KR101679245B1

KR101679245B1 - 상피성장인자 수용체를 표적으로 하는 암 진단 또는 영상화용 조성물

Info

Publication number: KR101679245B1
Application number: KR1020140175579A
Authority: KR
Inventors: 민정준; 김학성; 김동연
Original assignee: 전남대학교산학협력단
Priority date: 2014-12-09
Filing date: 2014-12-09
Publication date: 2016-11-25
Also published as: KR20160069689A

Abstract

본 발명은 보다 경제적이고 효율적인 암진단 및 암환자의 동반진단을 위하여, 항-EGFR 리피바디에 조영용 화합물이 공유결합 또는 비공유결합으로 결합된 복합체를 유효성분으로 함유하는 EGFR의 과발현 또는 비정상적인 활성화를 특징으로 갖고 있는 암의 진단 및 영상화용 조성물을 제공한다.

Description

상피성장인자 수용체를 표적으로 하는 암 진단 또는 영상화용 조성물{A composition for diagnosing or imaging cancer targeting epidermal growth factor receptor}

본 발명은 진단 또는 영상화용 조성물에 관한 것으로서, 더 상세하게는 상피성장인자 수용체를 표적으로 하는 신규 진단 또는 영상화용 조성물에 관한 것입니다.

상피성장인자 수용체(epidermal growth factor receptor, 이하, 'EGFR'로 약칭함)는 세포 표면에 존재하는 수용체 타이로신 키아나제(receptor tyrosine kinase, 이하, 'RTK'로 약칭함)의 일원인 수용체 단백질로서 상피성장인자(epdermal growth factor, 이하, 'EGF'로 약칭함) 및 형질전환 성장인자 α(transforming growth factor α, 이하, 'TGFα'를 포함하는 특이적 리간드의 결합에 의해 활성화가 된다. EGFR는 리간드의 결합에 의해 일단 활성화가 되면, 비활성화된 형태인 단량체에서 활성화 형태인 이량체로 변환과정을 거치게 되고, 이량체가 된 EGRF은 세포질내 존재하는 인산화 도메인(cytoplasmic kinase domain)에 의한 자가인산화 과정을 거쳐, PI3K, MAPK 등 하위 신호전달과정을 활성화시킴으로써, 세포의 성장, 증식, 분화 등 다양한 생물학적 변화를 야기한다. EGFR의 과발현 또는 비정상적인 활성화가 악성종양의 발생 및 발달에 밀접한 관련이 있다고 보고된 바 있다. EGFR의 과잉발현은, 예컨대 특정 암인, 폐암, 유방암, 대장암, 위암, 뇌암, 방광암, 두경부암, 난소암 및 전립선암에서 관찰되었고, 상피성장인자(epidermal growth factor, 이하 'EGF'로 약칭함)는 EGFR에 결합하여 세포증식과 종양성장을 유도하는 것으로 입증되었다. 따라서, EGFR에 대한 항체를 사용하여 EGFR을 과잉 발현하는 종양세포에 EGF가 결합하는 것을 저해하면 암세포의 성장을 억제하여 암을 치료할 수 있다는 가정 하에 다양한 EGFR에 특이적으로 결합하여 이를 억제할 수 있는 다양한 항체 치료제들이 개발되어 왔다. 뿐만 아니라, EGFR의 과잉발현을 검출함으로써 암을 조기에 진단하거나 항암제의 치료효과를 검증하기 위한 동반진단을 위한 표적으로 EGFR의 가치를 주목하고 있다.

이러한, EGFR에 대한 특이적 진단용 조성물의 예로는 미국 FDA 승인된 것을 기준으로 Dako North America사에서 판매중은 DAKO EGRF PharmDx kit 및 Qiagen사의 theracreen EGFR RGQ PCT kit가 존재한다.

그러나, 상기 진단용 조성물의 경우 항체를 사용하거나 실시간 PCR 기술을 사용하고 있는데, 전자의 경우에는 항체 기반의 진단용 시약으로서 하이브리도마세포의 제조 등 복잡한 생산 공정으로 인한 높은 제품단가로 인하여 진단시 비용이 많이 소요되는 단점이 있고, 후자의 경우 매우 민감한 기술이긴 하나 가-양성(false-positive)나 가-음성(false-negative)의 결과를 산출할 수 있으며, 시료의 오염에 민감하다는 단점을 가지고 있다. 뿐만 아니라, 양 제품 모두 시험관내 분석에만 사용될 수 있을 뿐, 암 치료효과의 모니터링을 위한 동반진단에는 사용될 수 없다는 단점을 가지고 있다. 따라서, 항체를 대체할 수 있는 새로운 단백질 스캐폴드를 개발할 필요성이 대두되고 있는 실정이다. 이와 관련하여, 최근 한국과학기술원의 김학성 교수 연구실에서 리피바디(Repebody)라는 단백질이 개발된 바 있다. 상기 리피바디는 LRR(Leucine-rich repeat)의 구조를 갖는 인터날린 B의 N-말단과 VLR의 구조의 유사성을 바탕으로 융합하여 컨센시스 디자인으로 최적화시킨 폴리펩타이드를 의미하는데, 이는 대장균에서 수용성 단량체 형태로 대량 발현되기 때문에 생산 단가를 낮출 수 있고, 높은 물리화학적 안정성을 지니고 있어 단백질의 변형이 용이하다. 현재까지 MD-2(대한민국 등록특허 제1255682호) 및 IL-6(대한민국 등록특허 제1356075호 및 대한민국 공개특허 제2013-0094837호)를 각각 표적으로 한 리피바디는 개발되었으나, 아직까지 EGFR을 표적으로 한 리피바디는 아직까지 개발된 바 없다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 포함하여 여러 문제점들을 해결하기 위한 것으로서, EGFR을 표적으로 하는 암 진단 또는 영상화용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 관점에 따르면, 항-EGFR 리피바디에 조영용 화합물이 공유 또는 비공유 결합에 의해 결합된 복합체를 유효성분으로 함유하는 EGFR의 과발현 또는 과활성화를 특징으로 갖고 있는 암의 진단 또는 영상화용 조성물이 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 항-EGFR 리피바디에 조영용 화합물이 공유 또는 비공유 결합에 의해 결합된 복합체를 유효성분으로 함유하는 EGFR의 과발현 또는 과활성화를 특징으로 갖고 있는 암 환자의 암치료효과의 모니터링 또는 예후 확인용 조성물이 제공된다.

상기 조성물은 항암제를 투여 받은 암환자에 투여되어 종양의 크기의 변화 및 전이 여부를 모니터링함으로써 항암치료 효과를 확인하거나, 미리 특정 약물에 대한 반응성을 예측하는데 사용될 수 있다. 이와 같은 방식의 진단을 동반진단(companion diagnosis)이라고 하며 최근 개인 맞춤 치료와 관련하여 매우 중요한 분야로 인식되고 있다.

따라서, 본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 항-EGFR 리피바디에 조영용 화합물이 공유 또는 비공유 결합에 의해 결합된 복합체를 유효성분으로 함유하는 암환자의 동반진단용 조성물이 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 항-EGFR 리피바디에 조영용 화합물이 공유 또는 비공유 결합에 의해 결합된 복합체를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 상기 개체의 암의 진단방법이 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 항-EGFR 리피바디에 조영용 화합물이 공유 또는 비공유 결합에 의해 결합된 복합체를 암환자에 투여하는 단계; 및 상기 암환자로부터 상기 조영용 화합물에 의한 이미지를 수득하는 단계를 포함하는 상기 암환자의 동반진단 방법이 제공된다.

상기 방법에 있어서, 상기 암환자가 EGFR 양성으로 판정될 경우 cetuximab을 비롯한 EGFR 저해제의 처방을 결정할 수 있다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 항-EGFR 리피바디에 조영용 화합물이 공유 또는 비공유 결합에 의해 결합된 복합체를 항암제를 투여 받고 있는 암환자에 투여하는 단계; 및 상기 조영용 화합물에 의한 이미지를 수득하는 단계를 포함하는 상기 항암제의 치료효과의 검증방법이 제공된다.

상기 방법에 있어서, 상기 이미지 상에서 EGFR 양성인 영역이 감소하거나 증가하지 않을 경우 상기 항암제에 의한 치료효과가 양성인 것으로 판정하고, EGFR 양성인 영역이 증가할 경우 상기 항암제에 의한 치료효과가 음성인 것으로 판정할 수 있다.

이하 본 문서에서 사용되는 용어를 하기와 같이 정의한다:

본 문서에서 사용되는 용어 "EGF"는 상피성장인자(epidermal growth factor)의 약어로, 수용체인 EGFR에 결합하여 세포의 성장, 증식 및 분화를 촉진하는 EGF-계열 단백질(EGF-familiy protein)의 일원인 성장인자로서 인간 EGF는 53 아미노산으로 구성되는 6,045 Da 크기의 단백질로 세 곳의 분자내 이황화 결합이 존재한다(Carpenter et al., J. Biol. Chem., 265(14):7709-7712, 1990).

본 문서에서 사용되는 용어 "EGFR"은 상피성장인자 수용체(epidermal growth factor receptor)의 약어로서 상기 EGF 또는 형질전환성장인자-α(transforming growth factor α, TNFα)를 리간드로 하는 수용체 타이로신 키나아제(receptor tyrosine kinase)의 일원인 세포막 표면에 존재하는 수용체 단백질이다(Herbst, R.S., Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys., 59(2 Suppl): 21-26, 2004).

본 문서에서 사용되는 용어 "리피바디(repebody)"는 LRR 구조를 갖는 상기 인터날린의 N-말단과 가변 임파구 수용체(vairable lymphocyte receptor, VLR)의 구조의 유사성을 바탕으로 융합하여 컨센서스 디자인으로 최적화시켜 제조된 폴리펩타이드로서, 본 발명자의 일원인 김학성 교수에 의해 개발된 스캐폴드 단백질의 일종이다(대한민국 등록특허 제1219628호). 상기 리피바디 단백질은 구조상 오목한 지역(Concave)와 볼록한 지역(Convex)으로 나누어 질 수 있는데, 여기서 오목한 지역은 서열의 다양성이 높으며 단백질 상호작용에 중요한 부위로 알려져 있다. 이와 반대로 볼록한 지역은 보존성이 높은 서열을 바탕으로 단백질의 전체구조를 안정하게 유지하는 역할을 수행한다. 상기 리피바디 단백질은 상기 VLR 외에도 반복 모듈을 갖는 LRR 패밀리에 속하는 모든 단백질을 상기 방법으로 수용성 발현 및 단백질의 생물리학적 성질을 향상 시킨 모든 융합 LRR 패밀리 단백질을 모두 포함할 수 있다.

본 문서에서 사용되는 "항-EGFR 리피바디"는 EGFR에 특이적으로 결합하여 EGFR의 하위 신호전달을 억제할 수 있는 리피바디를 의미한다.

본 문서에서 사용되는 "인터날린(internalin)"은 리스테리아(Listeria) 균주에서 발현되는 LRR(Leucin-rich repeat) 패밀리 단백질의 일종으로 소수성 코어가 전 분자에 걸쳐서 일정하게 분포되어 있는 LRR 패밀리 단백질들과는 다른 유형의 N-말단 구조 때문에 미생물에서도 안정적으로 발현되는 것으로 알려져 있다. 이러한 인터날린 단백질의 N-말단은 반복모듈의 접힘(folding)에 가장 중요한 N-말단 부위가 미생물 유래일 뿐 아니라 그 형태가 알파 나선을 포함하는 더욱 안정적인 모양을 가졌기 때문에 미생물에서 안정적으로 발현되는 것으로 생각되고 있다.

본 문서에서 사용되는 용어 "인터날린 단백질의 N-말단"은 단백질의 수용성 발현 및 접힘에 있어서 필요한 인터날린 단백질의 N-말단을 의미하며 알파 나선형 캡핑 모티프(capping motif) 및 인터날린 B 단백질의 반복 모듈을 의미한다. 인터날린 B 단백질의 N-말단은 단백질의 수용성 발현 및 접힘에 있어서 필요한 인터날린 단백질의 N-말단은 제한 없이 포함되나, 그 예로 알파 나선형 캡핑 모티프인 "ETITVSTPIKQIFPDDAFAETIKANLKKKSVTDAVTQNE" 및 반복 모듈을 포함할 수 있다. 바람직하게 반복 모듈 패턴은 "LxxLxxLxLxxN"을 포함할 수 있다. 상기 반복 모듈 패턴 중 L은 알라닌, 글리신, 페닐알라닌, 티로신, 루이신, 이소루이신, 발린 또는 트립토판; N은 아스파라진, 글루타민, 세린, 시스테인 또는 트레오닌, x는 임의의 아미노산을 의미한다. 인터날린 단백질의 N-말단은 융합될 수 있는 LRR 패밀리 단백질의 종류에 따라 높은 구조 유사도를 갖는 N-말단이 선택될 수 있으며 결합 에너지 등의 계산을 통해 가장 안정적인 아미노산을 선택하여 해당 모듈의 아미노산의 변이가 가능하다.

본 문서에서 사용되는 용어 "LRR(leucin-rich repeat)"는 루이신이 일정한 위치에 반복되는 모듈의 조합으로 이루어진 단백질을 의미하는 것으로, (i) 하나 이상의 LRR 반복 모듈을 갖고 있고, (ii) 상기 LRR 반복 모듈은 20 내지 30개의 아미노산으로 이루어져 있고, (iii) LRR 반복 모듈은 보존 패턴으로 "LxxLxxLxLxxN"을 갖고 있으며, 여기서 L은 알라닌, 글리신, 페닐알라닌, 티로신, 루이신, 이소루이신, 발린 및 트립토판과 같은 소수성 아미노산을, N은 아스파라진, 글루타민, 세린, 시스테인 또는 트레오닌을, x는 임의의 아미노산을 의미하며, (iv) LRR 패밀리 단백질은 말발굽과 같은 삼차원 구조를 갖고 있는 단백질을 의미한다. 본 발명의 LRR 패밀리 단백질은 이미 그 서열이 알려져 있거나, 생체에서 새로 유도된 mRNA나 cDNA를 이용하여 찾아낸 것 뿐 아니라, 컨센서스 디자인 (Consensus design) 등의 설계를 통하여 자연계에 알려지지 않은 서열을 가지면서 반복모듈의 골격 구조가 있는 변이체를 모두 포함할 수 있다.

본 문서에서 사용되는 용어 "VLR(variable lymphocyte receptor)"은 먹장어, 칠성장어 등의 무악어류에서 발현되는 LRR 패밀리 단백질의 일종으로, 먹장어와 칠성장어에서 획득 면역 기능을 수행하며 다양한 항원 물질에 결합할 수 있는 골격으로 유용하게 주목받고 있다.

본 문서에서 사용되는 용어 "동반진단(companion diagnosis)"이란 치료제와 동시에 출시되거나 병행 개발되어 해당 치료제의 투약여부 및 투여량을 결정하는 진단을 의미한다.

본 문서에서 사용되는 용어 "PET(positron emission tomography)"는 양전자 방출 단층 촬영이라고도 불리우며, 양전자 방출을 이용하는 핵의학 검사 방법 중의 하나로 양전자를 방출하는 방사성 동위원소를 결합한 의약품을 체내에 주입한 후 양전자 방출 단층 촬영기를 이용하여 이를 추적하여 체내 분포를 알아보는 방법이다. PET는 암 검사, 심장 질환, 뇌 질환 및 뇌 기능 평가를 위한 수용체 영상이나 대사 영상을 얻는데 활용된다.

본 문서에서 사용되는 용어 "SPECT(single photon emission computer tomography)"는 감마선을 이용하는 핵의학 단층 촬영방법으로서, 감마선을 방출하는 방사성 동위원소인 ^99mTc, I-123, I-131 또는 In-111을 사용한다.

본 문서에서 사용되는 용어 "MRI(magnetic resonance imaging)"은 자기공명 영상을 지칭하는 말로서 핵자기공명 원리를 이용하는 단층 촬영방법이다. 자기장을 발생하는 자기공명 촬영장치에 인체를 넣고 고주파를 발생시키면 신체의 수소 원자핵이 공명하게 된다. 이 때 나오는 신호의 차이를 측정하고 컴퓨터를 통해 재구성하여 영상화함으로써 자기공명영상을 관찰할 수 있다. 상자성을 띠는 조영제를 사용함으로써 보다 해상도가 높은 영상을 얻을 수 있다.

본 문서에서 사용되는 용어 "EGFR의 과발현"은 EGFR의 전사, 번역 수준에서의 발현양의 증가 또는 EGFR을 암호화하는 유전자의 체세포 내 복제수의 증가 등에 기인하는 EGFR 단백질 자체의 정상 수준 보다 높은 수준의 발현을 의미한다. 이러한 EGRF의 과발현은 다양한 종류의 암의 발생, 성장 및 전이에 있어서 밀접한 관련이 있는 것으로 알려지고 있다(Sasaki, T. et al., BioMed Res. Int., Article ID 546318: 8 pages, 2013)

본 문서에서 사용되는 용어 "EGFR의 비정상적인 활성화"는 EGRF을 암호화하는 유전자의 돌연변이 또는 전위(translocation)으로 인하여 리간드와 무관하게 EGFR이 항상 활성화되어 있는 현상을 의미하며, 조절되지 않는 세포분열을 야기하는 것으로 알려지고 있다(Lynch, T.J. et al., N. Engl. J. Med. 350(21): 2129-2139, 2004).

상기한 바와 같이 이루어진 본 발명의 일 실시예에 따르면, 보다 효율적이 경제적인 암의 진단, 영상화 및 동반진단을 구현할 수 있다. 물론 이러한 효과에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 항-EGFR 리피바디의 비소세포암 세포(H1650) 및 대장암 세포(HT29)에 대한 특이적 결합을 보여주는 형광현미경 사진이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 항-EGFR 리피바디를 이용한 FACS 분석 결과를 나타내는 histogram(a) 및 H1650 세포(b) 및 HT29 세포(c)의 수를 계수한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 대장암(HT29) 및 비소세포암(H1650)을 각각 이식하여 발생한 종양 마우스 모델에서 적출된 암조직을 대상으로 본 발명의 일 실시예에 따른 항-EGFR 리피바디를 이용하여 수득한 형광 면역조직화학 분석를 나타내는 형광현미경 사진이다.
도 4는 대장암(HT29) 및 비소세포암(H1650)을 각각 이식하여 발생한 종양 마우스 모델을 대상으로 본 발명의 일 실시예에 따른 항-EGFR 리피바디를 이용하여 수득한 생체내 형광 이미지를 나타내는 사진이다.
도 5는 비소세포암(H1650)을 이식하여 발생한 종양 마우스 모델을 대상으로 본 발명의 일 실시예에 따른 항-EGFR 리피바디를 이용하여 수득한 생체내 PET 이미징 결과를 나타내는 사진이다.

이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

상기 암의 진단 또는 영상화용 조성물에 있어서, 상기 항-EGFR 리피바디는 인터날린 단백질의 N-말단, VRL(variable lyphocyte receptor) 단백질의 변형된 반복모듈 및 VRL 단백질의 C-말단이 융합된 단백질일 수 있고, 상기 인터날린 단백질은 인터날린 A, 인터날린 B, 인터날린 C, 인터날린 H 또는 인터날린 J일 수 있다.

상기 조성물에 있어서, 상기 항-EGFR 리피바디는 서열번호 1 또는 2로 표시되는 아미노산 서열로 구성될 수 있다.

상기 조성물에 있어서, 상기 조영용 화합물은 형광단백질, 형광분자, 양전자 방출 단층촬영(positron emission tomography, PET) 조영용 방사성 동위원소 함유 조영제, 단일 광자 방출 단층촬영(single photon emission computer tomography, SPECT) 조영용 방사성 동위원소 함유 조영제, 또는 자기공명영상화(magnetic resonance imaging, MRI) 조영제일 수 있다.

이 때, 상기 형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 주황형광단백질(orange fluorescent protein, OFP), 청록색형광단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), 원적색형광단백질(far-red fluorescent protein) 또는 테트라시스테인 모티프(tetracystein motif)일 수 있다. 여기서, 상기 녹색형광단백질은 EGFP(enhanced green fluorescent protein), Emerald(Tsien, Annu. Rev. Biochem., 67: 509-544, 1998), Superfolder(Pedelacq et al., Nat. Biotech., 24: 79-88, 2006), GFP(Prendergast et al., Biochem., 17(17): 3448-3453, 1978), Azami Green(Karasawa, et al., J. Biol. Chem., 278: 34167-34171, 2003), TagGFP(Evrogen, Russia), TurboGFP(Shagin et al., Mol. Biol. Evol., 21(5): 841-850, 2004), ZsGreen(Matz et al., Nat. Biotechnol., 17: 969-973, 1999) 또는 T-Sapphire(Zapata-Hommer et al., BMC Biotechnol., 3:5, 2003)일 수 있고, 상기 황색형광단백질은 EYFP(enhanced yellow fluorescent protein, Tsien, Annu. Rev. Biochem., 67: 509-544, 1998), Topaz(Hat et al., Ann. N. Y. Acad. Sci., 1: 627-633, 2002), Venus(Nagai et al., Nat. Biotechnol., 20(1): 87-90, 2002), mCitrine(Griesbeck et al., J. Biol. Chem., 276: 29188-29194, 2001), Ypet(Nguyet and Daugherty, Nat. Biotechnol., 23(3): 355-360, 2005), TagYFP(Evrogen, Russia), PhiYFP(Shagin et al., Mol. Biol. Evol., 21(5): 841-850, 2004), ZsYellow1(Matz et al., Nat. Biotechnol., 17: 969-973, 1999) 또는 mBanana(Shaner et al., Nat. Biotechnol., 22: 1567-1572, 2004)일 수 있으며, 상기 적색형광단백질은 mRuby(Kredel et al., PLoS ONE, 4(2):e4391, 2009), mApple(Shaner et al., Nat. Methods, 5(6): 545-551, 2008), mStrawberry(Shaner et al., Nat. Biotechnol., 22: 1567-1572, 2004), AsRed2(Shanner et al., Nat. Biotehcnol., 22: 1567-1572, 2004) 또는 mRFP(Campbell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99(12): 7877-7882, 2002)일 수 있고, 상기 주황형광단백질은 Kusabira Orange(Karawawa et al., Biochem. J., 381(Pt 1): 307-312, 2004), Kusabira Orange2(MBL International Corp., Japan), mOrange(Shaner et al., Nat. Biotechnol., 22: 1567-1572, 2004), mOrange2(Shaner et al., Nat. Biotechnol., 22: 1567-1572, 2004), dTomato(Shaner et al., Nat. Biotechnol., 22: 1567-1572, 2004), dTomato-Tandem(Shaner et al., Nat. Biotechnol., 22: 1567-1572, 2004), TagRFP(Merzlyak et al., Nat. Methods, 4(7): 555-557, 2007), TagRFP-T(Shaner et al., Nat. Methods, 5(6): 545-551, 2008), DsRed(Baird et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97: 11984-11989, 1999) DsRed2(Clontech, USA), DsRed-Express(Clontech, USA), DsRed-Monomer(Clontech, USA) 또는 mTangerine(Shaner et al., Nat. Biotechnol., 22: 1567-1572, 2004)일 수 있으며, 상기 청록색형광단백질은 ECFP(enhanced cyan fluorescent protein, Cubitt et al., Trends Biochem. Sci., 20: 448-455, 1995), mECFP(Ai et al., Biochem. J., 400(3): 531-540, 2006), mCerulean(Koushik et al., Biophys. J., 91(12): L99-L101, 2006), CyPet(Nguyet and Daugherty, Nat. Biotechnol., 23(3): 355-360, 2005), AmCyan1(Matz et al., Nat. Biotechnol., 17: 969-973, 1999), Midori-Ishi Cyan(Karawawa et al., Biochem. J., 381(Pt 1): 307-312, 2004), TagCFP(Evrogen, Russia) 또는 mTFP1(Ai et al., Biochem. J., 400(3): 531-540, 2006)일 수 있고, 상기 청색형광단백질은 EBFP(enhanced blue fluorescent protein, Clontech, USA), EBFP2(Ai et al., Biochemistry, 46(20): 5904-5910, 2007), Azurite(Mena et al., Nat. Biotechnol., 24: 1569-1571, 2006) 또는 mTagBFP(Subach et al., Chem. Biol., 15(10: 1116-1124, 2008)일 수 있고, 상기 원적색형광단백질은 mPlum(Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101: 16745-16749, 2004), mCherry(Shanner et al., Nat. Biotehcnol., 22: 1567-1572, 2004), dKeima-Tandem(Kogure et al., Methods, 45(3): 223-226, 2008), JRed(Shagin et al., Mol. Biol. Evol., 21(5): 841-850, 2004), mRaspberry(Shanner et al., Nat. Biotehcnol., 22: 1567-1572, 2004), HcRed1(Fradkov et al., Biochem. J., 368(Pt 1): 17-21, 2002), HcRed-Tandem(Fradkov et al., Nat. Biotechnol., 22(3): 289-296, 2004) 또는 AQ143(Shkrob et al., Biochem. J., 392: 649-654, 2005)일 수 있으며, 상기 테트라시스테인 모티프는 Cys-Cys-Xaa-Xaa-Cys-Cys(서열번호 3)의 서열을 포함하는 폴리펩티드로서, 상기 Xaa는 시스테인을 제외한 아미노산일 수 있다. 상기 방법에 있어서, 상기 형광분자는 상기 형광분자는 플루오레세인(fluorescein), FITC(fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(Oregon green) 및 텍사스 레드(Texas red)로 구성된 군으로부터 선택되는 같은 잔틴(Xanthene) 유도체; Cy2, Cy3, Cy3B, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7, 인도카르보사이아닌(indocarbocyanine), 로다민(rhodamine), 옥사카르보사이아닌(oxacarbocyanine), 티아카르보사이아닌(thiacarbocyanine) 및 메로사이아닌(merocyanine)로 구성된 군으로부터 선택되는 사이아닌 유도체(cyanien derivatives); 피리딜록사졸(pyrodyloxazole), 니트로벤족사디아졸(nitrobenzoxadiazole), 및 벤족사디아졸(benzoxadiazole)로 구성된 군으로부터 선택되는 옥사디아졸(oxadiazole) 유도체; 나일 레드(Nile red), 나일 오렌지(Nile orange), 및 아크리딘 옐로우(acridine yellow)로 구성된 군으로부터 선택되는 아크리딘 유도체(acridine derivative); 오마린(aumarine), 크리스탈 바이올렌(crystal violet), 및 말라카이트 그린(malachite green)으로 구성된 군으로부터 선택되는 아릴메틴 유도체(arylmethine derivative); 포르핀(porphin), 프탈로사이아닌(phthalocyanine) 및 빌리루빈(bilirubin)로 구성된 군으로부터 선택되는 테트라피롤 유도체(tetrapyrrole derivative); 및 X-SIGHT, Pz 247, DyLight 750, DyLight 800, Alexa Fluor 680, Alexa Fluor 750, IRDye 680, IRDye 800CW 및 인도시아닌 그린(indocyanine green) 및 양성이온 근적외광 형광체(zwitterionic near-infrared fluorophores)로 구성된 군으로부터 선택되는 근적외광 형광체(NIR fluorophore)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상일 수 있다. 특히 상기 근적외광 형광체의 경우 통상의 가시광선대 빛을 방출하는 형광분자에 비하여 더 심도가 깊은 곳의 생체 분자의 영상화가 가능하기 때문에 인간과 같은 대동물의 생체내 형광이미징에 적합한 분자이다.

상기 PET 조영용 방사성 동위원소 함유 조영제는 PET 조영에 사용되는 그 어떠한 방사성 동위원소(radionuclide)를 함유하는 화합물도 사용될 수 있는데, 예컨대 상기 방사성 동위원소로는 C-11, N-13, O-15, F-18, Ru-82, Ga-68, Cu-60, Cu-61, Cu-62, 또는 Cu-64와 같은 짧은 반감기를 가진 방사성 동위원소가 사용될 수 있으며, C-11, N-13, O-15 및 F-18은 펩타이드에 결합이 용이한 그 어떠한 유기화합물 내의 구성원소로 포함되어 펩티아드에 표지될 수 있고, 가장 빈번히 사용되는 F-18은 당업계에 공지된 다양한 방법으로 펩타이드 또는 단백질에 표지가 가능한데, 대표적인 예로 4-nitro-3-trifluoromethyl arene을 F-18 표지를 전구체로 이용하는 일단계 F-18 표지방법이 있다(Jacobson et al., Bioconjug. Chem., 22(3): 422-428, 2011). Ru-82, Ga-68 및 Cu-64와 같은 금속 방사성 동위원소는 DTPA (diethylenetriamimepentaacetic acid), EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid), DOTA(1,4,7,10-tetraazacyclodocecane-N,N"",N"',N""-tetraacetic acid), NOTA (1,4,7,-triazacyclododecane-N,N",N"',N""-tetraacetic acid), DPTA(2-[Bis[2- [bis(carboxymethyl)amino]ethyl]amino] acetic acid), BTS(bis(thiosemi- carbazone), PnAO(propyleneamine oxime), DADT(diaminedthiol), MAG3 (mercapto- acetylglycylglycylglycine) 및 AAZTA(6-amino-6-methylperhydro-1,4-diazepine- tetraacetic acid)와 같은 킬레이터와의 착물의 형태로 단백질에 공유결합됨으로써 본 발명의 일 실시예에 따른 항-EGFR 리피바디에 표지될 수 있다.

종래에 암 진단 및 암치료효과의 모니터링을 위해 PET 조영술이 사용되어왔으나, 주로 F-18가 포함된 글루코스 유도체인 fludeoxyglucose를 이용한 것으로서, 암조직의 포도당 대사가 왕성한 점을 이용한 방법인데, 이는 암종에 따른 선택성이 없기 때문에, 동반진단에는 부적절한 방법이다. 반면, 본 발명의 항-EGFR 리피바디를 이용한 조영제의 경우 EGFR을 과발현하는 암조직만을 특이적으로 검출할 수 있기 때문에, EGFR 저해제 처방 여부를 결정할 수 있는 동반진단 및 약효 모니터링에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

상기 SPECT 조영용 방사성 동위원소 함유 조영제는 방사성 동위원소로 ^99mTc, I-123, I-131 또는 In-111를 함유한 화합물일 수 있는데 상기 방사성 동위원소는 금속 방사성 동위원소로서 상기 PET 조영제와 마찬가지로 킬레이터와의 착물의 형태로 단백질 또는 펩타이드에 공유결합될 수 있다.

상기 MRI 조영제는 초상자성 철 백금 입자(superparamagnetic iron platinum particles, SIPPs), 가돌리늄(Gd) 또는 망간(Mn)를 포함하는 화합물일 수 있는데, 상기 PET 조영용 화합물과 마찬가지로 이들 금속 원자를 DOTA, NOTA 등의 킬레이터와의 착물의 형태로 단백질에 도입하는 것이 가능하다(Xue et al., Nanomed. Nanobiotechnol., 5(2):163-179, 2013; Li et al., J. Inorg. Biochem., 107(1): 111-118, 2012).

상술한 본 발명의 일 실시예에 따른 조성물들은 생체 내에 직접 투여될 수 있기 때문에, 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 약제학적으로 허용되는 담체는 통상적으로 이용되는 것으로서, 탄수화물류 화합물(예: 락토스, 아밀로스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 셀룰로스 등), 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 염 용액, 알코올, 아라비아 고무, 식물성 기름(예: 옥수수 기름, 목화 종자유, 두유, 올리브유, 코코넛유), 폴리에틸렌 글리콜, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19^th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 조성물은 비경구로 투여되는 것이 바람직하고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입 등으로 투여할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면 조성물 기준으로는 0.0001 내지 100 mg/kg(체중)으로 투여될 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있거나 이틀 내지 한 달 간격으로 복수로 투여하는 것도 가능하다.

본 발명의 일 실시예에 따른 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 항-EGFR 리피바디에 조영용 화합물이 공유 또는 비공유 결합에 의해 결합된 복합체를 개체에 투여하는 단계; 및 상기 개체로부터 상기 조영용 화합물에 의한 이미지를 수득하는 단계를 포함하는 상기 개체의 암의 진단방법이 제공된다.

상기 방법에 있어서, 상기 암환자가 EGFR 양성으로 판정될 경우 cetuximab를 비롯한 EGFR 저해제의 처방을 결정할 수 있다.

이하, 첨부된 실시예 및 실험예를 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예 및 실험예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예 및 실험예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.

실시예 1: 항-EGFR 리피바디의 제조

본 발명에서 사용된 항-EGFR 리피바디는 대한민국 등록특허 제1356075호에 개시된 방법과 유사한 방법으로 제조되었으며, 구체적으로 대한민국 등록특허 제1219628호에서 구축한 리피바디 기본골격 컨스트럭트에 대한 무작위 돌연변이 라이브러리를 구축한 후, 이를 파지 디스플레이용 벡터에 삽입한 후 EGFR과의 결합 친화도가 높은 후보 리피바디를 선별한 후, 결합에 중요한 역할을 할 것으로 컴퓨터 분석을 통해 예측된 아미노산을 대상으로 표적 돌연변이화를 통해 두 번째 항-EGFR 리피바디(rAC1 repe)를 선별하였으며, 이에 대한 추가 돌연변이를 통해 세 번째 항-EGFR 리피바디(rEgA repe) 및 네 번째 항-EGFR 리피바디 클론(rEgH9 repe) 클론을 확보하였다. 상기 세 번째 항-EGFR 리피바디 및 네 번째 항-EGFR 리피바디는 각각 서열번호 1 및 2로 표시되는 아미노산 서열로 구성된다. 상기 특허문헌들은 본 문서에 참조로 삽입된다.

실시예 2: 항-EGFR 리피바디-FITC 컨주게이트의 제조

본 발명에서 사용된 항-EGFR 리피바디-FITC 컨주게이트는 FITC의 NHS를 이용하여 항-EGFR 리피바디의 N-말단의 아민기와 FITC 사이에 아마이드 결합을 형성시킴으로써 제조하였다.

실시예 3: 항-EGFR 리피바디-Cy5.5 컨주게이트의 제조

본 발명에서 사용된 항-EGFR 리피바디-Cy5.5 컨주게이트는 Cy5.5의 NHS를 이용하여 항-EGFR 리피바디의 N-말단의 아민기와 Cy5.5의 사이에 아마이드 결합을 형성시킴으로써 제조하였다.

실시예 4: ⁶⁴ Cu-NOTA-항-EGFR 리피바디 컨주게이트의 제조

본 발명에서 사용된 ⁶⁴Cu-NOTA-항-EGFR 리피바디 컨주게이트는 항-EGFR 리피바디의 N-말단의 아민기와 NOTA와의 아마이드 결합을 형성시키고, ⁶⁴Cu를 킬레이션 함으로써 제조하였다.

실험예 1: 시험관내 EGFR 결합 확인

본 발명자들은 EGFR 발현 비소세포페암 세포(H1650)와 대장암(HT29) 세포에서 EGFR 리피바디의 특이결합을 관찰하였다. 이를 위해 상기 실시예 2에서 제조된 항-EGFR 리피바디-FITC를 이용하여 면역형광염색과 FACS 분석을 실시하였다.

1-1: 면역형광염색 분석

먼저 본 발명자들은 EGFR을 발현하는 것으로 알려진 비소세포페암 세포(H1650)와 대장암(HT29)의 배양중인 세포에 상기 실시예 2에서 제조된 항-EGFR 리피바디-FITC 컨쥬게이트 0.1 μM를 처리하고 세척한 후, 형광현미경으로 관찰하였다. 그 결과, 도1에서 나타난 바와 같이, H1650 및 HT29 세포 모두에서 항-EGFR 항체에서와 유사한 결과를 확인하였다(도 1).

1-2: FACS 분석

이어 본 발명자들은 상기 항-EGFR 리피바디-FITC 컨쥬게이트를 이용하여 형광 활성화 세포 정렬(fluorescence activated cell sorting, FACS) 분석을 수행하였다. 구체적으로, 본 발명에서 최종적으로 사용된 항-EGFR 리피바디(네 번째 클론) 외에 개발과정에서 단계별로 친화도가 증가된 두 번째 및 세 번째 클론에 대하여도 분석을 수행하였다(도 2). 그 결과, 도 2에서 나타난 바와 같이, EGFR 과발현 세포와 EGFR 리피바디의 결합력은 친화도의 증가에 따라 결합력이 크게 증가하는 것을 확인할 수 있었다. HT29세포와 본 발명에서 사용된 항-EGFR 리피바디(네 번째 클론 EGFR 리피바디) 사이의 결합특이성은 두 번째 클론에 비해 8.8배 증가하였고, 세 번째 클론에 비해서는 1.1배 증가하였으며, 항-EGFR 항체와 비교할 경우 0.8배 정도의 결합특이성을 나타내어 항체와 유사한 정도의 결합특이성이 있는 것으로 확인되었다. H1650세포와 본 발명에서 사용된 항-EGFR 리피바디(네 번째 클론 EGFR 리피바디) 사이의 결합특이성은 두 번째 클론에 비해 23.4배 증가하였고, 세 번째 클론에 비해서는 3.1배 증가하였다. 이는 EGFR 항체에 비해서도 4.3배 높은 결합특이성으로서, 항체 이상의 결합특이성이 확인되었다.

실험예 2: 면역조직화학에 의한 EGFR 결합 확인

본 발명자들은 상기 in vitro 실험결과로부터 본 발명의 항-EGFR 리피바디가 배양중인 세포 뿐만 아니라 암조직 절편에서의 EGFR 발현을 분석하는데 활용될 수 있는 지 확인하기 위해, 마우스에서 형성된 암조직을 절취하여 이의 절편에 대하여 면역조직화학 분석을 수행하였다.

구체적으로, 마우스에서 형성된 비소세포폐암(H1650)과 대장암(HT29) 조직을 vibratome을 이용하여 절편화한 후, 4% 포름알데히드로 고정한 다음, 1% BSA/PBST로 차단하고, 항-EGFR 리피바디-FITC 콘주게이트를 3 μg/ml을 처리한 후, PBST로 3차례 세척한 다음, 형광현미경을 형광패턴을 관찰하였다(도 3). 그 결과, 도 3에서 나타난 바와 같이, H1650 및 HT29 세포 모두 EGFR에 의한 형광을 관찰할 수 있었으며, 이는 본 발명에서 사용된 항-EGFR 리피바디가 암조직에서 발현된 EGFR에 특이적으로 결합하고 있음을 입증하는 것이다.

실험예 3: 생체내 EGFR의 영상화

본 발명자들은 본 발명에서 사용한 항-EGFR 리피바디가 실제 생체 내 투여시, EGFR을 발현하는 암조직에 생체 내 영상화에 적용될 수 있는 지 확인하기 위해, 상기 실시예 3에서 제조된 항-EGFR 리피바디-Cy5.5 및 상기 실시예 4에서 제조된 ⁶⁴Cu-NOTA-항-EGFR 리피바디를 암을 유발시킨 동물 모델 각각 투여한 후 각각 생체 내 형광 이미징 및 PET 이미징을 통해 분석하였다.

3-1: 생체 내 형광 이미징 분석

본 발명자들은 상기 실시예 3에서 제조된 항-EGFR 리피바디-Cy5.5을 1.5 mg/kg의 투여량으로 대장암(HT29) 또는 비소세포암(H1650)이 이식되어 종양이 형성된 xenograft 암 모델 마우스에 꼬리정맥 주사한 후, cooled CCD 광학 카메라를 이용하여 시간에 따른 생체 내 형광 이미지를 수득하였다(도 4). 그 결과, 도 4에서 나타난 바와 같이, HT29와 H1650 동물모델에서 1일째부터 결합력이 확인되었고, 10일 이후까지 강한 영상신호가 관찰되었다(도 4). 이는, 본 발명에서 사용된 항-EGFR 리피바디가 동물모델 생체 내 환경에서도 표적에 대한 특이도가 매우 높은 것이 확인되었다.

3-2: PET 영상 분석

생체 내 형광 분석의 경우 소동물에는 적합하나 대동물에서는 자가형광 및 형광의 낮은 침투력 때문에 적합한 방법이 아니다. 따라서, 본 발명자들은 본 발명의 시스템이 대동물에도 적용 가능한 것이지 확인하기 위해 PET 분석을 수행하였다.

구체적으로 본 발명자들은 인간폐암(H1650) 마우스모델에 상기 실시예 4에서 제조된 ⁶⁴Cu-NOTA-항-EGFR 리피바디 컨주게이트를 10 mCi/kg의 투여량으로 정맥 주사한 후 시간별 PET 영상을 획득하였다(도 5). 그 결과, 도 5에서 나타난 바와 같이, 시간에 따른 종양 내 영상신호가 증가함을 확인하였다. 또한 주변 조직이나 타 장기들과의 구분을 명확하게 나타내기 위해서 간, 종양 조직 등의 섭취비율을 나타내는 영상 대조도를 시간에 따라 확인하였다.

상술한 바와 같이, 본 발명자들은 본 발명의 일 실시예에 따른 항-EGFR 리피바디가 시험관내 배양중인 암세포는 물론 생체 내에서 EGFR을 발현하고 있는 암세포 또는 암조직을 특이적으로 검출하고 영상화하는데 활용할 수 있음을 입증하였다. 따라서, 본 발명의 일 실시예에 따른 항-EGFR 리피바디를 포함하는 암 진단 또는 영상용 조성물은 암의 진단, 예후 판정 및 암환자의 동반진단에 매우 효과적으로 사용될 수 있다.

본 발명은 상술한 실시예 및 실험예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예와 실험예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.

<110> Industry Foundation of Chonnam National University <120> composition for diagnosing or imaging cancer targeting epidermal growth factor receptor <130> PD14-5149 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 242 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-EGRF repebody clone #3 (rEgA repe) <400> 1 Glu Thr Ile Thr Val Ser Thr Pro Ile Lys Gln Ile Phe Pro Asp Asp 1 5 10 15 Ala Phe Ala Glu Thr Ile Lys Ala Asn Leu Lys Lys Lys Ser Val Thr 20 25 30 Asp Ala Val Thr Gln Asn Glu Leu Asn Ser Ile Asp Gln Ile Ile Ala 35 40 45 Asn Asn Ser Asp Ile Lys Ser Val Gln Gly Ile Gln Tyr Leu Pro Asn 50 55 60 Val Arg Tyr Leu Ala Leu Gly Gly Asn Lys Leu His Asp Ile Ser Ala 65 70 75 80 Leu Lys Glu Leu Thr Asn Leu Thr Tyr Leu Met Leu His Tyr Asn Gln 85 90 95 Leu Gln Ile Leu Pro Asn Gly Val Phe Asp Lys Leu Thr Asn Leu Lys 100 105 110 Glu Leu Tyr Leu Ser Glu Asn Gln Leu Gln Ser Leu Pro Asp Gly Val 115 120 125 Phe Asp Lys Leu Thr Asn Leu Thr Glu Leu Asp Leu Ala Arg Asn Gln 130 135 140 Leu Gln Ser Leu Pro Lys Gly Val Phe Asp Lys Leu Thr Gln Leu Lys 145 150 155 160 Asp Leu Arg Leu Tyr Glu Asn Gln Leu Lys Ser Val Pro Asp Gly Val 165 170 175 Phe Asp Arg Leu Thr Ser Leu Gln Tyr Ile Trp Leu His Asp Asn Pro 180 185 190 Trp Asp Cys Thr Cys Pro Gly Ile Arg Tyr Leu Ser Glu Trp Ile Asn 195 200 205 Lys His Ser Gly Val Val Arg Asn Ser Ala Gly Ser Val Ala Pro Asp 210 215 220 Ser Ala Lys Cys Ser Gly Ser Gly Lys Pro Val Arg Ser Ile Ile Cys 225 230 235 240 Pro Thr <210> 2 <211> 242 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-EGRF repebody clone #4 (rEgH9 repe) <400> 2 Glu Thr Ile Thr Val Ser Thr Pro Ile Lys Gln Ile Phe Pro Asp Asp 1 5 10 15 Ala Phe Ala Glu Thr Ile Lys Ala Asn Leu Lys Lys Lys Ser Val Thr 20 25 30 Asp Ala Val Thr Gln Asn Glu Leu Asn Ser Ile Asp Gln Ile Ile Ala 35 40 45 Asn Asn Ser Asp Ile Lys Ser Val Gln Gly Ile Gln Tyr Leu Pro Asn 50 55 60 Val Arg Met Leu His Leu Pro Ser Asn Lys Leu His Asp Ile Ser Ala 65 70 75 80 Leu Lys Glu Leu Thr Asn Leu Thr Tyr Leu Met Leu His Tyr Asn Gln 85 90 95 Leu Gln Ile Leu Pro Asn Gly Val Phe Asp Lys Leu Thr Asn Leu Lys 100 105 110 Glu Leu Tyr Leu Ser Glu Asn Gln Leu Gln Ser Leu Pro Asp Gly Val 115 120 125 Phe Asp Lys Leu Thr Asn Leu Thr Glu Leu Asp Leu Ala Arg Asn Gln 130 135 140 Leu Gln Ser Leu Pro Lys Gly Val Phe Asp Lys Leu Thr Gln Leu Lys 145 150 155 160 Asp Leu Arg Leu Tyr Glu Asn Gln Leu Lys Ser Val Pro Asp Gly Val 165 170 175 Phe Asp Arg Leu Thr Ser Leu Gln Tyr Ile Trp Leu His Asp Asn Pro 180 185 190 Trp Asp Cys Thr Cys Pro Gly Ile Arg Tyr Leu Ser Glu Trp Ile Asn 195 200 205 Lys His Ser Gly Val Val Arg Asn Ser Ala Gly Ser Val Ala Pro Asp 210 215 220 Ser Ala Lys Cys Ser Gly Ser Gly Lys Pro Val Arg Ser Ile Ile Cys 225 230 235 240 Pro Thr <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> tetracysteine motif <220> <221> VARIANT <222> (3)..(4) <223> Xaa is any amino acid except cysteine <400> 3 Cys Cys Xaa Xaa Cys Cys 1 5

Claims

서열번호 1 또는 2로 표시되는 아미노산 서열로 구성되는 항-EGFR 리피바디에 조영용 화합물이 공유 또는 비공유 결합에 의해 결합된 복합체를 유효성분으로 함유하는 EGFR의 과발현 또는 과활성화를 특징으로 갖고 있는 암의 진단 또는 영상화용 조성물.
삭제
삭제
제1항에 있어서,
상기 조영용 화합물은 형광단백질, 형광분자, 양전자 방출 단층촬영(positron emission tomography, PET) 조영용 방사성 동위원소 함유 조영제, 단일 광자 방출 단층촬영(single photon emission computer tomography, SPECT) 조영용 방사성 동위원소 함유 조영제, 또는 자기공명영상화(magnetic resonance imaging, MRI) 조영제인, 조성물.
제4항에 있어서,
상기 형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 주황형광단백질(orange fluorescent protein, OFP), 청록색형광단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), 원적색형광단백질(far-red fluorescent protein) 또는 테트라시스테인 모티프(tetracystein motif)인, 조성물.
제4항에 있어서,
상기 형광분자는 플루오레세인(fluorescein), FITC(fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(Oregon green) 및 텍사스 레드(Texas red)로 구성된 군으로부터 선택되는 같은 잔틴(Xanthene) 유도체;
Cy2, Cy3, Cy3B, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7, 인도카르보사이아닌(indocarbocyanine), 로다민(rhodamine), 옥사카르보사이아닌(oxacarbocyanine), 티아카르보사이아닌(thiacarbocyanine) 및 메로사이아닌(merocyanine)로 구성된 군으로부터 선택되는 사이아닌 유도체(cyanien derivatives);
피리딜록사졸(pyrodyloxazole), 니트로벤족사디아졸(nitrobenzoxadiazole), 및 벤족사디아졸(benzoxadiazole)로 구성된 군으로부터 선택되는 옥사디아졸(oxadiazole) 유도체;
나일 레드(Nile red), 나일 오렌지(Nile orange), 및 아크리딘 옐로우(acridine yellow)로 구성된 군으로부터 선택되는 아크리딘 유도체(acridine derivative);
오마린(aumarine), 크리스탈 바이올렌(crystal violet), 및 말라카이트 그린(malachite green)으로 구성된 군으로부터 선택되는 아릴메틴 유도체(arylmethine derivative);
포르핀(porphin), 프탈로사이아닌(phthalocyanine) 및 빌리루빈(bilirubin)로 구성된 군으로부터 선택되는 테트라피롤 유도체(tetrapyrrole derivative); 및
X-SIGHT, Pz 247, DyLight 750, DyLight 800, Alexa Fluor 680, Alexa Fluor 750, IRDye 680, IRDye 800CW, 인도시아닌 그린(indocyanine green) 및 양성이온근적외광 형광체(zwitterionic near-infrared fluorophores)로 구성된 군으로부터 선택되는 근적외광 형광체(NIR fluorophore)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상인, 조성물.
제4항에 있어서,
상기 PET 조영용 방사성 동위원소 함유 조영제는 C-11, N-13, O-15, F-18, Ru-82, Ga-68, Cu-60, Cu-61, Cu-62, 또는 Cu-64을 포함하는 조영제인, 조성물.
제4항에 있어서,
상기 SPECT 조영용 방사성 동위원소 함유 조영제는 방사성 동위원소로 ^99mTc, I-123, I-131 또는 In-111를 함유한 화합물인, 조성물.
제4항에 있어서,
상기 MRI 조영제는 초상자성 철 백금 입자(superparamagnetic iron platinum particles, SIPPs), 가돌리늄(Gd) 또는 망간(Mn)를 포함하는 화합물인, 조성물.
서열번호 1 또는 2로 표시되는 아미노산 서열로 구성되는 항-EGFR 리피바디에 조영용 화합물이 공유 또는 비공유 결합에 의해 결합된 복합체를 유효성분으로 함유하는 EGFR의 과발현 또는 과활성화를 특징으로 갖고 있는 암 환자의 암치료효과의 모니터링 또는 예후 확인용 조성물.
서열번호 1 또는 2로 표시되는 아미노산 서열로 구성되는 항-EGFR 리피바디에 조영용 화합물이 공유 또는 비공유 결합에 의해 결합된 복합체를 유효성분으로 함유하는 암환자의 동반진단용 조성물.
서열번호 1 또는 2로 표시되는 아미노산 서열로 구성되는 항-EGFR 리피바디에 조영용 화합물이 공유 또는 비공유 결합에 의해 결합된 복합체를 인간을 제외한 포유동물 개체에 투여하는 단계; 및
상기 개체로부터 상기 조영용 화합물에 의한 이미지를 수득하는 단계를 포함하는 상기 개체의 암의 진단방법.
서열번호 1 또는 2로 표시되는 아미노산 서열로 구성되는 항-EGFR 리피바디에 조영용 화합물이 공유 또는 비공유 결합에 의해 결합된 복합체를 인간을 제외한 암에 걸린 포유동물 개체에 투여하는 단계; 및
상기 암에 걸린 포유동물 개체로부터 상기 조영용 화합물에 의한 이미지를 수득하는 단계를 포함하는 상기 암에 걸린 포유동물 개체의 동반진단 방법.
서열번호 1 또는 2로 표시되는 아미노산 서열로 구성되는 항-EGFR 리피바디에 조영용 화합물이 공유 또는 비공유 결합에 의해 결합된 복합체를 항암제를 투여 받고 있는 인간을 제외한 암에 걸린 포유동물 개체에 투여하는 단계; 및
상기 조영용 화합물에 의한 이미지를 수득하는 단계를 포함하는 상기 항암제의 치료효과의 검증방법.