JP6028253B2

JP6028253B2 - 癌細胞の検出方法及び癌細胞検出キット

Info

Publication number: JP6028253B2
Application number: JP2015014586A
Authority: JP
Inventors: 隆福山; 嘉伸市来; 等山▲崎▼; 憲忠小林; 瑠衣山村
Original assignee: Kitasato Institute
Current assignee: Kitasato Institute
Priority date: 2015-01-28
Filing date: 2015-01-28
Publication date: 2016-11-16
Anticipated expiration: 2035-01-28
Also published as: JP2016138840A

Description

本発明は、癌細胞の検出方法及び癌細胞検出キットに関する。

癌／精巣抗原は、癌細胞と精巣以外では発現が認められないタンパク質の総称である。癌／精巣抗原の１つであるＫｉｔａｋｙｕｓｈｕｌｕｎｇｃａｎｃｅｒａｎｔｉｇｅｎ−１（以下、「ＫＫ−ＬＣ−１」という。）は、肺癌細胞株が特異的に発現する抗原として同定されたものである（例えば、非特許文献１を参照。）。

Identification of a new cancer/germline gene, KK-LC-1, encoding an antigen recognized by autologous CTL induced on human lung adenocarcinoma. Fukuyama T, Hanagiri T, Takenoyama M, Ichiki Y, Mizukami M, So T, Sugaya M, So T, Sugio K, Yasumoto K. Cancer Res. 2006 May 1;66(9):4922-8.

しかしながら、ＫＫ−ＬＣ−１の細胞内での局在は不明であった。そこで、本発明は、ＫＫ−ＬＣ−１の局在を明らかにし、より高精度に癌細胞を検出することができる、癌細胞の検出方法を提供することを目的とする。本発明はまた、より高精度に癌細胞を検出することができる、癌細胞検出キットを提供することを目的とする。

本発明は、以下の通りである。
（１）生体試料中の癌細胞の検出方法であって、Ｃ末端領域を細胞外に露出した形態で細胞膜表面上に局在するＫＫ−ＬＣ−１タンパク質を検出する工程を備える、癌細胞の検出方法。
（２）（１）に記載の癌細胞の検出方法に用いられる癌細胞検出キットであって、ＫＫＬＣ−１タンパク質に対する抗体又はアプタマーを備える、キット。
（３）前記抗体又は前記アプタマーが、ポジトロン核種で標識されている、（２）に記載のキット。

本発明により、より高精度に癌細胞を検出することができる、癌細胞の検出方法及び癌細胞検出キットを提供することができる。

発現ベクターがコードするＫＫ−ＬＣ−１融合タンパク質の構造を示す模式図である。ウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。（ａ）及び（ｂ）は、フローサイトメトリーの結果を示すグラフである。（ａ）は、ＫＫ−ＬＣ−１融合タンパク質の構造を示す模式図である。（ｂ）及び（ｃ）は、動物細胞におけるＫＫ−ＬＣ−１融合タンパク質の存在状態を示す模式図である。

（癌細胞の検出方法）
１実施形態において、本発明は、細胞膜表面上に存在するＫＫ−ＬＣ−１タンパク質の発現を検出する工程を備える癌細胞の検出方法を提供する。

後述するように、発明者らは、ＫＫ−ＬＣ−１タンパク質がＣ末端領域を細胞外に露出した形態で細胞膜表面上に局在していることを明らかにした。

したがって、細胞膜表面上に存在するＫＫ−ＬＣ−１タンパク質の発現を検出する手法により、ＫＫ−ＬＣ−１タンパク質を検出することができる。例えば、ＫＫ−ＬＣ−１に対する抗体又はアプタマーを用いて生体試料中の細胞を染色することによりＫＫ−ＬＣ−１タンパク質の発現を検出することができる。

なお、本明細書において、「抗体」は、抗体及び抗体誘導体を含む。抗体誘導体としては、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメント等の抗体断片、ｓｃＦｖ等の１本鎖抗体等が挙げられる。

ＫＫ−ＬＣ−１に対する抗体は、定法により、ＫＫ−ＬＣ−１タンパク質又はその部分ペプチドを抗原として、動物を免疫すること等により作製することができる。

ＫＫ−ＬＣ−１に対する抗体は、蛍光色素、放射性同位元素等で標識されていてもよい。これにより、ＫＫ−ＬＣ−１タンパク質の発現の検出が容易になる。

ＫＫ−ＬＣ−１に対する抗体は、ヒト化されていてもよい。ヒト化された抗体は、ヒトに投与することができるため、抗体医薬としての応用も可能になる。

また、アプタマーとしては、例えばＤＮＡアプタマーが挙げられる。ＫＫ−ＬＣ−１タンパク質に対するＤＮＡアプタマーは、例えば、ＳＥＬＥＸ（ＳｙｓｔｅｍａｔｉｃＥｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆＬｉｇａｎｄｓｂｙＥＸｐｏｎｅｎｔｉａｌｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）法等の定法により、ＫＫ−ＬＣ−１タンパク質に対する結合能を指標として、ランダム配列の核酸ライブラリー等から選別することができる。

本実施形態の検出方法により検出可能な癌細胞としては、例えば、胃癌、肺癌、乳癌、大腸癌、食道癌、膵臓癌、胆道癌、胆嚢癌、十二指腸癌、大腸癌、肝癌、脳腫瘍、子宮癌、卵巣癌、白血病、骨肉腫、中皮腫等が挙げられる。

本実施形態に係る癌細胞の検出方法は、生体試料を対象に実施されてもよく、生体内で実施されてもよい。生体試料を対象に実施する場合には、例えば、フローサイトメトリー、組織染色、ウエスタンブロッティング等により実施することができる。

また、生体内で実施される場合には、例えば、ポジトロン断層法（ＰＥＴ）により実施することができる。例えば、ＫＫ−ＬＣ−１遺伝子の発現を指標として、遺伝子レベルで癌細胞の検出を行う場合には、生体組織を採取する必要があり、これは侵襲を伴うものである。これに対し、ＰＥＴ等の方法によれば、低侵襲で高精度に癌細胞の検出を行うことができる。

ＰＥＴとは、陽電子（ポジトロン）の検出を利用したコンピューター断層撮影技術である。ＰＥＴ診断に用いられるポジトロン核種としては、^１１Ｃ（半減期２０．４分）、^１３Ｎ（半減期９．９７分）、^１５Ｏ（半減期２．０４分）、^１８Ｆ（半減期１０９．８分）、^６４Ｃｕ（半減期１２．７時間）、^８９Ｚｒ（半減期７８．９１時間）等が挙げられる。

上記の抗体やアプタマーを、上記のいずれかのポジトロン核種で標識することにより、ＫＫ−ＬＣ−１タンパク質特異的なポジトロン断層法用プローブ（ＰＥＴ用プローブ）を製造することができる。

抗体やアプタマーをポジトロン核種で標識する方法としては、例えば、ＤＯＴＡ（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラ酢酸）等のキレート剤を抗体やアプタマーに結合させ、続いて、ＤＯＴＡに^６４Ｃｕ等のポジトロン核種をキレートさせる方法等が挙げられる。抗体やアプタマーにＤＯＴＡを結合させる方法としては、例えば、抗体やアプタマーとＤＯＴＡ−ＮＨＳ（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）エステルとを反応させる方法等が挙げられる。

ＫＫ−ＬＣ−１タンパク質は、正常細胞ではほとんど発現が見られない一方、各種癌細胞において高発現している。今回、発明者らがＫＫ−ＬＣ−１タンパク質の局在を明らかにしたことから、本実施形態の検出方法により、高精度に癌細胞を検出することができる。

（癌細胞の検出キット）
一実施形態において、本発明は、ＫＫ−ＬＣ−１に対する抗体又はアプタマーを備える癌細胞検出キットを提供する。ＫＫ−ＬＣ−１に対する抗体としては、上述したものを使用することができる。

本実施形態に係る癌細胞検出キットは、ポジトロン核種で標識されたＰＥＴ用プローブであってもよい。本実施形態に係る癌細胞検出キットをＰＥＴ用プローブとして用いることにより、低侵襲で高精度に癌細胞を検出することができる。

次に実験例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実験例に限定されるものではない。

［実験例１：ＫＫ−ＬＣ−１タンパク質の構造予測］
ＫＫ−ＬＣ−１タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１）をもとに、以下の複数のプログラムを用いてその構造を予測した。

（「ＳＯＳＵＩ」による検討）
プログラム「ＳＯＳＵＩ」（http://harrier.nagahama-i-bio.ac.jp/sosui/sosui_submit.html）を用いた検討を行った。その結果、Ｎ末端から２０残基が膜貫通ドメインであることが予測された。

（「Ｅｕｋ−ｍＰＬｏｃ２．０」による検討）
プログラム「Ｅｕｋ−ｍＰＬｏｃ２．０」（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/euk-multi-2/）を用いた検討を行った。その結果、ＫＫ−ＬＣ−１タンパク質は細胞膜に局在するタンパク質であることが予測された。

（「ＢａＣｅｌＬｏ」による検討）
プログラム「ＢａＣｅｌＬｏ」（http://gpcr.biocomp.unibo.it/bacello/pred.htm）を用いた検討を行った。その結果、ＫＫ−ＬＣ−１タンパク質は分泌タンパク質であることが予測された。

（「ＣＥＬＬＯ」による検討）
プログラム「ＣＥＬＬＯ」（http://cello.life.nctu.edu.tw/）を用いた検討を行った。その結果、ＫＫ−ＬＣ−１タンパク質は、細胞外又は細胞膜に局在するタンパク質であることが予測された。

以上の結果から、ＫＫ−ＬＣ−１タンパク質は、Ｎ末端から２０残基の領域に膜貫通ドメインを有し、細胞外に表出するタンパク質又は分泌タンパク質であることが予測された。

［実験例２：ＫＫ−ＬＣ−１融合タンパク質の発現ベクターの作製］
ＫＫ−ＬＣ−１タンパク質をコードする塩基配列（配列番号２）をもとに、ＫＫ−ＬＣ−１融合タンパク質の発現ベクターを作製した。

図１は、作製した発現ベクターがコードするＫＫ−ＬＣ−１融合タンパク質の構造を示す模式図である。具体的には、Ｃ末端にＶ５タグを有し、Ｎ末端にはタグを有しないＫＫ−ＬＣ−１融合タンパク質（以下、「ｎｏｆｌａｇ」という。）、Ｃ末端にＶ５タグを有し、Ｎ末端に１×ｆｌａｇタグを有するＫＫ−ＬＣ−１融合タンパク質（以下、「１×ｆｌａｇ」という。）、及び、Ｃ末端にＶ５タグを有し、Ｎ末端に３×ｆｌａｇタグを有するＫＫ−ＬＣ−１融合タンパク質（以下、「３×ｆｌａｇ」という。）の発現ベクターを作製した。なお、各Ｖ５タグの下流には、ヒスチジンタグ（図１において、「Ｈｉｓ×６」と示す。）も付加されていた。

［実験例３：ウエスタンブロッティングによるＫＫ−ＬＣ−１融合タンパク質の発現解析］
上述した各発現ベクターを、ヒト胃腺癌細胞株であるＡＧＳ細胞に導入して発現させ、４８時間後にＫＫ−ＬＣ−１融合タンパク質の発現を解析した。

ＫＫ−ＬＣ−１融合タンパク質を発現させた結果、動物細胞が培養皿から剥離して浮遊する現象が見られた。そこで、培養皿に接着した細胞及び浮遊した細胞をそれぞれ回収し、Ｖ５タグに対する抗体（抗Ｖ５抗体）を用いたウエスタンブロッティングを行い、ＫＫ−ＬＣ−１融合タンパク質の発現を確認した。陰性対照として、発現ベクターを導入していないＡＧＳ細胞を用いた。また、陽性対照として、抗β−アクチン抗体を用いてβ−アクチンタンパク質の検出も行った。

図２は、ウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。その結果、ＡＧＳ細胞がＫＫ−ＬＣ−１融合タンパク質を発現したことが確認された。更に、ＫＫ−ＬＣ−１融合タンパク質の発現量は、培養皿に接着した細胞よりも、浮遊した細胞においてより高い傾向が認められた。

［実験例４：フローサイトメトリーによるＫＫ−ＬＣ−１融合タンパク質の発現解析］
上述したＫＫ−ＬＣ−１融合タンパク質の発現ベクター（３×ｆｌａｇ）をヒト胃腺癌細胞株であるＡＧＳ細胞に導入して発現させた。続いて、遺伝子導入から４８時間後に、細胞を抗Ｖ５抗体で染色してフローサイトメトリーにより解析し、ＫＫ−ＬＣ−１融合タンパク質の発現を確認した。

図３（ａ）及び（ｂ）は、フローサイトメトリーの結果を示すグラフである。図３（ａ）は、対照として、発現ベクターを導入していないＡＧＳ細胞を、染色せずに解析した結果を示すグラフであり、横軸に蛍光強度を、縦軸に細胞数を示す。グラフ中の数字は、グラフ中の線で示した領域の細胞の存在割合（％）を示す。

図３（ｂ）左欄は、対照として、発現ベクターを導入していないＡＧＳ細胞を、抗Ｖ５抗体で染色して解析した結果を示すグラフであり、横軸に蛍光強度を、縦軸に細胞数を示す。グラフ中の数字は、グラフ中の線で示した領域の細胞の存在割合（％）を示す。

図３（ｂ）中欄は、発現ベクターを導入したＡＧＳ細胞のうち、培養皿に接着していた細胞を、抗Ｖ５抗体で染色して解析した結果を示すグラフであり、横軸に蛍光強度を、縦軸に細胞数を示す。グラフ中の数字は、グラフ中の線で示した領域の細胞の存在割合（％）を示す。

図３（ｂ）右欄は、発現ベクターを導入したＡＧＳ細胞のうち、培養皿から浮遊した細胞を、抗Ｖ５抗体で染色して解析した結果を示すグラフであり、横軸に蛍光強度を、縦軸に細胞数を示す。グラフ中の数字は、グラフ中の線で示した領域の細胞の存在割合（％）を示す。

その結果、抗体で細胞表面を染色することにより、ＫＫ−ＬＣ−１融合タンパク質の発現を検出することができた。図３（ｂ）右欄に示すように、ＫＫ−ＬＣ−１融合タンパク質の発現は、浮遊した細胞において特に顕著であった。

抗Ｖ５抗体を用いてＫＫ−ＬＣ−１融合タンパク質の発現を検出することができたことから、ＫＫ−ＬＣ−１は、Ｃ末端側を細胞の外部に露出した状態で細胞膜表面上に存在することが明らかとなった。

これについて説明する。図４（ａ）は、ＫＫ−ＬＣ−１融合タンパク質（３×ｆｌａｇ）４００の構造を示す模式図である。ＫＫ−ＬＣ−１融合タンパク質４００は、Ｎ末端に３×ｆｌａｇタグ４１０を有し、その下流に膜貫通ドメイン４２０を有し、Ｃ末端にＶ５タグ４３０を有している。

図４（ｂ）は、ＫＫ−ＬＣ−１融合タンパク質が、Ｃ末端側を細胞の外部に露出した状態で細胞膜表面上に存在すると仮定した場合の、動物細胞におけるＫＫ−ＬＣ−１融合タンパク質の存在状態を示す模式図である。ＫＫ−ＬＣ−１融合タンパク質が、このような状態で存在すれば、抗Ｖ５抗体による染色により、細胞が染色されると考えられる。

一方、図４（ｃ）は、ＫＫ−ＬＣ−１融合タンパク質が、Ｃ末端側を細胞の内側に向けた状態で細胞膜表面上に存在すると仮定した場合の、動物細胞におけるＫＫ−ＬＣ−１融合タンパク質の存在状態を示す模式図である。ＫＫ−ＬＣ−１融合タンパク質が、このような状態で存在すれば、抗Ｖ５抗体で染色しても、細胞は染色されないと考えられる。

したがって、抗Ｖ５抗体を用いたフローサイトメトリー解析により、ＫＫ−ＬＣ−１融合タンパク質の発現を検出することができたことは、ＫＫ−ＬＣ−１タンパク質がＣ末端側を細胞の外部に露出した状態で細胞膜表面上に存在することを示す。

以上の結果から、細胞膜表面上に存在するＫＫ−ＬＣ−１タンパク質の発現を検出することにより、癌細胞を高精度に検出することができることが示された。

４００…ＫＫ−ＬＣ−１融合タンパク質、４１０…３×ｆｌａｇタグ、４２０…膜貫通ドメイン、４３０…Ｖ５タグ。

Claims

生体試料中の癌細胞の検出方法であって、Ｃ末端領域を細胞外に露出した形態で細胞膜表面上に局在するＫＫ−ＬＣ−１タンパク質を検出する工程を備える、癌細胞の検出方法。
請求項１に記載の癌細胞の検出方法に用いられる癌細胞検出キットであって、ＫＫ−ＬＣ−１タンパク質に対する抗体又はアプタマーを備える、キット。
前記抗体又は前記アプタマーが、ポジトロン核種で標識されている、請求項２に記載のキット。