CN109575118A - 用于制备dc疫苗的多肽片段及dc疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了用于制备DC疫苗的多肽片段及DC疫苗。所述多肽片段选自如SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.6所示的至少其一的氨基酸序列。一种DC疫苗，该DC疫苗包含负载多肽片段的DC细胞。具体地，所述DC疫苗的组成为：负载所述多肽片段的DC细胞、人血白蛋白、生理盐水；其中，人血白蛋白在生理盐水中的质量浓度为5％‑20％，负载多肽片段的DC细胞的密度是(0.5‑2)*106个/mL。本发明选择人乳腺珠蛋白为攻击靶点，通过计算机设计和实验筛选得到有效的多肽片段用于制备的DC多肽疫苗可以用于HER2阳/阴性乳腺癌患者的治疗，并对复发和转移起到预防作用。本发明的DC疫苗在提高疫苗安全性的同时能够降低生产成本。

Description

用于制备DC疫苗的多肽片段及DC疫苗
技术领域
本发明属于生物疫苗技术领域，具体涉及用于制备DC疫苗的多肽片段及DC疫苗。
背景技术
乳腺癌发病率位居全球女性恶性肿瘤的第一位，严重危害女性健康；在中国，女性乳腺癌的发病率也呈逐年上升趋势。随着早期诊断和综合治疗的开展，乳腺癌的病死率已经逐渐下降。尽管如此，仍有较多患者会发生转移和复发。
1890年，纽约骨外科医生William Coley在做手术切除肿瘤的时候发现，术后感染的病人比没有感染的病人恢复的要更好，主要由于感染提高了机体免疫力，继而提高了免疫细胞识别和杀伤肿瘤细胞的能力，这一发现为肿瘤治疗提出了新的思路。2013年，肿瘤免疫治疗由于其卓越的疗效和创新性，被《科学》杂志评为年度最重要的科学突破。现在肿瘤免疫治疗已经成为与手术，化疗，放疗并行的重要治疗手段。
根据靶点特异性可以将肿瘤免疫细胞治疗技术分为两类：1.以CIK，NK为代表的非特异性免疫治疗，这类技术不局限于特定的靶点，对于多种肿瘤细胞均有一定的杀伤作用，但是杀伤作用较弱，很难完全消除肿瘤组织，可以用于肿瘤预防，与其他治疗手段联合使用可以提高患者的生存质量，减少肿瘤的复发及转移。2.以DC疫苗，CAR-T为代表的特异性肿瘤免疫治疗，该策略靶向了特定的肿瘤抗原，并能发挥强大的杀伤作用，以CAR-T技术为例，靶向CD19的CAR-T目前用于急性淋巴细胞白血病的治疗完全缓解率可以达到80％以上，但是由于作用靶点单一，往往不能对异质性的肿瘤组织进行彻底的杀伤。因此CAR-T目前在实体瘤治疗效果上受限。与使用T细胞不同，树突细胞属于抗原递呈细胞，具有强大的免疫调理作用，在体内不仅可以通过免疫突触激活特异性的T细胞克隆，还可以通过分泌的细胞因子，趋化因子等募集并激活其他的免疫细胞，对肿瘤组织进行杀伤。2010年美国FDA批准上市的首个癌症治疗疫苗PROVENGE就是基于DC细胞开发的晚期前列腺癌的治疗型疫苗，可将晚期前列腺患者的总生存期延长4.1个月。根据抗原负载的方式可以将DC疫苗分为多肽疫苗和基因疫苗。多肽疫苗是直接将抗原片段与DC细胞表面的抗原递呈分子结合并在体内形成免疫突触的方式激活体内特异性的T细胞，与DNA疫苗相比，不需要克服DC细胞难以导入外源基因的技术壁垒，且在减少转染操作步骤的同时提高DC细胞的存活率。
目前有专利报道的用于乳腺癌治疗的DC多肽疫苗主要靶向HER-2蛋白，与赫赛汀等靶向治疗药物相同，但是仅有20～30％的乳腺癌细胞表达HER-2蛋白，因此对于其余的70～80％的肿瘤细胞并没有直接的杀伤效果。
申请号为200910043974.7的专利报道了一种新的HER2/neu基因改造的树突细胞疫苗，属于DC细胞基因疫苗，专利中将表达HER2/neu的基因片段构建到表达载体上，通过病毒将HER2/neu基因转染到DC细胞中，基因在细胞内表达出目的蛋白，在细胞内降解成多肽片段后，通过MHC分子递呈到细胞表面，以此来激活体内的T细胞对表达HER2的肿瘤细胞进行杀伤。该疫苗适用于HER2阳性乳腺癌的治疗。由于仅有20～30％的乳腺癌细胞表达HER-2蛋白，因此靶向HER2的DC疫苗对于乳腺癌细胞的杀伤效果有限。研究中采用重组病毒为载体将基因导入DC细胞中，由于这种基因转入方式是将目的片段随机整合到基因组DNA中的，因此应用过程中存在一定的成瘤性的风险。DC细胞属于难转染细胞，往往需要多次转染才能达到理想的转染效果，且慢病毒生产成本高，因此提高了DC疫苗的生产成本。
申请号为200580052507.0的专利报道了由肿瘤抗原衍生的优化隐蔽性肽组成的免疫原性多肽及其用途，属于DC细胞多肽疫苗，专利中选择三种肿瘤普遍高表达的抗原TERT，MUC-1，HER-2，根据HLA-A0201表型进行了多肽的设计和筛选，将三种有效的多肽片段通过氨基酸连接或直接混合的方式组和在一起，负载在DC细胞上后激活CD8+CTL细胞发挥肿瘤杀伤的作用。专利中选择的三种抗原均为肿瘤相关抗原，除了在肿瘤组织高表达外，在正常组织中也有普遍表达，因此会导致CTL细胞攻击正常组织而导致一定的安全问题。
发明内容
本发明的目的是，提供一种用于制备DC疫苗的多肽片段及DC疫苗，解决现有技术中DC疫苗安全性低、生产成本高的技术问题。
本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案如下：
用于制备DC疫苗的多肽片段，所述多肽片段选自如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.6所示的至少其一的氨基酸序列。
优选地，所述多肽片段由化学法进行合成，多肽纯度大于95％。
优选地，所述多肽片段来自于人乳腺珠蛋白的氨基酸序列。
优选地，所述多肽片段获得方式为，在线预测人乳腺珠蛋白中不同多肽片段与MHC类分子HLA-A0201的亲和力数据，选取其中亲和力高的片段为所述多肽片段。在线预测的网址为https://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind/；网站会对测试的多肽片段给出评分，按照评分情况及多肽片段的位置选择需要的多肽。本发明通过对评分高的多肽逐一进行结合实验筛选，SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.6所示的多肽片段是筛选后阳性的多肽片段，阴性的多肽片段未在本专利中列出。
本发明还提供一种DC疫苗，该DC疫苗包含负载SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.6所示多肽片段的DC细胞。
优选地，所述DC疫苗的组成为：负载多肽片段的DC细胞、人血白蛋白、生理盐水；其中，人血白蛋白在生理盐水中的质量浓度为5％-20％，负载多肽片段的DC细胞的密度是(0.5-2)*106个/mL。
优选地，所述DC疫苗是通过将DC细胞与所述多肽片段共培养获得。
本发明还提供所述的DC疫苗的制备方法，该方法为：
步骤1，DC细胞的分离与诱导：血液样品或单采机收集到的白细胞，用淋巴细胞分离液分离出外周血单核细胞，通过贴壁培养分离出单核细胞后，用含有GM-CSF、IL-4、自体血浆的淋巴细胞培养基培养并诱导单核细胞向DC细胞分化；
步骤2，多肽的负载：诱导培养4-6天后，向培养体系中加入权利要求1所述的多肽片段，可单独加入一种序列的多肽片段或者几种多肽片段的混合物，所加入多肽片段的浓度为1-100μg/mL，37℃条件下共培养得到负载有多肽片段的DC细胞；
步骤3，制备DC疫苗制剂：向负载有多肽片段的DC细胞中加入10-30ng/mL TNF-α，促进DC细胞的成熟，DC细胞培养成熟后，离心收集细胞，用生理盐水洗涤细胞，最后将负载有多肽片段的DC细胞悬浮于含3-6％(质量体积比)人血白蛋白的生理盐水中，负载多肽片段的DC细胞的悬浮密度是(0.5-2)*106个/mL，制得DC疫苗制剂。
优选地，所述步骤2中多肽片段的浓度为5-50μg/mL。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1，本发明选择人乳腺珠蛋白为攻击靶点，通过计算机设计和实验筛选得到有效的多肽片段用于制备的DC多肽疫苗可以用于HER2阳/阴性乳腺癌患者的治疗，并对复发和转移起到预防作用。
2，本发明的DC疫苗具有较高的安全性。人乳腺珠蛋白具有组织特异性，仅表达于乳腺组织中，因此如同靶向CD19CAR-T，即便激活的T细胞对表达靶分子的正常细胞进行攻击，也仅仅对乳腺组织进行破坏，而不会攻击到其他组织，因此不会危及到患者的生命。多肽疫苗采用的技术方案是将合成的多肽片段与DC细胞结合形成，与基因疫苗不同，多肽疫苗不需要对细胞的基因进行修饰，因此不存在成瘤的风险。
3，本发明的DC疫苗生产成本低、操作简便。本发明多肽合成采用的是化学合成的方式，制备成本低，产品稳定性高，质控简单。制备疫苗的过程中也仅需要将多肽与细胞共孵育就可以达到制备疫苗的目的。
附图说明
图1为本发明实施例2中多肽片段与HLA-A0201结合能力检测结果；其中，MAM-01～09：待检多肽01～09。
图2为本发明实施例3中流式检测抗体共培养体系中特异性T细胞比例的流式结果图；其中Blank：空白对照。MAM-01～06：待检多肽01～06。
图3为本发明实施例4中LDH检测经负载多肽的DC细胞激活的T细胞对于乳腺癌细胞杀伤作用的数据图；其中，Con指：未负载多肽片段的DC细胞激活的T细胞；MAM-01～06指：负载待检多肽01～06片段的DC细胞激活的T细胞。
图4为本发明实施例5中动物实验检测负载多肽的DC细胞激活的T细胞对于乳腺癌肿块生成的抑制作用的数据图；其中，空白对照：注射细胞保存液；T细胞：注射未负载多肽片段的DC细胞激活的T细胞；MAM-01～06：注射负载待检多肽01～06片段的DC细胞激活的T细胞。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明。以下采用的试剂和生物材料如未特别说明，均为商业化产品。
树突细胞是体内功能最强的抗原递呈细胞，抗原在细胞内降解成为多肽片段，通过MHC分子递呈到细胞表面，并与能够识别抗原的TCR受体结合形成复合物，同时在共刺激分子CD80/86的作用下激活表达该受体的T细胞，从而使这种抗原特异性的T细胞克隆得以扩增，并对表达该抗原的靶细胞起到识别和杀伤作用。
根据递呈抗原的来源不同可以对MHC类分子分类：1)MHC-I类分子：普遍表达于体内各种细胞中，主要提呈内源性抗原，能结合的多肽片段大小一般为8-10个氨基酸，主要激活CD8+的CTL细胞。2)MHC-II类分子：主要表达于专职的抗原递呈细胞中，如树突细胞，巨噬细胞，部分内皮细胞中，主要递呈外源性抗原，结合的多肽片段大小为12～20个氨基酸，主要激活CD4阳性的辅助型T细胞。MHC类分子对于内/外源抗原的递呈并没有严格的区分，二者也可以对抗原进行交叉递呈。
在人体中，MHC类分子被称为HLA，是体内基因多态性最为复杂的分子，因此本发明在设计多肽疫苗时首先检测患者的HLA分型，然后根据不同HLA表型设计蛋白序列。本发明中选择了中国人HLA-A表型中出现频率较高的HLA-A0201进行设计与筛选，制备出的DC疫苗主要适用于这类人群。
本发明DC疫苗的制备流程如下：
1、DC细胞的分离与诱导：
乳腺癌患者的血液样品或单采机收集到的白细胞，用淋巴细胞分离液分离出外周血单核细胞，通过贴壁培养分离出单核细胞后用含有GM-CSF，IL-4，自体血浆的淋巴细胞培养基培养并诱导单核细胞向DC细胞分化。所采用的淋巴细胞分离液和淋巴细胞培养基均通过市售直接购买获得。
2、多肽的负载：
诱导培养5天后，向培养体系中加入来源于人乳珠蛋白的多肽片段，序列见表1，可以单独加入一种序列的多肽片段，也可以加入几种序列多肽片段的混合物。优选浓度1-100μg/mL,最适浓度为5～50μg/mL。37℃条件下共培养24小时。
表1
编号 序列
Seq01 LIYDSSLCDL
Seq02 LMVLMLAAL
Seq03 FMQLIYDSSL
Seq04 FLNQTDETL
Seq05 TINPQVSKT
Seq06 KLLMVLMLA
Seq07 TLSNVEVFM
Seq08 MLAALSQHC
Seq 09 QTDETLSNV
3.DC疫苗的制剂与回输：
向上述DC细胞和多肽共培养体系中加入20ng/mL TNF-α，继续培养24小时促进DC细胞的成熟，检测细胞中CD11c，CD83，HLA-DR的表达，并对细胞的无菌性，内毒素，支原体进行检测。离心收集负载有多肽片段的DC细胞，用生理盐水洗涤细胞，最后将DC细胞悬浮于1mL含5％人血白蛋白的生理盐水中作为最终制剂，对患者进行淋巴结注射。
4.对负载有多肽片段的DC疫苗进行功能检测。
实施例1抗原多肽片段的设计与合成
在NCBI数据库中获取人乳腺珠蛋白(也称mammaglobin-A蛋白)的氨基酸序列，在线(https://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind/)对不同多肽片段与HLA-A0201的亲和力等数据进行计算并进行评分，评分结果参见表2，5个预测的多肽片段的初始位置集中于2～4处，且评分均较高，因此选择2～10和4～12的多肽片段作为代表进行检测；另外有4个多肽片段的初始位置集中在80～84处，且评分差异较大，因此选择其中评分较高的83～92，80～89的多肽片段进行检测；依据表2及上述原因总共选择9种多肽进行合成，其序列参见表3。所述多肽片段MAM 01对应SEQ ID NO.1；MAM 02对应SEQ ID NO.2；MAM 03对应SEQID NO.3；MAM 04对应SEQ ID NO.4；MAM 05对应SEQ ID NO.5；MAM 06对应SEQ ID NO.6；MAM07对应SEQ ID NO.7；MAM 08对应SEQ ID NO.8；MAM 09对应SEQ ID NO.9。
表2
表3
编号 序列 位置 得分
MAM 01 LIYDSSLCDL 83-92 150.683
MAM 02 LMVLMLAAL 4-12 60.325
MAM 03 FMQLIYDSSL 80-89 70.971
MAM 04 FLNQTDETL 66-74 48.151
MAM 05 TINPQVSKT 32-40 2.375
MAM06 KLLMVLMLA 2-10 147.972
MAM 07 TLSNVEVFM 73-81 27.324
MAM 08 MLAALSQHC 8-16 8.446
MAM 09 QTDETLSNV 69-77 3.644
将设计好的多肽序列交由金斯瑞公司通过化学合成获得，要求多肽纯度大于95％，并对内毒素及盐含量进行控制(盐：三氟乙酸<1％,内毒素<10EU/mg)，合成好的冻干粉-20℃进行保存。
实施例2检测多肽与HLA-A0201的结合能力
1)试剂：IMDM培养基，胎牛血清，表达HLA-A0201T2细胞，HLA-A02抗体。
多肽：阳性对照PI-9(序列是PYVSRLLGI，SEQ ID NO.7所示),溶解于DMSO中，终浓度20mg/mL；阴性对照GL-9(序列是GILGFVFTL，SEQ ID NO.8所示)，溶解于DMSO中，终浓度20mg/mL；目的多肽MAM01～06，序列见表2，溶解于DMSO中，终浓度20mg/mL。溶解后的多肽需要进行分装，保存于-80℃，使用时避免反复冻融。
2)方法：
细胞培养：T2细胞(HLA-A0201)，悬浮于完全培养基(IMDM+20％FBS)中，在37℃，5％CO2条件下进行培养。
多肽负载：用完全培养基将T2细胞浓度调整为1*106/mL的密度，加入不同的多肽溶液(具体分组及浓度见表3)，室温条件下孵育24小时。将细胞离心弃上清，用HLA-A02抗体对孵育后的T2细胞进行检测，与空白对照组比较信号的位移情况。
表3
分组 多肽名称 多肽浓度
1空白对照组 ——— --
2阳性对照组 PI-9 10μg/mL
3阴性对照组 GL-9 10μg/mL
4MAM-01 MAM-01 10μg/mL
5MAM-02 MAM-02 10μg/mL
6MAM-03 MAM-03 10μg/mL
7MAM-04 MAM-04 10μg/mL
8MAM-05 MAM-05 10μg/mL
9MAM-06 MAM-06 10μg/mL
10MAM 07 MAM07 10μg/mL
11MAM 08 MAM08 10μg/mL
12MAM 09 MAM09 10μg/mL
3)实验结果
将多肽与表达HLA-A0201的T2细胞共孵育后，用流式细胞仪检测T2细胞表面HLA-A02的表达，HLA-A0201抗体为FITC标记。参见图1，为多肽片段与HLA-A0201结合能力检测结果；其中，MAM-01～09：待检多肽01～09。与空白对照组相比，阳性对照，MAM01～06组均能使HLA-A0201的流式信号向右发生位移，而MAM07～09的位移较少，阴性对照组则无此现象。结果表明：MAM01～06六组多肽片段均能与HLA-A02结合；而MAM07～09与HLA-A02的结合能力较弱，因此MAM07～09不选入后续的筛选实验。
实施例3四聚体检测负载多肽的DC细胞对T细胞的激活作用
1)试剂：荧光素标记的MHC-肽四聚体，洗涤液(含1％FCS，pH7.4PBS)，固定液(25％戊二醛3.2ml，葡萄糖2g加无BSA的细胞洗液至100ml)，FcR阻断剂。淋巴细胞培养基TakaraGT-T551，淋巴细胞分离液，自体血浆，IL-2；多肽溶液。
2)方法：
DC细胞的培养：全血样品用枸橼酸钠进行抗凝，用淋巴细胞分离液从全血中分离PBMC细胞和血浆，血浆在56℃条件下灭活40分钟后离心，取上清4℃保存备用。用含2％自体血浆的GT-T551培养基将PBMC浓度调整为2*106，铺6孔板，每孔2mL，置于培养箱中，37℃，5％CO2条件下培养2小时。
淋巴细胞培养：将未贴壁的细胞连同培养基一起移除，用GT-T551培养基洗两次，与未贴壁的细胞合并培养，细胞密度1*10^6,加入2％自体血浆，IL-2 200IU/mL，37℃，5％CO2条件下培养；每2～3天更换一次GT-T551培养基(含2％自体血浆，IL-2 200IU/mL)，细胞密度维持在1*10^6左右。贴壁细胞中加入GT-T551培养基，2％自体血浆，IL-41000IU/mL，GM-CSF 1000IU/mL,37℃，5％CO2条件下培养5天，分别加入多肽MAM01～MAM06；10μg/mL，37℃，5％CO2条件下培养24h，再加入促成熟剂TNF-α20ng/mL，37℃，5％CO2条件下培养24h。
移除培养上清，将上述步骤中培养的淋巴细胞与负载多肽的DC细胞按照20:1的比例进行混合；37℃，5％CO2条件下培养7天，每2～3天向培养体系中补充GT-T551培养基(含2％自体血浆，IL-2 200IU/mL)，细胞密度维持在1*10^6左右。
收集细胞，1500r/min离心3min，弃上清；用Fc阻断剂与细胞共孵育30分钟以减少非特异性结合导致的假阳性结果，1500r/min离心3min，弃上清；加入500μL洗涤液再洗一次；分别加入荧光素标记的MHC-肽四聚体50ml，混匀；4℃孵育60min，加入洗液，1500r/min离心3min，反复洗涤3次；用细胞洗液恢复体积至0.5ml，加入固定液20ml，混匀；上流式细胞仪进行检测。
3)实验结果：
将T细胞与负载了多肽的DC细胞共培养后，用PE标记的四聚体试剂检测培养体系中的T细胞。参见图2，为流式检测抗体共培养体系中特异性T细胞比例的流式结果图；其中Blank：空白对照。MAM-01～06：待检多肽01～06。图中纵坐标表示特异性抗体在T细胞上的表达强度，
图2结果表明：与负载了MAM的DC细胞共孵育后，抗原特异性的T细胞比例明显增加。
实施例4体外检测DC激活的CTL细胞对肿瘤细胞的杀伤能力
1)试剂：PBMC细胞，DC激活试剂，DC成熟剂，CIK诱导因子，IL-2，IFN-γ，淋巴细胞培养基，自体血浆，UAC-812细胞，1640培养基，胎牛血清，LDH检测试剂盒，生理盐水。
2)方法
取健康志愿者的全血样本200mL，分离PBMC细胞，计数，用完全培养基(含2％自体血浆的T551)将细胞密度调整至4*10^6，铺板(6孔板，每孔2mL)置于细胞培养箱中培养2h(37℃，5％CO2)。去除未贴壁细胞(T细胞)，并用无血清的T-551洗两次(1ml/次/孔)，将为贴壁细胞合并后培养备用(密度1*10^6/ml，加入IFN-γ1000IU/mL，24h后加入CIK激活剂(用量为CIK培养方案的1/10))。贴壁细胞中加入含有DC诱导因子(1×)的完全培养基，置于培养箱中培养。
24h后，取出一半的DC细胞，加入DC快速成熟剂培养24h后，加入多肽20ug/ml培养2h。离心去除培养基，并用生理盐水洗涤细胞1次。按1:20(DC:T)的比例加入T细胞进行共同培养，培养时间为7天。第5天式时需要向培养基中按4倍体积补液，同时加入300IU/mL IL-2。
5天后，在另一半的DC细胞中加入DC成熟剂培养24h，加入多肽20ug/ml培养2h。离心去除培养基，并用生理盐水洗涤细胞1次。将用激活过一次的T细胞加入DC中继续进行共培养，培养时间为7天。第9，11，13天式时需要向培养基中按2倍体积补液，同时加入300IU/mL IL-2。
第13天，乳腺癌肿瘤细胞系铺96孔板(UAC-812)，密度1*10^4/孔，培养箱培养过夜。
第14天，将CTL细胞计数，按效靶比5：1，10：1，20：1的梯度加入肿瘤细胞中培养12h，收集培养上清，按照检测试剂盒说明书测定各组LDH的释放量。
3)实验结果
将与DC细胞共孵育的T细胞与乳腺癌细胞UAC-812以5:1,10:1,20:1的比例进行混合，共孵育12小时后，取培养上清液，用检测试剂盒检测培养上清中LDH的释放量，并以阳性对照为1，计算出各组T细胞对于肿瘤细胞的毒性。结果参见图3，为LDH检测经负载多肽的DC细胞激活的T细胞对于乳腺癌细胞杀伤作用的数据图；其中，Con：未负载多肽片段的DC细胞激活的T细胞；MAM-01～06：负载待检多肽01～06片段的DC细胞激活的T细胞。
图3结果表明：用负载了多肽片段的DC细胞激活的T细胞对于MAM阳性的乳腺癌肿瘤细胞的杀伤能力明显高于仅通过DC细胞激活的T细胞。
实施例5在动物水平检测筛选活性多肽对肿瘤的抑制作用
实验动物：5-7周雄性裸鼠
实验分组及检测指标参见表4，其中，Blank组是空白对照(注射细胞保存液)，CTL组是指注射未负载多肽片段的DC细胞激活的T细胞，MAM-01～06组是指：注射负载待检多肽01～06片段的DC细胞激活的T细胞。
表4
将UAC-812肿瘤细胞注射在Null-bcl小鼠背部造模，待形成3*3mm^2肿块后开始注射经负载多肽的DC细胞激活的T细胞，每周一次，8周后测量小鼠背部肿块大小。参见图4，为动物实验检测负载多肽的DC细胞激活的T细胞对于乳腺癌肿块生成的抑制作用的数据图；其中，空白对照：注射细胞保存液；T细胞组：注射未负载多肽片段的DC细胞激活的T细胞；MAM-01～06：注射负载待检多肽01～06片段的DC细胞激活的T细胞。
图4结果表明：用负载了多肽片段的DC细胞激活的T细胞可以抑制MAM阳性的乳腺癌肿瘤细胞在小鼠体内的生长，且其作用明显优于仅通过DC细胞激活的T细胞。
上述仅为本发明的部分优选实施例，本发明并不仅限于实施例的内容。对于本领域中的技术人员来说，在本发明技术方案的构思范围内可以有各种变化和更改，所作的任何变化和更改，均在本发明保护范围之内。
序列表
<110> 英普乐孚生物技术（上海）有限公司
<120> 用于制备DC疫苗的多肽片段及DC疫苗
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 人乳腺珠蛋白(mammaglobin)
<400> 1
Leu Ile Tyr Asp Ser Ser Leu Cys Asp Leu
1 5 10
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> 人乳腺珠蛋白(mammaglobin)
<400> 2
Leu Met Val Leu Met Leu Ala Ala Leu
1 5
<210> 3
<211> 10
<212> PRT
<213> 人乳腺珠蛋白(mammaglobin)
<400> 3
Phe Met Gln Leu Ile Tyr Asp Ser Ser Leu
1 5 10
<210> 4
<211> 9
<212> PRT
<213> 人乳腺珠蛋白(mammaglobin)
<400> 4
Phe Leu Asn Gln Thr Asp Glu Thr Leu
1 5
<210> 5
<211> 9
<212> PRT
<213> 人乳腺珠蛋白(mammaglobin)
<400> 5
Thr Ile Asn Pro Gln Val Ser Lys Thr
1 5
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 人乳腺珠蛋白(mammaglobin)
<400> 6
Lys Leu Leu Met Val Leu Met Leu Ala
1 5
<210> 7
<211> 9
<212> PRT
<213> 人乳腺珠蛋白(mammaglobin)
<400> 7
Thr Leu Ser Asn Val Glu Val Phe Met
1 5
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> 人乳腺珠蛋白(mammaglobin)
<400> 8
Met Leu Ala Ala Leu Ser Gln His Cys
1 5
<210> 9
<211> 9
<212> PRT
<213> 人乳腺珠蛋白(mammaglobin)
<400> 9
Gln Thr Asp Glu Thr Leu Ser Asn Val
1 5

Claims (9)

1.用于制备DC疫苗的多肽片段，其特征在于：所述多肽片段选自如SEQ ID NO.1-SEQID NO.6所示的至少其一的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的用于制备DC疫苗的多肽片段，其特征在于：所述多肽片段由化学法合成，多肽纯度大于95％。
3.如权利要求1所述的用于制备DC疫苗的多肽片段，其特征在于：所述多肽片段来自于人乳腺珠蛋白的氨基酸序列。
4.如权利要求1所述的用于制备DC疫苗的多肽片段，其特征在于：所述多肽片段获得方式为，在线预测人乳腺珠蛋白中不同多肽片段与MHC类分子HLA-A0201的亲和力数据，选取其中亲和力高的片段为所述多肽片段。
5.一种DC疫苗，该DC疫苗包含负载权利要求1所述多肽片段的DC细胞。
6.如权利要求5所述的一种DC疫苗，其特征在于，该DC疫苗的组成为：负载权利要求1所述多肽片段的DC细胞、人血白蛋白、生理盐水；其中，人血白蛋白在生理盐水中的质量浓度为5％-20％，负载多肽片段的DC细胞的密度是(0.5-2)*106个/mL。
7.如权利要求5所述的一种DC疫苗，其特征在于：所述DC疫苗是通过将DC细胞与权利要求1所述的多肽片段共培养获得。
8.权利要求5所述的DC疫苗的制备方法，该方法为：
步骤1，DC细胞的分离与诱导：血液样品或单采机收集到的白细胞，用淋巴细胞分离液分离出外周血单核细胞，通过贴壁培养分离出单核细胞后，用含有GM-CSF、IL-4、自体血浆的淋巴细胞培养基培养并诱导单核细胞向DC细胞分化；
步骤2，多肽的负载：诱导培养4-6天后，向培养体系中加入权利要求1所述的多肽片段，可单独加入一种序列的多肽片段或者几种多肽片段的混合物，所加入多肽片段的浓度为1-100μg/mL，37℃条件下共培养得到负载有多肽片段的DC细胞；
步骤3，制备DC疫苗制剂：向负载有多肽片段的DC细胞中加入10-30ng/mL TNF-α，促进DC细胞的成熟，DC细胞培养成熟后，离心收集细胞，用生理盐水洗涤细胞，最后将负载有多肽片段的DC细胞悬浮于含3-6％(质量体积比)人血白蛋白的生理盐水中，负载多肽片段的DC细胞的悬浮密度是(0.5-2)*106个/mL，制得DC疫苗制剂。
9.如权利要求8所述的一种DC疫苗，其特征在于：所述步骤2中多肽片段的浓度为5-50μg/mL。
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