JP2015017117A - 抗原特異的な免疫応答を高めるための組成物及び方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】哺乳類において抗原特異的な免疫応答を誘導する又は高める方法を提供すること。
【解決手段】過剰増殖疾患、例えば、癌、の再発を治療または予防する方法が記載されている。方法には、哺乳動物に有効量の抗原または生物学的に活性なそのホモログをコードした核酸組成物を投与することにより哺乳動物を初回抗原刺激し、哺乳動物に有効量の抗原または生物学的に活性なそのホモログをコードした核酸を含む腫瘍退縮ウイルスを投与することにより哺乳動物を追加免役することを含むことができる。特定の実施形態では、核酸組成物はDNAワクチンである。一部の実施形態では、核酸組成物は、皮内、腹腔内及び静脈内から成る群から投与される。
【選択図】なし
【解決手段】過剰増殖疾患、例えば、癌、の再発を治療または予防する方法が記載されている。方法には、哺乳動物に有効量の抗原または生物学的に活性なそのホモログをコードした核酸組成物を投与することにより哺乳動物を初回抗原刺激し、哺乳動物に有効量の抗原または生物学的に活性なそのホモログをコードした核酸を含む腫瘍退縮ウイルスを投与することにより哺乳動物を追加免役することを含むことができる。特定の実施形態では、核酸組成物はDNAワクチンである。一部の実施形態では、核酸組成物は、皮内、腹腔内及び静脈内から成る群から投与される。
【選択図】なし
Description
関連出願との相互参照
本出願は、その内容が全体として参照によって本明細書に具体的に組み入れられる、2009年4月28日に出願された米国特許仮出願第61/173413号の利益を主張する。
本出願は、その内容が全体として参照によって本明細書に具体的に組み入れられる、2009年4月28日に出願された米国特許仮出願第61/173413号の利益を主張する。
政府の支援
本発明は、米国国立癌研究所によって授与された助成金番号P50CA098252及びRO1CA114425のもとでの政府の支援によって為された。政府は本発明に特定の権利を有する。
本発明は、米国国立癌研究所によって授与された助成金番号P50CA098252及びRO1CA114425のもとでの政府の支援によって為された。政府は本発明に特定の権利を有する。
癌の免疫療法は、多数の腫瘍や過剰増殖性疾患の治療に展望を示してきたが、それらの有用性は、腫瘍が相対的に大きく、速く増殖している状況に限定される。たとえば、進行した段階の癌は治療するのが極めて難しく、稀にしか治癒することはない。早期発見及び進行した段階の癌の治療を改善する尽力は相対的に不首尾であった。進行した疾患の既存の治療法、たとえば、化学療法及び放射線療法は、局所に進行した又は転移性の疾患を持つ患者の全体的な生存率を改善することはなかった(早期乳癌被験者共同グループ()。従って、特に進行段階に進んでいる場合の過剰増殖性疾患の制御のための革新的な治療方法を開発する強いニーズがある。
一実施形態では、本発明は少なくとも部分的に、哺乳類において抗原特異的な免疫応答を誘導する又は高める方法を指向するものであり、該方法は、(a)抗原又は生物学的に活性のあるそのホモログをコードする核酸組成物の有効量を哺乳類に投与することによって哺乳類を感作する工程と、(b)抗原又は生物学的に活性のあるそのホモログをコードする核酸を含む腫瘍崩壊性ウイルスの有効量を哺乳類に投与することにより哺乳類を追加免疫し、それによって抗原特異的な免疫応答を高める工程を含む。一部の実施形態では、抗原は、哺乳類にとって外来性である腫瘍関連抗原(TAA)であり、及び/又は卵白アルブミン、HPV、E6及びHPV E7が含まれる。さらに別の実施形態では、抗原は、配列番号139のアミノ酸配列に少なくとも90%一致するアミノ酸配列を含む卵白アルブミンタンパク質を含む。さらにほかの実施形態では、抗原は、LSRHFMHQKRTAMFQDPQERPRKLPQ及びAMFQDPQERPRKLPQLCTELQTTIHDIILECから成る群から選択されるアミノ酸配列に少なくとも90%一致するアミノ酸配列を含むHPV E7タンパク質を含む。一実施形態では、抗原は、PTLHEYMLDLQPETTDLYCYEQ、HEYMLDLQPET、TLHEYMLDLQPETTD、EYMLDLQPETTDLY、DEIDGPAGQAEPDRAHY及びGPAGQAEPDRAHYNIから成る群から選択されるアミノ酸配列に少なくとも90%一致するアミノ酸配列を含むHPV E7タンパク質を含む。
特定の実施形態では、核酸組成物はDNAワクチンである。一部の実施形態では、核酸組成物は、皮内、腹腔内及び静脈内から成る群から投与される。特定の実施形態では、哺乳類は腫瘍を有するヒトであり、核酸組成物は腫瘍内又は腫瘍周辺に投与される。一部の実施形態では、腫瘍崩壊性ウイルスは、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、単純性ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、水疱性口内炎ウイルス、麻疹ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、インフルエンザウイルス、及びレオウイルスから成る群から選択される。さらに別の実施形態では、腫瘍崩壊性ウイルスは、チミジンキナーゼ陰性である。特定の実施形態では、腫瘍崩壊性ウイルスは、皮内、腹腔内及び静脈内から成る群から投与される。一部の実施形態では、哺乳類は腫瘍を有するヒトであり、腫瘍崩壊性ウイルスは、腫瘍内又は腫瘍周辺に投与される。さらにほかの実施形態では、核酸組成物は腫瘍崩壊性ウイルスの中に存在する。ほかの実施形態では、工程(a)の腫瘍崩壊性ウイルスは、工程(b)の腫瘍崩壊性ウイルスと同一であるか、又は異なっている。さらにほかの実施形態では、工程(a)は、工程(b)の前に実施され、工程(a)と工程(b)は同時に実施され、又は工程(a)は工程(b)の後に実施される。さらに別の実施形態では、工程(a)及び/又は工程(b)は少なくとも1回繰り返される。一実施形態では、工程(a)及び/又は工程(b)で使用される投与量は1×10^7pfuを含む範囲である。
特定の実施形態では、抗原特異的な免疫応答は、核酸組成物単独の投与によって誘導される抗原特異的な免疫応答よりも程度が大きい。ほかの実施形態では、抗原特異的な免疫応答には少なくとも部分的にCD8+細胞傷害性Tリンパ球(CTL)が介在する。ほかの実施形態では、抗原特異的な免疫応答には少なくとも部分的にCD8−細胞傷害性Tリンパ球(CTL)及び/又は腫瘍周辺の間質細胞が介在する。さらに別の実施形態では、方法には、有効量の化学療法剤を投与することが含まれる。
さらにほかの実施形態では、方法には抗原に対する抗体の存在について哺乳類をスクリーニングすることが含まれる。一部の実施形態では、哺乳類はヒトである。ほかの実施形態では、哺乳類は癌に冒されている。
本発明は、哺乳類において進行した段階の癌を治療する又は予防する方法を指向するものであり、該方法は、(a)抗原又は生物学的に活性のあるそのホモログをコードする核酸組成物の有効量を哺乳類に投与することによって哺乳類を感作する工程と、(b)抗原又は生物学的に活性のあるそのホモログをコードする核酸を含む腫瘍崩壊性ウイルスの有効量を哺乳類に投与することにより哺乳類を追加免疫し、それによって抗原特異的な免疫応答を高める工程を含む。一部の実施形態では、進行した段階の癌は、黒色腫又は胸腺腫を含む、本明細書で記載される癌である。
本発明はまた少なくとも部分的に、感作組成物及び追加免疫組成物を含むキットを指向するものであり、該キットは、(a)免疫原性の外来抗原をコードするDNAと薬学上許容可能な担体を含む感作組成物と、(b)前記外来抗原をコードするウイルスと薬学上許容可能な担体を含む追加免疫組成物を含む。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される:
(項目1)
哺乳動物の抗原特異的免疫応答を誘導または高める方法であって、
(a)哺乳動物に抗原または生物学的に活性なそのホモログをコードした有効量の核酸組成物を投与することにより哺乳動物に初回抗原刺激を行うステップと、
(b)抗原または生物学的に活性なそのホモログをコードした核酸を含む有効量の腫瘍退縮ウイルスを哺乳動物に投与することにより哺乳動物に追加免疫を行うステップ、
を含み、それによって、抗原特異的免疫応答を誘導または高める方法。
(項目2)
抗原が腫瘍関連抗原(TAA)である項目1記載の方法。
(項目3)
抗原が哺乳動物に対し外来性である項目1記載の方法。
(項目4)
抗原が卵白アルブミン、HPVE6、およびHPVE7からなる群より選択される項目1記載の方法。
(項目5)
抗原が、配列番号139のアミノ酸配列に少なくとも90%同等であるアミノ酸配列を含む卵白アルブミンタンパク質を含む項目4記載の方法。
(項目6)
抗原が、LSRHFMHQKRTAMFQDPQERPRKLPQおよびAMFQDPQERPRKLPQLCTELQTTIHDIILECからなる群より選択されるアミノ酸配列に少なくとも90%同等であるアミノ酸配列を含むHPV E7タンパク質を含む項目4記載の方法。
(項目7)
抗原が、PTLHEYMLDLQPETTDLYCYEQ、HEYMLDLQPET、TLHEYMLDLQPETTD、EYMLDLQPETTDLY、DEIDGPAGQAEPDRAHYおよびGPAGQAEPDRAHYNIからなる群より選択されるアミノ酸配列に少なくとも90%同等であるアミノ酸配列を含むHPV E7タンパク質を含む項目4記載の方法。
(項目8)
核酸組成物がDNAワクチンである項目1記載の方法。
(項目9)
核酸組成物が皮内投与、腹腔内投与、および静脈内投与からなる群より選択されて投与される項目1記載の方法。
(項目10)
哺乳動物が腫瘍を有するヒトであり、核酸組成物が腫瘍内または腫瘍周囲に投与される項目1記載の方法。
(項目11)
腫瘍退縮ウイルスが、ワクチニアウイルス、アデノウイルス、単純疱疹ウィルス、ポックスウイルス、水疱性口内炎ウイルス、麻疹ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、インフルエンザウイルス、およびレオウイルスからなる群より選択される項目1記載の方法。(項目12)
腫瘍退縮ウイルスがチミジンキナーゼ陰性である項目1または11のいずれか1項に記載の方法。
(項目13)
腫瘍退縮ウイルスが皮内投与、腹腔内投与、および静脈内投与からなる群から選択されて投与される項目13記載の方法。
(項目14)
哺乳動物が腫瘍を有するヒトであり、腫瘍退縮ウイルスが腫瘍内または腫瘍周辺に投与される項目1記載の方法。
(項目15)
核酸組成物が腫瘍退縮ウイルス内に存在する項目1記載の方法。
(項目16)
ステップ(a)の腫瘍退縮ウイルスがステップ(b)の腫瘍退縮ウイルスと同じ、または異なる項目15記載の方法。
(項目17)
ステップ(a)がステップ(b)の前に行わる、ステップ(a)およびステップ(b)が同時に行われる、またはステップ(a)がステップ(b)の後で行われる項目1または16のいずれか1項に記載の方法。
(項目18)
ステップ(a)および/またはステップ(b)が少なくとも1回繰り返される項目1または16のいずれか1項に記載の方法。
(項目19)
ステップ(a)および/またはステップ(b)で使われる投与量が1x10^7pfuである項目1または16のいずれか1項に記載の方法。
(項目20)
抗原特異的免疫応答が核酸組成物単独投与による抗原特異的免疫応答誘導より大きい項目1記載の方法。
(項目21)
抗原特異的免疫応答の少なくとも一部がCD8+細胞障害性Tリンパ球(CTL)によって媒介される項目1記載の方法。
(項目22)
抗原特異的免疫応答の少なくとも一部がCD8−細胞障害性Tリンパ球(CTL)によって媒介される項目1記載の方法。
(項目23)
抗原特異的免疫応答の少なくとも一部が腫瘍周囲の間質細胞によって媒介される項目1記載の方法。
(項目24)
有効量の化学療法剤を投与することをさらに含む項目1記載の方法。
(項目25)
抗原に対する抗体の存在の観点から哺乳動物を選別することをさらに含む項目1記載の方法。
(項目26)
哺乳動物がヒトである項目1記載の方法。
(項目27)
哺乳動物が癌に罹患している項目1記載の方法。
(項目28)
哺乳動物の進行期癌を治療または予防する方法であって、
(a)哺乳動物に、有効量の抗原または生物学的に活性なそのホモログをコードした核酸組成物を投与することにより哺乳動物を初回抗原刺激し、
(b)哺乳動物に有効量の抗原または生物学的に活性なそのホモログをコードした核酸を含む腫瘍退縮ウイルスを投与して哺乳動物に追加免疫することにより、抗原特異的免疫応答を誘導または強化すること、
を含む方法。
(項目29)
進行期癌が黒色腫または胸腺腫である項目28記載の方法。
(項目30)
初回抗原刺激組成物および追加免疫組成物を含むキットであって、
(a)初回抗原刺激組成物が免疫原性外来性抗原をコードしたDNAおよび薬学的に許容可能な担体を含み、さらに
(b)追加免疫組成物が前記外来性抗原をコードしたウイルスおよび薬学的に許容可能な担体を含む、
キット。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される:
(項目1)
哺乳動物の抗原特異的免疫応答を誘導または高める方法であって、
(a)哺乳動物に抗原または生物学的に活性なそのホモログをコードした有効量の核酸組成物を投与することにより哺乳動物に初回抗原刺激を行うステップと、
(b)抗原または生物学的に活性なそのホモログをコードした核酸を含む有効量の腫瘍退縮ウイルスを哺乳動物に投与することにより哺乳動物に追加免疫を行うステップ、
を含み、それによって、抗原特異的免疫応答を誘導または高める方法。
(項目2)
抗原が腫瘍関連抗原(TAA)である項目1記載の方法。
(項目3)
抗原が哺乳動物に対し外来性である項目1記載の方法。
(項目4)
抗原が卵白アルブミン、HPVE6、およびHPVE7からなる群より選択される項目1記載の方法。
(項目5)
抗原が、配列番号139のアミノ酸配列に少なくとも90%同等であるアミノ酸配列を含む卵白アルブミンタンパク質を含む項目4記載の方法。
(項目6)
抗原が、LSRHFMHQKRTAMFQDPQERPRKLPQおよびAMFQDPQERPRKLPQLCTELQTTIHDIILECからなる群より選択されるアミノ酸配列に少なくとも90%同等であるアミノ酸配列を含むHPV E7タンパク質を含む項目4記載の方法。
(項目7)
抗原が、PTLHEYMLDLQPETTDLYCYEQ、HEYMLDLQPET、TLHEYMLDLQPETTD、EYMLDLQPETTDLY、DEIDGPAGQAEPDRAHYおよびGPAGQAEPDRAHYNIからなる群より選択されるアミノ酸配列に少なくとも90%同等であるアミノ酸配列を含むHPV E7タンパク質を含む項目4記載の方法。
(項目8)
核酸組成物がDNAワクチンである項目1記載の方法。
(項目9)
核酸組成物が皮内投与、腹腔内投与、および静脈内投与からなる群より選択されて投与される項目1記載の方法。
(項目10)
哺乳動物が腫瘍を有するヒトであり、核酸組成物が腫瘍内または腫瘍周囲に投与される項目1記載の方法。
(項目11)
腫瘍退縮ウイルスが、ワクチニアウイルス、アデノウイルス、単純疱疹ウィルス、ポックスウイルス、水疱性口内炎ウイルス、麻疹ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、インフルエンザウイルス、およびレオウイルスからなる群より選択される項目1記載の方法。(項目12)
腫瘍退縮ウイルスがチミジンキナーゼ陰性である項目1または11のいずれか1項に記載の方法。
(項目13)
腫瘍退縮ウイルスが皮内投与、腹腔内投与、および静脈内投与からなる群から選択されて投与される項目13記載の方法。
(項目14)
哺乳動物が腫瘍を有するヒトであり、腫瘍退縮ウイルスが腫瘍内または腫瘍周辺に投与される項目1記載の方法。
(項目15)
核酸組成物が腫瘍退縮ウイルス内に存在する項目1記載の方法。
(項目16)
ステップ(a)の腫瘍退縮ウイルスがステップ(b)の腫瘍退縮ウイルスと同じ、または異なる項目15記載の方法。
(項目17)
ステップ(a)がステップ(b)の前に行わる、ステップ(a)およびステップ(b)が同時に行われる、またはステップ(a)がステップ(b)の後で行われる項目1または16のいずれか1項に記載の方法。
(項目18)
ステップ(a)および/またはステップ(b)が少なくとも1回繰り返される項目1または16のいずれか1項に記載の方法。
(項目19)
ステップ(a)および/またはステップ(b)で使われる投与量が1x10^7pfuである項目1または16のいずれか1項に記載の方法。
(項目20)
抗原特異的免疫応答が核酸組成物単独投与による抗原特異的免疫応答誘導より大きい項目1記載の方法。
(項目21)
抗原特異的免疫応答の少なくとも一部がCD8+細胞障害性Tリンパ球(CTL)によって媒介される項目1記載の方法。
(項目22)
抗原特異的免疫応答の少なくとも一部がCD8−細胞障害性Tリンパ球(CTL)によって媒介される項目1記載の方法。
(項目23)
抗原特異的免疫応答の少なくとも一部が腫瘍周囲の間質細胞によって媒介される項目1記載の方法。
(項目24)
有効量の化学療法剤を投与することをさらに含む項目1記載の方法。
(項目25)
抗原に対する抗体の存在の観点から哺乳動物を選別することをさらに含む項目1記載の方法。
(項目26)
哺乳動物がヒトである項目1記載の方法。
(項目27)
哺乳動物が癌に罹患している項目1記載の方法。
(項目28)
哺乳動物の進行期癌を治療または予防する方法であって、
(a)哺乳動物に、有効量の抗原または生物学的に活性なそのホモログをコードした核酸組成物を投与することにより哺乳動物を初回抗原刺激し、
(b)哺乳動物に有効量の抗原または生物学的に活性なそのホモログをコードした核酸を含む腫瘍退縮ウイルスを投与して哺乳動物に追加免疫することにより、抗原特異的免疫応答を誘導または強化すること、
を含む方法。
(項目29)
進行期癌が黒色腫または胸腺腫である項目28記載の方法。
(項目30)
初回抗原刺激組成物および追加免疫組成物を含むキットであって、
(a)初回抗原刺激組成物が免疫原性外来性抗原をコードしたDNAおよび薬学的に許容可能な担体を含み、さらに
(b)追加免疫組成物が前記外来性抗原をコードしたウイルスおよび薬学的に許容可能な担体を含む、
キット。
略記の部分的リスト
ANOVA、分散分析;APC、抗原提示細胞;CRT、カルレチクリン;CTL、細胞傷害性Tリンパ球;DC、樹状細胞;E6HPV、腫瘍タンパク質E6;E7HPV、腫瘍タンパク質E7;ELISA、酵素結合免疫吸着アッセイ;HPV、ヒトパピローマウイルス;IFNγ、インターフェロン−γ;i.m.筋肉内;i.t.腫瘍内;i,v.静脈内;luc、ルシフェラーゼ;mAB、モノクローナル抗体;MOI、感染多重度;OVA、卵白アルブミン;p−、プラスミド;PBS、リン酸緩衝生理食塩水;PCR、ポリメラーゼ鎖反応;SD、標準偏差;TAA、腫瘍関連抗原;Vac、ワクシニアウイルス;WT、野生型
本明細書で提供されるのは、たとえば、過剰増殖性疾患、たとえば、癌の再発を治療する及び/又は予防するための免疫応答を高める又は刺激する方法及び組成物である。一実施形態では、発明は、抗原又は生物学的に活性のあるそのホモログをコードする核酸組成物を含む組成物の有効量を哺乳類に投与することによって哺乳類を感作することと、抗原又は生物学的に活性のあるそのホモログをコードする核酸を含む腫瘍崩壊性ウイルスの有効量を哺乳類に投与することによって哺乳類を追加免疫することを含む。そのような方法は治療目的及び/又は予防目的で使用されてもよい。追加的に投与されてもよいそのほかの組成物には、免疫系を高めるタンパク質をコードするタンパク質及び核酸が含まれるが、抗原、たとえば、本明細書でさらに記載されるような抗原提示細胞の寿命を延ばすものを含まない。
ANOVA、分散分析;APC、抗原提示細胞;CRT、カルレチクリン;CTL、細胞傷害性Tリンパ球;DC、樹状細胞;E6HPV、腫瘍タンパク質E6;E7HPV、腫瘍タンパク質E7;ELISA、酵素結合免疫吸着アッセイ;HPV、ヒトパピローマウイルス;IFNγ、インターフェロン−γ;i.m.筋肉内;i.t.腫瘍内;i,v.静脈内;luc、ルシフェラーゼ;mAB、モノクローナル抗体;MOI、感染多重度;OVA、卵白アルブミン;p−、プラスミド;PBS、リン酸緩衝生理食塩水;PCR、ポリメラーゼ鎖反応;SD、標準偏差;TAA、腫瘍関連抗原;Vac、ワクシニアウイルス;WT、野生型
本明細書で提供されるのは、たとえば、過剰増殖性疾患、たとえば、癌の再発を治療する及び/又は予防するための免疫応答を高める又は刺激する方法及び組成物である。一実施形態では、発明は、抗原又は生物学的に活性のあるそのホモログをコードする核酸組成物を含む組成物の有効量を哺乳類に投与することによって哺乳類を感作することと、抗原又は生物学的に活性のあるそのホモログをコードする核酸を含む腫瘍崩壊性ウイルスの有効量を哺乳類に投与することによって哺乳類を追加免疫することを含む。そのような方法は治療目的及び/又は予防目的で使用されてもよい。追加的に投与されてもよいそのほかの組成物には、免疫系を高めるタンパク質をコードするタンパク質及び核酸が含まれるが、抗原、たとえば、本明細書でさらに記載されるような抗原提示細胞の寿命を延ばすものを含まない。
ほかの方法は、化学療法剤又は化学療法薬、たとえば、核酸ワクチンではない薬剤、たとえば、癌細胞のアポトーシスを誘導する薬剤を投与することを含む。抗原をコードする核酸の1以上、抗原をコードする1以上の腫瘍崩壊性ウイルス、そのようなタンパク質をコードするタンパク質及び/又は核酸を高める1以上の免疫系、並びに1以上の薬剤、たとえば、化学療法薬の任意のそのほかの組み合わせも、哺乳類で免疫応答を刺激するのに使用してもよい。方法の少なくとも一部は、別の治療、たとえば、哺乳類において応答を高める免疫系を投与することを含む治療の効率を高めるために使用されてもよい。感作工程の投与は、1以上のほかの剤の投与、たとえば、追加免疫工程と造時に、その前に又はその後に実施されてもよい。
核酸ワクチン
哺乳類に投与してもよいワクチンには、任意のワクチン、たとえば、核酸ワクチン(たとえば、DNAワクチン)が挙げられる。本発明の一実施形態では、核酸ワクチンは、抗原、たとえば、それに対する免疫応答が望まれる抗原をコードする。使用されてもよいそのほかの核酸は、免疫応答を高める又は向上させるが、それに対する免疫応答が望まれる抗原をコードしていないものである。これらのワクチンを以下にさらに記載する。
核酸ワクチン
哺乳類に投与してもよいワクチンには、任意のワクチン、たとえば、核酸ワクチン(たとえば、DNAワクチン)が挙げられる。本発明の一実施形態では、核酸ワクチンは、抗原、たとえば、それに対する免疫応答が望まれる抗原をコードする。使用されてもよいそのほかの核酸は、免疫応答を高める又は向上させるが、それに対する免疫応答が望まれる抗原をコードしていないものである。これらのワクチンを以下にさらに記載する。
例となる抗原には、病原性生物、たとえば、細菌又はウイルス又はそのほかの微生物に由来するタンパク質又はその断片、並びに細胞、たとえば、癌細胞に由来するタンパク質又はその断片が挙げられる。一実施形態では、抗原は、ウイルス、たとえば、ヒトパピローマウイルス(HPV)の部類、たとえば、E7又はE6に由来する。これらのタンパク質はまた腫瘍形成性タンパク質であり、細胞性の形質転換の誘導及び維持に重要であり、ほとんどのHPV含有の子宮頸癌及びその前駆的病変にて同時発現される。従って、E7又はE6を標的とする本発明の組成物のような癌ワクチンを用いてHPV関連の腫瘍形成を制御することができる(Wu,T-C, Curr Opin Immunol. 6:746-54, 1994)。
しかしながら、言及されるように、本発明は例示される抗原に限定されない。むしろ、当業者は、T細胞介在性の応答が望まれる抗原(及びそのエピトープ)について同じ結果が期待されることを十分に理解するであろう。そのように生成される応答は、たとえば、病原性細胞の細胞表面抗原又は病原性ウイルスのエンベロープ若しくはそのほかの抗原、又は細菌抗原、又は病原性分子の一部として発現される抗原としてのエピトープ又は抗原決定基が関与する生物又は疾患に向けられた予防的又は治療的な、又は双方の免疫を提供することにおいて効果的である。
例となる抗原及びその配列を以下に示す。
HPV−16由来のE7タンパク質
HPV−16由来のE7の核酸配列(配列番号8)及びアミノ酸配列(配列番号9)を以下に示す(GenBank受入番号NC_001526)
HPV−16由来のE7タンパク質
HPV−16由来のE7の核酸配列(配列番号8)及びアミノ酸配列(配列番号9)を以下に示す(GenBank受入番号NC_001526)
別の実施形態では(GenBank受入番号AF125673、ヌクレオチド562〜858及びE7アミノ酸配列を参照)、上記のC末端の4つのアミノ酸QDKL(及びそのコドン)を3つのアミノ酸QKP(及びそのコドン、cagaaacca)で置き換えて98残基のタンパク質を得る。
腫瘍性タンパク質が免疫部分である場合、ワクチン自体の腫瘍形成リスクを低減することが好ましい。HPVE7タンパク質の潜在的な腫瘍原性のために、E7タンパク質は「解毒化」形態で使用され得る。
本発明の構築物でE7の腫瘍形成性を低減するには、E7の以下の位置の1以上を変異させる。
TGT→GGTの変異は配列番号9の24位にてCys→Glyの置換を生じ、GAG→GGGの変異は、野生型E7の26位にてGlu→Glyの置換を生じる。この変異させたアミノ酸配列を、下線を引いた置換残基と共に以下に示す:
HPV由来のE6タンパク質
野生型E6ヌクレオチド配列(配列番号11)及びアミノ酸配列(配列番号12)を以下に示す(GenBank受入番号K02718及びNC_001526を参照)
変異させるべきアミノ酸残基には上記E6アミノ酸配列で下線を引いてある。E6変異体の幾つかの検討は151核酸の短いE6タンパク質に基づくが、その際、N末端残基は、野生型E6の8位でのMetであるとみなされた。E6のその短縮版を(配列番号13)として以下に示す:
Cassetti,MCら、Vaccine,22:520−52,2004は、その腫瘍原性能を不活化するE6及びE7における4又は5のアミノ酸の位置の変異の効果を調べた。以下の変異を調べた:E6−C63G及びE6−C106G(野生型E6に基づく位置);E7−C24G、E7−E26G及びE7−C91G(野生型E6に基づく位置)。変異型又は野生型のE6及びE7をコードするベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルスのレプリコン粒子(VRP)ワクチンは、幾つかのHPV16 E6(+)E7(+)腫瘍感作モデルにて匹敵するCTL反応を誘発し、匹敵する抗腫瘍反応を生成し:C3又はTC−1腫瘍の感作からの防御はワクチン接種マウスの100%で認められた。C3腫瘍の撲滅はおよそ90%のマウスで認められた。E6及びE7の腫瘍原性能の予測された不活化は、変異E6及びE7遺伝子を発現しているVRPsに感染させたヒト乳腺上皮細胞におけるp53とRb双方のタンパク質の正常レベルを明らかにすることによって確認した。
HPV16のE6タンパク質は構造と機能に重要な2つの亜鉛フィンガーを含有し;C−X−X−C(Xはアミノ酸)亜鉛フィンガーモチーフの各対におけるシステイン(C)アミノ酸1つをE6の63位及び106位(野生型E6に基づく)にて変異させてもよい。たとえば、QuickChange部位特異的変異誘発キット(カリフォルニア州、ラホヤ、ストラタジーン)を用いて変異体を創製する。野生型E6におけるCys106(=野生型E6におけるCys113)のコドンにおける単一点突然変異を含有するHPV16のE6。Cys106は、p53を結合しないし、その分解も促進しないが、p53の分解に依存した表現型である、ヒト乳腺上皮細胞(MEC)を不死化することは不可能である。野生型E6におけるCys63(=野生型E6におけるCys70)位での単一アミノ酸置換は、幾つかのHPV16 E6も機能:p53の分解、E6TP−1の分解、テロメラーゼの活性化及びその結果としての一次上皮細胞の不活化を壊す。
これらE6ポリペプチド、その変異体の1つ又はその抗原断片若しくはエピトープをコードするヌクレオチド配列を本発明で使用することができる。上記Cassettiらに記載されたものを含めて本明細書で記載される方法に従って、そのほかの変異を調べ、使用することができる。コーディングDNAの変異による適当な出発配列からこれらの変異を作出することができる。
本発明はまた、本明細書で記載される1以上の変異を用いて生体内でその腫瘍原性能に関して腫瘍タンパク質を不活化する、直列E6−E7ワクチンの使用も含む。VRPワクチン(上記Cassettiらに記載された)は、4又は5のアミノ酸の位置で変異させる、オープンリーディングフレーム1つに融合したE6とE7の遺伝子を含んだ。従って、本構築物は、E6及びE7の1以上のエピトープを含み、それらは、天然の順に配置されてもよいし、免疫原性形態でE6及びE7の抗原性エピトープを運ぶように発現されたタンパク質を可能にするように混ぜられてもよい。再び、形質導入された宿主細胞によってそれらが発現された後、スペーサーが免疫原性の方式でエピトープの発現又は提示を可能にするという条件で、E6とE7の間又はこれらタンパク質の個々のエピトープの間におけるアミノ酸スペーサーをコードするDNAがベクターに導入されてもよい。
卵白アルブミン(OVA)
代表的なOVA(配列番号139)をコードするアミノ酸配列を以下に示す。
卵白アルブミン(OVA)
代表的なOVA(配列番号139)をコードするアミノ酸配列を以下に示す。
例となる抗原は、CTL及び遅延型過敏症を含むエフェクターT細胞の応答によって宿主が防御される病原性微生物のエピトープである。これらには通常、ウイルス、マラリアのような細胞内寄生虫、及びMycobacterium及びListeriaの種のような細胞内で増殖する細菌が挙げられる。従って、本発明のワクチン組成物に含まれる抗原の種類は、腫瘍特異的抗原と同様にそのような病原体に関わるものにいずれかであってもよい。ウイルスが腫瘍における原因因子である場合、一部のウイルス抗原は腫瘍抗原でもあることは注目に値すべきである。
事実、世界中で最も一般的な2つの癌、肝臓癌と子宮頸癌はウイルス感染に関連している。B型肝炎ウイルス(HBV)(Beasley, R.P. et al.,Lancet 2:1129-1133(1981)は肝臓癌の病原因子として関係するとみなされている。子宮頸癌の約80〜90%は、「高リスク」ヒトパピローマウイルス型:HPV−16、HPV−18、HPV−31及びHPV−45の4つのうち1つからのE6抗原及びE7抗原(上記で議論し、本明細書で例示する)を発現する(参照によって本明細書に組み入れられるGissmann,L.et al., Ciba Found Symp. 120:190-207, 1986; Beaudenon,S., et al. Nature321:246-9, 1986)
。HPVのE6及びE7の抗原は、子宮頸癌におけるその独特の発現のために、免疫が保たれている個体におけるウイルス関連の癌について最も有望な標的である。治療用の癌ワクチンについての標的としてのその重要性に加えて、ウイルス関連の腫瘍抗原は、予防用ワクチンの理想的な候補でもある。実際、アジアにおける予防用HBVワクチンの導入が肝臓癌の発生を減らした(Chang,MHet al. New Engl. J. Med. 336, 1855-1859 (1997)ということは、癌の予防に対する大きな効果を代表している。
。HPVのE6及びE7の抗原は、子宮頸癌におけるその独特の発現のために、免疫が保たれている個体におけるウイルス関連の癌について最も有望な標的である。治療用の癌ワクチンについての標的としてのその重要性に加えて、ウイルス関連の腫瘍抗原は、予防用ワクチンの理想的な候補でもある。実際、アジアにおける予防用HBVワクチンの導入が肝臓癌の発生を減らした(Chang,MHet al. New Engl. J. Med. 336, 1855-1859 (1997)ということは、癌の予防に対する大きな効果を代表している。
慢性のヒトのウイルス感染で最も重要なウイルスは、HPV、HBV、C型肝炎ウイルス(HCV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV−1及びHIV−2)のようなレトロウイルス、エプステインバーウイルス(EBV)、サイトメガロウイルス(CNV)、HSV−1及びHSV−2のようなヘルペスウイルス、並びにインフルエンザウイルスである。有用な抗原には、HBV表面抗原若しくはHBVコア抗原、CMVppUL83若しくはpp89、HIV−1のgp120、gp41若しくはp24の抗原、HSVのICP27、gD2、gB、又はインフルエンザの血球凝集素若しくは核タンパク質が挙げられる(Anthony,LS et al., Vaccine 1999; 17:373-83)。本明細書に記載されるように利用
することができる病原体に関連するそのほかの抗原は、マラリア、たとえば、NANPの反復に基づくマラリアペプチドを含む種々の寄生虫の抗原である。
することができる病原体に関連するそのほかの抗原は、マラリア、たとえば、NANPの反復に基づくマラリアペプチドを含む種々の寄生虫の抗原である。
特定の実施形態では、本発明は個体が既存のT細胞免疫(たとえば、インフルエンザ、破傷風、ヘルペスなど)を有してもよい外来抗原を用いる方法を含む。ほかの実施形態では、熟練者は、当該技術で利用できる周知の方法に従って対象が特定の抗原に対して既存のT細胞免疫を有するかどうかを容易に決定し、それに対して対象が既存のT細胞免疫をすでに有していない外来抗原を使用することができる。
代わりの実施形態では、抗原は、たとえば、Bordetella pertussis;Ehrlichia chaffeensis;Staphylococcus aureus;Toxoplasma gondii;Legionella pneumophila;Brucella suis;Salmonella enterica;Mycobacterium avium;Mycobacterium tuberculosis;Listeria monocytogenes;Chlamydia
trachomatis;Chlamydia pneumoniae;Rickettsia rickettsiiのような細菌である病原体、又はたとえば、Paracoccidioides brasiliensisのような真菌、又はたとえば、Plasmodium falciparumのようなそのほかの病原体に由来する。
trachomatis;Chlamydia pneumoniae;Rickettsia rickettsiiのような細菌である病原体、又はたとえば、Paracoccidioides brasiliensisのような真菌、又はたとえば、Plasmodium falciparumのようなそのほかの病原体に由来する。
本明細書で使用されるとき、用語「癌」は、固形腫瘍及び血液性腫瘍を含むが、これらに限定されない。用語、癌は、皮膚、組織、臓器、骨、軟骨、血液及び血管の疾患を含む。増殖で進行している癌を記載するのに使用され、また「後期段階の癌」又は「進行段階の癌」とも呼ばれる用語は、転移している、たとえば、元々の起源から体の別の部分に広がっている癌である。特定の実施形態では、進行した段階の癌にはステージ3及び4の癌が含まれる。癌は、その増殖と体中の広がりの程度に応じてステージにランク分けされ、ステージは重症度に相当する。所与の癌のステージを決定することによって、医師が治療を推奨すること、患者に起こりそうなことについての転帰のシナリオを作成すること、及びほかの医師と効率的に意思疎通することを助けることになる。
使用には複数のステージ決定の尺度がある。最も一般的なものの1つは患者を進行性に5つのさらに重度の段階:0、I、II、III及びIVにランク付けする。ステージ0の癌は、ほんのわずかな細胞が関与する始まったばかりの癌である。ステージI、II、III及びIVは、さらに大きな腫瘍サイズ、さらなる腫瘍、癌が増殖し、広がる悪性度及び癌が広がって隣接する組織や体内の臓器を冒す程度を特徴とする進行性にさらに進んだ癌を表す。
別のよく知られたステージ化方式は、TNM方式として知られ、癌の広範さの三次元のランク付けである。TNM方式を用いて、医師は3つの尺度それぞれで見つける癌をランク付けし、その際、Tは腫瘍サイズを表し、Nはリンパ節の関与を表し、Mは転移(癌が元々の位置を越えて広がった程度)を表す。3つの尺度のそれぞれにおけるより大きなスコアはさらに進行した癌を示す。たとえば、体のほかの部分に広がっていない大きな腫瘍はT3N0M0とランク付けされる一方で、小さいがさらに悪性の癌はT2N2M1とランク付けされるということは、局所リンパ節に広がっているが、新しい臓器への局在は始まったばかりである中程度の大きさの腫瘍を示唆している。
本発明の方法及び組成物によって治療され得る癌には、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、乳腺、結腸、食道、消化器、歯肉、頭部、腎臓、肝臓、肺、鼻咽頭、頚部、卵巣、前立腺、皮膚、胃、精巣、舌又は子宮に由来する癌が挙げられるが、これらに限定されない。加えて、癌は、これらに限定されないが、具体的には以下の組織学的種類であってもよい:新生物、悪性腫瘍;癌腫;未分化癌腫;巨細胞と紡錘細胞の癌腫;小細胞癌腫;乳頭癌腫;扁平上皮癌腫;リンパ上皮癌腫;基底細胞癌腫;毛母癌腫;移行細胞癌腫;乳頭移行細胞癌腫;腺癌;悪性ガストリン産生腫瘍;胆管癌;肝細胞癌;肝細胞癌と胆管癌の合併;索状腺腫;腺様嚢胞癌;腺腫性ポリープにおける腺癌;腺癌、家族性大腸ポリポーシス;固形癌種;カルチノイド腫瘍、悪性;気管支/肺胞腺癌;乳頭腺癌;嫌色素性細胞癌腫;好酸性癌腫;好酸性腺癌;好塩基性癌腫;明細胞腺癌;顆粒細胞癌腫;濾胞腺癌;乳頭及び濾胞腺癌;非被包性硬化性癌腫;副腎皮質癌腫;子宮内膜性癌腫;皮膚付属器癌腫;アポクリン腺癌;皮脂腺癌;耳道腺癌;粘膜表皮癌腫;嚢胞腺癌;乳頭嚢胞腺癌;乳頭漿液性嚢胞腺癌;粘液性嚢胞腺癌;粘液性腺癌;印環細胞癌腫;浸潤管癌腫;髄質癌腫;小葉癌腫;炎症性癌腫;パジェット病、乳腺;腺房細胞癌腫;腺扁平上皮癌腫;腺癌w/扁平上皮転移;胸腺腫、悪性;卵巣間質腫瘍、悪性;卵胞膜細胞腫、悪性;顆粒膜細胞腫、悪性;及び神経節芽腫、悪性;セルトリ細胞癌腫;ライディッヒ細胞腫瘍、悪性;脂質細胞腫瘍、悪性;傍神経節腫、悪性;乳腺外傍神経節腫、悪性;褐色細胞腫;血管球血管肉腫;悪性黒色腫;メラニン欠乏性黒色腫;表在性拡大黒色腫;巨大色素神経における悪性黒色腫;上皮細胞黒色腫;青色母斑、悪性;肉腫;線維肉腫;線維性組織球腫、悪性;粘液肉腫;脂肪肉腫;平滑筋肉腫;横紋筋肉腫;胎児性横紋筋肉腫;肺胞横紋筋肉腫;間質肉腫;混合腫瘍、悪性;ミュラー管混合腫瘍;腎芽腫;肝芽腫;癌肉腫;間葉腫、悪性;ブレナー腫瘍、悪性;葉状腫瘍、悪性;滑膜肉腫;中皮腫、悪性;未分化胚細胞腫;胎児性肉腫;奇形腫、悪性;卵巣甲状腺腫、悪性;絨毛癌;中腎腫、悪性;血管肉腫;血管内皮腫、悪性;カポジ肉腫;血管周皮細胞腫、悪性;リンパ管肉腫;骨肉腫;皮質近接部骨肉腫;軟骨肉腫;軟骨芽腫、悪性;間質性軟骨肉腫;骨の巨細胞腫瘍;ユーイング肉腫;歯原性腫瘍、悪性;エナメル上皮歯牙肉腫;エナメル上皮腫、悪性;エナメル上皮線維肉腫;松果体腫、悪性;脊索腫;神経膠腫、悪性;上衣細胞腫;星状細胞腫;原形質性星状膠細胞;線維性星状細胞腫;星状芽腫;膠芽細胞腫;乏突起膠腫;乏突起芽腫;原始性神経管外胚葉;脳肉腫;神経節神経芽腫;神経芽腫;網膜芽腫;嗅球神経原性腫瘍;髄膜腫、悪性;神経線維性肉腫;神経鞘腫、悪性;顆粒細胞腫瘍、悪性;悪性リンパ腫;ホジキン病;ホジキンリンパ腫;側肉芽腫;悪性リンパ腫;小リンパ性;悪性リンパ腫;大細胞、びまん性悪性リンパ腫;濾胞性菌状息肉腫;そのほかの特定された非ホジキンリンパ腫;悪性組織球腫;多発性骨髄腫;肥満細胞肉腫;免疫増殖性小腸疾患;白血病;リンパ性白血病;形質細胞白血病;赤白血病;リンパ性肉腫性細胞白血病;骨髄性白血病;好塩基球性白血病;好酸球性白血病;単球性白血病;肥満細胞性白血病;巨核芽球性白血病;骨髄性肉腫;及びヘアリー細胞白血病。
ヒトの癌及び感染性疾患へのその適用性に加えて、本発明はまた、獣医学の背景における動物の疾患を治療することでの使用も意図される。従って、本明細書に記載されるアプローチは、当業者によって、ウマのヘルペスウイルス、ウシのウイルス性下痢ウイルス(たとえば、E2抗原)、ウシのヘルペスウイルスのようなウシのウイルス、ニワトリやそのほかの家禽におけるマレック病ウイルスを含む家畜のヘルペスウイルス感染;動物のレトロウイルス及びレンチウイルスの疾患(たとえば、ネコ白血病、ネコ免疫不全、サル免疫不全ウイルスなど);偽狂犬病及び狂犬病などの治療に容易に適用されてもよい。
腫瘍抗原については、CTLを含むT細胞によって認識され得る腫瘍関連抗原又は腫瘍特異抗原(又は腫瘍由来のエピトープ)(まとめてTAA)のどんなものも使用することができる。これらには、限定しないで、変異p53、Her2/neu又はそのペプチド、又はMAGE−1、MAGE−3、MART−1−/Melan−Aのような多数の黒色腫関連抗原、チロシナーゼ、gp75、gp100、BAGE、GAGE−1、GAGE−2、GnT−V、及びp15(たとえば、参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第6,187,306号を参照)が挙げられる。
核酸ワクチンに完全長の抗原を含める必要はなく;MHCクラスI及び/又はIIによって提示される断片を含めるのが十分である。核酸は、同一であってもよく、異なっていてもよい、1、2、3、4、5以上の抗原を含んでもよい。
E6、E7及びそのほかの抗原の突然変異誘発のアプローチ
たとえば、QuickChange部位特異的変異誘発キット(カリフォルニア州、ラホヤ、ストラタジーン)を用いて、本明細書に記載される抗原の変異体を創製してもよい。一般に、本明細書で使用されてもよい抗原は、天然に存在するタンパク質又はペプチドとは異なるが、機能的な活性について必要なエピトープをまだ保持しているタンパク質又はペプチドであってもよい。特定の実施形態では、抗原は、天然に存在する抗原又はその断片と少なくとも約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一であるアミノ酸配列を含んでもよく、本質的にそれから成ってもよく、又はそれから成ってもよい。特定の実施形態では、抗原はまた、天然に存在する抗原又はその断片をコードするヌクレオチド配列と少なくとも約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一であるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含んでもよく、本質的にそれから成ってもよく、又はそれから成ってもよい。特定の実施形態では、抗原はまた、天然に存在する抗原又はその断片をコードする核酸に高い厳密性条件下でハイブリッド形成する核酸によってコードされるアミノ酸配列を含んでもよく、本質的にそれから成ってもよく、又はそれから成ってもよい。ハイブリッド形成の条件は本明細書でさらに記載される。
E6、E7及びそのほかの抗原の突然変異誘発のアプローチ
たとえば、QuickChange部位特異的変異誘発キット(カリフォルニア州、ラホヤ、ストラタジーン)を用いて、本明細書に記載される抗原の変異体を創製してもよい。一般に、本明細書で使用されてもよい抗原は、天然に存在するタンパク質又はペプチドとは異なるが、機能的な活性について必要なエピトープをまだ保持しているタンパク質又はペプチドであってもよい。特定の実施形態では、抗原は、天然に存在する抗原又はその断片と少なくとも約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一であるアミノ酸配列を含んでもよく、本質的にそれから成ってもよく、又はそれから成ってもよい。特定の実施形態では、抗原はまた、天然に存在する抗原又はその断片をコードするヌクレオチド配列と少なくとも約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一であるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含んでもよく、本質的にそれから成ってもよく、又はそれから成ってもよい。特定の実施形態では、抗原はまた、天然に存在する抗原又はその断片をコードする核酸に高い厳密性条件下でハイブリッド形成する核酸によってコードされるアミノ酸配列を含んでもよく、本質的にそれから成ってもよく、又はそれから成ってもよい。ハイブリッド形成の条件は本明細書でさらに記載される。
一実施形態では、例となるタンパク質は、本明細書で提供されるE6又はE7の配列のような、たとえば、E6又はE7を含むウイルスタンパク質と少なくとも約50%、55
%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一であるアミノ酸配列を含んでもよく、本質的にそれから成ってもよく、又はそれから成ってもよい。E6又はE7タンパク質が解毒E6又はE7タンパク質である場合、タンパク質のアミノ酸配列は、E6又はE7タンパク質と少なくとも約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、
96%、97%、98%又は99%同一であるアミノ酸配列を含んでもよく、本質的にそれから成ってもよく、又はそれから成ってもよく、その際、タンパク質を「解毒」タンパク質にするアミノ酸が存在する。
免疫原性を高めるポリペプチド(IPP)と抗原をコードする例となるDNAワクチン
一実施形態では、核酸ワクチンは、抗原と、第2のタンパク質、たとえば、IPPを含む融合タンパク質をコードする。IPPは、連結する抗原ポリペプチドのMHCクラスI経路を介した処理又は処理を高める細胞性区画のターゲティングを促進することによって免疫応答を高めることで作用してもよい。この基本戦略は、本発明者らとその共同研究者らによって開拓された追加の戦略と組み合わせるが、それには「標的化ポリペプチド」と呼ばれる別のタンパク質をコードするDNAを、抗原をコードするDNAに連結することが関与する。再び、簡略化のために、そのような標的化ポリペプチドをコードするDNAを本明細書では「標的化DNA」と呼ぶ。その戦略は、抗原のみをコードするDNAを運ぶベクターの能力を高めるのに有効であることが示されている。たとえば、Wuらによる以下のPCT公開;WO01/29233;WO02/009645;WO02/061113;WO02/074920;及びWO02/12281を参照のこと、それらすべてはその全体が参照によって本明細書に組み入れられる。ほかの戦略は、以下を促進する又は高めるポリペプチドをコードするDNAの使用が含まれる:
(a)抗原提示細胞の発生、蓄積若しくは活性、若しくは高い抗原定時をもたらす抗原提示細胞の区画への抗原の標的化;
(b)抗原の細胞間の輸送及び拡散;又は
(c)(a)と(b)の組み合わせ。
(d)リソソーム関連の膜タンパク質1型(Sig/LAMP−1)の選別。
%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一であるアミノ酸配列を含んでもよく、本質的にそれから成ってもよく、又はそれから成ってもよい。E6又はE7タンパク質が解毒E6又はE7タンパク質である場合、タンパク質のアミノ酸配列は、E6又はE7タンパク質と少なくとも約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、
96%、97%、98%又は99%同一であるアミノ酸配列を含んでもよく、本質的にそれから成ってもよく、又はそれから成ってもよく、その際、タンパク質を「解毒」タンパク質にするアミノ酸が存在する。
免疫原性を高めるポリペプチド(IPP)と抗原をコードする例となるDNAワクチン
一実施形態では、核酸ワクチンは、抗原と、第2のタンパク質、たとえば、IPPを含む融合タンパク質をコードする。IPPは、連結する抗原ポリペプチドのMHCクラスI経路を介した処理又は処理を高める細胞性区画のターゲティングを促進することによって免疫応答を高めることで作用してもよい。この基本戦略は、本発明者らとその共同研究者らによって開拓された追加の戦略と組み合わせるが、それには「標的化ポリペプチド」と呼ばれる別のタンパク質をコードするDNAを、抗原をコードするDNAに連結することが関与する。再び、簡略化のために、そのような標的化ポリペプチドをコードするDNAを本明細書では「標的化DNA」と呼ぶ。その戦略は、抗原のみをコードするDNAを運ぶベクターの能力を高めるのに有効であることが示されている。たとえば、Wuらによる以下のPCT公開;WO01/29233;WO02/009645;WO02/061113;WO02/074920;及びWO02/12281を参照のこと、それらすべてはその全体が参照によって本明細書に組み入れられる。ほかの戦略は、以下を促進する又は高めるポリペプチドをコードするDNAの使用が含まれる:
(a)抗原提示細胞の発生、蓄積若しくは活性、若しくは高い抗原定時をもたらす抗原提示細胞の区画への抗原の標的化;
(b)抗原の細胞間の輸送及び拡散;又は
(c)(a)と(b)の組み合わせ。
(d)リソソーム関連の膜タンパク質1型(Sig/LAMP−1)の選別。
戦略には以下の使用が挙げられる:
(a)単純性ヘルペスウイルス−1、VP22タンパク質、マレック病ウイルスUL49(WO02/09645及び米国特許第7,318,928号を参照)、タンパク質又はその機能的ホモログ若しくは誘導体の群から選択されるウイルス細胞間拡散タンパク質;(b)CRT様分子、ER604,GRP94、gp96、又はその機能的ホモログ若しくは誘導体(WO02/12281及び米国特許第7,3442,002号を参照)の群から選択されるカルレチクリン及び小胞体シャペロンポリペプチド;
(c)Pseudomonas外毒素ETAのドメインII又はその機能的ホモログ若しくは誘導体(公開された米国特許出願22040086845を参照)の群から選択される病原体毒素の細胞質転移ポリペプチドドメイン;
(d)γ−チューブリン又はその機能的ホモログ若しくは誘導体から選択される細胞の中心体を標的とするポリペプチド;
(e)GM−CSF、Flt3−リガンド細胞外ドメイン又はその機能的ホモログ若しくは誘導体の群から選択される、樹状細胞前駆体を刺激する又は樹状細胞活性を活性化するポリペプチド;又は
(f)B7−DC(米国特許シリアル番号09/794,210を参照)、B7.1、B7.2、可溶性CD40などを含むB7ファミリータンパク質のような同時刺激シグナル;
(g)(1)BCL−xL、(2)BCL−2。(3)XIAP、(4)FLICEc−s、(5)ドミナントネガティブカスパーゼ−8、(6)ドミナントネガティブカスパーゼ−9、(7)SPI−6及び(8)(1)〜(7)の機能的ホモログ若しくは誘導体 (WO2005/047501を参照)。
(a)単純性ヘルペスウイルス−1、VP22タンパク質、マレック病ウイルスUL49(WO02/09645及び米国特許第7,318,928号を参照)、タンパク質又はその機能的ホモログ若しくは誘導体の群から選択されるウイルス細胞間拡散タンパク質;(b)CRT様分子、ER604,GRP94、gp96、又はその機能的ホモログ若しくは誘導体(WO02/12281及び米国特許第7,3442,002号を参照)の群から選択されるカルレチクリン及び小胞体シャペロンポリペプチド;
(c)Pseudomonas外毒素ETAのドメインII又はその機能的ホモログ若しくは誘導体(公開された米国特許出願22040086845を参照)の群から選択される病原体毒素の細胞質転移ポリペプチドドメイン;
(d)γ−チューブリン又はその機能的ホモログ若しくは誘導体から選択される細胞の中心体を標的とするポリペプチド;
(e)GM−CSF、Flt3−リガンド細胞外ドメイン又はその機能的ホモログ若しくは誘導体の群から選択される、樹状細胞前駆体を刺激する又は樹状細胞活性を活性化するポリペプチド;又は
(f)B7−DC(米国特許シリアル番号09/794,210を参照)、B7.1、B7.2、可溶性CD40などを含むB7ファミリータンパク質のような同時刺激シグナル;
(g)(1)BCL−xL、(2)BCL−2。(3)XIAP、(4)FLICEc−s、(5)ドミナントネガティブカスパーゼ−8、(6)ドミナントネガティブカスパーゼ−9、(7)SPI−6及び(8)(1)〜(7)の機能的ホモログ若しくは誘導体 (WO2005/047501を参照)。
そのすべてはその全体が参照によって本明細書に組み入れられる以下の出版物がIPPを記載している:Kim,TWら、J.Clin.Invest.,112:109−1
17,2003;Cheng,WFら、J.Clin.Invest.,108:669−678,2001;Hung,CFら、Cancer Res.61:3698−3703,2001;Chen,CHら、2000,supra;米国特許第6,734,173号;公開された特許出願WO05/081716、WO05/047501、WO03/085085、WO02/12281、WO02/074920、WO02/061113、WO02/09645及びWO01/29233。抗体としてHPVのE6を用いたこれらIPPの比較研究は、Peng,Sら、J.Biomed.Sci.12:689−700,2005に記載されている。
17,2003;Cheng,WFら、J.Clin.Invest.,108:669−678,2001;Hung,CFら、Cancer Res.61:3698−3703,2001;Chen,CHら、2000,supra;米国特許第6,734,173号;公開された特許出願WO05/081716、WO05/047501、WO03/085085、WO02/12281、WO02/074920、WO02/061113、WO02/09645及びWO01/29233。抗体としてHPVのE6を用いたこれらIPPの比較研究は、Peng,Sら、J.Biomed.Sci.12:689−700,2005に記載されている。
抗原はIPPのN末端又はC末端に連結されてもよい。例となるIPP及びそのようなものをコードする融合構築物は以下に記載される。
リソソーム関連の膜タンパク質(LAMP−1)
転位シグナル配列に融合させたE7タンパク質とLAMP−1ドメインをコードするDNA配列(Sig−E7−LAMP−1)[配列番号16]は、
リソソーム関連の膜タンパク質(LAMP−1)
転位シグナル配列に融合させたE7タンパク質とLAMP−1ドメインをコードするDNA配列(Sig−E7−LAMP−1)[配列番号16]は、
Sig/E7/LAMP−1)のアミノ酸配列[配列番号17]は、
小文字にて下線付きでのSigE7−LAMP−1のコーディング配列と共に、免疫原性ベクターpcDNA−3−Sいg/E7/LAMP−1のヌクレオチド配列[配列番号18]を以下に示す。
HSP70をコードするヌクレオチド配列(配列番号19)は、(GenBankNC_000962におけるM.tuberculosisゲノムのヌクレオチド10633〜12510)である
E7−Hsp70キメラ/融合ポリペプチドの配列(ヌクレオチド配列、配列番号21及びアミノ酸配列、配列番号22)は以下に提供されるE7のコーディング配列は大文字にて下線付きで示す。
Pseudomonas aeruginosaの外毒素A型(ETA)の完全なコーディング配列−配列番号23−GenBank受入番号K01397を以下に示す。
上記の残基1〜25(イタリック体)はシグナルペプチドを表す。成熟ポリペプチドの最初の残基、Alaは太字体で下線を引く。成熟ポリペプチドは、配列番号24の残基26〜638である。
ドメインII(ETA(II))、転位ドメイン(上記で下線を引いた)は成熟ポリペプチドの残基247〜417にわたり(配列番号24の残基272〜442に相当する)、配列番号25として別に以下に表す。
E7とHSP70をコードするpcDNA3ベクターのヌクレオチド配列(pvDNA3−E7−HSP70)(配列番号3)
カルレチクリン(CRT)
よく調べられた約46kDaのタンパク質であるカルレチクリン(CRT)は、多数の生物活性及び生化学活性があるので、上記で手短に記載した。本明細書で使用されるとき、「カルレチクリン」又は「CRT」は、当該技術で周知である、本明細書で記載されるような例となるヒトのカルレチクリン、又はたとえば、ウサギ及びラットのCRTのような、そのホモログと実質的に同一性を有するポリペプチド及び核酸を指す。CRTのポリペプチドは、CRTのアミノ酸配列と同一又は実質的に同一の配列を含むポリペプチドである。本組成物及び方法で使用されるCRTについての例となるヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を以下に提示する。用語「カルレチクリン」又は「CRT」は、天然のタンパク質、並びに、抗原と融合した際(DNAレベル又はタンパク質レベルで)、CTL反応を含む免疫応答を促進し、血管新生を促進する組換えで生成した修飾タンパク質を包含する。従って、用語「カルレチクリン」又は「CRT」は、試験管内の技法によって構築された天然のタンパク質の変異体、及び天然の供給源から単離されたタンパク質の変異体を含むヒトCRTのホモログ及び対立遺伝子変異体を包含する。本発明のCRTポリペプチド及びそれをコードする配列はまた、非CRT配列、特にMHCクラスI結合ペプチドを含む、及びさらに、そのほかのドメイン、たとえば、エピトープタグ、酵素切断認識配列、シグナル配列、分泌シグナルなども含む融合タンパク質も含む。
ヒトCRTのコーディング配列を以下(配列番号28)で示す。
本発明者らとその共同研究者ら(その全体が参照によって組み入れられる上記Chengら
)は、HPV−16のE7にキメラ連結されたCRTのN、P及びCのドメインのそれぞれをコードするDNAワクチンが、遺伝子銃投与によってi.d.ワクチン接種したマウスにおいて強力な抗原特異的CD8+T細胞の応答と抗腫瘍免疫を誘発することを。N−CRT/E7、P−CRT/E7、又はC−CRT/E7のDNAはそれぞれ、E7のDNA(抗原のみ)でワクチン接種したマウスに比べて有意に多数のE7特異的CD8+T細胞前駆細胞とE7を発現する腫瘍に対する目覚しい抗腫瘍効果を示した。CRTのDNA投与もまた抗血管新生抗腫瘍効果を生じた。従って、腫瘍抗原に連結されたN−CRTをコードするDNAを用いた癌治療法は、抗原特異的免疫療法と血管新生の抑制の組み合わせを介して腫瘍を治療するのに使用されてもよい。
)は、HPV−16のE7にキメラ連結されたCRTのN、P及びCのドメインのそれぞれをコードするDNAワクチンが、遺伝子銃投与によってi.d.ワクチン接種したマウスにおいて強力な抗原特異的CD8+T細胞の応答と抗腫瘍免疫を誘発することを。N−CRT/E7、P−CRT/E7、又はC−CRT/E7のDNAはそれぞれ、E7のDNA(抗原のみ)でワクチン接種したマウスに比べて有意に多数のE7特異的CD8+T細胞前駆細胞とE7を発現する腫瘍に対する目覚しい抗腫瘍効果を示した。CRTのDNA投与もまた抗血管新生抗腫瘍効果を生じた。従って、腫瘍抗原に連結されたN−CRTをコードするDNAを用いた癌治療法は、抗原特異的免疫療法と血管新生の抑制の組み合わせを介して腫瘍を治療するのに使用されてもよい。
E7に連結されたCRT又はそのドメインの1つを含む構築物を以下に模式的に説明する。
本構築物は、多数の配位のいずれかにて1以上のCRTドメインの組み合わせを用いてもよい。ドメインを指定するために記号表示NCRT、PCRT及びCCRTを用いて、以下は、わずかな例ではあるが、本発明のDNAワクチンベクターで使用されてもよい組合せである(AgはE7(解毒)又はE6(解毒)を含む抗原であり得ることが理解される)。
本発明はまた、そのような断片が機能的である、たとえば、対になる(たとえば、連結される)抗原に対する免疫応答を高めることができるポリペプチドをコードするという条件で、CRT又はCRTドメインをコードするさらに短い核酸断片を採用してもよい。上記で示したCRT又はドメインの配列からのさらに短いペプチドをコードし、且つ機能的である、たとえば、MHCクラスI経路を介してタンパク質の処理を促進する能力を有する核酸も含まれ、日常の実験によって定義されてもよい。
CRTのポリペプチド断片は、少なくとも約50、100、200、300又は400のアミノ酸を含んでもよい。CRTのポリペプチド断片はまた、群、N−CRT、P−CRT及びC−CRTから選択されるCRTドメインからの少なくとも約25、50、75、100、25〜50、50〜100又は75〜125のアミノ酸を含んでもよい。CRTのポリペプチド断片は、N−ドメイン(たとえば、配列番号30)の残基1〜50、50〜75、75〜100、100〜125、125〜150、150〜170を含んでもよい。CRTのポリペプチド断片は、P−ドメイン(たとえば、配列番号31)の残基1〜50、50〜75、75〜100100〜109を含んでもよい。CRTのポリペプチド断片は、C−ドメイン(たとえば、配列番号32)の残基1〜50、50〜75、75〜100、100〜125、125〜138を含んでもよい。
CRTの核酸断片は、少なくとも約50、100、200、300又は400のアミノ酸をコードしてもよい。CRTの核酸断片はまた、N−CRT、P−CRT及びC−CRTから選択されるCRTドメインからの少なくとも約25、50、75、100、25〜50、50〜100又は75〜125のアミノ酸をコードしてもよい。CRTの核酸断片は、N−ドメイン(たとえば、配列番号30)の残基1〜50、50〜75、75〜100、100〜125、125〜150、150〜170をコードしてもよい。CRTの核酸断片は、P−ドメイン(たとえば、配列番号31)の残基1〜50、50〜75、75〜100100〜109をコードしてもよい。CRTの核酸断片は、C−ドメイン(たとえば、配列番号32)の残基1〜50、50〜75、75〜100、100〜125、125〜138をコードしてもよい。
本明細書で提供されるようなCRTのポリペプチド「断片」は完全長のCRTを含まない。同様に、本明細書で提供されるようなCRTの核酸「断片」は、完全長のCRT核酸配列を含まず、完全長のCRTポリペプチドをコードしない。
一実施形態では、本発明の完全なキメラ核酸のベクター構築物は以下に示される(配列番号36)。配列は、プラスミド由来のヌクレオチド(小文字)、CRT由来のヌクレオチド(大文字、太字体)、及びHPV−E7由来のヌクレオチド(小文字、イタリック体/下線)を示すように注釈が付けられる。5つのプラスミドヌクレオチドがCRTとE7のコーディング配列の間に見い出され、E7配列の停止コドンが二重下線で示されることに留意のこと。このプラスミドはpNGVL4a−CRT/E7(解毒)と呼ばれる。
細胞間で拡散するタンパク質 生体内で増幅し、拡散するその能力によってネイキッドDNAワクチンの能力を高めてもよい。VP22、単純性ヘルペスウイルス1型(HSV−1)及びたとえば、鳥類のマレック病ウイルス(MDV)のようなほかのヘルペスウイルスにおけるそのホモログは、ワクチンの能力を高めるアプローチを提供する細胞間輸送の特性を有する。本発明は、以前、抗原の拡散とMHCクラスIによる提示を高めるDNAワクチンにおいてモデル抗原、ヒトのパピローマウイルス16型(HPV−16)のE7とのVP22の新規の融合を創製した。これらの特性は、ワクチン接種したマウスにおいてE7特異的なCD8+T細胞前駆体の数の劇的な増加をもたらし(少なくとも50倍)、あまり効果的ではないワクチンをE7発現腫瘍に対する有意な能力をもつものに変換した。比較すれば、非拡散変異体VP22(1−267)はワクチンの能力を高めることはできなかった。その全体が参照によって本明細書に組み入れられる米国特許出願公開番号20040028693(米国特許第7,318,928号)で提示された成績は、抗原の細胞間拡散とMHCクラスIによる提示の増大を介してDNAワクチンの能力が劇的に改善されることを示している。
MDV−1UL49をE7に連結する同様の検討もワクチン接種したマウスにおけるE7特異的なCD8+T細胞前駆細胞の数の劇的な増加とE7発現腫瘍に対する強力な応答をもたらした。MDV−1UL49DNAワクチンを接種したマウスは、HSV−1VP22/E7によって誘導されたレベルに匹敵するレベルでE7特異的なCD8+T細胞前駆細胞を刺激した。従って、標的抗原の遺伝子をコードするDNAへのMDV−1UL49DNAの融合は、DNAワクチンの能力を有意に高める。
一実施形態では、拡散タンパク質は、ヘルペスウイルスVP22タンパク質を含むウイルス性の拡散タンパク質であってもよい。本明細書で例示されるのは、単純性ヘルペスウイルス−1(HSV−1)VP22(HVP22と略記)及びMDV−VP22又はMVP−22と呼ばれるマレック病ウイルス(MDV)に由来するそのホモログを含む融合構築物である。また本発明に含まれるのは、ヘルペスウイルス科のほかのメンバーに由来するVP22のホモログ、又はホモログであるとみなされ、それに融合される若しくは化学的に抱合されるポリペプチド若しくはペプチドの細胞間拡散を促進する機能的特性を共有する非ウイルス起源のポリペプチドである。
HVP22をコードするDNAはさらに長い配列(HVP22を含むベクターの完全長ヌクレオチド配列である)配列番号16のヌクレオチド1〜192としての配列、配列番号7を有する。MDV−VP22をコードするDNAは、以下に示される概裂番号37である:
MDV−VP22のアミノ酸配列、配列番号40は以下のとおりである:
E7(配列番号41)のアミノ酸配列は配列番号39の残基308〜403である。この特定のクローンは、E7に存在する98残基のうち96を有する。野生型E7のC末端残基、LysとProはこの構築物に存在しない。これは、用語が以下で記載されるように欠失変異体の例である。ほかの抗原性ポリペプチドのそのような欠失変異体(たとえば、2又は少数のアミノ酸の末端切捨て)は、本発明の融合ポリペプチドの範囲内で意図される実施形態の例である。
IPPのホモログ
それらが必要とされる生物活性を有するという条件で、本明細書に記載されるようなIPPのホモログ又は変異体も使用されてもよい。これらには、アミノ酸配列又は核酸配列の置換、欠失又は付加が含まれる。コドンの縮重のために、たとえば、同一のアミノ酸配列をコードする核酸配列には相当の変異があってもよい。
IPPのホモログ
それらが必要とされる生物活性を有するという条件で、本明細書に記載されるようなIPPのホモログ又は変異体も使用されてもよい。これらには、アミノ酸配列又は核酸配列の置換、欠失又は付加が含まれる。コドンの縮重のために、たとえば、同一のアミノ酸配列をコードする核酸配列には相当の変異があってもよい。
IPPの機能的な誘導体は、クラスI経路による提示を促進することによってそれに融合される1以上の抗原性エピトープの免疫原性を促進することを含む、測定可能なIPP様の活性を保持する。「機能的な誘導体」は、用語が本明細書と併せて又はその代わりに使用されるかどうかにかかわりなく、「変異体」及び「断片」を包含する。
用語「キメラ」の又は「融合」のポリペプチド又はタンパク質は、線形様式で第2のポリペプチド又はペプチドのドメインと化学的に結合する少なくとも1つのポリペプチド又はペプチドの配列を含む組成物を指す。本発明の一実施形態は、少なくとも2つのドメインを含む融合タンパク質をコードする単離された又は組換えの核酸分子であり、その際、第1のドメインはIPPを含み、第2のドメインは抗原性エピトープ、たとえば、MHCクラスIに結合するペプチドエピトープを含む。「融合」は、ペプチド結合、化学結合、電荷相互作用(たとえば、塩架橋、H−結合などのような静電気誘引)などによって生成される会合である。ポリペプチドが組換え性であるなら、「融合タンパク質」は共通するmRNAから翻訳され得る。或いは、ドメインの組成物は、化学的手段又は静電気的手段によって連結することができる。本発明のキメラ分子(たとえば、標的化ポリペプチド融合タンパク質)にはまた、追加の配列、たとえば、リンカー、エピトープタグ、酵素切断認識配列、シグナル配列、分泌シグナル等が含まれ得る。
或いは、ペプチドを単にキャリアに連結させて、ペプチドの操作、特定/局在化を円滑にすることができる。
また、含まれるのは、IPPの「機能的な誘導体」であり、それは、アミノ酸置換変異体、タンパク質の「断片」と呼ばれる。IPPの機能的な誘導体は、それと共に融合される又は同時投与される1以上の抗原性エピトープの免疫原性を増進するとき明らかにされてもよい測定可能な活性を保持する。「機能的な誘導体」は、用語が本明細書と併せて又はその代わりに使用されるかどうかにかかわりなく、「変異体」及び「断片」を包含する。
機能的なホモログは、上記の生化学的な及び生物学的な活性を持たなければならない。この機能的な性状分析の観点から、未だに発見されていないタンパク質を含むホモログタンパク質の使用は、これらのタンパク質が配列類似性を有し、言及された生化学的な及び生物学的な活性を有するならば、本発明の範囲内に入る。
2つのアミノ酸配列又は2つの核酸配列のパーセント同一性を決定するには、最適な比較目的のために配列を並べる(たとえば、最適な配置のために第1及び第2のアミノ酸配列又は核酸配列の一方又は両方にギャップを導入することができ、比較目的で、非相同配列を無視する)。一実施形態では、配置の方法にはCys残基の配置が含まれる。
一実施形態では、比較される配列の長さは、IPP参照配列の長さの少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%である。次いで、相当するアミノ酸(又はヌクレオチド)の位置でアミノ酸残基(又はヌクレオチド)を比較する。第1の配列における位置が、第2の配列における相当する位置と同一のアミノ酸(ヌクレオチド)で占められている場合、分子はその位置で同一である(本明細書で使用されるとき、アミノ酸又は核酸の「同一性」はアミノ酸又は核酸の「相同性」と同等である)。2つの配列の間のパーセント同一性は、配列によって共有される同一の位置の数の関数であり、2つの配列の最適な配置のために導入されることが必要なギャップの数、各ギャップの長さを説明する。
数学的なアルゴリズムを用いて配列の比較及び2つの配列の間のパーセント同一性の決定を達成することができる。一実施形態では、Blossom62マトリクス又はPAM250マトリクス、及び16、14、12、10、8、6又は4のギャップ加重及び1、2、3、4、5又は6の長さ荷重を用いたGCGソフトウエアパッケージ(http://www.gcg.comで利用可能)におけるGAPプログラムに組み入れられているNeedleman及びWunsch(J.Mol. Biol. 48:444-453 (1970)のアルゴリズムを用いて、2つのアミノ酸配列の間のパーセント同一性が決定される。さらに別の実施形態では、NWSgapdna.CMPマトリクス及び40、50、60、70又は80のギャップ荷重及び1、2、3、4、5又は6の長さ荷重を用いたGCGソフトウエアパッケージ(http://www.gcg.comで利用可能)におけるGAPプログラムを用いて2つのヌクレオチド配列の間のパーセント同一性が決定される。別の実施形態では、PAM120加重残基表、12のギャップ長さペナルティ及び4のギャップペナルティを用いたALIGNプログラム(バージョン2.0)に組み入れられているE.MeyersとW.Miller(CABIOS,4:11-17 (1989))のアルゴリズムを用いて2つのアミノ酸配列又はヌクレオチド配列の間のパーセント同一性が決定される。
本発明の核酸配列及びタンパク質配列をさらに「クエリー配列」として用いて、公的なデータベースでの検索を行う、たとえば、ほかのファミリーメンバー又は関連する配列を特定することができる。そのような検索は、Altschulら(1990)J.Mol.Biol.215:403−10のNBLAST及びXBLASTのプログラム(バージョン2.0)を用いて実施することができる。NBLASTプログラム、スコア=100、ワード長=12と共にBLASTヌクレオチド検索を用いてIPP核酸分子に対するヌクレオチド配列のホモログを入手することができる。NBLASTプログラム、スコア=50、ワード長=30と共にBLASTタンパク質検索を用いてIPPタンパク質分子に対するアミノ酸配列のホモログを入手することができる。比較目的でギャップのある配置を入手するには、Altschulら(1997)Nucleic Acids Res.25:3389−3402に記載されたようにギャップ付きBLASTを利用することができる。BLAST及びギャップ付きBLASTのプログラムを利用する場合、各プログラム(たとえば、XBLAST及びNBLAST)の初期設定パラメータを使用することができる。http://www.ncbi.nlm.nih.gov.を参照のこと。
従って、上記で記載されたIPP又はIPPドメインのホモログは、(a)天然のIPP又はそのドメインの機能的な活性を有し、(b)上記で決定されたとき、少なくとも約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%天然のIPPタンパク質又はそのドメインに類似するアミノ酸配列を有することを特徴とする。
IPPの開示された配列に基づいたDNAプローブを用いてそのようなタンパク質を入手し、発現させることは当該技術の技量の範囲内である。次いで、本明細書に記載されるもののような当該技術で承認されている方法、たとえば、T細胞増殖、サイトカイン分泌又は細胞傷害性アッセイ、又は腫瘍防御若しくは腫瘍治療の生体内アッセイを用いて融合タンパク質んp生化学的な及び生物学的な活性を容易に調べることができる。抗原特異的T細胞の反応性の刺激の生物学的なアッセイは、ホモログが必要とされる活性を有して「機能的なホモログ」として評価されるかどうかを示す。
「変異体」は、完全なタンパク質又は1以上のアミノ酸残基が置換されている(置換変異体)又は1又は幾つかの欠失した(欠失変異体)又は付加された(付加変異体)残基を有する、その断片と実質的に同一である分子を指す。IPPの「断片」は完全長タンパク質の短いポリペプチドである分子のサブセットを指す。
多数の方法を用いて、単離されたDNA配列の断片、突然変異体及び変異体を生成する。拡散タンパク質をコードする核酸の小さな亜領域又は断片、たとえば、1〜30塩基の長さを標準的な化学合成によって調製することができる。さらなる合成断片の生成に使用するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド及びプライマー。
変異体の一群は、少なくとも1つのアミノ酸残基、特定の実施形態では、たった1つのアミノ酸残基が異なった残基によって置換されているものである。タンパク質の化学及び構造の詳細な記載については、参照によって本明細書に組み入れられるSchulz,GEら、Principles of Protein Structure,Springer−Verlag,New York,1978,及びCreighton,T.E.,Proteins:Structure and Molecular Properties,W.H.Freeman & Co.,San Francisco,1983を参照のこと。タンパク質分子で為されてもよい置換の種類は、Schulzら(上記)の表1〜2及びCreighton(上記)の図3〜9で提示されるもののような異なった種の相同なタンパク質間におけるアミノ酸変化の頻度の分析に基づいてもよい。そのような分析に基づいて、保存的置換は、以下の5群の1つの中での交換として本明細書で定義される。
上記5群の中ではなく、その間でのあまり保存的ではない置換を選択することによって生化学的な、機能的な(又は免疫的な)特性でのさらに実質的な変化を為す。そのような変化は、(a)置換の領域におけるペプチド主鎖の構造、たとえば、シート状若しくは螺旋状の構造、(b)標的部位での分子の電荷若しくは疎水性、又は(c)側鎖の嵩高を維持することに対するその効果でさらに有意に異なる。そのような置換の例は、(i)ほかのアミノ酸によるGly及び/又はProの置換、又はGly又はProの欠失若しくは挿入;(ii)疎水性残基、たとえば、Leu、Ile、Phe、Val若しくはAlaについての(又はによる)親水性残基、たとえば、Ser若しくはThrの置換;(iii)ほかの残基についての(又はによる)Cysの置換;(iv)電気的に負の電荷を有する残基、たとえば、Glu若しくはAspについての(又はによる)電気的に正の荷電を有する残基、たとえば、Lys、Arg若しくはHisの置換;又は(v)嵩高な側鎖を有さない残基、たとえば、Glyについての(又はによる)そのような側鎖を有する残基の置換である。
本発明に従って最も許容できる欠失、挿入及び置換は、関連する生物活性という点で、たとえば、抗原性エピトープ又はタンパク質に融合されるエピトープに対する抗原特異的なT細胞の反応性を刺激する能力という点で、野生型又は天然のタンパク質の特徴に過激な変化を生じないものである。しかしながら、そのように行う前に置換、欠失又は挿入の正確な影響を予測するのが難しい場合、当業者は、過度の実験を必要とすることなく、ここで記載されるような日常のスクリーニングアッセイによって影響を評価することができることを十分に理解するであろう。
本明細書で提供される例となる融合タンパク質は、IPPタンパク質又はそのホモログと抗原を含む。たとえば、融合タンパク質は、抗原に連結された、IPP又はIPP断片、たとえば、N−CRT、P−CRT及び/又はC−CRT、又はIPP又はIPP断片のアミノ酸配列と少なくとも約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一であるアミノ酸配列を含んでもよく、本質的にそれから成ってもよく又はそれから成ってもよく、その際、IPP断片は本明細書でさらに記載されるように機能的に活性がある。融合タンパク質はまた、IPP又はIPP断片及びIPP断片のN末端及び/又はC末端で少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10以上のアミノ酸又は約1〜5、1〜10、1〜15、1〜201〜25、1〜301〜50のアミノ酸を含んでもよい。これら追加のアミノ酸は、IPPタンパク質における相当する位置でのアミノ酸配列に無関係であるアミノ酸配列を有してもよい。
IPP又はIPP断片のホモログは、付加、欠失又は置換によって、たとえば、少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10のアミノ酸又は約1〜5、1〜15又は1〜20のアミノ酸の保存的置換によってIPP又はIPP断片とは異なるアミノ酸配列を含んでもよく、本質的にそれから成ってもよく又はそれから成ってもよい。IPP又はIPP断片のホモログは、本明細書で記載されるもののようなIPP又はIPP断片をコードするヌクレオチド配列と少なくとも約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一であるヌクレオチド配列によってコードされてもよい。
IPP又はIPP断片のさらにほかのホモログは、IPP又はIPP断片をコードする核酸とストリンジェントなハイブリッド形成の条件下でハイブリッド形成する核酸によってコードされる。たとえば、65℃にて0.2〜1×SSC、次いで65℃にて0.2×SSCでの洗浄の高いストリンジェントな条件下で、本明細書に記載される配列から成る核酸とハイブリッド形成する核酸によってコードされてもよい。室温にて6×SSC次いで室温にて2×SSCの洗浄の低いストリンジェントな条件下で、本明細書に記載される配列から成る核酸とハイブリッド形成する核酸を使用することができる。ほかのハイブリッド形成の条件には、40又は50℃での3×SSC,次いで20、30、40、50、60又は65℃での1又は2×SSCでの洗浄が挙げられる。ハイブリッド形成は、ハイブリッド形成の厳密性をさらに高める、たとえば、10%、20%、30%、40%又は50%のホルムアルデヒドの存在下で実施することができる。核酸のハイブリッド形成の理論と実践はS.Agrawal(編)、Methods in Molecular Biology,第20巻に記載されており;Tijssen(1993)、Laboratory Techniques in biochemistry and molecular biology−hybridization with nucleic acid probes, e.g., part I chapter 2 “Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays,”Elsevier,New Yorkは核酸のハイブリッド形成への基本的な指針を提供している。
核酸配列の断片は、完全長のCRTポリペプチド、抗原性ポリペプチド又はその融合物をコードするヌクレオチド配列よりも少ないヌクレオチドを有するヌクレオチド配列として定義される。本発明は、融合ポリペプチドの抗原部分に特異的である、CD8+T細胞を含むT細胞の頻度又は反応性の増大を誘導する融合ポリペプチドの能力を保持するポリペプチドをコードするそのような核酸断片を含む。
本発明の核酸配列は、コードされるタンパク質又は断片のクローニング、発現又は精製に関連する操作に有用であるリンカー配列、天然の又は修飾された制限エンドヌクレアーゼ部位及びそのほかの配列も含んでもよい。たとえば、融合タンパク質は、抗原とIPPタンパク質の間にリンカーを含んでもよい。
使用されてもよいそのほかの核酸ワクチンには、実施例及びその中で引用される参考文献にさらに記載されるような単鎖三量体(SCT)が挙げられるが、それらのすべては参照によって特に本明細書に組み入れられる。
核酸ワクチンの主鎖
核酸ワクチン、たとえば、DNAワクチンは、「発現ベクター」又は「発現カセット」、すなわち、タンパク質のコーディング配列の発現に影響を及ぼすことが可能であるヌクレオチド配列を、そのような配列と相性が合う宿主にて含んでもよい。発現カセットは、ポリペプチドのコーディング配列と操作可能に連結され、任意で、ほかの配列、たとえば、転写停止シグナルと操作可能に連結された少なくとも1つのプロモータを含む。発現を達成するのに必要な又は役立つ追加の因子、たとえば、エンハンサが含まれてもよい。
核酸ワクチンの主鎖
核酸ワクチン、たとえば、DNAワクチンは、「発現ベクター」又は「発現カセット」、すなわち、タンパク質のコーディング配列の発現に影響を及ぼすことが可能であるヌクレオチド配列を、そのような配列と相性が合う宿主にて含んでもよい。発現カセットは、ポリペプチドのコーディング配列と操作可能に連結され、任意で、ほかの配列、たとえば、転写停止シグナルと操作可能に連結された少なくとも1つのプロモータを含む。発現を達成するのに必要な又は役立つ追加の因子、たとえば、エンハンサが含まれてもよい。
「操作可能に連結される」は、コーディング配列の発現を可能にするような方式でコーディング配列を調節性配列に連結することを意味する。既知の調節配列を選択して、適切な宿主細胞にて所望のタンパク質の発現を指向する。従って、用語「調節配列」には、プロモータ、エンハンサ及びそのほかの発現制御要素が挙げられる。そのような調節配列は、たとえば、Goeddel,Gene Expression Technology.Methods in Enzymology,vol.185, Academic
Press,San Diego,Calif.(1990))に記載されている。
Press,San Diego,Calif.(1990))に記載されている。
DNA又はRNA分子のプロモータ領域がRNAポリメラーゼに結合し、「操作可能に」連結された核酸配列の転写を促進する。本明細書で使用されるとき、「プロモータ配列」は、RNAポリメラーゼによって転写されるDNA又はRNAの鎖上に見い出されるプロモータのヌクレオチド配列である。たとえば、プロモータとコーディング配列のような2つの核酸分子の配列は、双方の配列が同一のRNA転写物に転写されるのを可能にする又は一方の配列で始まったRNA転写物が第2の配列に伸びるのを可能にする方法でそれらが互いに連結される場合、「操作可能に連結される」。従って、プロモータとDNA又はRNAのコーディング配列のような2つの配列は、プロモータ配列で開始する転写が操作可能に連結されたコーディング配列のRNA転写物を生じるならば、操作可能に連結されている。「操作可能に連結される」ためには、2つの配列が線状配列において互いに間近に隣接する必要はない。
一実施形態では、本発明の特定のプロモータ配列は哺乳類細胞で操作可能でなければならず、真核生物のプロモータ又はウイルスのプロモータのいずれかであってもよい。特定のプロモータも実施例で記載され、有用なプロモータ及び調節性要素は以下で記載される。好適なプロモータは、誘導性、抑制性又は構成的であってもよい。「構成的な」プロモータは、細胞の環境において及び発生全体を通して遭遇されるほとんどの環境下で活性があるものである。「誘導性」のプロモータは、環境的な調節又は発生上の調節のもとにあるものである。「組織特異的な」プロモータは生物の特定の種類の組織で活性があるものである。構成的なプロモータの例は、ウイルスプロモータ、MSV−LTRであり、それは、種々の細胞種で効率的であり、活性があり、ほかのほとんどのプロモータとは対照的に、停止した細胞及び増殖中の細胞で同様に高い活性を有する。ほかのウイルスプロモータのは、CMV−LTR(サイトメガロウイルスに由来)に存在するもの(Bashart,M. et al., Cell 41:521, 1985)又はRSV−LTR(ラウス肉腫ウイルスに由来)に存在
するもの(Gorman,C.M., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6777, 1982)が挙げられる。
有用なのはまた、マウスのメタロチオネインI遺伝子のプロモータ(Hamer,D, et al., J. Mol. Appl. Gen. 1:273-88,1982);ヘルペスウイするのTKプロモータ(McKnight,S, Cell 31:355-65, 1982);SV40早期プロモータ(Benoist,C., et al., Nature290:304-10, 1981);及び酵母gal4遺伝子プロモータ(Johnston, SA et al.,Proc.Natl. Acad. Sci. USA 79:6971-5, 1982); Silver, PA, et al., Proc.Natl.Acad. Sci. (USA) 81:5951-5, 1984))である。プロモータ領域に関連する転写因子及び転写因子の別々の活性化とDNA結合のそのほかの説明的記載には、Keeganら、Nature 231:699,1986;Fieldsら、Nature 340:245,1989;Jones,Cell 61:9,1990;Lewin,Cell 61:1161,1990;Ptashneら、Nature 346:329,1990;Adamsら、Cell 72:306,1993が挙げられる。
するもの(Gorman,C.M., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6777, 1982)が挙げられる。
有用なのはまた、マウスのメタロチオネインI遺伝子のプロモータ(Hamer,D, et al., J. Mol. Appl. Gen. 1:273-88,1982);ヘルペスウイするのTKプロモータ(McKnight,S, Cell 31:355-65, 1982);SV40早期プロモータ(Benoist,C., et al., Nature290:304-10, 1981);及び酵母gal4遺伝子プロモータ(Johnston, SA et al.,Proc.Natl. Acad. Sci. USA 79:6971-5, 1982); Silver, PA, et al., Proc.Natl.Acad. Sci. (USA) 81:5951-5, 1984))である。プロモータ領域に関連する転写因子及び転写因子の別々の活性化とDNA結合のそのほかの説明的記載には、Keeganら、Nature 231:699,1986;Fieldsら、Nature 340:245,1989;Jones,Cell 61:9,1990;Lewin,Cell 61:1161,1990;Ptashneら、Nature 346:329,1990;Adamsら、Cell 72:306,1993が挙げられる。
プロモータ領域にはさらに、特定の組織で見い出される特定のタンパク質と相互作用することによって、組織特異的なエンハンサとして機能してもよいオクタマー領域が挙げられる。本発明のDNA構築物のエンハンサドメインは、形質移入される標的細胞に特異的であるもの、又はそのような標的細胞の細胞性因子によって高度に活性化されるものである。ベクター(プラスミド又はレトロウイルス)の例は、たとえば、参照によって組み入れられるRoy−Burmanらの米国特許第5,112,767号に記載されている。エンハンサ及び転写におけるその作用の一般的な議論については、Lewin,BM,Genes IV,Oxford University Press pp.552−576,1990(又はその後の版)を参照のこと。特に有用なのは、プロモータの上流に置かれ、それと相互作用して遺伝子の発現を刺激するレトロウイルスのエンハンサ(たとえば、ウイルスLTR)である。レトロウイルスベクターと共に使用するために、内因性のウイルスLTRをエンハンサなしにして、組織特異性又は、転写効率のようなほかの所望の特性を付与するほかの所望のエンハンサ配列で置き換える。
従って、発現カセットには、プラスミド、組換えウイルス、任意の形態の組換え「ネイキッドDNA」ベクターなどが含まれる。「ベクター」は、細胞に感染し、細胞を形質移入し、一時的に又は永続的に細胞に形質導入することができる核酸を含む。ベクターは、ネイキッド核酸であることができ、又はタンパク質若しくは脂質と複合体化した核酸であることができる。ベクターは任意で、ウイルス又は細菌の核酸及び/又はタンパク質、及び/又は膜(たとえば、細胞膜、ウイルス脂質エンベロープなど)を含む。ベクターは、DNAの断片が連結され、複製されるようになってもよいレプリコン(たとえば、RNAレプリコン)、バクテリオファージ)を含む。従って、ベクターは、RNA、自律的な自己複製の環状又は線状のDNA又はRNA、たとえば、プラスミド、ウイルスなどを含むが、これらに限定されず(参照によって組み入れられる米国特許第5,217,879号)、発現プラスミド及び非発現プラスミドの双方を含む。組換え細胞又は培養物が「発現ベクター」を受け入れるとして記載される場合、これには、染色体外の環状又は線状のDNAと宿主染色体に組み込まれているDNAの双方が含まれる。ベクターが宿主細胞で維持される場合、ベクターは、自律的構造として細胞分裂の間に細胞によって安定的に複製されてもよいし、宿主のゲノムに取り込まれてもよい。
使用されてもよい例となるウイルスベクターには、組換えアデノウイルス(Horowitz,MS, In: Virology, Fields, BN etal., eds, Raven Press, NY, 1990,p. 1679; Berkner,
KL, Biotechniques 6:616-29, 1988; Strauss, SE, In: TheAdenoviruses, Ginsberg,HS, ed., Plenum Press, NY, 1984, chapter 11)及び単純性ヘルペスウイルス(HSV)が挙げられる。ヒトの遺伝子送達にとってのアデノウイルスの利点には、組換えが稀であり、そのようなウイルスと関連するヒトの悪性腫瘍は知られておらず、アデノウイルスのゲノムは、7.5kbのサイズまでの外来遺伝子を受け入れるように操作することができる二本鎖DNAであり、生きたアデノウイルスは安全なヒトワクチン用生物であるという事実が挙げられる。アデノ関連ウイルスも本発明に係るヒトの治療法(Samulski,RJet al., EMBO J. 10:3941, 1991)に有用である。
KL, Biotechniques 6:616-29, 1988; Strauss, SE, In: TheAdenoviruses, Ginsberg,HS, ed., Plenum Press, NY, 1984, chapter 11)及び単純性ヘルペスウイルス(HSV)が挙げられる。ヒトの遺伝子送達にとってのアデノウイルスの利点には、組換えが稀であり、そのようなウイルスと関連するヒトの悪性腫瘍は知られておらず、アデノウイルスのゲノムは、7.5kbのサイズまでの外来遺伝子を受け入れるように操作することができる二本鎖DNAであり、生きたアデノウイルスは安全なヒトワクチン用生物であるという事実が挙げられる。アデノ関連ウイルスも本発明に係るヒトの治療法(Samulski,RJet al., EMBO J. 10:3941, 1991)に有用である。
本発明のDNA分子を発現することができ、本治療法の設定で有用である別のベクターは、ワクシニアウイルスであり、それは、非複製にすることができる(それぞれ参照によって組み入れられる米国特許第5,225,336号;同第5,204,243号;同第5,155,020号;同第4,769,330号;uerst,TR et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 :2549-53, 1992; Chakrabarti, S et al.,Mol Cell Biol 5 :3403-9, 1985)。組換えワクシニアウイルス及び非均質DNAを含有するほかのウイルスの説明及び免疫とDNA療法におけるその使用は、Moss,B,Curr Opin Genet Dev 3:86−90,1993;Moss,B,Biotechnol.20:345−62,1992に概説されている。
使用されてもよいそのほかのウイルス性ベクターには、アデノ関連ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、及びプラスミドベクターを含むウイルス性又は非ウイルス性のベクターが挙げられる。例となる種類のウイルスには、HSV(単純性ヘルペスウイルス)、AAV(アデノ関連ウイルス)、HIV(ヒト免疫不全ウイルス)、BIV(ウシ免疫不全ウイルス)及びMLV(マウス白血病ウイルス)が挙げられる。
また、DNAワクチンには、レプリコン、例えば、自己複製型RNAベクターである、RNAレプリコンを使ってもよい。一実施形態では、レプリコンは、シンドビスウイルスRNAレプリコン、例えば、SINrep5をベースにしたものである。本発明者等は、E7をこの様なワクチンの観点から試験し、E7に結合したHSV−1VP22をコードしたシンドビスウイルスRNAワクチンがE7特異的CD8T細胞の活性化を有意に高
め、E7発現腫瘍に対する強力な抗腫瘍免疫が得られることを示した(Wu et al、米国特許出願第10/343、719号参照)。これらの調査で使われたシンドビスウイルスRNAレプリコンベクターのSINrep5については、(Bredenbeek、PJ et al.、1993、J.Virol.67:6439−6446)に記載がある。
め、E7発現腫瘍に対する強力な抗腫瘍免疫が得られることを示した(Wu et al、米国特許出願第10/343、719号参照)。これらの調査で使われたシンドビスウイルスRNAレプリコンベクターのSINrep5については、(Bredenbeek、PJ et al.、1993、J.Virol.67:6439−6446)に記載がある。
一般的には、RNAレプリコンワクチン剤は、アルファウイルス、例えば、シンドビスウイルス(Hariharan、MJ et al.、1998.J Virol 72:950−8.)、セムリキ森林ウイルス(Berglund、P M et al.、1997.AIDS Res Hum Retroviruses 13:1487−95;Ying、HT et al.、1999.Nat Med 5:823−7)またはベネズエラウマ脳炎ウイルス(Pushko、P M et al.、1997.Virology 239:389−401)由来であってもよい。これらの自己複製および自己制御型ワクチン剤は、インビトロでまたはインビボで形質移入される細胞中に、(1)RNAとして、または(2)後でRNAレプリコンに転写されるDNAとして投与されてもよい(Berglund、PC et al.、1998.Nat Biotechnol 16:562−5;Leitner、W W et al.、2000.Cancer Res 60:51−5)。代表的セムリキ森林ウイルスは、pSCA1(DiCiommo、D P et al.、J Biol Chem 1998;273:18060−6)である。
プラスミドベクターpcDNA3またはその機能的ホモログ(配列番号1)をDNAワクチンとして使ってもよい。他の実施形態では、pNGVL4a(配列番号2)が使われている。
本発明の1つのプラスミドバックボーン、pNGVL4aは、元々pNGVL3ベクター由来で、ヒトワクチン治験で承認された。pNGVL4aベクターには、非コード領域中に2つの免疫賦活性配列(CpGジヌクレオチドの直列反復)を含む。他方、DCを含むAPC、または交差提示により抗原成分をDCに移送する他の細胞を形質転換できる任意の他のプラスミドDNAは本発明に有用であり、ヒト治療上の使用にすでに認可されているという事実により、pNGFVLA4aを使ってもよい。
次の文献には、基礎的な医学および獣医学のウイルス学の分野における原理と最新の情報が記述されており、これらは参照によって組み込まれる:Fieldsウイルス学、Fields、BN et al.、eds.、Lippincott Williams
& Wilkins、NY、1996;ウイルス学原論:分子生物学、発病、および管理、Flint、S.J.et al.、eds.、Amer Soc Microbiol、Washington DC、1999;臨床的ウイルス学の原理と実践、4th
Edition、Zuckerman.A.J.et al.、eds、John Wiley & Sons、NY、1999;C型肝炎、by Hagedorn、CH et al.、eds.、Springer Verlag、1999;B型肝炎ウイルス:分子的疾患メカニズムおよび新規治療戦略、Koshy、R.et al.、eds、World Scientific Pub Co、1998;獣医学のウイルス学、Murphy、F.A.et al.、eds.、Academic Press、NY、1999;鳥ウイルス:機能と管理、Ritchie、B.W.、Iowa State University Press、Ames、2000;ウイルス分類学:ウイルスの分類と命名法:Seventh Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses、by
M.H.V.VanRegenmortel、MHV et al.、eds.、Academic Press;NY、2000。
& Wilkins、NY、1996;ウイルス学原論:分子生物学、発病、および管理、Flint、S.J.et al.、eds.、Amer Soc Microbiol、Washington DC、1999;臨床的ウイルス学の原理と実践、4th
Edition、Zuckerman.A.J.et al.、eds、John Wiley & Sons、NY、1999;C型肝炎、by Hagedorn、CH et al.、eds.、Springer Verlag、1999;B型肝炎ウイルス:分子的疾患メカニズムおよび新規治療戦略、Koshy、R.et al.、eds、World Scientific Pub Co、1998;獣医学のウイルス学、Murphy、F.A.et al.、eds.、Academic Press、NY、1999;鳥ウイルス:機能と管理、Ritchie、B.W.、Iowa State University Press、Ames、2000;ウイルス分類学:ウイルスの分類と命名法:Seventh Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses、by
M.H.V.VanRegenmortel、MHV et al.、eds.、Academic Press;NY、2000。
元のままのDNAまたはウイルスベクターの他に、操作した細菌をベクターとして使ってもよい。多くの細菌株には、サルモネラ、BCGおよびリステリア菌(LM)(Hoiseth et al.、Nature 291:238−9、1981;Poirier、TP et al.、J Exp Med168:25−32、1988);Sadoff、J Cetal.、Science240:336−8、1988;Stover、CK et al.、Nature 351:456−60、1991;Aldovini、A et al.、Nature 351:479−82、1991)がある。これらの微生物はワクチンとしての使用に有望な2つの特性を示す:(1)経口ワクチン送達の可能性を与える、腸経路による感染、および(2)単球/マクロファージへの感染により、抗原をプロフェッショナルAPCに向かわせる。
インビボでのウイルス媒介遺伝子移入に加えて、プラスミドDNAの投与を含む、当技術分野でよく知られた物理的手段をDNAの直接移入に使用可能である(Wolff et al.、1990、上記)および微粒子銃介在遺伝子移入(Yang、N−S、et
al.、Proc Natl Acad Sci USA 87:9568、1990;Williams、RSetal.、ProcNatlAcadSciUSA88:2726、1991;Zelenin、AV et al.、FEBS Lett 280:94、1991;Zelenin、AV et al.、FEBS Lett 244:65、1989);Johnston、SA et al.、In Vitro Cell Dev Bio l27:11、1991)。さらに、本発明に従って、遺伝子の細胞中へのインビトロでのよく知られた移入手段である電気穿孔をインビボでの組織へのDNA分子移入に使用可能である。(Titomirov、AV et al.、Biochim Biophys Acta 1088:131、1991)。
al.、Proc Natl Acad Sci USA 87:9568、1990;Williams、RSetal.、ProcNatlAcadSciUSA88:2726、1991;Zelenin、AV et al.、FEBS Lett 280:94、1991;Zelenin、AV et al.、FEBS Lett 244:65、1989);Johnston、SA et al.、In Vitro Cell Dev Bio l27:11、1991)。さらに、本発明に従って、遺伝子の細胞中へのインビトロでのよく知られた移入手段である電気穿孔をインビボでの組織へのDNA分子移入に使用可能である。(Titomirov、AV et al.、Biochim Biophys Acta 1088:131、1991)。
また、「担体媒介遺伝子移入」について、(Wu、CH et al.、J Biol
Chem 264:16985、1989;Wu、GY et al.、J Biol
Chem 263:14621、1988;Soriano、P et al.、Proc Nat.Acad Sci USA 80:7128、1983;Wang、C−Y et al.、Pro.Natl Acad Sci USA8 4:7851、1982;Wilson、JM et al.、J Biol Chem 267:963、1992)に記載されている。一実施形態では、担体は、標的とされたリポソーム(Nicolau、C et al.、Proc Natl Acad Sci USA 80:1068、1983;Soriano et al.、上述)、例えば、免疫リポソームで、これはアシル化mAbを脂質二重層中に組み込むことができる(Wang et
al.、上述).ポリカチオン、例えば、アシアロ糖タンパク質/ポリリシン(Wu et al.、1989、上述)を使ってもよく、この場合、複合体には、標的組織認識分子(例えば、肝臓に対するアシアロオロソムコイド)および損傷を起こすことなく形質移入できるようにDNAに結合するDNA結合化合物、例えば、ポリリシン、が含まれる。この複合体は、次に、本発明のプラスミドDNAと複合化される。
Chem 264:16985、1989;Wu、GY et al.、J Biol
Chem 263:14621、1988;Soriano、P et al.、Proc Nat.Acad Sci USA 80:7128、1983;Wang、C−Y et al.、Pro.Natl Acad Sci USA8 4:7851、1982;Wilson、JM et al.、J Biol Chem 267:963、1992)に記載されている。一実施形態では、担体は、標的とされたリポソーム(Nicolau、C et al.、Proc Natl Acad Sci USA 80:1068、1983;Soriano et al.、上述)、例えば、免疫リポソームで、これはアシル化mAbを脂質二重層中に組み込むことができる(Wang et
al.、上述).ポリカチオン、例えば、アシアロ糖タンパク質/ポリリシン(Wu et al.、1989、上述)を使ってもよく、この場合、複合体には、標的組織認識分子(例えば、肝臓に対するアシアロオロソムコイド)および損傷を起こすことなく形質移入できるようにDNAに結合するDNA結合化合物、例えば、ポリリシン、が含まれる。この複合体は、次に、本発明のプラスミドDNAと複合化される。
形質移入または微量注入に使われるプラスミドDNAは、当技術分野でよく知られた方法、例えば、Quiagen法(Quiagen)を使い、その後、既知の本明細書に例示されてるような方法でDNA精製して調製できる。
このような発現ベクターは、DNAの発現、および融合タンパク質またはペプチドを含むコード化タンパク質の産生を目的として、宿主細胞(インビトロ、エクスビボまたはインビボで)に形質移入するために使用可能である。一実施形態では、DNAワクチンは細胞、例えば、患者から入手した細胞、(例えば、抗原提示細胞)に投与され、または細胞と接触させ、そして、患者に投与されるが、ここで患者は、細胞が患者に投与される時間の前、後または同時に治療される。
本明細書で使われる用語の「単離」は、分子または組成物、例えば、転座ポリペプチドまたはそれをコードした核酸、に関する場合は、分子または組成物が少なくとも1つの他の化合物(タンパク質、他の核酸、等)から、または元々随伴しているまたは処理中に随伴するようになった他の混入物から分離されていることを意味する。また、単離組成物は、実質的に純粋でありうる。単離組成物は、均質の状態および無水または水溶液であってもよい。純度と均質性は、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法(PAGE)または高速液体クロマトグラフィー(HPLC)のような分析化学の技術、を使って測定できる。たとえタンパク質が単離され、ゲルパターンで均質または支配的バンドに見えても、同時に精製される痕跡の混入物がある。
融合ポリペプチドまたはそのホモログもしくは機能的誘導体を発現するために形質転換または形質移入した宿主細胞は、本発明の範囲内に含まれる。例えば、融合ポリペプチドは、酵母中、またはチャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)もしくはヒト細胞のような哺乳動物細胞中で発現してもよい。一実施形態では、本発明による発現用細胞はAPCまたはDCである。他の適切な宿主細胞は当業者には既知である。
免疫応答を増強する他の核酸
化学療法剤およびワクチンを投与する方法には、さらに、1つまたは複数の他の構築物、例えば、抗原提示細胞の寿命を延長するための構築物、の投与を含んでもよい。代表的構築物は次の2つの節で記載する。このような複数の構築物を同時に、またはDNAワクチンと同時に投与してもよい。あるいは、DNAワクチンまたは化学療法剤の投与の前または後で投与してもよい。
化学療法剤およびワクチンを投与する方法には、さらに、1つまたは複数の他の構築物、例えば、抗原提示細胞の寿命を延長するための構築物、の投与を含んでもよい。代表的構築物は次の2つの節で記載する。このような複数の構築物を同時に、またはDNAワクチンと同時に投与してもよい。あるいは、DNAワクチンまたは化学療法剤の投与の前または後で投与してもよい。
アポトーシス経路を標的にしたsiRNAを使った免疫応答の増強
DNAワクチンおよび化学療法剤の患者への投与には、1つまたは複数の他の試薬、例えば、構築物を一緒に投与してもよい。一実施形態では、ある方法は、アポトーシス経路を標的にしたsiRNAの患者へのさらなる投与を含む(例えば、国際公開特許WO2006/073970に記載されている。この特許は、本明細書にその全体が組み込まれる)。
DNAワクチンおよび化学療法剤の患者への投与には、1つまたは複数の他の試薬、例えば、構築物を一緒に投与してもよい。一実施形態では、ある方法は、アポトーシス経路を標的にしたsiRNAの患者へのさらなる投与を含む(例えば、国際公開特許WO2006/073970に記載されている。この特許は、本明細書にその全体が組み込まれる)。
本発明者等は、以前、アポトーシス信号伝達経路で中心的役割を演ずるBakおよびBaxタンパク質にハイブリダイズし、その活性化の発現を遮断するsiRNA配列の設計をしたことがある。本発明もまた、腫瘍または過剰増殖疾患の治療方法を対象とし、これには、siRNA分子(配列)、siRNAを含むかまたはコードしたベクター、BakおよびBax核酸の配列に「特異的」なsiRNA配列の転写を推進する配列をコードしたsiRNAに機能的に連結されたプロモーターを有する発現ベクターの投与が含まれる。siRNAsは、一本鎖「ヘアピン」配列を含んでもよい。理由は、それらが、安定性があり、標的mRNAに対し結合するからである。
他のデスタンパク質の中で、BakとBaxはAPC、特にDCのアポトーシスに関係するため、本siRNA配列を、抗原をコードした広範囲のDNAワクチン構築物と一緒に使って、このようなDNAワクチン構築物、特にCTL活性化と作用で典型的に表されるCD8+T細胞媒介免疫応答により誘導される免疫応答を強化し、促進してもよい。これは、抗原提示DCの寿命延長に対するsiRNAの効果の結果として起こると考えられている。このDCは、この効果がなければ、免疫応答を進めている過程でDCが誘導に関与する、まさに同じCTLによって死滅させられる可能性がある。
BakとBaxのほかに、類似の方式で設計されるsiRNAの別の標的には、カスパーゼ8、カスパーゼ9およびカスパーゼ3がある。本発明は、任意の2つ以上のBak、Bax、カスパーゼ8、カスパーゼ9およびカスパーゼ3を標的とするsiRNAが組み合わされて使用され、任意選択で同時に(抗原をコードするDNA免疫原と一緒に)、患者に投与される組成物および方法を含む。また、このようなsiRNAの組み合わせは、DCに形質移入(抗原負荷と共に)して細胞性ワクチン剤としてアポトーシスに対する耐性を付与することによりDCの免疫原性を改善するために使うことができる。
siRNAsは、RNA干渉(RNAi)と呼ばれる高度に制御された酵素媒介プロセスにより遺伝子発現を抑制する(Sharp、P.A.、Genes Dev.15:485-90、2001;Bernstein、E et al.、Nature 409
:363-66、2001;Nykanen、A et al.、Cell 107:3
09-21、2001;Elbashir et al.、Genes Dev.15:
188-200、2001)。RNA干渉は、siNAの標的配列のmRNA中のホモロ
グの配列特異的分解である。本明細書で使われる用語のsiNA(小さい(small)、または短い(short)、干渉核酸)は、配列特異的RNAi(RNA干渉)、例えば、短い(または小さい)干渉RNA(siRNA)、二本鎖RNA(dsRNA)、マイクロRNA(miRNA)、低分子ヘアピンRNA(shRNA)、低分子干渉オリゴヌクレオチド、低分子干渉核酸、低分子干渉修飾オリゴヌクレオチド、化学修飾siRNA、転写後遺伝子サイレンシングRNA(ptgsRNA)、翻訳サイレンシング、等、を媒介することができる核酸分子を記述するのに使われる他の用語と等価であることを意図している。RNAiは、4つの主要ステップ:siRNAからRNA誘導サイレンシング複合体(RISC)の構築、RISCの活性化、標的認識および標的分割、を特徴とする複数のRNAタンパク質相互作用を伴う。これらの相互作用は、siRNA−RISC構築および活性化の間に鎖選択に対し一方に偏らせ全体のRNAi効率に寄与することができる(Khvorova、A et al.、Cell 115:209-216(2
003);Schwarz、DS et al.115:199-208(2003))
。
:363-66、2001;Nykanen、A et al.、Cell 107:3
09-21、2001;Elbashir et al.、Genes Dev.15:
188-200、2001)。RNA干渉は、siNAの標的配列のmRNA中のホモロ
グの配列特異的分解である。本明細書で使われる用語のsiNA(小さい(small)、または短い(short)、干渉核酸)は、配列特異的RNAi(RNA干渉)、例えば、短い(または小さい)干渉RNA(siRNA)、二本鎖RNA(dsRNA)、マイクロRNA(miRNA)、低分子ヘアピンRNA(shRNA)、低分子干渉オリゴヌクレオチド、低分子干渉核酸、低分子干渉修飾オリゴヌクレオチド、化学修飾siRNA、転写後遺伝子サイレンシングRNA(ptgsRNA)、翻訳サイレンシング、等、を媒介することができる核酸分子を記述するのに使われる他の用語と等価であることを意図している。RNAiは、4つの主要ステップ:siRNAからRNA誘導サイレンシング複合体(RISC)の構築、RISCの活性化、標的認識および標的分割、を特徴とする複数のRNAタンパク質相互作用を伴う。これらの相互作用は、siRNA−RISC構築および活性化の間に鎖選択に対し一方に偏らせ全体のRNAi効率に寄与することができる(Khvorova、A et al.、Cell 115:209-216(2
003);Schwarz、DS et al.115:199-208(2003))
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RNAi分子を設計する際に考慮すべきことには、特に、標的とする配列、RNA標的の2次構造およびRNA結合タンパク質の結合がある。siRNA配列を最適化する方法は、熟練作業者には明らかであろう。典型的なアルゴリズムと方法は、Vickers et al.(2003)J Biol Chem 78:7108−7118;Yang et al.(2003)Proc Natl Acad Sci USA 99:9942−9947;Far et al.(2003)Nuc.AcidsRes.31:4417−4424;およびReynolds et al.(2004)Nature Biotechnology 22:326−330、に記載されている。これらはその全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
Far et al.、上述、およびReynolds et al.、上述、に記載された方法は、当業者なら使用可能で、関連するmRNAの転写のサイレンシングに有効な標的配列を選択し、siRNA配列を設計できる。Far et al.は、siRNAの標的へのアクセシビリティーを評価し、活性siRNA構築物設計の支援をするためのオプションを提案している。この手法は高スループットになるよう適合させて自動化可能で、上記RNAiの各ステップでの効率的な処理に寄与しやすいsiRNAの特異的性質を特定するために、siRNAの生物活性に関する追加のパラメーターを含めることができる。Reynolds et al.、上述、は、2つの遺伝子のmRNAを標的とする180siRNAの系統的分析を示した。siRNAの機能性に関連した8つの特性が特定された:低G/C含量、センス鎖3’−末端での低内部安定性の方向への偏り、逆方向反復の欠損、およびセンス鎖塩基選択性(位置3、10、13および19)。8つの基準全てを組み込んだアルゴリズムの適用により効力のあるsiRN選択が顕著に改善される。このことにより、機能的遺伝子ノックダウンを促進する効力のあるsiRNAの選択のための合理的設計が有用であることが強調される。
マウスとヒトBaxおよびBakに対するsiRNA配列候補は、BaxまたはBak(または他の任意の標的)の配列に対しBLAST探索の実行、およびこれらの配列が他のいずれかの遺伝子と交差適合しないことを保障して「生き残る」配列の選択を含むプロセスを使って選択される。
このような選択プロセスとアルゴリズムにより選択されたsiRNA配列を発現プラスミドに挿入し、適切な動物種のBak/Bax機能細胞を抑止する活性を試験することができる。RNAi活性を示すこれらの配列は、粒子に向けて直接投与して使用しても、ウイルスベクター、例えば、複製欠損ヒトアデノウイルス血清型5(Ad5)に再挿入して使用してもよい。
このウイルスベクターの利点の1つは、高い力価(1010のレベル)が得られ、その結果として、高い感染効率が得られることである。例えば、100感染単位/細胞の感染では、全細胞の感染が保障される。このウイルスの別の利点は、高い感受性および感染力ならびに宿主の範囲(細胞の型に関して)である。たとえ発現が一次的であっても、細胞は生き残り、おそらく複製し、Bak/Baxの作用より前に機能し続け、回復して細胞死に誘導するであろう。一実施形態では、構築物には下記が含まれる:
Bakに対しては:
Bakタンパク質をコードしたヌクレオチド配列(停止コドンを含む)(GenBank受入番号NM_007523)を標的配列(大文字、下線)と一緒に下記に示す(配列番号44)。
Baxに対しては:
一実施形態では、抑制分子は2本鎖核酸(すなわち、RNA)で、RNA干渉の方法で使われる。下記に、上で示したsiRNA配列の「対での」19ヌクレオチド構造(対を記号
で示す):
1.カスパーゼ8:ヒトカスパーゼ8のヌクレオチド配列を下に示す(配列番号50)。
GenBank受入番号NM_001228。RNAiに対する1つの標的配列を下線
で示した。他のものは、本明細書記載の方法によって特定できる(および本明細書に引用の文献、主に、Far et al.、前述、およびReynolds et al.、前述、によって)。
で示した。他のものは、本明細書記載の方法によって特定できる(および本明細書に引用の文献、主に、Far et al.、前述、およびReynolds et al.、前述、によって)。
2.カスパーゼ9:ヒトカスパーゼ9のヌクレオチド配列を下に示す(配列番号53)。GenBank受入番号NM_001229を参照。下記の配列は、「変異体α」のものであり、これはスプライスされた他の2つ目の変異体βより長く、この変異体βは、下記配列の下線部が欠けている(そして抗アポトーシス性である)。下線部Dセグメントに入ると予測されるRNAiのための標的配列は、既知の方法、例えば、本明細書記載の方法(およびFaretal.、前述、およびReynoldsetal.、前述、にある方法)により特定され、この結果、siRNA等のsiNAが設計される。
siNAは、mRNAのコードまたは非コードの任意の領域を標的にして設計可能である。siNAは、自己相補的なセンスおよびアンチセンス領域を含む二本鎖ポリヌクレオチド分子で、アンチセンス領域は、核酸分子またはその一部のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、センス領域は、標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列を有する。siNAは、2つの別のオリゴヌクレオチドから構築することができ、ここで1つの鎖はセンス鎖で、もう一方はアンチセンス鎖であり、アンチセンスとセンス鎖は自己相補的である。siNAは、単一のオリゴヌクレオチドから構築することができ、この場合、siNAの自己相補的なセンスとアンチセンス領域は核酸ベースまたは非核酸ベースのリンカーを使って結合される。siNAは、自己相補的なセンスとアンチセンス領域を有するヘアピン2次構造のポリヌクレオチドであってもよい。siNAは、2つ以上のループ構造および自己相補的なセンスとアンチセンス領域を含む基部を有する環状1本鎖ポリヌクレオチドであってもよく、この場合、環状ポリヌクレオチドは、インビボまたはインビトロで処理されRNAiを媒介できる活性siNA分子を生成することができる。また、siNAは、標的核酸分子またはその一部のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有する1本鎖ポリヌクレオチドを含んでもよい(またはsiNA分子内に標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列の存在を必要としないsiNA分子であってもよい)。この場合、1本鎖ポリヌクレオチドは、末端リン酸塩基、例えば、5’−リン酸塩(例えば、Martinez et al.(2002)Cell 110、563−574およびSchwarz et al.(2002)Molecular Cell 10、537−568、を参照)、または5’、3’−二リン酸塩、をさらに含むことができる。
特定の実施形態では、本発明のsiNA分子は、別々のセンスとアンチセンス配列または領域を含み、センスとアンチセンス領域は、当技術分野で既知のヌクレオチドまたは非ヌクレオチドリンカー分子により共有結合しているか、またはその代替として、イオン相互作用、水素結合、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用、および/またはスタッキング相互作用により非共有結合をしている。
本明細書に使われる、siNA分子は、リボヌクレオチドのみを含む分子に限定される必要はなく、さらにデオキシリボヌクレオチド(dTdTジヌクレオチドをそれぞれ含むsiRNAのように)、化学的に修飾したヌクレオチド、および非ヌクレオチドを包含してもよい。特定の実施形態では、本発明のsiNA分子は、2’−ヒドロキシ(2’−OH)を含むヌクレオチドを欠いている。特定の実施形態では、siNAは、RNAi媒介するための2’−ヒドロキシ基を有するヌクレオチドの存在を必要とせず、任意選択として、このように、本発明のsiNAは、いずれのリボヌクレオチド(例えば、2’−OH基を有するヌクレオチド)を含まなくてもよい。しかし、RNAiを行うためにsiNA分子にリボヌクレオチドの存在を必要としないこのようなsiNA分子は、2’−OH基を有する1つまたは複数のヌクレオチドを含む付着リンカー(単数、複数の)または他の付着または随伴基、成分、または鎖を有する。任意選択で、siNA分子は、ヌクレオチド位置の約5、10、20、30、40、または50%のリボヌクレオチドを含んでもよい。修飾された場合は、本発明のsiNAは「低分子干渉修飾オリゴヌクレオチド」または「siMON」とも呼ばれうる。他の化学的修飾、例えば、国際公開特許WO03/
070918およびWO03/074654(両特許は参照によって組み込まれる)に記載のように、本発明のいずれかのsiNA配列に適用可能である。
070918およびWO03/074654(両特許は参照によって組み込まれる)に記載のように、本発明のいずれかのsiNA配列に適用可能である。
一実施形態では、分子媒介RNAiは、2ヌクレオチド3’オーバーハング(本明細書で開示された配列中のdTdT)を有する。細胞中で、構築物から、例えば、所望の配列のヘアピン分子からまたは逆方向反復から、RNAi分子が発現した場合は、内在細胞機構がオーバーハングを作ることになる。
siRNAを作製する方法は通常の方法である。インビトロでの方法には、無細胞系でのポリヌクレオチド配列の処理(例えば、長いdsRNAのRNAse IIIまたはダイサーによる消化)、組換え型二本鎖DNAのインビトロ転写、およびBakまたはBax配列に相同なヌクレオチド配列の化学合成、が含まれる。例えば、Tuschl et
al.、Genes & Dev.13:3191−3197、1999、を参照。インビボでの方法には:
(1)基質がインビボでsiRNAに変換されるようにDNAベクターの細胞中への移入、例えば、Kawasaki et al.、Nucleic Acids Res 31:700−07、2003;;Miyagishi et al.、Nature Biotechno l20:497−500、2003;;Lee et al.、Nature Biotechno l20:500−05、2002;Brummelkamp et al.、Science 296:550−53、2002;McManus et al.、RNA 8:842−50、2002;Paddison et al.、Genes Dev 16:948−58、2002;Paddison et al.、Proc Natl Acad Sci USA 99:1443−48、2002;Paul et al.、Nature Biotechno l20:505−08、2002;Sui et al.、Proc Natl Acad Sci USA 99:5515−20、2002;Yu et al.、Proc Natl Acad Sci USA 99:6047−52、2002、を参照。
(2)RNAポリメラーゼIII(polIII)プロモータを使ってプラスミド系からの低分子ヘアピンRNAの発現、例えば、Kawasaki et al.、前述;Miyagishi et al.、前述;Lee et al.、前述;Brummelkamp et al.、前述;McManus et al.、前述)、Paddison et al.、前述(両方);Paul et al.、前述、Sui et al.、前述;およびYu et al.、前述、を参照;および/または
(3)タンデムプロモータからの低分子RNAの発現。例えば、Miyagishi et al.、前述;Lee et al.、前述)、
が含まれる。
al.、Genes & Dev.13:3191−3197、1999、を参照。インビボでの方法には:
(1)基質がインビボでsiRNAに変換されるようにDNAベクターの細胞中への移入、例えば、Kawasaki et al.、Nucleic Acids Res 31:700−07、2003;;Miyagishi et al.、Nature Biotechno l20:497−500、2003;;Lee et al.、Nature Biotechno l20:500−05、2002;Brummelkamp et al.、Science 296:550−53、2002;McManus et al.、RNA 8:842−50、2002;Paddison et al.、Genes Dev 16:948−58、2002;Paddison et al.、Proc Natl Acad Sci USA 99:1443−48、2002;Paul et al.、Nature Biotechno l20:505−08、2002;Sui et al.、Proc Natl Acad Sci USA 99:5515−20、2002;Yu et al.、Proc Natl Acad Sci USA 99:6047−52、2002、を参照。
(2)RNAポリメラーゼIII(polIII)プロモータを使ってプラスミド系からの低分子ヘアピンRNAの発現、例えば、Kawasaki et al.、前述;Miyagishi et al.、前述;Lee et al.、前述;Brummelkamp et al.、前述;McManus et al.、前述)、Paddison et al.、前述(両方);Paul et al.、前述、Sui et al.、前述;およびYu et al.、前述、を参照;および/または
(3)タンデムプロモータからの低分子RNAの発現。例えば、Miyagishi et al.、前述;Lee et al.、前述)、
が含まれる。
インビトロで合成する場合、典型的なマイクロモルレベルのRNA合成では、約1mgのsiRNAが得られ、24ウエル組織培養プレート形式を使った約1000例の移入実験を行うのに十分である。一般的には、培養細胞中でBakまたはBaxの発現を抑制するために、1つまたは複数のsiRNAを培地中の細胞に添加でき、通常、約1ng/ml〜約10mgsiRNA/mlである。
抑制型RNAに関する概要、またはより一般的な説明には、Lau et al.、Sci Amer Aug 2003:34−41;McManus et al.、Nature Rev Genetics 3、737−47、2002;およびDykxhoorn et al.、Nature Rev Mol Cell Bio 4:457−467、2003、を参照のこと。siRNAの設計と調製、それらの有効性の試験、およびRNA干渉法における使用(インビトロとインビボの両方で)に関するさらなるガイダンスのためには、例えば、Allshire、Science 297:1818−19、2002;Volpe et al.、Science 297:1833−37、2002;Jenuwein、Science 297:2215−18、2002;Hall et al.、Science 2972232−37、2002;Hutvagner et al.、Science 297:2056−60、2002;McManus et al.RNA 8:842−850、2002;Reinhart
et al.、Genes Dev.16:1616−26、2002;Reinhartet al.、Science 297:1831、2002;Fire et al.(1998)Nature 391:806−11、2002;Moss、Curr
Biol 11:R772−5、2002:Brummelkamp et al.、前述;Bass、Nature 411 428−9、2001;Elbashir et al.、Nature 411:494−8;米国特許第6、506、559号;米国特許公開公報第20030206887号;ならびに国際公開特許WO99/07409、WO99/32619、WO00/01846、WO00/44914、WO00/44895、WO01/29058、WO01/36646、WO01/75164、WO01/92513、WO01/29058、WO01/89304、WO01/90401、WO02/16620、およびWO02/29858を参照のこと(これら全ては、参照によって組み込まれる)。
et al.、Genes Dev.16:1616−26、2002;Reinhartet al.、Science 297:1831、2002;Fire et al.(1998)Nature 391:806−11、2002;Moss、Curr
Biol 11:R772−5、2002:Brummelkamp et al.、前述;Bass、Nature 411 428−9、2001;Elbashir et al.、Nature 411:494−8;米国特許第6、506、559号;米国特許公開公報第20030206887号;ならびに国際公開特許WO99/07409、WO99/32619、WO00/01846、WO00/44914、WO00/44895、WO01/29058、WO01/36646、WO01/75164、WO01/92513、WO01/29058、WO01/89304、WO01/90401、WO02/16620、およびWO02/29858を参照のこと(これら全ては、参照によって組み込まれる)。
リボザイムおよびsiNAは、修飾バージョンを含むアンチセンス核酸分子用に記述される任意の形を取ることができ、オリゴヌクレオチド(1本鎖または2本鎖の)として、または発現ベクターの形で細胞中に導入可能である。
一実施形態では、アンチセンス核酸、siNA(例えば、siRNA)またはリボザイムは、少なくとも約90%(例えば、少なくとも約93%、95%、97%、98%または99%)が標的セグメント(上述BakおよびBaxに対するもの等)またはその相補配列と同等の配列を含む1本鎖ポリヌクレオチドを含む。本明細書で使われるDNAおよびそれによりコードされるRNAは、DNA中のチミンベースをRNAのウラシルベースに置換したことを考慮すれば、同じ「配列」を含むと考えられる。
本明細書で検討された核酸ベースの抑制剤の活性変異体(例えば、断片を含む長さ変異体および配列変異体)もまた、本発明の範囲内にある。「活性」変異体は、元の抑制剤の活性(すなわち、発現を抑制する能力)を維持している変異体である。通常の手段でその活性を測定することは、変異体を試験することになる。
長さ変異体に関しては、アンチセンス核酸またはsiRNAは、標的遺伝子の抑制に有効な任意の長さであってよい。通常、アンチセンス核酸は、約6および約50ヌクレオチドの間(例えば、少なくとも約12、15、20、25、30、35、40、45または50nt)であるが、約100〜約200ヌクレオチド以上の長さであってもよい。抑制される遺伝子またはコード配列と大略同じ長さを有するアンチセンス核酸を使ってもよい。長さについて言う場合は、用語の塩基および塩基対(bp)は、同義として使用され、1本鎖(ss)および2本鎖(ds)核酸に対応すると理解されよう。有効なsiNAの長さは、通常約15bpおよび約29bpの間、ならびに約19および約29bpの間(例えば、約15、17、19、21、23、25、27または29bp)で、より短いおよびより長い配列も受容可能である。一般的に、siNAは、約30塩基より短くして、インターフェロン効果の誘発をを防ぐ。例えば、鎖の1つに、本明細書中の配列番号42、43、46、および47の内のいずれかの19ヌクレオチド配列を有するsiRNAの活性変異体は、siRNAの全体の長さが約19bpおよび約29bpの間(両端含む)にあるという条件下では、dsRNAのどちらかまたは両方の末端から塩基対を欠損してもよく、または追加の塩基対をdsRNAのどちらかまたは両方の末端に含んでもよい。本発明の一実施形態は、「基本的な構成要素になる」配列が配列番号42、43、46、および47またはこれらの配列の相補配列によって表されるsiRNAである。用語の「基本的な構成要素になる」は中間的移行句であり、この場合は、例えば、大きなインターフェロン応答を誘導するのに十分な長さの配列、を除外する。本発明のsiRNAは、約19および約29bpの間の長さを基本的な構成要素としてもよい。
配列変異体に関しては、一実施形態では、抑制的核酸は、アンチセンス分子でも、リボザイム(認識配列)でもsiNAでも、抑制対象として設計されている遺伝子の配列に相補的(100%同等配列)である鎖を含む。しかし、100%配列同一性は本発明の実施には必要ではない。従って、本発明は、天然の配列変異、例えば、ヒトの遺伝子変異、遺伝子多型、または進化的分岐により起こる可能性があるc−メチオニン、を許容するという利点を有する。あるいは、変異体配列は、人工的に生成してもよい。標的配列に比べ少量の挿入、欠失、または1つの点変異を有する核酸配列は有効な抑制剤でありうる。
配列同一性の度合は、当技術分野でよく知られた配列比較および整列アルゴリズム(Gribskov and Devereux、配列解析プライマー、Stockton Press、1991、およびその引用文献を参照)、例えば、BESTFITソフトウェアプログラムに実装されているSmith−Watermanアルゴリズムによりデフォルトのパラメーターを使ってヌクレオチド配列間のパーセント差異の計算をして最適化できる(例えば、ウィスコンシン大学Genetic Computing Group)。一実施形態では、少なくとも、約90%の配列同一性を使用可能であり(例えば、少なくとも、約92%、95%、98%または99%)、または更に100%の抑制性核酸と標的遺伝子の標的配列の間の配列同一性を使用可能である。
あるいは、本発明の抑制性核酸の活性変異体は、高ストリンジェンシーな条件(high stringency conditions)下、抑制することを目的としている配列にハイブリダイズするものである。例えば、siRNAの2本鎖領域は、高ストリンジェンシーな条件下(例えば、400mM NaCl、40mM PIPES pH6.4、1mM EDTA、50℃または70℃、12〜16時間ハイブリダイゼーションし、通常は次に洗浄する)、標的遺伝子転写物の一部とハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列として機能的に定義できる。
所定の抗原Xを提示しているDC−1細胞またはBM−DCは、本発明のsiRNAで処理していない場合は、十分な数のX特異的CD8+CTLにアポトーシス細胞死で応答する。対照的に、siRNAを形質移入したまたは本発明のsiRNA配列をコードしたウイルスベクターに感染した同じ細胞は、殺作用シグナル伝達にもかかわらずより長く生存する。
本発明のsiRNA組成物の送達と発現により、T細胞応答の進展の過程でインビボでDCの死亡が抑制され、その結果、抗原をコードしたDNAワクチンベクターによる免疫化により誘導される免疫応答の生成が促進および刺激される。これらの可能性は以下のことをを示すことにより実証された:
(1)HPV−16 E7をコードしたDNAワクチン剤ならびにBakおよびBaxを標的としたsiRNAの同時投与が、流入領域リンパ節中の抗原提示DCの寿命を延長し、結果として、抗原特異的CD8+T細胞応答を強化し、予防接種した患者のE7発現腫瘍に対する強力な抗腫瘍効果を誘発する。
(2)BakおよびBaxを標的のsiRNAを移入したDCは、T細胞による殺作用にインビボで抵抗する。BakおよびBaxタンパク質発現が下方制御されるようにBak/Bax siRNAを移入したE7負荷DCは、T細胞によるアポトーシス性死亡誘導にインビボで抵抗する。患者に投与された場合には、これらのDCは、より強力な抗原特異的免疫応答および有意な治療効果を生み出す(対照siRNAを移入したDCに比べて)。
このように、siRNA構築物は、核酸ワクチン接種および本出願記載の化学療法計画の一部として有用である。
(1)HPV−16 E7をコードしたDNAワクチン剤ならびにBakおよびBaxを標的としたsiRNAの同時投与が、流入領域リンパ節中の抗原提示DCの寿命を延長し、結果として、抗原特異的CD8+T細胞応答を強化し、予防接種した患者のE7発現腫瘍に対する強力な抗腫瘍効果を誘発する。
(2)BakおよびBaxを標的のsiRNAを移入したDCは、T細胞による殺作用にインビボで抵抗する。BakおよびBaxタンパク質発現が下方制御されるようにBak/Bax siRNAを移入したE7負荷DCは、T細胞によるアポトーシス性死亡誘導にインビボで抵抗する。患者に投与された場合には、これらのDCは、より強力な抗原特異的免疫応答および有意な治療効果を生み出す(対照siRNAを移入したDCに比べて)。
このように、siRNA構築物は、核酸ワクチン接種および本出願記載の化学療法計画の一部として有用である。
抗アポトーシスタンパク質を使った免疫応答の増強
DNAワクチンおよび化学療法剤の患者への投与は、国際公開特許WO2005/047501および米国特許出願公開第20070026076号に記載されているように、抗アポトーシスタンパク質をコードした核酸の投与を伴ってもよい(これらの特許は参照によって組み込まれる)。
DNAワクチンおよび化学療法剤の患者への投与は、国際公開特許WO2005/047501および米国特許出願公開第20070026076号に記載されているように、抗アポトーシスタンパク質をコードした核酸の投与を伴ってもよい(これらの特許は参照によって組み込まれる)。
本発明者等は、以前に、DNAワクチン組成物をコードした抗原とbcl−2、bc−lxL、XIAP、カスパーゼ−8およびカスパーゼ−9のドミナントネガティブ変異体(これらの産物はアポトーシスを抑制することがわかっている)等の抗アポトーシス遺伝子を含む追加のDNAベクターと組み合わせた免疫療法戦略を計画し開示したことがある(Wu、et al.米国特許出願公開第20070026076号。これらは参照により本明細書に組み込まれる)。また、グランザイムBを抑制するセリンプロテアーゼ抑制剤6(SPI−6)も、組成物および方法に採用して、DCのアポトーシス細胞死を遅らせることができる。本発明者等は、追加の生物学的アポトーシス抑制メカニズムの利用により、抗原コード配列ならびにこのようなIPPをコードした結合配列を含むDNAワクチン剤に対するT細胞応答を著しく高められることを示した。
遺伝子銃による皮内ワクチン接種は、DNAワクチンを皮膚のDCに効率よく送達し、抗原特異的T細胞の活性化と初回抗原刺激がインビボで得られる。しかし、DCの寿命は限られており、その抗原特異的T細胞を刺激する長期にわたる能力を妨害する。本発明に従って、治療とDNA形質導入DCの生存を延長する方法を組み合わせた戦略により、抗原特異的T細胞の初回抗原刺激を高め、その結果、DNAワクチン効力を強化する。アポトーシス(BCL−xL、BCL−2、XIAP、ドミナントネガティブカスパーゼ−9、またはドミナントネガティブカスパーゼ−8)の抑制剤をコードしたDNAと抗原(HPV−16E7タンパク質として例証された)をコードしたDNAを同時送達することにより、形質導入されたDCの生存が延長される。更に重要なことに、ワクチン接種した患者は、抗原特異的CD8+T細胞免疫応答の有意な増強を示し、抗原発現腫瘍に対する強力は抗腫瘍効果が得られる。これらの抗アポトーシス因子の中で、BCL−XLにおいて、抗原特異的免疫応答および抗腫瘍効果の両方で最大の増強が認められた。このように、DNAワクチンと1つまたは複数の抗アポトーシスタンパク質をコードしたDNA構築物を含む組み合わせ治療の同時投与によりDNAワクチン効力を高める手法が得られる。
セリンプロテアーゼ抑制剤6(SPI−6)、は、また、セルピンb9とも呼ばれ、グランザイムBを抑制し、その結果、DCのアポトーシス細胞死を遅らせることができる。SPI−6をコードしたDNAと種々のIPPと結合したE7をコードしたDNA構築物の皮内同時投与は、SPI−6なしのワクチン接種に比較して、E7特異的CD8+T細胞およびCD4+Th1細胞応答を著しく増やし、抗腫瘍効果を高めた。このようにして、特定の実施形態では、組み合わされた方法が使用され、免疫を増強するためのSPI−6の送達によりMHCクラスIおよびII抗原プロセシングが強化される。
類似の手法がDNAベースのアルファウイルスRNAレプリコンベクターに採用され、自殺DNAベクターとも呼ばれている。抗原、例えば、HPVE7、DNAベースセムリキ森林ウイルスベクター、pSCA1、に対する免疫応答を高めるために、抗原DNAを、BCL−2ファミリーのメンバーであるBCL−xL等の抗アポトーシスポリペプチドをコードしたDNAと融合する。抗原ポリペプチドとBCL−xLの融合タンパク質をコードしたpSCA1は、形質移入したDCの細胞死を遅らせ、著しく高い抗原特異的CD8+T細胞媒介免疫を生成する。BCL−xLの抗アポートシス機能は、抗原特異的CD8+T細胞応答の増強にとって重要である。このように、一実施形態では、そうでない場合は望ましい自殺DNAワクチンにより誘導される細胞死を遅らせることによりその効力が高められる。
このように、本発明は、また、化学療法剤と免疫原として有用な核酸組成物の投与を含む組み合わせ治療に関し、下記の(a)、(b)の組み合わせを含む:(a)抗原ポリペプチドまたはペプチドをコードした第一の配列を含む第一の核酸ベクターで、第一のベクターが任意選択で第一の配列に結合した第二の配列を含み、第二の配列が免疫原性増強ポリペプチド(IPP)をコードする;b)抗アポトーシスポリペプチドをコードした第二の核酸ベクターで、ここで、第二のベクターが第一のベクターと一緒に患者に投与される場合は、抗原ポリペプチドまたはペプチドに対するT細胞媒介免疫応答誘導が第一のベクター単独投与による免疫応答誘導よりも大きさが増しおよび/または持続期間が長くなる。上記第一のベクターは、第一および/または第二の配列に機能的に連結されたプロモーターを含んでもよい。
上記組成物で、抗アポトーシスポリペプチドを、(a)BCL−xL、(b)BCL2、(c)XIAP、(d)FLICEc−s、(e)ドミナントネガティブカスパーゼ−8、(f)ドミナントネガティブカスパーゼ−9、(g)SPI−6、および(h)(a)〜(g)のいずれかの機能的ホモログまたは誘導体、からなる群から選択してもよい。抗アポトーシスDNAは、抗原をコードしたDNAに物理的に結合していてもよい。この例は、主に自殺DNAワクチンベクターの形で米国特許出願公開第20070026076号で提供されている(この特許は参照によって組み込まれる)。あるいは、抗アポトーシスDNAを別々に、抗原をコードしたDNA分子と組み合わせて、投与してもよい。これらの2つの型のベクターの同時投与に関するさらなる例は、米国特許出願第10/546、810号(出願公開番号US2007−0026076)で提供されている。
抗アポトーシス性および他のタンパク質の代表的ヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、配列リストに掲載している。これらのタンパク質と構築物の生物学的に活性なホモログも使用可能である。生物学的に活性なホモログは、本明細書記載のように、他のタンパク質、例えば、IPPとの関連で理解されるはずである。
本発明のpcDNA3ベクター中に存在するBCL−xLのコード配列は、配列番号55である;BCL−xLのアミノ酸配列は配列番号56である;配列pcDNA3−BCL−xLは配列番号57である(BCL−xLコード配列はヌクレオチド983〜1732に対応);E7とBCL−xLを結合させるpcDNA3ベクター(pcDNA3−E7/BCL−xLと命名)は配列番号58である(E7とBCL−xL配列はヌクレオチド960〜2009に対応);E7−BCL−xLキメラまたは融合ポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号59である;変異体BCL−xL(「mtBCL−xL」)DNA配列は配列番号60である;mtBCL−xLのアミノ酸配列は配列番号61である;E7−mtBCL−xLキメラまたは融合ポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号62である;pcDNA−mtBCL−xL[配列番号63]ベクターでは、この変異体配列がBCL−xLが挿入されている配列番号57中の同じ位置に挿入され、pcDNA−E7/mtBCL−XL[配列番号64]では、BCL−xL配列の配列番号58中の位置と同じ位置にこの配列が挿入される;自殺DNAベクターpSCA1−BCL−xLの配列は配列番号65である(BCL−xL配列はヌクレオチド7483〜8232に対応);「組み合わされた」ベクター、pSCA1−E7/BCL−xLの配列は配列番号66である(E7およびBCL−xLの配列はヌクレオチド7461〜8510に対応);pSCA1−mtBCL−xL[配列番号67]の配列は、mtBCL−xL配列がpSCA1−mtBCL−xLベクターの野性型配列と同じ位置に挿入されることを除けば、野性型BCL−xLと同じである。;配列pSCA1−E7/mtBCL−xL[配列番号68]は、野性型配列と同じ位置にmtBCL−xL配列が挿入されることを除いて、上記の野性型pSCA1−E7/BCL−xLと同じである。;ベクターpSG5−BCL−xLの配列は配列番号69である(BCL−xLコード配列はヌクレオチド1061〜1810に対応する);配列決定されたベクターpSG5−mtBCL−xLは変異体BCL−xL配列を含む配列番号70で、すぐ上に記載の野性型ベクターと同じ位置に挿入されたmtBCL−xLを持っている;XIAP抗アポトーシスタンパクをコードしたDNAのヌクレオチド配列は配列番号71である;XIAP抗アポトーシスタンパク質コード配列を含むベクターのアミノ酸は配列番号72である;XIAP抗アポトーシスタンパク質コード配列を含むベクター(PSG5−XIAPと命名)のヌクレオチド配列は配列番号73に示す(XIAPと共に、ヌクレオチド1055〜2553に対応);抗アポトーシスタンパク質FLICEc−sをコードしたDNAの配列は配列番号74である;抗アポトーシスタンパク質FLICEc−sのアミノ酸配列は配列番号75である;抗アポトーシスタンパク質FLICEc−sをコードしたPSG5ベクター(PSG5−FLICEc−sと命名)は配列番号76の配列を有する(FLICEc−s配列と共に、ヌクレオチド1049〜2443に対応);抗アポトーシスタンパク質Bcl2をコードしたDNA配列は配列番号77である;Bcl2のアミノ酸配列は配列番号78である;Bcl2をコードしたPSG5ベクター(PSG5−BCL2と命名)は配列番号79の配列を有する(Bcl2配列と共に、ヌクレオチド1061〜1678に対応);pSG5−dn−カスパーゼ−8ベクターは配列番号80である(ドミナントネガティブカスパーゼ−8のコードはヌクレオチド1055〜2449)に対応;dn−カスパーゼ−8のアミノ酸配列は配列番号81である;pSG5−dn−カスパーゼ−9ベクターは配列番号82である(ドミナントネガティブカスパーゼ−9のコードはヌクレオチド1055〜2305に対応);dn−カスパーゼ−9のアミノ酸配列は配列番号83であある;マウスセリンプロテアーゼ抑制剤6(SPI−6、GENEBANKにNM009256として登録)のヌクレオチド配列は配列番号84である;SPI−6タンパク質のアミノ酸配列は配列番号85である;変異体SPI−6(mtSPI6)の核酸配列は配列番号86である;変異体SPI−6タンパク質(mtSPI−6)のアミノ酸配列は配列番号87である;pcDNA3−Spi6ベクターの配列は配列番号88である(SPI−6配列はヌクレオチド960〜2081に対応);および変異体ベクターpcDNA3−mtSpi6ベクター[配列番号89]の配列は、野性型SPI−6の位置と同じ位置にmtSPI−6配列が挿入されることを除けば、上述と同じである。
これらの核酸やタンパク質の生物学的に活性なホモログを使用可能である。生物学的に活性なホモログは本明細書にある他のタンパク質、例えば、IPP、との関連で記載されているように理解されるべきである。例えば、ベクターは、少なくとも、約90%、95%、98%または99%本明細書に記載の配列のタンパク質に同等である抗アポトーシスタンパク質をコードしてもよい。
腫瘍退縮ウイルス
腫瘍退縮ウイルスは、抗原特異的免疫応答が期待される特定の抗原をコードおよび発現できる種類のクラスのベクターを含むのみならず、癌細胞の殺作用の媒介もする。用語の「腫瘍退縮性(oncolytic)」および「腫瘍退縮ウイルス(oncolytic viruse)」は、癌殺作用を指し、すなわち「onco」が癌を意味し、「lytic」が「殺作用」を意味する。本明細書で使用する場合、腫瘍退縮性(oncolytic)は「腫瘍退縮ウイルス(oncolytic viruse)」および「OV」を指し、このウイルスは、癌細胞を殺す可能性のあるウイルスを表す。原理的には、腫瘍、新生物、細胞腫、肉腫、等を含む腫瘍性細胞中で選択的複製が可能などのウイルスでも本発明で使用可能である。腫瘍細胞中での選択的複製は、少なくとも3種の異なる非腫瘍形成性組織に比べて、異なる腫瘍から樹立された少なくとも3種の細胞株中で、少なくとも1x104、1x105、1x106、またはそれ以上効率的にウイルスが複製を行えることを意味する。
腫瘍退縮ウイルスは、抗原特異的免疫応答が期待される特定の抗原をコードおよび発現できる種類のクラスのベクターを含むのみならず、癌細胞の殺作用の媒介もする。用語の「腫瘍退縮性(oncolytic)」および「腫瘍退縮ウイルス(oncolytic viruse)」は、癌殺作用を指し、すなわち「onco」が癌を意味し、「lytic」が「殺作用」を意味する。本明細書で使用する場合、腫瘍退縮性(oncolytic)は「腫瘍退縮ウイルス(oncolytic viruse)」および「OV」を指し、このウイルスは、癌細胞を殺す可能性のあるウイルスを表す。原理的には、腫瘍、新生物、細胞腫、肉腫、等を含む腫瘍性細胞中で選択的複製が可能などのウイルスでも本発明で使用可能である。腫瘍細胞中での選択的複製は、少なくとも3種の異なる非腫瘍形成性組織に比べて、異なる腫瘍から樹立された少なくとも3種の細胞株中で、少なくとも1x104、1x105、1x106、またはそれ以上効率的にウイルスが複製を行えることを意味する。
腫瘍退縮ウイルスは、追加または代替として、特異的組織または腫瘍組織を標的にしてもよい。このことは、例えば、ウイルス遺伝子の転写標的化によって(例えば、国際公開特許WO96/39841:本件は参照によって組み込まれる)または細胞性結合および感染過程中の取り込み機構に関与するウィルス蛋白質の改変によって(例えば、国際公開特許WO2004033639またはWO2003068809:これらの特許は参照によって組み込まれる)、達成することができる。
本発明では、広範囲のウイルスが腫瘍退縮ウイルスとして意図されており、例えば、これに限定されないが、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、インフルエンザウイルス、レオウイルス、水疱性口内炎ウイルス(VSV)、ニューキャッスルウイルス、ワクチニアウイルス、ポリオウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、シンドビスウイルス(SrN)およびセンダイウイルス(SV)が挙げられる。下記の表1〜6には、以前に発表された腫瘍退縮ウイルスの例の概要を示す(www.oncolyticVirus.orgから採取した)。
本発明に使われる腫瘍退縮ウイルスの産生と精製の方法は、下記に引用した文献に記載されている。
一般的には、ウイルスを精製して基本的に望ましくない混入物、例えば、欠陥のある干渉性ウイルス性粒子または内毒素および他の発熱物質、を含まないようにして、ウイルスを受ける細胞、動物、または個体中でなんらかの好ましくない反応の原因にならないようにすることもできる。ウイルス精製手段には、浮力のある密度傾斜、例えば、セシウム塩化物勾配遠心分離、の使用も含まれる。
一実施形態では、腫瘍退縮ウイルス、例えば、ワクチニアウイルス、は外来性DNA、すなわち、前記ウイルス由来でないDNAを更に含む。このDNAは、それに対し抗原特異的免疫応答が期待される抗原をコードしていてもよい。他の実施形態では、外来性DNAは、異種のプロモーター領域、構造遺伝子、またはこのような遺伝子に機能的に連結されたプロモーターであってもよい。代表的プロモータには、これには限定されないが、CMVプロモーター、LacZプロモーター、Egrプロモーターまたは既知のHSVプロモータが挙げられる。一実施形態では、構造遺伝子は、サイトカイン/ケモカイン、自殺遺伝子、融合タンパク質またはマーカー遺伝子の群から選ばれる。使用可能なサイトカイン/ケモカインには、これには限定されないが、IL−4、IL−12およびGM−CSFがある。使用可能な自殺遺伝子には、これには限定されないが、p450およびシトシンデアミナーゼが含まれる。融合タンパク質は、例えば、テナガザル白血病ウイルスエンベロープである。一般的なマーカー遺伝子は、ルシフェラーゼ、GFPまたはそれらの変異体、およびLacZである。
さらなる実施形態では、腫瘍退縮ウイルスは、さらに改変され、変質宿主細胞特異性を有する。このような変異体は、例えば、国際公開特許WO2004/033639(参照によって組み込まれる)、米国特許第2005271620号(参照により組み込まれる)、Kamiyama et al.(2006)およびMenotti et al.(2006)、による報告からHSV−1として有名である。ここで、HSV−1の糖タンパク質、例えば、gD、gCは、リガンド、特に、選んだ標的細胞に特異的に結合する1本鎖抗体、と融合する。さらに、このようなウイルスを、天然の受容体およびヘパリン硫酸プロテオグリカンから標的解除するために、欠失および/または点変異がgB、gCおよび/またはgD中に形成される(国際公開特許WO2004/033639(参照によって組み込まれる)、Zhou and Roizman、2006)。
化学療法剤
さらに、薬剤を本明細書の方法と組成物に従って哺乳動物に投与してもよい。通常、免疫系に大きな影響を与えずに細胞の増殖を低下させる、または、少なくとも患者に投与されたDNAワクチンのプラス効果を排除する程度には免疫系を抑制しない任意の薬剤が使われる。一実施形態では、薬剤は化学療法剤である。
ワクチン、例えば、DNAワクチンの効果を刺激するという前提であれば、広範な種々の化学療法剤を使うことができる。ある特定の実施形態では、化学療法剤は、(a)接触した場合、細胞、特に、癌細胞のアポトーシスを誘導する;(b)腫瘍の重荷を減らす;および/または(c)CD8+T細胞媒介抗腫瘍免疫を強化する、薬剤であってもよい。特定の実施形態では、薬剤は、また、免疫系を阻害しない、または少なくともある濃度では阻害しないものでなければならない。
さらに、薬剤を本明細書の方法と組成物に従って哺乳動物に投与してもよい。通常、免疫系に大きな影響を与えずに細胞の増殖を低下させる、または、少なくとも患者に投与されたDNAワクチンのプラス効果を排除する程度には免疫系を抑制しない任意の薬剤が使われる。一実施形態では、薬剤は化学療法剤である。
ワクチン、例えば、DNAワクチンの効果を刺激するという前提であれば、広範な種々の化学療法剤を使うことができる。ある特定の実施形態では、化学療法剤は、(a)接触した場合、細胞、特に、癌細胞のアポトーシスを誘導する;(b)腫瘍の重荷を減らす;および/または(c)CD8+T細胞媒介抗腫瘍免疫を強化する、薬剤であってもよい。特定の実施形態では、薬剤は、また、免疫系を阻害しない、または少なくともある濃度では阻害しないものでなければならない。
一実施形態では、化学療法剤は、エピガロカテキン−3−ガリウム酸塩(EGCG)または化学的誘導体または薬学的に許容可能なその塩である。エピガロカテキンガリウム酸塩(EGCG)は、緑茶で見つかった主要ポリフェノール成分である。EGCGは、種々のヒトと動物モデルで立証された、乳房、前立腺、胃、食道、結腸、膵臓、皮膚、肺、およびその他の部位の癌に対する抗腫瘍効果を有する。EGCGは、異なる経路で作用し、癌細胞増殖、生存、血管形成および転移を調節することが示された。例えば、ある研究ではEGCGが細胞周期の停止を起こし、アポトーシスを誘導して癌に対して防御することが示唆されている。また、テロメラーゼ抑制がEGCGの抗腫瘍効果の根底にある主要機序の1つである可能性があるとの報告もある。通常使われるレチノイドおよびドキソルビシンを含む抗腫瘍薬と比べて、EGCGは、相対的に低い毒性であり、その経口バイオアベイラビリティの故に、投与に都合がよい。従って、EGCGは臨床試験で使われており、潜在的な理想的抗腫瘍薬であると思われる。
EGCGの代表的類似体または誘導体には、(−)−EGCG、(+)−EGCG、(−)−EGCG−アミド、(−)−GCG、(+)−GCG、(+)−EGCG−アミド、(−)−ECG、(−)−CG、ゲニステイン、GTP−1、GTP−2、GTP−3、GTP−4、GTP−5、Bn−(+)−エピガロカテキンガリウム酸塩(米国公開特許US2004/0186167(参照によって組み込まれる))、およびジデオキシエピガロカテキンガリウム酸塩(Furuta、et al.、Bioorg.Med.Chem.Letters、2007、11:3095−3098)が挙げられる。さらなる例としては、米国公開特許US2004/0186167(その全体が参照によって組み込まれる);Waleh、et al.、Anticancer Res.、2005、25:397−402;Wai、et al.、Bioorg.Med.Chem.、2004、12:5587−5593;Smith、et al.、Proteins:Struc.Func.& Bioinform.、2003、54:58−70;米国特許US7、109、236(その全体が参照によって組み込まれる);Landis−Piwowar、et al.、Int.J.Mol.Med.、2005、15:735−742;Landis−Piwowar、et al.、J.Cell.Phys.、2007、213:252−260;Daniel、et al.、Int.J.Mol.Med.、2006、18:625−632;Tanaka、et al.、Ang.Chemie Int.、2007、46:5934−5937、を参照のこと。
別の使用可能な化学療法剤は、(a)5、6−ジメチルキサンテノン−4−酢酸(DMXAA)、またはその化学的誘導体もしくは類似体または薬学的に許容可能なその塩である。代表的類似体または誘導体には、キサンテノン−4−酢酸、フラボン−8−酢酸、
キサンテン−9−オン−4−酢酸、メチル(2、2−ジメチル−6−オキソ−1、2−ジヒドロ−6H−3、11−ジオキサシクロペンタ[α]アントラセン−10−イル)アセタート、メチル(2−メチル−6−オキソ−1、2−ジヒドロ−6H−3、11−ジオキサシクロペンタ[α]アントラセン−10−イル)アセタート、メチル(3、3−ジメチル−7−オキソ−3H、7H−4、12−ジオキサベンゾ[α]アントラセン−10−イル)アセタート、メチル−6−アルキルオキシキサンテン−9−オン−4−アセタート(Gobbi、et al.、2002、J.Med.Chem.、45:4931)が挙げられる。さらなる例に関しては、国際公開特許WO2007/023302A1、WO2007/023307A1、米国公開特許US2006/9505、国際公開特許WO2004/39363A1、WO2003/80044A1、オーストラリア公開特許AU2003/217035A1、およびAU2003/282215A1を参照のこと(これらはそれぞれ参照によってその全体が組み込まれる)。
キサンテン−9−オン−4−酢酸、メチル(2、2−ジメチル−6−オキソ−1、2−ジヒドロ−6H−3、11−ジオキサシクロペンタ[α]アントラセン−10−イル)アセタート、メチル(2−メチル−6−オキソ−1、2−ジヒドロ−6H−3、11−ジオキサシクロペンタ[α]アントラセン−10−イル)アセタート、メチル(3、3−ジメチル−7−オキソ−3H、7H−4、12−ジオキサベンゾ[α]アントラセン−10−イル)アセタート、メチル−6−アルキルオキシキサンテン−9−オン−4−アセタート(Gobbi、et al.、2002、J.Med.Chem.、45:4931)が挙げられる。さらなる例に関しては、国際公開特許WO2007/023302A1、WO2007/023307A1、米国公開特許US2006/9505、国際公開特許WO2004/39363A1、WO2003/80044A1、オーストラリア公開特許AU2003/217035A1、およびAU2003/282215A1を参照のこと(これらはそれぞれ参照によってその全体が組み込まれる)。
また、化学療法剤は、シスプラチン、またはその化学的誘導体もしくは類似体または薬学的に許容可能なその塩であってもよい。代表的類似体または誘導体には、ジクロロ[4、4′−ビス(4、4、4−トリフルオロブチル)−2、2′−ビピリジン]白金(Kyleretal.、Bioorganic & Medicinal Chemistry、2006、14:8692−8700)、シス−[Rh2(−O2CCH3)2(CH3CN)6]2+(Lutterman et al.、J.Am.Chem.Soc.、2006、128:738−739)、(+)−シス−(1、1−シクロブタンジカルボキシラト)((2R)−2−メチル−1、4−ブタンジアミン−N、N’)白金(O’Brien et al.、Cancer Res.、1992、52:4130−4134)、シス−ビスネオデカノアト−トランス−R、R−1、2−ジアミノシクロヘキサン白金(II)(Lu et al.、J.of Clin.Oncol.、2005、23:3495−3501)、カルボプラチン(Woloschuk、Cancer Intell.Clin.Pharm.、1988、22:843−849)、セブリプラチン(Kanazawa et al.、Head & Neck、2006、14:38−43)、サトラプラチン(Amorino et al.、Cancer Chemother.and Pharmacol.、2000、46:423−426)、アザン(ジクロロ白金)(CID:11961987)、アザニド(CID:6712951)、プラチノール(CID:5702198)、lopac−P−4394(CID:5460033)、MOLI001226(CID:450696)、トリクロロ白金(CID:420479)、プラチナート(1−)、アンミントリクロロ−、アンモニウム(CID:160995)、トリアンミン白金(CID:119232)、ビオシス白金(CID:84691)、プラチブラスチン(CID:2767)および薬学的に許容可能なその塩がある。さらなる例は、米国特許US5922689、US4996337、US4937358、US4808730、US6130245、US7232919、およびUS7038071、を参照のこと(これらは全て参照によってその全体が組み込まれる)。
別の使用可能な化学療法剤はアピゲニン、またはその化学的誘導体もしくは類似体または薬学的に許容可能なその塩である。代表的類似体または誘導体には、アカセチン、クリシン、カンフェロール、ルテオリン、ミリセチン、ナリンゲニン、ケルセチン(Wang
et al.、Nutrition and Cancer、2004、48:106−114)、プエラリン(米国公開特許US2006/0276458(参照によってその全体が組み込まれる)および薬学的に許容可能なその塩が挙げられる。さらなる例については、米国公開特許US2006/189680A1を参照のこと(参照によってその全体が組み込まれる)。
et al.、Nutrition and Cancer、2004、48:106−114)、プエラリン(米国公開特許US2006/0276458(参照によってその全体が組み込まれる)および薬学的に許容可能なその塩が挙げられる。さらなる例については、米国公開特許US2006/189680A1を参照のこと(参照によってその全体が組み込まれる)。
別の使用可能な化学療法剤は、ドキソルビシン、またはその化学的誘導体もしくは類似体または薬学的に許容可能なその塩である。代表的類似体または誘導体には、アントラサイクリン、3’−デアミノ−3’−(3−シアノ−4−モルホリニル)ドキソルビシン、WP744(Faderl、et al.、Cancer Res.、2001、21:3777−3784)、アンナマイシン(Zou、et al.、Cancer Chemother.Pharmacol.、1993、32:190−196)、5−イミノ−ダウノルビシン、2−ピロリノドキソルビシン、DA−125(Lim、et al.、Cancer Chemother.Pharmacol.、1997、40:23−30)、4−デメトキシ−4′−O−メチルドキソルビシン、PNU152243および薬学的に許容可能なその塩(Yuan、et al.、Anti−Cancer Drugs、2004、15:641−646)が挙げられる。さらなる例は、欧州特許EP1242438B1、米国特許US6630579、オーストラリア公開特許AU2001/29066B2、米国特許US4826964、US4672057、US4314054、オーストラリア公開特許AU2002/358298A1、および米国特許US4301277(これらは参照によってその全体が組み込まれる)を参照のこと。
他の使用可能な化学療法剤は抗細胞死受容体5抗体および結合タンパク質、ならびにその誘導体であり、抗体断片、1本鎖抗体(scFv)、アビマー、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体およびペプチド結合細胞死受容体5が含まれる。例えば、米国公開特許US2007/31414およびUS2006/269554(参照によってその全体が組み込まれる)を参照。
別の使用可能な化学療法剤は、ボルテゾミブ、またはその化学的誘導体もしくは類似体または薬学的に許容可能なその塩である。代表的類似体または誘導体には、MLN−273および薬学的に許容可能なその塩(Witola、et al.、Eukaryotic Cell、2007、doi:10.1128/EC.00229−07)が含まれる。さらなる可能性については、Groll、et al.、Structure、14:451を参照のこと。
別の使用可能な化学療法剤は、5−アザ−2’−デオキシシチジン、またはその化学的誘導体もしくは類似体または薬学的に許容可能なその塩である。代表的類似体または誘導体には、他のデオキシシチジン誘導体および他のヌクレオチド誘導体、例えば、デオキシアデニン誘導体、デオキシグアニン誘導体、デオキシチミジン誘導体および薬学的に許容可能なその塩が含まれる。
別の使用可能な化学療法剤は、ゲニステイン、またはその化学的誘導体もしくは類似体または薬学的に許容可能なその塩である。代表的類似体または誘導体には、7−O−改変ゲニステイン誘導体(Zhang、et al.、Chem.& Biodiv.、2007、4:248−255)、4’、5、7−トリ[3−(2−ヒドロキシエチルチオ)プロポキシ]イソフラボン、ゲニステイングリコシド(Polkowski、Cancer Letters、2004、203:59−69)、他のゲニステイン誘導体(Li、etal.、Chem & Biodiv.、2006、4:463−472;Sarkar、et al.、Mini.Rev.Med.Chem.、2006、6:401−407)または薬学的に許容可能なその塩があげられる。さらなる例は、米国特許US6541613、US6958156、および国際公開特許WO/2002/081491(参照によってその全体が組み込まれる)を参照のこと。
別の使用可能な化学療法剤は、セレコキシブ、またはその化学的誘導体もしくは類似体または薬学的に許容可能なその塩である。代表的類似体または誘導体には、N−(2−アミノエチル)−4−[5−(4−トリル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンスルホンアミド、4−[5−(4−アミノフェニル)−3−(トリフルオロメチル)−1H−ピラゾール−1−イル]ベンゼンスルホンアミド、OSU03012(Johnson、et al.、Blood、2005、105:2504−2509)、OSU03013(Tong、et.al、Lung Cancer、2006、52:117−124)、ジメチルセレコキシブ(Backhus、etal.、J.Thorac.and Cardiovasc.Surg.、2005、130:1406−1412)、および他の誘導体または薬学的に許容可能なその塩(Ding、et al.、Int.J.Cancer、2005、113:803−810;Zhu、et al.、Cancer Res.、2004、64:4309−4318;Song、et al.、J.Natl.Cancer Inst.、2002、94:585−591)が含まれる。さらなる例は、米国特許US7026346(参照によってその全体が組み込まれる)を参照のこと。
当業者ならプロテアソーム抑制剤(ボルテゾミブに追加して)およびDNAメチル化抑制剤を含む他の化学療法剤が本発明で開示した方法とキットと共に使用可能であることを容易にわかるであろう。他の使用可能な薬剤には、パクリタキセル;セレン化合物;SN38、エトポシド、5−フルオロウラシル;VP−16、cox−2抑制剤、Vioxx、シクロオキシゲナーゼ−2抑制剤、クルクミン、MPC−6827、タモキシフェンまたはフルタミド、エトポシド、PG490、2−メトキシエストラジオール、AEE−788、アグリコンプロトパナキサジオール、アプリジン、ARQ−501、亜ヒ酸、BMS−387032、カネルチニブ二塩酸塩、カンホスフアミド塩酸塩、コンブレタスタチンA−4プロドラッグ、イドロノキシル、インジスラム、INGN−201、マパツムマブ、モテクサフィンガドリニウム、オブリメルセンナトリウム、OGX−011、パツピロン、PXD−101、ルビテカン、ティピファニブ、トラベクテジンPXD−101、メトトレザト、ゼルンボン、カンプトテシン、MG−98、VX−680、Ceflatonin、オブリメルセンナトリウム、モテクサフィンガドリニウム、1D09C3、PCK−3145、ME−2およびアポトーシス−誘導−リガンド(TRAIL/Apo−2リガンド)が挙げられる。他の薬剤が、「癌治療におけるアポトーシス新薬競合動向」というタイトルで2006年12月にBioseekerから出版された報告で提供されており、例えば、http://bizwiz.bioseeker.com/bw/Archives/Files/TOC_BSG0612193.pdf、で入手可能である。
また、一般的に、アポトーシス標的に影響を与える任意の薬剤が使用可能である。アポトーシス標的には、腫瘍壊死因子(TNF)関連アポトーシス誘導リガンド(TRAIL)受容体、抗アポトーシスタンパク質のBCL2ファミリー(例えば、Bcl−2)、アポトーシス(IAP)タンパク質の抑制剤、MDM2、p53、TRAILおよびカスパーゼが含まれる。代表的標的には、B−細胞 CLL/リンパ腫2、カスパーゼ3、CD4分子、細胞質卵巣癌抗原1、真核生物翻訳延長因子2、ファルネシルトランスフェラーゼ、CAAXbox、アルファ;IgEのFc断片;ヒストン脱アセチル化酵素1;ヒストン脱アセチル化酵素2;インターロイキン13受容体、アルファ1;ホスホジエステラーゼ2A、cGMP刺激ホスホジエステラーゼ5A、cGMP−特異的;タンパク質キナーゼC、ベータ1ステロイド5α還元酵素、アルファポリペプチド1;8.1.15トポイソメラーゼ(DNA)I;トポイソメラーゼ(DNA)IIアルファ;チューブリン、ベータポリペプチド;およびp53タンパク質が挙げられる。
特定の実施形態では、本明細書記載の化合物、例えば、EGCG、は天然に存在し、例えば、自然界より単離できる。従って、特定の実施形態では、化合物は単離または精製された形で、すなわち、天然に存在する形以外の形で使われる。例えば、単離された化合物は、約50%、30%、10%、1%、0.1%または0.01%未満の自然界の化合物に関連した分子を含んでもよい。化合物の精製した調製物は、分子数または重量で、少なくとも、約50%、70%、80%、90%、95%、97%、98%または99%の化合物を含むことができる。組成物は、基本的に1つまたは複数の本明細書記載の化合物を含むことができる。天然に存在する一部の化合物は、実験室で合成してもよく、この場合、「合成」と称する。これら以外の本明細書記載の化合物は非天然である。
特定の実施形態で、化学療法剤は、天然ソースから、例えば、緑茶から調製される。
1、2、3、4、5またはそれ以上の化学療法剤または薬学的に許容可能なその塩を含む医薬品組成物も本明細書で提供されている。医薬品組成物は薬学的に許容可能な担体を含んでもよい。組成物、例えば、医薬品組成物は、また、ワクチン、例えば、DNAワクチン、を含んでもよく、さらに任意選択として1、2、3、4、5またはそれ以上のベクター、例えば、他のDNAワクチン剤または他の構築物、例えば、本明細書記載のものを含んでもよい。
化合物は薬学的に許容可能な塩で提供されてもよい。用語の「薬学的に許容可能な塩」は、当該分野で承認されているものであって、これに限定されないが、相対的に無毒の、治療薬、賦形剤、他の物質、等の組成物の無機、有機酸付加塩を含む。薬学的に許容可能な塩の例には、塩酸や硫酸のような鉱酸由来の塩、およびエタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、p−トルエンスルホン酸、等のような有機酸由来の塩が挙げられる。適切な塩形成用無機塩基の例には、アンモニア、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アルミニウム、亜鉛、等の水酸化物、炭酸塩、および重炭酸塩がある。また、塩は適切な有機塩基との間でも形成でき、この有機塩基には、無毒でこのような塩を形成するのに十分な塩基強度を有する塩基が含まれる。説明の目的で記載するが、このような有機塩基の種類には、モノ−、ジ−、およびトリアルキルアミン、例えば、メチルアミン、ジメチルアミン、およびトリエチルアミン;モノ−、ジ−またはトリヒドロキシアルキルアミン、例えば、モノ−、ジ−、およびトリエタノールアミン;アミノ酸、例えば、アルギニンおよびリシン;グアニジン;N−メチルグルコサミン;N−メチルグルカミン;L−グルタミン;N−メチルピペラジン;モルホリン;エチレンジアミン;N−ベンジルフェネチルアミン;(トリヒドロキシメチル)アミノエタン;等、が挙げられる。例えば、、J.Pharm.Sci.、66:1−19(1977)を参照。
また、1つまたは複数のDNAワクチン剤および1つまたは複数の化学療法剤、ならびに任意選択で1つまたは複数の他の本明細書記載の構築物を含む組成物およびキットも、本明細書で提供されている。
治療組成物およびその投与
核酸および核酸またはこの核酸を発現している細胞を含む粒子を含むワクチン組成物を、哺乳類患者に投与できる。ワクチン組成物は、生物学的に有効なおよび/または、治療に有効な量を薬学的に許容可能な担体に入れて投与できる。
核酸および核酸またはこの核酸を発現している細胞を含む粒子を含むワクチン組成物を、哺乳類患者に投与できる。ワクチン組成物は、生物学的に有効なおよび/または、治療に有効な量を薬学的に許容可能な担体に入れて投与できる。
本明細書記載のように、特定の条件が実施例では開示される。組成物は単独でも、別のタンパク質またはペプチド、例えば、免疫賦活性分子、と組み合わせて投与してもよい。治療には、任意の非特異的免疫刺激化合物、例えば、インターフェロン、を含む最も広範な意味で使われる場合のアジュバントの投与を含むことができる。本明細書で意図されているアジュバントには、レゾルシノール、非イオン界面活性剤、例えば、ポリオキシエチレンオレイルエーテルおよびn−ヘキサデシルポリエチレンエーテル、が含まれる。
治療有効量とは、有効期間投与された場合、所望の免疫学的または臨床的効果が得られる投与量である。
融合ポリペプチドをコードした核酸の治療有効量は、疾患状態、年齢、性別、および個体重量、およびペプチドの個体で所望の応答を誘発する能力、等の因子により変化する可能性がある。投与計画は、最適治療応答が得られるように調整できる。例えば、いくつかの分割用量を毎日投与しても、または用量を治療状況の緊急性に応じて減らしてもよい。細胞結合型におけるタンパク質の治療有効量は、タンパク質または細胞等価物に換算して記載することができる。
従って、ワクチンの有効量は、1キログラムのレシピエント体重当たり約1ナノグラムと約1グラムの間、約0.1mg/kgと約10mg/kgの間、約1mg/kgと約1mg/kgの間とすることができる。内服に適した剤形には、(後者の用量範囲に対し)1単位当たり約0.1mg〜100mgの有効成分を含むことができる。有効成分は、組成物の全重量に対する重量で0.5〜95%の間で変化してもよい。あるいは、本発明のDNAワクチン構築物を移入された細胞の有効量は、約104と108細胞の間である。免疫療法の専門家なら、必要以上の実験をしないでこの用量を調節できるであろう。
特定の実施形態では、DNAの投与経路には、(a)腫瘍内、腫瘍周囲、および/または皮内「遺伝子銃」送達、この場合、有効量の金粒子被覆DNAが既知のレベル、例えば、400p.s.i.の発射圧力のヘリウム駆動遺伝子銃(BioRad、Hercules、CA)を使って送達される;(b)通常のシリンジ針を使った筋肉内(i.m.)注入;および(c)無針注入器(biojector)、例えば、射出装置およびディスポーザブル注入器で構成される注入装置であるBiojector2000(Bioject Inc.、Portland、OR)、の使用、を含んでもよい。オリフィスサイズにより浸透深さが制御される。例えば、50mgのDNAをno.2シリンジノズルの
Biojectorを使って送達できる。
Biojectorを使って送達できる。
他の投与経路には、次記のものが含まれる。用語の「全身投与」は、患者の循環系への組成物の導入を可能にする、または全身への伝搬を可能にする方法による本明細書記載の組成物またはDNAワクチンのような試薬の投与を指す。「領域性(regional)」投与は、特異的、および幾分限定された、解剖学的空間、例えば、腹腔内、鞘内、硬膜下、または特異的器官への投与を指す。「局所(local)投与」は、組成物または薬剤の限定された、または限局性、解剖学的空間への投与、例えば、腫瘍塊への腫瘍内注入、皮下注入、皮内または筋肉内注入、を指す。また、当業者なら、局所投与または領域性投与が、循環系への組成物の進入を生じる、すなわち、多かれ少なかれ、これらの投与に全身性を与える可能性があることをわかるであろう。他の投与経路には、経口、鼻腔内もしくは直腸または当技術分野で既知の他の任意の経路が含まれる。
本発明の目的を達成するために、機能的に活性なDNAを哺乳類体細胞組織または器官にインビボで直接移入することにより核酸治療を完成できる。DNA移入は、下記に示す多くの手法を使って成し遂げることができる。これらの系は、選択可能マーカー(例えば、G418耐性)を使ってDNAを発現している形質移入クローンを選択し、続いて、適切なイムノアッセイを使って産物に対する抗体を使って、発現産物を含む抗原の存在を検出(誘導系の場合は、誘導因子で処理後)することにより、インビトロでの発現の成功に関し試験できる。
また、DNA分子、例えば、融合ポリペプチドをコードしているDNA分子、を当技術分野でよく知られている複製欠陥のあるレトロウイルスを産生するパッケージング細胞株を使ってレトロウイルスベクター中にパッケージできる(例えば、Cone、R.D.et al.、Proc Natl Acad Sci USA 81:6349−53、1984;Mann、RF et al.、Cell 33:153−9、1983;Miller、AD et al.、Molec Cell Biol 5:431−7、1985;Sorge、J、et al.、Molec Cell Biol 4:1730−7、1984;Hock、RA et al.、Nature 320:257、1986;Miller、AD et al.、Molec Cell Biol 6:2895−2902(1986)。遺伝子移入に対し効率的で安全な新規パッケージング細胞株についても、報告がある(Bank et al.、米国特許第5、278、056号(参照によって組み込まれる))。
上述の進め方は、レトロウイルスベクターを部位特異的に選択した組織または器官に送達する場合にも使用できる。従って、例えば、カテーテルデリバリーシステムを使用可能である(Nabel、EG et al.、Science 244:1342(1989))。レトロウイルスベクターまたはリポソームベクターを使うこのような方法は、特に、発現させたい核酸を血管壁、または腫瘍の血液循環路に送達するのに有用である。
投与経路に依存して、酵素、酸および他の化合物を不活性化する可能性のある自然条件の作用から化合物を保護する材料で組成物を被覆してもよい。このように、不活性化を防ぐ材料で組成物を被覆するか、またはこのような不活化を防ぐ材料と組成物を同時投与する必要がある可能性がある。例えば、ヌクレアーゼまたはプロテアーゼの酵素抑制剤(例えば、膵臓トリプシンインヒビター、ジイソプロピルフルオロリン酸およびトラジロール)を使用するか、またはリポソーム(水中油中水型エマルジョンを含む)ならびに従来のリポソーム(Strejan et al.、J.Neuroimmunol7:27、1984)等の適切な担体に入れてもよい。
他の本発明の核酸ワクチン組成物のための薬学的に許容可能な担体は、リポソームで、これは、活性タンパク質を脂質層に付着した水性の同心円状層から成る小体中に分散しているか、または多様な存在形態で含まれている医薬品組成物である。活性タンパク質の存在が、水性層および脂質層中でも、その内側でも外側でも、または、なんらかのイベント中でも、一般的にリポソーム懸濁液として知られる不均一系中であってもよい。疎水性層、または脂質層は、限定されない一般論として、リン脂質、例えば、レシチンやスフィンゴミエリン、ステロイド、例えば、コレステロール、程度の差はあるがイオン界面活性物質、例えば、ジセチルリン酸、ステアリルアミンまたはホスファチジン酸、および/または疎水性の他の物質が含まれる。当業者なら、本リポソーム製剤の他の適切な実施形態がわかるであろう。
化学療法剤を、その化学療法剤が癌治療に投与される用量と同様の用量で投与してもよい。あるいは、より少ない用量、例えば、10%、30%、50%、または2、5、もしくは10倍少ない用量で使用可能である。通常、化学療法剤の用量は、DNAワクチンの有効性を高めるのに有効な量で、しかし、著しい免疫抑制または基本的にDNAワクチンの効果を取り消す免疫抑制を生ずる量未満の用量である。
化学療法剤の投与経路は、薬剤に依存する可能性がある。本明細書記載の方法での使用では、化学療法剤は、既知の方法で使われるように使用可能である。通常、薬剤は、経口で投与されるか、または注入されてもよい。薬剤投与計画は、既知の方法で通常使われるものと同じでもよい。例えば、特定の薬剤は一度に投与され、他の薬剤は、設定された期間の間3日毎に投与され、さらに別の薬剤は、隔日、3日毎、4日毎、5日毎、6日毎または毎週投与される。実施例では、薬剤ならびにDNAワクチン剤の代表的投与計画が示される。
本発明の組成物は、同時に、または引き続いて投与してもよい。同時に投与する場合は、異なる構成成分を1つの組成物として投与してもよい。このように、本明細書では、組成物、例えば、1つまたは複数の試薬を含む医薬品組成物も提供される。
一実施形態では、患者は最初に1つまたは複数の用量の化学療法剤の投与を受け、次に1つまたは複数の用量のDNAワクチンの投与を受ける。DMXAAの場合には、患者に対し最初にDNAワクチン用量を、次に化学療法剤の用量を投与するのが好ましい可能性がある。1、2、3、4、5またはそれ以上の用量のDNAワクチン、および1、2、3、4、5それ以上の用量の化学療法剤を投与してもよい。
一方法として、患者に別の癌治療、例えば、放射線療法、血管新生抑制試薬および/またはヒドロゲルベースシステム、をさらに受けさせることを含めてもよい。
本明細書で使用する「薬学的に許容可能な担体」には、任意かつ全ての溶剤、分散媒、コーティング、抗菌と抗真菌試薬、等張性および吸収遅延試薬、等、が含まれる。薬学的に活性物質用のこのような媒質および試薬の使用は、当技術分野でよく知られている。いずれかの従来の媒質や試薬が活性化合物と不適合である場合を除き、治療組成物中にそれらを使用することが意図されている。補充の活性化合物も、また、組成物中に組み入れることができる。
薬学的に許容可能な希釈剤には、食塩水および水性の緩衝液が含まれる。注入に適する医薬品組成物には、無菌の水溶液(水に溶解する場合は)または分散液および無菌注入可能溶液または分散液を即座に調製するための無菌粉末が含まれる。等張性試薬、例えば、糖、多価アルコール、例えば、マンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムを医薬品組成物に含んでもよい。全てのケースで、組成物は無菌、また液体でなければならない。それは、製造と貯蔵の条件下安定でなければならず、また、微生物、例えば、バクテリアおよび菌類による汚染を防ぐ防腐剤を含まねばならない。また、分散液は、グリセリン、液体ポリエチレングリコール、およびこれらの混合物ならびにオイル中で調整可能である。通常の貯蔵と使用の条件下のこれらの調整で防腐剤を入れて微生物の増殖を防いでもよい。
担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセリン、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール、等)、および適切なこれらの混合物を含む溶媒または分散媒であってもよい。例えば、コーティング、例えば、レシチンの使用により、分散の場合は所定の粒径の維持により、および界面活性剤の使用により、適切な流動性が維持できる。
医薬品組成物中の微生物の活動の防止は、種々の抗菌および抗真菌試薬、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール、等により達成できる。
投与の容易にし、投与量を均一にするため、組成物を投与量単位形で処方してもよい。投与量単位形は、哺乳類患者用の単一用量として適した物理的に離散性の単位を指し、各単位は、必要な医薬品担体と共同して、所望の治療効果を生み出すように計算された所定量の活物質(例えば、核酸ワクチン)を含む。本発明の投与量単位形に対する仕様は、(a)活物質の独特の特性および達成されるべき詳細な治療効果、および(b)個別の患者治療と感受性に対するこのような活性化合物の配合の当技術分野で固有の制約、に影響され、また直接に依存する。
肺注入に対しては、エアロゾル化した溶液が使われる。スプレー可能エアロゾル調製では、活性タンパク質を固体または液体の不活性担体材料と組み合わせてもよい。これは、スクイーズボトルに入れて、または加圧された揮発性の、通常はガス状の噴霧剤と混合してパッケージ化することができる。エアロゾル調製では、溶剤、緩衝液、界面活性剤、および抗酸化剤を本発明のタンパク質のほかに含むことができる。
本明細書記載の治療可能な疾患には、過剰増殖疾患、例えば、局所的であれ、転移し多ものであれ、癌が含まれる。代表的な癌には、頭頸部癌および子宮頸癌がある。特定の癌に付随する腫瘍関連抗原が存在する場合には、いずれの癌も治療可能である。他の癌には、皮膚癌、肺癌、結腸癌、腎臓癌、乳癌、前立腺癌、膵臓癌、硬骨癌、脳癌、ならびに血液癌、例えば、骨髄腫、白血病およびリンパ腫が含まれる。細胞増殖に付随する抗原が存在し、その抗原またはそのホモログがDNAワクチンによってコードされうる場合には、通常、いずれの細胞増殖も治療可能である。
患者の治療には、患者の治癒または少なくとも1つの疾患の症状の改善、患者の再発の可能性の防止または低減が含まれる。例えば、癌に罹患している患者の治療は、患者の、例えば、約10%、30%、50%、75%、90%またはそれ以上の腫瘍量の低減、腫瘍の除去、患者の再発の可能性の防止または低減、または部分的もしくは完全寛解であってもよい。
本明細書に頻用された全ての文献は、具体的に組み込まれてもそうでなくても、全て参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書に引用された、全ての出版物、特許、特許出願、GenBank配列およびATCC登録物は、ここに明確に全ての目的のために参照によって組み込まれる。特に、本明細書で参照されている、または1人または複数の本出願の発明者が著している特許、特許出願および他の出版物に記載されている全てのヌクレオチド配列、アミノ酸配列、核酸構築物、DNAワクチン剤、投与方法、DNAワクチン剤と試薬の特定の投与順序は、具体的に参照によって本明細書に組み込まれる。矛盾がある場合には、本出願にある定義が優先される。
これまで本発明について十分に説明してきたので、本発明の趣旨と範囲を逸脱することなく、また必要以上の実験をすることなく、等価なパラメーター、濃度、および条件の広範な範囲内で、同じことが実行可能であることを当業者ならわかるであろう。
この記載は、下記の実施例によりさらに説明されるが、これがなんらかの制限をするものと解釈されるべきではない。
この記載は、下記の実施例によりさらに説明されるが、これがなんらかの制限をするものと解釈されるべきではない。
実施例1:実施例2〜6用材料と方法
A.マウス
雌C57BL/6マウス(H−2KbおよびI−Ab)、5〜6週齢、をNational Cancer Institute(Frederick、MD)から購入した。卵白アルブミンペプチド、SIINFEKL、特異的TCRを発現するトランスジェニックマウス、OT−1、をThe Jackson Laboratoryから購入した。全てのマウスを特異的病原体のない条件下、Johns Hopkins Hospital(Baltimore、MD)の動物施設中で維持した。動物を研究機関の動物健康管理規則に従って使用し、全ての動物実験手続きは、Johns Hopkinsの研究機関の動物管理と使用委員会により承認された。
B.細胞株
TC−1細胞またはTC−1ルシフェラーゼを形質導入した(TC−1luc)細胞の産生と維持については、以前記載した(Lin et al.、Cancer.Res.、56:21−6(1996);Kim et al.、Human Gene Ther.、18:575−88(2007))。マウス黒色腫細胞B16/F10および胸腺腫細胞EL4(H−2b)をATCC(Rockville、MD、USA)から購入した。H−2Kb−OVA特異的CTLの生成のため、1x107EG7細胞(卵白アルブミンcDNAを形質移入したEL4細胞)を照射し(10、000rad)、1x107OT−1マウス由来脾臓細胞を添加した完全RPMI−1640培地中で6日間培養した。全ての細胞株を、10%(v/v)ウシ胎仔血清、50U/mlペニシリン/ストレプトマイシン、2mML−グルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム、2mM非必須アミノ酸、および0.4mg/mlG418を補充したRPMI−1640培地中で、37℃、5%CO2の条件で成長させた。
A.マウス
雌C57BL/6マウス(H−2KbおよびI−Ab)、5〜6週齢、をNational Cancer Institute(Frederick、MD)から購入した。卵白アルブミンペプチド、SIINFEKL、特異的TCRを発現するトランスジェニックマウス、OT−1、をThe Jackson Laboratoryから購入した。全てのマウスを特異的病原体のない条件下、Johns Hopkins Hospital(Baltimore、MD)の動物施設中で維持した。動物を研究機関の動物健康管理規則に従って使用し、全ての動物実験手続きは、Johns Hopkinsの研究機関の動物管理と使用委員会により承認された。
B.細胞株
TC−1細胞またはTC−1ルシフェラーゼを形質導入した(TC−1luc)細胞の産生と維持については、以前記載した(Lin et al.、Cancer.Res.、56:21−6(1996);Kim et al.、Human Gene Ther.、18:575−88(2007))。マウス黒色腫細胞B16/F10および胸腺腫細胞EL4(H−2b)をATCC(Rockville、MD、USA)から購入した。H−2Kb−OVA特異的CTLの生成のため、1x107EG7細胞(卵白アルブミンcDNAを形質移入したEL4細胞)を照射し(10、000rad)、1x107OT−1マウス由来脾臓細胞を添加した完全RPMI−1640培地中で6日間培養した。全ての細胞株を、10%(v/v)ウシ胎仔血清、50U/mlペニシリン/ストレプトマイシン、2mML−グルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム、2mM非必須アミノ酸、および0.4mg/mlG418を補充したRPMI−1640培地中で、37℃、5%CO2の条件で成長させた。
C.プラスミドDNA構築物
CRT/E7(p−CRT/E7)をコードした組換え型プラスミドpcDNA3または卵白アルブミン(p−OVA)をコードした組換え型pcDNA3の生成については、以前に記載した(Kim et al.、J.Clin.Invest、112:109−17(2003);Peng et al.、J.Biomed.Sci.、12:689−700(2005))。DNA構築物の正確さをDNAシーケンシングにより確認した。遺伝子銃媒介皮内ワクチン接種のために、2mg/マウスの組換えプラスミドDNA
を、C57BL/6マウスの剪毛した腹腔領域へ、400p.s.i.の発射圧力のヘリウム駆動遺伝子銃(BioRad、Hercules、CA、USA)を使って、以前記載のプロトコルに従って送達した(Chen et al.、Cancer Res.、60:1035−42(2000))。
CRT/E7(p−CRT/E7)をコードした組換え型プラスミドpcDNA3または卵白アルブミン(p−OVA)をコードした組換え型pcDNA3の生成については、以前に記載した(Kim et al.、J.Clin.Invest、112:109−17(2003);Peng et al.、J.Biomed.Sci.、12:689−700(2005))。DNA構築物の正確さをDNAシーケンシングにより確認した。遺伝子銃媒介皮内ワクチン接種のために、2mg/マウスの組換えプラスミドDNA
を、C57BL/6マウスの剪毛した腹腔領域へ、400p.s.i.の発射圧力のヘリウム駆動遺伝子銃(BioRad、Hercules、CA、USA)を使って、以前記載のプロトコルに従って送達した(Chen et al.、Cancer Res.、60:1035−42(2000))。
D.組換え型ワクチニアウイルス
野性型ワクチニアウイルス(Vac−WT)を以前記載のように調製した(Wu et al.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、92:11671−5(1995))。ルシフェラーゼ発現ワクチニアウイルス(Vac−luc)を、以前記載のプロトコルを使って産生した。これには、VV(tk−)のチミジンキナーゼ領域に挿入された2つのレポーター遺伝子(lucおよびlacZ)を含む(Chen et al.、J.Immunotherapy、24:46−57(2001)に記載されている)。完全長ニワトリOVA(Vac−OVA)を発現しているワクチニアウイルスを、以前記載のプロトコルを使って産生した(Norbury et al.、J.Immunol.、166:4355−62(2001))。モデル腫瘍抗原HPV−16E7(Vac−CRT/E7)に結合したカルレティキュリン(CRT)をコードした組換え型ワクチニアウイルスの産生を、前に記載したものと類似のプロトコルを使って行った(Earl et al.、AIDS Res.Hum.Retroviruses、9:589−94(1993))。緑蛍光タンパク質(Vac−GFP)を発現している組換え型ワクチニアウイルスの産生を前に記載したものと類似のプロトコルを使って行った(Ward et al.、Methods Mol.Biol.、269:205−18(2004))。
野性型ワクチニアウイルス(Vac−WT)を以前記載のように調製した(Wu et al.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、92:11671−5(1995))。ルシフェラーゼ発現ワクチニアウイルス(Vac−luc)を、以前記載のプロトコルを使って産生した。これには、VV(tk−)のチミジンキナーゼ領域に挿入された2つのレポーター遺伝子(lucおよびlacZ)を含む(Chen et al.、J.Immunotherapy、24:46−57(2001)に記載されている)。完全長ニワトリOVA(Vac−OVA)を発現しているワクチニアウイルスを、以前記載のプロトコルを使って産生した(Norbury et al.、J.Immunol.、166:4355−62(2001))。モデル腫瘍抗原HPV−16E7(Vac−CRT/E7)に結合したカルレティキュリン(CRT)をコードした組換え型ワクチニアウイルスの産生を、前に記載したものと類似のプロトコルを使って行った(Earl et al.、AIDS Res.Hum.Retroviruses、9:589−94(1993))。緑蛍光タンパク質(Vac−GFP)を発現している組換え型ワクチニアウイルスの産生を前に記載したものと類似のプロトコルを使って行った(Ward et al.、Methods Mol.Biol.、269:205−18(2004))。
E.インビボでのバイオルミネセンス画像処理
ウイルスの複製レベルを、異なる注入経路による投与の腫瘍間で定量的に比較した。TC−1マウス(腫瘍サイズ=8〜10mm)に、200mLのリン酸塩緩衝食塩水中のワク
チニア−lucの1x107pfu/マウスの腹腔内(i.p.)または腫瘍内(i.t.)注入により投与した。バイオルミネッセンス画像処理を、極低温冷却したIVISシステム(Xenogen/Caliper Life Sciences)を使って、ウイルス注入後1、3、および7日目に行った。Living Imageソフトウェア2.5(Xenogen/Caliper Life Sciences)を使って関心領域(ROI)として腫瘍を覆った領域をマニュアルで描画した。
ウイルスの複製レベルを、異なる注入経路による投与の腫瘍間で定量的に比較した。TC−1マウス(腫瘍サイズ=8〜10mm)に、200mLのリン酸塩緩衝食塩水中のワク
チニア−lucの1x107pfu/マウスの腹腔内(i.p.)または腫瘍内(i.t.)注入により投与した。バイオルミネッセンス画像処理を、極低温冷却したIVISシステム(Xenogen/Caliper Life Sciences)を使って、ウイルス注入後1、3、および7日目に行った。Living Imageソフトウェア2.5(Xenogen/Caliper Life Sciences)を使って関心領域(ROI)として腫瘍を覆った領域をマニュアルで描画した。
F.ワクチニア感染CD31+細胞のキャラクタリゼーション
TC−1含有マウス(腫瘍サイズ=8〜10mm)に、200mLのリン酸塩緩衝食塩水
中のワクチニア−GFPの1x107pfu/マウスの腹腔内(i.p.)または腫瘍内(i.t.)注入により投与した後に、ワクチニアウイルス感染CD31+細胞の度数を特徴付けした。腫瘍細胞をウイルス注入の24時間後に採取して、単一の細胞懸濁液を作り、CD31染色に供した。
TC−1含有マウス(腫瘍サイズ=8〜10mm)に、200mLのリン酸塩緩衝食塩水
中のワクチニア−GFPの1x107pfu/マウスの腹腔内(i.p.)または腫瘍内(i.t.)注入により投与した後に、ワクチニアウイルス感染CD31+細胞の度数を特徴付けした。腫瘍細胞をウイルス注入の24時間後に採取して、単一の細胞懸濁液を作り、CD31染色に供した。
CD31+細胞の殺作用を評価するため、TC−1腫瘍をC57BL/6マウス中で成長させ、腫瘍サイズが8〜10mmになった時点で採取した。腫瘍を解離させて単一細胞懸濁液とし、24−ウエルマイクロタイタープレートを使って完全培地中で(3x105/ウエル)で播種した。24時間で、Vac−WTまたはVac−OVAを0.5MOIで各ウエルに添加し、48時間で、完全培地を交換し、effector−to−target比1:1(E/T=1:1)で各ウエルに活性化したOT−1T細胞を添加した。4時間後、細胞を採取しPE抗マウスCD31mAbおよび7−AADで染色後、FACSCaliburフローサイトメーター、とCellQuestソフトウェア(Becton Dickinson、SanJose、CA)を使って、フローサイトメトリーにより分析した。データは、3x105細胞当たりのCD31+7−AAD−細胞の絶対数として表している。
G.異種プライムブースト免疫化
マウス群(群当たり5匹)にB16/F10細胞またはTC−1細胞(5x104/マウス)をDay0に接種した。次に、day5に、遺伝子銃を使って、2μgの対照pcDNA3、p−OVAまたはp−CRT/E7DNAでマウスを刺激し、day12のVac−WT、Vac−OVA、またはVac−CRT/E7のi.t.注入(1x107pfu/マウス、200μL PBS)により追加免疫した。
マウス群(群当たり5匹)にB16/F10細胞またはTC−1細胞(5x104/マウス)をDay0に接種した。次に、day5に、遺伝子銃を使って、2μgの対照pcDNA3、p−OVAまたはp−CRT/E7DNAでマウスを刺激し、day12のVac−WT、Vac−OVA、またはVac−CRT/E7のi.t.注入(1x107pfu/マウス、200μL PBS)により追加免疫した。
H.細胞内サイトカイン染色およびフローサイトメトリー分析によるE7特異的CD8+T細胞の度数評価
E7−特異的CD8+T細胞のキャラクタリゼーションのために、脾細胞および腫瘍の両方の異種移植片を、最後の免疫化の1週間後に採取した。細胞内のサイトカイン染色の前に、2x106の各治療群由来のプールした脾細胞およびプールした腫瘍を別々にH−2Kb制限ペプチド(SIINFEKL;1.0mM)またはI−Ab制限ペプチド(LS
QAVHAAHAEINEAGR;1.0mM)と共に16時間インキュベートした。さ
らに、2x106の各治療群由来のプールした脾細胞およびプールした腫瘍を、E7特異的CD8+T細胞前駆物質を検出するためのMHCクラスIエピトープを含む1μg/mlのE7ペプチド(aa49−57)6と共に16時間インキュベートした(Feltkamp et al.、Eur.J Immunol.、23:2242−9(1993))。次に、細胞を採取し、以前記載した標準プロトコルを使ってCD8とIFN−gを染色した(Cheng et al.、J Clin.Invest.、108:669−78(2001))。試料をCellQuestソフトウェア(Becton Dickinson、San Jose、CA)を使って、FACSCaliburフローサイトメーターで分析した。示した全ての分析をゲーティッドリンパ球集団に対し行った。
E7−特異的CD8+T細胞のキャラクタリゼーションのために、脾細胞および腫瘍の両方の異種移植片を、最後の免疫化の1週間後に採取した。細胞内のサイトカイン染色の前に、2x106の各治療群由来のプールした脾細胞およびプールした腫瘍を別々にH−2Kb制限ペプチド(SIINFEKL;1.0mM)またはI−Ab制限ペプチド(LS
QAVHAAHAEINEAGR;1.0mM)と共に16時間インキュベートした。さ
らに、2x106の各治療群由来のプールした脾細胞およびプールした腫瘍を、E7特異的CD8+T細胞前駆物質を検出するためのMHCクラスIエピトープを含む1μg/mlのE7ペプチド(aa49−57)6と共に16時間インキュベートした(Feltkamp et al.、Eur.J Immunol.、23:2242−9(1993))。次に、細胞を採取し、以前記載した標準プロトコルを使ってCD8とIFN−gを染色した(Cheng et al.、J Clin.Invest.、108:669−78(2001))。試料をCellQuestソフトウェア(Becton Dickinson、San Jose、CA)を使って、FACSCaliburフローサイトメーターで分析した。示した全ての分析をゲーティッドリンパ球集団に対し行った。
I.インビトロ細胞障害性アッセイ
ルシフェラーゼ発現TC−1腫瘍細胞を96ウエルプレートに2x104/ウエルの用量で添加した。24時間後、Vac−WTまたはVac−OVA(MOI=0.5)を各ウエルに添加した。49時間に、完全培地を交換し、活性化したOT−1T細胞を1:1のE:T比で各ウエルに添加した。バイオルミネッセンス画像処理を4時間後に行った。腫瘍細胞のCTL媒介殺作用度合をIVIS発光画像処理システムシリーズ200を使って発光活性の減少により示した。バイオルミネッセンスシグナルは10秒間採取した。
ルシフェラーゼ発現TC−1腫瘍細胞を96ウエルプレートに2x104/ウエルの用量で添加した。24時間後、Vac−WTまたはVac−OVA(MOI=0.5)を各ウエルに添加した。49時間に、完全培地を交換し、活性化したOT−1T細胞を1:1のE:T比で各ウエルに添加した。バイオルミネッセンス画像処理を4時間後に行った。腫瘍細胞のCTL媒介殺作用度合をIVIS発光画像処理システムシリーズ200を使って発光活性の減少により示した。バイオルミネッセンスシグナルは10秒間採取した。
J.統計的分析
統計的分析を、プリズム3.0ソフトウェア(GraphPad、SanDiego、USA)を使って行った。全てのデータを平均±標準偏差(SD)として表し、また、少なくとも2つの非依存的実験の代表値である。個別データ点の間の比較は、必要に応じ、スチューデントt検定または反復測定ANOVA(分散分析)検定を使って実施した。腫瘍サイズを、ディジタルキャリパーで週2回治療の間に測定し、腫瘍容量(mm3)を、下位の式で計算した:(腫瘍長さx幅x高さ)/2。マウスの死亡を、2cmを超える腫瘍直径として、自由裁量で定義した。実験群間の生存の差をログランク検定を使って解析した。群間の差の有意性の判定に0.05以下のp値を設定した。
統計的分析を、プリズム3.0ソフトウェア(GraphPad、SanDiego、USA)を使って行った。全てのデータを平均±標準偏差(SD)として表し、また、少なくとも2つの非依存的実験の代表値である。個別データ点の間の比較は、必要に応じ、スチューデントt検定または反復測定ANOVA(分散分析)検定を使って実施した。腫瘍サイズを、ディジタルキャリパーで週2回治療の間に測定し、腫瘍容量(mm3)を、下位の式で計算した:(腫瘍長さx幅x高さ)/2。マウスの死亡を、2cmを超える腫瘍直径として、自由裁量で定義した。実験群間の生存の差をログランク検定を使って解析した。群間の差の有意性の判定に0.05以下のp値を設定した。
実施例2:外来性抗原をコードしたDNAで刺激し、同じ外来性抗原をコードしたワクチニアウイルスの細胞内注入で治療した担癌マウスが有意な治療上の抗腫瘍効果をもたらした
ルシフェラーゼ等のマーカー遺伝子をコードしたワクチニアの腫瘍内注入により、腫瘍内にルシフェラーゼの顕著な発現が生じることが最近証明され、ワクチニアの腫瘍内注入により腫瘍細胞を顕著なウイルス感染に導くことが可能であることが示された(図1)。これを受け、OVA等の外来性抗原をコードしたDNAで刺激し、同じ外来性抗原をコードしたワクチニアウイルスの腫瘍内注入により治療した担癌マウスに生じた抗腫瘍効果を測定するために、C57BL/6マウス群(群当たり5匹)を最初B16腫瘍細胞で感作し、次に対照pcDNA3のみ、または卵白アルブミン(p−OVA)をコードしたpcDNA3で刺激した。1週後、マウスを、野性型ワクチニア(Vac−WT)またはOVA(Vac−OVA)をコードしたワクチニアの腫瘍内注入により治療した。1XPBSで治療した担癌マウスを陰性対照として使用した。治療計画を図2Aに図示した。図2Bに示すように、p−OVAで刺激し、その後、腫瘍内Vac−OVA注入した担癌マウスは、他のプライムブースト治療計画での治療に比べ、最良の治療上の抗腫瘍効果を示した。さらに、p−OVAで刺激し、その後、腫瘍内Vac−OVA注入した担癌マウスは、他の治療計画による治療に比べて生存の改善を示した(p<0.01)(図2C)。このように、データは、p−OVAでの治療とその後の腫瘍内Vac−OVA注入により、B16担癌マウスで有意な治療上の抗腫瘍効果および長期生存がもたらされたことを示している。
ルシフェラーゼ等のマーカー遺伝子をコードしたワクチニアの腫瘍内注入により、腫瘍内にルシフェラーゼの顕著な発現が生じることが最近証明され、ワクチニアの腫瘍内注入により腫瘍細胞を顕著なウイルス感染に導くことが可能であることが示された(図1)。これを受け、OVA等の外来性抗原をコードしたDNAで刺激し、同じ外来性抗原をコードしたワクチニアウイルスの腫瘍内注入により治療した担癌マウスに生じた抗腫瘍効果を測定するために、C57BL/6マウス群(群当たり5匹)を最初B16腫瘍細胞で感作し、次に対照pcDNA3のみ、または卵白アルブミン(p−OVA)をコードしたpcDNA3で刺激した。1週後、マウスを、野性型ワクチニア(Vac−WT)またはOVA(Vac−OVA)をコードしたワクチニアの腫瘍内注入により治療した。1XPBSで治療した担癌マウスを陰性対照として使用した。治療計画を図2Aに図示した。図2Bに示すように、p−OVAで刺激し、その後、腫瘍内Vac−OVA注入した担癌マウスは、他のプライムブースト治療計画での治療に比べ、最良の治療上の抗腫瘍効果を示した。さらに、p−OVAで刺激し、その後、腫瘍内Vac−OVA注入した担癌マウスは、他の治療計画による治療に比べて生存の改善を示した(p<0.01)(図2C)。このように、データは、p−OVAでの治療とその後の腫瘍内Vac−OVA注入により、B16担癌マウスで有意な治療上の抗腫瘍効果および長期生存がもたらされたことを示している。
同じ治療の手法を別の腫瘍モデルのTC−1を使ってさらに試験した。C57BL/6マウス群(群当たり5匹)を最初TC−1腫瘍細胞で感作し、次に、対照pcDNA3またはp−OVAで刺激した。1週後、マウスをVac−WTまたはVac−OVAの腫瘍内注入により治療した。PBSで治療した担癌マウスを陰性対照として使用した。治療計画を図3Aに図示した。図3Bに示すように、p−OVAでの治療とその後の腫瘍内Vac−OVA注入で治療した担癌マウスは、他のプライムブースト治療計画での治療に比べ、最良の治療上の抗腫瘍効果を示した。さらに、p−OVAでの治療とその後の腫瘍内Vac−OVA注入で治療した担癌マウスは、他の治療計画の治療に比べ生存の改善を示した(p<0.01;図3C)。このように、データは、p−OVAでの治療とその後の腫瘍内Vac−OVA注入による治療により、TC−1担癌マウスで有意な治療上の抗腫瘍効果および長期生存がもたらされたことを示している。
さらに、この治療の手法をTC−1腫瘍細胞特異的抗原システムを使って、E7特異的に試験した。CRT/E7DNAワクチンで皮内ワクチン接種し、その後、CRT/E7をコードしたワクチニアの腫瘍内注入しても、TC−1担癌マウスで有意な治療上の抗腫瘍効果および長期生存が得られた(図4)。まとめると、データは、外来性抗原特異的DNAワクチンでの治療と、その後の同じ外来性抗原をコードしたワクチニアの腫瘍内注入により、担癌マウスの2つの異なる腫瘍モデルにおいて、有意な治療上の抗腫瘍効果および長期生存がもたらされることを示している。
実施例3:外来性抗原をコードしたDNAで刺激し、同じ外来性抗原をコードしたワクチニアを腫瘍内注入で治療した担癌マウスは、有意な度数の外来性抗原特異的CD8+T細胞を生じる
DNA刺激および腫瘍内ウイルス性追加免疫モデルを使って、担癌マウス中のOVAに対する抗原特異的CD8+T細胞免疫応答を測定するために、前に図2に記載のように、C57BL/6マウス群(群当たり5匹)を最初B16腫瘍細胞で感作し、次に、pcDNA3またはp−OVAで治療し、その後Vac−WTまたはVac−OVAの腫瘍内注入で治療した。1XPBSで治療した担癌マウスを陰性対照として使用した。ワクチニア注入の7日後に細胞をワクチン接種したマウスの脾臓および腫瘍から採取して、IFN−g
の細胞内サイトカイン染色と、それに続くフローサイトメトリー分析を使って、OVA特異的CD8+T細胞の存在を調べた。図5に示すように、他の治療計画で治療した担癌マウスに比べて、p−OVAと、それに続く腫瘍内Vac−OVA注入による治療を受けた担癌マウスで有意に高い数/パーセンテージのOVA特異的CD8+T細胞が脾臓ならびに腫瘍の両方で生じた。
DNA刺激および腫瘍内ウイルス性追加免疫モデルを使って、担癌マウス中のOVAに対する抗原特異的CD8+T細胞免疫応答を測定するために、前に図2に記載のように、C57BL/6マウス群(群当たり5匹)を最初B16腫瘍細胞で感作し、次に、pcDNA3またはp−OVAで治療し、その後Vac−WTまたはVac−OVAの腫瘍内注入で治療した。1XPBSで治療した担癌マウスを陰性対照として使用した。ワクチニア注入の7日後に細胞をワクチン接種したマウスの脾臓および腫瘍から採取して、IFN−g
の細胞内サイトカイン染色と、それに続くフローサイトメトリー分析を使って、OVA特異的CD8+T細胞の存在を調べた。図5に示すように、他の治療計画で治療した担癌マウスに比べて、p−OVAと、それに続く腫瘍内Vac−OVA注入による治療を受けた担癌マウスで有意に高い数/パーセンテージのOVA特異的CD8+T細胞が脾臓ならびに腫瘍の両方で生じた。
異なる抗原システム、E7を使用する別の腫瘍モデル、TC−1、で誘発された抗原特異的免疫応答も測定した。C57BL/6マウス群(群当たり5匹)を最初TC−1腫瘍細胞で感作し、次にpcDNA3またはp−CRT/E7DNAワクチンで皮内刺激した。1週後、マウスをVac−WTまたはVac−CRT/E7の腹腔内または腫瘍内注入によって治療した。PBSで治療した担癌マウスを陰性対照として使用した。他の治療計画で治療した担癌マウスに比べて、p−CRT/E7DNAで治療し、続けて腫瘍内Vac−CRT/E7注入により治療した担癌マウスは、有意に高い数のE7特異的CD8+T細胞を脾臓ならびに腫瘍で生じることが観察された(図6)。まとめると、データは、担癌マウスを外来性抗原特異的DNAワクチンで治療し、続けて同じ外来性抗原をコードしたワクチニアの腫瘍内注入により治療することにより、脾臓と腫瘍において、最強の抗原特異的CD8+T細胞免疫応答がもたらされることを示している。
また、p−OVAとそれに続く腫瘍内Vac−OVA注入により治療された担癌マウスのOVA−特異的CD4+T細胞免疫応答も測定した。治療マウスの脾臓中のOVA特異的CD4+T細胞免疫応答は、他の治療計画で治療された担癌マウス中のそれと有意に異ならないが、治療マウスの腫瘍内のOVA特異的CD4+T細胞免疫応答は、他の治療計画で治療した担癌マウスのものに比べ、有意に高いことが明らかになった(図7)。このように、データは、p−OVAに続き腫瘍内Vac−OVA注入による治療が、腫瘍中のOVA特異的CD4+T細胞免疫応答の増加をもたらすが、担癌マウスの脾臓では、そうはならないことを示している。
観察した抗腫瘍効果にとって重要である免疫細胞のサブセットを測定するために、インビボ抗体欠乏実験をp−OVAで治療後、腫瘍内Vac−OVA注入治療をした担癌マウスを使って行った。CD8+T細胞を欠失したマウスは、両腫瘍モデルの欠乏のない治療マウスに比較して、有意な生存の減少を示すことが明らかになった(図8)。さらに、CD8+T細胞欠乏ほど有意ではないが、CD4+T細胞の欠乏が、わずかな生存の減少を示した。まとめると、データは、CD8+T細胞、ならびにCD4+T細胞が、p−OVAで治療後、腫瘍内Vac−OVA注入治療をしたマウスで観察された抗腫瘍効果に関して、重要な役割を演じていることを示している。
実施例4:ワクチニアを発現しているOVAでの治療は腫瘍細胞を直接死滅させるだけでなく、腫瘍細胞に対しOVA特異的T細胞による殺作用の影響をさらに受けやすくする腫瘍細胞のVac−OVAによる治療が、腫瘍細胞に対し、ウイルス性腫瘍退縮ならびにOVA特異的T細胞媒介殺作用の影響をさらに受けやすくしているかどうかを判断するために、ルシフェラーゼ発現TC−1腫瘍細胞を使って細胞障害性アッセイを行った。TC−1/luc腫瘍細胞をDay0に蒔き、Day1にVac−OVAまたはVac−WTで治療した。次に、図9Aに示すように、Day2にOVA−特異的CD8+T細胞(OT−1T細胞)のある場合と無い場合について細胞を治療した。4時間後、バイオルミネッセンス画像処理システムを使って、各ウエル中のTC−1腫瘍細胞のCTL媒介殺作用をモニターした。腫瘍細胞のCTL媒介殺作用の程度を発光活性の減少で示した。図9Bに示すように、Vac−WTまたはVac−OVA単独と共にインキュベートした腫瘍細胞は、有意なルシフェラーゼ活性の減少を実証し、このことは、ウイルス性腫瘍退縮が腫瘍殺作用に寄与することを示している。さらに、OT−1T細胞に結合したVac−OVAで治療したTC−1細胞において低いルシフェラーゼ活性が認められたが、Vac−WTで治療した細胞ではそれが認められなかった。データは、OVA−特異的細胞障害性のT細胞媒介殺作用が腫瘍溶解の増加に寄与していることを示している。まとめると、データは、Vac−OVAおよびOT−1細胞による腫瘍細胞の治療により、ウイルス性腫瘍縮退とOVA特異的細胞障害性T細胞媒介殺作用の組み合わせによる腫瘍溶解がもたらされうることを示している。
実施例5:ワクチニアの腫瘍内注入がCD31+非腫瘍細胞のワクチニア感染をもたらす
Vac−OVA治療が、CD31+内皮および間質細胞を含む周辺の非腫瘍細胞に細胞障害性効果を及ぼすかどうかについてさらに調査した。担癌マウス中でワクチニアに感染したCD31+非腫瘍細胞の数を測定するために、C57BL/6マウス群(群当たり5匹)をTC−1腫瘍細胞に皮下で感作し、Vac−GFPの腫瘍内(i.t.)または腹腔内(i.p.)注入で治療した。腫瘍細胞をワクチニアウイルス注入の24時間後採取し、CD31の染色を行って、フローサイトメトリー分析により特性解析をした。図10Aに示すように、Vac−GFP感染CD31+非腫瘍細胞の割合は、腹腔内注入マウスまたはPBS治療マウスに比べ、Vac−GFP腫瘍内注入担癌マウスで有意に高い。このように、データは、ワクチニアの腹腔内注入に比べて、腫瘍内注入によりワクチニア感染CD31+非腫瘍細胞の増加がもたらされることを示している。
Vac−OVA治療が、CD31+内皮および間質細胞を含む周辺の非腫瘍細胞に細胞障害性効果を及ぼすかどうかについてさらに調査した。担癌マウス中でワクチニアに感染したCD31+非腫瘍細胞の数を測定するために、C57BL/6マウス群(群当たり5匹)をTC−1腫瘍細胞に皮下で感作し、Vac−GFPの腫瘍内(i.t.)または腹腔内(i.p.)注入で治療した。腫瘍細胞をワクチニアウイルス注入の24時間後採取し、CD31の染色を行って、フローサイトメトリー分析により特性解析をした。図10Aに示すように、Vac−GFP感染CD31+非腫瘍細胞の割合は、腹腔内注入マウスまたはPBS治療マウスに比べ、Vac−GFP腫瘍内注入担癌マウスで有意に高い。このように、データは、ワクチニアの腹腔内注入に比べて、腫瘍内注入によりワクチニア感染CD31+非腫瘍細胞の増加がもたらされることを示している。
実施例6:ワクチニアOVAによる治療は腫瘍微小環境中の周辺のCD31 + 間質細胞を直接死滅させるだけでなく、OVA特異的T細胞による殺作用の影響をさらに受けやすくする
Vac−OVAを注入した外植された腫瘍の治療により周辺腫瘍間質由来のCD31+非腫瘍細胞がウイルス性腫瘍縮退およびOVA特異的CD8+T細胞媒介殺作用の影響をより受けやすくなるか否かについてさらに調べた。このために、day0に、外植TC−1腫瘍細胞を96ウエルプレートに蒔き、day1にVac−OVAまたはVac−WTで治療した。次に、day2に、細胞をOVA特異的CD8+T細胞(OT−1T細胞)がある場合と無い場合について治療した。4時間後、フローサイトメトリー分析により細胞のCD31および7−AADの発現を解析した。図10Bに示すように、Vac−WTまたはVac−OVA単独と共にインキュベートしたCD31+細胞は、有意なルシフェラーゼ活性の減少を示すことが認められ、このことは、ウイルス性腫瘍縮退が殺作用に寄与していることを示している。さらに、低いルシフェラーゼ活性がVac−OVAおよびOT−1T細胞で治療したCD31+細胞において認められたが、Vac−WTで治療した細胞ではこれが認められず、このことは、OVA特異的細胞障害性T細胞媒介殺作用が腫瘍溶解の増加に寄与していることを示唆している。まとめると、データは、CD31+細胞のVac−OVAおよびOT−1細胞による治療により、ウイルス性腫瘍縮退とOVA特異的細胞障害性T細胞媒介殺作用の組み合わせによる腫瘍溶解が生じることを示している。
Vac−OVAを注入した外植された腫瘍の治療により周辺腫瘍間質由来のCD31+非腫瘍細胞がウイルス性腫瘍縮退およびOVA特異的CD8+T細胞媒介殺作用の影響をより受けやすくなるか否かについてさらに調べた。このために、day0に、外植TC−1腫瘍細胞を96ウエルプレートに蒔き、day1にVac−OVAまたはVac−WTで治療した。次に、day2に、細胞をOVA特異的CD8+T細胞(OT−1T細胞)がある場合と無い場合について治療した。4時間後、フローサイトメトリー分析により細胞のCD31および7−AADの発現を解析した。図10Bに示すように、Vac−WTまたはVac−OVA単独と共にインキュベートしたCD31+細胞は、有意なルシフェラーゼ活性の減少を示すことが認められ、このことは、ウイルス性腫瘍縮退が殺作用に寄与していることを示している。さらに、低いルシフェラーゼ活性がVac−OVAおよびOT−1T細胞で治療したCD31+細胞において認められたが、Vac−WTで治療した細胞ではこれが認められず、このことは、OVA特異的細胞障害性T細胞媒介殺作用が腫瘍溶解の増加に寄与していることを示唆している。まとめると、データは、CD31+細胞のVac−OVAおよびOT−1細胞による治療により、ウイルス性腫瘍縮退とOVA特異的細胞障害性T細胞媒介殺作用の組み合わせによる腫瘍溶解が生じることを示している。
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