(聚乙二醇100)在高锰酸钾酸性溶液的氧化下生成聚乙二醇二酸(2)。然后于80℃下酰氯化，得聚乙二醇酰氯(3)。聚乙二醇酰氯与DOX反应，生成聚乙二醇化的DOX。除去有机反应溶剂，用PBS调整反应溶液的pH为7.2，用EDC活化后，与Met抗体反应24h。透析，浓缩，并用葡聚糖凝胶G100进行分离，既得到目标产物MET-DOX。经过高效液相色谱分析，认为抗体与阿霉素偶联成功。并将偶联物命名为DOX-MetFab。(图27)

实施例4偶联后抗体活性的鉴定

(1)免疫荧光实验：用SK-Hep-12X104铺96孔板，贴壁后用4％多聚甲醛固定，2％BSA封闭37度2h，加入偶联前后的MetFab为一抗(均含有MetFab40μg/mL)孵育2h，含0.5％Tween的PBST洗3次，再加入绿色荧光标记的羊抗人Fab二抗(1∶16)孵育1h，荧光显微镜下观察，细胞都能显示绿色荧光，表明偶联后的MetFab(DOX-MetFab)与其亲本抗体一样都能结合SK-Hep-1细胞上的Met蛋白。并且由于阿霉素有自发的红色荧光，所以可以观察到DOX-MetFab作用的SK-Hep-1细胞还呈现有红色荧光(图3-4)。

(2)药物作用细胞过程的观察：96孔板培养SK-Hep-1，分别加入含20μg/mL阿霉素的游离阿霉素标准品和DOX-MetFab，在药物作用30min，1h，2h，3.5h后分别荧光显微镜下观察。相同条件下，将二者作用于不表达Met的NIH3T3细胞3.5h，荧光显微镜下观察荧光分布情况。结果发现随着作用时间的延长，细胞内阿霉素的红色荧光逐渐增多；并且游离阿霉素作用下主要表现为在细胞核内的红色荧光，且很快呈现在核中；DOX-MetFab作用下阿霉素的红色荧光在细胞膜-胞浆-核均有呈现，并且随着作用时间的延长表现为的从细胞膜-胞浆-核的呈现过程。表明游离的阿霉素和DOX-MetFab的阿霉素进入细胞的路径不同，MetFab能将阿霉素通过细胞表面的特异性受体内化而带入细胞中。游离的阿霉素作用下，NIH3T3细胞的核上能观察到红色荧光，而DOX-MetFab作用时不能观察到红色荧光，也证明了DOX-MetFab只能结合Met表达的细胞，并将药物带入细胞中(图5-8)。

(3)细胞ELISA实验比较偶联前后抗体结合能力：SK-Hep-1细胞包板，分别加入MetFab，DOX-MetFab，能与HRP-羊抗人Fab结合的抗炭疽毒素的嵌合人IgG(阴性对照)做为一抗，所含的抗体浓度均设40、20、10、5、1.25、0.31μg/mL 6个梯度；同时用NIH3T3细胞包板，加入相同浓度梯度的DOX-MetFab；空白对照不加一抗，二抗为HRP-羊抗人Fab(1∶2000)，TMB显色。结果发现抗炭疽毒素的嵌合人IgG不能与SK-Hep-1细胞结合，DOX-MetFab也不能与NIH3T3细胞结合，而MetFab和DOX-MetFab均能与SK-Hep-1细胞表面的Met受体特异性结合结合，具有浓度依赖性；且DOX-MetFab的结合能力略低于MetFab，表明偶联后仍保留了抗体特异性的结合能力，但是偶联有可能对抗体的空间构象有影响而在一定程度上影响了抗体的结合能力。

实施例5偶联后抗体对肝癌细胞的体外杀伤作用

选用Met高表达的肝癌细胞HepG2，SK-Hep-1，SMMC-7721，5000个/孔铺96孔板，设阿霉素组，DOX-MetFab组，MetFab组和不加药物处理组，阿霉素组与DOX-MetFab组按照阿霉素的剂量设0.25、0.5、1、2.5、5、7.5、10μg/mL浓度组，MetFab组给予DOX-MetFab组相同量的抗体蛋白，药物作用48h，MTT观察对细胞的杀伤作用。

同时选用不表达Met的NIH3T3和人正常肝细胞LO2，用阿霉素，DOX-MetFab和MetFab同样条件分别处理细胞24h和48h，MTT观察对细胞的杀伤作用。

结果表明MetFab对上述所有细胞均无杀伤作用。阿霉素和DOX-MetFab对肿瘤细胞均有杀伤作用，且有剂量依赖性，DOX-MetFab杀伤效果略低于阿霉素。阿霉素对不表达Met的NIH3T3和人正常肝细胞LO2均有杀伤作用，药物作用24h杀伤作用就非常明显。DOX-MetFab作用NIH3T3至48h仍无明显杀伤作用，而作用LO2细胞24h时杀伤作用不明显，作用48h时显示出杀伤作用，但明显弱于游离阿霉素的细胞杀伤作用(图9-15)。

实施例6DOX-MetFab的裸鼠体内治疗实验

选用Met高表达的HepG2及sk-Hep-1细胞，培养至对数生长期，胰酶消化收集细胞，无血清的DMEM重悬，调整细胞浓度，以1X10⁶/只接种于4-6周龄的裸鼠背部皮下。10天后待平均肿瘤体积为150mm3时分组给予治疗：生理盐水组(只给等体积生理盐水)；MetFab组(含与DOX-MetFab组等量的MetFab)；DOX-MetFab组(含DOX 2mg/kg)；DOX组(2mg/kg)。治疗方法为隔天1次，尾静脉注射，治疗因DOX组的小鼠发生死亡而结束，共治疗10次。隔天测量小鼠肿瘤长短径，按照公式V＝1/2ab2计算肿瘤体积，隔天称量小鼠体重。实验结束后剥离肿瘤称量瘤重，取重要组织脏器进行固定，行病理学观察。

治疗结束时，生理盐水组的肿瘤最大，而DOX组的肿瘤最小(图16)；监测小鼠体重时发现，随着治疗时间的延长，DOX组的小鼠体重明显下降，最终发生严重恶液质而死亡；而其他3组小鼠体重未有明显下降(图17-20)；组织病理显示DOX组的小鼠肾脏肾小球的萎缩严重，肺脏充血出血明显，肺泡融合，炎性细胞浸润严重，而其余组小鼠肾脏和肺脏的情况明显好于DOX组(图21-26)。

序列表

<110>南京医科大学

<120>抗Met人源Fab及其阿霉素偶联物和其制法及应用

<130>

<160>4

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>116

<212>PRT

<213>Fab抗体库

<400>1

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Asn Trp Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Pro

115

<210>2

<211>108

<212>PRT

<213>Fab抗体库

<400>2

Glu Leu Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Leu Leu Ser Ala Ser Thr Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro His

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

<210>3

<211>348

<212>DNA

<213>Fab抗体库

<400>3

caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agctatgcta tgcactgggt ccgccaggct 120

ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatggtatg atggaagtaa taaatactat 180

gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagataac 300

tggggatttg actactgggg ccagggcacc ctggtcaccg tctcccct 348

<210>4

<211>324

<212>DNA

<213>Fab抗体库

<400>4

gacatccaga tgacccagtc tccatcctta ctctctgcat ctacaggaga cagagtcacc 60

atcagttgtc gggcaagtca gagcattagc agttatttaa attggtatca gcagaaacca 120

gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180

aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240

gaagattttg caacttacta ctgtcagcag agttacagta cccctcacac ttttggccag 300

gggaccaagc tggagatcaa acga 324

Claims

1.一种抗Met人源Fab，其特征在于轻链的氨基酸序列如SEQ ID No：1所示，重链的氨基酸序列如SEQ ID No：2所示。

2.一种抗Met人源Fab，其特征在于轻链的核苷酸序列如SEQ ID No：3所示，重链的核苷酸序列如SEQ ID No：4所示。

3.权利要求1或2所述抗Met人源Fab与阿霉素偶联后的产物。

4.制备权利要求3所述抗Met人源Fab与阿霉素偶联后产物的方法，其特征在于步骤为：聚乙二醇100在高锰酸钾酸性溶液的氧化下生成聚乙二醇二酸，然后于80℃下酰氯化，得聚乙二醇酰氯，聚乙二醇酰氯与阿霉素反应，生成聚乙二醇化的DOX；除去有机反应溶剂，用PBS调整反应溶液的pH为7.2，用二氯乙烷活化后，与Met抗体反应24h，透析，浓缩，并用葡聚糖凝胶G100进行分离，既得到抗Met人源Fab与阿霉素偶联后产物。

5.权利要求3所述抗Met人源Fab与阿霉素偶联后产物在制备抗肝癌药物中的应用。