CN108285480B - 十二肽及其在制备治疗和/或诊断宫颈癌的产品中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医药技术领域，尤其涉及十二肽及其在制备治疗和/或诊断宫颈癌的产品中的应用。本发明提供了如SEQ ID NO:1～3任一项所示氨基酸序列的多肽，并实验证明其对宫颈癌细胞或组织存在特异性识别的作用，因此可作为宫颈癌细胞的检测试剂或宫颈癌的诊断试剂，也能够作为宫颈癌靶向治疗药物的载体。本发明实验表明，该多肽仅能够识别宫颈癌细胞而对其他肿瘤细胞则无识别作用。

Description

十二肽及其在制备治疗和/或诊断宫颈癌的产品中的应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，尤其涉及十二肽及其在制备治疗和/或诊断宫颈癌的产品中的应用。

背景技术

子宫颈癌是女性常见的恶性肿瘤之一，发病率在全球女性恶性肿瘤中位居第二，且有年轻化的趋势，死亡率高，为女性肿瘤死亡的第三位，严重威胁着女性的生命健康。目前，对于宫颈癌的临床治疗，尤其是转移/复发性宫颈癌，仍然具有挑战性。与早期宫颈癌相比，转移/复发性宫颈癌通常没有标准的治疗方案，往往是姑息性治疗。早期宫颈癌患者经治疗后五年生存率可达91.5％，而晚期患者的平均生存期仅有8-13个月。其难以治愈的主要原因是常规化疗药物的非特异性与癌细胞的不敏感性而致的肿瘤细胞耐药。因此，探寻宫颈癌早期诊断新方法和新型高效靶向治疗药物载体是目前妇产科学所面临的重要课题之一。

肿瘤靶向治疗旨在提高药物对肿瘤细胞的特异性识别和攻击，减少药物对正常细胞的毒性作用。然而，目前的宫颈癌靶向治疗效果并不理想，主要是因其缺乏有效的靶向药物载体系统。理想的抗肿瘤靶向药物载体可以向肿瘤部位定向传递抗肿瘤药物，以攻击癌细胞，而不损害正常细胞。具有肿瘤组织高度特异性和靶向性的小分子多肽因其分子量小，结构简单，易制备，肿瘤组织穿透力强且免疫原性低等特点，可以作为抗肿瘤靶向药物的理想载体。

肿瘤特异性靶向肽的筛选可利用噬菌体展示技术实现。噬菌体展示通过将外源多肽或蛋白的编码/目的基因片段插入噬菌体DNA中而使相应的多肽或蛋白表达在pⅢ衣壳蛋白上。被展示的多肽或蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性，以利于靶分子的识别和结合。噬菌体展示肽库技术使大量随机多肽与其DNA编码序列之间建立直接联系，使得各种靶分子的多肽配体通过体外或体内筛选程序得以快速鉴定。相对体外筛选，体内筛选过程筛选出的多肽与体内环境更相吻合，可能更好维持了其靶向组织或细胞的天然结构和功能构象，因而体内筛选获得的靶向肽可能更具临床应用价值。到目前为止，应用噬菌体展示体内筛选技术已成功筛选出多种肿瘤特异性靶向肽，例如分别靶向骨肉瘤、膀胱癌、卵巢癌、前列腺癌的短肽NF-1、NYZL1、OSTP和WSGPGVWGASVK、PKRGFQD和SNTRVAP，但是对于宫颈癌特异性靶向肽(cervical cancer specific targeting peptides,CSPs)的相关研究报道鲜见。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供十二肽及其在制备治疗和/或诊断宫颈癌的产品中的应用。

本发明提供了氨基酸序列如SEQ ID NO:1～3所示的多肽。

本发明提供的三条多肽的氨基酸序列分别为：GDALFSVPLEVY(SEQ ID NO:1)、FTPGGNTYAGQP(SEQ ID NO:2)或SIDDQRDVAEFA(SEQ ID NO:3)。

氨基酸序列如SEQ ID NO:1～3中任一种所示的多肽在制备靶向识别宫颈癌细胞的试剂中的应用。

本发明实施例中，所述宫颈癌细胞为C-33A、SiHa和/或ME-180。

本发明还提供了一种宫颈癌细胞检测试剂盒，其包括如SEQ ID NO:1～3所示氨基酸序列的多肽中的至少一种。

本发明提供的宫颈癌细胞试剂盒中还包括荧光染料。本发明实施例中，所述荧光染料为FITC。

本发明提供的宫颈癌细胞检测试剂盒适用于细胞的免疫荧光检测。

本发明还提供了一种非诊断目的的宫颈癌细胞检测方法，以荧光染料标记氨基酸序列如SEQ ID NO:1～3中任一种所示的多肽作为检测试剂，对待测样品进行检测，被染色的细胞为宫颈癌细胞。

本发明提供了氨基酸序列如SEQ ID NO:1～3中任一种所示的多肽在制备宫颈癌诊断试剂中的应用。

本发明实施例中，所述宫颈癌为宫颈腺癌。

宫颈癌的诊断方法包括，将待测组织以石蜡封片，以荧光染料标记氨基酸序列如SEQ ID NO:1～3任一种所示的多肽作为检测试剂，被染色的则为宫颈癌组织。

本发明还提供了一种宫颈癌诊断试剂盒，其包括SEQ ID NO:1～3所示氨基酸序列的多肽中的至少一种。

本发明提供的宫颈癌诊断试剂盒中还包括荧光染料。本发明实施例中，所述荧光染料为FITC。

本发明提供的宫颈癌诊断试剂盒适用于待测组织的免疫荧光检测。

本发明提供的氨基酸序列如SEQ ID NO:1～3任一种所示的多肽在制备治疗宫颈癌的药物中的应用。

本发明提供的治疗宫颈癌的药物，其原料包括SEQ ID NO:1～3所示氨基酸序列的多肽中的至少一种。

本发明提供的药物以氨基酸序列如SEQ ID NO:1～3任一项所示的多肽为靶向载体，负载抗肿瘤药物，从而实现对宫颈癌的靶向治疗。

宫颈癌的治疗方法包括，给予本发明提供的治疗宫颈癌的药物。

本发明提供了如SEQ ID NO:1～3所示氨基酸序列的多肽，并实验证明其对宫颈癌细胞或组织存在特异性识别的作用，因此可作为宫颈癌细胞的检测试剂或宫颈癌的诊断试剂，也能够作为宫颈癌靶向治疗药物的载体。本发明实验表明，该多肽仅能够识别宫颈癌细胞而对其他肿瘤细胞则无识别作用。该多肽靶向效果好，组织分布特异性强，又具有分子量小，肿瘤组织穿透力强，免疫原性低，且易制备等普遍特点，是一系列较为理想的宫颈癌靶向治疗药物载体，所以该多肽既可用于制备宫颈癌诊断试剂，又可用于制备宫颈癌靶向治疗药物，具有较广阔的应用前景。

附图说明

图1示各轮筛选后肿瘤组织中噬菌体回收率；

图2示ELISA检测第三轮筛选所得噬菌体单克隆对宫颈癌细胞的亲和力(特异性结合系数P/N＝OD_{450筛选噬菌体单克隆}/OD_{450原库随机噬菌体单克隆})；其中(A)以SiHa细胞移植瘤筛选所得噬菌体单克隆对SiHa细胞的亲和力；(B)以C-33A细胞移植瘤筛选所得噬菌体单克隆对C-33A细胞的亲和力；

图3示荷瘤裸鼠体内回输CSPs噬菌体后肿瘤组织中的噬菌体回收率；

图4示FITC-CSPs在人宫颈癌SiHa、C-33A及ME-180细胞中的免疫荧光强度分析；

图5示FITC-CSPs在人宫颈癌组织中的免疫荧光强度分析。

具体实施方式

本发明提供了十二肽及其在制备治疗和/或诊断宫颈癌的产品中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明利用噬菌体展示肽库技术在宫颈癌裸鼠移植瘤模型体内筛选得到3条可特异性靶向宫颈癌的12肽，并验证此多肽对宫颈癌细胞或组织存在靶向性，本发明的筛选方法包括：

第一步：将噬菌体原肽库经尾静脉注射到荷瘤(SiHa/C-33A)裸鼠体内循环15min，从肿瘤组织回收噬菌体，并将其与OD₆₀₀＝0.5大肠杆菌ER2738菌液充分混合，常温感染后，再将该噬菌体扩增、纯化。

第二步：将第一步扩增纯化的噬菌体注射到新的荷瘤裸鼠体内，重复第一步，进行第二轮筛选，如此筛选进行3轮，以得到与宫颈癌组织结合特异性强、亲和力高的噬菌体多肽。

第三步：以每轮筛选后噬菌体的回收率和免疫组化染色分析其在肿瘤组织中的富集情况(取相应的心、肝、脑、肾组织为对照)。

第四步：将最后一轮筛选所得噬菌体单克隆化，用ELISA实验检测噬菌体单克隆对宫颈癌细胞株的亲和力，以原库噬菌体单克隆作为对照，当特异性结合系数P/N(OD_{450筛选噬菌体单克隆}/OD_{450原库随机噬菌体单克隆})>2.1时，认为该克隆为阳性克隆，与肿瘤细胞结合有特异性。

第五步：将最后一轮筛选所得噬菌体单克隆(包括第四步ELISA检测为阳性的噬菌体单克隆)进行噬菌体DNA提取和测序，对比分析得到重复率较高的多肽序列，即为特异性结合肽序列。

第六步：将第五步所得重复率较高的单克隆噬菌体多肽回输至荷瘤裸鼠体内，验证其体内靶向效果。

第七步：将第六步体内回输验证靶向效果好的多肽序列合成并进行FITC修饰，用免疫荧光法验证其对人类宫颈癌细胞和组织的体外靶向能力。

本发明采用的试材、仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。

主要材料与试剂包括：

Ph.D.-12噬菌体展示肽库试剂盒(Ph.D.^TM-12phage display peptide librarykit,#E8110S)购自美国New England Biolabs公司，内含E.coli ER2738宿主菌。

人宫颈癌细胞株SiHa、C-33A和ME-180均购自中国科学院上海细胞库，人胃癌细胞株MGC803为南华大学肿瘤所保藏细胞株。

SPF级雌性BALB/c裸小鼠(4周龄，体重约18～20g)购自北京维通利华实验动物技术有限公司。钴60辐照灭菌饲料购自北京科澳协力饲料有限公司。无菌垫料及饮用水由南华大学医学研究中心/实验动物学部提供。

M13噬菌体单链DNA快速提取试剂盒(#27704)为德国QIAGEN公司产品，辣根过氧化物酶标记的抗M13单克隆抗体(HRP/Anti-M13，#27942101)为美国GE Healthcare公司产品。

细胞培养基DMEM、McCOY’s 5A、胎牛血清(FBS)及胰蛋白酶均为Gibco产品，购自中国上海赛默飞世尔科技(Thermo Fisher Scientific)；酵母提取物(Yeast Extract)、胰蛋白胨(Bacto-Tyrptone)及琼脂粉(Agar Power)为英国Oxoid公司产品。

人宫颈癌组织微阵列购自西安艾莉娜(Alenabio)生物技术有限公司。

异丙基-硫代-β-D-半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG)、盐酸四环素(Tetracyclin HCl)、1M Tris-HCl(pH7.5)、抗荧光猝灭剂(含DAPI)等为北京索莱宝科技有限公司产品；5-溴-4-氯-3-吲哚-β-硫代半乳糖苷(5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galaetoside,X-gal)为美国Genview公司产品；二甲基甲酰胺(N,N-Dimethylformamide,DMF)为Sigma产品。

免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒、protease inhibitor cocktail购自北京康为世纪生物科技有限公司；即用型TMB显色剂、Nonidet P-40等购自上海碧云天生物技术公司。

多肽的合成及荧光(FITC)标记均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成，干粉产品保存在-20℃。以学者杨璞等(博士学位论文，中南大学，2010)体内筛选的肝细胞癌特异性结合12肽为阴性对照，在此命名为NCSP-12。

主要试剂的配制方法为：

磷酸盐缓冲液(0.01M PBS)：8.00g NaCl，0.20g KCl，2.90g Na₂HPO₄·12H₂O和0.20g KH₂PO₄，加适量ddH₂O充分搅拌溶解，并用ddH2O定容至1L，分装于250ml广口瓶后高压灭菌，4℃冰箱贮存。

IPTG/X-gal贮存液：0.1g X-gal和0.125g IPTG，混入2.5ml DMF，充分搅拌溶解，以500μl/管分装于500μl EP管后，-20℃避光保存。

四环素贮存液：20mg盐酸四环素加1ml去离子水充分溶解，以200μl/管分装于500μl EP管后，-20℃避光贮存，用前充分摇匀溶解。

LB液体培养基：10g胰蛋白胨，5g酵母提取物和5g NaCl，加适量ddH₂O充分搅拌溶解(可辅以加热)，并用ddH₂O定容至1L，分装于250ml或100ml广口瓶后高压灭菌，室温保存。

LB固体培养基：10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，5g NaCl和15g琼脂粉，加适量ddH₂O充分搅拌溶解(可辅以加热)，并用ddH₂O定容至1L，分装于250ml广口瓶后高压灭菌，室温保存。

顶层琼脂：4g胰蛋白胨，2g酵母提取物，2g NaCl和2.8g琼脂粉，加适量ddH₂O充分搅拌溶解(可辅以加热)，并用ddH₂O定容至400ml，分装于100ml广口瓶后高压灭菌，室温保存，使用前置于微波炉中融化。

LB/IPTG/X-gal培养板：将上述配制好的200ml LB固体培养基，高压灭菌，待冷却至低于70℃左右时，加入200μl IPTG/X-gal贮存液，充分混匀后快速倾倒于培养皿中铺板。待平板冷却至常温，用封口膜密封后4℃避光贮存。注意：温度过高会使IPTG/X-gal失效；若LB/IPTG/X-gal培养板保存超过2周或颜色显棕黄色，应弃之重配。

LB-Tet培养板：将上述配制好的200ml LB固体培养基，高压灭菌，待冷却至低于70℃左右时，加入200μl四环素贮存液，充分混匀后快速倾倒于培养皿中铺板。待平板冷却至常温，用封口膜密封后4℃避光贮存。若平板显棕色或黑色忌用。

PEG/NaCl：20g PEG-8000，14.6g NaCl，加ddH₂O定容至100ml，高压灭菌，室温贮存。

Tris缓冲液(TBS，pH＝7.5)：5ml 1M Tris-HCl(pH7.5)，0.88g NaCl，加ddH₂O至100ml，高压灭菌，室温贮存。

TBST洗脱液(0.1％、0.2％、0.5％)：分别将0.l ml、0.2ml或0.5ml Tween-20加入TBS缓冲液，并定容至100ml，摇匀，配成浓度为0.1％、0.2％或0.5％的TBST洗脱液，高压灭菌，常温保存。使用前配制，不宜久放。

2％牛血清蛋白(BSA)溶液:2g BSA溶解于100ml PBS溶液中，使用前配制，不宜久放。

HRP/anti-M13antibody：用2％BSA 1:5000稀释，每5ml BSA加入1μl。

0.1％PBST缓冲液：将0.l ml Tween-20加入0.01M PBS缓冲液，并定容至100ml，摇匀即可。使用前配制，不宜久放。

0.5％Triton X-100：将0.5ml Triton X-100加入PBS缓冲液，并定容至100ml，摇匀即可。使用前配制，不宜久放。

DAB显色液：各取1滴DAB显色试剂盒中A、B、C液，加入l ml去离子水混匀。使用前配制，不宜久放。

多肽溶液的配制及保存：先将2mg FITC修饰的多肽粉末用一定比例的乙腈和ddH₂O溶解成浓度为10mM的贮存液(-20℃避光保存)，如若少数未完全溶解时加少量冰醋酸或超声处理。使用时，用无血清培养基或PBS缓冲液将贮存液稀释成工作液(4℃避光保存)。

细胞冻存液：90％胎牛血清+10％DMSO。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例

1筛选前期的准备工作

1.1肿瘤细胞株的体外培养及接种用单细胞悬液的制备

人宫颈癌SiHa和C-33A细胞、人胃癌MGC803细胞在含10％FBS的DMEM完全培养基中培养，人宫颈癌ME-180细胞在含10％FBS的McCOY’s5A完全培养基中培养，并置于37℃，5％CO₂的细胞培养箱中。2-3天换液，根据细胞生长状态予以0.25％胰蛋白酶消化传代，部分培养细胞用于-70℃冻存保种。

取大量对数期生长的贴壁细胞，0.25％胰蛋白酶消化片刻后，用培养基吹打制成单细胞悬液，离心(1000rpm，5min)去上清液，再重悬于无血清的DMEM培养基中，并调整细胞密度为5×10⁷个/ml，稍后备用。

1.2荷瘤裸鼠动物模型的建立及饲养

荷瘤裸鼠动物模型的建立及饲养在南华大学医学研究中心/实验动物学部SPF级实验室完成。所有BALB/c裸小鼠(雌性，4周龄，体重约18～20g)购买回来后适应实验室环境7d。在适应环境及实验期间，动物分笼饲养，3只/笼，自由采食、饮水，实验室维持12h光照和12h黑暗的循环，室温维持在22±2℃，日温差不超过4℃，相对湿度40％-70％。饲料为Co⁶⁰辐照灭菌饲料，垫料及饮用水经高压灭菌后使用。

用1ml无菌注射器抽取上述“1.1”备好的SiHa或C-33A单细胞悬液200μl(200μl/只，～1×10⁷个细胞)，接种在适应好环境的裸鼠腋下或背部皮下，继续按原条件饲养。在此期间，对裸鼠的精神、饮食、肿瘤大小及体重变化等情况进行定期观察。约4-6周后选用移植瘤体积至少达l cm³的荷瘤裸鼠进行体内筛选或体内鉴定实验。

1.3ER2738菌的活化及培养

取出-20℃保存的噬菌体展示文库试剂盒中的受体菌E.coli ER2738，接种环灭菌后蘸取少许，轻划在LB-Tet平板上，倒置平板在37℃生化培养箱中培养过夜。待LB-Tet平板上生长出菌落后，平板用封口膜密封后4℃避光保存备用(一般保存不超过1月，否则需重新活化)。

从上述活化的宿主菌平板上挑取单克隆菌落，接种于LB液体培养基中，恒温摇床振荡培养(37℃，200rpm)。在噬菌体扩增中当菌液达到对数生长期，即分光光度计测得的OD₆₀₀＝0.5时即可停止扩增，将扩增好的菌液分装到已灭菌的离心管中备用。(宿主菌种最好要随用随培养，不易保存过久)。

1.4ER2738菌生长曲线绘制

从“1.3”刚活化的宿主菌平板上挑取单克隆菌落，接种于LB液体培养基中，恒温摇床振荡培养(37℃，200rpm)。当培养0h、0.5h、1h、2h、3h、4h、5h、6h、8h、10h时，分别取出菌液样品进行比色测定，以等量LB液体培养基为空白对照。以培养时间为横坐标，测得的菌液样品OD₆₀₀值为纵坐标绘制出E.coli ER2738菌生长曲线。

2噬菌体滴度测定

(1)接种ER2738单克隆菌落于10ml LB液体培养基中，恒温震荡培养至对数生长中期(OD₆₀₀＝0.5)，再200μl等份分装于无菌EP管中备用。

(2)与此同时，微波炉融化顶层琼脂，3ml等份分装于灭菌试管中，约45℃保存备用。

(3)提前预热LB/IPTG/X-gal平板(37℃，1h)，每个噬菌体稀释度取一个平板备用。

(4)用LB液体培养基准备10倍系列稀释的噬菌体(稀释范围：扩增的噬菌体培养物上清稀释度大点(10⁸-10¹¹)，未扩增的噬菌体培养物上清稀释度小点(10¹-10⁴)，每个稀释度更换新鲜吸头)。

(5)在(1)备用的EP管中，每管加入10μl不同稀释度的噬菌体，快速震荡混匀，室温孵育1-5min后，倒入(2)备用的顶层琼脂中，快速混匀，倾注于37℃预温的LB/IPTG/X-gal平板上(适当倾斜平板将上层琼脂均匀铺开)。

(6)待平板冷却5min后，倒置于37℃生化培养箱中培养过夜。第二天检查平板，计数约有～1×10²个噬菌斑的平板上的蓝斑数。噬菌体滴度(pfu/10μl)＝稀释倍数×蓝斑数，即得到每10μl噬菌体的形成单位。

3下面结合实施例详细说明具体的筛选步骤：

3.1噬菌体随机肽库的体内筛选

(1)选取移植瘤体积至少达l cm³的宫颈癌裸鼠肿瘤模型，尾静脉注射2×10¹¹pfu噬菌体十二肽库(用190μl TBS缓冲液将10μl噬菌体原液稀释成200μl)，循环15min。

(2)腹腔注射10％水合氯醛(0.03ml/10g)麻醉裸鼠，剪开横膈膜以上的皮肤，将胸壁暴露，剪开并去除胸骨及胸骨旁组织，使心脏裸露。采用心脏灌流技术，用静脉输液管将约50ml生理盐水通过左心房对裸鼠进行全身洗脱(剪开右心耳，液体从此流出)，裸鼠全身血液连同未结合的噬菌体一起被生理盐水洗脱至体外，结合在体内各个部分的噬菌体被保留在相应的组织。灌注时可见肝脏变白，说明灌注效果良好。

(3)灌洗至肝脏变白时，迅速用眼科手术剪将裸鼠的肿瘤组织、肝脏、脑、肾和心脏摘除，并立即置于冰上孵育(防止phage内化)。

(4)将以上切除的肿瘤、心、肝、脑、肾组织剪成两部分，取一部分放入预先备好的装有5ml的4％多聚甲醛的冻存管内浸泡固定，用于免疫组化实验鉴定各组织与噬菌体的亲和力。将剩余部分称重后，装入备好的2m1EP管内，加1ml冰上预冷TBS匀浆保护液(含1％cocktail)，用眼科手术剪将各组织剪碎匀浆。再加入0.5ml预冷保护液，3000rpm离心10min，小心弃掉上清。

(5)加1.5ml冰上预冷的0.1％TBST洗脱液，充分混匀后，3000rpm离心5min，共进行5次漂洗。

(6)漂洗结束后，各组织分别加入100μl含有1％NP-40的TBST洗脱液，漩涡混匀，冰上作用10min。

(7)取1ml OD值为0.5的ER2738菌液(挑取单克隆菌落220rpm，37℃振摇6小时)，与组织匀浆悬液室温下孵育20min，孵育后加入9ml LB液体培养基并常温感染30min。

(8)按上述“2噬菌体滴度测定”方法，各组织分别取100μl样品进行滴度测定及数据分析。再将剩余的肿瘤组织回收物连同10ml新鲜的LB液体培养基一起置入已灭菌的250ml三角瓶，无菌透气封口膜封口后，37℃，220rpm恒温震荡培养4～5h，制备出肿瘤组织特异性结合噬菌体扩增原液。

(9)将上述培养物转入50ml离心管中，4℃，12000rpm离心10min。上清液转入另一离心管中，再离心；

(10)将上清的上部80％转入一新鲜50ml管中，加入1/6体积的PEG/NaCl。让噬菌体4℃沉淀过夜；

(11)将过夜培养物4℃，12000rpm离心15min。倒掉上清液，再短暂离心，吸去残留上清液；

(12)沉淀物重悬于1ml TBS中，悬液转入1.5ml EP管中，4℃，14000rpm离心5min使残余细胞沉淀；

(13)上清(约1ml)转入另一新鲜1.5ml EP管，用1/6体积的PEG/NaCl(约167ul)冰上孵育60min，再次沉淀。

(14)将上述培养物4℃，14000rpm离心10min，弃上清，再短暂低温高速离心后微量移液器吸去残余上清；

(15)沉淀物重悬于200μl TBS中。低温高速离心1min，沉淀任何残余的不溶物。上清转入新鲜管中，此即为扩增后的噬菌体(4℃可储存3周，等体积灭菌甘油中-20℃长期贮存)。

(16)取少量样品按上述方法“3”进行噬菌体滴度测定，再根据测定结果，计算出下一轮筛选所需的扩增物用量(以保证每轮筛选输入的噬菌体总量为2×10¹¹pfu)，然后用TBS缓冲液稀释成总量为200μl的输入液。

(17)将步骤(16)所得的输入液，尾静脉注射入另一只荷瘤裸鼠，重复步骤(1)-(15)进行下一轮筛选与扩增。

(18)最后一轮肿瘤组织噬菌体回收物无需扩增，取少量样品进行噬菌体滴度测定。

(19)结果：在荷有SiHa或C-33A细胞移植瘤裸鼠体内分别进行三轮筛选后，肿瘤组织中噬菌体回收率均逐渐增加(P<0.05vs Round1，图1)，而相应对照组织(心、肝、肾及脑)中并无类似变化。表明噬菌体在肿瘤组织中得到了较好的富集。

3.2免疫组化对噬菌体富集效果的分析

(1)取出4％多聚甲醛固定好的肿瘤组织、肝脏、肾、心脏及脑组织，经常规石蜡包埋、切片、烤片。

(2)二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡(2×10min)，过梯度酒精至水洗，PBS冲洗(3×3min)，滤纸尽量吸干PBS，滴加3％过氧化氢溶液，室温孵育10min。

(3)PBS冲洗(3×3min)，滤纸尽量吸干，滴加非免疫性动物血清，室温孵育10分钟，不冲洗直接甩去血清，孵一抗(HRP/Anti-M13 1:1000)，4℃湿盒孵育过夜。

(4)PBS冲洗(3×3min)，滤纸尽量吸干，滴加生物素标记羊抗鼠第二抗，室温孵育20分钟，PBS洗3次，3分钟/次。

(5)滤纸吸去PBS，滴加HRP标记的链霉素亲和素，室温孵育10分钟，PBS洗3次，3分钟/次。

(6)滤纸吸去PBS，DAB显色，显微镜下看到变黄时，迅速清水冲洗终止反应，苏木素复染30秒，盐酸分化，自来水返蓝5分钟，自然晾干，中性树胶封片观察，并拍片统计分析。

(7)结果判定：细胞内有棕黄色颗粒出现则判定为阳性。

(8)结果：经过三轮筛选后，见大部分肿瘤细胞内均呈棕黄色着色，而心、肝、肾及脑组织细胞内未见明显棕黄色颗粒，表明噬菌体在肿瘤组织中有明显的特异性富集。

3.3噬菌体的单克隆化

将最后一次筛选得到的肿瘤组织特异结合噬菌体感染E.coli ER2738后，按上述“2噬菌体滴度测定”方法，在LB/IPTG/X-gal平板上获得单个的蓝色噬菌斑。

3.4噬菌斑的扩增及纯化(用于ELISA鉴定与DNA测序)

(1)将ER2738过夜培养物按1:100稀释接种于LB液体培养基，以每份2ml分装至10ml的培养管中，备用。

(2)用灭菌牙签或吸头，分别挑取单个蓝色噬菌斑至上述(1)备用的培养管。每个需要鉴定的单克隆一管。(应从1-3天，4℃保存，且总量不到100个噬菌斑的平板上挑选，以保证每个被挑的噬菌斑仅含一个DNA序列。一般情况下，由最后一轮筛选物中取10-20个单克隆便足以检测出特异性结合肽中的共有序列。)

(3)无菌透气封口膜封口后，37℃，250-300rpm，恒温震荡培养4.5-5h(不要过长)。

(4)培养物转入微量离心管中，低温高速离心30s(4℃，14000rpm)。上清转入一新离心管，再离心。用微量移液器将80％(约1600μl)的上清转入另一干净且无菌的离心管，此即为扩增的噬菌斑贮存液。取少量进行常规滴度测定与分析，其余4℃或-20℃贮存备用(4℃贮存≤3周，长期贮存应用灭菌甘油1:1稀释后，-20℃贮存)。

3.5细胞ELISA实验检测噬菌体单克隆对人宫颈癌细胞的亲和性。

(1)将体外培养的人宫颈癌Siha及C-33A细胞分别消化下来，记数后制成相同浓度的细胞悬液。将癌细胞按1×10⁴个/孔的密度接种于96孔板(100μl/孔)，细胞培养箱培育12h，使细胞贴壁。

(2)PBS洗涤(3×3min)，无血清DMEM 37℃处理1h；PBS洗涤(3×3min)，4％多聚甲醛固定20min；0.l％PBST洗涤(6×1min)，0.5％tritonX-100室温穿透10min；加满0.l％PBST静置l min，倒去洗涤液，并倒置于滤纸上，尽量吸干水分，如此重复洗板4次。

(3)每孔加入0.4ml 2％PBS-BSA 37℃封闭l h后，倒去封闭液，0.l％PBST反复洗板4次。

(4)加入“3.3”已扩增的单克隆噬菌斑贮存液(1×10¹²pfu/孔)，37℃孵育2h，甩干，0.l％PBST重复洗板6次。以试剂盒原始文库随机噬菌体克隆为对照，每个克隆及对照组各设4个复孔。

(5)加入HRP-antiM13抗体(200μl/孔，1:5000)，37℃孵育l h，甩干，0.l％PBST重复洗板6次。

(6)加入TMB工作液(100μl/孔)，室温避光显色约25～30min。

(7)见液体颜色由蓝色转为黄色后，每孔加终止液0.5M H₂SO₄(50μl/孔)终止反应。

(8)10min内将96孔板放在酶标仪上检测各孔溶液在450nm处的吸光度值(OD₄₅₀值)。

(9)结果判定：特异性结合系数P/N＝OD_{450筛选噬菌体单克隆}/OD_{450原库随机噬菌体单克隆}，当P/N>2.1为阳性，认为该噬菌体克隆与肿瘤细胞结合有特异性。

(10)结果：以SiHa细胞移植瘤筛选所得噬菌体单克隆化后，随机挑选的18个噬菌体单克隆中14个对SiHa细胞有特异性结合能力(图2A)；以C-33A细胞移植瘤筛选所得噬菌体单克隆化后，随机挑选的16个噬菌体单克隆中12个对C-33A细胞有特异性结合能力(图2B)。

3.6噬菌体DNA提取(QIArep Spin M13Kit,QIAGN,Cat.No.27704)及测序分析

(1)将500μl已扩增噬菌体贮存液(含噬菌体上清液)转入一新的离心管，加1/100体积的Buffer MP(10μl MP/1ml噬菌体贮存液)，室温斡旋混合并孵育至少2分钟，以沉淀M13噬菌体。

(2)将上述混合物加入已放入2ml收集管的吸附柱中，4℃离心(8000rpm,15s)，倒掉收集管中的废液(注意：吸附柱一次最多只可以容纳大约700μl混合物，故混合物多时需要分次添加，离心收集)。

(3)加入700μl Buffer PB，4℃离心(8000rpm,15s)，弃废液。

(4)将吸附柱放回空收集管中，再次加入700μl Buffer PB，室温孵育1min，以充分裂解细菌噬菌体，4℃离心(8000rpm,15s)，弃废液。

(5)加入700μl Buffer PE(注意：使用前加24ml 100％的乙醇至PE缓冲液！)，4℃离心(8000rpm,15s)，弃废液。

(6)再次4℃离心(8000rpm,15s)，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

(7)取出吸附柱，放入一个干净的1.5ml微量离心管中，在吸附膜的中间部位加100μl洗脱Buffer EB(注意：事先将EB缓冲液在50℃水浴中预热)，室温孵育10min，4℃离心(8000rpm,30s)，离心所得溶液即含噬菌体DNA。(如想得到较多量的DNA，可将得到的溶液重新加入吸附柱中，再次离心1min。洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果需要DNA浓度较高，可以适当减少洗脱体积，但至少≥40μl)。

(8)将提取的部分DNA样品送往生工生物工程(上海)股份有限公司测序(测序引物为-96gIII:5′-HOCCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3′,Ph.D.-12噬菌体展示肽库试剂盒中附带引物)；其余样品可短期存放在2-8℃，如果要长时间存放，则需放置在-20℃。

(9)参考噬菌体文库说明书中序列比对图，对测序结果进行比对分析，得出重复率较高的DNA序列，最后转换成多肽序列。

(10)结果：获得4条重复率较高的多肽序列(表1)

表1经三轮体内筛选后获得的特异性结合肽

3.7体内回输验证CSPs噬菌体对宫颈癌移植瘤的特异靶向能力。

(1)取筛选得到的CSPs噬菌体单克隆扩增液2×10¹¹，通过荷瘤裸鼠的尾静脉注射回输到裸鼠体内。

(2)循环15min后，如前述“3.1”对裸鼠行心脏灌流术，取其肝、肾及肿瘤组织并一分为二，一部分做噬菌体回收率分析；另一部分做噬菌体的免疫组化染色，并对结果进行观察、拍照分析。

(3)结果：CSP-GD、CSP-FT及CSP-SI噬菌体在肿瘤组织中的回收率明显高于相应对照组织(P＜0.01，图3)，且免疫组化染色后肿瘤细胞内可见大量的棕黄色颗粒(对照组织中仅见背景染色)；CSP-TL噬菌体在肿瘤组织中的回收率和免疫组化染色与对照组均无统计学差异。表明筛选所得CSP-GD、CSP-FT及CSP-SI噬菌体对宫颈癌裸鼠移植瘤具有体内特异性靶向能力。

3.8免疫细胞荧光检测CSPs对宫颈癌细胞的体外靶向能力

(1)按上述“2.1”方法培养人宫颈癌细胞(SiHa、ME-180、C-33A)及人胃癌MGC803细胞(作为对照)，并取对数生长期细胞制成单细胞悬液，以5×10⁴每孔种于24孔板，继续培养。

(2)待细胞贴壁后，实验组加入FITC-CSPs溶液(5.5mM，2μl/孔)，以宫颈癌非特异性结合肽FITC-NCSP-12溶液(5.5mM，2μl/孔)作阴性对照，15％乙腈(Acetonitrile)溶液(2μl/孔)作溶媒对照，每组至少设3个复孔。稍后在细胞培养箱中继续避光孵育1-6h。

(3)PBS避光冲洗(3×3min)，4％多聚甲醛避光固定20min。

(4)PBS避光冲洗(3×3min)，抗荧光猝灭剂封片。

(5)荧光显微镜下观察、拍照并分析。

(6)结果：与CSPs噬菌体对人宫颈癌裸鼠移植瘤的体内靶向能力一致，在SiHa、C-33A及ME-180细胞中均检测到FITC-CSP-GD、FITC-CSP-FT和FITC-CSP-SI的绿色荧光，然而在MGC803细胞中并未检测到，在与FITC-NCSP-12孵育的任何细胞中也未见到绿色荧光；免疫荧光强度分析表明，CSP-GD、CSP-FT和CSP-SI对宫颈癌SiHa、C-33A及ME-180细胞具有特异性靶向能力(P＜0.05vs MGC803细胞，图4)。

3.9免疫组织荧光检测CSPs对人宫颈癌组织的体外靶向能力

(1)烤片65℃，1h。

(2)松节油Ⅰ、Ⅱ脱蜡(2×5min,40℃)，过梯度酒精至水洗。

(3)加入0.5％Triton X-100室温孵育20min。

(4)高压锅抗原修复：将切片完全浸入修复液(0.01M sodium citrate buffer，PH6.0)中，盖盖至上汽，计时10min后自然冷却至常温。

(5)PBS冲洗(3×3min)，1mg/ml硼氢化钠溶液(用PBS配制)冰上淬灭组织自发荧光(3×10min)。

(6)PBS冲洗(3×3min)，滴加10％正常山羊血清37℃封闭45min。

(7)甩干，滴加2mM FITC-CSPs溶液100μl，在湿盒中4℃避光孵育过夜，以FITC-NCSP-12为对照肽。

(8)0.1％PBST避光振洗(3×5min)，滴加含DAPI染液的抗荧光淬灭剂封片。

(9)荧光显微镜下观察、拍照分析。

(10)如图5所示，免疫组织荧光强度分析结果与免疫细胞荧光一致，CSP-GD、CSP-FT及CSP-SI对宫颈癌组织有不同程度的靶向特异性(P＜0.05vs正常宫颈组织)，其中CSP-GD对宫颈腺癌特异结合能力最强。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 南华大学

<120> 十二肽及其在制备治疗和/或诊断宫颈癌的产品中的应用

<130> MP1801578

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gly Asp Ala Leu Phe Ser Val Pro Leu Glu Val Tyr

1 5 10

<210> 2

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Phe Thr Pro Gly Gly Asn Thr Tyr Ala Gly Gln Pro

1 5 10

<210> 3

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Ser Ile Asp Asp Gln Arg Asp Val Ala Glu Phe Ala

1 5 10

Claims (10)

1.氨基酸序列如SEQ ID NO:1~3任一项所示的多肽。

2.氨基酸序列如SEQ ID NO:1~3中任一种所示的多肽在制备靶向识别宫颈癌细胞的试剂中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述宫颈癌细胞为SiHa、C-33A和/或ME-180。

4.一种宫颈癌细胞检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的多肽。

5.一种非诊断目的的宫颈癌细胞检测方法，其特征在于，以荧光染料标记氨基酸序列如SEQ ID NO:1~3中任一种所示的多肽作为检测试剂，对待测样品进行检测，被染色的细胞为宫颈癌细胞。

6.氨基酸序列如SEQ ID NO:1~3中任一种所示的多肽在制备宫颈癌诊断试剂中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述宫颈癌为宫颈腺癌。

8.一种宫颈癌诊断试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的多肽。

9.氨基酸序列如SEQ ID NO:1~3任一种所示的多肽在制备治疗宫颈癌的药物中的应用，其中所述多肽作为靶向载体。

10.一种治疗宫颈癌的药物，其特征在于，其原料包括权利要求1所述的多肽，所述多肽作为靶向载体。

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