CN109311955B - 一种新的肿瘤特异性多肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种新的肿瘤特异性多肽及其应用。具体而言，本发明涉及一种与HLA‑A0201具有高亲和力并具有细胞毒性T淋巴细胞诱导能力的肿瘤特异性多肽，以及其在诊断、预防和治疗TWISTNB基因高表达或TWISTNB基因突变相关的疾病(特别是癌症)中的应用。

Description

一种新的肿瘤特异性多肽及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体而言，本发明涉及多肽及其应用，更具体地，本发明涉及多肽及其在制备试剂盒、药物、疫苗中的用途，涉及药物组合物、DC细胞、靶向性免疫细胞群、疫苗、抗体，涉及制备抗体的方法、治疗方法、诊断方法和诊断系统。

背景技术

癌症是一种由于细胞内基因突变导致细胞增殖失控而产生的疾病。目前，癌症已成为人类健康的重大威胁，是导致人类死亡的主要原因之一。世界卫生组织(WHO)在发表的《全球癌症报告2014》中指出，2012年全球癌症患者和死亡病例都在迅速增加，而新增癌症病例有近一半出现在亚洲，其中大部分出现在中国，中国新增癌症病例高居第一位(WorldHealth Organization.Globocan 2012:Estimated cancer incidence,mortality andprevalence worldwide in 2012)。《2012年中国肿瘤登记年报》数据显示，中国每年新增癌症病例约350万例，约有250万人由于罹患癌症死亡(Bernard W.Stewart CPW.WorldCancer Report 2014)。因此，寻找高效、高特异性的癌症治疗方法具有重大的临床价值。

传统的癌症治疗方法主要包括手术、放疗和化疗，但这几种方法都存在较大的局限性。由于癌细胞的近端入侵或远端转移，手术切除后的肿瘤转移复发率较高；而放疗和化疗对于机体自身的正常细胞尤其是造血系统和免疫系统会造成严重的损害，因此对于已发生癌症转移的患者很难达到较好的远期疗效(哈小琴，张尚弟，杨志华，张俊.肿瘤生物治疗的新技术--靶向基因治疗.解放军医药杂志.2014；26:24-7.)。

随着癌症分子机制的深入研究和生物技术的进一步发展，靶向治疗和免疫治疗在癌症的综合治疗中发挥着愈来愈大的作用。靶向疗法主要包括单克隆抗体(有时归为被动免疫疗法)和小分子靶向药物，而免疫疗法主要包括细胞因子疗法、免疫检验点阻断法、过继细胞回输和肿瘤疫苗等(Mellman I,Coukos G,Dranoff G.Cancer immunotherapycomes of age.Nature 2011；480:480-9；Chen DS,Mellman I.Oncology meetsimmunology:the cancer-immunity cycle.Immunity2013；39:1-10)。免疫疗法通过调动机体的免疫系统，增强肿瘤微环境抗肿瘤免疫力，从而控制和杀伤肿瘤细胞，因此具有效率高、特异性强、耐受性好的优点，在肿瘤治疗中具有广阔的前景(Chen DS,MellmanI.Oncology meets immunology:the cancer-immunity cycle.Immunity 2013；39:1-10；Currie GA.Eighty years of immunotherapy:a review of immunological methodsused for the treatment of human cancer.British journal of cancer 1972；26:141-53.)。

用于免疫治疗的肿瘤疫苗主要包括肿瘤细胞疫苗、树突状细胞疫苗、蛋白质和多肽疫苗、核酸疫苗、基因工程疫苗和抗独特型肿瘤疫苗(李亭葶，李晖，王熙才.肿瘤疫苗在肿瘤治疗中的研究进展.现代肿瘤医学.2013；21:2351-3)。这些疫苗能够杀伤肿瘤的主要机制是使患者针对肿瘤特异性抗原产生免疫反应，包括抗原抗体反应和细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T-lymphocyte，CTL)特异性杀伤等，其中CTL特异性杀伤在肿瘤免疫反应中起到很大的作用。

肿瘤特异性多肽是一种肿瘤特异性抗原，主要诱导CTL并引起CTL特异性杀伤靶细胞。肿瘤特异性多肽包括肿瘤突变的多肽以及肿瘤特异性高表达的多肽。其中肿瘤突变的多肽由于其只存在于患者的肿瘤组织，是肿瘤免疫治疗的特异性靶点，具有安全性好、副作用小等特点。靶向肿瘤突变的多肽的免疫治疗，以多肽特异性DC-CTL以及TIL过继回输等方法为代表，具有良好的治疗效果(Tran E,Turcotte S,Gros A,et al.Cancerimmunotherapy based on mutation-specific CD4+ T cells in a patient withepithelial cancer.Science.2014.344(6184):641-5；Cobbold M,De La Pena H,NorrisA,et al.MHC class I-associated phosphopeptides are the targets of memory-likeimmunity in leukemia.Sci Transl Med.2013.5(203):203ra125)。

肿瘤特异性多肽能够被CTL或肿瘤浸润淋巴细胞(tumor-infiltratinglymphocyte，TIL)识别，需要人类白细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)的抗原呈递功能。不同的多肽与特定亚型的HLA的结合能力是不同的。在特定HLA亚型的肿瘤患者体内，HLA亚型决定了只有某些突变的多肽能够与其HLA结合，并被其HLA递呈至CTL或TIL细胞。HLA主要分为I型HLA和II型HLA。I型HLA又主要分为HLA-A、HLA-B和HLA-C三种亚型；其中，对于每种亚型，根据其序列的不同，又可以分为多种亚型。HLA-A0201是HLA-A亚型中的一种，在中国人群中占有约13％的较高的比例。

TWISTNB(全称为Twist neighbor)基因编码长度为338个氨基酸、分子量大小为37,432道尔顿的蛋白质。该蛋白质称为Twist neighbor 蛋白，或DNA介导的RNA聚合酶I亚单位RPA43(DNA-directed RNA polymerase I subunit RPA43)，GeneBank登录号为Q3B726，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。Twist neighbor蛋白在正常体内主要发挥DNA依赖的RNA聚合酶的作用，作为RNA聚合酶I的组成部分，催化从DNA到RNA的转录反应，并且在成人正常组织中低表达。突变后的TWISTNB基因能够在肿瘤组织中高水平表达。迄今为止，国内外尚未报道过TWISTNB基因相关多肽用于肿瘤的免疫治疗。因此，TWISTNB基因相关肿瘤特异性多肽对于患者的肿瘤检测、早期预防以及免疫治疗，具有非常重要的意义。

发明内容

本发明涉及一种新的肿瘤特异性多肽及其应用。具体而言，本发明人出人意料地发现，本发明的多肽与HLA抗原、特别是HLA-A0201抗原具有高亲和力，可以用作TWISTNB基因高表达或突变的肿瘤的肿瘤特异性抗原，有效地诱导CTL，用于预防或者治疗与TWISTNB基因高表达或突变相关的疾病，尤其是癌症。

因此，本申请包括以下各项的实施方案以及它们的任意组合。

1.一种多肽或其衍生物，其选自：

a)包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列KLMGIVYKV或由其组成的多肽；或者

b)多肽，其氨基酸序列与SEQ ID NO:2具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％的同一性，所述多肽具有细胞毒性T淋巴细胞诱导能力；或者

c)多肽，其氨基酸序列与SEQ ID NO:2相比具有至少一个或几个氨基酸的取代、缺失和/或添加，所述多肽具有细胞毒性T淋巴细胞诱导能力；或者

d)多肽的衍生物，其为a)-c)任一所述的多肽的衍生物，所述多肽的衍生物具有细胞毒性T淋巴细胞诱导能力。

2.根据第1项所述的多肽或其衍生物，其中所述多肽的氨基酸序列自N-末端起的第二个氨基酸被取代为亮氨酸或甲硫氨酸，和/或C-末端氨基酸被取代为缬氨酸或亮氨酸。

3.根据第1或2项所述的多肽或其衍生物，其特征在于：所述多肽包含氨基酸序列与SEQ ID NO:2相比具有至少一个或几个氨基酸的取代和添加的TWISTNB蛋白片段，或者包含SEQ ID NO:2所示的多肽的TWISTNB蛋白片段。

4.根据第1-3任一项所述的多肽或其衍生物，其包含以下氨基酸序列或者由以下氨基酸序列组成：

-KLMGIVYKV(SEQ ID NO:2)；

-KMMGIVYKV(SEQ ID NO:3)；

-KLMGIVYKL(SEQ ID NO:4)；

-KMMGIVYKL(SEQ ID NO:5)。

5.一种多核苷酸，其编码第1-4任一项所述的多肽。

6.一种核酸构建体，其包含第5项所述的多核苷酸，以及与之可操作地连接、指导所述多肽在宿主细胞中表达的一个或多个调控序列。

7.一种载体，其包含第5项所述的多核苷酸。

8.一种宿主细胞，其中转化或转染了如第6项所述的核酸构建体或如权利要求7所述的载体。

9.一种缀合物，其包含第1-4任一项所述的多肽或其衍生物、或者第5项所述的多核苷酸、或者第6项所述的核酸构建体、或者第7项所述的载体、或者第8项所述的宿主细胞。

10.一种药物组合物，其包含第1-4任一项所述的多肽或其衍生物、或者第5项所述的多核苷酸、或者第6项所述的核酸构建体、或者第7项所述的载体、或者第8项所述的宿主细胞；任选地包含佐剂和/或药学上可接受的载体。

11.一种产生抗原呈递细胞的体外方法，所述方法包括下述步骤：

(a)使抗原呈递细胞与第1-4任一项所述的多肽或其衍生物接触，或

(b)将第5项所述的多核苷酸、或者第6项所述的核酸构建体、或者第7项所述的载体导入抗原呈递细胞。

12.一种抗原呈递细胞，其在细胞表面呈递如第1-4任一项所述的多肽或其衍生物。

13.根据第12项所述的抗原呈递细胞，其是通过第11项的方法产生的。

14.一种靶向性免疫细胞群，其是通过将第12或13项所述的抗原呈递细胞与淋巴细胞进行共培养获得.的或可通过将第12或13项所述的抗原呈递细胞与淋巴细胞进行共培养获得。

15一种产生免疫效应细胞的方法，其包括：将如第1-4任一项所述的多肽或其衍生物与免疫细胞接触的步骤；

优选地，所述免疫细胞为T淋巴细胞，优选为CD8+ T淋巴细胞。

16.根据第15项所述的方法，其特征为：所述的免疫细胞通过抗原呈递细胞与1-4任一项所述的多肽或其衍生物接触。

17.一种免疫效应细胞，其通过第15或16项所述的方法产生。

18.一种疫苗或药物组合物，其特征在于：包含第1-4任一项所述的多肽或其衍生物、或者第5项所述的多核苷酸、或者第6项所述的核酸构建体、或者第7项所述的载体、或者第8项所述的宿主细胞、或者第12-13任一项所述的抗原呈递细胞、或者第14项所述的靶向性免疫细胞群、或者第17项所述的免疫效应细胞。

19.根据第18项所述的疫苗，其还包含佐剂。

20.根据第18-19任一项所述的疫苗，其被配制成向HLA抗原为HLA-A2亚型、优选HLA-A0201亚型的受试者施用。

21.一种抗体，其特征在于，所述抗体特异性识别第18-19任一项所述的疫苗。

22.一种制备抗体的方法，其特征在于，包括：

采集经第18-19任一项所述的疫苗免疫接种的动物血清；以及

从所述血清中纯化出目的抗体。

23.第1-4任一项所述的多肽或其衍生物、或者第5项所述的多核苷酸、或者第6项所述的核酸构建体、或者第7项所述的载体、或者第8项所述的宿主细胞、或者第12-13任一项所述的抗原呈递细胞、或者第14项所述的靶向性免疫细胞群、或者第17项所述的免疫效应细胞、或者第18-19任一项所述的疫苗、或者第21项所述的抗体，其用于预防或治疗受试者中与TWISTNB基因的高表达或TWISTNB基因突变相关的疾病。

24.根据第23项所述的多肽或其衍生物、多核苷酸、核酸构建体、载体、宿主细胞、抗原呈递细胞、靶向性免疫细胞群、免疫效应细胞、疫苗、或者抗体，其中所述疾病为癌症。

25.根据第24项所述的多肽或其衍生物、多核苷酸、核酸构建体、载体、宿主细胞、抗原呈递细胞、靶向性免疫细胞群、免疫效应细胞、疫苗、或者抗体，其中所述癌症包括乳腺癌、肺癌、鼻咽癌、肝癌、胃癌、食道癌、结直肠癌、胰腺癌、黑色素瘤、皮肤癌、前列腺癌、宫颈癌、白血病、脑肿瘤。

26.根据第22-25任一项所述的多肽或其衍生物、多核苷酸、核酸构建体、载体、宿主细胞、抗原呈递细胞、靶向性免疫细胞群、免疫效应细胞、疫苗、或者抗体，其中所述受试者为哺乳动物；优选地，所述受试者为人类。

27.根据第23-26任一项所述的多肽或其衍生物、多核苷酸、核酸构建体、载体、宿主细胞、抗原呈递细胞、靶向性免疫细胞群、免疫效应细胞、疫苗、或者抗体，其中所述受试者的HLA抗原为HLA-A2亚型、优选HLA-A0201亚型。

28.第1-4任一项所述的多肽或其衍生物、或者第5项所述的多核苷酸、或者第6项所述的核酸构建体、或者第7项所述的载体、或者第8项所述的宿主细胞、或者第12-13任一项所述的抗原呈递细胞、或者第14项所述的靶向性免疫细胞群、或者第17项所述的免疫效应细胞、或者第18-19任一项所述的疫苗、或者第21项所述的抗体在制备用于预防或治疗受试者中与TWISTNB基因的高表达或TWISTNB基因突变相关的疾病的药物中的用途。

29.根据第28项所述的用途，其中所述疾病为癌症。

30.根据第29项所述的用途，其中所述癌症包括乳腺癌、肺癌、鼻咽癌、肝癌、胃癌、食道癌、结直肠癌、胰腺癌、黑色素瘤、皮肤癌、前列腺癌、宫颈癌、白血病、脑肿瘤。

31.根据第28-30任一项所述的用途，其中所述受试者为哺乳动物；优选地，所述受试者为人类。

32.根据第31项所述的用途，其中所述受试者的HLA抗原为HLA-A2亚型；优选HLA-A0201亚型。

33.第1-4任一项所述的多肽或其衍生物、或者第5项所述的多核苷酸、或者第6项所述的核酸构建体、或者第7项所述的载体、或者第8项所述的宿主细胞、或者第12-13任一项所述的抗原呈递细胞、或者第14项所述的靶向性免疫细胞群、或者第17项所述的免疫效应细胞在制备用于预防或治疗受试者中与TWISTNB基因的高表达或TWISTNB基因突变相关的疾病的疫苗中的用途。

34.根据第33项所述的用途，其中所述疾病为癌症。

35.根据第34项所述的用途，其中所述癌症包括乳腺癌、肺癌、鼻咽癌、肝癌、胃癌、食道癌、结直肠癌、胰腺癌、黑色素瘤、皮肤癌、前列腺癌、宫颈癌、白血病、脑肿瘤。

36.根据第33-35任一项所述的用途，其中所述受试者为哺乳动物；优选地，所述受试者为人类。

37.根据第33-36任一项所述的用途，其中所述受试者的HLA抗原为HLA-A2亚型、优选HLA-A0201亚型。

38.一种预防或治疗受试者中与TWISTNB基因的高表达或TWISTNB基因突变相关的疾病的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的第1-4任一项所述的多肽或其衍生物、或者第5项所述的多核苷酸、或者第6项所述的核酸构建体、或者第7项所述的载体、或者第8项所述的宿主细胞、或者第12-13任一项所述的抗原呈递细胞、或者第14项所述的靶向性免疫细胞群、或者第17项所述的免疫效应细胞、或者第18-19任一项所述的疫苗、或者第21项所述的抗体。

39.根据第38项所述的方法，其中所述疾病为癌症。

40.根据第39项所述的方法，其中所述癌症包括乳腺癌、肺癌、鼻咽癌、肝癌、胃癌、食道癌、结直肠癌、胰腺癌、黑色素瘤、皮肤癌、前列腺癌、宫颈癌、白血病、脑肿瘤。

41.根据第38-40任一项所述的方法，其中所述受试者为哺乳动物；优选地，所述受试者为人类。

42.根据第38-41任一项所述的方法，其中所述受试者的HLA抗原为HLA-A2亚型、优选HLA-A0201亚型。

43.一种诊断受试者中与TWISTNB基因的高表达或TWISTNB基因突变相关的疾病的体外方法，其包括以下步骤：

从受试者获取血清；和

检测血清中第1-4任一项的多肽或其衍生物的存在。

44.第43项所述的方法，其中所述检测通过质谱进行。

45.根据第43或44项所述的方法，其中所述疾病为癌症。

46.根据第43-45任一项所述的方法，其中所述癌症包括乳腺癌、肺癌、鼻咽癌、肝癌、胃癌、食道癌、结直肠癌、胰腺癌、黑色素瘤、皮肤癌、前列腺癌、宫颈癌、白血病、脑肿瘤。

47.根据第43-46任一项所述的方法，其中所述受试者为哺乳动物；优选地，所述受试者为人类。

48.根据第43-47任一项所述的方法，其中所述受试者的HLA抗原为HLA-A2亚型、优选HLA-A0201亚型。

49.第1-4任一项所述的多肽或其衍生物、或者第5项所述的多核苷酸、或者第6项所述的核酸构建体、或者第7项所述的载体、或者第8项所述的宿主细胞、或者第12-13任一项所述的抗原呈递细胞、或者第14项所述的靶向性免疫细胞群、或者第17项所述的免疫效应细胞、或者第18-19任一项所述的疫苗、或者第21项所述的抗体在制备用于诊断受试者中与TWISTNB基因的高表达或TWISTNB基因突变相关的疾病的诊断试剂或试剂盒中的用途。

50.根据第49项所述的用途，其中所述疾病为癌症。

51.根据第50项所述的用途，其中所述癌症包括乳腺癌、肺癌、鼻咽癌、肝癌、胃癌、食道癌、结直肠癌、胰腺癌、黑色素瘤、皮肤癌、前列腺癌、宫颈癌、白血病、脑肿瘤。

52.根据第49-51任一项所述的用途，其中所述受试者为哺乳动物；优选地，所述受试者为人类。

53.根据第49-52任一项所述的用途，其中所述受试者的HLA抗原为HLA-A2亚型、优选HLA-A0201亚型。

本发明的有益效果

本发明的多肽，例如，KLMGIVYKV多肽(SEQ ID NO:2)及其可变形式KMMGIVYKV(SEQID NO:3)、KLMGIVYKL(SEQ ID NO:4)、KMMGIVYKL(SEQ ID NO:5)，具有强的免疫原性、激活特异性T免疫的能力。

本发明的多肽来源于肿瘤突变多肽，在未发生该突变的人体内不存在，且只存在于发生该突变的患者的肿瘤组织，正常组织不包含该突变。由于其只存在于患者肿瘤组织，而不存在正常组织，因此其特异性更高，引起的免疫反应的特异性也更高，可以制备为多肽疫苗，与其他肿瘤多肽疫苗相比，具有更为安全、副作用小、很少引起严重的免疫反应的优点，又因其结构简单、易于人工合成，作为疫苗，可以引起针对肿瘤的免疫反应。

上述多肽可以被作为靶点或者疫苗应用于同时表达HLA-A0201和该突变多肽的肿瘤的生物疗法。其可以采用多肽+佐剂、或多肽负载的DC疫苗、或多肽特异性DC-CTL等方式，能够引起机体免疫反应，特异性杀伤肿瘤细胞，预防以及治疗与TWISTNB基因的高表达或TWISTNB基因突变相关的疾病(例如，癌症)，包括表达上述多肽序列的肺癌、黑色素瘤、乳腺癌、鼻咽癌、肝癌、胃癌、食道癌、结直肠癌、胰腺癌、皮肤癌、前列腺癌、宫颈癌、白血病、脑肿瘤等癌症类型。本发明的多肽疫苗能够显著地抑制肿瘤生长，延长受试者的生存期。

此外，由于该突变仅发现于癌组织中，而且可以通过质谱的方式检测到血清中存在的该游离多肽，因此，作为肿瘤标志物其可以应用于癌症的诊断。

再者，本发明的多核苷酸、核酸构建体、载体、宿主细胞、抗原呈递细胞、靶向性免疫细胞群或免疫效应细胞也可以制备为疫苗、药物组合物，用于预防和治疗上述与TWISTNB基因的高表达或TWISTNB基因突变相关的疾病。

同时，本发明的多核苷酸、核酸构建体、载体、宿主细胞、抗原呈递细胞、靶向性免疫细胞群或免疫效应细胞、疫苗或者抗体可以用来制备诊断试剂或试剂盒，用于诊断受试者中与TWISTNB基因的高表达或TWISTNB基因突变相关的疾病。

在本发明的上下文中，“突变多肽”或“本发明的多肽”意指相对于野生型多肽(即，未突变的Twist neighbor蛋白中第130-138位氨基酸所示的肽段，其序列为KLMGIVNKV，示于SEQ ID NO:6)发生突变的多肽。在本发明的具体实施方案、特别是实施例中，“突变多肽”或“本发明的多肽”具体指分别如SEQ ID NO:2-5所示的多肽，特别是SEQ ID NO:2所示的多肽。

在结合附图说明和实施例阅读发明详述之后，本发明的目的和特征将变得更加明显。然而，本领域技术人员将理解，无论是前面的发明内容，还是之后的发明详述，均为本发明的优选实施方案，而不是对本发明可供选择的实施方案的限制。

附图说明

图1显示通过流式细胞术测定的多肽与T2细胞的亲和力。

图2显示通过酶联免疫斑点测定(ELISPOTs)方法，表明本发明的KLMGIVYKV多肽(SEQ ID NO:2)激活CD8+T细胞免疫反应。将共培养后的CD8+T细胞与负载了KLMGIVYKV多肽和野生型多肽的T2细胞分别加入到ELISPOTs板中进行培养，20小时后进行ELISPOTs检测。左图表示负载了KLMGIVYKV多肽的斑点数，右图表示负载了野生型多肽的斑点数(“对照”)。

图3显示CD8+T细胞特异性杀伤呈递突变多肽、野生型多肽以及未负载多肽的靶细胞的杀伤比(％)。

图4显示突变多肽免疫治疗对肿瘤生长的抑制效果和治疗后的生存率。图4A表示进行佐剂、佐剂+野生型多肽组、佐剂+突变多肽组治疗后对肿瘤生长的抑制效果。图4B表示进行佐剂、佐剂+野生型多肽组、佐剂+突变多肽组治疗后小鼠的生存率。

图5显示DC-突变多肽免疫治疗对肿瘤生长的抑制效果和治疗后的生存率。图5A表示进行DC-负载野生型(KLMGIVNKV)多肽、DC-负载突变多肽(SEQ ID NO:2-5)治疗后对肿瘤生长的抑制效果。图5B表示进行DC-负载野生型(KLMGIVNKV)多肽、DC-负载突变多肽(SEQID NO:2-5)治疗后小鼠的生存率。

图6显示携带多肽的慢病毒免疫治疗对肿瘤生长的抑制效果和治疗后的生存率。图6A表示携带野生型(SEQ ID NO:6)或突变多肽(SEQ ID NO:2-5)序列的慢病毒载体转染DC后治疗对肿瘤生长的抑制效果。图6B表示携带野生型或突变多肽序列的慢病毒载体转染DC后治疗小鼠的生存率。

图7显示DC-负载多肽+CTL免疫治疗对肿瘤生长的抑制效果和治疗后的生存率。图7A表示进行DC-负载野生型多肽(SEQ ID NO:6)+CTL、DC负载突变多肽(SEQ ID NO:2-5)+CTL组治疗后对肿瘤生长的抑制效果。图7B表示进行DC-负载野生型多肽+CTL、DC-负载突变多肽+CTL组治疗后小鼠的生存率。

发明详述

定义

除非特殊说明，本说明书中使用的术语“一个”或“一种”和“该/所述”是指至少一个或至少一种。

除非另有定义，本说明书中使用的所有技术和科学术语的含义与本领域技术人员所通常理解的含义相同。

术语“多肽”如用于本文中指由两个或两个以上氨基酸通过肽键连接而成的线性多聚体。

术语“多核苷酸”如用于本文中指由3’,5’-磷酸二酯键连接起来的、多于10个核苷酸的线性多聚体。

术语“基因”如用于本文中指在染色体上占有特定基因座的遗传单位。

参数“同一性”描述两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性。两个氨基酸序列之间的序列同一性程度可以使用本领域技术人员公知的软件包或程序来确定，如EMBOSS软件包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice等,2000；http://emboss.org)或BLAST序列比对工具(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。

术语“片段”意指从多肽的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个(几个)氨基酸的多肽。

术语“细胞毒性T淋巴细胞诱导能力”如用于本文中指诱导细胞毒性T淋巴细胞的能力，例如，刺激CD8+T细胞扩增并激活CD8+T细胞免疫反应。

术语“变体”意指在一个或多个(几个)位置包含氨基酸的改变，即一个或多个(几个)氨基酸残基的取代、插入和/或缺失的、具有亲本或野生型多肽的活性的多肽。“取代”意指将占据某位置的氨基酸用不同的氨基酸替代；“缺失”意指去除占据某位置的氨基酸；而“插入”意指在邻接着占据某位置的氨基酸添加一个或几个氨基酸。

术语“MHC”即主要组织相容性复合物，指一个多基因的基因座，负责产生组织相容性抗原。对于不同的生物体，此基因座有不同的符号，在人体中为HLA。

术语“HLA抗原”是一种组织相容性抗原，是由人体白细胞A基因座(即主要组织相容性基因座)决定的抗原。它们是存在于绝大多数具核细胞及血小板的多肽或糖蛋白，可决定移植的组织类型，并与某些疾病有关。

术语“I类HLA抗原”指由人体MHC复合物的HLA基因座编码的抗原。

术语“HLA-A抗原”或“HLA-A”指多态性I类人体组织相容性表面抗原，存在于几乎所有的有核细胞中。它们是T细胞溶解反应的靶抗原，也参与组织/器官移植物的接受或排斥。

术语“疫苗”指用微生物或其毒素、酶，人或动物的血清、细胞等制备的供预防、诊断和治疗用的制剂。在本申请的上下文中，“疫苗”指当接种入受试者时，诱导免疫反应或抗肿瘤免疫性的制剂。

术语“高表达”或“高水平表达”如用于本文中指以比正常组织高的表达量进行表达。

术语“贴壁培养”是指细胞贴附在一定的固相表面进行的培养。贴壁培养系统主要有转瓶、中空纤维、玻璃珠、微载体系统等。

“T2细胞”指的是内源性抗原提呈途径中必需的抗原多肽转运蛋白(TAP)缺陷的细胞株，为HLA-A2阳性的T、B淋巴细胞杂交瘤细胞，T2细胞表达HLA-A0201，可用于研究多肽与MHC的结合和T细胞与MHC-分子的相互识别。

多肽

本发明的多肽来源于肿瘤突变蛋白，具体而言，突变的TWIST Neighbor蛋白。突变的TWIST Neighbor蛋白的氨基酸序列的第136位的天冬酰胺(Asn,N)突变为酪氨酸(Tyr,Y)，其存在于肿瘤组织中，并在肿瘤组织中高水平表达。由于其只存在于患者肿瘤组织，而不存在正常组织，因此其特异性更高，引起的免疫反应也是特异性更高，与其他肿瘤多肽疫苗相比，具有更为安全、副作用小的优点，很少引起严重的免疫反应，又因其结构简单、易于人工合成，作为疫苗，可以引起针对肿瘤的免疫反应。

本发明提供一种多肽或其衍生物，其选自：

a)包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列KLMGIVYKV或由其组成的多肽；或者

b)多肽，其氨基酸序列与SEQ ID NO:2具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％的同一性，所述多肽具有细胞毒性T淋巴细胞诱导能力；或者

c)多肽，其氨基酸序列与SEQ ID NO:2相比具有至少一个或几个氨基酸的取代、缺失和/或添加，所述多肽具有细胞毒性T淋巴细胞诱导能力；或者

d)多肽的衍生物，其为a)-c)任一所述的多肽的衍生物，所述多肽的衍生物具有细胞毒性T淋巴细胞诱导能力。

在一个具体实施方案中，本发明提供了一种由9个氨基酸组成的多肽,分子量为1050.37道尔顿，全长序列为：KLMGIVYKV(SEQ ID NO:2)。本发明人通过计算机预测软件，预测该多肽序列与HLA-A0201(也称为“HLA-A*0201”)具有高亲和力。经T2亲和力测试，证实该多肽确实与HLA-A0201具有高亲和力。

本发明还涉及所述多肽的变体。所述变体在一个或多个(几个)位置包含氨基酸的改变，即一个或多个(几个)氨基酸残基的取代、插入和/或缺失的，但仍具有所述多肽的活性，即，与HLA-A0201具有高亲和力并具有CTL诱导能力。在具体实施方案中，“几个”意指5个或更少，更优选3个或更少，最优选2个或更少。例如，所述多肽的变体可以与SEQ ID NO:2所示的多肽相比具有5个、4个、3个、2个或1个氨基酸残基的取代、插入和/或缺失。

优选地，氨基酸的改变为保守取代。保守取代的实例是在以下组之内：碱性氨基酸组(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸组(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸组(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸组(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸组(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸组(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。

除了20个标准氨基酸，也可用非标准氨基酸(例如4-羟脯氨酸、6-N-甲基赖氨酸、2-氨基异丁酸、异缬氨酸和α-甲基丝氨酸)取代多肽中的氨基酸残基。有限数量的非保守氨基酸、不由遗传密码编码的氨基酸和非天然氨基酸可以取代氨基酸残基。非天然氨基酸可以通过化学方法合成，并且优选是可商购的，包括，例如，六氢吡啶羧酸、噻唑烷羧酸、脱氢脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸，和3,3-二甲基脯氨酸。

此外，能够根据本领域已知的方法，例如定位诱变或丙氨酸分区诱变法(Cunningham和Wells,1989,Science 244:1081-1085)来鉴定亲本多肽中的必需氨基酸。在后一技术中，将单一丙氨酸突变引入到分子中的每个残基，并且测试所得突变分子的生物活性以鉴定对于所述分子的活性关键的氨基酸残基。参见Hilton等,1996,J.Biol.Chem.271:4699-4708。

在优选的实施方案中，可以使用SEQ ID NO:2的N末端起的第二个氨基酸被取代为亮氨酸或甲硫氨酸的多肽，和/或C末端氨基酸被取代为缬氨酸或亮氨酸的多肽。

在一个具体实施方案中，该多肽的变体包括KMMGIVYKV(SEQ ID NO:3，即SEQ IDNO:2的N末端起的第二个氨基酸被取代为甲硫氨酸)、KLMGIVYKL(SEQ ID NO:4，即SEQ IDNO:2的C末端氨基酸被取代为亮氨酸)、KMMGIVYKL(SEQ ID NO:5，即SEQ ID NO:2的N末端起的第二个氨基酸被取代为甲硫氨酸、C末端氨基酸被取代为亮氨酸)。以上变体与HLA-A0201的亲和力增强，而不改变其与T细胞之间的特异性。因此，以上变体也具有激活特异性T细胞免疫的能力。KLMGIVYKV所示的多肽或其变体均可以被作为靶点或者疫苗应用于同时表达HLA-A0201和所述多肽或其变体的肿瘤的生物学治疗。

本发明的多肽能够使用公知的技术制备。例如，可以使用重组DNA技术或通过化学合成的方法制备所述多肽。本发明的多肽也可以通过病毒载体或细菌载体来表达。合适的表达载体的实例包括但不限于：病毒载体，诸如慢病毒、痘苗病毒、禽痘病毒、腺病毒和腺伴随病毒载体、逆转录病毒载体；BCG(卡介苗(BacilleCalmetteGuerin))载体；细菌载体，如伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)载体。优选地，所述病毒载体是没有复制能力和致病性的载体。在本发明的一个具体实施方案中，所述病毒载体是慢病毒载体。

本发明的多肽优选地是分离的多肽。术语“分离的多肽”如用于本文中指从其来源分离的多肽。例如，所述多肽为至少60％纯、优选至少80％纯、更优选至少90％纯和最优选至少95％纯，如通过SDS-PAGE和HPLC所确定。优选地，所述“分离的多肽”为基本上纯的多肽。“基本上纯的多肽”在本文中指多肽制备物，其按重量计含有最多10％，优选最多8％，更优选最多6％，更优选最多5％，更优选最多4％，更优选最多3％，甚至更优选最多2％，最优选最多1％，和甚至最优选最多0.5％与其天然或重组结合的其它多肽物质。

本发明还涉及多肽的衍生物。例如，本发明的多肽可以含有修饰，诸如糖基化、侧链氧化或磷酸化修饰；只要所述修饰不影响所述的肽的生物学活性，即与HLA抗原结合并诱导CTL的能力。所述多肽的衍生物的实例还包括带有放射性标记、生物素标记或荧光标记的多肽。此外，本发明还涵盖所述多肽的水合物、溶剂化物、或生理学上可接受的盐。

此外，本发明还涉及编码所述多肽的多核苷酸。可以通过多肽序列，根据本领域技术人员公知的方法来设计并制备所述多核苷酸。

在进一步的实施方案中，本发明涉及核酸构建体，其包含本发明的多核苷酸，以及与之可操作地连接、指导所述多肽在宿主细胞中表达的一个或多个调控序列。所述调控的实例包括但不限于启动子、增强子等。

在进一步的实施方案中，可以将本发明的多核苷酸构建为载体，例如病毒载体、细菌载体、真核生物载体和BCG载体。病毒载体的实例包括但不限于慢病毒、痘苗病毒、禽痘病毒、腺病毒和腺伴随病毒载体、逆转录病毒载体，优选慢病毒载体。更优选地，所述病毒载体是减毒或脱毒的载体。细菌载体的实例包括但不限于伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)载体、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)载体、大肠杆菌(E.coli)载体等。真核生物载体的实例包括但不限于酵母载体，如酿酒酵母载体。

在更进一步的实施方案中，可以将本发明的核酸构建体或载体转化或转染如宿主细胞。合适的宿主细胞可以是任何适合所述核酸构建体或载体表达的宿主细胞。在一个具体实施方案中，宿主细胞为树突细胞。

抗原呈递细胞以及免疫效应细胞的产生

本发明还涉及一种产生抗原呈递细胞的体外方法，所述方法包括下述步骤：

(a)使抗原呈递细胞与本发明的多肽或其衍生物接触，或者

(b)将本发明的多核苷酸、核酸构建体、或载体导入抗原呈递细胞。

在一种实施方案中，可以通过以下方式来诱导抗原呈递细胞：从外周血单个核细胞诱导树突细胞，再使本发明的多肽或其衍生物在体外、回体或体内接触树突细胞，从而使得树突细胞负载所述多肽或其衍生物。

本发明还涉及通过上述方法产生的抗原呈递细胞。所述抗原呈递细胞在细胞表面呈递本发明的多肽或其衍生物。在一个具体实施方案中，所述抗原呈递细胞为负载本发明的多肽的树突细胞。

进一步地，本发明涉及一种产生免疫效应细胞的方法，其包括：将本发明的多肽或其衍生物与免疫细胞接触的步骤。具体而言，所述免疫效应细胞可以通过以下方式产生：将本发明的多肽或其衍生物与淋巴细胞进行共培养获得。在一个实施方案中，所述免疫细胞为T淋巴细胞，优选为CD8+ T淋巴细胞。具体而言，将负载本发明的多肽的树突细胞与来自受试者的CD8+ T淋巴细胞共培养后，可以将CD8+ T淋巴细胞激活为多肽特异性CD8+ T淋巴细胞。

本发明还涉及一种免疫效应细胞，其通过以上方法产生。可以通过ELISPOTs方法来验证本发明的多肽是否激活了CD8+ T淋巴细胞的细胞免疫反应，并通过LDH释放实验来验证CD8+ T淋巴细胞的杀伤活性。

ELISPOTs(EnzymeLinked ImmunoSpot assays，即酶联免疫斑点测定法)，是一种免疫学领域常用的测定法，其结合了细胞培养技术与酶联免疫吸附技术，能够在单细胞水平检测细胞因子的分泌情况。该测定法的一般性原理在于：通过抗体捕获培养中的细胞分泌的细胞因子，并以酶联斑点显色的方式呈现出来。该方法具有灵敏度高、操作简便的优点。

LDH释放实验(即乳酸脱氢酶释放实验，又名LDH释放法或LDH细胞毒性检测)的原理在于：LDH在胞浆内含量丰富，在正常情况下其不能通过细胞膜，然而，当细胞受损或死亡时可释放到细胞外，从而细胞死亡数目与细胞培养基中LDH活性成正比，用比色法测定实验孔LDH并与靶细胞对照孔进行比较，可计算效应细胞对靶细胞的细胞杀伤比。该实验方法具有操作简便快速的优点，可以应用于CTL的细胞活性测定。

疫苗

经体外的免疫原性实验(ELISPOTs)验证，本发明的多肽可以诱导抗原特异性的T细胞分泌IFN-γ细胞因子，引起免疫细胞的激活反应。此外，LDH释放实验证实激活后的CD8+T细胞可以特异性识别呈递实验多肽的靶细胞并杀伤该靶细胞。

因此，本发明的多肽可以制备为疫苗，用于肿瘤的诊断、预防及治疗。所述疫苗可以采用多肽+佐剂、多肽负载的DC疫苗、或多肽特异性DC-CTL、DC-CIK疫苗等形式。如本领域技术人员所知晓，抗肿瘤免疫包括但不限于以下免疫应答：细胞毒性T淋巴细胞的诱导；抗体的产生；抗肿瘤细胞因子的产生。当多肽在接种至受试者中诱导这些免疫应答中的任何一种时，则可以认为所述多肽具有诱导抗肿瘤免疫的效果。

用于检测细胞毒性T淋巴细胞的诱导的方法是本领域公知的。进入活体的外来物质通过抗原呈递细胞(APC)呈递给T细胞。以抗原特异性方式响应于由APC呈递的抗原的T细胞由于所述抗原的刺激而分化成细胞毒性T淋巴细胞(也称为细胞毒性T细胞或CTL)并扩增。因此，由多肽造成的CTL诱导，可以通过将所述多肽由APC呈递给T细胞并且检测对CTL的诱导来加以评估。此外，APC具有活化CD4+T细胞、CD8+T细胞的效果，可以利用这些细胞的活化作用作为指示来评估所述多肽的抗肿瘤免疫诱导作用。

此外，使用树突细胞(DC)作为APC来评价CTL诱导作用的方法是本领域公知的。在这种方法中，首先将实验多肽与DC接触，然后将该DC与T细胞接触。在与DC接触之后检测到有抗原特异性杀伤效应的T细胞，表明受试多肽具有诱导细胞毒性T淋巴细胞的活性。如本领域技术人员所知晓，可以使用LDH(乳糖脱氢酶)释放作为指示，来评估负载了肿瘤抗原的抗原呈递细胞的损害程度。此外，也可以通过测量在携带固定化肽的抗原呈递细胞的存在下由CTL产生并释放的IFN-γ来检测，所述测量通过用抗IFN-γ抗体使IFN-γ可视化来进行，诸如本申请中所采用的ELISPOTs测定法。

通过这些方法确认实验多肽具有CTL诱导活性，并因此可用作针对与TWISTNeighbor基因高表达或突变相关的疾病(例如癌症)的疫苗。此外，通过与所述多肽接触而具备CTL诱导活性的APC以及由于APC呈递多肽抗原而获得了细胞毒性的CTL也可用作与TWISTNeighbor基因高表达或突变相关的疾病(例如癌症)的疫苗。所述癌症包括但不限于乳腺癌、肺癌、鼻咽癌、肝癌、胃癌、食道癌、结直肠癌、胰腺癌、黑色素瘤、皮肤癌、前列腺癌、宫颈癌、白血病、脑肿瘤。

在本发明的一个方面，本发明的多肽可以与佐剂组合使用。合适的佐剂的实例包括但不限于氢氧化铝、弗氏佐剂、CpG、霍乱毒素、沙门氏菌毒素等，但是不限于此。另外，本发明的疫苗可以任选地与药学可接受的载体组合。所述载体的实例包括但不限于无菌水、生理盐水、磷酸盐缓冲液等。如果需要，疫苗也可以含有稳定剂、表面活性剂等。

在其他实施方案中，本发明的疫苗也可以为包含本发明的多核苷酸、核酸构建体、载体、宿主细胞、抗原呈递细胞、靶向性免疫细胞群或免疫效应细胞的形式。

如本领域技术人员所知晓，所述疫苗可以全身施用或局部施用。疫苗施用可以通过单-剂量施用或通过多-剂量施用，例如初施-加强施用的方式进行。

当使用APC或CTL作为本发明的疫苗时，可以通过例如回体的方式来治疗或预防与TWIST Neighbor基因高表达或突变相关的疾病(例如癌症)。具体而言，可以收集待接受治疗或预防的受试者的PBMC，在体外与本发明的肽接触；在诱导APC或CTL之后，将其施用于受试者。可以在施用之前扩增体外诱导的APC或CTL，从而更有效地治疗或预防所述疾病。也可以通过回体的方式将编码所述肽的载体引入PBMC来诱导APC。

抗体

本发明还涉及一种抗体，其能够特异性识别本发明的疫苗。本发明的抗体包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化和灵长类动物化抗体、CDR移植抗体、人抗体、重组产生的抗体、细胞内抗体、多特异性抗体、双特异性抗体、单价抗体、多价抗体、免疫特异性抗体片段(诸如Fd、Fab、F(ab')2、F(ab')片段)、单链片段(例如ScFv和ScFvFc)；及其衍生物。本发明的抗体可以包含所有类别的抗体(即IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)和所有亚类(即IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。

本发明的抗体可以使用本领域中已知的各种方法来产生。例如，可以在宿主动物中生成多克隆抗体；通过杂交瘤技术、重组技术、噬菌体展示技术、转基因动物等产生单克隆抗体。在一种具体实施方式中，采集经本发明的疫苗免疫接种的动物血清，并从血清中纯化目的抗体，从而制备本发明的抗体。

在生成本发明的抗体后，可以进一步对其进行改造，提供具有改善的活性的抗体。例如，可以通过分子生物学技术来对抗体进行修饰或改变，提供具有期望的治疗特性的衍生的抗体。所述衍生的抗体包括但不限于，嵌合抗体、人源化抗体等。

本发明的抗体也可缀合、连接或融合至或以其它方式缔合至其它活性成分，例如抗癌药。合适的抗癌药包括但不限于阿巴瑞克、阿柔比星、氨基嘌呤、阿地白介素、阿来组单抗、艾舒坦、六甲蜜胺、氨磷汀、氨鲁米特、阿那白滞素、阿那曲唑、阿扎胞苷、博莱霉素、硼替佐米、白消安、卡培他滨、卡铂、卡莫司汀、西妥昔单抗、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、氯法拉滨、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、达沙替尼、地西他滨、多西他赛、依西美坦、吉妥单抗、利妥昔单抗、长春新碱、长春地辛、沃雷诺司、唑来膦酸。此外，本发明的抗体可以与生物相容的修饰剂缀合，从而调整、改变、改进或调节抗体特征。例如，可以通过结合相对高分子量聚合物分子(诸如商业可得的聚乙二醇，即PEG)或类似的生物相容的聚合物而生成具有增加的体内半衰期的抗体或融合构建体。

本发明的抗体可以用于治疗和预防TWISTNB基因的高表达或TWISTNB基因的突变相关的疾病，例如癌症。所述癌症包括但不限于乳腺癌、肺癌、鼻咽癌、肝癌、胃癌、食道癌、结直肠癌、胰腺癌、黑色素瘤、皮肤癌、前列腺癌、宫颈癌、白血病、脑肿瘤。

本领域技术人员可以根据需要将抗体配制为合适的剂型，并根据所治疗的疾病、受试者的年龄、体重、施用方法等，适当地调整抗体的剂量。

药物组合物

本发明的多肽可以配制为药物组合物向受试者施用。在所述药物组合物中，除了本发明的多肽，还可以包含药学可接受的载体、赋形剂、佐剂等。示例性的佐剂包括，但不限于，磷酸铝、氢氧化铝和明矾。此外，所述药物组合物可以包含其它活性成分，例如抗癌药。合适的抗癌药包括但不限于阿巴瑞克、阿柔比星、氨基嘌呤、阿地白介素、阿来组单抗、艾舒坦、六甲蜜胺、氨磷汀、氨鲁米特、阿那白滞素、阿那曲唑、阿扎胞苷、博莱霉素、硼替佐米、白消安、卡培他滨、卡铂、卡莫司汀、西妥昔单抗、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、氯法拉滨、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、达沙替尼、地西他滨、多西他赛、依西美坦、吉妥单抗、利妥昔单抗、长春新碱、长春地辛、沃雷诺司、唑来膦酸。

此外，本发明的药物组合物也可以为包含本发明的多核苷酸、核酸构建体、载体、宿主细胞、抗原呈递细胞、靶向性免疫细胞群或免疫效应细胞的形式。本领域技术人员可以根据需要将药物组合物配制为合适的剂型，如脂质体、颗粒、粉末等。所述组合物可以通过，例如，口服、皮内、皮下、静脉内注射等方式，全身施用或向目标肿瘤局部施用。

本领域技术人员可以根据所治疗的疾病、受试者的年龄、体重、施用方法等，适当地调整本发明的药物组合物中所述多肽的剂量，因为这些剂量的选择和优化在本领域技术人员的能力范围之内。所述多肽的剂量通常为0.001mg至1000mg，优选0.01mg至100mg，更优选0.1mg至10mg，例如3mg。

所述药物组合物可以用于治疗和预防TWISTNB基因的高表达或TWISTNB基因的突变相关的疾病，例如癌症。所述癌症包括但不限于乳腺癌、肺癌、鼻咽癌、肝癌、胃癌、食道癌、结直肠癌、胰腺癌、黑色素瘤、皮肤癌、前列腺癌、宫颈癌、白血病、脑肿瘤。

试剂盒

本发明还涉及试剂盒，其在一个或多个容器中包含本发明的多肽或其衍生物、多核苷酸、核酸构建体、载体、宿主细胞、抗原呈递细胞、靶向性免疫细胞群、免疫效应细胞、疫苗、或者抗体，以及任选地，使用所述试剂盒的说明书。合适的容器包括例如小瓶、注射器等。所述容器可以由多种材料诸如玻璃或塑料形成。

在某些实施方案中，所述试剂盒还含有一种或多种另外的试剂和任选地一种或多种抗癌药。合适的抗癌药包括但不限于阿巴瑞克、阿柔比星、氨基嘌呤、阿地白介素、阿来组单抗、艾舒坦、六甲蜜胺、氨磷汀、氨鲁米特、阿那白滞素、阿那曲唑、阿扎胞苷、博莱霉素、硼替佐米、白消安、卡培他滨、卡铂、卡莫司汀、西妥昔单抗、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、氯法拉滨、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、达沙替尼、地西他滨、多西他赛、依西美坦、吉妥单抗、利妥昔单抗、长春新碱、长春地辛、沃雷诺司、唑来膦酸。

当试剂盒的组分提供于一种或多种液体溶液中时，所述液体溶液可以是非水性的或者是含水的溶液，优选无菌水溶液。试剂盒中的制剂也可以作为干燥粉末或冻干形式提供，所述干燥粉末或冻干形式可以在添加适当液体后重构。用于重构的液体可以含于分开的容器中。此类液体可以包含无菌的药学上可接受的缓冲剂或其它稀释剂，诸如注射用抑菌水、磷酸缓冲盐水、林格氏溶液或右旋糖溶液。

本发明的应用

TWISTNB基因所编码的Twist neighbor蛋白在正常体内主要发挥DNA依赖的RNA聚合酶的作用，作为RNA聚合酶I的组成部分，催化从DNA到RNA的转录反应，并且在成人正常组织中低表达。然而，突变后的TWISTNB基因能够在肿瘤组织中高水平表达。

本发明人出人意料地发现，本发明的多肽能够诱导特异性的T细胞分泌IFN-γ，引起免疫细胞的激活反应，并且通过LDH释放实验，证实CD8+T细胞可以特异性识别呈递本发明的多肽的靶细胞并杀伤所述靶细胞。

因此，本发明的多肽可以用于：产生具有细胞毒性T细胞诱导能力的抗原呈递细胞；诱导细胞毒性T淋巴细胞。

具体而言，本发明的应用至少在于以下方面。

A.疾病的诊断或检测

本发明可以用于诊断或检测与TWISTNB基因的高表达或TWISTNB基因突变相关的疾病。

在一个方面，可以通过从受试者获取血清并检测血清中本发明的多肽或其衍生物的存在，诊断受试者中与TWISTNB基因的高表达或TWISTNB基因突变相关的疾病。

在另一个方面，本发明的抗体也可以用于检测或诊断受试者中与TWISTNB基因的高表达或TWISTNB基因突变相关的疾病。任选地，所述抗体可以与诊断剂、可检测试剂、标记物或报道分子(例如生物分子、小分子化合物、荧光团或放射性同位素)缀合。

在一个实施方案中，与TWISTNB基因的高表达或TWISTNB基因突变相关的疾病为癌症，所述癌症包括乳腺癌、肺癌、鼻咽癌、肝癌、胃癌、食道癌、结直肠癌、胰腺癌、黑色素瘤、皮肤癌、前列腺癌、宫颈癌、白血病、脑肿瘤。在一个具体的实施方案中，所述癌症为肺癌，具体地为非小细胞肺癌，更具体地为非小细胞系肺腺癌。

在一个实施方案中，所述受试者为哺乳动物，优选人类、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、犬、猫、马或牛。在一个具体实施方案中，所述受试者为人类。

在一个实施方案中，所述受试者的HLA抗原为HLA-A2亚型、优选HLA-A0201亚型。

B.疾病的预防或治疗

本发明可以用于预防或治疗与TWISTNB基因的高表达或TWISTNB基因突变相关的疾病。

具体而言，本发明的多肽或其衍生物、多核苷酸、核酸构建体、载体、宿主细胞、抗原呈递细胞、靶向性免疫细胞群、免疫效应细胞、疫苗、或者抗体可以用于预防或治疗受试者中与TWISTNB基因的高表达或TWISTNB基因突变相关的疾病，也可以用于制备预防或治疗受试者中与TWISTNB基因的高表达或TWISTNB基因突变相关的疾病的药物。在优选的实施方案中，所述与TWISTNB基因的高表达或TWISTNB基因突变相关的疾病为癌症。具体地，所述癌症包括乳腺癌、肺癌、鼻咽癌、肝癌、胃癌、食道癌、结直肠癌、胰腺癌、黑色素瘤、皮肤癌、前列腺癌、宫颈癌、白血病、脑肿瘤。优选地，所述癌症为宫颈癌、结直肠癌、结直肠癌、胰腺癌、胃癌。

所述受试者为哺乳动物，优选人类、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、犬、猫、马或牛。在一个具体实施方案中，所述受试者为人类。

所述受试者的HLA抗原为HLA-A2亚型、优选HLA-A0201亚型。

本领域技术人员可以根据需要将药物配制为合适的剂型，如脂质体、颗粒、粉末等。所述组合物可以通过，例如，口服、皮内、皮下、静脉内注射等方式，全身施用或向目标肿瘤局部施用。

本领域技术人员可以根据所预防或治疗的疾病、受试者的年龄、体重、施用方法等，适当地调整本发明的药物中所述多肽或其衍生物、多核苷酸、核酸构建体、载体、宿主细胞、抗原呈递细胞、靶向性免疫细胞群、免疫效应细胞、疫苗、或者抗体的剂量，因为这些剂量的选择和优化在本领域技术人员的能力范围之内。

在以下实施例中，将描述本发明的多个方面，这些实施例仅是出于示例性的目的，而不以任何方式限制本发明的范围。

实施例

实施例1.多肽的合成与纯化

依照标准固相合成方法合成本发明的多肽，并通过反相HPLC进行纯化。多肽的纯度(>90％)和身份分别通过HPLC和质谱测定。

实施例2.多肽与HLA-A0201的亲和力预测

根据选定的HLA等位基因分型(在本发明的具体实施方案中，为HLA-A0201)，利用自主开发的“基于肿瘤DNA和RNA测序的突变多肽结合能力预测软件”(软件著作权号：2016SR002835)，对多肽进行亲和力预测。预测结果用IC50分值表示，IC50分值越低，表明多肽与HLA等位基因分型的亲和力越高。具体而言，IC50小于500表示该多肽与HLA-A0201具有亲和力，IC50小于50表示该多肽与HLA-A0201具有高亲和力。

对突变多肽(SEQ ID NO:2-5)以及野生型多肽(SEQ ID NO:6)进行亲和力预测，筛选IC50得分小于500、并且小于野生型多肽的突变多肽进行下一步的T2亲和力验证。

突变多肽(SEQ ID NO:2-5)以及野生型多肽与HLA-A0201的亲和力预测得分如表1所示。

表1

由此可以看出，预测本发明的SEQ ID NO:2-5所示的突变多肽与HLA-A0201具有高亲和力，并且其与HLA-A0201的亲和力均高于野生型多肽序列与HLA-A0201的亲和力。因此，选择本发明的多肽(SEQ ID NO:2-5)进一步验证其与HLA-A0201的亲和力。

实施例3.多肽与HLA-A0201的亲和力的验证

取2*105个T2细胞(购买自美国ATCC公司，货号：CRL-1992^TM)，用500ul含有人类β2微球蛋白(最终浓度，3ug/ml)的IMDM无血清培养基(货号：12440-053，GIBCO)重悬至24孔板中，加入本发明的SEQ ID NO:2-5所示的多肽以及野生型多肽(最终浓度分别为100μM)，在培养箱(37℃,5％CO₂)，培养过夜。每个组2个复孔。没有加入多肽的T2细胞被用作背景对照，加入CMV(NLVPMVATV)多肽的T2细胞用作阳性对照。将200g细胞离心5分钟，收集细胞。收集的细胞用PBS(货号：10010-031，GIBCO)洗涤两次后，将细胞直接用抗HLA-A 0201的FITC单克隆抗体孵育，4℃维持30分钟。然后用流式细胞仪(BDFACSJazz^TM)及其软件检测并分析其平均荧光强度(MFI)，如图1所示。

荧光指数(FI)用下列公式计算：

FI＝[平均荧光强度(MFI)样品–MFI_背景]/MFI_背景，其中MFI_背景代表不含多肽的值。

FI>1.5表明该多肽具有对于HLA-A 0201分子的高亲和力，1.0<FI<1.5表明该多肽对HLA-A 0201分子具有中等亲和力，而0.5<FI<1.0表明该多肽对于HLA-A 0201分子具有低亲和力。

通过流式细胞术测定的本发明的多肽与T2细胞的亲和力结果如示于表2中。

表2：多肽与HLA-A0201亲和力的检测结果

样本	加入多肽浓度	MFI	FI
				KLMGIVNKV(野生型)	100μM	647.8	1.89
KLMGIVYKV(SEQ ID NO:2)	100μM	665.7	1.97
				KMMGIVYKV(SEQ ID NO:3)	100μM	681.6	2.04
KLMGIVYKL(SEQ ID NO:4)	100μM	723.6	2.23
				KMMGIVYKL(SEQ ID NO:5)	100μM	692.3	2.09
空白	100μM	223.7	0
				CMV	100μM	681.6	2.04

对于本发明的多肽(SEQ ID NO:2-5)而言，FI均大于1.5，进一步证明：本发明的多肽与HLA-A0201具有高亲和力。

实施例4.多肽体外刺激CD8+T细胞扩增

使用源自单核细胞的树突细胞(DC)作为抗原呈递细胞(APC)来诱导针对HLA上呈现的肽的CTL应答。取HLA-A0201亚型阳性的健康志愿者的外周血100ml，采用Ficoll淋巴细胞分离液(货号：17-1440-02，GE healthcare公司)，分离2×10⁸个PBMC细胞外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，用贴壁培养法(3h)获取单核细胞，并用CD8磁珠筛选PBMC细胞中的CD8+T细胞。采用GM-CSF(1000U/ml)、IL-4(1000U/ml)诱导贴壁单核细胞为未成熟DC，再用IFN-γ(100U/ml)、LPS(10ng/ml)以及本发明SEQ ID NO:2-5所示的多肽诱导贴壁细胞为成熟DC细胞。将负载了多肽的成熟DC细胞辐照(剂量25Gy)，并与志愿者的CD8+ T细胞共培养(DC密度为5x10⁵个细胞/ml，CD8+T细胞密度为2x10⁶个细胞/ml，将两者等体积混匀并加入孔板中，即共培养)，并加入IL-21,3天后，补加IL-2和IL-7，此后于第5天、第7天分别补加一次IL-2和IL-7，于第10天取共培养的细胞(共培养的CD8+T细胞激活为多肽特异性CD8+T细胞)进行计数。计数结果如表3所示：

表3：培养后细胞计数结果

以上结果表明，本发明的多肽显著地刺激了CD8+T细胞的扩增。培养10天后，细胞有明显增殖，总的细胞数目扩增倍数在5-7倍之间。

实施例5.酶联免疫斑点测定(ELISPOTs)方法验证多肽激活CD8+T细胞免疫反应

ELISPOTs检测方法原理：CD8+T细胞能够特异性识别HLA-A0201与多肽的复合物，多肽序列的不同，识别多肽与HLA-A0201的复合物的T细胞的群体也不同。由于T2细胞表达HLA-A0201，因此，CD8+T细胞能够特异性识别负载了突变多肽的T2细胞，而不能识别负载野生型多肽的T2细胞。在特异识别HLA-A0201和多肽的复合物之后，多肽特异性CD8+ T细胞能够再次激活并分泌IFN-γ。而CD8+T细胞被激活所分泌的IFN-γ被生物素标记的二抗所捕获。然后再与碱性磷酸酶或过氧化物辣根氧化酶标记的链霉亲和素结合。通过底物显色作用形成斑点。斑点的数目代表了被激活分泌IFN-γ的细胞的数目。

取实施例4共培养的细胞分别与负载了突变多肽或野生型多肽的T2细胞，分别加入到人IFN-γELISPOTs板中培养与检测。最终对ELISPOT实验产生的斑点进行计数。实验多肽具有免疫原性的要求如下：斑点数(实验多肽)/斑点数(野生型多肽)>2，即实验多肽引起的斑点数超过野生型多肽斑点数目的两倍以上。

实验例4中共培养后的细胞分别与负载了突变多肽KLMGIVYKV及其可变形式多肽(SEQ ID NO:2-5)和野生型多肽KLMGIVNKV的T2细胞加入到ELISPOTs板中进行培养，20小时后进行ELISPOTs检测(Mabtech,货号3420-4APW-2)。

ELISPOTs的结果如图2和表4所示。

表4：多肽刺激特异性CD8+T细胞分泌IFN-γ干扰素

突变多肽引起的斑点数远高于野生型多肽引起的斑点数的2倍以上，表明突变多肽具有强免疫原性。

实施例6.LDH释放实验证明CD8+T细胞多肽特异性杀伤活性

参照Thermo公司的Pierce^TM LDH Cytotoxicity Assay Kit(货号：88953)说明书，进行以下实验，取实施例4中共培养后的细胞与负载了突变多肽或野生型多肽或未负载多肽的T2细胞进行共培养，实验中设置最大释放孔、体积校正孔、培养基对照孔、自发释放孔、不同效靶比(T细胞与T2细胞的数目比)等对照，每组设置3个复孔，4h后，取出共培养的细胞上清50ul，并加入到50ul LDH底物混合液中，使细胞上清催化LDH底物反应，30分钟后，加入50ul反应终止液，读取490nm波长和680nm参考波长，并根据对照孔，计算靶细胞杀伤T2细胞的杀伤活性。

杀伤活性计算公式为：

杀伤效率(％)＝(实验孔-效应细胞自发释放-靶细胞自发释放+培养基孔)/(靶细胞最大释放-体积校正孔-靶细胞自发释放+培养基孔)×100％

杀伤效率的结果如图3和表5所示。

表5：T细胞特异性识别并杀伤呈递实验多肽的靶细胞

以上结果表明，在效靶比为1:1或1:10时，突变多肽激活的T细胞，能够杀伤呈递了突变多肽的T2细胞，而不能杀伤呈递野生型多肽的T2细胞，这进一步验证突变多肽能够特异性杀伤呈递突变多肽的靶细胞。尤其是当效靶比为1:10时，T细胞对负载了突变多肽的T2细胞的杀伤效率显著高于其针对负载了野生型多肽的T2细胞的杀伤效率，也显著高于其针对未负载多肽的T2细胞的杀伤效率。由此可见，CD8+T细胞能够以高特异性杀伤负载本发明的突变多肽的靶细胞。

实施例7.构建并包装野生型多肽或突变多肽的重组慢病毒

通过DNA自动合成仪，用固相亚磷酸酰胺法合成，按照已知序列将核苷酸一个一个连接上去成为核苷酸序列，合成野生型KLMGIVNKV多肽对应的DNA序列“AAGCTTATGGGTATAGTTAATAAAGTG”(SEQ ID NO:7)、突变多肽KLMGIVYKV(SEQ ID NO:2)对应的多核苷酸序列“AAGCTTATGGGTATAGTTTATAAAGTG”(SEQ ID NO:8)、突变多肽KMMGIVYKV(SEQ ID NO:3)对应的多核苷酸序列“AAGATGATGGGTATAGTTTATAAAGTG”(SEQ ID NO:9)、突变多肽KLMGIVYKL(SEQ ID NO:4)对应的多核苷酸序列“AAGCTTATGGGTATAGTTTATAAACTG”(SEQ ID NO:10)以及突变多肽KMMGIVYKL(SEQ ID NO:5)对应的多核苷酸序列“AAGATGATGGGTATAGTTTATAAACTG”(SEQ ID NO:11)。分别构建包含野生型多肽以及突变多肽的慢病毒载体质粒pHBLV-Puro，并分别命名为pHBLV-Puro-KLMGIVNKV、pHBLV-Puro-KLMGIVYKV、pHBLV-Puro-KMMGIVYKV、pHBLV-Puro-KLMGIVYKL、pHBLV-Puro-KMMGIVYKL。之后，分别将这5个慢病毒质粒与pSPAX2和pMD2G辅助质粒共同转染T293细胞，并包装出包含野生型多肽或突变多肽的慢病毒。

实施例8.H2087-KLMGIVYKV的皮下移植瘤模型的建立

8.1表达KLMGIVYKV多肽的人源肺癌细胞系的建立

人非小细胞系肺腺癌细胞系NCI-H2087购买于ATCC,其HLA亚型为HLA-A0201阳性(Rao M,et al.Inhibition of histone lysine methylation enhances cancer-testisantigen expression in lung cancer cells:implications for adoptiveimmunotherapy of cancer.Cancer research.2011；71:4192-204)。细胞培养于含10％胎牛血清、100U/mL青霉素和链霉素的DMEM培养基中。37℃,5％CO₂的孵箱中培养。将包装好的KLMGIVYKV慢病毒转染H2087细胞系，并采用Puromycin抗生素，持续筛选存活的H2087细胞系，最终建立表达KLMGIVYKV多肽的H2087细胞系，命名为H2087-KLMGIVYKV细胞系。

8.2NOD SCID小鼠的人免疫重建

采集健康志愿者抗凝外周血300～600ml。Ficoll分离外周血单个核细胞(PBMC)，收集细胞待用。选取300只排除免疫渗漏的NOD SCID小鼠，每只腹腔注射PBMC 2×10⁷/0.5ml，对NOD SCID小鼠进行人免疫重建。选取4周后的小鼠准备接种以上8.1中建立的人源肺癌细胞系。

8.3人非小细胞系肺腺癌肿瘤模型的构建

将已建系的人非小细胞系肺腺癌细胞系H2087-KLMGIVYKV细胞于含有10％胎牛血清、100U/mL青霉素和链霉素的DMEM培养基中，在37℃、5％CO₂的孵箱中培养。收集H2087-KLMGIVYKV肿瘤细胞(新鲜培养基培养过夜)，1500rpm离心5分钟，用无菌生理盐水洗涤肿瘤细胞3次。适当稀释后，取40μl细胞悬液加入10μl 0.4％台酚蓝染色并镜检计数，制成浓度为1×10⁸个细胞/ml的肿瘤细胞悬液，选取NOD/SCID小鼠或免疫重建后的NOD/SCID小鼠，每只小鼠皮下接种肿瘤细胞悬液100ul。接种完成后，逐日观察接种部位有无感染，肿瘤生长后有无自然消退，用游标卡尺，每2-3天测量肿瘤长径a和短径b,并计算肿瘤的大小＝a*b*b/2。7天后，小鼠皮下瘤可摸到约米粒大小的肿瘤，此时对H2087-KLMGIVYKV皮下瘤模型的NOD/SCID小鼠进行DC-CTL疫苗的治疗。对免疫重建4周的H2087-KLMGIVYKV皮下瘤模型NOD/SCID小鼠分别进行多肽+完全弗氏佐剂、或多肽+DC疫苗、或慢病毒感染的DC细胞疫苗，并每2天记录肿瘤的体积和小鼠的生存率。

实施例9.多肽疫苗治疗方案

将荷瘤小鼠随机分为6组:佐剂组、佐剂+野生型多肽组、佐剂+KLMGIVYKV(SEQ IDNO:2)多肽组、佐剂+KMMGIVYKV(SEQ ID NO:3)多肽组、佐剂+KLMGIVYKL(SEQ ID NO:4)多肽组、以及佐剂+KMMGIVYKL(SEQ ID NO:5)多肽组，每组各6只。首次多肽免疫剂量为100ug/只小鼠，多肽用PBS重悬后与150ul/只小鼠弗氏完全佐剂混匀，用PBS调整至300ul/只小鼠，于背部皮下双点注射。2周后相同剂量进行加强免疫(第1次使用完全弗氏佐剂，以后均用不完全弗氏佐剂)共免疫4次。每天观察荷瘤鼠的一般性特征，包括精神状态、活动力、反应、饮食、体重及肿瘤的生长情况等。每2天用游标卡尺测量肿瘤最长径(a)和最短径(b)。肿瘤体积计算为:1/2×长×宽²。结果见图4。

结果显示，相对于单纯佐剂组和野生型多肽组，突变多肽(分别地SEQ ID NO:2-5)+弗氏佐剂均可以有效地抑制肿瘤的生长，并延长小鼠的生存期。

生存期计算公式：

一定时间内生存率＝该时间内存活小鼠/(该时间内存活小鼠+该时间内死亡小鼠)*100％。

实施例10.DC多肽疫苗治疗方案

10.1DC多肽疫苗的制备

采集健康志愿者抗凝外周血100～150ml。Ficoll分离外周血单个核细胞(PBMC)，收集PBMC细胞，按2～3×10⁶/ml重悬于RPMI 1640培养基中，37℃孵育2h，贴壁细胞即为DC。吸取未贴壁细胞即是外周血淋巴细胞(peripheral blood lymphocyte,PBL)，备用。采用1000U/ml GM-CSF，1000U/ml IL-4，100U/ml，IFN-gamma，10ng/mlLPS，诱导贴壁细胞为成熟DC细胞。收获成熟DC后，加入突变多肽(SEQ ID NO:2-5，终浓度10μg/ml)，共育4h后用生理盐水洗涤3次。用生理盐水将负载多肽后的DC调整为(4.0±0.5)×10⁷个细胞/ml，用于后续实验。

10.2多肽负载的DC疫苗对小鼠生存期和肿瘤生长的影响

将荷瘤小鼠随机分为5组:DC-负载野生型多肽组、DC-负载KLMGIVYKV(SEQ ID NO:2)多肽组、DC-负载KMMGIVYKV(SEQ ID NO:3)多肽组、DC-负载KLMGIVYKL(SEQ ID NO:4)多肽组、以及DC-负载KMMGIVYKL(SEQ ID NO:5)多肽组，每组各6只。制备DC-负载KLMGIVYKV(SEQ ID NO:2)多肽、DC-负载KMMGIVYKV(SEQ ID NO:3)多肽、DC-负载KLMGIVYKL(SEQ IDNO:4)多肽、以及DC-负载KMMGIVYKL(SEQ ID NO:5)多肽的细胞悬液(4×10⁷细胞/ml)。对荷瘤小鼠近腹股沟大腿内侧进行皮内注射，每侧注射0.1ml，每周注射1次。剂量为(4.0±0.5)×10⁶细胞/次，共注射2次。注射结束后观察小鼠生命体征，每2天用游标卡尺测量肿瘤纵横大小(Klebanoff CA,Finkelstein SE,Surman DR,Lichtman MK,Gattinoni L,TheoretMR,et al.IL-15enhances the in vivo antitumor activity of tumor-reactive CD8+T cells.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United Statesof America.2004；101:1969-74)。肿瘤体积计算为:肿瘤体积＝1/2x长x宽²。同时，记录小鼠体重变化情况和小鼠生存情况。结果示于图5。

结果表明，相对于野生型多肽(SEQ ID NO:6)负载的DC疫苗组，突变多肽(SEQIDNO:2-5)负载的DC疫苗组可以明显地延长小鼠的生存期，以及减缓小鼠肿瘤的生长。

实施例11.核酸转染的DC疫苗治疗方案

11.1核酸转染的DC疫苗的制备

采集健康志愿者抗凝外周血100～150ml。Ficoll分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear，PBMC)，收集PBMC细胞，37℃孵育2h，洗去未贴壁细胞，经重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)、重组人白介-4(rhIL-4)培养DC细胞。培养至第五天，更换半量的DC培养基及调整细胞密度为1×10⁶个/ml；加入表达野生型多肽及突变多肽(SEQ ID NO:2-5)的慢病毒培养液(每1ml DC培养基中加入50ul慢病毒培养液)。24h后去除病毒培养液，加入含有50ng/mlrhIL-4、100ng/ml rh GM-CSF、100U/ml的IFN-和10ng/ml LPS的培养液，置于37℃5％CO₂培养箱中培养。48-72h后荧光显微镜下观察慢病感染DC细胞，收集成熟DC细胞，用于小鼠肿瘤模型的治疗。

11.2核酸转染的DC疫苗治疗方案

将荷瘤小鼠随机分为5组:野生型多肽-DC组、突变多肽(分别地SEQ ID NO:2-5)-DC组，每组各6只。制备DC-负载野生型多肽、DC-负载突变多肽的细胞悬液(4×10⁷细胞/ml)。对荷瘤小鼠近腹股沟大腿内侧进行皮内注射，每侧注射0.1ml，每周注射1次。剂量为(4.0±0.5)×10⁶细胞/次，共注射2次。注射结束后观察小鼠生命体征，每2天用游标卡尺测量肿瘤纵横大小(Klebanoff CA,Finkelstein SE,Surman DR,Lichtman MK,Gattinoni L,Theoret MR,et al.IL-15enhances the in vivo antitumor activity of tumor-reactive CD8+ T cells.Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnited States of America.2004；101:1969-74)。肿瘤体积计算为:肿瘤体积＝1/2x长x宽²。同时，记录小鼠体重变化情况和小鼠生存情况。结果如图6。

结果显示，相对于野生型多肽的慢病毒，突变多肽的慢病毒感染的DC疫苗具有明显的肿瘤抑制效果，并且延长小鼠的生存期，而野生型多肽对该肿瘤没有作用。

实施例12.体内DC-CTL治疗方案

12.1多肽特异性CTL疫苗的制备

实施例10.2中收集的PBL经过磁珠分选获得CD8⁺T与负载野生型多肽的DC、负载突变多肽的DC共育致敏，细胞比例为DC:CD8⁺T＝1:4。培养液中加入500IU/ml IL-2和50ng/mlIL-7，37℃5％CO₂培养箱共同孵育，培养1周后进行细胞计数；第2周再用负载突变多肽的DC、负载野生型多肽的DC进行第二轮刺激。共刺激三轮，培养期间适当添加培养液。于培养第0、7、14和21天分别计数淋巴细胞数量，计算细胞增殖指数(proliferation index，PI)。PI＝扩增后细胞数/接种细胞数。培养至21天后收获细胞，即细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。将细胞用生理盐水重悬(5×10⁸细胞/ml)，体积为0.2ml，经尾静脉回输，每只肿瘤模型小鼠回输细胞数约为1×10⁸个细胞。注射结束后留心观察小鼠生命体征，每2天用游标卡尺测量肿瘤纵横大小(McCormack E,Adams KJ,Hassan NJ,Kotian A,Lissin NM,Sami M,et al.Bi-specific TCR-anti CD3redirected T-cell targeting of NY-ESO-1-and LAGE-1-positive tumors.Cancer immunology,immunotherapy:CII.2013；62:773-85)。结果如图7所示。

结果表明，相对于野生型多肽组，突变多肽(SEQ ID NO:2-5)激活的DC-CTL疫苗具有显著的抑制肿瘤生长的效果，并且延长了小鼠的生存期。

以上结果表明，本发明的多肽具有强免疫原性，能够以高亲和力结合HLA-A0201抗原，并具有CTL诱导能力，刺激了CD8+T细胞的扩增，并使得CD8+T细胞特异性杀伤负载本发明的多肽的靶细胞，减缓了肿瘤生长，并延长了受试者的生存期。因此，本发明的多肽能够用于预防或治疗TWISTNB基因高水平表达或TWISTNB基因突变的疾病。

尽管已经详细地并且参考本发明的具体实施方案描述了本发明，但本领域技术人员会理解，以上说明仅是示例性和解释性的，不意于任何方式限制本发明的范围。本领域技术人员可以容易地对本发明进行各种变化和调整，而不背离本发明的精神和范围。因此，本发明并不意于受到上述说明的限定，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

序列表

<110> 深圳华大基因研究院

<120> 一种新的肿瘤特异性多肽及其应用

<130> IDC180276

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 338

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> Twist neighbor 蛋白

Met Ala Ala Gly Cys Ser Glu Ala Pro Arg Pro Ala Ala Ala Ser Asp

1 5 10 15

Gly Ser Leu Val Gly Gln Ala Gly Val Leu Pro Cys Leu Glu Leu Pro

20 25 30

Thr Tyr Ala Ala Ala Cys Ala Leu Val Asn Ser Arg Tyr Ser Cys Leu

35 40 45

Val Ala Gly Pro His Gln Arg His Ile Ala Leu Ser Pro Arg Tyr Leu

50 55 60

Asn Arg Lys Arg Thr Gly Ile Arg Glu Gln Leu Asp Ala Glu Leu Leu

65 70 75 80

Arg Tyr Ser Glu Ser Leu Leu Gly Val Pro Ile Ala Tyr Asp Asn Ile

85 90 95

Lys Val Val Gly Glu Leu Gly Asp Ile Tyr Asp Asp Gln Gly His Ile

100 105 110

His Leu Asn Ile Glu Ala Asp Phe Val Ile Phe Cys Pro Glu Pro Gly

115 120 125

Gln Lys Leu Met Gly Ile Val Asn Lys Val Ser Ser Ser His Ile Gly

130 135 140

Cys Leu Val His Gly Cys Phe Asn Ala Ser Ile Pro Lys Pro Glu Gln

145 150 155 160

Leu Ser Ala Glu Gln Trp Gln Thr Met Glu Ile Asn Met Gly Asp Glu

165 170 175

Leu Glu Phe Glu Val Phe Arg Leu Asp Ser Asp Ala Ala Gly Val Phe

180 185 190

Cys Ile Arg Gly Lys Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gln Phe Lys Arg Ser

195 200 205

Glu Val Ser Glu Glu Val Thr Glu Asn Gly Thr Glu Glu Ala Ala Lys

210 215 220

Lys Pro Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Asp Pro Glu Thr Tyr Glu Val

225 230 235 240

Asp Ser Gly Thr Thr Lys Leu Ala Asp Asp Ala Asp Asp Thr Pro Met

245 250 255

Glu Glu Ser Ala Leu Gln Asn Thr Asn Asn Ala Asn Gly Ile Trp Glu

260 265 270

Glu Glu Pro Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys His Gln Glu Val Gln

275 280 285

Asp Gln Asp Pro Val Phe Gln Gly Ser Asp Ser Ser Gly Tyr Gln Ser

290 295 300

Asp His Lys Lys Lys Lys Lys Lys Arg Lys His Ser Glu Glu Ala Glu

305 310 315 320

Phe Thr Pro Pro Leu Lys Cys Ser Pro Lys Arg Lys Gly Lys Ser Asn

325 330 335

Phe Leu

<210> 2

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Lys Leu Met Gly Ile Val Tyr Lys Val

1 5

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Lys Met Met Gly Ile Val Tyr Lys Val

1 5

<210> 4

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Lys Leu Met Gly Ile Val Tyr Lys Leu

1 5

<210> 5

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Lys Met Met Gly Ile Val Tyr Lys Leu

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Lys Leu Met Gly Ile Val Asn Lys Val

1 5

<210> 7

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

aagcttatgg gtatagttaa taaagtg 27

<210> 8

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

aagcttatgg gtatagttta taaagtg 27

<210> 9

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

aagatgatgg gtatagttta taaagtg 27

<210> 10

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

aagcttatgg gtatagttta taaactg 27

<210> 11

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

aagatgatgg gtatagttta taaactg 27

Claims (63)

1.一种多肽，其由以下氨基酸序列组成：

- KLMGIVYKV(SEQ ID NO:2)；或

- KMMGIVYKV(SEQ ID NO:3)；或

- KLMGIVYKL(SEQ ID NO:4)；或

- KMMGIVYKL(SEQ ID NO:5)。

2.一种多核苷酸，其编码权利要求1所述的多肽。

3.一种核酸构建体，其包含权利要求2所述的多核苷酸，以及与之可操作地连接、指导所述多肽在宿主细胞中表达的一个或多个调控序列。

4.一种载体，其包含权利要求2所述的多核苷酸。

5.一种宿主细胞，其中转化或转染了如权利要求3所述的核酸构建体或如权利要求4所述的载体。

6.一种缀合物，其包含权利要求1所述的多肽、或者权利要求2所述的多核苷酸、或者权利要求3所述的核酸构建体。

7.一种药物组合物，其包含权利要求1所述的多肽、或者权利要求2所述的多核苷酸、或者权利要求3所述的核酸构建体、或者权利要求4所述的载体、或者权利要求5所述的宿主细胞；任选地包含佐剂和/或药学上可接受的载体。

8. 一种产生抗原呈递细胞的体外方法，所述方法包括下述步骤：

(a)使抗原呈递细胞与权利要求1所述的多肽接触，或

(b)将权利要求2所述的多核苷酸、或者权利要求3所述的核酸构建体、或者权利要求4所述的载体导入抗原呈递细胞。

9.一种抗原呈递细胞，其在细胞表面呈递如权利要求1所述的多肽。

10.根据权利要求9所述的抗原呈递细胞，其是通过权利要求8的方法产生的。

11.一种靶向性免疫细胞群，其是通过将权利要求9或10所述的抗原呈递细胞与淋巴细胞进行共培养获得的或通过将权利要求9或10所述的抗原呈递细胞与淋巴细胞进行共培养获得。

12.一种产生免疫效应细胞的体外方法，其包括：将如权利要求1所述的多肽与免疫细胞接触的步骤。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述免疫细胞为T淋巴细胞。

14. 根据权利要求13所述的方法，其中所述T淋巴细胞为CD8+ T淋巴细胞。

15.根据权利要求12-14中任一项所述的方法，其特征为：所述的免疫细胞通过抗原呈递细胞与权利要求1所述的多肽接触。

16.一种免疫效应细胞，其通过权利要求12-15中任一项所述的方法产生。

17.一种疫苗或药物组合物，其特征在于：包含权利要求1所述的多肽、或者权利要求2所述的多核苷酸、或者权利要求3所述的核酸构建体、或者权利要求4所述的载体、或者权利要求5所述的宿主细胞、或者权利要求9-10任一项所述的抗原呈递细胞、或者权利要求11所述的靶向性免疫细胞群、或者权利要求16所述的免疫效应细胞。

18.根据权利要求17所述的疫苗，其还包含佐剂。

19.根据权利要求17-18任一项所述的疫苗，其被配制成向HLA抗原为HLA-A2亚型的受试者施用。

20.根据权利要求17-18任一项所述的疫苗，其被配制成向HLA抗原为HLA-A0201亚型的受试者施用。

21.一种抗体，其特征在于，所述抗体特异性识别权利要求17-18任一项所述的疫苗。

22. 一种制备抗体的方法，其特征在于，包括：

采集经权利要求17-18任一项所述的疫苗免疫接种的动物血清；以及

从所述血清中纯化出目的抗体。

23.权利要求1所述的多肽、或者权利要求2所述的多核苷酸、或者权利要求3所述的核酸构建体、或者权利要求4所述的载体、或者权利要求5所述的宿主细胞、或者权利要求9-10任一项所述的抗原呈递细胞、或者权利要求11所述的靶向性免疫细胞群、或者权利要求16所述的免疫效应细胞、或者权利要求17-18任一项所述的疫苗、或者权利要求21所述的抗体，其用于预防或治疗受试者中与TWISTNB基因的高表达或TWISTNB基因突变相关的疾病。

24.根据权利要求23所述的多肽、多核苷酸、核酸构建体、载体、宿主细胞、抗原呈递细胞、靶向性免疫细胞群、免疫效应细胞、疫苗、或者抗体，其中所述疾病为癌症。

25.根据权利要求24所述的多肽、多核苷酸、核酸构建体、载体、宿主细胞、抗原呈递细胞、靶向性免疫细胞群、免疫效应细胞、疫苗、或者抗体，其中所述癌症为乳腺癌、肺癌、鼻咽癌、肝癌、胃癌、食道癌、结直肠癌、胰腺癌、皮肤癌、前列腺癌、宫颈癌、白血病或脑肿瘤。

26.根据权利要求24所述的多肽、多核苷酸、核酸构建体、载体、宿主细胞、抗原呈递细胞、靶向性免疫细胞群、免疫效应细胞、疫苗、或者抗体，其中所述癌症为黑色素瘤。

27.根据权利要求23-26任一项所述的多肽、多核苷酸、核酸构建体、载体、宿主细胞、抗原呈递细胞、靶向性免疫细胞群、免疫效应细胞、疫苗、或者抗体，其中所述受试者为哺乳动物。

28.根据权利要求23-26任一项所述的多肽、多核苷酸、核酸构建体、载体、宿主细胞、抗原呈递细胞、靶向性免疫细胞群、免疫效应细胞、疫苗、或者抗体，其中所述受试者为人类。

29.根据权利要求23-26任一项所述的多肽、多核苷酸、核酸构建体、载体、宿主细胞、抗原呈递细胞、靶向性免疫细胞群、免疫效应细胞、疫苗、或者抗体，其中所述受试者的HLA抗原为HLA-A2亚型。

30.根据权利要求23-26任一项所述的多肽、多核苷酸、核酸构建体、载体、宿主细胞、抗原呈递细胞、靶向性免疫细胞群、免疫效应细胞、疫苗、或者抗体，其中所述受试者的HLA抗原为HLA-A0201亚型。

31.权利要求1所述的多肽、或者权利要求2所述的多核苷酸、或者权利要求3所述的核酸构建体、或者权利要求4所述的载体、或者权利要求5所述的宿主细胞、或者权利要求9-10任一项所述的抗原呈递细胞、或者权利要求11所述的靶向性免疫细胞群、或者权利要求16所述的免疫效应细胞、或者权利要求17-18任一项所述的疫苗、或者权利要求21所述的抗体在制备用于预防或治疗受试者中与TWISTNB基因的高表达或TWISTNB基因突变相关的疾病的药物中的用途。

32.根据权利要求31所述的用途，其中所述疾病为癌症。

33.根据权利要求32所述的用途，其中所述癌症为乳腺癌、肺癌、鼻咽癌、肝癌、胃癌、食道癌、结直肠癌、胰腺癌、皮肤癌、前列腺癌、宫颈癌、白血病或脑肿瘤。

34.根据权利要求32所述的用途，其中所述癌症为黑色素瘤。

35.根据权利要求31-34任一项所述的用途，其中所述受试者为哺乳动物。

36.根据权利要求31-34任一项所述的用途，其中所述受试者为人类。

37.根据权利要求35所述的用途，其中所述受试者的HLA抗原为HLA-A2亚型。

38.根据权利要求35所述的用途，其中所述受试者的HLA抗原为HLA-A0201亚型。

39.权利要求1所述的多肽、或者权利要求2所述的多核苷酸、或者权利要求3所述的核酸构建体、或者权利要求4所述的载体、或者权利要求5所述的宿主细胞、或者权利要求9-10任一项所述的抗原呈递细胞、或者权利要求11所述的靶向性免疫细胞群、或者权利要求16所述的免疫效应细胞在制备用于预防或治疗受试者中与TWISTNB基因的高表达或TWISTNB基因突变相关的疾病的疫苗中的用途。

40.根据权利要求39所述的用途，其中所述疾病为癌症。

41.根据权利要求40所述的用途，其中所述癌症为乳腺癌、肺癌、鼻咽癌、肝癌、胃癌、食道癌、结直肠癌、胰腺癌、皮肤癌、前列腺癌、宫颈癌、白血病或脑肿瘤。

42.根据权利要求40所述的用途，其中所述癌症为黑色素瘤。

43.根据权利要求39-42任一项所述的用途，其中所述受试者为哺乳动物。

44.根据权利要求39-42任一项所述的用途，其中所述受试者为人类。

45.根据权利要求39-42任一项所述的用途，其中所述受试者的HLA抗原为HLA-A2亚型。

46.根据权利要求39-42任一项所述的用途，其中所述受试者的HLA抗原为HLA-A0201亚型。

47. 检测血清中权利要求1的多肽的存在的试剂在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于诊断受试者中与TWISTNB基因的高表达或TWISTNB基因突变相关的疾病的体外方法，所述体外方法包括以下步骤：

从受试者获取血清；和

检测血清中权利要求1的多肽的存在。

48.权利要求47所述的用途，其中所述检测通过质谱进行。

49.根据权利要求47或48所述的用途，其中所述疾病为癌症。

50.根据权利要求49所述的用途，其中所述癌症为乳腺癌、肺癌、鼻咽癌、肝癌、胃癌、食道癌、结直肠癌、胰腺癌、皮肤癌、前列腺癌、宫颈癌、白血病或脑肿瘤。

51.根据权利要求49所述的用途，其中所述癌症为黑色素瘤。

52.根据权利要求47或48所述的用途，其中所述受试者为哺乳动物。

53.根据权利要求47或48所述的用途，其中所述受试者为人类。

54.根据权利要求47或48所述的用途，其中所述受试者的HLA抗原为HLA-A2亚型。

55.根据权利要求47或48所述的用途，其中所述受试者的HLA抗原为HLA-A0201亚型。

56.权利要求1的多肽、或者权利要求2所述的多核苷酸、或者权利要求3所述的核酸构建体、或者权利要求4所述的载体、或者权利要求5所述的宿主细胞、或者权利要求9-10任一项所述的抗原呈递细胞、或者权利要求11所述的靶向性免疫细胞群、或者权利要求16所述的免疫效应细胞、或者权利要求17-18任一项所述的疫苗、或者权利要求21所述的抗体在制备用于诊断受试者中与TWISTNB基因的高表达或TWISTNB基因突变相关的疾病的诊断试剂中的用途。

57.根据权利要求56所述的用途，其中所述疾病为癌症。

58.根据权利要求57所述的用途，其中所述癌症为乳腺癌、肺癌、鼻咽癌、肝癌、胃癌、食道癌、结直肠癌、胰腺癌、皮肤癌、前列腺癌、宫颈癌、白血病或脑肿瘤。

59.根据权利要求57所述的用途，其中所述癌症为黑色素瘤。

60.根据权利要求56-59任一项所述的用途，其中所述受试者为哺乳动物。

61.根据权利要求56-59任一项所述的用途，其中所述受试者为人类。

62.根据权利要求56-59任一项所述的用途，其中所述受试者的HLA抗原为HLA-A2亚型。

63.根据权利要求56-59任一项所述的用途，其中所述受试者的HLA抗原HLA-A0201亚型。

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