ES2532410T3 - Identificación de antígenos asociados a tumores para diagnóstico y terapia - Google Patents
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Abstract
Un método para diagnosticar o hacer seguimiento a una enfermedad cancerosa caracterizada por un aumento de la expresión de un antígeno asociado al tumor en comparación con el estado en un individuo sano, cuyo método comprende detectar o determinar la cantidad (i) de un ácido nucleico que codifica para el antígeno asociado al tumor, y/o (ii) del antígeno asociado al tumor, en una muestra biológica, con dicho antígeno asociado al tumor que tiene una secuencia codificada por un ácido nucleico que se selecciona del grupo que consiste de: (a) un ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 5, y (b) un ácido nucleico que es al menos 95% idéntico al ácido nucleico de (a), en donde el cáncer es un cáncer de próstata, un carcinoma de próstata o una metástasis de los mismos.
Description
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en una muestra biológica, con dicho antígeno asociado al tumor que tiene una secuencia codificada por un ácido nucleico que es seleccionado del grupo que consiste de:
(a) un ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 5, y 5 (b) un ácido nucleico que es al menos 95% idéntico al ácido nucleico de (a),
en donde el cáncer es un cáncer de próstata, un carcinoma de próstata o una metástasis de los mismos.
En una realización de la invención, dicho seguimiento de dicha enfermedad comprende la determinación de regresión, el
10 curso o aparición de dicha enfermedad en una muestra de un paciente que ha manifestado la enfermedad o que se sospecha que puede padecer dicha enfermedad.
La presente invención se refiere además a un anticuerpo que se enlaza específicamente a una proteína o polipéptido, dicha proteína o polipéptido siendo codificado por un ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo
15 con la SEQ ID NO: 5, en donde el anticuerpo está acoplado a un agente de diagnóstico, para uso en un método de diagnóstico o seguimiento de una enfermedad cancerosa que se caracteriza por un aumento de la expresión de un antígeno asociado al tumor en comparación con el estado en un individuo sano, cuyo método comprende administrar dicho anticuerpo, dicho antígeno asociado al tumor que tiene una secuencia codificada por un ácido nucleico que se selecciona del grupo que consiste de:
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- (a)
- un ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 5,
- (b)
- un ácido nucleico que es al menos 95% idéntico al ácido nucleico de (a),
en donde el cáncer es un cáncer de próstata, un carcinoma de próstata o una metástasis de los mismos.
25 En una realización de la invención, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, quimérico o humanizado, o es un fragmento de un anticuerpo, dicho fragmento se enlaza específicamente a la proteína codificada por un ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 5.
30 En otra realización de la invención, dicha proteína o polipéptido o dicho antígeno asociado al tumor comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 6, 51, 52, 53, 54, 55, 56 y 57.
Además, la presente invención se refiere al uso de un kit para el diagnóstico de una enfermedad cancerosa en una muestra obtenida de un paciente, dicha enfermedad cancerosa estando caracterizada por un aumento de la expresión de un
35 antígeno asociado al tumor en comparación con el estado en un individuo sano, cuyo kit comprende agentes para detectar o determinar la cantidad
- (i)
- de un ácido nucleico que codifica el antígeno asociado al tumor, y/o
- (ii)
- del antígeno asociado al tumor,
40 dicho antígeno asociado al tumor teniendo una secuencia codificada por un ácido nucleico que se selecciona del grupo que consiste de:
(a) un ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la SEQ ID NO: 5, y 45 (b) un ácido nucleico que es al menos 95% idéntico al ácido nucleico de (a),
en donde el cáncer es un cáncer de próstata, un carcinoma de próstata o una metástasis de los mismos y en donde dicho agente para detectar o determinar la cantidad de dicho ácido nucleico es una sonda o cebador oligo o polinucleótido que comprende una secuencia de 10-30 nucleótidos contiguos de dicho ácido nucleico, y en donde dicho agente para detectar o
50 determinar la cantidad de dicho antígeno asociado al tumor es un anticuerpo que se enlaza específicamente al antígeno asociado al tumor.
Descripción detallada de la invención
55 Como se utiliza en la presente invención, se puede utilizar una "referencia", tal como una muestra de referencia o un organismo de referencia, para correlacionar y comparar los resultados obtenidos en los métodos descritos en la presente invención a partir de una muestra de prueba o de un organismo de prueba, es decir, un paciente. Normalmente, el organismo de referencia es un organismo sano, en particular un organismo que no padece cáncer.
60 Un “valor de referencia” se puede determinar empíricamente a partir de una referencia midiendo una cantidad suficientemente grande de referencias. Preferiblemente, el valor de referencia se determina midiendo por lo menos 2,
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Las variantes de aminoácido descritas anteriormente se pueden preparar fácilmente con la ayuda de técnicas de síntesis de péptidos conocidas como, por ejemplo, mediante síntesis en fase sólida (Merrifield, 1964) y métodos similares o mediante manipulación del ADN recombinante. La manipulación de secuencias de ADN para la preparación de proteínas y péptidos que tienen sustituciones, inserciones o supresiones se describe en detalle, por ejemplo, en Sambrook et al. (1989).
Como se utiliza aquí, los “derivados” de proteínas y péptidos también comprenden sustituciones, supresiones y/o adiciones simples o múltiples de cualquiera de las moléculas asociadas con la proteína o el péptido, tales como hidratos de carbono, lípidos y/o proteínas o péptidos. El término “derivado” se extiende también a todos los equivalentes químicos funcionales de dichas proteínas y péptidos.
Una parte o fragmento de un antígeno asociado al tumor tiene preferiblemente una propiedad funcional de la proteína o péptido del que se ha derivado. Tales propiedades funcionales comprenden la interacción con anticuerpos, la interacción con otros péptidos o proteínas, el enlazamiento selectivo de ácidos nucleicos y una actividad enzimática. Una propiedad especial es la capacidad para formar un complejo con moléculas del CMH y, cuando proceda, generar una respuesta inmunitaria, preferiblemente mediante la estimulación de células T cooperadoras o citotóxicas. Una parte o fragmento de un antígeno asociado al tumor de la invención comprende preferiblemente una secuencia de por lo menos 6, en particular de por lo menos 8, por lo menos 10, por lo menos 12, por lo menos 15, por lo menos 20, por lo menos 30 o por lo menos 50, aminoácidos consecutivos del antígeno asociado al tumor. Una parte o fragmento de un antígeno asociado al tumor comprende preferiblemente una secuencia de hasta 8, en particular de hasta 10, de hasta 12, de hasta 15, de hasta 20, de hasta 30 o de hasta 55 aminoácidos consecutivos del antígeno asociado al tumor. Una parte o un fragmento de un antígeno asociado al tumor es preferiblemente una parte del antígeno asociada al tumor que corresponde a la porción no transmembrana, en particular la porción extracelular del antígeno, o está compuesta de la misma.
Una parte o un fragmento de un ácido nucleico que codifica para un antígeno asociado al tumor se refiere a la parte del ácido nucleico, que codifica por Io menos al antígeno asociado al tumor y/o para una parte o fragmento de dicho antígeno asociado al tumor, tal como se define más arriba. Una parte o fragmento de un ácido nucleico que codifica para un antígeno asociado al tumor es preferiblemente la parte del ácido nucleico que se corresponde con el marco abierto de lectura.
Los antisueros que contienen anticuerpos específicos que se enlazan específicamente a la proteína objetivo se pueden preparar mediante varios procedimientos estándares; véase, por ejemplo, “Monoclonal Antibodies: A Practical Approach” por Philip Shepherd, Christopher Dean ISBN 0-19-963722-9; “Antibodies: A Laboratory Manual" por Ed Harlow, David Lane, ISBN: 0879693142 y “Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol NO” por Edward Harlow, David Lane, Ed Harlow ISBN 0879695447. Por lo tanto, también es posible generar anticuerpos afines y específicos que reconocen proteínas complejas de la membrana en su forma nativa (Azorsa et al., J. Immunol. Methods 229: 35-48, 1999; Anderson et al., J. Immunol. 143: 1899-1904, 1989; Gardsvoll, J. Immunol. Methods 234: 107-116, 2000). Esto es especialmente relevante para la preparación de los anticuerpos que se utilizan terapéuticamente, pero también para muchas aplicaciones de diagnóstico. En este sentido, es posible inmunizar con toda la proteína, con secuencias extracelulares parciales así como con células que expresan la molécula objetivo en la forma fisiológicamente plegada.
Los anticuerpos monoclonales se prepararan tradicionalmente utilizando la tecnología del hibridoma. (Para detalles técnicos véase: “Monoclonal Antibodies: A Practical Approach” por Philip Shepherd, Christopher Dean ISBN 0-19-963722-9; “Antibodies: A Laboratory Manual” por Ed Harlow, David Lane ISBN: 0879693142; “Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol NO” por Edward Harlow, David Lane, Ed Harlow ISBN: 0879695447).
Se sabe que sólo una pequeña parte de una molécula del anticuerpo, el paratopo, está implicado en el enlazamiento del anticuerpo a su epítopo (cotejar con Clark, WB. (1986), The Experimental Foundations of Modern Immunology, Wiley Sons, Inc., New York; Roitt, I. (1991), Essential Immunology, 7ª Edición, Blackwell Scientific Publications, Oxford). Las regiones pFc’ y Fc son, por ejemplo, efectoras de la cascada del complemento pero no están implicadas en el enlazamiento del antígeno. Un anticuerpo del que se ha removido enzimáticamente la región pFc’ o que ha sido producido sin la región pFc’, denominada fragmento F(ab’)2, es portador de ambos sitios de enlazamiento del antígeno de un anticuerpo completo. De modo similar, un anticuerpo del que se ha removido enzimáticamente la región Fc o que ha sido producido sin la región Fc, denominada fragmento Fab, es portador de un sitio de enlazamiento del antígeno de una molécula de anticuerpo intacta. Además, los fragmentos Fab consisten en una cadena ligera enlazada en forma covalente de un anticuerpo y parte de la cadena pesada de dicho anticuerpo, denominada Fd. Los fragmentos de Fd son los determinantes principales de la especificidad del anticuerpo (un solo fragmento Fd puede asociarse con hasta diez cadenas ligeras diferentes, sin alterar la especificidad del anticuerpo) y los fragmentos Fd, cuando se aíslan, retienen la capacidad de enlazamiento a un epítopo.
Situadas en la parte de enlazamiento del antígeno de un anticuerpo están las regiones determinantes de complementariedad (CDR) que interactúan directamente con el epítopo del antígeno y las regiones marco (FR) que mantienen la estructura terciaria del paratopo. Tanto el fragmento Fd de la cadena pesada como el de la cadena ligera de la inmunoglobulina IgG contienen cuatro regiones marco (FR1 a F4) que están separadas en cada caso por tres regiones
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determinantes de complementariedad (CDR1 a CDR3). Las regiones CDR, y en especial, las regiones CDR3 y, aún más particularmente, las regiones CDR3 de la cadena pesada son responsables en gran medida por la especificidad del anticuerpo.
Es sabido que las regiones no CDR de un anticuerpo de mamífero se pueden reemplazar por regiones similares de anticuerpos con la misma o diferente especificidad, reteniendo la especificidad por el epítopo del anticuerpo original. Esto hace posible el desarrollo de anticuerpos “humanizados” en los que las CDR no humanos se enlazan covalentemente a regiones FR y/o Fc/pFc’ humanas para producir un anticuerpo funcional.
Como otro ejemplo, el documento WO 92/04381 describe la producción y el uso de anticuerpos RSV murinos humanizados en los que por Io menos parte de las regiones FR de murino han sido reemplazadas con regiones FR de origen humano. Los anticuerpos de este tipo, incluyendo fragmentos de anticuerpos intactos con capacidad de enlazamiento al antígeno, son denominados a menudo anticuerpos “quiméricos”.
El término “anticuerpo” también incluye fragmentos F(ab’)2, Fab, Fv y Fd de anticuerpos, anticuerpos quiméricos, en los que las regiones Fc y/o FR y/o CDR1 y/o CDR2 y/o CDR3 de cadena ligera han sido reemplazadas por secuencias homólogas humanas o no humanas, anticuerpos quiméricos con fragmentos F(ab’)2 en los que las regiones FR y/o CDR1 y/o CDR2 y/o CDR3 de la cadena ligera han sido remplazadas por secuencias homólogas humanas o no humanas, anticuerpos quiméricos con el fragmento Fab en los que las regiones FR y/o CDR1 y/o CDR2 y/o CDR3 de la cadena ligera han sido reemplazadas por secuencias homólogas humanas o no humanas, y anticuerpos quiméricos con el fragmento Fd en los que las regiones FR y/o CDR1 y/o CDR2 han sido reemplazadas por secuencias homólogas humanas o no humanas. El término “anticuerpo” también comprende anticuerpos de “cadena sencilla”.
La divulgación también se refiere a proteínas y péptidos que se enlazan específicamente a antígenos asociados a tumores. Las sustancias de enlazamiento también se pueden proporcionar, por ejemplo, mediante bibliotecas de péptidos degenerados que se pueden preparar simplemente en una solución en una forma inmovilizada o mediante bibliotecas de despliegue en fagos. También es posible preparar bibliotecas combinatorias de péptidos con uno o más aminoácidos. También se pueden preparar bibliotecas de peptoides y de residuos sintéticos no peptídicos.
Los anticuerpos también se pueden acoplar a sustancias de diagnóstico específicas para que muestren las células y los tejidos que expresan los antígenos asociados al tumor. También se pueden acoplar a sustancias terapéuticas útiles.
Las sustancias de diagnóstico incluyen cualquiera de los marcadores que se utilizan para: (i) proporcionar una señal detectable; (ii) interactuar con un segundo marcador para modificar la señal detectable proporcionada por el primero o el segundo marcador, por ejemplo, FRET (transferencia de energía por resonancia de fluorescencia); (iii) afectar la movilidad, por ejemplo, la movilidad electroforética, mediante carga, hidrofobicidad, forma, u otros parámetros físicos; o (iv) proporcionar una fracción de captura, por ejemplo, de afinidad, anticuerpo/antígeno, o formación de complejos iónicos. Los marcadores adecuados son estructuras tales como marcadores fluorescentes, marcadores Iuminiscentes, marcadores cromóforos, marcadores radioisotópicos, marcadores isotópicos, preferiblemente marcadores isotópicos estables, marcadores isobáricos, marcadores enzimáticos, marcadores de partículas, en particular marcadores de partículas metálicas, marcadores de partículas magnéticas, marcadores de partículas poliméricas, moléculas orgánicas pequeñas como la biotina, ligandos de receptores o de moléculas de enlazamiento tales como proteínas de adhesión celular o Iecitinas, secuencias de marcadores que comprenden ácidos nucleicos y/o residuos de aminoácidos que se pueden detectar mediante el uso de agentes de enlazamiento, etc. Las sustancias de diagnóstico comprenden, en una forma no limitante, sulfato de bario, ácido iocetámico, ácido iopanóico, ipodato de calcio, diatrizoato de sodio, diatrizoato de meglumina, metrizamida, tiropanoato de sodio y de radiodiagnóstico, que incluyen los emisores de positrones tales como flúor 18 y carbono 11, emisores gamma tales como el yodo 123, tecnecio 99m, yodo 131 e indio 111, nucleídos para resonancia magnética nuclear, tales como flúor y gadolinio.
El término “complejo mayor de histocompatibilidad" o “CMH” como se utiliza aquí se refiere a un complejo de genes presentes en todos los vertebrados. Las proteínas o moléculas del CMH están implicadas en la señalización entre los linfocitos y las células presentadoras de antígeno en las reacciones inmunitarias normales mediante el enlazamiento de péptidos y presentándolas para el reconocimiento por parte de los receptores de las células T (RCT). Las moléculas del CMH enlazan péptidos en un compartimento de procesamiento intracelular y presentan estos péptidos en la superficie de las células que presentan un antígeno para el reconocimiento por parte de las células T. La región del CMH humano también denominada HLA está situada en el cromosoma 6 e incluye la región de clase I y de clase II. En una forma de realización preferida de todos los aspectos de la invención, una molécula del CMH es una molécula de HLA.
“Reducir” o “inhibir” tal como se utiliza en la presente invención significa la capacidad de provocar una disminución total, preferiblemente del 20% o superior, más preferiblemente del 50% o superior, y aún más preferiblemente del 75% o superior, en el nivel, por ejemplo, en el nivel de proteínas o de ARNm en comparación con una muestra de referencia (por ejemplo,
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