CN101503473A

CN101503473A - 一种用于肺癌体内外诊断或治疗的靶向性多肽及其应用

Info

Publication number: CN101503473A
Application number: CNA2009100377420A
Authority: CN
Inventors: 臧林泉; 潘琴; 石磊; 张德志; 冯冰虹; 潘雪刁
Original assignee: Guangdong Pharmaceutical University
Current assignee: Guangdong Pharmaceutical University
Priority date: 2009-03-10
Filing date: 2009-03-10
Publication date: 2009-08-12

Abstract

本发明公开了一种用于肺癌体内外早期诊断或治疗的靶向性多肽，属于医药技术领域，所述多肽是十二肽。本发明还公开了所述的靶向性多肽的应用，是应用于作为肺癌靶向治疗的载体或制备抗癌药物，或作为肺癌早期、中期诊断的药物。本发明提供的多肽为小分子抗体，除有传统抗体药物的优点外，较抗体分子量小，穿透力强，容易到达肿瘤组织，能更加灵敏的诊断肿瘤，有利于肿瘤的早期诊断，还具有良好的肿瘤靶向作用，适合作为靶向治疗或者作为靶向治疗的载体，具有广阔的应用前景。

Description

一种用于肺癌体内外诊断或治疗的靶向性多肽及其应用

技术领域

本发明涉及一种靶向性多肽及其应用，具体地说是一种用于肺癌体内外诊断或治疗的靶向性多肽及其应用，属于医药技术领域。

背景技术

肺癌是一种常见的恶性肿瘤，据美国最新数据统计推测在2007年肺癌发病率在男性中仅次于前列腺癌，在女性中仅次于乳腺癌，但死亡率却均居各恶性肿瘤之首，肺癌对于放疗和化疗的敏感性均较差，治疗方法选择有限，因此肺癌死亡率极高，平均5年生存率不到10％。选择性地阻断导致肿瘤细胞无限制增殖的信号转导通路、修正或封闭某个(些)致病性基因或基因位点、激发并增强人体自身免疫抗瘤能力已成为抗肿瘤新药研发的趋势。

近年来，抗体药物治疗肿瘤受到了广泛的关注，一批新药被批准上市，推动了肿瘤治疗和生物技术产业的发展。

目前，国际上已有500多种抗体用于诊断与治疗，美国食品药品管理局(FDA)至今已批准18个抗体上市，其中有8个是用于肿瘤治疗的靶向抗体。例如，Rituxan是1997年第一个获FDA批准上市的抗肿瘤抗体药物，用于治疗B细胞性非霍奇金淋巴瘤，已治疗了30多万例病人，单药治疗总反应率为50％，其疗效与化疗治疗相同，但几乎无副作用，联合化疗有效率高达80％以上；针对血管表皮生长因子(VEGF)的抗体Avastin，使晚期结肠癌患者的生存期平均延长了5个月，FDA认为它几乎对所有的晚期结肠癌患者都有帮助，因此被批准作为晚期结肠癌的一线用药。

国际市场上现有多肽类药物约35种，其中畅销产品包括：亮丙瑞林、戈瑞林、布舍瑞林、促黄体激素拮抗剂以及罗氏去年新上市的天价多肽类新药Fuzeon(系由36个氨基酸分子组成)等。还有几种抗SARS病毒、HIV病毒的活性肽类新药即将被FDA批准上市。不仅美国公司在开发多肽类新药，一些传统欧洲制药强国如瑞士、瑞典、荷兰、法国、德国和英国均在大力开发活性肽类新药。

北京大学医学部免疫学系陈慰峰院士领导的T细胞研究室，在肿瘤抗原鉴定及免疫应答分析、肿瘤疫苗研制等方面取得了显著成果。近期，该实验室顺利完成了癌-睾丸抗原(CT抗原)NY-ESO-1抗原肽(NY-ESO-1b)的临床前研究工作，其研制的肿瘤抗原NY-ESO-1b多肽疫苗也已通过国家食品药品监督管理局的评审，获得新药临床研究批文。

肺癌的临床初诊时5％的患者已经发生远处转移，因此早期诊断肺癌是降低肺癌死亡率的关键。肿瘤标志物(tumormarker，TM)的检测是一种非侵袭性的检查方法，在肿瘤发生发展的早期，当影像学检查还没有出现阳性结果时，血液中肿瘤标志物已有不同程度的升高。目前，临床上所采用的诊断方法主要为传统的胸片、支气管镜、痰细胞学检查等，缺乏足够的特异性和敏感性，大多数肺癌患者确诊时已为晚期。因此，寻找一种灵敏、特异、无创的早期诊断肺癌的生物标记物是当务之急。

目前国内多肽用于肿瘤及肺癌诊断治疗的相关专利主要有：

1.上海亿康生物化学工程有限公司的抗小细胞肺癌多肽混合物。

该抗小细胞肺癌多肽混合物是一种抗小细胞肺癌P物质类似物的多肽混合物，有三种形式：SPDD多肽混合物、SPDD结构趋同化组合的多肽文库的多肽混合物以及前两者混合的多肽混合物，可用于制备抗小细胞肺癌的多肽药物。

2.南京大学的抗肿瘤多肽及其应用。

该抗肿瘤多肽及其应用是人工合成了一种具有抗肿瘤作用的多肽，定名为ND100，是由1Ala、1Glu、1Gly、1Leu、2Pro、1Thr、1Tyr组成的八肽，分子量为846.9，可用于治疗肿瘤。

3.南京大学的导向双功能抗肿瘤多肽及其应用。

该导向双功能抗肿瘤多肽及其应用利用一个载体分子聚乙二醇把两个不同功能的多肽连接在一起，其中一个多肽为细胞粘附肽，序列为Glu-Ile-Leu-Asp-Val；另一个为抗肿瘤寡肽，序列为Tyr-X-Glu-Pro-Gly-Pro-Y-Ala，其中X为Leu或Ile，Y为Thr或Ser，合成的杂合分子称导向双功能抗肿瘤多肽。它具有抑制肿瘤细胞生长和转移的功能，可在制备治疗肿瘤药物中应用。

噬菌体展示技术是19世纪80年代由Smith等人提出的，其基本原理是将外源DNA片段插入噬菌体编码蛋白基因PIII或PVI中，使外源DNA片段对应的表达产物融合在噬菌体的外壳蛋白中形成融合蛋白，呈现在噬菌体表面。噬菌体库作为一种简便、高效筛选工具，已广泛应用于抗肿瘤药物、肿瘤诊断标志物等的筛选和研发。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于肺癌体内外诊断或治疗的靶向性多肽，利用体内噬菌体展示技术筛选肺癌组织特异性结合的多肽，鉴定其特异性和亲和力，为肿瘤诊断试剂及肿瘤药物的研制奠定基础。

本发明的另一目的是提供上述靶向性多肽的应用。

本发明用于肺癌体内外早期诊断或治疗的靶向性多肽是由1K 1M 1D 1R1H 1D 1P 1S 1P 1A 1L 1L组成的十二肽，分子量为1379.61，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1。

本发明采用了体内筛选技术，在适当的条件下，在荷瘤A549裸鼠体内对噬菌体随机肽库进行多轮体内筛选，逐轮增强洗涤力度，获得了肺癌特异性结合的噬菌体克隆。经过Elisa、免疫组织化学等方法鉴定出1个噬菌体克隆与肺癌具有较强的亲和力，测序后定名为zp-7，是由1K 1M 1D 1R 1H 1D 1P 1S 1P1A 1L 1L组成的十二肽，分子量为1379.61。

本发明所述的靶向性多肽的应用，是应用作为肺癌靶向治疗的载体或制备抗癌药物，或者是应用于作为肺癌早期、中期诊断的药物。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)现有技术中尚无用于肿瘤及肺癌诊断或治疗的12肽，本发明的技术方案提供了一种全新的肿瘤及肺癌诊断或治疗途径；而且本发明筛选的十二肽，测序的氨基酸及其序列与已有报道序列无任何同源性。经过生物信息学分析比对发现ZP-7与美国国立生物技术信息中心(NCBI)GenBank DNA序列数据库和Swiss-Prot蛋白数据库中的已知基因和蛋白无同源性，且国内外文献均未见报道，本发明提供的是一种新的治疗或诊断肺癌的标志物。

(2)本发明提供的十二肽为小分子抗体，除有传统抗体药物的优点外，较抗体分子量小，穿透力强，容易到达肿瘤组织，能更加灵敏的诊断肿瘤，有利于肿瘤的早期诊断，还具有良好的肿瘤靶向作用，适合作为靶向治疗或者作为靶向治疗的载体。

(3)本发明提供的靶向性多肽可广泛应用于肺癌的体外筛查和早期诊断(血液、痰液标本)；中晚期肺癌的体内诊断、预后判断、转归等；肺癌的靶向治疗载体；肺癌的直接治疗；其它常见恶性肿瘤的体外筛查和早期诊断(血液、痰液标本)；其它常见恶性肿瘤的体内诊断、预后判断、转归等；其它常见恶性肿瘤的靶向治疗载体；其它常见恶性肿瘤的直接治疗。由此可见，其应用前景相当广阔。

附图说明

图1是实施例1中Elisa检测第三轮筛选噬菌体克隆与A549的亲和力结果图；其中横坐标是克隆编号，纵坐标是亲和力强度，亲和力强度＝(噬菌体克隆对A549亲和力-噬菌体克隆对MRC-5亲和力)/(噬菌体随机克隆对A549亲和力-噬菌体随机克隆对MRC-5亲和力)。

具体实施方式

以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案。

实施例1

本发明是利用体内噬菌体展示技术筛选肺癌组织特异性结合的多肽，鉴定其特异性和亲和力而得，具有很好的肺癌靶向特异性。

试剂噬菌体十二肽库(Ph.D-12^TM Phage Display Peptide Library)购自NewEngland Biolabs公司，文库滴度为1.5×10¹³pfu/ml，复杂度为2.7×10⁹；受体菌E.coliER2738购自New England Biolbs公司；HRP/anti-M13antibody(#27-9421-01，1:5000稀释工作浓度)购自Amersham Biosciences公司；TMB、IPTG，、Xgal等其它试剂均购于北京鼎国公司。

仪器 CO₂培养箱、倒置显微镜、生物安全柜、高速冷冻离心机、酶标仪、。

方法：

细胞培养肺腺癌细胞A549为中山大学肿瘤医院惠赠，用含10％胎牛血清(TBD)的DMEM培养；肺二倍体成纤维细胞MRC-5购自上海中科院细胞库，用含10％胎牛血清(TBD)的MEM培养，于37℃、5％ CO₂条件下常规培养，细胞生长至90％时用于试验。

裸鼠饲养与致瘤 BALB/c-nu/nu裸鼠饲养1周后选取身体状况良好的健康裸鼠，于其背后部两侧选取两个注射位点皮下接种人源肿瘤细胞A549，每个位点注射细胞数目约为10⁵个，1～2周后即可长出瘤状肿块，逐日记录肿块直径，待肿块长至0.5～1.5cm备用。

1.1 荷瘤裸鼠体内A549抗原配体肽筛选 A549荷瘤裸鼠以戊巴比妥麻醉(约5μg/只)；尾静脉注射肽库(约1016pfu，以200μl生理盐水稀释)；15分钟后，裸鼠泡75％酒精，解剖胸腔，取肿瘤组织以眼科剪剪碎为约1mm³，以PBS洗涤3次；再用1.6ml 0.1M glycine，pH 2.0洗脱10min，洗脱液用36μl 2MTris中和；再用trypsine洗脱10min，洗脱产物分装2支，取10μl测滴度，并另取10μl扩增，用于下一轮筛选。测定第三轮筛选获得的噬菌体的滴度后，在IPTG/Xgal琼脂板上随机挑取蓝色噬菌斑，制备噬菌体原种用于鉴定。

1.2 噬菌体克隆对肺癌的亲和力鉴定

ELISA鉴定将NCI-H1299、A549按1×10⁴/孔的密度接种于96孔板，置37℃、5％ CO2培养箱培养24h后，对细胞进行无血清处理1h，清洗细胞，再用4％多聚甲醛固定20min，PBS稍洗，0.1％ triton X-100处理10min，PBST洗3次；2％ PBS-BSA封闭1h后，加入滴度约10¹²的噬菌体，37℃孵育2h，PBST洗4次；加HRP-anti M13抗体，37℃孵育1h，PBST洗3次；用TMB显色，HCl终止反应，酶标仪450nm处读数。随机挑取噬菌体原库蓝斑作为对照，P/N>2为阳性。

噬菌体肽库经过连续三轮体内筛选后，随机挑选20个噬菌体克隆，编号为T1～T20，利用ELISA初步鉴定噬菌体克隆对A549的亲和力，结果见图1，图1显示T14号克隆对A549细胞亲和力最强，命名为ZP-7，Control为原库随机噬菌体克隆。

细胞免疫组化鉴定将NCI-H1299、A549按1×10⁵/孔的密度接种于24孔板中，试验步骤同1.5；DAB染色10min，水洗终止显色反应，Mayer氏苏木精复染15min，1％盐酸乙醇分化3s，1％氨水反蓝2min，显微镜下观察染色情况。

进一步鉴定多肽ZP-2与A549的亲和力和特异性。FITC-ZP-2分别与肺癌细胞A549、NCI-H1299、肝癌细胞7402、HepG2、正常肺细胞WI-38及正常肝细胞LO2孵育，观察其荧光现象。结果显示A549绿色荧光最强，NCI-H1299也有较强荧光，但是其它细胞荧光很弱，说明ZP-2对肺癌细胞具有高亲和力。

1.3 噬菌体克隆质粒提取及测序取阳性克隆噬菌体扩增液500μL，加200μL 20％PEG/NaCl，混匀，室温放置15min，10000rpm离心10min，取沉淀；用100μL TE(PH＝8.0)溶解沉淀，加100μL Tris饱和酚，上下颠倒1min，再静置1min，再上下颠倒约1min混匀；10000rpm离心5min，取上层加入300μl 3mol/L乙酸钠:无水乙醇(1:25)沉淀DNA，混匀后静置约30min，10000rpm离心10min，去上清，加100μL 70％乙醇洗一次，风干残余乙醇，用40μL TE(PH＝8.0)溶解，琼脂糖凝胶电泳鉴定。用肽库自带测序引物送上海英俊生物技术有限公司测序，测序引物为：5′-CCC TCA TAG TTA GCG TAACG-3′，距目的片段相距96bp。

扩增阳性克隆ZP-7，提取质粒，由上海英俊公司采用-96gIII引物测序，测序结果分别为5’-TAT CCG CAT TAT AGT CTT CCT GGT TCG TCT ACG CTT-3’，推导其氨基酸系列为：YPHYSLPGSSTL。由北京中科亚光合成多肽并同时合成标记FITC的多肽，通过HPLC及质谱纯化和鉴定该多肽纯度>95％。

多肽合成由北京中科亚光生物科技有限公司(Scilight Biotechnology，LLC)合成纯度95％以上的多肽。

1.4 噬菌体-多肽竞争抑制试验取生长状态良好的A549细胞，消化，PBS洗3次，分装入EP管，每管10⁵个细胞，2％ PBS-BSA封闭37℃ 1h，再用多肽(浓度：100、10、1、0.1、0.01nm)先与细胞4℃孵育1h，加入滴度约10¹²的对应噬菌体4℃孵育1h；PBST洗3次，甘氨酸盐酸洗脱下来，测各条件下滴度。

竞争抑制试验结果显示，噬菌体克隆T14与A549的结合同多肽ZP 2具有浓度依赖性，多肽ZP 2浓度为0.00001mM，对噬菌体与A549抑制率为12％；多肽ZP2浓度为1mM，对噬菌体与A549抑制率为79.5％。

1.5 多肽对肺癌的亲和力、特异性鉴定

FITC标记多肽的组织免疫荧光鉴定肺癌临床患者肿瘤组织及正常组织石蜡切片与FITC-ZP-2孵育，多肽浓度为100um，鉴定FITC-ZP-2对肺癌组织的特异性，观察其荧光现象。肿瘤组织可见明显FITC绿色荧光，但是正常组织FITC绿色荧光很弱，说明ZP-2对肺癌组织具有高特异性。

临床标本检测收集未经放疗、化疗、手术治疗的肺癌病人血清、痰液涂片检测验证其特异性和靶向性。

结果本发明的多肽经鉴定其特异性和亲和力，具有很好的肺癌靶向性。具有灵敏、特异的特点。

序列表

<110>广东药学院

<120>一种用于肺癌体内外诊断或治疗的靶向性多肽及其应用

<130>

<160>1

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>12

<212>PRT

<213>人(human)

<400>1

Claims

1.一种用于肺癌体内外早期诊断或治疗的靶向性多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1。

2.权利要求1所述的靶向性多肽的应用，是应用于作为肺癌靶向治疗的载体或制备抗癌药物。

3.权利要求1所述的靶向性多肽的应用，是应用于作为肺癌早期、中期诊断的药物。