PT97073A

PT97073A - Processo para a preparacao de epitopos soro-reactivos de proteinas de papillomavirus 16 humano (hpv)

Info

Publication number: PT97073A
Application number: PT97073A
Authority: PT
Inventors: Martin Muller; Lutz Gissmann
Original assignee: Behringwerke Ag
Priority date: 1990-03-20
Filing date: 1991-03-19
Publication date: 1991-10-31
Also published as: JPH04217998A; CA2038581A1; KR910016343A; EP0451550A3; AU650868B2; IE910909A1; AU7351591A; EP0451550A2

Description

a

Descrição referente à patente de invenção de BEHRINGWERKE AKTIEN-GESSELSCHAFT, alema, industrial e comercial, com sede em D-3550 Marburg, República Federal Alema, (inventores: Dr. Martin Muller e Prof. Dr. Lutz Gissmann, residentes na República Federal Alema) , para f,PR0CESS0 PARA A PREPARAÇÃO DE EPÍTOPOS SORO-REACTIVOS DE PROTEÍNAS DE PAPILLOMAVIRUS 16 HUMANO (HPV)"

DESCRIÇÃO A presente invenção refere-se a regiões soro-reactivas em proteínas do Papillomavirus 16 humano (HPV), E4 , E6, E7 e Ll. A invenção re ;f ere-se ainda a uma vacina contendo péptidos com sequênci; as que abrangem as das referidas regiões : seropositivas, bem como a conjuntos ("kits") de diaj gnostico que contêm péptidos com se quências que abrangem as das referidas regiões seropositivas. 0 HPV 16 é um tipo de Papi llomavi- rus humano, descrito pela primeira vez em Proc. Natl. Acad. Sei., USA 80, 3813-3815 (1983). A sequência de DNA e a organizaçao de genoma do HPV 16 encontram-se publicadas em Virology 145, 181-185 (1985). 0 HPV 16 está intimamente relacionado nao apenas com lesões iniciais do tracto anogenital mas também como o cancro maligno do colo do útero, pénis e vulva. Além disso, o HPV 16 pode também encontrar-se em esfregaços 1

genitais obtidos a partir de indivíduos clinicamente assintomá-ticos. Pouco se sabe acerca da resposta imunológica a infecçoes causadas pelo HPV 16 e por Papillomavirus em geral. Em experiências preliminares testaram-se soros humanos obtidos a partir de pacientes de STD, de pacientes sofrendo de cancro do colo do útero e ainda de indivíduos saudaveis em relaçao a. presença de anticorpos dirigidos contra proteínas virais.

Estas proteínas exprimiram-se como fusões com diferentes pépti-dos procarióticos ligados ao seu terminal azotado e usaram- -se como antigenes em experiências de "Western-Blot". Este tipo de teste é relativamente entediante dificultando assim a análise quantitativa de um grande número de colheitas de soro. Além disso, devido â semelhança dos vários tipos de

Papillomavirus, nao se pode excluir a reactividade cruzada dos anticorpos. invenção se possam e terapia domínios um método selecçao 0 objectivo da presente é a identificação das estruturas varais do HPY16 que usar como instrumentos na profilaxia, diagnóstico de doenças humanas causadas pelo HPV16. 0 conhecimentos destes é a condição necessárias para o estabelecimento de de teste ELISA de péptidos a utilizar para a ("screening”) em larga escala de sores humanos. A presente invenção refere-se a: - Epítopos soro-reactivos da proteína E4 do HPV16, caracterizado por uma das seguintes sequências de aminoácidos:

I. IPKPSPWAPKK II. KPSPWAPKKHRRLS; do HPV16, sequências - Epítopos soro-activos da proteína E6 caracterizados por uma das seguintes de aminoácidos:

I. LSRHFMHQKRTAMFQDPQERPRKLPQ II. AMFQDPQERPRKLPQLCTELQTTIHDIILEC; 2

Epítopos soro-reactivos da proteína E6 do HPV16, caracterizados por uma das seguintes sequências de aminoacidos:

I. LSRHFMHQKRTAMFQDPQERPRKLPQ II. AMFQDPQERPRKLPQLCTELQTTIHDIILEC;

Epítopos soro-reactivos da proteína E7 do HPV16, na região genómica E7-221, caracterizados por uma das seguintes sequências de amino-ácidos:

I. PTLHEYMLDLQPETTDLYCYEQ

II. HEYMLDLQPET

III. TLHEYMLDLQPETTD IV. EYMLDLQPETTDLY;

Epítopos soro-reactivos da proteína E7 do HPV16, na região genómica E7-107, caracterizados por uma das seguintes sequências de amino-ácidos:

I. DEIDGPAGQAEPDRAHY II. GPAGQAEPDRAHYNI;

Epítopos soro-reactivos da proteína LI do HPV16, na região genómica Ll-809, caracterizados pela seguinte sequência de aminoacidos: PLLNKLDDTENASAYAANAGVDN;

Epítopos soro-reactivos da proteína LI do HPV16, na região genómica Ll-830, caracterizados por uma das seguintes sequências de aminoacidos:

I. ICTSICKYPDYIKMVSEPYGDSLFFYLRREQMFVRHLFNRAGTVG-ENVP

II. DDLYIKGSGSTANLASSNYFPTPSGSMVTSDAQIFNKPY

Epítopos soro-reactivos da proteína LI do HPV16, na região genómica Ll-842, caracterizados por uma das seguintes sequências de amino- 3

I. II. III. ácidos :

KHTPPAPKEDDPLKK

AIACQKHTPPAPKEDDPLKKYTFWEVNLKEKFSADLD LKKYTFWEVNLKEKFSADLDQF: presente invenção refere-se ainda a: por conterem um ou soro-reactivos acima - Pétidos caracterizados vários dos epítopos mencionados; - Uma vacina caracterizada por conter um ou vários dos petidos acima referidos; - Um conjunto ("kit") de diagnostico para identificação de anticorpos específicos contra as proteínas E4, E6, E7 ou LI de HPV16, caracterizado por conter os peptidos acima referidos;

Anticorpos monoclonais caracterizados por terem uma afinidade com os epítopos soro--reactivos das proteínas de HPV16 humano;

Um conjunto de diagnóstico que contenha os referidos anticorpos monoclonais;

Um meio de diagnóstico que contenha os referidos anticorpos monoclonais para a identificação de proteínas específicas de HPV16; A utilização de peptidos acima mencionados para a produção de uma vacina ou de um conjunto de diagnóstico.

Para identificar os epítopos soro-reactivos nas proteínas E4, E6, E7, e LI do Papillomavirus humano (HPV) do tipo 16, escolheu—se o método experimental descrito em Science, 228, 1315-1317 (1985). Clonaram-se aleato-riamento pequenos fragmentos do genoma virai na proteína do III do DNA de bacteriofago de cadeia simples, no sentido direc- 4

to. Identificaram-se os recombinantes positivos por comparaçao colorimétrica imunológica com os anti-soros adequados preparados contra proteínas de fusão bacterianas (Virology, 145, 181-185 (1985) e determinaram-se os epítopos por sequenciaçao do DNA inserido. Devido a algumas reacçoes do substrato, dependentes provavelmente da quantidade de anti-soro usada, apenas se pode identificar uma parte dos recombinantes inicialmente caracterizados, em testes subsequentes após isolamento e reaná-lise.

Nos casos de recombinantes repeti-damente positivos, contudo, este método revelou-se altamente especifico, uma vez que se encontraram apenas as sequências de código de leitura aberto (ORF) contra as quais se preparara originariamente o anti-soro, e na maior parte dos casos identificaram-se repetidamente as respectivas sequências (vide Tabela 3). Excepto no caso dos ORFs de E4 e de LI encontraram-se clonos coincidentes independentes continuando a utilizar o "método da biblioteca" para a expressão. Uma evidência adicional resulta de facto de se obterem resultados idênticos com anti-soros diferentes preparados em coelhos isolados ou mesmo com soros derivados de espécies diferentes. 0 epítopo 221 da proteína E7 identificou-se também com anticorpos monoclo-nais. Alem disso, verificou-se que péptidos sintéticos derivados do epítopo 107 de E7 e do epítopo de E4 reagem com vários soros humanos.

No caso do ORF de E4 apenas se verificou um tipo de recombinantes positivos. Confirmou-se o epítopo, contudo, por um método independente. Sintetizaram--se octapéptidos coincidentes cobrindo o ORF total e usaram--se para testar um anti-soro anti-E4 pelo método ELISA. Verificou-se que quatro outros péptidos cobrindo um total de 14 aminoácidos (posição 17-20) se ligaram a imunoglobulinas dos soros de coelho (Fig. 3). 0 péptido 17 está completamente contido no epítopo derivado no sentido directo (Tabela 2) mas coincide com o péptido 20 em apenas um aminoácido. Por isso, nao é claro se existem realmente dois epítopos adjacentes - 5 -

contidos na proteína E4 ou se o péptido 20 se liga a imunoglo-bulinas de um modo independente da sequência. De facto, este modo de ligaçao nao específico parece ser o caso dos péptidos 5/6 e 40 (Fig. 3) uma vez que os octapéptidos adjacentes coincidentes em seis aminoácidos sao completamente negativos. Alem disso, apenas o péptido sintético derivado da região reactiva a volta do péptido 20 mas nao de outras regiões (Fig. 3) se verificou reagir com o anti-soro de coelho no teste ELISA. Por isso, a ligaçao nao específica devida a alguns produtos aberrantes sintétizados nas partes plásticas poderá ser a razao da reacçao positiva nas posiçoes 5/6 e 40.

Os métodos utilizados na presente invenção permitem apenas a identificação de epítopos lineares mas nao conformacionais. Assim, fica em aberto a questão se no interior das proteíans nativas estas regiões estão realmente expostos ao sistema imunológico. No caso dos epítopos de E7 isto parece ser muito provável porque sao complementarmente coincidentes com as regiões prováveis de ligaçao de E7 à proteína do retinoblastoma ou âs regiões imediatamente adjacentes e uma vez que se verificou que o oligopéptido respectivo reage com soro humanos. Fez-se uma observação semelhante para o péptido do ORF de LI completamente contido na região Ll-830 (Tabela 2).

Os epítopos identificados podem utilizar-se como antigenes para a selecçao ("screening") de soros humanos em relaçao à presença de anticorpos anti- HPV16. Ê uma questão importante neste contexto saber se numa determinada proteína todos os epítopos foram identificados. Nos sistemas animais a pré-incubaçao dos soros com os pêptidos sintéticos dos epítopos de E4 e E7 antes da reacçao com as respectivas proteínas de fusão em experiências de Western-Blot resultou numa quase total perda do sinal (ver também Fig. 3) que indica que nao se falhou nenhum epítopo importante.

Os epítopos identificados das diferentes proteínas de HPV16 podem ser úteis como reagentes para definir o tipo de anticorpos presentes em pacientes com 6

doenças causadas pelo HPV bem como em controles sanitários. Cadeias e fogos bacterianos: utilizou-se o derivado filamentoso do fogo-fusao 1 (fd-tet-J6); (Science 228, 1315-1317 (1985),

Gene 73, 305-318 (1988)) como sistema de expressão para os fragmentos de DNA genómico de HPV16 na única posição PVUII da fusaol. Para a transformaçao com o vector da fusão 1 utili-zou-se a estirpe K802 de E-coli (F galK2 galT22 metBl supE44 hsdr2) (J. of Molec. Biol. 16, 118-133 (1966)). As colánias resistentes à tetraciclina produzem bacteriofagos que nao sao infecciosos para esta estirpe devido ao seu fenotipo-F.

Para o desenvolvimento dos fogos recombinantes utilizou-se a estirpe K91 de E.coli (F+, derivado de K38; Virology 49, 45-60(1972)). Efectuou-se a transformaçao bacteriana de acordo com J. of Molec. Biol. 166, 557-580 (1983). A inserção de um fragmento de DNA do tamanho de 3n + 2 nucleótidos sem codoes stop internos para a translaçao restaura uma mutaçao de estrutura no gene III no sentido directo que impede a produção de prole infecciosa.

Anti-soros: utilizaram-se anti- -soros policlonais de coelho preparados contra uma polimerase MS2 (Virology 145, 181-185 (1985)) ou uma proteína de fusão E4 de CII-HPV16 ou dirigidos contra uma proteína de fusão de polimerase MS2/E7 de HPV16. A parte de fusão E7 inclui os aminoácidos das posiçoes 585 a 855, as partes de fusão E4 os aminoácidos das posiçoes 3399 a 3617 do genoma de HPV16. Usaram-se dois anticorpos monoclonais diferentes anti E7 dirigidos contra a mesma proteína de fusão (E7 II e E7 IV, J. Gen. Virol. 68, 2933-2938 (1987)). 0 anti-soro anti-HPVl6 E6 preparou-se contra uma fusão de polimerase MS2 contendo a parte principal do ORF de E6 (posiço 110 a 556, Virology 145, 181-185 (1985)).

Utilizaram-se dois anti-soros policlonais de coelho diferentes, preparados contra a parte N-terminal (Ll/1: posição 5692 a 6819) e C-terminal (posição 6819 a 7152) da LI de HPV16 fundida com o terminal azotado da polimerase MS2 (Virology 145, 181-185 (1985)). 7

Preparaçao de biblioteca de expressão da fusão 1 de HPV16: Trataram-se por ultrassons 5 g de DNA plasmídeo de HPV16 durante 120 segundos ate se obter um fragmento de tamanho de aproximadamente 1 kb e continuou a digerir-se até cerca de 300 bp (pares de bases) com 0.02 - -2 unidades de DNase I durante 10 minutos a 15°C na presença 2+ - de Mn 10 mM. A DNase I fora diluida e pre-incubada durante 1 hora num tampao contendo 50 mM Tris, a pH 8,0, 10 mM MnC12 e 0.1 mg/ml de BSA.

Para obter extremos planos trataram-se os fragmentos de DNA durante 60 minutos a 15°C com 15 unidades de polimerase T4 e 10 unidades de DNA ligase de E.coli e 100 M de cada um dos quatro desoxirribonucleótidos. Ligou-se então o DNA na única posição PVUII da fusão 1. Transformaram-se células de E. coli k802 (F-) adequadas com o DNA ligado e colocaram-se em placas LM. Obtiveram-se aproximadamente um total de 3x104 colónias produtoras de fagos resistentes à tetraciclina, a partir de oito experiências diferentes. Para obter os fagos recombinantes lavaram-se as colónias com LM. Desta amplificaçao resultaram oito bibliotecas diferentes cora um número total de aproximadamente 5x1012 partículas infec-ciosas mas levou também a uma subrepresentaçao de certos recombinantes .

Centrifugaram-se as suspensões de fagos a aqueceram-se durante 10 minutos a 65°C para remover as bactérias remanescentes. Salvo indicaçao am contrário guardaram-se separadamente esta bibliotecas amplificadas e utilizaram-se para as experiências seguintes.

Selecção imunológica: Desenvolveram-se entre 2000 e 6000 fagos com 0,2 ml de células K91 em crescimento exponencial em 3.5 ml de agarose a 0.5% contendo 10 mM MgS04 em placas de agar mínimas. Tiraram-se réplicas em nitrocelulose e incubaram-se depois em placas mínimas frescas durante 6 horas a 37°C para aumentar os sinais. Depois bloquearam-se os filtros durante 60 minutos em PBS de leite 8

a 5% contendo uma diluição de 1:100 a 1:1000 de anti-soros específicos de HPV (pré-adsorvidos com células K91 tratadas com ultrassons) ou de anticorpos monoclonais. Lavaram-se então os filtros 5 vezes durante 5 minutos em PBS/0.1% de Tween 20 e incubaram-se durante 3 horas à temperatura ambiente com anticorpos de peroxidase anti-coelho (ou anti-rato) de cabra (1:1000) em leite magro a 5%. Após a lavagem revelaram-se os filtros em 50 ml de PBS contendo 30 mg de diaminobenzidina, 30 ml de ^02 e 1.5 ml de NiSO^. Finalmente lavaram-se os filtros em H^O durante 30 minutos e secaram-se em papel.

Preparaçao de DNA de cadeia simples de recombinantes da fusão 1: Seguiu-se um protocolo semelhante ao descrito anteriormente (proc. Nat. Acad. Sei. USA 74, 5463--5467 (1977)). Inocularam-se 50 ml de LM com E. coli K91 resistente a tetraciclina no plasmídeo da fusão 1 e incubou-se durante 16 horas a 37°C. Peletizaram-se então as bactérias a 6000 rpm durante 30 minutos. Após adicionar 2 ml de PEG 6000 a 40% e 2 ml de acetato de sódio 5M, a pH 6.5, à camada sobrenadante, precipitaram-se os fagos durante 60 minutos a 0^C e sedimentaram-se a 6000 rpm durante 60 minutos. 0 pele-tizado ressuspendeu-se e 0.3 ml de TE. Após duas extraeções com fenol precipitou-se o DNA. Utilizaram-se aproximadamente 25% destas preparações para uma reacçao de sequênciaçao.

Sequênciaçao: Para a sequênciaçao do DNA utilizou-se o protocolo padrao VSB(United States Bioche-micals) (USB, 1987) e substituiu-se o marcador ("primer") universal por um oligonucleótido de 20 unidades (5'-TCCAGACGTT-AGTAAATGAA-3'). Na Fig. 1 mostra-se um exemplo de uma reacçao de sequênciaçao. Síntese peptídica: Sintetizou--se um conjunto de péptidos coincidentes correspondentes ao ORF da E4 de HPV16 num substrato de polietileno, seguindo essencialmente a estratégia descrita em Proc. Nat. Acad. Sei. 82, 178 (1985); Proc. Natl. Acad. Sei. 81, 3998 (1985).

Os pólipos de polietileno derivati- 9

tizados com beta-alanina foram obtidos da CRB, Inglaterra. Como alternativa ao processo recomendado por Geysen a sequência proteica dividiu-se em péptidos de oito membros coincidentes em seis unidades e efectuou-se a síntese utilizando a química Fmoc e activaçao in situ por BOP (reagente de Castro) (Tetrahedron Lett. 14, 1219 (1975)). As soluções dos derivados Fmoc de aminoácidos (6 micromoles) de BOP e de N-metilmorfolina distribuiram-se por tabuleiros reaccionais de polietileno (CRB) de acordo com a sequências peptídicas a sintetizar. Todas as outras reacçoes se efectuaram de acordo com o protocolo CRB. Como controle positivo sintetizou-se o péptido RPDYLDFA juntamente com os péptidos específicos do HPV16 e testou-se com um anti-soro adequada pelo método ELISA. ELISA com octapéptidos: detecçao de anticorpos em octapéptidos acoplados a pólipos:

Todos os testes se efectuaram-em péptidos ligados covalentemente os pólipos de polietileno onde foram originalmente sintetizados. Utilizaram-se séries de 86 polipos fixadas numa configuração que permite a inserção nos orificios de um tabuleiro de microtitulaçao. AS incubações para o teste ELISA efectuaram-se durante a introdução dos pólipos nos orifícios. Lavaram-se as placas com metanol em PBS e bloquearam-se depois com 0.25% de gelatina, 0.1% de Tween 20 em PBS durante 2 horas a 37°C seguido por incubaçao com soros diluidos a 1:200-1:4000 em 0.125% de gelatina, 0.05% de Tween 20 durante 1 hora a 37°C. Após lavagem com PBS/0.1% de Tween 20 incubaram-se os pólipos durante 1 hora a 37°C com proteína A-peroxidase 1:4000 seguido por lavagem posterior e revelaçao com tetrametilbenzidina (TMB; V.R. Holland et al. (1974), Tetrahedron 30, 3299-3302) durante 15 minutos. A revelaçao terminou-se retirando as placas do corante e adicionando 100 ml de I^SO^ o.5M. Mediu-se a absorçao num leitor ELISA automático. Para remover o complexo de anticorpo/enzima após o teste ELISA trataram-se os pólipos com ultrasson durante 1 hora (banho maria, 30W, 48kHz) a 60°G em PBS/1% SDS/0.1% β-mercaptoetanol e lavaram-se finalmente com metanol. A eficiên- 10

cia do processo de interrupção testou-se por ELISA usando proteína A-peroxidase sem soro primário. Utilizaram-se os mesmos péptidos mais de 40 vezes em testes ELISA subsequentes.

Breve descrição das tabelas e figuras:

Tabela 1:

Inserções de DNA de HPV16 representando a região imunogénica 221 da E7 de MPV16. Os clonos E7--1 a E7-4 identificaram-se com um anti-soro policlonal do coelho anti E7. Os clonos do grupo E7-4 sao idênticos aos identificados com o anticorpo monoclonal de rato (tipo II) descrito em J. Gen, Virol. 68, 2933-2938 (1987).

Tabela 2:

Regiões imunogénicas das proteínas E4, E6, E7 e LI de HPV16. As regiões de E6, E7 e Ll-842 estão representadas em diferentes clonos no sentido directo. Para a proteína E4 mostra-se também o epítopo identificado pelos octapéptidos coincidentes. Indicam-se as posiçoes de nucleóti-dos correspondentes dos primeiros aminoácidos e os últimos nucleotídos dos últimos aminoácidos. 0 clono 830, que abrange a região imunogénica Ll-830 codifica para 88 aminoácidos. Apresenta-se apenas em parte a sua sequência. 0 numero de clonos individuais que representam as regiões imunogénicas indica-se na última coluna.

Fig. 1:

Auto-radiograma de uma reacçao sequencial de clono 107 no sentido directo (ver Tabela 2). Mostram-se a sequência de DNA da inserção do clono obtida com o marcador ("primer") de sequênciaçao, as respectivas sequências codificantes, bem como os aminoácidos translacciona-dos. As letras maiúsculas indicam a parte de HPV16 da sequência de DNA.

Fig. 2:

Inibição da revelaçao imunológica 11

da proteína de fusão MS2 polimerase/E7 sz HPV16 com anticorpos monoclonais por bacteriofagos contendo a região imunogénica E7-221,

Bandas de "Western Blot" reveladas com o anticorpo monoclonal do tipo IV contra E7 de HPV16. 0 anticorpo foi pré-adsorvido com preparaçao de diferentes clonos fagos e incubado com as bandas contendo a proteína de fusão E7 de HPV16/MS2. Apenas as preparações das partículas de fago de clono 221 (bandas b e d; concentrações diferentes de partículas de fago usadas para absorpçao; para os números dos clonos ver Tabela 1) ou do clono 108 (banda e) reagiram com os anticorpos monoclonais impedidndo assim a reacçao com a proteína de fusão nas bandas. Os clonos 209 (bandas e e f, concentrações diferentes de partículas de fagos) ou 212(g) nao interferem com a revelaçao da proteína. Na banda a os anticorpos foram pré-absorvidos sem partículas de fagos, na banda h foram incubados com partículas contendo uma inserção nao relacionada com as sequências de E7.

Fig. 3:

Teste ELISA de octa péptidos coincidentes representando o ORF da E4 de HPV16. Os 45 péptidos incubaram-se primeiro com um anti-soro policlonal de coelho conta z E7 de HPV16 seguido por incubação com complexo de proteína A-peroxidase. Revelaram-se os péptidos como descrito acima e determinou-se o coeficiente de extinção. Obtiveram--se resultados muito semelhantes em quatro experiências diferentes usando dois anti-soro individuais.

Exemplo 1

Identificação de epítopos na proteína E7 de HPV16 usando a biblioteca de expressão no sentido directo

Golocaram-se aproximadamente 25000 bacteriofagos recombinantes, obtidos a partir de bibliotecas de expressão no sentido directo de HPV16, construídas separada- 12

mente, em células de E.coli, como descrito acima. Identificou-se um total de 230 recombinantes por selecçao ("screeninig") com um anti-soro policlonal de coelho dirigido contra uma proteína de fusão MS2 polimerase/E7 de HPV16. Desenvolveram-se individualmente 54 destes recombinantes e re-seleccionaram-se, 31 dos quais permaneceram positivos após 2 a 3 selecçoes subsequentes e analisaram-se posteriormente: Produziram-se partículas de bacteriofago e preparou-se o DNA de cadeia simples e usou-se para sequênciaçao como descirto acima. Os resultados apresentam-se na Tabela 1. Todos os 31 clonos fagos revelaram conter sequências específicas da E7 de HPV16 representando duas regiões genómicas diferentes (E7-221 e E7-107) no ORF de E7. A região E7-221 é representada por 22 clonos que se dividem em 4 grupos de diferentes tamanhos. 0 grupo E7-1 consiste num único isolado de 68 nucleótidos (bp 576 a bp 643). Os grupos E7-2, -3 e -4 sao representados por 3,9 e 9 clonos, respectivamente, sendo todos mais curtos do que o clono E7-1 e coincidem entre as posições de nucleótido 589 a 618. Por isso, o epítopo mais pequeno identificado é representado pela sequência de aminoácidos EYMLDLQPET. A região E7-107 é representada por 9 clonos de duas classes diferentes coincidindo em 41 nucleótidos e o epítopo resultante tem a sequência GPAGQAEPNR-AHY (bp 679 a bp 711, Tabela 2).

Exemplo 2

Identificação de epítopos da proteína E6 de HPV16 A0 contrário do caso de E7 nao foi possível identificar os bacteriofagos positivos de E6 por selecçao de um número equivalente de recombinantes, como acima, com um anti-soro policlonal de coelho preparado contra a proteína de fusão de MS2 polimerase/E6 de hPV16. Isto pode explicar-se por uma subrepresentaçao desses clonos na biblioteca de fagos obtida a partir das colonias originais. 13

Para identificar os fagos reactivos de E6 ligou-se a fracçao de imunoglobulina do soro de coelho anti-E6 a proteína A-Sepharose. Incubaram-se aproximadamente 1010 bacteriofagos, obtidos como uma mistura de sete diferentes bibliotecas de hPV16 construída por ligaçao individual de DNA de hPV16 cortado e digerido por DNase, do plasmídeo em sentido directo, com os complexos de proteína A-sepharose--imunoglobulina. Os bacteriofagos ligados especificamente eluiram-se e desenvolveram-se em E.coli K91. Obtiveram-se aproximadamente 3000 áreas. Para amplificaçao suspenderam--se os fagos e desenvolveram-se de novo.

Para testar a eficiência do passo de enriquecimento desenvolveram-se quantidades idênticas de recombinantes eluídos da coluna de proteína A e hibridizaram--se com amostras de DNA de HPV16 específicas do 0RF de E6 (24-654) ou de E4 (2714-3693). Por comparaçao com a hibridaçao dos recombinantes originais calculou-se um enriquecimento de aproximadamente 20 vezes dos fagos positivos de E6. Uma vez os recombinantes imuno-reactivos exprimem apenas uma parte da proteina E6 (ver abaixo) assumiu-se que esses recombinantes sao ainda menos abundantes na biblioteca original e assim o factor de enriquecimento é maior. De facto, obtiveram-se cerca de 300 sinais positivos quando se seleccionaram os fagos com os mesmo anti-soro E6 usado para a coluna de proteína A. Re-seleccionaram 14 dos recombinantes positivos, 9 dos quais se analisaram-se finalmente por sequenciaçao de DNA e mostraram pertencer a duas classes diferentes representando uma região do 0RF da E6 de HPV16. A sequência coincidente (bp 101 a 145) codifica para o epítopo AMFQDPQERPRKLPQ.

Exemplo 3 epitopos da proteína LI Seleccionaram-biblioteca de

Identificação dos proteína LI de HPV16

Identificaram-se na de HPV16 três regiões imunogénicas diferentes, -se 20000 bacteriofagos recombinantes de uma 14

N-terminal do ORF da LI de HPV16 (bp 5695 a 6818). Re-seleccio-naram-se 25 de entre 80 sinais positivos e sequenciaram-se 11 deles. Verificou-se que três clonos continham um fragmento idêntico do ORF da LI de HPV16, i.e. da posição 5998 a 6066, codificando para o péptido PLINKLDDTENSASAYAANAGVDN (Ll-808; Tabela 2) Todos os outros oito clonos continham uma inserção (posição 6307-6570) codificando para um péptido I com o comprimento de 88 aminoácidos (CTSICKYPD---SDAQIFNKPY; Ll-830).

Da selecçao de 8000 recombinantes da mesma biblioteca de hPV16 com um anti-soro policlonal de coelho dirigido contra a parte C-terminal de LI de hPV16 (bp 6818 a 7152) resultaram 52 recombinantes positivos. Seis deles foram confirmados por selecçao repetida e sequenciaram-se as suas inserções. Todos os clonos pertenciam á mesma região imunogénica (Ll-842, Tabela 2). A inserção de dois clonos (842, de 6922 a 6966) codifica para o péptido KHTPPAPKEDDPLKK que coincide em três aminoácidos com a inserção do clono 877 (6958-7023) que codifica para o pétido LKKYTFWEVNLKEKFSADLDQF. Um terceiro grupo de recombinantes (905; de 6907 a 7017) representado por quatro clonos coincide com os clonos 842 e 877 e codifica para o péptido de 37 unidades (AIACQKHTPPAPKEDDPLKK-YTFWEVNLKEKFSADLD). Uma vez que a sequência commun aos três clonos consiste em apenas três aminoácidos (LKK) há provavelmente duas posiçoes de ligaçao independentes na região Ll--842 (6907-7023) embora nao se possa excluir a existência desse curto epítopo.

Exemplo 4

Identificação de epitopos na pro- teína E4 de hPV16

Para identificar os epitopos de E4 utilizou-se a mesma biblioteca que para LI. Por selecçao com um soro anti-E4 preparado contra uma proteína de fusão MS2 identificaram-se 28 recombinantes. Analisaram-se 3 deles por sequenciaçao e verificou-se conterem a inserção específica do ORF da E4 de HPV16 (posição 3422 a 3456) correspondente 15

ao péptido IPKPSPWAPKK.

Exemplo 6

Identificação da posição de ligaçao de um anticorpo monoclonal de rato anti E7

Como descirto para a identificação de epítopos específicos de E6 ligaram-se 1010 fagos, obtidos a partir de sete diferentes bibliotecas de HPV16 no sentido directo, a complexos de proteína A-Sepharose-IgG (monoclonal de rato). Após eluiçao obtiveram-se aproximadamente 300 recom-binantes, desenvolveram-se e suspenderam-se em LM. Selecciona-ram-se 500 recombinantes desta sub-biblioteca com o anticorpo monoclonal anti E7 de HPV16 designado por II. Sequenciaram--se dois dos clonos após três passos de re-selecçao. Ambos os clonos continham uma inserção idêntica a dos clonos do grupo 4 da região imunogénica 221 do 0RF da E7 de hPV16 (Tabela D. A fim de determinar se os vários clonos da região imunogénica 221 se ligam a anticorpos monoclo-nais anti E7 do HPV16 efectuaram-se testes de competição. Revelou-se a proteína de fusão MS2 polimerase/E7, em bandas de "Western Blot", com dois anticorpos monoclonais diferentes (E7 II e E7 IV, J. Chem. Virol. 68, 2933-2938 (1987)). Utilizaram-se partículas de bacteriofago recombinantes purificadas contendo epítopos dos grupos 1 a 4 (Tabela 1) para pré-adsorp-çao dos anticorpos monoclonais antes da imuno-revelaçao do "Western Blot". Nao se observou diferença quando se utilizou 0 anticorpo ' monoclonal E7 IV para revelaçao. Como se mostra na Fig. 2 apenas as partículas d e bacteriofago dos grupos 1 e 4 impedi em a ligaçao do anticorpo monoclonal E7 II à proteí- nq E7. Por isso, concluiu-se que ex iste pelo menos uma posiçao de ligaçao adicional para anticorpos adjacente ao epítopo EYMLDLQPET da região imunogénica E7- 221 acima descr ita.

Exemplo 6

Identificação de regiões imunogéni-cas na proteína E4 de HPV16 por teste dos péptidos coincidentes. 16

representando o ORF da E4 de hPVló em pólipos de polietileno, * , , <» , como descrito acima. Os peptidos coincidiam em seis aminoaci- dos, representando deste modo o péptido número 1 os aminoacidos 1 a 8 do ORF de E4 de HPV16, o péptido número dois os aminoacidos 3 a 10, e assim sucessivamente. Incubaram-se os peptidos com o anti-soro policlonal de coelho dirigido contra uma proteína de fusão MS2/E4 de HPV16 acima mencionada. Detectaram--se imunoglobulinas de coelho por incubaçao com complexos de Proteína A-peroxidase, seguida por revelaçao com TMB como descrito na parte "Materiais e Métodos". Como se mostra na Fig. 4 obteve-se um aglomerado ("cluster") maioritário de peptidos que se ligam a anticorpo com o anti-soro de coelho. Este aglomerado inclui o péptido KPSPWAPKKHRRLS do ORF da E4 de HPV16. Esta sequência está parcialmente incluída na região reactiva identificada por imuno-selecçao (Tabela 3). Do teste dos pêptidos com um anti-soro de coelho, preparado idependentemente, dirigido contra uma proteína de fusão CII/E4 de HPV16, resultou uma situaçao muito semelhante comparada com a obtida com o ant :i-soro ant i- MS2/E4 (re ‘sultados nao 9 o co trados). A incubaçao com soro de coelho de controle ou com proteína A-peroxidai se apenas, não deu orij gem a sinais sig; nificativos . Obtiveram-se sinai s adicionais com pépti dos iso lados (p. e x. péptido ns 40; ver fig. 3), muito semelhant es, nao indicando um epitopo específico de ligaça o a imunoglobu li na, uma vez que, ao co ntrario do péptido KPSPWAPKKHRLS, os •H I—1 O gopéptidos sintéticos derivados destas re giõe s nao rea gem com os anti-so ros no test e ELISA (re sultados n ao a presentado s). 17

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Continua 19

Tabela 2, continuação

co 00 0-3 -tf 1—1 CO CN O r-. cu O P3 Ω Γ 1 ιο Pd Ph cO eu titi θ' jo 1 titi Ω cO >u cO > Ω o Pu o P3 Ω cu Pd Ό S <3 1 titi co titi Ω Pu CO Pu cO Ω cu EH Pu H pQ > 1 l>u Pd O* Pd o Pd P3 <a3 Pd <3 Pd Pd ti Ω titi 1-1 titi CO Pu <1 Ph titi 1 Ω <3 1 Ω > 1 Ω >u 1 Ω W ·· ·· 1 ·· w <! 1 P3 12 cO cO 1 vO Pd i—i CO i—1 1 3-I Pd Pu 1 Ph > <3 > 1 > Ph Eh Pu Ph 1 Ph <d titi titi w 1 «d >h 1 Ph <u P3 cu ti <U Ph Pd Ό Ό X) Ph E-i Pu Ph Pd i—i rH !—1 EH Ω Ω titi K-I Ι-Ί EH Ω ____ w 1 Ω Pd titi I-p CO oc O CSJ Pd !-1 LO o i-3 CO o St* 1 Pd O Ω 00 00 00 CN r- cO 1 Pd 1 H 1 CN θ' cu & 1—1 r—) r—1 ON pQ pQ Ω titi i-3 CO 1-1 CO u 1 CU Ω cd titi cd Η cd pO <3 U O υ Ω •H i-3 •H O •H H tí G ti Ω ' (U P-l 'CU H 'CU <3 M 1 M 1 « 1 <1 O 00 O Γ- O r- ti ON C o G o CO ti Ω 3 CO ti σ> S m S cO B CO Pu H cu •H CU •H cu O pO Pd O O O 1 cd t Cd t cd •H H •rl 01 0£ O ac CN LO I-h CU o CU CO cu -4· o O P3 00 Pti 00 pí CO 00 - 20 -

Claims

- Ia - Processo para a preparaçao de um conjunto de diagnóstico ("Kit") para a identificação de anticorpos específicos contra proteínas HPV16, E4, E6, E7 ou Li, caracterizado por se ligarem de forma covalente peptidos contendo um ou mais dos seguintes epítopos: I. IPKPSPWAPKK (E4) II. KPSPWAPKKHRRLS. I. LSRHFMHQKRTAMFQDPQERPRKLPQ (E6) II. AMFQDPQERPRKLPQLCTELQTTIHDIILEC. I. PTLHEYMLDLQPETTDLYCYEQ II. HEYMLDLQPET III. TLHEYMLDLQPETTD (ET) IV. EYMLDLQPETTDLY -221 I. DEIDGPAGQAEPDRAHY (E7) II. GPAGQAEPDRAHYNI. -107 PLLNKLDDTENASAYAANAGVDN. (Ll) -809 I. ICTSICKYPN—SNAQIFNKPY II. ICTSICKYPDYIKMVSEPIGDSLFFYLRREQMF (LI) VRHLFNRAGTVGENVPDDLYIKGSGSTANLASS -830 NYFPTSSGSMVTSDAQIFNKPY I. KHTPPAPKEDDPLKK II. AIACQKHTPPAPQEDDPLKKYTFWEVNLKEKFS (LI) ADLD -842 III. LKKYTFWEVNLKEKFSADLDQF a uma fase sólida, de forma a que os anticorpos dirigidos 21 aos referidos epítopos sejam detectaveis por técnicas de ensaio imunológico. - 25 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o "Kit" diagnostico preparado ser do tipo ELISA. - 3â - Processo para a preparaçao de um "Kit" diagnóstico para detectar epítopos específicos de HPV16, caracterizado por um ou mais dos epítopos referidos na reivindicação 1, produzirem anticorpos monoclonais que se ligam subsequentemente a uma fase sólida de modo a ser possível detectar os epitopos específicos referidos. - 4a - Processo para a preparaçao de uma vacina contra o HPV16, caracterizado por se misturar um ou mais dos epítopos referidos na reivindicação 1 com veículos e aditivos adequados. A requerente reivindica a prioridade do pedido de patente europeia apresentado em 20 de Março de 1990, sob o nQ 90105222.5. Lisboa, 19 de Março de 1991

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