CN112358531B

CN112358531B - 靶向her2蛋白的多肽及其应用

Info

Publication number: CN112358531B
Application number: CN202011239124.7A
Authority: CN
Inventors: 王浩; 王磊; 杨超; 杨培培
Original assignee: National Center for Nanosccience and Technology China
Current assignee: National Center for Nanosccience and Technology China
Priority date: 2020-11-09
Filing date: 2020-11-09
Publication date: 2022-05-27
Anticipated expiration: 2040-11-09
Also published as: CN112358531A

Abstract

本发明提供了靶向HER2蛋白的多肽及其应用，所述多肽包括SEQ ID NO:1～11所示的氨基酸序列；或所述多肽为将SEQ ID NO:1～11所示的氨基酸序列经若干个氨基酸取代、缺失或在N端和C端添加而获得的具有靶向HER2蛋白的活性的氨基酸序列。本发明的多肽具有结合HER2蛋白的能力，相对分子量小、特异性强、制备成本低，在肿瘤的靶向诊断和治疗方面具有独特的优势和重要的应用前景。

Description

靶向HER2蛋白的多肽及其应用

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，涉及靶向HER2蛋白的多肽及其应用。

背景技术

二十年前，科学家们总结了肿瘤的六大特征，即生长不受控、血管增生、组织浸润和转移、能够逃脱死亡通路、无限增值；二十年过去了，当代研究者仍以这些特征为前提探索肿瘤的发生和发展。随着科技的进步和研究的深入，研究者们发现了更多的肿瘤特征，包括肿瘤微环境、肿瘤特殊的代谢途径、炎症反应等，为研究提供了新的思路。在现有的肿瘤临床治疗方案中，分子靶向治疗占有一席之地。

分子靶向治疗即在分子水平上，针对已经明确的致癌位点设计治疗药物，当药物进入人体后，特异性选择致癌位点与肿瘤细胞结合，致使肿瘤细胞特异性死亡、同时避免波及肿瘤周围的正常组织细胞，这种有的放矢的治疗方法为肿瘤治疗指明了方向。

人类肿瘤常见的标志物人表皮生长因子受体2(HER2)在肿瘤的发生发展中起着重要作用，HER2是表皮生长因子受体(EGFR)家族的第二位成员，通常情况下只在胎儿时期表达，正常细胞以组织特异性的方式在浆膜上表达少量HER2蛋白。目前尚无已知的HER2配体，因而HER2被称为“孤儿受体”。HER2发生聚合作用使得酪氨酸残基磷酸化，并启动多种信号通路诱发细胞增殖和癌症发生。据临床统计，15％～30％的乳腺癌和10％～30％的胃/食管癌会发生HER2基因扩增或过表达。此外，在卵巢癌、肺癌、膀胱癌、头颈癌中也发现了HER2基因的过表达。

近年来，针对HER2靶点的药物成为研究热点，已经有5种HER2靶向药物通过了FDA审批，包括曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、Kadcyla、拉帕替尼、阿法替尼等，其中两种获CFDA批准在国内上市。尽管目前使用的抗癌抗体取得了临床和商业上的成功，但是抗体药物仍然存在许多问题，例如，多数患者会产生耐药性，各种因素可能降低药物效力，抗体药物的毒性作用可能造成肺毒性反应的呼吸困难、偶尔的中枢和周围神经系统并发症、以及肝功能和肾功能衰退等，也是药物研发中的巨大障碍。

因此，提供具有HER2亲和性的制剂并应用于疾病的诊断和治疗，仍是本领域的一个重要议题。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了靶向HER2蛋白的多肽及其应用，所述多肽具有对HER2蛋白持续的亲和性，可以特异地与HER2蛋白结合，在肿瘤的治疗和诊断中具有重要应用价值。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了靶向HER2蛋白的多肽，所述多肽包括SEQ ID NO:1、SEQID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列；

或所述多肽为将SEQ ID NO:1～11所示的氨基酸序列经若干个氨基酸取代、缺失或在N端和C端添加而获得的具有靶向HER2蛋白的活性的氨基酸序列；

SEQ ID NO:1：ELYDTGP；

SEQ ID NO:2：QDYKIPG；

SEQ ID NO:3：QDHRIPG；

SEQ ID NO:4：WPNEDIG；

SEQ ID NO:5：SYFEDIG；

SEQ ID NO:6：VRIIPYF；

SEQ ID NO:7：IVIEFIR；

SEQ ID NO:8：FPEYRDI；

SEQ ID NO:9：WWKRSPR；

SEQ ID NO:10：SFRPAYW；

SEQ ID NO:11：TTYEWEW。

本发明中，采用一珠一化合物(one-bead-one-compound，OBOC)的组合化学方法合成多肽库，利用多肽库与HER2蛋白，筛选得到如SEQ ID NO:1～11所示的具有靶向HER2蛋白活性的多肽，所述多肽可以与其他多肽和/或蛋白进行融合表达，构建靶向杀伤HER2过表达细胞的药物。

第二方面，本发明提供了一种第一方面所述的多肽的筛选方法，所述方法包括以下步骤：

(1)利用一珠一化合物法合成多肽库；

(2)向步骤(1)的多肽库中加入HER2蛋白进行孵育，筛选得到具有结合HER2蛋白作用的多肽。

根据本发明，一珠一化合物(one-bead-one-compound，OBOC)法是一种组合化学方法，基于OBOC方法建立的多肽库主要用于筛选具有蛋白靶向功能的多肽，具有通量高、筛选效率高等优势；本发明利用多肽库与HER2蛋白进行筛选，最终从多肽库中筛选得到能够与HER2蛋白特异性结合的多肽树脂，经过测序得到多肽的氨基酸序列；本发明的方法建立了蛋白与多肽之间的联系，为发现与HER2蛋白结合的多肽提供了简便易行的方法，为进一步研发抗肿瘤药物提供了依据。

优选地，步骤(1)所述多肽库的合成方法包括：

(1’)在树脂微珠上合成前导序列；

(2’)将树脂微珠均分后，将一个Fmoc保护的氨基酸进行活化并加入树脂微珠中，与脱保护的前一个氨基酸进行缩合反应；

(3’)将树脂微珠混合，进行Fmoc脱保护，重复步骤(2’)和(3’)，直至最后一个氨基酸合成完成，得到所述多肽库。

本发明中，在固相合成过程中，通过对树脂微珠的多次混合与均分，使每个树脂微珠上带有唯一一种随机多肽序列，构建得到多肽库。

优选地，步骤(1’)所述前导序列的长度为2～4aa，例如可以是2aa、3aa或4aa。

优选地，所述前导序列包括甲硫氨酸。

本发明中，首先在树脂微珠上合成含有甲硫氨酸的前导序列，主要作用是CNBr₃乙醇溶液将甲硫氨酸裂解生成高丝氨酸，使得功能性多肽从树脂微珠上裂解下来。

根据本发明，前导序列中还含有其他19种氨基酸中的任意一种或多种，优选为含有甘氨酸(G)，用于将树脂微珠与功能性多肽相间隔。

优选地，步骤(2’)所述活化的试剂包括N,N-二甲基甲酰胺、甲醇、N-甲基吗啉、N,N'-二异丙基碳二亚胺或1-羟基苯并三唑中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，步骤(3’)所述脱保护的试剂包括含有六氢吡啶的DMF溶液或含有哌嗪和1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯的DMF溶液。

优选地，步骤(1)所述多肽库中多肽的长度为5～10aa，例如可以是5aa、6aa、7aa、8aa、9aa、或10aa。

优选地，步骤(2)所述HER2蛋白包括如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列；

SEQ ID NO:12：

MELAALCRWGLLLALLPPGAASTQVCTGTDMKLRLPASPETHLDMLRHLYQGCQVVQGNLELTYLPTNASLSFLQDIQEVQGYVLIAHNQVRQVPLQRLRIVRGTQLFEDNYALAVLDNGDPLNNTTPVTGASPGGLRELQLRSLTEILKGGVLIQRNPQLCYQDTILWKDIFHKNNQLALTLIDTNRSRACHPCSPMCKGSRCWGESSEDCQSLTRTVCAGGCARCKGPLPTDCCHEQCAAGCTGPKHSDCLACLHFNHSGICELHCPALVTYNTDTFESMPNPEGRYTFGASCVTACPYNYLSTDVGSCTLVCPLHNQEVTAEDGTQRCEKCSKPCARVCYGLGMEHLREVRAVTSANIQEFAGCKKIFGSLAFLPESFDGDPASNTAPLQPEQLQVFETLEEITGYLYISAWPDSLPDLSVFQNLQVIRGRILHNGAYSLTLQGLGISWLGLRSLRELGSGLALIHHNTHLCFVHTVPWDQLFRNPHQALLHTANRPEDECVGEGLACHQLCARGHCWGPGPTQCVNCSQFLRGQECVEECRVLQGLPREYVNARHCLPCHPECQPQNGSVTCFGPEADQCVACAHYKDPPFCVARCPSGVKPDLSYMPIWKFPDEEGACQPCPINCTHSCVDLDDKGCPAEQRASPLTSIISAVVGILLVVVLGVVFGILIKRRQQKIRKYTMRRLLQETELVEPLTPSGAMPNQAQMRILKETELRKVKVLGSGAFGTVYKGIWIPDGENVKIPVAIKVLRENTSPKANKEILDEAYVMAGVGSPYVSRLLGICLTSTVQLVTQLMPYGCLLDHVRENRGRLGSQDLLNWCMQIAKGMSYLEDVRLVHRDLAARNVLVKSPNHVKITDFGLARLLDIDETEYHADGGKVPIKWMALESILRRRFTHQSDVWSYGVTVWELMTFGAKPYDGIPAREIPDLLEKGERLPQPPICTIDVYMIMVKCWMIDSECRPRFRELVSEFSRMARDPQRFVVIQNEDLGPASPLDSTFYRSLLEDDDMGDLVDAEEYLVPQQGFFCPDPAPGAGGMVHHRHRSSSTRSGGGDLTLGLEPSEEEAPRSPLAPSEGAGSDVFDGDLGMGAAKGLQSLPTHDPSPLQRYSEDPTVPLPSETDGYVAPLTCSPQPEYVNQPDVRPQPPSPREGPLPAARPAGATLERPKTLSPGKNGVVKDVFAFGGAVENPEYLTPQGGAAPQPHPPPAFSPAFDNLYYWDQDPPERGAPPSTFKGTPTAENPEYLGLDVPV。

优选地，步骤(2)所述HER2蛋白标记有荧光基团。

优选地，步骤(2)所述孵育的时间为2～4h，例如可以是2h、3h或4h，优选为2h。

优选地，步骤(2)所述筛选为根据荧光信号进行筛选。

优选地，所述方法在步骤(2)之后还包括将筛选的多肽与HER2蛋白共培养，进行二次筛选的步骤。

作为优选技术方案，本发明提供了一种第一方面所述的多肽的筛选方法，所述方法包括以下步骤：

(1)在树脂微珠上合成含有甲硫氨酸的长度为2～4aa的前导序列；

(2)将树脂微珠均分后，将一个Fmoc保护的氨基酸进行活化并加入树脂微珠中，与脱保护的前一个氨基酸进行缩合反应；

(3)将树脂微珠混合，采用含有六氢吡啶的DMF溶液进行Fmoc脱保护，重复步骤(2)和(3)，直至最后一个氨基酸合成完成，得到所述多肽库，所述多肽库中多肽的长度为7～10aa；

(4)向多肽库中加入如SEQ ID NO:12所示的荧光标记HER2蛋白，孵育2～4h，根据荧光信号筛选得到具有特异性结合HER2蛋白作用的多肽；

(5)将筛选的多肽与HER2蛋白共培养，进行二次筛选。

本发明中，采用人工标记的HER2蛋白与一珠一化合物多肽库共培养，筛选获得靶向HER2蛋白的多肽树脂，将所述多肽从树脂上裂解下来后进行测序鉴定，获得多肽序列；利用单光子激光共聚焦进一步检测多肽与HER2高表达细胞的结合能力，根据荧光强度筛选获得与HER2蛋白结合效果好的多肽。

第三方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括连接有第一方面所述的多肽的细胞毒药物。

本发明中，连接有第一方面所述的多肽的细胞毒药物，利用多肽靶向HER2阳性肿瘤细胞，使得细胞毒药物发挥分子靶向治疗功效，特异性杀伤HER2阳性肿瘤细胞、同时避免波及周围的正常组织细胞。

优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合，所述药物组合物的剂型优选为注射制剂。

第四方面，本发明提供了第一方面所述的多肽和/或第三方面所述的药物组合物在制备疾病治疗药物中的应用。

优选地，所述疾病包括HER2阳性肿瘤。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明的多肽与HER2蛋白结合能力强，能够特异性结合HER2阳性肿瘤细胞，在肿瘤的治疗和/或检测领域具有重要的应用前景；

(2)本发明的多肽相较于抗体导向药物分子量小、免疫原性弱、活性高，具有制备成本低、易于修饰的优势；

(3)本发明的多肽筛选方法具有通量高、筛选效率高等优势，建立了蛋白与多肽之间的联系，为发现与HER2蛋白结合的多肽提供了简便易行的方法，为进一步研发抗肿瘤药物提供了依据。

附图说明

图1为多肽序列的一级质谱；

图2A为QDYKIPG多肽与HER2过表达的SK-BR-3细胞结合后的单光子激光共聚焦照片，图2B为WWKRSPR多肽与HER2过表达的SK-BR-3细胞结合后的单光子激光共聚焦照片，图2C为QDHRIPG多肽与HER2过表达的SK-BR-3细胞结合后的单光子激光共聚焦照片，图2D为SYFEDIG多肽与HER2过表达的SK-BR-3细胞结合后的单光子激光共聚焦照片；

图3为多肽与HER2蛋白的结合力分析结果；

图4为多肽对SK-BR-3细胞的毒性试验结果。

具体实施方式

为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例中采用的实验材料和试剂包括：

多肽合成树脂，Fmoc保护的氨基酸(除去半胱氨酸C)，N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，甲醇，羟基苯并三唑HOBt(anhydrous)，N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIC)，六氢吡啶，无水乙醇，茚三酮反应试剂，三氟乙酸(TFA)，苯酚，超纯水，三异丙基硅烷(TIS)，75％医用酒精，人HER2蛋白(His标签)，荧光染料FITC，PBS等。

实施例1OBOC多肽库的建立

本实施例利用OBOC法在树脂微珠(beads)上合成多肽库，步骤如下：

(1)取一定量的多肽合成树脂置于合成管中，加入一定量的DMF浸没树脂进行树脂溶胀，浸泡2h以上；

(2)向合成管中加入Fmoc保护的甲硫氨酸(M)，摇床反应2h以上；用甲醇和DMF反复交替冲洗三次，冲洗过程中用吸管反复将树脂吹起；之后进行茚三酮沸水浴检验，树脂显色为无色；

(3)加入脱保护剂进行Fmoc脱保护10min，用甲醇和DMF反复交替冲洗三次，冲洗过程中用吸管反复将树脂吹起；重复脱保护一次，即连续脱保护两次；之后进行茚三酮沸水浴检验，树脂显色为深蓝紫色；

(4)向合成管中加入2.1402g Fmoc保护的甘氨酸(G)，重复步骤(2)和(3)；

(5)将合成管中的树脂平均分为18份，向每一支合成管中加入相应剂量的Fmoc保护的氨基酸(除甲硫氨酸和甘氨酸之外的18种天然氨基酸)和HOBT(1-羟基苯并三唑)/DIC(N,N'-二异丙基碳二亚胺)混合液，摇床反应合成6h以上；

(6)用甲醇和DMF反复交替冲洗三次，冲洗过程中用吸管反复将树脂吹起，确保充分混合冲洗；

(7)抽检其中几种多肽的合成效率，取出树脂用乙醇浸泡后进行茚三酮沸水浴检验，重复步骤(5)-(7)，直至树脂变为无色，将所有合成管中的树脂混合；

(8)重复步骤(5)-(7)，直至最后一个氨基酸合成完成；

(9)用脱保护剂(20％六氢吡啶+80％DMF)脱去侧链Fmoc保护基后，依次用DMF、甲醇、DMF冲洗三次，室温下避光干抽15min，得到较为干燥的树脂；将干燥的树脂转移至小反应瓶(提前烘干)中，加入磁子，用酸性脱保护剂(TFA 82.5％、苯酚5％、水10％、TRIS2.5％)脱去所有的酸响应侧链保护基，室温反应4小时，构建得到多肽库。

实施例2HER2蛋白的FITC标记

本实施例对HER2蛋白(SEQ ID NO:12)进行FITC标记，步骤如下：

(1)采用PBS溶解HER2蛋白，使HER2蛋白的终浓度为10～50μg/mL；

(2)向步骤(1)配制好的HER2蛋白溶液中加入FITC，使FITC标记蛋白的量为5％，进行冰浴，避光条件下磁力搅拌过夜；

(3)第二天，将混合液置于截留分子量为500的透析袋中，在去离子水条件下透析三天；

(4)收集透析后的溶液，冷冻干燥机冻干，得到FITC标记的HER2蛋白。

实施例3筛选靶向HER2蛋白的多肽

将FITC标记的HER2蛋白与多肽库在PBS缓冲液中培养2小时，荧光显微镜下观察405nm波长激发下的多肽树脂颜色，将观察到的有明显绿色荧光的多肽树脂挑选出来；

将挑选出的多肽树脂采用30％CNBr₃乙醇溶液裂解过夜，离心处理取上清液，经过脱盐处理后进行多肽测序。

图1所示为多肽序列的一级质谱图，所测多肽分子量与理论分子量接近，是期望得到的多肽序列。

实施例4多肽与HER2过表达的SK-BR-3细胞的结合

将HER2过表达的SK-BR-3人源乳腺癌细胞在含有8.0×10^-5M多肽溶液(QDYKIPG、WWKRSPR、QDHRIPG或SYFEDIG中的任意一种)、10.0％胎牛血清、100.0U/mL青霉素和100.0μg/mL链霉亲和素的DMEM培养基中培养，培养温度为37.0℃，湿润空气中CO₂的浓度为5.0％，培养细胞至对数生长期，用胰酶消化分散细胞；

将合适比例的细胞悬浮液(10⁴个/mL)加至共聚焦皿中，在细胞培养箱中培养24h，随后将含有多肽(8.0×10^-5M)的培养基替换原培养液再培养2～4h，用PBS清洗三遍，进行单光子激光共聚焦成像实验。

结果如图2A、图2B、图2C和图2D所示，其中，图2A所用的多肽为SEQ ID NO:2：QDYKIPG，图2B所用的多肽为SEQ ID NO:9：WWKRSPR，图2C所用的多肽为SEQ ID NO:3：QDHRIPG，图2D所用的多肽为SEQ ID NO:5：SYFEDIG，可以看出，四种多肽与HER2过表达的SK-BR-3细胞均具有一定的结合作用，其中，图2A的荧光信号更强，说明QDYKIPG多肽对HER2阳性细胞有最强的结合力。

实施例5多肽与HER2蛋白的结合力分析

本实施例采用微量热泳动仪(microscale thermophoresis，MST)测量多肽与HER2蛋白之间的结合力。步骤如下：

将HER2蛋白用PBS(pH＝7.4)配制成1.25μM浓度的蛋白溶液，并用染料N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)-酯进行标记，标记完成后采用凝胶柱过滤去除游离染料；将16个不同浓度梯度的QDYKIPG多肽溶液(5μM、2.5μM、1.25μM、0.625μM、0.3125μM、0.156μM、0.078μM、0.039μM、0.0195μM、0.01μM、0.005μM、0.0025μM、0.00125μM、0.0006μM、0.0003μM、0.00015μM)与染料标记的HER2蛋白溶液混合后上机测试。

如图3所示，QDYKIPG多肽与HER2蛋白的结合力常数KD＝10^-7，表现出与HER2蛋白较好的亲和力。

实施例6细胞毒性实验

用含10％胎牛血清的培养基将SK-BR-3细胞制成单个细胞悬液，采用血球计数板计数后，以每孔4000～10000个细胞的浓度接种于96孔板中，每孔体积为100μL，置于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养过夜；

细胞贴壁后加入浓度梯度为5μM、10μM、40μM、160μM、240μM、320μM的QDYKIPG多肽溶液，继续在培养箱中培养过夜，同时以BT474细胞和HER2阴性细胞人肾上皮细胞293T为对照组，进行同上处理；

24h后吸弃孔内含有多肽的培养基，并用PBS润洗1～2次，随后加入CCK-8试剂，在培养箱中继续培养2h，酶标仪检测各孔450nm处的吸光度，设定650nm吸收为参比，记录结果。

如图4所示，QDYKIPG多肽仅对HER2阳性的SKBR-3细胞显示出一定的杀伤效果，对BT474细胞和HER2阴性的人肾上皮细胞293T无明显作用，说明QDYKIPG多肽对SKBR-3细胞具有特异性结合和杀伤效果。

综上所述，本发明采用OBOC法合成多肽库，筛选得到靶向HER2蛋白的多肽，所述多肽与HER2蛋白结合能力强，细胞毒性低，相较于抗体导向药物具有分子量小、免疫原性弱、活性高、制备成本低、易于修饰的优势，在肿瘤的治疗和/或检测领域具有重要的应用前景。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 国家纳米科学中心

<120> 靶向HER2蛋白的多肽及其应用

<130> 20201103

<160> 12

<170> PatentIn version 3.3

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<212> PRT

<213> 人工序列

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Glu Leu Tyr Asp Thr Gly Pro

1 5

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<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Gln Asp Tyr Lys Ile Pro Gly

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<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Gln Asp His Arg Ile Pro Gly

1 5

<210> 4

<211> 7

<212> PRT

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Trp Pro Asn Glu Asp Ile Gly

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<212> PRT

<213> 人工序列

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Ser Tyr Phe Glu Asp Ile Gly

1 5

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<212> PRT

<213> 人工序列

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Val Arg Ile Ile Pro Tyr Phe

1 5

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<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

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Ile Val Ile Glu Phe Ile Arg

1 5

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<211> 7

<212> PRT

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Phe Pro Glu Tyr Arg Asp Ile

1 5

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<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

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Trp Trp Lys Arg Ser Pro Arg

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<212> PRT

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Ser Phe Arg Pro Ala Tyr Trp

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<211> 7

<212> PRT

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Thr Thr Tyr Glu Trp Glu Trp

1 5

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<211> 1255

<212> PRT

<213> 人源

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Met Glu Leu Ala Ala Leu Cys Arg Trp Gly Leu Leu Leu Ala Leu Leu

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Pro Pro Gly Ala Ala Ser Thr Gln Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys

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Leu Arg Leu Pro Ala Ser Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His

35 40 45

Leu Tyr Gln Gly Cys Gln Val Val Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr

50 55 60

Leu Pro Thr Asn Ala Ser Leu Ser Phe Leu Gln Asp Ile Gln Glu Val

65 70 75 80

Gln Gly Tyr Val Leu Ile Ala His Asn Gln Val Arg Gln Val Pro Leu

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Gln Arg Leu Arg Ile Val Arg Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr

100 105 110

Ala Leu Ala Val Leu Asp Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro

115 120 125

Val Thr Gly Ala Ser Pro Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu Arg Ser

130 135 140

Leu Thr Glu Ile Leu Lys Gly Gly Val Leu Ile Gln Arg Asn Pro Gln

145 150 155 160

Leu Cys Tyr Gln Asp Thr Ile Leu Trp Lys Asp Ile Phe His Lys Asn

165 170 175

Asn Gln Leu Ala Leu Thr Leu Ile Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala Cys

180 185 190

His Pro Cys Ser Pro Met Cys Lys Gly Ser Arg Cys Trp Gly Glu Ser

195 200 205

Ser Glu Asp Cys Gln Ser Leu Thr Arg Thr Val Cys Ala Gly Gly Cys

210 215 220

Ala Arg Cys Lys Gly Pro Leu Pro Thr Asp Cys Cys His Glu Gln Cys

225 230 235 240

Ala Ala Gly Cys Thr Gly Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Cys Leu

245 250 255

His Phe Asn His Ser Gly Ile Cys Glu Leu His Cys Pro Ala Leu Val

260 265 270

Thr Tyr Asn Thr Asp Thr Phe Glu Ser Met Pro Asn Pro Glu Gly Arg

275 280 285

Tyr Thr Phe Gly Ala Ser Cys Val Thr Ala Cys Pro Tyr Asn Tyr Leu

290 295 300

Ser Thr Asp Val Gly Ser Cys Thr Leu Val Cys Pro Leu His Asn Gln

305 310 315 320

Glu Val Thr Ala Glu Asp Gly Thr Gln Arg Cys Glu Lys Cys Ser Lys

325 330 335

Pro Cys Ala Arg Val Cys Tyr Gly Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu

340 345 350

Val Arg Ala Val Thr Ser Ala Asn Ile Gln Glu Phe Ala Gly Cys Lys

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Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp

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Pro Ala Ser Asn Thr Ala Pro Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val Phe

385 390 395 400

Glu Thr Leu Glu Glu Ile Thr Gly Tyr Leu Tyr Ile Ser Ala Trp Pro

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Asp Ser Leu Pro Asp Leu Ser Val Phe Gln Asn Leu Gln Val Ile Arg

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Gly Ile Ser Trp Leu Gly Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly

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Leu Ala Leu Ile His His Asn Thr His Leu Cys Phe Val His Thr Val

465 470 475 480

Pro Trp Asp Gln Leu Phe Arg Asn Pro His Gln Ala Leu Leu His Thr

485 490 495

Ala Asn Arg Pro Glu Asp Glu Cys Val Gly Glu Gly Leu Ala Cys His

500 505 510

Gln Leu Cys Ala Arg Gly His Cys Trp Gly Pro Gly Pro Thr Gln Cys

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Val Asn Cys Ser Gln Phe Leu Arg Gly Gln Glu Cys Val Glu Glu Cys

530 535 540

Arg Val Leu Gln Gly Leu Pro Arg Glu Tyr Val Asn Ala Arg His Cys

545 550 555 560

Leu Pro Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Gln Asn Gly Ser Val Thr Cys

565 570 575

Phe Gly Pro Glu Ala Asp Gln Cys Val Ala Cys Ala His Tyr Lys Asp

580 585 590

Pro Pro Phe Cys Val Ala Arg Cys Pro Ser Gly Val Lys Pro Asp Leu

595 600 605

Ser Tyr Met Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Gln

610 615 620

Pro Cys Pro Ile Asn Cys Thr His Ser Cys Val Asp Leu Asp Asp Lys

625 630 635 640

Gly Cys Pro Ala Glu Gln Arg Ala Ser Pro Leu Thr Ser Ile Ile Ser

645 650 655

Ala Val Val Gly Ile Leu Leu Val Val Val Leu Gly Val Val Phe Gly

660 665 670

Ile Leu Ile Lys Arg Arg Gln Gln Lys Ile Arg Lys Tyr Thr Met Arg

675 680 685

Arg Leu Leu Gln Glu Thr Glu Leu Val Glu Pro Leu Thr Pro Ser Gly

690 695 700

Ala Met Pro Asn Gln Ala Gln Met Arg Ile Leu Lys Glu Thr Glu Leu

705 710 715 720

Arg Lys Val Lys Val Leu Gly Ser Gly Ala Phe Gly Thr Val Tyr Lys

725 730 735

Gly Ile Trp Ile Pro Asp Gly Glu Asn Val Lys Ile Pro Val Ala Ile

740 745 750

Lys Val Leu Arg Glu Asn Thr Ser Pro Lys Ala Asn Lys Glu Ile Leu

755 760 765

Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala Gly Val Gly Ser Pro Tyr Val Ser Arg

770 775 780

Leu Leu Gly Ile Cys Leu Thr Ser Thr Val Gln Leu Val Thr Gln Leu

785 790 795 800

Met Pro Tyr Gly Cys Leu Leu Asp His Val Arg Glu Asn Arg Gly Arg

805 810 815

Leu Gly Ser Gln Asp Leu Leu Asn Trp Cys Met Gln Ile Ala Lys Gly

820 825 830

Met Ser Tyr Leu Glu Asp Val Arg Leu Val His Arg Asp Leu Ala Ala

835 840 845

Arg Asn Val Leu Val Lys Ser Pro Asn His Val Lys Ile Thr Asp Phe

850 855 860

Gly Leu Ala Arg Leu Leu Asp Ile Asp Glu Thr Glu Tyr His Ala Asp

865 870 875 880

Gly Gly Lys Val Pro Ile Lys Trp Met Ala Leu Glu Ser Ile Leu Arg

885 890 895

Arg Arg Phe Thr His Gln Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr Val

900 905 910

Trp Glu Leu Met Thr Phe Gly Ala Lys Pro Tyr Asp Gly Ile Pro Ala

915 920 925

Arg Glu Ile Pro Asp Leu Leu Glu Lys Gly Glu Arg Leu Pro Gln Pro

930 935 940

Pro Ile Cys Thr Ile Asp Val Tyr Met Ile Met Val Lys Cys Trp Met

945 950 955 960

Ile Asp Ser Glu Cys Arg Pro Arg Phe Arg Glu Leu Val Ser Glu Phe

965 970 975

Ser Arg Met Ala Arg Asp Pro Gln Arg Phe Val Val Ile Gln Asn Glu

980 985 990

Asp Leu Gly Pro Ala Ser Pro Leu Asp Ser Thr Phe Tyr Arg Ser Leu

995 1000 1005

Leu Glu Asp Asp Asp Met Gly Asp Leu Val Asp Ala Glu Glu Tyr

1010 1015 1020

Leu Val Pro Gln Gln Gly Phe Phe Cys Pro Asp Pro Ala Pro Gly

1025 1030 1035

Ala Gly Gly Met Val His His Arg His Arg Ser Ser Ser Thr Arg

1040 1045 1050

Ser Gly Gly Gly Asp Leu Thr Leu Gly Leu Glu Pro Ser Glu Glu

1055 1060 1065

Glu Ala Pro Arg Ser Pro Leu Ala Pro Ser Glu Gly Ala Gly Ser

1070 1075 1080

Asp Val Phe Asp Gly Asp Leu Gly Met Gly Ala Ala Lys Gly Leu

1085 1090 1095

Gln Ser Leu Pro Thr His Asp Pro Ser Pro Leu Gln Arg Tyr Ser

1100 1105 1110

Glu Asp Pro Thr Val Pro Leu Pro Ser Glu Thr Asp Gly Tyr Val

1115 1120 1125

Ala Pro Leu Thr Cys Ser Pro Gln Pro Glu Tyr Val Asn Gln Pro

1130 1135 1140

Asp Val Arg Pro Gln Pro Pro Ser Pro Arg Glu Gly Pro Leu Pro

1145 1150 1155

Ala Ala Arg Pro Ala Gly Ala Thr Leu Glu Arg Pro Lys Thr Leu

1160 1165 1170

Ser Pro Gly Lys Asn Gly Val Val Lys Asp Val Phe Ala Phe Gly

1175 1180 1185

Gly Ala Val Glu Asn Pro Glu Tyr Leu Thr Pro Gln Gly Gly Ala

1190 1195 1200

Ala Pro Gln Pro His Pro Pro Pro Ala Phe Ser Pro Ala Phe Asp

1205 1210 1215

Asn Leu Tyr Tyr Trp Asp Gln Asp Pro Pro Glu Arg Gly Ala Pro

1220 1225 1230

Pro Ser Thr Phe Lys Gly Thr Pro Thr Ala Glu Asn Pro Glu Tyr

1235 1240 1245

Leu Gly Leu Asp Val Pro Val

1250 1255

Claims

1.靶向HER2蛋白的多肽，其特征在于，所述多肽为SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

2.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括连接有权利要求1所述的多肽的细胞毒性药物。

3.根据权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。

4.权利要求1所述的多肽和/或权利要求2或3所述的药物组合物在制备疾病治疗药物中的应用；

所述疾病为HER2过表达的乳腺癌。