ES2535500T3 - Identificación de antígenos asociados a tumores para el diagnóstico y la terapia - Google Patents

Abstract

Una composición farmacéutica para utilizar en un método de terapia, que comprende uno o más componentes seleccionados de entre el grupo que consiste en: (i) un antígeno asociado a un tumor o una parte extracelular del mismo, (ii) un ácido nucleico que codifica para un antígeno asociado a un tumor o una parte extracelular del mismo, y (iii) una célula huésped que expresa un antígeno asociado a un tumor o una parte extracelular del mismo, en la que dicha parte es un fragmento inmunogénico que comprende al menos 6 aminoácidos consecutivos del antígeno asociado al tumor, teniendo dicho antígeno asociado al tumor una secuencia codificada por un ácido nucleico que se selecciona de entre el grupo que consiste en: (a) un ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEC ID nº: 1, y (b) un ácido nucleico que es al menos un 95% idéntico al ácido nucleico de (a).

Description

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realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, quimérico, o humanizado, un anticuerpo producido mediante técnicas combinatorias, o un fragmento de un anticuerpo. En una forma de realización preferida, la descripción se refiere a un anticuerpo que se enlaza selectivamente a un complejo de (i) un antígeno asociado al tumor o una parte del mismo y (ii) una molécula del CMH a la que se enlaza dicho antígeno asociado al tumor o dicha parte del mismo, con dicho anticuerpo no unido a (i) o (ii) solo.

En particular, la presente descripción se refiere a tal agente, en particular un anticuerpo, que se enlaza específicamente a un péptido que tiene o comprende una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 58, 59, 60, 68 y 69 del listado de secuencias, una parte o derivado de las mismas.

Tal como se utiliza aquí, el término "enlazamiento" preferiblemente se refiere a un enlazamiento específico. "Enlazamiento específico" significa que un agente tal como un anticuerpo se enlaza más fuertemente a un objetivo tal como un epítopo para el que es específico en comparación con el enlazamiento con otro objetivo. Un agente se enlaza más fuertemente a un primer objetivo en comparación con un segundo objetivo si se enlaza al primer objetivo con una constante de disociación (KD) que es menor que la constante de disociación para el segundo objetivo. Preferiblemente, la constante de disociación (KD) para el objetivo al cual se enlaza específicamente el agente es más de 10 veces, preferiblemente más de 20 veces, más preferiblemente más de 50 veces, incluso más preferiblemente más de 100 veces, 200 veces, 500 veces o 1.000 veces menor que la constante de disociación (KD) para el objetivo al cual el agente no se enlaza específicamente.

Dichos anticuerpos específicos pueden, por ejemplo, ser obtenidos mediante inmunización usando los péptidos antes mencionados.

La descripción se refiere además a un conjugado entre un agente descrito en la presente invención que se enlaza a un antígeno asociado al tumor o a una parte del mismo, o un anticuerpo y un agente terapéutico o de diagnóstico. En una realización, el agente terapéutico o de diagnóstico es una toxina.

En un aspecto adicional, la descripción se refiere a un kit para detectar la expresión o la expresión anormal de un antígeno asociado a un tumor identificado de acuerdo con la invención, cuyo kit comprende agentes para la detección o la determinación de la cantidad (i) del ácido nucleico que codifica para el antígeno asociado al tumor o de una parte del mismo, (ii) del antígeno asociado al tumor o de una parte del mismo, (iii) de anticuerpos que se enlazan al antígeno asociado al tumor o a una parte del mismo, y/o (iv) de células T que son específicas para el antígeno asociado al tumor o una parte del mismo o un complejo del mismo con una molécula del CMH. En una realización, los agentes para la detección del ácido nucleico o la parte del mismo son moléculas de ácido nucleico para la amplificación selectiva de dicho ácido nucleico, que comprenden, en particular, una secuencia de 6-50, en particular, 10-30, 15-30 y 20-30 nucleótidos contiguos de dicho ácido nucleico.

La invención se refiere en particular a lo siguiente:

1. Una composición farmacéutica para uso en un método de terapia, que comprende uno o más componentes seleccionados del grupo que consiste en:

(i)

un antígeno asociado a un tumor o una parte extracelular del mismo,

(ii)

un ácido nucleico que codifica para un antígeno asociado a un tumor o una parte extracelular del mismo, y

(iii) una célula huésped que expresa un antígeno asociado a un tumor o una parte extracelular del mismo,

en el que dicha parte es un fragmento inmunogénico que comprende al menos 6 aminoácidos consecutivos del antígeno asociado a un tumor,

teniendo dicho antígeno asociado al tumor una secuencia codificada por un ácido nucleico que se selecciona de entre el grupo que consiste en:

(a)

un ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico de la SEC ID NO: 1, y

(b)

un ácido nucleico que es al menos un 95% idéntico al ácido nucleico de (a).

2.

La composición farmacéutica para utilizar como se describe en el punto 1, en la que la método de terapia es un método de tratamiento o prevención de un cáncer caracterizado por la expresión del antígeno asociado a un tumor de acuerdo con el punto 1, en el que el cáncer es un tumor esofágico, un tumor ovárico, un tumor de cabeza y cuello, un tumor de riñón, un tumor de hígado, un tumor de pulmón, un tumor de mama, un tumor de próstata, un tumor de colon, un tumor gástrico, un cáncer de estómago, un tumor pancreático, un carcinoma de células renales, un carcinoma de colon o un carcinoma de mama.

3.

La composición farmacéutica para utilizar como se describe en los puntos 1 y 2, en la que el antígeno asociado a un tumor comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEC ID NOs: 2, 58, 59, 60, 68 y 69.

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J. Mol. Biol. 48, 443, mediante el método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman, 1988, Proc. Nati Acad. Sci. USA 85, 2444, o mediante programas de ordenador que utilizan estos algoritmos (GAP, BESTFIT, BLAST P, BLAST N y TFASTA en Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.).

El porcentaje de identidad se calcula determinando la cantidad de posiciones idénticas entre las dos secuencias que se comparan, dividiendo este número por el número de posiciones comparadas y multiplicando por 100 el resultado obtenido de forma que se obtiene el porcentaje de identidad entre estas dos secuencias.

Los ácidos nucleicos que codifican para los antígenos asociados a tumores pueden estar presentes solos o en combinación con otros ácidos nucleicos, en particular con ácidos nucleicos heterólogos. En las formas de realización preferidas, un ácido nucleico se enlaza funcionalmente a secuencias de control de expresión o a secuencias reguladoras que pueden ser homologas o heterólogas en relación con dicho ácido nucleico. Una secuencia de codificación y una secuencia reguladora están “funcionalmente” unidas entre sí están covalentemente enlazadas entre sí de tal forma que la expresión o transcripción de dicha secuencia de codificación está bajo el control o bajo la influencia de dicha secuencia reguladora. Si la secuencia de codificación se debe traducir en una proteína funcional, entonces, con una secuencia reguladora unida funcionalmente a dicha secuencia de codificación, la inducción de dicha secuencia reguladora da lugar a la transcripción de dicha secuencia de codificación, sin provocar un cambio de marco en la secuencia de codificación o sin que dicha secuencia de codificación pueda ser traducida en la proteína o péptido deseado.

Como se utiliza aquí, el término “secuencia de control de la expresión” o “secuencia reguladora” comprende promotores, potenciadores y otros elementos de control que regulan la expresión de un gen. En las formas de realización particulares, las secuencias de control de la expresión se pueden regular. La estructura exacta de las secuencias reguladoras puede variar en función de la especie o del tipo de célula, pero normalmente comprende secuencias 5 no transcritas y 5 no traducidas que están implicadas en el inicio de la transcripción y de la traducción, respectivamente, tal como la caja TATA, la secuencia protectora, la secuencia CAAT, y similares. Más específicamente, las secuencias reguladoras 5 no transcritas comprenden una región promotora que incluye una secuencia promotora para el control transcripcional del gen unido funcionalmente. Las secuencias reguladoras también pueden comprender secuencias potenciadoras o secuencias activadoras en dirección ascendente.

Un ácido nucleico puede además estar presente en combinación con otro ácido nucleico que codifica para un péptido que controla la secreción de la proteína o el péptido codificado por dicho ácido nucleico de una célula huésped. También puede estar presente un ácido nucleico en combinación con otro ácido nucleico que codifica para un péptido que provoca que la proteína o el péptido codificado se ancle a la membrana celular de la célula huésped

o compartimentada en orgánulos especiales de dicha célula. De forma similar, es posible una combinación con un ácido nucleico que representa un gen reportero o una de las “etiquetas”.

Una molécula de ácido nucleico recombinante es, por ejemplo, un vector, adecuado para un promotor, que controla la expresión de un ácido nucleico, por ejemplo un ácido nucleico que codifica para un antígeno asociado a un tumor identificado según la invención. El término “vector” se utiliza en la presente memoria en su significado más general y comprende un vehículo intermediario para un ácido nucleico que permite que dicho ácido nucleico, por ejemplo se introduzca en células procariotas y/o eucariotas y, cuando proceda, se integre en el genoma. Preferentemente, los vectores de este tipo se replican y/o se expresan en la célula. Se puede adaptar un vehículo intermediario, por ejemplo para su utilización en la electroporación, en el bombardeo con microproyectiles, en la administración liposomal, en la transferencia con la ayuda de agrobacterias o en la inserción a través de virus ADN o ARN. Los vectores comprenden plásmidos, fagémidos, bacteriófagos o genomas víricos.

Los ácidos nucleicos que codifican para un antígeno asociado a un tumor se pueden utilizar para la transfección de células huésped. Los ácidos nucleicos significan tanto ADN como ARN recombinante. El ARN recombinante se puede preparar mediante una transcripción in vitro de un patrón de ADN. Además, se puede modificar mediante secuencias de estabilización, tapón y poliadenilación antes de su aplicación.

De acuerdo con la invención, el término “célula huésped” se refiere a cualquier célula que pueda ser transformada o transfectada con un ácido nucleico exógeno. El término células huésped comprende de acuerdo con la invención células procariotas (por ejemplo, £. co/í) o eucariotas (por ejemplo, células dendríticas, células B, células CHO, células COS, células K562, células de levadura y células de insecto). Se da particular preferencia a células de mamífero tales como las células de humanos, ratones, hámsteres, cerdos, cabras, primates. Las células pueden derivarse de una multiplicidad de tipos de tejidos y comprenden células primarias y líneas celulares. Los ejemplos específicos comprenden queratinocitos, células de sangre periférica, células madre de la médula ósea y células madre embrionarias. En otras formas de realización, la célula huésped es una célula presentadora de antígeno, en particular una célula dendrítica, un monocito o un macrófago. Un ácido nucleico puede estar presente en la célula huésped en la forma de una sola copia o de dos o más copias y, en una forma de realización, se expresa en la célula huésped.

El término "expresión" se utiliza en su significado más general y comprende la producción de ARN o de ARN y proteína. También comprende la expresión parcial de ácidos nucleicos. Además, la expresión se puede llevar a cabo

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Por “ARN pequeño interferente” o “ARNpi”, tal como se utiliza en la presente memoria, se entiende una molécula aislada de ARN, preferentemente mayor de 10 nucleótidos de longitud, más preferentemente mayor a 15 nucleótidos de longitud, y más preferentemente 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ó 30 nucleótidos de longitud que se utiliza para identificar un gen diana o ARNm que se debe degradar. Un intervalo de 19-25 nucleótidos es el tamaño preferido para los ARNpi.

Los ARNpi descritos en el presente documento pueden comprender ARN parcialmente purificado, ARN sustancialmente puro, ARN sintético o ARN producido de forma recombinante, así como ARN alterado que se diferencia del ARN que se da de forma natural por la adición, delección, sustitución y/o alteración de uno o más nucleótidos. Estas alteraciones pueden incluir la adición de material no nucleótido, como al extremo/extremos del ARNpi o a uno o más nucleótidos internos del ARNpi; modificaciones que hacen al ARNpi resistente a la digestión por la nucleasa (por ejemplo, la utilización de ribonucleótidos sustituidos en 2’ o modificaciones del esqueleto del azúcar-fosfato) ; o la sustitución de uno o más nucleótidos en el ARNpi con desoxirribonucleótidos. Además, el ARNpi se puede modificar para aumentar su estabilidad como se ha descrito anteriormente mediante oligonucleótidos modificados, en particular mediante la introducción de una o más uniones fosforotioato.

Una o ambas hebras del ARNpi pueden comprender también un extremo 3’ saliente. Tal como se utiliza en la presente memoria, un “extremo 3’ saliente” se refiere a por lo menos un nucleótido no emparejado que se extiende desde el extremo de 3’ de una hebra de ADN. Por consiguiente, en una forma de realización, el ARNpi comprende por lo menos un extremo 3’ saliente de 1 a aproximadamente 6 nucleótidos de longitud (que incluye ribonucleótidos

o desoxirribonucleótidos) , preferentemente de 1 a aproximadamente 5 nucleótidos de longitud, más preferentemente de 1 a aproximadamente 4 nucleótidos de longitud y especialmente preferentemente de 2 a aproximadamente 4 nucleótidos de longitud. En la forma de realización en la que ambas hebras de la molécula comprenden un extremo 3‘ saliente, la longitud de los salientes puede ser igual o diferente para cada hebra. En una forma de realización más preferida, el extremo 3’ saliente está presente en ambas hebras del ARNpi, y presenta 2 nucleótidos de longitud. Por ejemplo, cada hebra del ARNpi de la invención puede comprender extremos 3’ salientes de ácido didesoxitimidílico (“TT”) o ácido diuridílico (“uu”) .

Para aumentar la estabilidad del ARNpi, los extremos 3’ salientes también se pueden estabilizar frente a la degradación. En una forma de realización, los salientes se estabilizan incluyendo nucleótidos purina, como nucleótidos de adenosina o guanosina. Alternativamente, se tolera la sustitución de nucleótidos de pirimidina con análogos modificados, por ejemplo, la sustitución de los nucleótidos de uridina en los extremos 3’ salientes con 2’desoxitimidina y no afecta a la eficacia de la degradación del ARNi. En particular, la ausencia de 2’-hidroxilo en la 2’desoxitimidina aumenta significativamente la resistencia a la nucleasa del extremo 3’ salientes en medios de cultivo tisulares.

Las hebras sentido y antisentido del ARNpi pueden comprender dos moléculas de ARN de hebra única complementarias o pueden comprender una sola molécula en la que dos porciones complementarias están emparejadas por las bases y están unidas covalentemente por un área “horquilla” de hebra simple. Es decir, la región sentido y la región antisentido pueden estar conectadas covalentemente a través de una molécula de enlace. La molécula de enlace puede ser una molécula de enlace polinucleótido o no nucleótido. Sin vincularse a una teoría en concreto, se cree que el área horquilla del último tipo de la molécula de ARNpi está adherida intracelularmente por la proteína “Dicer” (o su equivalente) para formar un ARNpi de dos moléculas de ARN individuales emparejadas por las bases.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el “ARNm diana” se refiere a una molécula de ARN que es la diana para la disminución de la regulación.

El ARNpi se puede expresar a partir de los vectores de expresión pol III sin un cambio en el sitio diana, ya que se cree que la expresión del ARNs a partir de los promotores pol III sólo es eficaz cuando el primer nucleótido transcrito es una purina.

Según la invención, se puede hacer diana en el ARNpi en cualquier tramo de los aproximadamente 19-25 nucleótidos adyacentes de las secuencias diana del ARNm (la “secuencia diana”) . Las técnicas para la selección de las secuencias diana para el ARNpi se proporcionan, por ejemplo, en Tuschl T. et al., “The siRNA User Guide”, revisado el 11 de octubre de 2002, cuya descripción completa se incorpora en la presente memoria como referencia. “The siRNA User Guide” está disponible en Internet en una página gestionada por el Dr. Thomas Tuschl, Laborator y of RNA Molecular Biology, Rockefeller University, New York, USA, y se puede encontrar accediendo a la página de la Rockefeller University y buscando la palabra clave “siRNA”. Por consiguiente, la hebra sentido del presente ARNpi comprende una secuencia de nucleótidos sustancialmente idéntica a uno de los tramos adyacentes de aproximadamente 19 a aproximadamente 25 nucleótidos en el ARNm diana.

Generalmente, una secuencia diana en el ARNm diana se puede seleccionar a partir de una secuencia dada de ADNc que corresponde al ARNm diana, preferentemente comenzando de 50 a 100 nt hacia 3’ (es decir, en la dirección del extremo 3’) desde el codón de inicio. Sin embargo, la secuencia diana puede estar situada en las regiones 5’ o 3’ no traducidas, o en la región próxima al codón de inicio.

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El ARNpi se puede obtener utilizando varias técnicas conocidas por los expertos en la materia. Por ejemplo, el ARNpi se puede sintetizar químicamente o producir de forma recombinante utilizando unos procedimientos conocidos en la técnica, como el sistema in vitro con Drosophila descrito en la solicitud publicada en US 2002/0086356 de Tuschl et al.

Preferentemente, el ARNpi se sintetiza químicamente utilizando ribonucleósido-fosforamiditas protegidas adecuadamente y un sintetizador de ADN/ARN convencional. El ARNpi se puede sintetizar como dos moléculas separadas de ARN complementarias, o como una sola molécula de ARN con dos regiones complementarias.

Alternativamente, el ARNpi también se puede expresar a partir de plásmidos de ADN lineales o circulares recombinantes utilizando un promotor adecuado. Estas formas de realización se incluyen cuando se hace referencia en la presente memoria a la administración de ARNpi o a la incorporación de ARNpi en composiciones farmacéuticas. Los promotores adecuados para expresar el ARNpi de la invención a partir de un plásmido incluyen, por ejemplo, las secuencias del promotor U6 ó H1 ARN pol III y el promotor citomegalovirus.

La selección de otros promotores adecuados forma parte de las habilidades del experto en la materia. Los plásmidos recombinantes descritos en la presente memoria también pueden comprender promotores inducibles o regulables para la expresión del ARNpi en un tejido particular o en un entorno intracelular particular.

El ARNpi expresado a partir de plásmidos recombinantes se puede aislar a partir de sistemas de expresión de células cultivadas mediante técnicas habituales, o se puede expresar intracelularmente. La utilización de plásmidos recombinantes para distribuir el ARNpi a células in vivo se expone a continuación. El ARNpi se puede expresar a partir de un plásmido recombinante como dos moléculas de ARN complementarias separadas o como una sola molécula de ARN con dos regiones complementarias.

La selección de plásmidos adecuados para la expresión del ARNpi, los procedimientos para la inserción de las secuencias de ácido nucleico para la expresión del ARNpi en el plásmido, y los procedimientos para distribuir el plásmido recombinantes en las células de interés forman parte de las habilidades del experto en la materia.

El ARNpi también se puede expresar a partir de vectores virales recombinantes intracelularmente in vivo. Los vectores virales recombinantes comprenden secuencias que codifican para el ARNpi y un promotor adecuado para la expresión de las secuencias de ARNpi. Los vectores virales recombinantes también pueden comprender promotores inducibles o regulables para la expresión del ARNpi en un tejido en particular o en un entorno intracelular en particular. El ARNpi se puede expresar a partir de un vector viral recombinante como dos moléculas de ARN complementarias separadas o como una sola molécula de ARN con dos regiones complementarias.

El término “péptido” comprende oligo y polipéptidos y se refiere a sustancias que comprenden dos o más, preferiblemente 3 o más, preferiblemente 4 o más, preferiblemente 6 o más, preferiblemente 8 o más, preferiblemente 10 o más, preferiblemente 13 o más, preferiblemente 16 o más, preferiblemente 21 o más y preferiblemente hasta 8, 10, 20, 30, 40 o 50, en particular 100 aminoácidos unidos en forma covalente mediante enlaces peptídicos. El término “proteína” se refiere a péptidos grandes, preferiblemente a péptidos con más de 100 residuos de aminoácidos, pero en general los términos “péptidos” y “proteínas” son sinónimos y se utilizan en la presente invención de forma intercambiable.

Preferiblemente, las proteínas y los péptidos descritos aquí han sido aislados. Los términos “proteína aislada” o “péptido aislado” significan que la proteína o el péptido han sido separados de su ambiente natural. Una proteína o un péptido aislado pueden estar en un estado esencialmente purificado. El término “esencialmente purificado”·significa que la proteína o el péptido están presentes esencialmente libres de otras sustancias con las que están asociados de forma natural o in vivo.

Tales proteínas y péptidos se pueden utilizar, por ejemplo, en la producción de anticuerpos y en un ensayo inmunológico o de diagnóstico o como agentes terapéuticos. Las proteínas y los péptidos descritos de acuerdo con la invención se pueden aislar a partir de muestras biológicas tales como tejidos o homogeneizados celulares y también se puede expresar de forma recombinante en múltiples sistemas de expresión procariotas o eucariotas.

Como se utiliza aquí, “derivados” de una proteína o péptido o de una secuencia de aminoácidos comprenden variantes de inserción de aminoácidos, variantes de supresión de aminoácidos y/o variantes de sustitución de aminoácidos.

Las variantes de inserción de aminoácidos comprenden fusiones del terminal amino y/o carboxilo y también inserciones de uno o dos o más aminoácidos en una secuencia particular de aminoácidos. En el caso de las variantes de secuencia de aminoácidos que tienen una inserción, se insertan uno o más residuos de aminoácidos en un sitio determinado de una secuencia de aminoácidos, aunque también es posible una inserción aleatoria con un cribado adecuado del producto resultante. Las variantes de supresión de aminoácidos se caracterizan por la eliminación de uno o más aminoácidos de la secuencia. Las variantes de sustitución de aminoácidos se caracterizan por la remoción de por lo menos un residuo en la secuencia y la inserción de otro residuo en su lugar. Se da preferencia a las modificaciones en posiciones en la secuencia de aminoácidos que no se conservan entre las proteínas o péptidos homólogos y/o para reemplazar aminoácidos por otros que tienen propiedades similares tales

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realizar la transferencia adoptiva utilizando estos linfocitos T genéticamente alterados (Stanislawski et al., Nat Immunol. 2: 962-70, 2001 Kessels et al., Nat Immunol. 2: 957-61, 2001) .

La transferencia adoptiva no es la única forma de terapia que puede ser aplicada. Los linfocitos T citotóxicos también se pueden generar in vivo de la manera conocida per se. Un procedimiento utiliza células no proliferativas que expresan el complejo. Las células que se utilizan en este caso serán las células que normalmente expresan el complejo, tales como células de tumor irradiadas o células transfectadas con uno o más genes necesarios para la presentación del complejo (es decir, el péptido antigénico y la molécula presentadora del CMH) . Otra forma preferida es la introducción del antígeno asociado a un tumor en la forma de ARN recombinante que se puede introducir en las células, por ejemplo, mediante transferencia liposomal o mediante electroporación. Las células resultantes presentan el complejo de interés y son reconocidas por los linfocitos T citotóxicos autólogos que después se propagan.

Se puede conseguir un efecto similar combinando el antígeno asociado a un tumor o un fragmento suyo con un adyuvante para hacer que sea posible la incorporación in vivo en las células presentadoras de antígeno. El antígeno asociado a un tumor o un fragmento suyo puede estar representado como una proteína, como ADN (por ejemplo, dentro de un vector) o como ARN. El antígeno asociado a un tumor se procesa para producir un complementario del péptido para la molécula del CMH, mientras que su fragmento puede ser presentado sin la necesidad de un procesamiento adicional. Este último es el caso en particular, si éstos se pueden unir a las moléculas del CMH. Resultan preferidas las formas de administración en las que el antígeno completo se procesa in vivo por una célula dendrítica, ya que esto también producirá respuestas de los linfocitos T cooperadores que son necesarios para una respuesta inmunitaria eficaz (Ossendorp et al., Immunol Lett. 74: 75-9, 2000; Ossendorp et al., J. Exp. Med. 187: 693-702, 1998) . En general, es posible administrar una cantidad eficaz de antígeno asociado a un tumor a un paciente, por ejemplo, mediante una inyección intradérmica. Sin embargo, la inyección también se puede realizar intranodalmente en un nódulo linfático (Maloy et al., Proc Natl Acad Sci USA 98: 3299-303, 2001) .

Las composiciones farmacéuticas y métodos de tratamiento descritos según la invención también pueden usarse para inmunización o vacunación para tratar terapéuticamente o prevenir una enfermedad descrita en este documento. De acuerdo con la invención, los términos "inmunización" o "vacunación" se refieren preferiblemente a un incremento en o activación de una respuesta inmune a un antígeno. Es posible utilizar modelos animales para analizar un efecto inmunizante sobre el cáncer mediante el uso de un antígeno asociado a un tumor o un ácido nucleico que lo codifica. Por ejemplo, se pueden introducir células cancerosas humanas en un ratón para generar un tumor, y se pueden administrar uno o más ácidos nucleicos que codifican para los antígenos asociados al tumor. El efecto sobre las células cancerosas (por ejemplo, reducción en el tamaño del tumor) puede medirse como una medida de la eficacia de una inmunización por el ácido nucleico.

Como parte de la composición para una inmunización o vacunación, preferentemente se administran uno o más antígenos asociados al tumor o fragmentos suyos estimulados conjuntamente con uno o más adyuvantes para inducir una respuesta inmunitaria o para aumentar una respuesta inmunitaria. Un adyuvante es una sustancia que se incorpora al antígeno o que se administra conjuntamente con este último y que aumenta la respuesta inmunitaria. Los adyuvantes pueden aumentar la respuesta inmunitaria proporcionando un depósito de antígenos (extracelularmente o en macrófagos) , activando macrófagos y/o estimulando determinados linfocitos. Los adyuvantes son conocidos y comprenden, de manera no limitativa, monofosforil lípido A (MPL, SmithKline Beecham) , saponinas como la QS21 (SmithKline Beecham) , DQS21 (SmithKline Beecham; WO 96/33739) , la QS7, la QS17, la QS18 y la QS-L1 (So et al., Mol. Cells 7: 178-186, 1997) , adyuvante incompleto de Freund, adyuvante completo de Freund, vitamina E, montanide, alumbre, oligonucleótidos CpG (cf. Kreig et al., Nature 374: 546-9, 1995) y varias emulsiones de agua en aceite preparadas a partir de aceites biológicamente degradables como el escualeno y/o tocoferol. Preferentemente, los péptidos se administran en una mezcla con DQS21/MPL. La proporción de DQL21 en relación al MPL es habitualmente de aproximadamente 1:10 a 10:1, preferentemente de aproximadamente 1:5 a

5:1 y en particular de aproximadamente 1:1. Para la administración en humanos, una formulación de vacuna contiene habitualmente DQS21 y MPL en un intervalo de entre aproximadamente 1 µg hasta aproximadamente 100 µg.

También se pueden administrar otras sustancias que estimulan una respuesta inmunitaria del paciente. Es posible por ejemplo, utilizar citocinas en una vacunación, debido a sus propiedades reguladoras sobre los linfocitos. Estas citocinas comprenden, por ejemplo, interleucina-12 (IL-12) que ha demostrado que aumenta las acciones protectoras de las vacunas (cf. Science 268: 1432-1434, 1995) , GM-CSF y IL-18.

Existen varios componentes que aumentan la respuesta inmunitaria y que, por consiguiente, se pueden utilizar en una vacunación. Estos compuestos comprenden moléculas coestimuladoras proporcionadas en la forma de proteínas o ácidos nucleicos como B7-1 y B7-2 (CD80 y CD86, respectivamente)

La invención también proporciona péptidos y proteínas para la administración de ácidos nucleicos. Las proteínas y los péptidos se pueden administrar de una forma conocida per se. En una realización, los ácidos nucleicos se administran mediante procedimientos ex vivo, es decir, extrayendo las células de un paciente, modificando genéticamente dichas células para incorporar un antígeno asociado a un tumor y reintroducción en el paciente de las células alteradas. Esto generalmente comprende la introducción in vitro de una copia funcional de un gen en las

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células de un paciente y la reintroducción de las células genéticamente alteradas en el paciente. La copia funcional del gen está bajo el control funcional de elementos reguladores que permiten que el gen se exprese en las células alteradas genéticamente. Los procedimientos de transfección y transducción son conocidos por el experto en la materia. La invención también proporciona ácidos nucleicos para administración in vivo utilizando vectores, tales como virus y liposomas con control de diana. Si se hace referencia según la invención a la administración o incorporación en composiciones farmacéuticas de ácidos nucleicos esto incluye formas de realización en las que el ácido nucleico está presente en estos vectores.

En una forma de realización preferida, se selecciona un virus o un vector viral para la administración de un ácido nucleico que codifica para un antígeno asociado a un tumor de entre el grupo que consiste en adenovirus, virus asociados a adenovirus, pox virus, que incluyen la vacuna del virus y atenuados de pox virus, virus Semliki Forest, retrovirus, virus Sindbis y partículas similares a los virus Ty. En especial, resultan preferidos los adenovirus y los retrovirus. Los retrovirus son normalmente deficientes para la replicación (es decir, son incapaces de generar partículas infecciosas) .

Los procedimientos para la introducción in vitro o in vivo de ácidos nucleicos en las células comprende la transfección de ácidos nucleicos precipitados por fosfato cálcico, la transfección de ácidos nucleicos asociados a DEAE, transfección o infección con los virus indicados anteriormente que portan los ácidos nucleicos de interés, la transfección mediada por liposomas, y similares. En formas de realización determinadas, resulta preferido dirigir el ácido nucleico a determinadas células. En estas formas de realización, el vehículo utilizado para la administración de un ácido nucleico en una célula (por ejemplo, un retrovirus o un liposoma) puede presentar una molécula diana control unida. Por ejemplo, se puede incorporar una molécula, como un anticuerpo específico para una proteína de la membrana de la superficie en la célula diana o un ligando para un receptor de la célula diana en el interior o unido al vehículo de ácido nucleico. Los anticuerpos preferidos comprenden anticuerpos que se unen selectivamente a un antígeno asociado a un tumor. Si se desea una administración de un ácido nucleico a través de liposomas, se pueden incorporar proteínas que se unen a una proteína de la membrana de la superficie asociada con la endocitosis en la formulación del liposoma para hacer posible el control de la diana y/o la absorción. Estas proteínas comprenden proteínas de cápsida o sus fragmentos que son específicos para un tipo de células determinado, anticuerpos para proteínas que se internalizan, proteínas que se dirigen a un sitio intracelular, y similares.

Las composiciones terapéuticas se pueden administrar en preparaciones farmacéuticamente compatibles. Estas preparaciones pueden contener habitualmente concentraciones farmacéuticamente compatibles de sales, sustancias tampón, conservantes, vehículos, sustancias que aumentan la inmunidad suplementaria como los adyuvantes, por ejemplo, oligonucleótidos CpG, citoquinas, quimiocinas, saponinas, GM-CSF y/o ARN y, cuando sea apropiado, otros compuestos terapéuticamente activos.

Los compuestos terapéuticamente activos se pueden administrar mediante una de las vías convencionales, incluyendo la inyección o la infusión. La administración se puede realizar, por ejemplo, oralmente, intravenosamente, intraperitonealmente, intramuscularmente, subcutáneamente o trasdérmicamente. Preferentemente, los anticuerpos se administran terapéuticamente mediante un aerosol pulmonar. Los ácidos nucleicos antisentido se administran preferentemente mediante una administración intravenosa lenta.

Las composiciones descritas en la presente memoria se administran en cantidades eficaces. Una “cantidad eficaz” se refiere a la cantidad que consigue una reacción deseada o un efecto deseado por sí sola o con dosis adicionales. En el caso del tratamiento de una enfermedad determinada o de una patología determinada que se caracteriza por la expresión de uno o más antígenos asociados a un tumor, la reacción deseada se refiere preferentemente a la inhibición del curso de la enfermedad. Esto comprende frenar el progreso de la enfermedad y, especialmente, interrumpir o revertir el progreso de la enfermedad. La reacción deseada en el tratamiento de una enfermedad o de una patología también puede ser un retraso en la aparición o la prevención de la aparición de dicha enfermedad o de dicha patología. Según la invención, un diagnóstico o tratamiento de un cáncer también puede incluir el diagnóstico

o el tratamiento de la metástasis del cáncer que ya se ha formado o que se vaya a formar.

Según la invención, el término “tratamiento” comprende tratamiento terapéutico y profiláctico, es decir, prevención.

Una cantidad efectiva de una composición de la invención dependerá de la patología que se debe tratar, la gravedad de la enfermedad, los parámetros individuales del paciente, incluyendo la edad, el estado fisiológico, el tamaño y el peso, la duración del tratamiento, el tipo de la terapia de acompañamiento (si está presente) , la vía específica de administración y factores similares.

Las composiciones farmacéuticas de la invención son preferentemente estériles y contienen una cantidad eficaz de la sustancia terapéuticamente activa para generar la reacción deseada o el efecto deseado.

Las dosis administradas de las composiciones de la invención dependerán de varios parámetros como el tipo de administración, el estado del paciente, el periodo de administración deseado, etc. En el caso de que una administración en el paciente sea insuficiente con una dosis inicial, se pueden utilizar dosis más elevadas (o dosis más elevadas eficaces que se consiguen mediante una vía de administración diferente, más localizada) .

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24-04-2015

Tejidos normales

Expresión Tipo de tumor Expresión

Nódulos linfáticos

-

Bazo

+

PBMC

-

Próstata

-

+

La expresión selectiva y elevada de los transcritos de ISC468 en los tumores no se conocía anteriormente y se puede utilizar, según la invención, para procedimientos de diagnóstico molecular como RT-PCR para detectar células tumorales diseminadas en el suero y en la médula ósea y para detectar metástasis en otros tejidos. Esta molécula se puede utilizar además como diana específica para estrategias terapéuticas.

Según la invención, los péptidos siguientes, entre otros, se seleccionaron para la producción de anticuerpos específicos para ISC-468: SEC ID NO: 58, 59, 60, 68, 69, 2. La especificidad de los anticuerpos se confirmó mediante análisis por inmunoflorescencia de las células transfectadas ISC-468-eGFP (figura 4A) .

Se analizó la localización subcelular de ISC-468 en las líneas celulares de carcinoma de mama MCF-7 y BT-549 para la expresión de forma endógena mediante análisis por inmunofluorescencia. La tinción tanto de las células fijadas con MeOH (figura 4B) como de las no fijadas (figura 4C) reveló que el ISC-468 se encuentra en las membranas plasmáticas de las células que lo expresan. La especificidad de la tinción se confirmó mediante el silenciamiento de la expresión del ISC-468 inducido por ARNi, dando como resultado la pérdida de tinción en la membrana plasmática.

Además, se utilizaron los anticuerpos específicos para ISC-468 para el análisis inmunohistoquímico de la expresión del ISC-468 en muestras clínicas de mama normales y carcinomas de mama. La expresión del ISC-468 no se detectó en las muestras de mamas normales (figura 5A, B) . Por el contrario, las muestras de carcinoma de mama mostraron una expresión fuerte y homogénea del ISC-468 (figura 5C, D) . Las señales se acentuaron en la membrana plasmática de las células que expresaban las células cancerosas, confirmando que el ISC-468 es una proteína de la membrana que se expresa selectivamente en las células cancerosas.

Según la invención, los dominios extracelulares del ISC-468 se pueden utilizar como estructura diana para el inmunodiagnóstico y la terapia mediante anticuerpos monoclonales. Además, el ISC-468 se puede utilizar según la invención como vacuna (ARN, ADN, proteína, péptido) para inducir respuestas inmunitarias específicas para el tumor (respuestas inmunitarias mediadas por los linfocitos T y B) .

El silenciamiento de la expresión del ISC-468 inducido por ARNi se consiguió mediante la transfección de células con dúplex de ARNpi que hacen diana específicamente en el ARNm del ISC-468 (SEC ID NO: 70-73) . La transfección de las líneas celulares de carcinoma de mama MCF-7 y BT-549 que expresan de forma endógena dio como resultado una reducción estable y específica de la expresión del ARNm del ISC-468 (figura 6) .

Para obtener más conocimiento sobre el papel fisiológico de la expresión del ISC-468 se realizaron varios ensayos celulares in vitro basados en el ARNi. La transfección de las líneas celulares de carcinoma de mama MCF-7 y BT549 con dúplex de ARNpi dio como resultado una reducción evidente de la proliferación celular en comparación con los controles respectivos, tal como se analizó en un ensayo de proliferación basado en BrdU (figura 7) . El análisis del ciclo celular basado en FACS mostró que la derogación de la proliferación celular dio como resultado una detención del G1/S (figura 8A, B) . Adicionalmente, se podría mostrar que el silenciamiento del ISC-468 inducido por ARNi afecta notablemente la vía de señalización AKT en las células cancerosas que expresan endógenamente mediante la inhibición de la fosforilación de AKT (figura 9) . Además, la proliferación de las células MCF-7 se atenuó cuando las células se incubaron con anticuerpos específicos para el ISC-468 generados contra péptidos específicos de ISC468 (SEC ID NO: 68, 69) en comparación con un anticuerpo de control irrelevante (figura 10). Estos resultados indican que el ISC-468 es un factor fundamental para la proliferación de las células cancerosas presumiblemente mediante la mediación en la activación inducida por el factor de crecimiento de la vía de señalización AKT y otros. El ISC-468 mismo puede representar un receptor, correceptor o chaperona unida a la membrana para los factores de crecimiento, quimiocinas u otras sustancias.

Además, se analizó el impacto de la expresión del ISC-468 en la capacidad de migración de las células cancerosas. El silenciamiento de la expresión de ISC-468 inducido por ARNi en las líneas celulares de carcinoma de mama MCF7 y BT-549 dio como resultado una deficiencia evidente de la quimiotaxis, quimiocinesis y la invasión de las células, tal como se evaluó en los ensayos de migración transpocillo (figura 11A, B, C) . La quimiotaxis, la quimiocinesis y la invasión son actores fundamentales para la metástasis de las células cancerosas a otros órganos. Por consiguiente, la expresión del ISC-468 en las células cancerosas puede ser un factor positivo para la metástasis de las células cancerosas.

En los carcinomas de mama, se podría mostrar que la expresión del ISC-468 corresponde al estado del receptor de estrógeno del tumor. El análisis cuantitativo por RT-PCR en tiempo real de la expresión de ISC-468 en 60 muestras

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