JP2559482B2 - Ｈｔｌｖーｉペプチド抗原および分析法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 1.技術分野 本発明は、一般に、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型
（HTLV−Ｉ）に関し、さらに詳細には、HTLV−Ｉに感染
した個体に存在する抗HTLV−Ｉ抗体に対して免疫反応性
を有する組換え体ペプチド抗原に関する。

2.参考文献 Huynh,T.V.ら、“DNA Cloning.Volume 1"D.M.Glover
編、ワシントンD.C.:IRLプレス、1985（チャプター２） Maniatis,T.ら、Molecular Cloning:A Laboratory Ma
nual,Cold Spring Harbor Laboratory（1982） Matsushita,S.ら、Proc Natl Acad Sci（USA），83:2
672（1986） Miyoshi,I.ら、Nature，294:770（1981） Poiesz,B.J.ら、Proc Natl Acad Sci（USA），77:741
5（1980） Popovic,M.ら、Science, 219:856（1983） Seiki,M.ら、Proc Natl Acad Sci（USA），80:3618
（1983） 3.発明の背景 ヒトＴ細胞白血病ウイルス（HTLV）は、３種類の既知
のメンバーの一群のＴ細胞レトロウイルスである。HTLV
I型（HTLV−Ｉ）は、インビトロで形質転換活性を有
し、病因論的に、成人Ｔ細胞白血病と関連がある。この
成人Ｔ細胞白血病は、世界のいくつかの地域に固有なも
のとして知られている。HTLV−IIはインビトロで形質転
換能を有する、他のレトロウイルスであり、毛様細胞性
白血病にかかった患者のＴ細胞変種から単離されてい
る。HTLV−IIIは、リンパ節症関連ウイルスとも呼ば
れ、現在ではヒト免疫不全症ウイルス（HIV）として知
られ、ある種のＴ細胞に対して溶解性を有し、病因論的
には後天性免疫不全症候群（AIDS）に関連している。HT
LV−ＩおよびHTLV−IIとは異なり、HTLV−IIIは、イン
ビトロでの形質転換活性を有していないことが知られて
いる。

HTLV−Ｉに対して反応性を有するモノクローナル抗体
（Mab）が、すでに報告されている（Matsushita）。0.5
αと呼ばれるその抗体は、HTLV−Ｉに感染したＴ細胞の
細胞膜に結合し、補体の存在下で細胞溶解を起こすIgG₁
Mabである。電気ブロット法による研究により、このMab
はHTLV−Ｉの主要エンベローブタンパクと反応すること
が示されている（Matsushita）。このタンパクはgp46と
呼ばれており、env遺伝子産物の外膜の成分である。プ
ロウイルスHTLV−Ｉのゲノムが単離され、その全体の配
列が決定されている（Seiki）。競合阻害結合分析法を
用いると、成人Ｔ細胞白血病の15名の患者のうちの15名
が、粉砕されたHTLV−ＩビリオンにこのMabが結合する
のを阻止する抗体を有することが観察された（Matsushi
ta）。この抗体は、HTLV−IIもしくはHTLV−IIIのビリ
オン、または感染細胞には結合しないようである。

上記の研究は、HTLV−Ｉ感染症の診断に抗HTLV−Ｉ抗
体を用いる可能性を示しているが、この方法には２つの
大きな欠点がある。第１に、分析システムが比較的面倒
であり、HTLV−Ｉビリオン、感染細胞、もしくは分画さ
れたgp46タンパクの起源と；競合結合分析法フォーマッ
トに組み合わせた抗HTLV−I Mabとの両者が必要であ
る。第２に、全ビリオンまたはその分画されたタンパク
でさえも、１を超える数のエピトープ特異的抗HTLV−Ｉ
抗体と反応するようであり、そのため、この試験法の感
度と特異性とが低下する。

4.発明の要旨 従って、Ｔ細胞白血病に感染した患者を含むHTLV−Ｉ
に感染したすべての患者に存在することが知られている
抗体と免疫反応性であり、HTLV−Ｉ感染症のある段階の
病状を特異的に示す１またはそれ以上のHTLV−Ｉペプチ
ド抗原を提供することは、HTLV−Ｉ感染症を診断するの
に有用である。このような抗原は、HTLV−Ｉ感染症の病
状を示す抗体を迅速に測定するための、単純な固相抗体
結合分析法もしくは均一系抗体結合分析法に使用され得
る。本発明のひとつの一般的な目的は、HTLV−Ｉ関連Ｔ
細胞白血病にかかっている患者に存在する抗HTLV−Ｉ抗
体に特異的なHTLV−Ｉペプチド抗原を提供することにあ
る。

本発明の他の目的は、そのような抗原を用いる、簡単
かつ迅速で比較的安価な免疫分析法を提供することにあ
る。

本発明には、（ａ）HTLV−Ｉエンベロープタンパクgp
46由来で、（ｂ）Ｔ細胞白血病の個体中に存在する抗HT
LV−Ｉ抗体と免疫反応性の組換え体ペプチド抗原が含ま
れる。この抗原はグリコシル化されておらず、そして、
好ましくは、次のアミノ酸配列を含む:Leu−Leu−Val−
Asp−Ala−Pro−Gly−Tyr−Asp−Pro−Ile−Trp−Phe−
Leu−Asn−Thr−Glu−Pro−Ser−Gln−Leu−Pro−Pro−
Thr−Ala−Pro−Pro−Leu−Leu−Pro−His−Ser−Asn−
Leu−Asp−His−Ile−Leu−Glu−Pro−Ser。

本発明の他の態様では、この抗原は、好ましくは、Ｔ
細胞白血病の個体を含むHTLV−Ｉに感染した個体の血清
中に存在する抗体と免疫反応性である。

本発明にはまた、被検個体中のHTLV−Ｉ感染症を検出
するシステムと方法とが含まれる。その方法を実施する
際には、上記のタイプの抗原を、被検個体由来の血清と
反応させ、次いで結合した抗体の存在が試験される。そ
の分析システムは固相式であってよく均一系であっても
よい。上記固相式においては、抗原が固体支持体に保持
されており、上記均一系においては、抗原がレポーター
と結合し、抗原に結合する抗体がレポーターシグナル
（これが検出される）を変化させる。

さらに他の態様においては、本発明には、Ｔ細胞白血
病に対して個体を免疫化するワクチンが含まれる。この
ワクチンは、薬学的に受容され得るアジュバント中に上
記のタイプの組換え体ペプチドを含有している。

本発明の上記およびその他の目的と特徴は、本発明の
下記の詳細な説明を添付図面を参照して読めばより充分
に理解されるであろう。上記図面のＡにおいては、HTLV
−Ｉゲノムの一部分が示され、Ｂにおいては、本発明の
３種のペプチド抗原をコードするヌクレオチド配列に対
応するゲノムの拡大領域（expanded regions）が示さ
れ、そしてＣにおいては、この３種のペプチド抗原の遺
伝子配列とそれに対応するアミノ酸配列とが示されてい
る。

発明の詳細な説明 I.HTLV−Ｉペプチド抗原の調製 この項では、HTLV−Ｉ関連Ｔ細胞白血病の個体に見出
される抗HTLV−Ｉ抗体と免疫反応性を有するHTLV−Ｉペ
プチド抗原の調製について述べる。この抗原は、適切な
発現ベクターにクローン化され次に免疫反応性ペプチド
の発現について抗体で選択された、長さが100〜300塩基
対のランダムHTLV−Ｉ遺伝子配列を用いて調製される。

A.HTLV−Ｉゲノムライブラリー HTLV−Ｉのゲノムライブラリーは、HTLV−Ｉプロウイ
ルスゲノムを含有する細胞DNAから、従来の方法で調製
される。二本鎖DNAは、HTLV−Ｉウイルスに感染してい
ることが知られている患者から単離されたＴ細胞または
既知の細胞系を含む、HTLV−Ｉ感染細胞から調製され
る。上記既知の細胞系としては、例えば、HUT102−B2
（Poiesz）、MT−２（Miyoshi）、およびMJ−腫瘍（Pop
ovic）細胞（これらはすべてHTLV−Ｉウイルスを産生す
ることが知られている。）がある。ウイルスのゲノムが
これらの細胞の宿主DNAに組み込まれている。HTLV−Ｉ
ゲノムを含有する細胞系の調製法は前記文献に詳細に記
載されている。

上記細胞系由来の全宿主ゲノムDNAは、15〜20キロ塩
基の大きさの範囲の部分消化断片を産生する条件下で、
Hae IIIまたはAlu Iのようなフリークエントカッター
（frequent cutter）で部分的に消化され、得られた消
化産物を、例えば、スクロース勾配遠心分離法で分画し
て15〜20キロ塩基の断片が単離される。得られた断片
は、次いで適切なクローニングベクター、好ましくは15
〜20キロ塩基の挿入物を有効に組み込むことができるフ
ァージのクローニングベクター，にクローン化される。
好ましい方法においては、単離された断片は、EcoRIメ
チラーゼで処理され、次にそれらの末端に、標準条件下
（Maniatis）で、EcoRIリンカーが連結され、次いで、
唯一のEcoRI挿入部位を有するλシャロン4aのようなフ
ァージベクターにクローン化される。

得られたクローン化ゲノム断片は、全コピーHTLV−Ｉ
ゲノムの，選択された配列に相補的はプローブでスクリ
ーニングされる。選択された配列のための、放射能標識
された合成オリゴヌクレオチドプローブの調製法と同様
に、HTLV−Ｉの配列も公知である（Seiki）。さらに、
特定の配列の合成オリゴヌクレオチドは、Synthetic Ge
netics,Inc.（カリフォルニア州、サンジエゴ）により
提供されるような商業的サービスにより調製され得る。
このようなオリゴヌクレオチドプローブを用いて、HTLV
−Ｉ配列を含む分子クローンは、標準的なハイブリダイ
ゼーション法（Maniatis,322頁）によって、上記ライブ
ラリーから単離される。このクローンは、まず、制限部
位分析法により分析され、全ウイルスゲノム配列が存在
することが確認される。その存在は、組み込まれたウイ
ルスゲノムに隣接する長い直接末端重複部分の存在によ
り示される。同定された分子クローンは、適切なエンド
ヌクレアーゼで消化され、全コピーウイルスゲノムが放
出される。この目的のために好ましいエンドヌクレアー
ゼはSac Iであり、これは長い末端重複部分（LTR）中の
ウイルスゲノムを、ウイルスのコード配列のどちらかの
末端を切断するが、内部切断を起こさない。クローンの
HTLV−Ｉゲノムが、３番目の内部Sac I部位を有する変
異体である場合には、適切な制限酵素を選択することに
より、全長のゲノムが単離される。精製した全コピー配
列は、約9.5キロ塩基の断片である。あるいは、env遺伝
子配列だけを示すゲノムの断片を精製することにより発
現ライブラリーが調製され得る。

あるいは、全コピーHTLV−Ｉ二本鎖DNAを含有するク
ローニングベクターが報告されており（Seiki）、実施
例Ｉに示すように、その研究者から直接入手することが
できる。

所望のHTLV−Ｉゲノムライブラリーを調製するため
に、全コピーHTLV−Ｉ挿入物を、例えばSac Iで完全消
化することによって、上記クローニングベクターから切
出して、実施例Ｉに述べるようにして、9.5キロ塩基の
断片が単離される。単離された全コピー断片は消化され
て、DNA断片、好ましくは主として約100から300塩基対
の間の大きさのランダム断片が調製される。実施例は、
このような断片のDNアーゼ消化法による調製が述べられ
ている。約30から100の間のアミノ酸からなるペプチド
抗原を得ることが望ましいので、消化断片はサイズ分画
を行うのが好ましく、例えば、ゲル電気泳動法によって
約100から300塩基対の間の大きさの範囲の断片が選択さ
れる。

ゲノム消化断片は、適切なクローニングベクターであ
って、好ましくは適切な宿主中でコードされたペプチド
を発現できる発現ベクターに挿入される。１つの好まし
い発現ベクターはλgt11であり、このベクターは，β−
ガラクトシダーゼ遺伝子の翻訳終止コドンの53塩基対上
流に、唯一のEcoRI挿入部位を有する。したがって、こ
の挿入された配列は、β−ガラクトシダーゼ遺伝子のＮ
末端部の大部分、その非相同ペプチド、およびβ−ガラ
クトシダーゼ遺伝子のＣ末端領域の少なくとも一部分を
含有するβ−ガラクトシダーゼ融合タンパクとして発現
される。またこのベクターは、例えば32℃の許容温度で
ウイルスの溶原化を起こし、例えば42℃の高温ではウイ
ルスが溶解するに至る、温度感受性レプレッサー（cI85
7）を産生する。このベクターの利点は次の通りであ
る：（１）高効率での組換え体の生成；（２）許容温度
では宿主細胞の増殖に基づいて溶原化した宿主細胞を選
択でき、非許容温度ではこのような選択ができないとい
う性能；および（３）組換え体融合タンパクの高レベル
の産生。さらに、非相同の挿入物を有するファージは、
不活性β−ガラクトシダーゼ酵素を産生するので、挿入
物を有するファージは、β−ガラクトシダーゼ呈色基質
反応で容易に同定することができる。

発現ベクターに挿入するために、ウイルス消化断片
は、従来の方法により、Eco RIリンカーのような選択さ
れた制限部位リンカーを含むように、必要に応じて修飾
される。実施例Ｉは消化断片をλgt11中にクローン化す
る方法を例示しており、この方法には、断片の平滑末端
化、Eco RIリンカーの付加、およびこの断片をEco RIで
切断されたλgt11と連結させる工程が含まれる。得られ
たウイルスゲノムライブラリーをチェックし、比較的大
きな（代表的な）ライブラリーが産生されていることが
確認される。この確認は、λgt11ベクターの場合には、
適切な細菌宿主を感染させて、その細菌をプレートし、
次いで、β−ガラクトシダーゼ活性の損失についてプラ
ークを検査することによって実施され得る。実施例Ｉに
記載の方法を用いると、約60％のプラークが酵素活性の
損失を示した。酵素活性の損失を示すバックグラウンド
ファージのレベルは、実施例Ｉに見られるように比較的
低い。

B.ペプチド抗原の発現 上記で形成されたゲノムライブラリーは、問題のヒト
抗HTLV−Ｉ抗体と免疫反応性を有するペプチド抗原（融
合タンパクとして発現される）を調製するためにスクリ
ーニングされる。HTLV−Ｉ感染症を診断するのに特に重
要な１つの抗体は、0.5α抗体であり、これは前記のよ
うにHTLV−Ｉ感染症に関連するＴ細胞白血病の患者に存
在している。この抗体は,EBVで形質転換されたＢリンパ
球細胞系〔ATCC寄託番号HB8755（実施例II参照）〕で産
生され、HTLV−Ｉのgp46エンベロープタンパクと反応す
ることが示されている（Matsushita）。この細胞系は、
HTLV−Ｉに感染した患者に由来するヒトＢ細胞クローン
であり、Epstein−Barrウイルスで永久増殖性となって
いる。この細胞系は、メリーランド20852ロックビル、
パークローンドライブ12301のアメリカンタイプカルチ
ャーコレクションに寄託されている。

好ましいスクリーニング法では、ファージライブラリ
ーベクターが感染した宿主細胞を上記のようにプレート
し、次にこのプレートをニトロセルロースフィルターで
ブロットし、細胞で産生された組換え体抗原をフィルタ
ーに転移させる。次にそのフィルターを、抗HTLV−Ｉ抗
体と反応させ、洗浄して未反応の抗体を除去し、レポー
ターで標識された抗ヒト抗体と反応させる。その結果こ
の抗体は、抗HTLV−Ｉ抗体を介してサンドイッチ形でフ
ィルターに結合する。

典型的には、問題の組換え体抗原の産生によって同定
されるファージプラークは，抗体反応性タンパクの産生
について，比較的低密度で再試験される。実験例IIに記
載のスクリーニング法がその例である。免疫反応性組換
え体抗原を産生したいくつかの組換え体ファージのクロ
ーンをこの方法で同定した。

上記のようにして同定された１種もしくはそれ以上の
ライブラリーベクーターは，塩基対配列決定法で分析し
て,HTLV−Ｉゲノム内のペプチドをコードする領域の位
置を決定するのが好ましい。非相同挿入物（必要に応じ
て，融合タンパクの隣接コード配列を含む）を選択され
たライブラリーのベクターから切り出して，切り出され
た断片を精製し配列決定する方法は，実施例IIIに述べ
るような公知の方法で一般に行われる。0.5α抗体に対
して免疫反応性であることが見い出され,3種のペプチド
のコード配列が図面に示されている。この３種の非相同
配列は,HTLV−Ｉの公知の配列（Seiki）と一致した。に
おいてより充分に考察されているが，全配列が,HTLV−
Ｉのエンベロープタンパクgp46をコードする遺伝子中の
HTLV−Ｉゲノムの5565〜5895の塩基対（図のＡ部分）の
範囲内に入り,5664および5790の塩基対の間（図のＢ部
分）に重複コード配列（図中,2つの矢印で示す）を有す
る。図から分かるように,C部分の重複配列が，下記のア
ミノ酸配列を有する41のアミノ酸ペプチドの抗原をコー
ドしている： Leu−Leu−Val−Asp−Ala−Pro−Gly−Tyr−Asp−Pro−
Ile−Trp−Phe−Leu−Asn−Thr−Glu−Pro−Ser−Gln−
Leu−Pro−Pro−Thr−Ala−Pro−Pro−Leu−Leu−Pro−
His−Ser−Asn−Leu−Asp−His−Ile−Leu−Glu−Pro−
Ser。

さらに一般的に，この発明のペプチドは，（ａ）HTLV
−Ｉエンベロープタンパクgp46から誘導され，かつ
（ｂ）Ｔ細胞白血病の個体に存在する抗HTLV−Ｉ抗体と
免疫反応性である。ここで，“〜由来の”という用語
は，その組換え体ペプチドの合成が，ここで同定された
5664から5790の塩基対間の,HTLV−Ｉエンベリープタン
パクgp46をコードする領域の大部分と，コドンの配列が
実質的に同一のコード配列によって行われることを意味
する。

大規模生産用には，組換え体タンパクを精製するため
に，選択されたクローンが用いられる。大規模生産は，
すでに報告されている次のような各種の方法のうちのひ
とつを用いて実施される：（ａ）イー．コリのような適
切な宿主を，選択されたλgt11組換え体で溶原化し，
（ｂ）生成した形質導入細胞を高レベルの非相同ペプチ
ドが得られる条件下で培養し，（ｃ）溶解細胞から組換
え体抗原を生成する方法。

上記λgt11クローニングベクターを含む好ましい方法
では，高産生性のイー・コリ宿主BNN103を，選択された
ライブラリーファージに感染させ，そして,2枚のプレー
トにレプリカプレートする。これらプレートの１枚を,3
2℃で培養すると，この温度ではウイルスの溶原化が起
こる。他方のプレートを42℃で培養すると，感染してい
るファージが溶菌状態になるので細胞の増殖が阻止され
る。従って，低温では増殖するが高温では増殖しない細
胞は，溶原化が成功していると考えられる。

溶原化された宿主細胞は，次に，ウイルス挿入物を含
有する融合タンパクを大量に生産するのに好都合な液体
培養条件下で培養され，次いで急速凍結によって溶菌し
て所望の融合タンパクを放出させる。これらの方法は，
以下の実施例IVおよびＶで詳述する。

C.ペプチドの精製 組換え体ペプチドは，示差沈澱法，分子ふるいクロマ
トグラフィー，イオン交換クロマトグラフィー，焦点電
気泳動法，ゲル電気泳動法およびアフィニティークロマ
トグラフィーを含む標準的なタンパク精製法で精製され
得る。上記のようにして調製したβ−ガラクトシダーゼ
融合タンパクのような融合タンパクの場合には，タンパ
ク単離法は，天然タンパクの単離に用いる方法のなかか
ら選択して適用され得る。したがって，β−ガラクトシ
ダーゼ融合タンパクを単離するには，そのタンパクは，
その表面に抗β−ガラクトシダーゼ抗体を結合させて有
する固体支持体上を，細胞溶解物質を通過させることに
よる，簡単なアフィニティークロマトグラフィーによっ
て容易に単離され得る。この方法は，そのウイルスペプ
チドの配列を図面に示してあるMTA4/Bβ−ガラクトシダ
ーゼ融合タンパクの精製を行う実施例VIで用いられてい
る。

II.有用性 この項では，本発明の抗原ペプチドの,HTLV−Ｉ感染
症を診断する用途，およびHTLY−Ｉ感染症に対する強力
なワクチンとしての用途について述べる。

A.診断上の用途 ペプチド抗原の３種の基本的な診断上の用途について
述べる。第１図の用途は，ペプチドによる，補体を介す
る抗体依存性細胞溶解の阻害に基づくものである。この
方法では，被検個体由来の血清が，補体の保存（preser
ve）下でHTLV−Ｉに感染したＴ細胞クローンと反応す
る。抗HTLV−Ｉ抗体の存在は，例えばトリパンブルー色
素排除法で判断する細胞溶解によって証明される。細胞
溶解が観察された場合には,HTLV−Ｉペプチドに対する
抗HTLV−Ｉ抗体の特異性が，まず血清の過剰のペプチド
と反応させ，次にその血清を補体の存在下で細胞と混合
することによって証明される。抗体の特異性は，細胞溶
解が顕著に減少することによって示される。この方法は
実施例VIIに記載されている。またこの方法は，血清を
ペプチドの増加量について滴定し，次に，細胞溶解の程
度について顕著な効果が最初に観察された場合にそのペ
プチドの濃度を測定することにより，被分析物である血
清中の抗体力価を定量するのに利用できる。

第２の一般的分析法は固相免疫分析法である。この方
法では，表面に結合したペプチドを有する固相試薬を，
抗体を試薬上のペプチドの結合させる条件下で，被分析
物である血清と反応させる。固相試薬を洗浄して未結合
の血清成分を除いた後，この試薬をレポーターで標識し
た抗ヒト抗体と反応させて，リポーターを，固相支持体
に結合した抗HTLV−Ｉ抗体の量に比例して該試薬に結合
させる。この試薬を再び洗浄して，未結合の標識抗体を
除き，そして，試薬と結合したレポーターの量を測定す
る。典型的には，実施例VIIIに記載した系のように，レ
ポーターは，適切な螢光分析もしくは比色分析用基質の
存在下で固相試薬をインキュベートすることによって検
出される酵素である。

上記分析法で用いられる固相面を有する試薬は，タン
パク物質を，ポリマービーズ，浸漬スティックまたはフ
ィルター材のような固体支持材料に結合させる公知の方
法で製造される。一般にこれらの結合法には，タンパク
を支持体（例えば，実施例VIIIに述べるフィルター支持
体）に非特異的に吸着させる方法，またはタンパクを，
代表的には遊離のアミン基を介して固体支持体上の化学
反応性基，例えば活性化されたカルボキシル基，水酸基
もしくはアルデヒド基に共有結合させる方法がある。

第３の一般的な分析法は均一系分析法である。この方
法では，固体支持体に結合している抗体は，反応媒体中
である種の変化を起こし，その変化はその媒体中で直接
検出することができる。既知の一般のタイプの均一系分
析法には次の方法が包含される：（ａ）スピン標識レポ
ーター法；この方法では，抗原に結合する抗体が，レポ
ーターの移動度の変化で検出される（スピン分裂のピー
クの幅が広くなる）；（ｂ）螢光レポーター法；この方
法では，結合は螢光効率の変化で検出される；（ｅ）酵
素レポーター法；この方法では，抗体の結合は酵素／基
質の相互作用で行われる；および（ｄ）リポソーム結合
レポーター法；この方法では，結合によって，リポソー
ムが溶解して封入されたレポーターが放出される。これ
らの方法をこの発明のペプチドに適用する際には，均一
系分析法の試薬の通常の製造法が利用される。

上記の３種の一般的な各分析法では，試験個体由来の
血清を抗体と反応させ，結合した抗体の存在について抗
原の試験が行われる。第１の分析法では，試験は，抗体
が，ペプチドに結合するときに，抗体を介する細胞溶解
が減少するのを観察することによって行われる。固相分
析法では，試験は，標識抗ヒト抗体を，被検体に結合さ
せ，そして，個体支持体に結合したレポーターの量を測
定して行われる。第３の検定法では，試験は，均一系分
析法の試薬に結合する抗体の作用を観察することによっ
て行われる。

Ｂ・ペプチドのワクチン 本発明のペプチド抗原は，ワクチンとしても用いられ
得，細胞毒性の抗HLTV−Ｉ抗体を誘発する。ここでは,
0.5αモノクローナル抗体が，補体の存在下で,HTLV−Ｉ
ウイルスに感染したＴ細胞に対して細胞毒性になること
に留意することが大切である。このペプチドは，適切な
担体／アジュバンドによって製剤化され，細胞毒性抗HT
LV−Ｉ抗体の有意な力価が血清中に検出されるまで，所
定の間隔をおいて注射される。このワクチンは，初期の
HTLV−Ｉ感染症に対して，抗体を介する細胞毒性によっ
て防御を行う。

上記の説明から，本発明により，いかに種々の目的と
特徴が達成されるかが理解されるであろう。本発明のペ
プチド抗原は，成人のＴ細胞白血病の症状を示す抗HTLV
−Ｉ抗体と特異的に反応するので,T細胞白血病の迅速で
安価な分析法に用いられる。同時に，このペプチド抗原
は，既存の0.5αモノクローナル抗体によって行われる
細胞毒性抗体反応を誘発する。

下記の実施例は，本発明の種々の態様を例示するが，
本発明の範囲を限定するものではない。

材料 以下の実施例で使用された材料は、次の通りであっ
た。

酵素:DNアーゼＩおよびアルカリホスファターゼをBoe
hringer Mannheim Biochemicals（BMB、インディアナ
州、インディアナポリス）より得た。EcoRI、EcoRIメチ
ラーゼ、DNAリガーゼおよびポリメラーゼＩをNew Engla
nd Biolabs（NEB,マサチューセッツ州、ベヴァリー）よ
り得た。RNアーゼをSigma（ミズーリ州、セントルイ
ス）より得た。

他の試薬:EcoRIリンカーをNEBより得た。そしてニト
ロブル−テトラゾリウム（NBT）、５−ブロモ−４−ク
ロロ−３−インドリルホスフェート（BCIP）、５−ブロ
モ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピ
ラノシド（Ｘ−gal）、およびイソプロピルβ−Ｄ−チ
オガラクトピラノシド（IPTG）をSigmaから得た。

実施例 １ HTLV−Ｉゲノムライブラリーの調製 ゲノム材料のライブラリーソース:HTLV−Ｉゲノムに
由来する全コピーDNA挿入物を含有するバクテリオファ
ージを合衆国国立衛生研究所のthe Laboratory of Tumo
r Cell Biology（メリーランド州、ベテスダ）のDr.R.
C.GalloおよびDr.F.Wong−Staalより得た。バクテリオ
ファージをSacIで完全に消化し、ウイルスゲノム挿入物
を放出させた。消化された材料を標準10％アガロースゲ
ルで電気泳動にかけ、電気溶離によって得られた9.5キ
ロ塩基の断片をエタノール沈澱前に、フェノール／クロ
ロホルムで抽出した。

DNA消化：精製ゲノムDNAを標準消化バッファー（0.5M
Tris HCl.pH7.5;1mg/ml BSA;10mM MnCl₂）に懸濁し、
約1mg/mlの濃度とし、室温で約５分間DNアーゼ１で消化
した。これらの反応条件は、較正のために前もって研究
で決定され、主として100〜300塩基対の断片を製造する
のに必要なインキュベートの時間が決定された。上記消
化物を、エタノール沈澱前に、フェノール／クロロホル
ムで抽出した。

EcoRIリンカーの付加：上記のゲノム断片を、標準条
件（Huynh）下でDNA Pol Iで平滑末端にし、次いでフェ
ノール／クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させ
た。平滑末端にされた材料を標準条件下でEcorRIリンカ
ーで連結し（Maniatis,pp396.397）、その後、EcoRIで
消化し、余剰のリンカー末端を取り除いた。これをその
後、アガロースゲル分画し、非連結リンカーを取り除
き、サイズ選択を行った（以下を参照）。

サイズ選択：上記の工程で得られた断片をΦX174/Hae
IIIおよびλ/Hind IIIサイズマーカーを用いて、1.2％
アガロースゲル電気泳動（５〜10V/cm）で分析した。10
0〜300bpの画分をNA45ストリップ（SchleicherおよびSc
huell）に溶出し、その後、溶離溶液（1M NaCl,50mMア
ルギニン,pH9.0）で1.5mlマイクロチューブに入れ、30
〜60分間67℃でインキュベートした。DNA（溶液中に存
在する）を、フェノール／クロロホルムで抽出し、エタ
ノールで沈澱させた。ペレットを、20μl TE（0.01M Tr
is HCl,pH7.5,0.001M EDTA）中に再び懸濁させた。

λgt11への連結およびインビトロでのパッケージ λgt11ファージベクター（Huynh）を、Promega Biote
c（ウィスコンシン州マジソン）より得た。このクロー
ニングベクターは、β−ガラクトシダーゼ翻訳終止コド
ンの53塩基対上流に唯一のEcoRIクローニング部位を持
つ。上記のゲノム断片を、0.5〜1.0μｇのEcoRI−切断g
t11、0.5〜３μｌの上記HTLV−Ｉゲノム断片、0.5μｌ
のリガーゼ（200単位）および蒸留水５μｌを混合する
ことで、EcoRI部位に導入した。混合物を、標準方法（M
aniatis,pp.256−268）により、一晩、14℃でインキュ
ベートし、インビトロパッケージを行った。

パッケージされたファージは、DNAX（カリフォルニア
州パロアルト）のDr.Kevin Mooreより得たE.Coli,KM392
株を感染させるのに、使用された。または、アメリカン
タイプカルチャーコレクション（ATCC＃37197）より入
手可能なE.Coli,Y1090株も使用され得る。感染したバク
テリアをプレートし、生じたコロニーを、標準Ｘ−gal
基質プラークアッセイ方法（Maniatis）を用いて、Ｘ−
galの存在下でβ−ガラクトシダーゼ活性−−（クリア
ープラーグ）の欠失を検査した。下記の表１に、EcoRI
末端HTLV−Ｉ断片（列１）の挿入で得られた組換え体
（クリアー）プラークの数を示す。EcoRIリンカーの対
照（列２）およびバックグラウンドを持たない対照（列
３）も、実施された。表１からわかるように、約50％の
ファージプラークが、酵素（組換え体）の欠失を示し
た。EcoRIリンカーが存在するもしくはしないバックグ
ラウンドレベルは、15％未満であった。プラークの約60
％が、酵素活性の欠失を示した。ファージ材料は、約10
⁶プラーク形成ユニット（pfu）/mlを含有していた。

実施例 II gp46コード挿入物のスクリーニング モノクローナル抗体：ヒト細胞系（ATCC HB8755）に
由来する精製した0.5α抗体を、合衆国国立衛生研究所
のthe National cancer Institute（メリーランド州、
ベテスダ）のDr.Samuel Broaderより得た。アルカリホ
スファターゼと結合した状態で誘導された（covalently
derivatized with alkaline phosphatase）マウス抗ヒ
トIgG抗体を、Promega Biotec（ウィスコンシン州、マ
ジソン）から得た。

組換え体gp46の同定：実施例１からの約10⁴pfuのファ
ージストックで感染したKM392細胞のローン（lawn of K
M392 cells）を、150mmプレートで調製し、37℃で約５
〜８時間にわたりインキュベートし、表返した。ローン
に、ニトロセルロースシートを敷き、プラークから紙へ
分泌されたHTLV−Ｉ組換え体タンパクを転移させた。プ
レートおよびフィルターは、対応するプレートおよびフ
ィルター位置にあわせるために、印を付けた。

フィルターを、TBSTバッファー（10mM Tris,pH8.0,15
0mM NaCl,0.05％Tween20）で２回洗浄し、AIB（１％ゼ
ラチンを含むTBSTバッファー）でブロックし、TBSTで再
び洗浄し、0.5αモノクローナル抗体（AIBで１〜２μg/
mlに希釈;12〜15ml/プレート）を加えた後、一晩、イン
キュベートした。TBSTでシートを２回洗浄し、その後、
酵素標識抗ヒト抗体と接触させ、0.5α抗体で認識され
る抗原を含むフィルター部位に標識抗体を付着させた。
最終洗浄の後、フィルターを、5mlのアルカリホスファ
ターゼバッファー（100mM Tris,9.5,100mM NaCl,5mM Mg
Cl₂）中の16μl BCIP（５℃に維持された50mg/mlのスト
ック溶液）と混合した32μl NBT（５℃に維持された50m
g/mlのストック溶液）を含有する基質媒体中で発色させ
た。抗原産生点（0.5x抗体で認識される）では、紫色が
現れた。

二次プレーティング：前記工程で決定された抗原産生
領域を、82mmプレートに、約100〜200pfuで再びプレー
トした。上記工程、つまり、まず、５〜８時間インキュ
ベートし、NBT/BCIPによる発色の工程を、0.5α抗体と
反応し得る抗原を分泌するプラークを同定するために、
繰り返した。同定されたプラークを、取り上げ、ファー
ジバッファーで溶出した（Maniatis,p.443）。抗体反応
性ペプチドを分泌する組換え体ファージプラークのうち
の３つを、実施例３の方法による配列決定のために選択
した。対応する感染したファージは、MTA4,MTA1およびM
TA5と命名された。

実施例 III ファージ精製およびDNA抽出 ファージMTA4,MTA1およびMTA5を、感染したE.coli Y1
088バクテリアのプレート培養物より単離した。これら
の細胞は、ATCC（ATCC＃31195）より入手可能である。
プレートで生産された物質を、低速遠心分離法によりバ
クテリア破砕物より精製し、上清をSW27チューブに注い
だ。RNアーゼおよびDNアーゼを1mg/miのストック溶液か
ら各１μg/mlの濃度でそれぞれ加えた。試料を37℃で30
分間インキュベートし、20％m.w.8000PEG,5.8g NaCl,2.
0g MgSO₄・7H₂O,1M TrisCl,pH7.5,および２％ゼラチン
を含むポリエチレングリコール（PEG）溶液を等容量加
えた。試料を１時間氷浴に置き、ファージ粒子を沈澱さ
せ、その後、４℃で約20分間10kで遠心分離により単離
した。

上清をデカンテーションによって除き、ペレットを0.
6mlPDBバッファー（5.8g NaCl,2.0g MgSO₄・7H₂O,50ml
1M Tris Cl,pH7.5,および5ml 2％ゼラチン）中に再び懸
濁させ、1.5mlのポリプロピレンマイクロチューブに移
した。５μl 10％ SDS,5μl 0.5M EDTA,および2.5μｌ
プロテイナーゼＫ（20MG/ML）を加え、試料を15分間50
℃でインキュベートした。

洗浄剤および酵素処理された材料を、等量のフェノー
ル／クロロホルムで抽出し、遠心分離して相の分離を確
実にした。水相を新しいチューブに移し、抽出／遠心分
離工程をクロロホルムとイソアミルアルコールとの混合
物を用いて繰り返した。等容量のイソプロパノールを加
え、試料を数回逆にして混合し、−70℃で20分間冷却し
た。試料を５分間遠心分離にかけ、上清をデカンテーシ
ョンで除いた。ペレットを70％エタノール中で洗浄し、
37℃ヒートブロックで簡単に乾燥し、100μl TEバッフ
ァー,pH7.5に再び懸濁させた。

単離したファージDNAをKpn IおよびSac Iで消化し、
その後、Kpn I/Sac Iで切断したプラスミドベクターpGE
M−３（Promega Biotec）と結合させ、所望の挿入物を
有するプラスミド組換え体を単離した。HTLV−Ｉ挿入物
を、その後、標準ジデオキシ配列決定法を用い、EcoRI
挿入部位に隣接するλgt11配列の前後のプライマーを用
いて配列決定した。

図は、試験された３つの融合ペプチドのそれぞれにつ
いて、コード配列、および上記の方法によって形成され
た融合タンパクの一部分であり、上記コード配列に対応
するアミノ酸配列を示す。３つの各挿入配列で与えられ
たβ−gal遺伝子の末端Ｇ塩基および隣接するenv遺伝子
のCC塩基は、GCC（Ala）コドンを生じ、通常、３つの全
てのHTLV−I env挿入物においてそののコドン位置で生
じるSerコドンを置換する。示されるように、MTA4の挿
入物は、HTLV−Ｉコード領域の5565塩基から5790塩基ま
で延びている225塩基対配列を含み、これは、gp46配列
の129から203位のアミノ酸（74個のアミノ酸）に対応す
る。MTA1挿入物は、HTLV−Ｉコード領域の5664塩基から
5807塩基まで延びている143塩基対配列を含み、これ
は、gp46配列の162から209位のアミノ酸（47個のアミノ
酸）に対応する。MTA5ファージの挿入物もまた、5664塩
基で始まり、5895塩基まで延びている。この231塩基対
配列は、gp46タンパクの162から239位のアミノ酸（77個
のアミノ酸）をカバーする。

5664から5790の挿入物の重なりの領域は、天然のgp46
タンパクの161から203位のアミノ酸の41アミノ酸配列を
含む。３つのペプチドのアミノ酸の数は、中断された
５′末端Serコドン（転写された組換え体コード配列に
おいては、Alaコドンによって置換されている）を含む
が、３′末端の中断されたコドン（組換え体ペプチドに
おいては、翻訳されない）を含まずに計算される。従っ
て、ここに開示されるペプチドは、（ａ）長さが約80個
を下まわるアミノ酸であり、そして（ｂ）ATCC番号HB87
55で特徴付けられる細胞系によって製造される抗ヒトHT
LV−Ｉ抗体と免疫反応性のアミノ酸配列Leu−Leu−Val
−Asp−Ala−Pro−Gly−Tyr−Asp−Pro−Ile−Trp−Phe
−Leu−Asn−Thr−Glu−Pro−Ser−Gln−Leu−Pro−Pro
−Thr−Ala−Pro−Pro−Leu−Leu−Pro−His−Ser−Asn
−Leu−Asp−His−Ile−Leu−Gle−Pro−Serによって形
成される免疫原性の領域を含む。

実施例 IV 溶原菌の構築 E.coli C600株を、スタンフォード大学（カリフォル
ニア州、スタンフォード）のDr.R.Davisより得た。また
は、E.coli Y1089（ATCC＃37196）も使用し得る。一晩
培養し、飽和した1mlの細胞培養物を、実施例IIIの３つ
のファージのひとつで感染させた。上記感染は、一晩培
養したバクテリア培養物50μｌに、溶出したプラークス
トックを10μｌ吸着させることにより行った。感染バク
テリアを、LB寒天プレート（Maniatis,p.440）にまき、
32℃でインキュベートした。個々のコロニーを、つまみ
上げ、２つの別々のプレートの対応するグリッドに付与
した。プレートの一方を32℃でインキュベートし、他方
を42℃でインキュベートした。低い方の温度で増殖した
（ファージレプレッサータンパクの存在で産生された溶
原状態を示した）が、高い方の温度では（細胞溶解のた
め）増殖しなかった細胞は、溶原性であると推定され
た。３つの各ファージのタイプから多くの溶原性のコロ
ニーが見い出された。

実施例 Ｖ 溶原菌からの組換え体抗原の誘導 本実施例は、MTA4ファージを用いて実施例IVで調製さ
れたλgt11溶原菌からHTLV−Ｉエピトープを含む組換え
体タンパクの誘導を説明する。上記で示されるように、
抗原は、ファージβ−galタンパクのＮ末端部分を含む
β−ガラクトシダーゼ融合タンパクの形で製造される。

スーパーブロスを、35gバクトトリプトン、2gバクト
イーストエクストラクト、5g NaClおよび5ml 1N NaOH
を、11の蒸留水中に含有させて調製した。500mlのスー
パーブロスに、上記の実施例で調製された一晩培養した
E Coliλgt11溶原菌の飽和培養物を1:100で接種した。
この培養物を、激しくエアレーションを行ないながらA
₆₀₀が、約0.4〜0.5となるまで培養した。

タンパクの製造を最大にするために、培養物の温度を
43〜44℃に上げた。そのことにより、温度感受性のβ−
ガラクトシダーゼリプレッサー遺伝子が不活性化され
た。温度を、65℃の水槽中でエアレーションを行いなが
ら15分間にわたり43℃に維持した。更にタンパクの製造
を増加させるために、IPTGをブロスに加えた。このIPTG
は、拮抗的にβ−galリプレッサーに結合することでβ
−ガラクトシダーゼ発現を誘発する。培養物を、約１時
間38℃のシェーカーに戻した。細胞をその後、37℃で15
分間6,000xgでペレット化し、溶解バッファー（10mM Tr
is,pH7.4,2％ TritonX−100,1％ aprotinin,50μg PMS
F）中に再懸濁し、そして、その後すぐに、液体N₂に投
入した。溶解は、冷凍試料の解凍で完了した。

実施例 VI 融合タンパクの精製 前記実施例で得られた細胞溶解物を解凍し、37℃に暖
めた。10μｌのDNアーゼ（１μg/ml）を加え、混合物を
粘性が減少するまでインキュベートした。溶解物を氷で
急冷し、マイクロフュージ中で５分間４℃にて清澄化
し、Sepharose 4B（Pharmacia）に結合した抗β−ガラ
クトシダーゼの6mlのカラムに負荷した。カラムを１〜
２時間平衡化し、７容量（カラム容積量）のTXバッファ
ー（10mM Tris,pH8.0,2％ Triton X−100,50μg/ml PMS
F）で洗浄し、5mM3,5−ジョードサリチル酸を含むTXバ
ッファー２容量で洗浄した。融合タンパクをその後、35
mM3.5−ジョードサリチル酸を含むTXバッファーでカラ
ムから溶離した。タンパクの大部分は、最初の３〜４容
量で溶離され、除去は、実質的に７容量で完了した。

溶離試料を脱塩し、Amiconフィルター（マサチューセ
ッツ州Danvers）を用いて濃縮した。

実施例 VII 補体を介する細胞溶解の阻害 HUT102−B2細胞をDr,R.C.Gallo,LTCB,NIHから得た。
これは、HTLV−Ｉを製造することが知られている長期培
養Ｔ−細胞系である。

0.5α抗体（約５μg/ml IgG）もしくはアイソタイプ
の、適合したヒトIgGの対照を、MTA4組換え体ペプチド
もしくは無関係な組換え体とともに30分間、室温でプレ
インキュベートした。50μｌのこれらの混合物を、その
後、96ウェルマイクロタイタープレート中の5x10⁵のHUT
102B2に加え、室温で30分間インキュベートした。ウェ
ル当り、30μｌのウサギの補体を加え、37℃で１時間イ
ンキュベートした。細胞の生存を、顕微鏡観察で決定し
た。細胞溶解は、MTA4ペプチド抗原の添加で明らかに阻
止されたが、無関係な組換え体ペプチド抗原とのプレイ
ンキュベーションでは、阻止されなかった。組換え体抗
原もしくは無関係な組換え体ペプチド抗原とのプレイン
キュベーション後の、アイソタイプの対応ヒトIgGは、H
UT102−82生存に効果はなかった。

実施例 VIII 固相アッセイ 精製MTA4ペプチド抗原を実施例IVの様に調製し、ニト
ロセルロースフィルターにドットプロットした。次い
で、これをＴ−細胞白血病の患者（HTLV−Ｉ感染の６人
の患者）の血清抗体のアッセイに用いた。各場合とも、
被検個体からの0.1mlの様々な血清希釈溶液を、1:100か
ら1:50,000の範囲で、フィルターに加え、30分間室温で
反応させた。フィルターをその後、TBSTバッファー（実
施例II）で２回洗浄し、実施例IIの様にアルカリホスフ
ァターゼと結合した抗ヒト抗体とともにインキュベート
した。抗体の存在は、実施例IIと同様に、NBTおよびBCI
Pでの発色で決定された。

本発明を、特定の実施態様、構築方法および使用につ
いて説明してきたが、本発明から逸脱することなく、様
々な変化および改変がなされ得ることは、当業者には明
らかである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (56)参考文献 特開 昭62−244393（ＪＰ，Ａ) ＧＥＮＥ（Ａｍｓｔｅｒｄａｍ），48 （２−３）（1986），Ｐ．183−193 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，80（12），（Ｊｕｎｅ. 1983），Ｐ．3618−3622

Claims (7)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】HTLV−Ｉエンベロープタンパク質gp46に由
   来する、約80個を下まわるアミノ酸を有し、アミノ酸配
   列： Leu−Leu−Val−Asp−Ala−Pro−Gly−Tyr−Asp−Pro−
   Ile−Trp−Phe−Leu−Asn−Thr−Glu−Pro−Ser−Gln−
   Leu−Pro−Pro−Thr−Ala−Pro−Pro−Leu−Leu−Pro−
   His−Ser−Asn−Leu−Asp−His−Ile−Leu−Glu−Pro−
   Ser を含むペプチドからなる群から選択される、ペプチド抗
   原。
2. 【請求項２】前記アミノ酸配列の41個のアミノ酸を有す
   る、請求項１に記載のペプチド抗原。
3. 【請求項３】組換え融合タンパク質の一部である、請求
   項１に記載のペプチド抗原。
4. 【請求項４】被検個体のHTLV−Ｉ感染症を検出する方法
   であって、該方法は次の工程を包含する： 被検個体由来の血清と、HTLV−Ｉエンベロープタンパク
   質gp46に由来する、約80個を下まわるアミノ酸を有し、
   アミノ酸配列： Leu−Leu−Val−Asp−Ala−Pro−Gly−Tyr−Asp−Pro−
   Ile−Trp−Phe−Leu−Asn−Thr−Glu−Pro−Ser−Gln−
   Leu−Pro−Pro−Thr−Ala−Pro−Pro−Leu−Leu−Pro−
   His−Ser−Asn−Leu−Asp−His−Ile−Leu−Glu−Pro−
   Ser を含むペプチドからなる群から選択される、ペプチド抗
   原とを反応させる工程、および 結合した抗体の存在について抗原を試験する工程。
5. 【請求項５】請求項４に記載の方法であって、前記提供
   された抗原が固体支持体に付着し、前記反応がそのよう
   な血清と支持体との接触を包含し、前記試験が支持体お
   よび結合した抗体とレポーター標識抗ヒト抗体との反応
   を包含する、方法。
6. 【請求項６】HTLV−Ｉに対する抗体の存在を確かめるた
   めのキットであって、該キットは、その表面にペプチド
   抗原が結合した固体支持体、およびレポーター標識抗ヒ
   ト抗体とを含有し、 該ペプチド抗原はHTLV−Ｉエンペロープタンパク質gp46
   に由来する、約80個を下まわるアミノ酸を有し、アミノ
   酸配列： Leu−Leu−Val−Asp−Ala−Pro−Gly−Tyr−Asp−Pro−
   Ile−Trp−Phe−Leu−Asn−Thr−Glu−Pro−Ser−Gln−
   Leu−Pro−Pro−Thr−Ala−Pro−Pro−Leu−Leu−Pro−
   His−Ser−Asn−Leu−Asp−His−Ile−Leu−Glu−Pro−
   Ser を含むペプチドからなる群から選択される。
7. 【請求項７】Ｔ細胞白血病に対して個体を免疫化するワ
   クチンであって、該ワクチンは、薬理学的に受容され得
   るアジュバンド中に組換え体ペプチドを有し、該ペプチ
   ドは、HTLV−Ｉエンベロープタンパク質gp46に由来し、
   約80個を下まわるアミノ酸を有する、アミノ酸配列： Leu−Leu−Val−Asp−Ala−Pro−Gly−Tyr−Asp−Pro−
   Ile−Trp−Phe−Leu−Asn−Thr−Glu−Pro−Ser−Gln−
   Leu−Pro−Pro−Thr−Ala−Pro−Pro−Leu−Leu−Pro−
   His−Ser−Asn−Leu−Asp−His−Ile−Leu−Glu−Pro−
   Ser を含むペプチドからなる群から選択される。