CN112661812B - 一种kk-lc-1抗原靶向结合肽及其衍生物、探针与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种KK‑LC‑1抗原靶向结合肽及其衍生物、探针与应用，KK‑LC‑1抗原靶向结合肽的序列为SEQ ID No.1：CKNTALTTC，其空间结构为环九肽，有9个氨基酸残基组成，且由首尾两端半胱氨酸形成二硫键连接，能够特异性地结合KK‑LC‑1抗原蛋白分子，亦可在体内、体外环境中结合KK‑LC‑1表达阳性的肿瘤细胞。经多水平、多对照的体内体外水平实验验证，本发明公开的KK‑LC‑1抗原靶向结合肽及其衍生物、探针具有明确而显著的KK‑LC‑1结合能力，可在胃癌、肺癌、乳腺癌、恶性黑色素瘤等疾病的病理诊断、影像诊断和抗肿瘤治疗药物中应用。

Description

一种KK-LC-1抗原靶向结合肽及其衍生物、探针与应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种KK-LC-1抗原靶向结合肽及其衍生物、探针与应用。

背景技术

胃癌是全世界范围内发病率最高的癌症之一，也是我国最常见的消化系统肿瘤之一。胃癌的发病具有明显的地域性，以中国为首的东亚是发病率最高的地区。胃癌的5年相对生存期在20%左右，男性的发病率是女性的1.5～2.5倍。大约 90%的胃癌属于腺癌，可分为两个主要类型：（1）肠型胃癌，分化较好，在男性、老年患者中更常见。（2）弥漫型胃癌，分化不好，在男性与女性中发病率更接近，在年轻患者中更常见。随着胃癌早诊意识及诊断技术的不断进步，胃癌的整体发病率在下降，同时其 5 年生存率也有较为明显的提高，平均为20%-40%，其中我国为 30%-40%。尽管胃癌生存率在逐渐提高，但是胃癌仍是严重危害我国人民健康的主要疾病之一。据全国肿瘤登记中心数据显示，2015年我国新发胃癌例数约为68万例，死亡病例约50万例，同时数据显示我国胃癌发病呈年轻化趋势。

胃癌具有复杂的发生发展过程，目前虽有大量研究成果，但发病机制不甚明了。胃癌复杂发病机制及高度异质性使其治疗尤为困难。胃癌的传统治疗方式有手术、化疗、放疗。手术依旧为治疗的首选，但对于进展期胃癌来说，手术很难彻底清除癌肿，术后的复发转移率高。手术治疗获益有限。晚期胃癌的主要治疗手段是化疗，虽然全球的优化方案尚未确定，但经多年的研究发展，亚洲以氟尿嘧啶联合铂类为基础的两药联合的化疗体系已成熟，多种化疗药物联合治疗体现出良好的治疗效果。然而疾病缓解率低、患者耐受能力差、药物耐药以及毒副作用大等缺点使得化疗进入治疗瓶颈。

近年，靶向治疗在恶性肿瘤的治疗中取得重大成果，IMAB362、MET、EGFR、HER2等多种靶点被发现，多种靶向药物接连上市。靶向治疗疗效肯定，但是胃癌相关靶向治疗相对进展缓慢，至今用于临床的靶点只有HER2及VEGFR。研究者仍在不断寻找新的治疗方法。

有研究发现，最初从肺癌中发现的肿瘤抗原北九州肺癌抗原1（Kita-kyushu lungcancer antigen 1，KK-LC-1），作为一种独特的肿瘤抗原，只在部分肿瘤和人的部分生殖细胞表面表达，而在人的其它正常细胞中不表达是一种经典的癌-睾抗原蛋白。后续的研究表明，KK-LC-1在胃癌、肺癌、乳腺癌和恶性黑色素瘤等多种肿瘤细胞中均有较高表达水平，是有着极强应用前景的抗肿瘤分子靶点。

通过特定的肽分子靶向结合肿瘤细胞表面的KK-LC-1抗原，有着极大的临床应用潜力。相较与抗体而言，靶向结合肽分子更小，显像背景清楚更快、肿瘤渗透性更好、更不容易在肝脏中蓄积。因此，研发肿瘤靶向结合肽对以胃癌为首的多种肿瘤的诊疗具有重要临床应用价值。

发明内容

本发明公开了一种KK-LC-1抗原靶向结合肽及其衍生物、探针与应用，分别从蛋白水平、体外细胞水平和体内实验动物水平验证了KK-LC-1抗原靶向结合肽的肿瘤特异性结合能力。该KK-LC-1抗原靶向结合肽可特异性结合KK-LC-1抗原蛋白，利用荧光示踪剂标记靶向结合肽形成荧光探针，在体内外实验中可高效靶向KK-LC-1表达阳性的胃癌细胞。通过放射性核素⁶⁸Ga标记靶向结合肽形成放射性核素探针，在PET/CT动物活体成像中可明确显示肿瘤病灶，揭示了该靶向结合肽良好的肿瘤靶向性和诊疗一体化应用前景。本发明为制备以胃癌为首的多种肿瘤诊断相关试剂、肿瘤靶向治疗药物等提供了新的途径。

一种KK-LC-1抗原靶向结合肽，KK-LC-1抗原靶向结合肽的序列为SEQ ID No.1：CKNTALTTC，其空间结构为环九肽，有9个氨基酸残基组成，且由首尾两端半胱氨酸形成二硫键连接；KK-LC-1抗原靶向结合肽能够特异性地结合于肿瘤分子标志物KK-LC-1。

KK-LC-1抗原靶向结合肽的衍生物包括噬菌体、荧光染料偶联产物、螯合物、放射性核素络合物偶联产物。

荧光标记探针，由KK-LC-1抗原靶向结合肽与荧光染料偶联得到。

放射性核素标记探针，由KK-LC-1抗原靶向结合肽与螯合物偶联，再与放射性金属离子形成络合物。

本发明还保护KK-LC-1抗原靶向结合肽作为制备胃癌肿瘤靶向药物的应用。

本发明还保护KK-LC-1抗原靶向结合肽的衍生物作为制备胃癌肿瘤靶向药物的应用。

本发明还保护荧光标记探针在胃癌肿瘤诊断或治疗药物中的应用。

本发明还保护放射性核素标记探针在胃癌肿瘤诊断或治疗药物中的应用。

本发明的靶向结合肽氨基酸序列如SEQ ID No：1所示，为9个氨基酸长度的环形短肽，N端及C端由半胱氨酸形成二硫键，分子量小，合成工艺简单，成本低。

本发明的靶向结合肽特异性结合KK-LC-1表达阳性的胃癌组织但不限于胃癌，如还可特异性结合其他表达KK-LC-1阳性的肺癌、乳腺癌、恶性黑色素瘤等肿瘤组织，不限制肿瘤类型。

本发明公开了KK-LC-1抗原靶向结合肽在肽类制剂肿瘤诊断方面的用途，尤其是作为肿瘤病理诊断检测探针和肿瘤靶向分子显像探针应用。

本发明公开了KK-LC-1抗原靶向结合肽在制备肿瘤靶向治疗药物制剂方面的用途，包括靶向结合肽偶联抗肿瘤分子、肿瘤靶向纳米载药系统等方面的应用。

进一步地，本发明公开了一种红色荧光探针，将本发明KK-LC-1抗原靶向结合肽与荧光染料罗丹明B（Rhodamine B，RhoB）化学偶联后形成探针，在体外细胞免疫荧光、体内生物分布实验中，荧光标记肽显示出对KK-LC-1阳性肿瘤细胞及组织的良好靶向性，并在体内可富集于肿瘤部位而非正常器官。

进一步地，本发明还公开了一种⁶⁸Ga放射性核素标记探针，将本发明KK-LC-1抗原靶向结合肽通过化学合成连接1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸（1，4，7，10-Tetraazacyclododecane-1，4，7，10-tetraacetic Acid，DOTA），再与放射性核素形成络合物，将此核素探针静脉注射于荷瘤小鼠，PET/CT显示核素探针对KK-LC-1阳性的胃癌皮下移植瘤具有良好的靶向聚集性。

本发明提供的KK-LC-1抗原靶向结合肽可利用本领域已知方法生产，可利用细胞的方法和无细胞体外转录/翻译方法生产肽，也可利用本领域已知的技术进行合成，如液相法、固相法等进行化工合成。

本发明提供的KK-LC-1抗原靶向结合肽，由噬菌体展示文库技术淘选及鉴定获得，经过肿瘤靶向性验证，具有针对KK-LC-1表达阳性的胃癌良好靶向性，可与现有抗肿瘤药物、载药系统及分子显像剂等连接或联合应用，实现肿瘤诊疗新方法。

附图说明

图1：RhoB-P1131荧光探针和RhoB-CG7C荧光探针在NUGC-4细胞表面的结合情况。

图2：RhoB-P1131荧光探针和RhoB-CG7C荧光探针在NUGC-4细胞表面结合的定量统计图。

图3：RhoB-P1131荧光探针和RhoB-CG7C荧光探针在小鼠体内生物分布情况。

图4：⁶⁸Ga-DOTA-P1131放射性核素探针在小鼠体内生物分布。

具体实施方式

以下结合实施例及附图进一步详细描述本发明。然而应当理解，这些实施例只是为起说明作用，而非用于限制本发明。在本发明的构思前提下对本发明生物淘选KK-LC-1靶向结合肽及制备荧光探针和放射性核素探针的简单改造，均属本发明要求保护的范围。

本发明所涉及的靶向结合肽P1131及其化学偶联靶向结合肽RhoB-P1131、DOTA-P1131通过化学合成得到。下述实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明均为常规方法，所用的试剂、方法和设备，如无特殊说明均为本技术领域常规试剂、方法和设备。

实施例1：RhoB-P1131荧光探针在细胞表面的结合验证

1.使用化学合成的方法获得靶向结合肽RhoB-P1131荧光探针，并化学合成阴性对照肽CG7C（序列为CGGGGGGGC，首尾两端形成二硫键为环肽）并标记RhoB，获得荧光探针RhoB-CG7C。

2.将表达KK-LC-1阳性的胃癌细胞株NUGC-4在实验室中培养并贴壁。铺于细胞培养板上。封闭后与荧光探针孵育结合，之后洗去未结合的探针，并使用4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（4’， 6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染料进行细胞核染色。

3.在高精度的荧光显微镜下观察细胞培养板的荧光情况。并用Image J软件对RhoB荧光进行定量分析。如图1所示，对比阴性对照，RhoB-P1131荧光探针对于NUGC-4细胞膜表面有着显著的结合。

图1为RhoB-P1131荧光探针和RhoB-CG7C荧光探针在NUGC-4细胞表面的结合情况。RhoB-P1131对于NUGC-4细胞表面有着显著的结合，而RhoB-CG7C肽则无显著结合。图2的定量统计图也印证了RhoB-P1131的优秀靶向能力。

实施例2：RhoB-P1131荧光探针在小鼠体内生物分布

1.使用化学合成的方法获得靶向结合肽RhoB-P1131荧光探针，并化学合成阴性对照肽CG7C（序列为CGGGGGGGC，首尾两端形成二硫键为环肽）并标记RhoB，获得荧光探针RhoB-CG7C。

2.将NUGC-4细胞株培养至贴壁，选取4周龄裸鼠，于裸鼠腹股沟处皮下接种10⁶以上个细胞，并观察数日，直到肿瘤生长成团块状。

3.以尾静脉注射的方式为荷瘤鼠注射RhoB-P1131荧光探针和RhoB-CG7C荧光探针。注射后麻醉并处死裸鼠，取其肿瘤、脑、心、肺、肝、胃、肠、肾、膀胱按病理标准制成石蜡切片。

4.以DAPI染料染切片，并在高精度的荧光显微镜下观察切片的荧光情况。如图2所示，RhoB-P1131荧光探针可以靶向性富集与肿瘤组织中，而在正常组织中富集很少。

图3为RhoB-P1131荧光探针和RhoB-CG7C荧光探针在小鼠体内生物分布情况。图中可见，RhoB-P1131荧光探针对于肿瘤组织切片有着显著的结合，而对其它正常组织没有结合。

实施例3：⁶⁸Ga-DOTA-P1131放射性核素探针在小鼠体内生物分布

1.通过化学合成方法，获得螯合物DOTA分子修饰的DOTA-P1131肽复合物。

2.将NUGC-4细胞株培养至贴壁，选取4周龄裸鼠，于裸鼠右侧肩部皮下接种10⁶以上个细胞，并观察数日，直到肿瘤生长成团块状。

3.通过NaAc缓冲体系配置肽复合物溶液。向锗-镓发生器推注超纯盐酸溶液以获得⁶⁸Ga离子溶液，在高温条件下与肽复合物溶液反应以获得⁶⁸Ga-DOTA-P1131放射性核素探针溶液。

4.以尾静脉注射的方式为荷瘤鼠注射⁶⁸Ga-DOTA-P1131放射性核素探针，注射后麻醉，并于30分钟、60分钟和120分钟时间点将荷瘤鼠置于PET/CT机器中成像。成像如图4所示，可见放射性核素探针能够特异性于肿瘤部位有效富集，显示了其作为临床诊疗药物的优秀潜力。

图4为⁶⁸Ga-DOTA-P1131放射性核素探针在小鼠体内生物分布。可见放射性核素探针能够特异性于肿瘤部位有效富集，显示了其作为临床诊疗药物的优秀潜力。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上的限制，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，依据本发明的技术实质，对以上实施例所作的任何简单的修改、等同替换与改进等，均仍属于本发明技术方案的保护范围之内。

序列表

<110> 南京鼓楼医院

<120> 一种KK-LC-1抗原靶向结合肽及其衍生物、探针与应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列 (Artificial Sequence)

<400> 1

Cys Lys Asn Thr Ala Leu Thr Thr Cys

1 5

Claims (6)

1.一种KK-LC-1抗原靶向结合肽，其特征在于：KK-LC-1抗原靶向结合肽的序列为SEQID No.1：CKNTALTTC，其空间结构为环九肽，有9个氨基酸残基组成，且由首尾两端半胱氨酸形成二硫键连接；KK-LC-1抗原靶向结合肽能够特异性地结合于肿瘤分子标志物KK-LC-1。

2.权利要求1所述的KK-LC-1抗原靶向结合肽的衍生物，其特征在于：KK-LC-1抗原靶向结合肽的衍生物包括噬菌体、荧光染料偶联产物、螯合物、放射性核素络合物偶联产物。

3.一种荧光标记探针，其特征在于：由权利要求1所述的KK-LC-1抗原靶向结合肽与荧光染料偶联得到。

4.一种放射性核素标记探针，其特征在于，由权利要求1所述的KK-LC-1抗原靶向结合肽与螯合物偶联，再与放射性金属离子形成络合物。

5.权利要求1所述的KK-LC-1抗原靶向结合肽在制备胃癌肿瘤靶向药物中的应用。

6.权利要求2所述的KK-LC-1抗原靶向结合肽的衍生物在制备胃癌肿瘤靶向药物中的应用。

Images