PL168925B1 - Sposób wykrywania antygenu wirusowego PT-NANBH i przeciwciała przeciwko antygenowi wirusowemu PT-NANBH - Google Patents
Sposób wykrywania antygenu wirusowego PT-NANBH i przeciwciała przeciwko antygenowi wirusowemu PT-NANBHInfo
- Publication number
- PL168925B1 PL168925B1 PL30593090A PL30593090A PL168925B1 PL 168925 B1 PL168925 B1 PL 168925B1 PL 30593090 A PL30593090 A PL 30593090A PL 30593090 A PL30593090 A PL 30593090A PL 168925 B1 PL168925 B1 PL 168925B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- sequence
- nanbh
- amino acid
- viral
- acid sequence
- Prior art date
Links
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
1. Sposób wykrywania antygenu wirusowego PT-NANBH i przeciwciała przeciwko antygenowi wirusowemu PT-NANBH, znamienny tym, że kontaktuje się testowaną próbkę z polipeptydem wirusowym PT-NANBH o sekwencji aminokwasowej, homologicznej przynajmniej w 90% z sekwencją aminokwasową podaną w sekwencjach o numerach identyfikacyjnych 3, 4, 5, 18, 19, 20, 21 lub 22 przedstawionych odpowiednio na fig. 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 lub jej fragmentem antygenowym, lub z poliklonalnym albo z monoklonalnym przeciwciałem przeciwko takiemu polipeptydowi wirusowemu i ustala się czy w testowanej próbce występuje jakiekolwiek wiązanie antygen-przeciwciało. 7. SposóS wyórywaniaprzeaiwziała przeciwkoantyoenowiwiwsowemoPT-NANBH, znamienny tym, ze kontaktuje się testowaną próbkę z jednym lub większą ilością wirusowych polipeptydów PT-NANBH, które to polipeptydy zawierają dwa lub większą ilość wirusowych antygenów PT-NANBH występujących w kombinacji albo połączonych przez fuzję i stanowiących pojedynczy polipeptyd, przy czym co najmniej jeden z tych antygenów pochodzi ze strukturalnego regionu kodującego wirusa i co najmniej jeden inny z tych antygenów pochodzi z ziesteuktueclzogo regionu kodującego wirusa i ustala się, czy w materiale testowanej próbki występuje jakiekolwiek wiązanie antygen-przeciwciało.
Description
Przedmiotem wynalazku jest sposób wykrywania antygenu wirusowego PT-NANBH i przeciwciała przeciwko temu wirusowi.
Antygen wirusowy PT-NANBH wykrywany sposobem według wynalazku, odpowiedzialny jest za potransfuzyjne zapalenie wątroby typu nie-A nie-B /PT-NANBH/.
Sekwencję DNA kodującą polipeptydy wirusowe PT-NANBH można stosować do oznaczania kwasu nukleinowego w celu diagnozowania PT-NANBH.
Polipeptydy wirusowe PT-NANBH, lub poliklonalne bądź monoklonalne przeciwciała skierowane przeciwko takim polipeptydom, stosuje się do oznaczania immulogicznego stosowanego w celu diagnozowania PT-NANBH.
Diagnoza zapalenia wątroby typu nie-A nie-B /NANBH/ jest z definicji diagnozą przez wykluczenie. Na ogół wykorzystuje się ją do opisu przypadków infekcji wirusowych wywołujących zapalenie wątroby, które to infekcje nie są spowodowane wirusami zapalenia wątroby typu A lub B. Chociaż w większości takich przypadków nie zidentyfikowano przyczyn infekcji, na podstawie danych klinicznych i epidemiologicznych uważa się, że odpowiedzialne za nie są liczne czynniki, których przeglądu dokonali Shih i inni /Prog. Liver Dis., 1985, 8, 433 - 452/. W samych Stanach Zjednoczonych Ameryki do 10% transfuzji krwi może zakończyć się NANBH, co czyni je znaczącym problemem. Nawet dla PT-NANBH może istnieć co najmniej kilka czynników wirusowych odpowiedzialnych za infekcję i przez kilka lat czyniono wiele prób identyfikacji czynnika, wielokrotnie zastrzegano sposób identyfikacji tego czynnika, z których żadnego nie udowodniono.
W europejskim zgłoszeniu patentowym nr 88310922.5 opisano izolację i charakterystykę czynnika etiologicznego odpowiedzialnego za PT-NANBH, który w tym zgłoszeniu określa się także jako wirus zapalenia wątroby typu C /HCV/. Z wirusowego kwasu nukleinowego, otrzymanego z organizmu szympansa zainfekowanego PT-NANBH, przygotowano bibliotekę cDNA i przeszukano ją stosując ludzkie antysurowice. Wyizolowano i zsekwencjonowano liczne klony dodatnie. Otrzymane dane dotyczące sekwencji kwasów nukleinowych i sekwencji aminokwasowych, które opisano w tym zgłoszeniu, stanowią około 70% genomu wirusowego o długości 10 Kb i pochodzą w całości z jego końca 3', odpowiadającego niestrukturalnemu regionowi kodującemu.
Autorzy ni^^^jszego wynalazku wyizolowali i scharakteryzowali polipeptydy wirusowe PT-NANBH poprzez sklonowanie i ekspresję sekwencji DNA kodujących takie polipeptydy. Nieoczekiwanie okazało się, że dane dotyczące zarówno sekwencji kwasów nukleinowych, jak sekwencji aminokwasowych, wykazują znaczne różnice w porównaniu z odpowiadającymi im danymi według europejskiego zgłoszenia patentowego nr 88310922.5. Całkowite różnice wynoszą około 20% na poziomie kwasu nukleinowego i około 15% na poziomie aminokwasowym, lecz w pewnych regionach sekwencji znaleziono nawet większe różnice. Całkowity poziom różnic jest dużo wyższy niż możnaby było oczekiwać w przypadku dwóch izolatów tego samego wirusa, nawet uwzględniając czynniki geograficzne, i sądzi się, że różnice te spowodowane są przez jedną z dwóch możliwych przyczyn.
Po pierwsze, autorzy niniejszego wynalazku i autorzy wspomnianego powyżej europejskiego zgłoszenia patentowego zastosowali różne źródła kwasu nukleinowego użytego do klonowania cDNA. W szczególności według ouropejskiogo zgłoszenia patentowego, stosowano jako źródło wirusowego kwasu nukleinowego, będącego materiałem wyjściowym, osocze szympansa, zawierające wirusa dwukrotnie pasażowanego w organizmie szympansa. PT-NAnBH jest oczywiście chorobą ludzką i wynikiem pasażowania wirusa w organizmie obcego gospodarza, nawet jeśli jest on blisko spokrewniony z ludźmi, jest prawdopodobnie duża częstość mutacji wirusowego kwasu nukleinowego. Zgodnie z tym, dane sekwencyjne zawarte w europejskim zgłoszeniu patentowym nr 88310922.5 mogą nie być naprawdę reprezentatywne dla czynnika wirusowego odpowiedzialnego za PT-NANBH u ludzi. W przeciwieństwie do wspomnianego stanu techniki autorzy niniejszego wynalazku wykorzystali jako materiał wyjściowy do klonowania cDNA wirusowy kwas nukleinowy z osocza ludzkiego. Jest znacznie bardziej prawdopodobne, ze tak otrzymane dane sekwencyjne odpowiadają natywnej sekwencji kwasu nukleinowego i sekwencji aminokwasowej PT-NANBH.
168 925
Po drugie, możliwe jest, że czynnik wirusowy istnieje w postaci więcej, niż jednego podtypu, i dane sekwencyjne opisane w europejskim zgłoszeniu patentowym oraz przedstawione przez autorów ninieeszego wynalazku, odpowiadają oddzielnym i odmiennym podtypom tego samego czynnika wirusowego. Alternatywnie, możliwe jest, że poziom różnic pomiędzy dwiema grupami danych sekwencyjnych spowodowany jest obydwoma wyżej omawianymi czynnikami.
W wyniku przeprowadzonych doświadczeń okazało się, że wirusowy polipeptyd PTNANBH obejmuje antygen posiadający sekwencję aminokwasową homologiczną co najmniej w 90% z sekwencją aminokwasową przedstawioną w sekwencjach o numerach identyfikacyjnych: 3,4, 5, 18, 19, 20, 21 lub 22, lub stanowi fragment tego antygenu.
Sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 3, 4, 5, 18, 19, 20, 21 lub 22 przedstawiają sekwencję aminokwasową wywnioskowaną z sekwencji kwasu nukleinowego. Sekwencja aminokwasowa jest co najmniej w 95%, lub nawet 98% homologiczna z sekwencją aminokwasową przedstawioną w sekwencjach o numerach identyfikacyjnych: 3, 4, 5, 18, 19, 20, 21 lub 22. Ewentualnie antygen poddaje się fuzji z polipeptydem heterologicznym.
Stosuje się razem dwa lub większą liczbę antygenów albo w połączeniu, albo po fuzji jako pojedynczy polipeptyd. Zastosowanie dwóch lub większej liczby antygenów w oznaczeniu diagnostycznym zapewnia bardziej wiarygodne wyniki przy stosowaniu oznaczenia w testowaniu krwi pod kątem wirusa PT-NANBH. Jeden antygen otrzymuje się ze strukturalnego regionu kodującego, /koniec 5'/, a drugi antygen otrzymuje się z niestrukturalnego regionu kodującego, /koniec 3'/. Korzystną metodą przeprowadzania fuzji antygenów jest otrzymywanie pojedynczego polipeptydu technikami rekombinacyjnymi. Metoda ta ma liczne zalety polegające na tym, że pojedyncze antygeny łączy się w określonym wcześniej, stałym stosunku /zazwyczaj równomolowym/ i zachodzi potrzeba wytworzenia, oczyszczania i scharakteryzowania tylko pojedynczego polipeptydu.
Antygenowy fragment antygenu posiadającego sekwencję aminokwasową homologiczną co najmniej w 90% z sekwencją przedstawioną w sekwencjach o numerach identyfikacyjnych: 3, 4, 5, 18, 19, 20, 21 lub 22 korzystnie zawiera minimum pięć, sześć, siedem, osiem, dziewięć lub dziesięć, piętnaście, dwadzieścia, trzydzieści, czterdzieści lub pięćdziesiąt aminokwasów. Miejsca antygenowe takich antygenów identyfikuje się przy zastosowaniu znanych sposobów. Mogą one obejmować fragmentację samego polipeptydu z zastosowaniem enzymów lub czynników chemicznych, a następnie określanie zdolności każdego fragmentu do wiązania przeciwciał lub wywoływania odpowiedzi immunologicznej, jeśli inokuluje się nimi zwierzę lub odpowiedni układ modelowy in vitro (Strohmaier i inni, J. Gen. Virol., 1982, 59, 205 - 306). Alternatywnie można fragmentować DNA kodujący polipeptyd przez trawienie enzymami restrykcyjnymi, lub stosując inne dobrze znane metody, a następnie wprowadzać do układu ekspresyjnego w celu wytworzenia fragmentów ewentualnie poddanych fuzji w dowolny sposób z polipeptydem, zazwyczaj pochodzenia bakteryjnego). Otrzymane fragmenty oznacza się jak opisano uprzednio (Spece i inni, J. Ge. Virol., 1989,70, 2843 - 51; Smith i inni, Gene, 1984, 29, 163 - 9). Można ponadto dokonywać syntezy na drodze chemicznej krótkich fragmentów peptydowych (o długości 3-20 aminokwasów; dogodnie o długości 6 aminokwasów) obejmujących całą sekwencję peptydu o pełnej długości, z każdym peptydem zachodzącym na przylegający peptyd. Ten region zachodzenia może posiadać długość 1 - 10 aminokwasów, lecz najlepiej n-1 aminokwasów, gdzie n jest długością peptydu; Geysen i inni, Proc. Natl. Acad, Sci., 1984, 81, 3998 - 4002). Każdy peptyd następnie oznacza się jak opisano uprzednio, z tym wyjątkiem, że peptyd zazwyczaj najpierw sprzęga się z jakąś cząsteczką nośnikową w celu ułatwienia indukcji odpowiedzi immunologicznej. Wreszcie, znane są metody przewidywania obejmujące analizę sekwencji pod kątem określonych cech, np. hydrofobowości, o których to cechach sądzi się, ze związane są z miejscami ważnymi immunologicznie (Hopp i Woods, Prac, Natl. Acad. Sci., 1981, 78 3824 - 8; Borzofsky, Science, 1985, 229, 932-40). Przewidywane sekwencje można następnie testować stosując opisane uprzednio sposoby a dotyczące polipeptydów otrzymywanych technikami rekombinacyjnymi lub fragmentacji samego peptydu.
Wirusowy polipeptyd może być wytwarzany w postaci czystej tj. wytwarza się polipeptyd o czystości wyższej niz 90% lub nawet 95%.
168 925
Możliwe jest otrzymanie polipeptydu wirusowego PT-NANBH przy zastosowaniu syntetyzatora aminokwasowego, w przypadku, jeśli jest on antygenem posiadającym nie więcej niż około trzydziestu reszt, lub sposobami rekombinacji DNA.
W opisie niniejszego wynalazku ujawniono także sekwencję DNA kodującą polipeptyd wirusowy PT-NANBH. Tę sekwencję DNA wytwarza się na drodze syntezy lub przez klonowanie. Korzystnie wytwarza się sekwencję DNA przedstawioną w sekwencjach o numerach identyfikacyjnych: 3, 4, 5, 18, 19, 20, 21 lub 22.
W celu otrzymania polipeptydu wirusowego PT-NANBH obejmującego wiele antygenów, korzystnie dokonuje się fuzji pojedynczych sekwencji kodujących w jedną otwartą ramkę odczytu. Fuzję przeprowadza się w taki sposób, aby nie nastąpiło znaczące ograniczenie aktywności antygenowej każdego antygenu spowodowane jego położeniem w stosunku do innych antygenów. Szczególną uwagę należy oczywiście zwrócić na charakter sekwencji w miejscu połączeń pomiędzy antygenami. Sposoby za pomocą których otrzymuje się takie pojedyncze polipeptydy są ogólnie dobrze znane.
W opisie niniejszego wynalazku ujawniono także wektor ekspresyjny zawierający zdefiniowaną tu sekwencję DNA, który to wektor jest zdolny do ekspresji sekwencji DNA w odpowiednim gospodarzu w celu wytworzenia polipeptydu wirusowego PT-NANBH.
Wektor ekspresyjny zawiera zwykle fragmenty kontrolujące DNA, które umożliwiają zajście ekspresji sekwencji DNA w odpowiednim gospodarzu. Fragmenty różnią się w zależności od gospodarza, zazwyczaj jednak obejmują promotor, miejsce wiązania rybosomu, miejsca początku i końca translacji oraz miejsce terminacji transkrypcji. Przykłady takich wektorów obejmują plazmidy i wirusy. Wektory ekspresyjne ujawnione w niniejszym opisie obejmują zarówno wektory pozachromosomalne, jak i wektory ulegające integracji z chromosomem komórki gospodarza. W przypadku wykorzystania wektora w E. coli, wektor ekspresyjny zawiera sekwencję DNA według postaci fuzji dowolnie połączonej z końcem albo 5', albo 3', sekwencji DNA kodującej, na przykład, B-galaktozydazę lub z końcem 3' sekwencji DNA kodującej, na przykład, gen trp E. W przypadku wykorzystania wektora w układzie bakulowirusa owadów (AoNPV), sekwencję DNA ewentualnie łączy się z sekwencją kodującą poliedrynę.
Niniejszy opis ujawnia także komórkę gospodarza stransformowaną zdefiniowanym tu wektorem ekspresyjnym.
Przykłady komórek gospodarza obejmują komórki prokariotyczne i eukariotyczne, takie jak komórki bakterii, drożdży, ssaków i owadów. Zwłaszcza, stosuje się takie komórki jak komórki E. coli, S. cerevisiae, P. pastoris, komórki jajnika chomika chińskiego i komórki myszy, oraz Spodoptera trugiperda i Tricoplusia ni, wybór komórki gospodarza zależy od licznych czynników, lecz w przypadku, gdy ważna jest potranslacyjna modyfikacja polipeptydu wirusowego PT-NANBH, korzystnie stosuje się komórki gospodarza eukariotycznego.
Polipeptyd wirusowy PT-NANBH można wytwarzać w ten sposób, że klonuje się lub syntetyzuje się sekwencje DNA kodującą polipeptyd wirusowy PT-NANBH, wstawia się tę sekwencję DNA do takiego wektora ekspresyjnego, który jest zdolny do ulegania ekspresji w odpowiednim gospodarzu, transformuje się komórki gospodarza wektorem ekspresyjnym, hoduje się stransformowane komórki gospodarza i izoluje się polipeptyd wirusowy.
Klonowanie sekwencji DNA prowadzi się znanymi sposobami. Istotne jest jednakże wykorzystanie danych sekwencyjnych ujawnionych w niniejszym opisie, tak aby ułatwić identyfikację i izolację pożądanej sklonowanej sekwencji DNA. Pożądane jest aby RNA izolować przez osadzanie wirusa z osocza zainfekowanych ludzi zidentyfikowanych dzięki ich udziałowi w przenoszeniu PT-NANBH. Wyizolowany RNA poddaje się odwrotnej transkrypcji na cDNA stosując albo startery losowe albo oligo-dT. Ewentualnie RNA poddaje się obróbce wstępnej w celu usunięcia wszystkich struktur drugorzędowych mogących interferować z syntezą cDNA, przykładowo przez ogrzewanie lub reakcję z wodorotlenkiem metylortęciowym. cDNA zazwyczaj modyfikuje się przez dodanie łączników, po którym następuje trawienie enzymem restrykcyjnym. Następnie wstawia się go do wektora klonującego, takiego jak pBR322 lub do pochodnej tego wektora, albo do wektorów lambda gtlO i gtll (Huynch i inni, DNA Clonmg, 1985, tom 1: A Practical Approach, Oxford, IRC Press) upakowy wanych odpowiednio
168 925 w wiriony i powstałą zrekombinowaną cząsteczkę DNA wykorzystuje się do transformowania E. coli, a zatem utworzenia pożądanej biblioteki, DNA.
Bibliotekę przeszukuje się stosując znaną strategię przeszukiwania. Jeśli biblioteka jest biblioteką ekspresyjną, można ją przeszukiwać stosując metodę immunologiczną z antysurowicami otrzymanymi z tego samego źródła osocza z którego pochodził RNA, a także antysurowicami pochodzącymi ze źródeł dodatkowych od ludzi, którzy, jak się przypuszcza, posiadają przeciwciała skierowane przeciwko PT-NANBH. Ponieważ ludzkie antysurowice zazwyczaj zawierają przeciwciała skierowane przeciwko E. coli, które mogą dawać wysokie tło podczas przeszukiwania, korzystnie wcześniej traktuje się te antysurowice lizatem niestransformowanej E. coli w celu usunięcia wszystkich takich przeciwciał. Korzystnie prowadzi się kontrolę negatywną stosując antysurowice z odpowiednich ludzkich dawców, to znaczy takich, których testowano wielokrotnie i nie znaleziono w nich przeciwciał przeciwko wirusowi. W alternatywnej strategii przeszukiwania wykorzystuje się jeden lub większą liczbę znakowanych oligonukleotydów. Jako sondy hybrydyzacyjne zastosowanie oligonukleotydów w poszukiwaniu biblioteki cDNA jest ogólnie prostsze i bardziej wiarygodne niż przeszukiwanie za pomocą antysurowic. Oligonukleotydy te syntetyzuje się, korzystnie stosując ujawnione w niniejszym opisie informacje o sekwencji DNA. W celu charakteryzacji i identyfikacji dodatnich klonów przeprowadza się jedną lub większą liczbę dodatkowych rund przeszukiwania tym samym lub innym sposobem.
Posiadając zidentyfikowany pierwszy dodatni klon, bibliotekę ponownie przeszukuje się pod kątem dodatkowych dodatnich klonów, stosując pierwszy klon jako sondę hybrydyzacyjną. Alternatywnie, lub dodatkowo, przygotowuje się następne biblioteki i przeszukuje się je stosując testy immunologiczne lub sondy hybrydyzacyjne. W ten sposób otrzymuje się dalsze sekwencje DNA.
Alternatywnie, syntetyzuje się sekwencję DNA kodującą polipeptyd wirusowy PT-NANBH. W pewnych okolicznościach synteza jest korzystniejsza od klonowania DNA (Gait, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, 1984 Oxford, IRL Press).
Sklonowaną lub zsyntezowaną pożądaną sekwencję DNA wstawia się do wektora ekspresyjnego stosując znane i standardowe techniki. Wektor ekspresyjny trawi się zwykle przy użyciu enzymów restrykcyjnych i sekwencję DNA wstawia się stosując ligację tępych lub lepkich końców. Cięcia dokonuje się zazwyczaj w miejscu restrykcyjnym w dogodnej pozycji wektora ekspresyjnego tak, że po wbudowaniu sekwencja DNA pozostaje pod kontrolą fragmentów funkcjonalnych DNA, co uniemożliwia ekspresję.
Transformację komórki gospodarza prowadzi się przy zastosowaniu znanych sposobów. Zazwyczaj do rozróżnienia pomiędzy transformantami które z powodzeniem pobrały, a tymi które nie pobrały wektora ekspresyjnego, wykorzystuje się pewne markery fonotypowe. Stransformowane komórki gospodarza hoduje się znanymi sposobami i izoluje się polipeptyd wirusowy PT-NANBH przy zastosowaniu znanych technik.
Tak wytworzony polipeptyd stosuje się do wytwarzania przeciwciała specyficznego wobec polipeptydu wirusowego PT-NANBH. Wytwarza się przeciwciało poliklonalne lub monoklonalne. Przeciwciała takie stosuje się w kontroli jakości do testowania serii polipeptydu wirusowego PT-NANBH; do oczyszczania polipeptydu wirusowego PT-NANBH lub lizatu wirusowego; do mapowania epitopów; po wyznakowaniu, jako koniugat w oznaczaniu typu współzawodniczego, do wykrywania przeciwciał i do oznaczenia i wykrywania antygenów.
Przeciwciało poligonalne skierowane przeciwko polipeptydowi wirusowemu PT-NANBH otrzymuje się przez iniekcję polipeptydu wirusowego PT-NANBH, dowolnie sprzężonego z nośnikiem w celu pobudzania odpowiedzi immunologicznej, gospodarzowi będącemu ssakiem, takim jak mysz, szczur, owca lub królik. Tak wytworzone przeciwciało odzyskuje się. Polipeptyd wirusowy PT-NANBH podaje się na ogół w postaci odpowiedniej do iniekcji, w której polipeptyd jest zmieszany z fizjologicznie dopuszczalnym rozcieńczalnikiem. Do postaci tej można włączyć adiuwanty, takie jak kompletny adiuwant Freunda (FCA) lub niekompletny adiuwant Freunda (FIA). Tę postać wstrzykuje się zwykle gospodarzowi w ciągu odpowiedniego okresu czasu, w odpowiednich odstępach czasu pobiera się próbki osocza do oznaczania przeciwciała anty-wirus PT-NANBH. Po wykryciu odpowiedniego poziomu aktywności,
168 925 pobiera się krew od gospodarza. Następnie, stosując standardowe techniki, np. chromatografię na białku A lub chromatografię jonowymienną, przeciwciało ekstrahuje się i oczyszcza z osocza krwi.
Przeciwciało mozoklonalno skierowane przeciwko polipeptydowi wirusowemu PT-NANBH można otrzymać na drodze fuzji komórek nieśmiertelnej linii komórkowej z komórkami wytwarzającymi przeciwciało skierowane przeciwko polipeptydowi wirusowemu. Następnie hoduje się otrzymaną na skutek fuzji nieśmiertelną linię komórkową. Zazwyczaj polipeptydem wirusowym inokuluje się gospodarza będącego ssakiem innym od człowieka, takiego jak mysz lub szczur. Po upływie odpowiedniego czasu potrzebnego do wytworzenia u gospodarza przeciwciał, usuwa się komórki wytwarzające przeciwciała, takie jak splezocyty. Komórki nieśmiertelnej linii komórkowej, takiej jak linii komórkowej szpiczaka myszy lub szczura, poddaje się fuzji z komórkami wytwarzającymi przeciwciała, i produkty fuzji testuje się w celu identyfikacji linii komórkowej, takiej jak hybrydoma, która wydziela pożądane przeciwciało mozoklozalne. Powstałą w wyniku fuzji linię komórkową hoduje się, a przeciwciało monoklozalne oczyszcza się z podłoża hodowlanego w sposób podobny do oczyszczania przeciwciała poligonalnego. Próby diagnostyczne oparte na sposobie wykrywania według wynalazku stosuje się do określania obecności lub nieobecności PT-NANBH. Stosuje się je również do monitowania leczenia takich infekcji, przykładowo w terapii interferonowej.
W próbie stosowanej w celu diagnozowania infekcji wirusowej stosuje się trzy zasadniczo różne sposoby obejmujące wykrywanie wirusowego kwasu nukleinowego. Wykrywanie antygenu wirusowego lub przeciwciał skierowanych przeciwko wirusowi. Wirusowy kwas nukleinowy na ogół uważa się za najlepszy wskaźnik obecności samego wirusa, służy on do diagnozowania w przypadku prawdopodobnie zainfekowanego materiału. Wykrywanie kwasu nukleinowego nie jestjodnrkże zazwyczaj tak prostejak wykrywanie antygenów lub przeciwciał, ponieważ poziom kwasu nukleinowego może być bardzo niski. Antygen wirusowy wykorzystuje się jak marker obecności wirusa i jako wskaźnik infekcyjności. W zależności od wirusa, ilość obecnego w próbce antygenu może być bardzo niska i trudna do wykrycia. Wykrywanie przeciwciał jest stosunkowo proste, ponieważ, w rzeczywistości, układ immunologiczny gospodarza wzmacnia odpowiedź na infekcję przez wytwarzanie dużych ilości krążących przeciwciał. Charakter odpowiedzi humora^ej często może być użyteczny klinicznie, na przykład, na niedawną infekcję wskazuje raczej klasa przeciwciał IgM niż IgG, lub odpowiedź na konkretny antygen wirusowy może być związana ze stopniem zniszczenia wirusa. A zatem, dokładne dopasowanie sposobu diagnozowania infekcji wirusowej zależy od konkretnych okoliczności i potrzebnych informacji. W przypadku PT-NANBH, oznaczenie diagnostyczne może wykorzystywać jeden z tych trzech sposobów.
Pierwszy sposób wykrywania wirusowego kwasu nukleinowego polega na tym, ze hybradyzujo się wirusowy RNA obecny w testowanej próbce, lub cDNA syntezowany na matrycy takiego wirusowego RNA, o sekwencji DNA odpowiadającej sekwencji nukleotydowoj o numerach identyfikacyjnych: 3,4,5,18,19,20,21 lub 22, i testuje się powstałe hybrydy kwasów nukleinowych w celu identyfikacji wirusowego kwasu nukleinowego PT-NANBh. Zastosowanie tego sposobu ogranicza się zazwyczaj do testowanej próbki odpowiedniej tkanki, takiej jak pochodząca z biopsji tkanka wątroby, w której prawdopodobna jest obecność wirusowego RNa na wysokim poziomie. Sekwencja DNA odpowiadająca sekwencjom zukleotydowam o numerach identyfikacyjnych: 3, 4, 5, 18, 19, 20, 21 lub 22 może przybierać formę sekwencji oligozukleotadowej lub sekwencji cDNA ewentualnie zawartej w plazmidzie. Testowanie hybryd kwasów nukleinowych przeprowadza się stosując znakowaną sekwencję DNA. W celu dalszej charakteryzacji hybryd, a zatem identyfikacji wirusowego kwasu nukleinowego PT-NANBH, przeprowadza się jedną lub większą liczbę dodatkowych rund testowania tym samym lub innym sposobem. Etapy hybrydyzacji i testowania przeprowadza się zgodnie ze znanymi sposobami.
Z powodu ograniczonego zastosowania tego sposobu w oznaczaniu wirusowego kwasu nukleinowego, korzystna i bardziej dogodna metoda polega na tym, ze syntetyzuje się cDNA na matrycy wirusowego RNA obecnego w testowanej próbce, amplifikuje się wstępnie wyselekcjonowaną sekwencję DNA odpowiadającą sursekwezcji sekwencji zuklootydowych o numerach
168 925 identyfikacyjnych: 3, 4, 5, 18, 19, 20, 21 lub 22 i identyfikuje się wstępnie wyselekcjonowaną sekwencję DNA. Testowaną próbkę stanowi próbka każdej odpowiedniej tkanki lub płynu fizjologicznego, który korzystnie zatęża się pod względem obecnego wirusowego RNA. Przykłady odpowiedniej tkanki obejmują tkankę pochodzącą z biopsji wątroby. Przykłady odpowiednich płynów fizjologicznych obejmują mocz, osocze, krew, surowicę, nasienie, łzy, ślinę lub płyn mózgowo-rdzeniowy. Korzystnie stosuje się surowicę i osocze.
Syntezę cDNA zwykle przeprowadza się na drodze odwrotnej transkrypcji z zastosowaniem starterów losowych, starterów określonych lub starterów oligo-dT. Korzystnie stosuje się starter stanowiący oligonukleotyd o sekwencji nukleotydowej odpowiadającej sekwencji o numerach identyfikacyjnych: 3, 4, 5, 18, 19, 20, 21 lub 22, który przeznaczony jest do wzbogacenia cDNA zawierającego wstępnie wyselekcjonowaną sekwencję.
Amplifikację wstępnie wyselekcjonowanej sekwencji DNA przeprowadza się korzystnie stosując technikę reakcji łańcuchowej polimerazy (PGR) (Saiki i inni, Science, 1985, 230, 1350-4). W technice tej wykorzystuje się parę starterów oligonukleotydowych, z których jeden odpowiada części sekwencji nukleotydowej o numerach identyfikacyjnych: 3, 4, 5, 18, 19, 20, 21, lub 22, a drugi z nich zlokalizowany jest po stronie 3' pierwszego startera i odpowiada części sekwencji komplementarnej. Para starterów określa zawartą miedzy nimi wstępnie wyselekcjonowaną sekwencję DNA. Oligonukleotydy posiadają zazwyczaj długość przynajmniej 15, najkorzystniej 20 do 26 zasad 1, chociaż niewielkie błędy mogą być tolerowane przez zmianę warunków reakcji, koniec 3' oligonukleotydów powinien być dokładnie komplementarny aby startery działały efektywnie. Odległość pomiędzy końcem 3' oligonukleotydów może wynosić od około 100 do około 2000 zasad. Dogodnie, jednego z pary oligonukleotydów stosowanych w tej technice używa się także jako startera do syntezy cDNA. Samą technikę PGR przeprowadza się z cDNA w formie jednoniciowej, stosując enzym, taki jak polimeraza Taq, 1 nadmiar starterów oligonukleotydowych przez 20 - 40 cykli zgodnie z opublikowanymi procedurami (Salki i inni, Science, 1988, 239, 487 - 491).
W celu udoskonalenia sposobu przeprowadza się kilka rund amplifikacji, z których w każdej stosuje się inną parę oligonukleotydów jako startery. A zatem, po pierwszej rundzie amplifikacji, w drugiej rundzie stosuje się wewnętrzną parę oligonukleotydów określających krótszą sekwencję DNA (o długości od 50 do 500 zasad). W tym nieco bardziej pewnym udoskonaleniu zwanym Nested PCR jest ona oczywiście końcową zamplifikowaną sekwencją DNA, która stanowi sekwencję wstępnie wyselekcjonowaną. (Kemp i inni, Proc. Natl. Acad, Sci., 1989, 86(7), 2433-7 i Mullis i inni, Methods in Enzymology, 1987, 155, 335-350).
Wyselekcjonowaną uprzednio sekwencję DNA identyfikuje się przez analizę produktów PCR na żelu agarozowym. Obecność prążka o masie cząsteczkowej obliczonej dla wyselekcjonowanej uprzednio sekwencji stanowi dodatni wskaźnik obecności wirusowego kwasu nukleinowego w testowanej próbce. Alternatywne sposoby identyfikacji obejmują metody oparte na blottingu Southerna, dot-blottingu, trawieniu restrykcyjnym oligomerów i sekwencjonowaniu DNA.
Niniejszy opis ujawnia także zestaw testujący do wykrywania wirusowego kwasu nukleinowego PT-NANBH, który zawiera:
I) parę starterów oligonukleotydowych, z których jeden odpowiada części sekwencji nukleotydowej o numerach identyfikacyjnych: 3, 4, 5, 18, 20, 21 lub 22, a drugi z nich zlokalizowany jest po stronie 3' pierwszego startera i odpowiada części sekwencji komplementarnej. Para starterów określa zawartą miedzy nimi wstępnie wyselekcjonowaną sekwencję DNA;
II) odwrotną transkryptazę do syntezy cDNA na matrycy RNA testowanej próbki na odcinku od startera odpowiadającego sekwencji nukleotydowej komplementarnej do sekwencji o numerach identyfikacyjnych: 3, 4, 5, 18, 19, 20, 21 lub 22;
III) enzym zdolny do amplifikacji wstępnie wyselekcjonowanej sekwencji DNA i ewentualnie;
IV) roztwory do przemywania i bufory reakcyjne.
Zestaw testujący może także zawierać dodatnią próbkę kontrolną ułatwiającą identyfikację wirusowego kwasu nukleinowego.
168 925
Charakterystyki starterów i enzymów są korzystnie takie jak opisano powyżej w związku z techniką PCR.
Sposób wykrywania antygenu wirusowego PT-NANBH i przeciwciała przeciwko antygenowi wirusowemu PT-NANBH według wynalazku polega na tym, że kontaktuje się testowaną próbkę z polipeptydem wirusowym PT-NANBH o sekwencji aminokwasowej homologicznej przynajmniej w 90% z sekwencją aminokwasową podaną w sekwencjach o numerach identyfikacyjnych: 3, 4, 5, 18, 19, 20, 21 lub 22 przedstawionych odpowiednio na fig. 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 lub jej fragmentem antygenowym, lub z poliklonalnym albo z monoklonalnym przeciwciałem przeciwko takiemu polipeptydowi wirusowemu i ustala się czy w testowanej próbie występuje jakiekolwiek wiązanie antygen-przeciwciało. Testowaną próbkę do wykrywania wirusowego kwasu nukleinowego pobiera się z każdej ze wspomnianych powyżej odpowiednich tkanek oraz z płynów fizjologicznych. Jeśli otrzymuje się płyn fizjologiczny ewentualnie zatęża się go pod kątem obecnego antygenu wirusowego lub przeciwciała skierowanego przeciwko wirusowi.
W sposobie według wynalazku korzystnie testowaną próbkę kontaktuje się z sekwencją aminokwasową homologiczną przynajmniej w 90% z sekwencją aminokwasową podaną w sekwencjach o numerach identyfikacyjnych 3,4 lub 5, przedstawionych odpowiednio na fig. 4, 5, 6 lub jej fragment antygenowy. W sposobie wykrywania antygenu wirusowego PT-NANBH korzystnie stosuje się także sekwencję aminokwasową homologiczną z sekwencją aminokwasową podaną w sekwencjach o numerach identyfikacyjnych 3 lub 4, przedstawionych odpowiednio na fig. 4, 5, lub jej fragment antygenowy, lub także taką sekwencję aminokwasową, która jest homologiczna przynajmniej w 90% z sekwencją aminokwasową podaną w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 5, przedstawionej na fig. 6, lub jej fragment antygenowy. Jeszcze bardziej korzystnie stosuje się sekwencję aminokwasową, homologiczną przynajmniej w 95% z sekwencją aminokwasową podaną w sekwencjach o numerach identyfikacyjnych 3,4, 5, 18, 19, 20, 21 lub 22 przedstawionych odpowiednio na fig, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 lub jej fragment antygenowy, lub też sekwencję aminokwasową homologiczną przynajmniej w 98% z sekwencją aminokwasową podaną w sekwencjach o numerach identyfikacyjnych 3,4, 5,18, 19, 20, 21 lub 22 przedstawionych odpowiednio na fig. 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 lub jej fragment antygenowy.
Ponadto przedmiotem wynalazku jest także sposób wykrywania przeciwciała przeciwko antygenowi wirusowemu PT-NANBH, polegający na tym, że kontaktuje się testowaną próbkę z jednym lub większą ilością wirusowych polipeptydów PT-NANBH, które to polipeptydy zawierają dwa lub większą ilość wirusowych antygenów PT-NANBH występujących w kombinacji albo połączonych przez fuzję i stanowiących pojedynczy polipeptyd, przy czym co najmniej jeden z tych antygenów pochodzi ze strukturalnego regionu kodującego wirusa i co najmniej jeden inny z tych antygenów pochodzi z mestrukturalnego regionu kodującego wirusa i ustala się, czy w materiale testowanej próbki występuje jakiekolwiek wiązanie antygen-przeciwciało. Korzystnie stosowany w sposobie według wynalazku antygen kodowany przez strukturalny region kodujący, posiada sekwencję aminokwasową homologiczną przynajmniej w 90% z sekwencją aminokwasową podaną w sekwencji aminokwasowej o numerze identyfikacyjnym 5 przedstawionej na fig. 6 lub jej fragment antygenowy, i antygen kodowany przez niestrukturalny region kodujący, który to antygen posiada sekwencję aminokwasową homologiczną przynajmniej w 90% z sekwencją aminokwasową podaną w sekwencjach o numerach identyfikacyjnych 3 lub 4, przedstawionych odpowiednio na fig. 4, 5 lub jej fragment antygenowy.
Do tak przedstawionego sposobu wykrywania antygenu wirusowego dostosowane są różnorodne techniki i sposoby jego oznaczania.
Polipeptyd wirusowy można zastosować do specyficznego wychwytywania przeciwciała skierowanego przeciwko PT-NANBH z roztworu, do specyficznego znakowania przeciwciała już wychwyconego lub do zarówno wychwytywania, jak i znakowania przeciwciała. Ponadto, polipeptyd wirusowy można zastosować w różnych homogennych sposobach oznaczania, w których wykrywa się przeciwciała reaktywne wobec antygenu w roztworze, bez rozdziału faz.
Typy oznaczeń, w których do wychwytywania przeciwciała z roztworu stosuje się polipeptyd wirusowy PT-NANBH, obejmują immobilizację polipeptydu na stałej powierzchni. Powinno być możliwe przemywanie powierzchni w jakikolwiek sposób. Przykłady odpowied10
168 925 nich powierzchni obejmują polimery różnych typów (odlewanych w kształcie studzienek do mikromiareczkowania; perełek; różne typy prętów; końcówki aspiratora; elektrody i przyrządy optyczne), cząstki (na przykład lateks; stabilizowane krwinki czerwone; komórki bakteryjne lub grzybowe; zarodniki; złoto lub inne zole metaliczne lub zawierające metal i koloidy białkowe) o wielkości cząstek od 0,02 do 5 mikrometrów; membrany (np. nitrocelulozowe; papier; octan celulozy i membrany o dużej porowatości/dużej powierzchni z materiału organicznego lub nieorganicznego).
Wiązanie polipeptydu wirusowego PT-NANBH z powierzchnią może następować w wyniku biernej adsorpcji z roztworu o optymalnym składzie, który zawiera środki powierzchniowo czynne, rozpuszczalniki, sole i/lub czynniki chaotropowe, lub może następować na drodze aktywnego wiązania chemicznego. Aktywne wiązanie może zachodzić poprzez różnorodne reaktywne lub mogące ulegać aktywacji grupy funkcjonalne, które eksponowane są na powierzchni (na przykład czynniki kondensujące; aktywne estry kwasowe, halogenki i bezwodniki; grupy aminowe, hydroksylowe lub karboksylowe; grupy sulfhydrylowe; grupy karbonylowe; grupy diazowe lub nienasycone). Ewentualnie aktywne wiązanie może zachodzić poprzez białko (związane z powierzchnią biernie lub przez aktywne wiązanie), takie jak albumina lub kazeina, z którym chemicznie związuje się polipeptyd wirusowy przy zastosowaniu różnych metod. Ten sposób zastosowania białka może stanowić zaletę z powodu punktu izoelektrycznego, ładunku, hydrofilowości lub innych właściwości fizykochemicznych. Polipeptyd wirusowy można także związać z powierzchnią (zazwyczaj, choć niekoniecznie, membraną) po elektroforetycznym rozdziale mieszaniny reakcyjnej, takim jak immunoprecypitacja.
Po zetknięciu (reakcji) powierzchni niosącej polipeptyd wirusowy PT-NANBH z testowaną próbką, pozostawieniu czasu na przereagowanie i, jeśli jest to konieczne po usunięciu nadmiaru próbki jednym z wielu sposobów (takich jak przemywanie, wirowanie, sączenie, działanie magnetyczne lub kapilarne), wychwycone przeciwciało wykrywa się różnymi sposobami, takimi które zapewniają wykrywalny sygnał. Można to osiągnąć, na przykład, przez zastosowanie znakowanej cząsteczki lub cząstki, jak to opisano powyżej, która reaguje z wychwyconym przeciwciałem (na przykład białko A, białko G i podobne; przeciwciała skierowane przeciwko immunoglobulinom określonych gatunków lub podklasom immunoglobulin; czynnik reumatoidalny lub przeciwciało skierowane przeciwko antygenowi, zastosowano w sposób współzawodniczy lub blokujący, lub każdej cząsteczki zawierającej epitop zawarty w polipeptydzie.
Wykrywalny sygnał może być sygnałem optycznym, radioaktywnym lub fizykochemicznym, i uzyskuje się go bezpośrednio przez znakowanie cząsteczki lub cząstki na przykład barwnikiem, znacznikiem radioaktywnym, aktywnym elektrycznie lub wykazującym rezonans magnetyczny lub fluoroforem, lub pośrednio, przez znakowanie cząsteczki lub cząstki enzymem zdolnym do wywołania mierzalnej zmiany jakiegokolwiek rodzaju. Alternatywnie, jeśli powierzchnia ma postać cząstek, wykrywalny sygnał można uzyskać stosując, na przykład, aglutynację, lub poprzez dyfrakcję lub efekt podwójnego załamania.
Oznaczenia, w których do znakowania przeciwciała już wychwyconego stosuje się sam polipeptyd wirusowy, wymagają pewnych form znakowania antygenu, które umożliwiać będą jego wykrycie. Znakowanie można przeprowadzać bezpośrednio przez chemiczne lub bierne wiązanie, na przykład, znacznika radioaktywnego, znacznika rezonansu magnetycznego, znacznika cząstkowego lub enzymatycznego z polipeptydem, lub pośrednio, przez wiązanie jakiejkolwiek postaci znacznika z cząsteczką, która sama będzie reagować z polipeptydem. Znacznik z polipeptydem wirusowym PT-NANBH można wiązać bezpośrednio, przez grupę już obecną w polipeptydzie, taką jak grupa aminowa, lub przez grupę pośredniczącą, taką jak grupa maleimidowa. Przeciwciało może być wychwytywane przez każdy reagent na każdej ze wspomnianych już powierzchni dzięki biernej lub aktywnej adsorpcji której wynikiem będzie związanie przeciwciała lub kompleksów immunologicznych. W szczególności, przeciwciała mogą być wychwytywane przez przeciwciała skierowane przeciwko immunoglobulinom określonych gatunków lub podklasom immunoglobulin; czynnik reumatoidalny, białka A i C i podobne, lub przez każdą cząsteczkę zawierającą epitop zawarty w polipeptydzie.
168 925
Znakowany polipeptyd wirusowy PT-NANBH stosuje się we współzawodniczym sposobie wiązania, w którym jego wiązanie z każdą specyficzną cząsteczką na każdej z powierzchni podanych przykładowo powyżej blokuje antygen zawarty w próbce. Alternatywnie, polipeptyd można stosować w sposób, w którym antygen w próbce wiąże się specyficznie lub niespecyficznie z każdą z powierzchni podanych powyżej i wiąże się także ze specyficzną cząsteczką dwulub wielowartościową (np. przeciwciałem) o pozostałych wartościowościach walencyjnych, które wychwytują znakowany polipeptyd.
Często w homogoznych sposobach oznaczania oddzielnie znakuje się polipeptyd wirusowy PT-NANBH i przeciwciało tak, że kiedy przeciwciało reaguje z polipeptydem wirusowym w wolnym roztworze, dwa znaczniki oddziaływują ze sobą, co umożliwia na przykład bezpromiezisty transfer energii z jednego znacznika do drugiego, i stwarza możliwość detekcji wzbudzonego drugiego znacznika lub wygaszonego pierwszego (np. przez fluorymetrię, rezonans magnetyczny lub pomiar enzymatyczny). Wynikiem dodania w próbce polipeptydu wirusowego bądź przeciwciała jest ograniczenie oddziaływań pary znaczników, a zatem inny poziom sygnału w detektorze.
Odpowiednim oznaczeniem do wykrywania przeciwciała skierowanego przeciwko PT-NANBH jest bezpośrednie oznaczenie immunoenzymatyczno typu sazdwich (EIA). Aolipoptydem wirusowym PT-NANBH opłaszcza się studzienki do mikromiareczkowania. Jednocześnie dodaje się testowaną próbkę oraz polipeptyd wirusowy PT-NANBH sprzężony z enzymem. Przeciwciała skierowane przeciwko PT-NANBH obecne w testowanej próbce wiążą się zarówno z polipeptydem wirusowym opłaszczającym studzienkę, jak i z polipeptydem wirusowym sprzężonym z enzymem. Zazwyczaj po obu stronach sandwicha stosuje się ten sam polipeptyd wirusowy. Po przepłukaniu, związany enzym wykrywa się stosując specyficzny substrat zmieniający barwę po przejściu w produkt. Zestaw testujący do stosowania w oznaczeniu EIA zawiera:
(1) polipeptyd wirusowy PT-NANBH znakowany enzymem;
(2) substrat enzymu;
(3) rroeek dotrerkaająay pnwlekccnni na ^ο^ immobilizuie się polieeptyd wiruspwy PT-NANBH; i (4) ewentualnie roztwory do przemywania i/lub bufory.
Opis figur rysunku:
Fig. 1 przedstawia wytwarzanie plazmidu pDX122 opisanego w przykładzie VII.
Fig. 2 przedstawia wytwarzanie dwóch alternatywnie sfuzjowanach sekwencji opisanych w przykładzie XVII.
Fig. 3 przedstawia mapy restrykcyjne sokwencji o numerach identyfikacyjnych 21 i 22.
Fig. 4 przedstawia sekwencję o numerze identyfikacyjnym 3.
Fig. 5 przedstawia sekwencję o numerze identyfikacyjnym 4.
Fig. 6 przedstawia sekwencję o zumorzo identyfikacyjnym 5.
Fig. 7 przedstawia sekwencję o numerze identyfikacyjnym 18.
Fig. 8 przedstawia sekwencję o numerze identyfikacyjnym 19.
Fig. 9 przedstawia sekwencję o numerze identyfikacyjnym 20.
Fig. 10 przedstawia sekwencję o numerze identyfikacyjnym 21.
Fig. 11 przedstawia sekwencję o numerze identyfikacyjnym 22.
Fig. 12 przedstawia sekwencję o numerze identyfikacyjnym 24.
Fig. 13 przedstawia sekwencję o numerze identyfikacyjnym 25.
Następujące przykłady podano w celu zilustrowania ziniejszogo wynalazku.
Przykład I Synteza cDNA
Połączone osocza (160 ml) pochodzące od dwóch osobników (określonych jako A - L), o których wiadomo było, że zostali zarażeni NANBH przez transfuzję rozcieńczono (1:2,5) solą fizjologiczną zbuforowaną fosforanem (PBS), a następnie wirowano przy 190 000g (np. 30 000 rpm w roztworze MSE 8x50) przez 5 godzin w temperaturze 4°C. Supernatant zachowano jako źródło specyficznych przeciwciał do późniejszego przeszukiwania bibliotek cDNA. Osad ponownie zawieszono w 2 ml buforu o składzie: 20 mM Tris-HCl, 2 MM EDTA, 3% SDS, 0,2 M NaCl (2xPK), ekstrahowano trzykrotnie równą objętością fenolu, trzykrotnie chloroformem i
168 925 raz eterem, a następnie 2,5 objętościami etanolu w temperaturze -20°C. Osad ponownie zawieszano w 10 gl buforu o składzie: 10 mM Tris-HCl, i mM EDTA o pH 8,0 (TE).
Kwas nukleinowy zastosowano jako matrycę w zestawie do syntezy cDNA (Amersham International plc, Amersham, Wielka Brytania), a jako startery zarówno oligo-dT jak i losowo wybrane heksanukleotydy. Warunki reakcji zastosowano zgodnie z zaleceniami dostawcy zestawu. Szczegółowo, do reakcji syntezy pierwszej nici zastosowano 1 gl kwasu nukleinowego, którą wyznakowano [α-32ρ] dCTP (Amersham; aktywność właściwa 3000 Ci/mmol) w objętości końcowej 20gl i inkubowano w temperaturze 42°C przez 1 godzinę. Całą mieszaninę reakcyjną po syntezie pierwszej nici zastosowano następnie w reakcji syntezy drugiej nici. Mieszanina reakcyjna zawierająca RNazę H E. coli (0,8 U) i polimerazę DNA I w objętości końcowej 100 gl inkubowano w przez 60 minut temperaturze 12°C, a następnie przez 60 minut w temperaturze 22°C. Całą mieszaninę reakcyjną inkubowano następnie przez 10 minut w temperaturze 70°C, umieszczono na lodzie, dodano 1 U polimerazy DNA faga T4 i następnie inkubowano przez 10 minut w temperaturze 37°C. Reakcję zatrzymano przez dodanie 5μΐ 0,2 M EDTA o pH 8.
Niewbudowane nukleotydy usunięto z mieszaniny reakcyjnej na kolumnie NICK (Pharmacia Ltd, Milton Keynes, Wielka Brytania). Następnie DNA ekstrahowano dwukrotnie fenolem, trzykrotnie chloroformem i raz eterem, a następnie, przed wytrąceniem 2,5 objętościami 100% etanolu, dodano 20 μg dekstranu.
Przykład II. Wytwarzanie bibliotek ekspresyjnych
Wysuszony osad cDNA ponownie zawieszono w 5 μl jałowego TE i następnie inkubowano przez 3 godziny w temperaturze 15°C z 500 ng łączników EcoRI (Pharmacia; GGAATTCC ufosforylowany) i 0,5 U ligazy DNA faga T4 (New England BioLabs, Beverley, MA, USA) w roztworze o objętości końcowej 10 gl zawierającym 20 mM Tris-HCL pH 7,5, 10 mM MgCh, 10 mM DTT, 1 mM ATP. Ligazę zinaktywowano przez ogrzewanie w temperaturze 65°C przez 10 minut i cDNA trawiono przez 1 godzinę w temperaturze 37°C 180 U restryktazy EcoRI (BCL, Lewes, Wielka Brytania) w końcowej objętości 100 gl. Dodano EDTA do stężenia końcowego 10 mM i całą mieszaninę reakcyjną nałożono na kolumnę z AcA34 (LKB). Zbierano frakcje (50 gl) i mierzono ich radioaktywność w liczniku scyntylacyjnym. Zebrano pik cDNA w objętości elucyjnej (980 cpm), ekstrahowano dwukrotnie fenolem, trzykrotnie chloroformem i raz eterem, a następnie wytrącono etanolem.
Dwuniciowy cDNA ponownie zawieszono w 5 gl TE i ligowano przez noc w temperaturze 15°C z ramionami EcoRI faga lambda gtii (Gibco, Paisley, Szkocja) w 10μ1 mieszaniny reakcyjnej zawierającej 0,5 U ligazy DNA faga T4, 66 mM Tris-HCl, 10 mM MgCL, 15 mM DTT, pH 7,6. Po inaktywacji ligazy przez ogrzewanie przez 10 minut w temperaturze 65°C, 5 (gl mieszaniny reakcyjnej dodano do zestawu do pakowania do kapsydów Amersham i inkubowano w temperaturze 22°C przez 2 godziny. Miano upakowanego materiału określano na szczepie E. coli Y1090 (Huynh i in., 1985) i stwierdzono 2,6x104 rekombinantów.
Komórki do wysiewania (Y1090) przygotowano przez inokulację 10 ml L-bulionu pojedynczą kolonią z płytki agarowej i wytrząsanie przez noc w temperaturze 37°C. Następnego dnia 0,5 ml nocnej hodowli rozcieńczono 10 ml świeżego L-bulionu i dodano 0,1 ml MgSO4 oraz 0,1 ml 20% (w/v) maltozy. Hodowlę wytrząsano przez 2 godziny w temperaturze 37°C, bakterie zebrano przez wirowanie przy 5 000g przez 10 minut i ponownie zawieszono w 5 ml 10 mM MgS O4 w celu przygotowania zawiesiny podstawowej komórek do wysiewania. Część (1 gl) upakowanego materiału zmieszano z 0,2 ml komórek przygotowanych do wysiewania, inkubowano przez 20 minut w temperaturze 37°C przed dodaniem 3 ml agaru i całą mieszaninę wylano jako wierzchnią warstwę na płytki o średnicy 90 mm z L-agarem. Po całonocnej inkubacji w temperaturze 37°C liczono łysinki na płytkach i określono całkowitą liczbę zrekombinowanych fagów. Pozostały upakowany materiał przechowywano w temperaturze 4°C.
W zasadniczo podobny sposób przygotowano dodatkowe biblioteki.
Przykład III. Przeszukiwanie bibliotek ekspresyjnych
Opisaną w przykładzie II początkową bibliotekę wysiano na szczep Y1090 E. coli w stężeniu około 5x103jednostek łysinkotwórczych na płytkę o średnicy 140 mm i namnażano przez 2 godziny w temperaturze 37°C, dopóki łysinki nie stały się widoczne. Na 3 godziny
168 925 pozostawiono w styczności z płytką jałowe sączki nitrocelulozowe impregnowane IPTG (izopropylotiogalaktozydem), i następnie usunięto je. Sączki najpierw blokowano przez inkubację z roztworem blokującym [3% (w/v) BSA (albumina surowicy bydlęcej)/TBS-Tween (10 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 0,05% (v/v) Tween 20) zawierającym 0,05% bronidoks] (20 ml/sączek), a następnie przeniesiono do buforu do wiązania [1% (w/v) BSA/TBSTween zawierającego 0,05% bronidoks] zawierającego oczyszczone (przez chromatografię jonowymienną) przeciwciała pochodzące z połączonych osoczy osobników A i L (20 gg/ml). Po inkubacji w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, sączki przemyto trzykrotnie TBS-Tween, a następnie inkubowano w buforze do wiązania zawierającym biotynylowane przeciwciała owcy skierowane przeciwko immunoglobulinom ludzkim (1:250). Po jednej godzinie w temperaturze pokojowej sączki trzykrotnie przemyto TBS/Tween, a następnie inkubowano w buforze do wiązania zawierającym kompleks streptawidynOperoksydaza (1:100). Reakcję barwną wywoływano DAB (diaminobenzydyną). Dodatnia reakcja uwidaczniała się w postaci (zabarwionych) łysinek.
Spośród całkowitej liczby 2,6 x 104przetestowanych łysinek, w wyniku pierwszej rundy przeszukiwania otrzymano 8 dodatnich rekombinantów. Stosując sączki jako wzorzec przeniesiono, stosując jałowe pipety pasterowskie, regiony oryginalnych płytek odpowiadające tym dodatnim sygnałom. Czopy agaru zawieszono w 0,1 ml buforu SM i umożliwiono fagom oddyfundowanie. Na szczepie Y1090 E. coli określono miano faga z każdego czopa agarowego. Następnie zawiesinę podstawową fagów każdego czopa agarowego ponownie przetestowano j ak uprzednio, na pojedynczych płytkach o średnicy 90 mm przy stężeniu około 1 x 103jednostek łysinkotwórczych na płytkę. Spośród 8 dodatnich rekombinantów z pierwszej rundy, w drugiej rundzie jeden był wyraźnie dodatni, tj. dodatnich było >1 % łysinek, nazwano je JG2. Odpowiada częstości dodatnich rekombinantów w bibliotece 40/106.
Ten, i inne dodatnie fagi zidentyfikowane w podobny sposób w innych opisanych bibliotekach, oczyszczono przez powtórzone rudy testowania łysinek przy niższej gęstości (1 - 200 jednostek łysinkotwórczych/płytkę o średnicy 90 mm) do momentu aż 100% łysinek nie było dodatnich w testowaniu przeciwciałem pochodzącym z osoczy osobników A i L. Trzema takimi zrekombinowanymi fagami były JG1, JG2 i JG3.
Przykład IV. Powtórne testowanie JG1, JG2 i JG3 z zestawami surowic.
Każdy ze zrekombinowanych fagów, JG1, JG2 i JG3, oczyszczono z łysinek i przechowywano jako zawiesinę podstawową o określonym mianie w buforze SM w temperaturze 4°C. Fagi te mieszano (1:1) z zawiesiną faga określonego w przykładzie III jako ujemny, i mieszaninę stosowano do infekowania szczepu Y1090 E. coli przy stężeniu 1000 jednostek łysinkotwórczych na płytkę. Białka z łysinek przenoszono na sączki i postępowano z nimi jak opisano w przykładzie III, z tym wyjątkiem, że sączki cięto na ćwiartki, a każdą ćwiartkę inkubowano z innym przeciwciałem; były to przeciwciała z połączonych surowic osobników A i L (20 (ig/ml), osocze A (1:500), osocze L (1:500) i IgG pacjenta H (20 gg/ml). Oczekiwano, że pacjent H okaże się dodatnim pod względem obecności przeciwciał skierowanych przeciwko PT-NANBH, ponieważ był on chorym na hemofilię otrzymującym czynnik VIII nie poddawany obróbce cieplnej. Po zakończeniu reakcji każdy sączek oceniano jako dodatni (kiedy wyraźnie występowały dwie klasy sygnałów) lub ujemny (kiedy wszystkie łysinki dawały ten sam sygnał). Mogła to być ocena subiektywna, i dlatego porównywano oceny, i tylko te sączki uznawano za dodatnie, gdzie zachodziła największa zgodność. Wyniki przedstawiono w tabeli 1.
Tabela 1
| A i L | A | L | H | |
| JG1 | + | + | - | |
| JG2 | + | + | + | + |
| JG3 | + | + | + | + |
JG1, jak się okazało, reagował tylko z przeciwciałami pacjenta A, ale nie reagował z przeciwciałami pacjenta L czy H; nie takiego wyniku możnaby oczekiwać w przypadku
168 925 prawdziwego, związanego z PT-NANBH, polipeptydu otrzymanego metodami rekombinacyjnymi, a zatem JG1 wyeliminowano z analizy. Zarówno JG2, jak i JG3 dały jednakże wyraźne dodatnie reakcje z trzema surowicami skierowanymi przeciwko PT-NANBH; te rekombinanty analizowano dalej.
Opisany powyżej typ analizy powtórnie zastosowano dla JG2 i JG3, z tym wyjątkiem, że sączki pocięto na mniejsze części, które inkubowano z zestawami surowic dodatnich i ujemnych. Zestawy dodatnich surowic obejmowały zestaw 10 surowic chorych na hemofilię i zestaw 9 surowic osób uzależnionych, stosujących narkotyki dożylnie. Dawcy ci stanowią najlepsze źródła surowic dodatnich nawet pomimo tego, że proporcja surowic dodatnich była nieznana. Zestaw surowic ujemnych otrzymano dawców pewnych, którzy byli przez wiele lat dokładnie badani przez North London Blood Transfusion Centre, Deansbrook Road, Edgware, Middlesex, Wielka Brytania i nigdy nie wykazywali żadnych oznak infekcji różnymi czynnikami włącznie z PT-NANBH. Wyniki te przedstawiono w tabelach 2 i 3.
Tabela 2
| Nr identyfikacyjny | JG2 | JG3 | |
| Narkomani | V19146 | 4/4 | 0/5 |
| V27083 | 2/4 | 0/5 | |
| V29779 | 0/4 | 0/5 | |
| V12561 | 0/5 | 4/5 | |
| VI5444 | 2/4 | 5/5 | |
| VI8342 | 4/4 | 0/5 | |
| V8403 | 2/4 | 0/5 | |
| V20001 | 4/4 | 0/5 | |
| V21213 | 2/4 | 0/5 | |
| Chorzy na hemofilię | M1582 | 4/4 | 4/5 |
| M1581 | 5/5 | 5/5 | |
| M1575 | 2/5 | 0/5 | |
| Ml 579 | 5/5 | 5/5 | |
| M1585 | 2/5 | 0/5 | |
| Ml 576 | 1/5 | 1/5 | |
| M158O | 1/5 | 0/5 | |
| Ml 578 | 1/5 | 0/5 | |
| M1587 | 1/5 | 2/5 | |
| Ml 577 | 2/5 | 1/5 |
Dodatnie reakcje zaznaczono przez podkreślenia.
Tabela 3
| Narkomani | Chorzy na hemofilę | Dawcy ujemni | |
| JG2 | 6/9 (66%) | 5/10 (50%) | 0/10 (0%) |
| JG3 | 2/9 (22%) | 4/10 (40%) | 0/10 (0%) |
| JG2 + JG3 | 1/9(11%) | 3/10 (30%) | 0/10 (0%) |
| JG2 lub JG3 | 7/9 (77%) | 6/10 (60%) | 0/10 (0%) |
Dane zgodne są z hipotezą, że oba rekombinanty eksprymują polipeptydy związane z czynnikiem odpowiedzialnym za PT-NANBH, i że polipeptydy te nie są identyczne, lecz mogą posiadać takie same pewne miejsca antygenowe.
Przykład V. Mapowanie restrykcyjne i sekwencjonowanie DNA JD2 i JG3
Część (10 μΐ) zawiesiny podstawowej fagów zarówno JG2, jak i JG3 utrzymywano w temperaturze wrzenia w celu denaturacji fagów i ekspozycji DNA. DNA ten zastosowano
168 925 następnie jako matrycę w amplifikacji PCR z zastosowaniem polimerazy Taq. Każda mieszanina reakcyjna zawierała w objętości końcowej 50 μl co następuje: 10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 0,1% żelatynę, pH 8,3 w temperaturze 25°C oraz startery ollgonukleotydowe dl9 i d20 (sekwencje o numerach identyfikacyjnych, odpowiednio, 1 i 2; 200 ng każdego); startery te zlokalizowane są w sekwencji faga lambda flankującej miejsce Eco RI do klonowania, i dlatego mogą służyć jako startery amplifikacji każdej sekwencji sklonowanej w tym miejscu.
Część mieszaniny reakcyjnej analizowano na 1,0% żelu agarozowym i porównano z markerami. Dzięki amplifikacji JG2 otrzymano fragment o długości około 2 Kb; JG3 fragment o długości około 1 Kb. Pozostałość mieszaniny reakcyjnej ekstrahowano fenolem/chloroformem w obecności 10 mM EDTA i 1% SDS, i DNA odzyskano przez wytrącanie etanolem. Zamplifikowany materiał trawiono następnie przez 60 minut 20 U restryktazy EcoRI w temperaturze 37°C i rozdzielono na 1% żelu agarozowym LGT w TAE. Fragmenty o zmniejszonej zgodnie z oczekiwaniami wielkości wyeluowano i oczyszczono stosując Elutips (S&S). Wstawki JG2 i JG3 zligowano z plazmidem pUC 13 strawionym restryktazą EcoRI i transformowano nimi szczep TG1 E. coli. Rekombinanty identyfikowano jako kolonie o barwie białej na płytkach X-gal/L-amp (płytki z L-agarem wzbogaconym o 100 gg/ml ampicyliny, 0,5 mg/ml X-gal) i sprawdzono przez preparatykę plazmidu na małą skalę i trawienie enzymem restrykcyjnym EcoRI w celu określenia wielkości wstawki DNA. Zrekombinowany plazmid zawierający wstawkę JG2 nazwano DM415, a plazmid zawierający wstawkę JG3 nazwano DM416.
Sekwencję wstawki JG2 określono przez bezpośrednie sekwencjonowanie dwuniciowego plazmidu DNA i sokwoncjonowanio w wektorach do sekwencjonowania opartych na fagu M13, takich jak mpl8 i mpl9, po którym następowało sekwencjonowanie jednoniciowo. Sekwencję wstawki JG3 określono w podobny sposób. Otrzymane sekwencje DNA i wywnioskowane sekwencje aminokwasowe przedstawiono na sekwencjach o numerach identyfikacyjnych 3 i 4.
Przykład VI. Ekspresja polipeptydu PT-NANBH w E. coli.
Plazmid pDM415 (5 gg) strawiono restryktazą EcoRI (20 U) w objętości końcowej 20 gl. Wstawkę o długości 1 Kb odzyskano przez wyeluowanie z 1% żelu agarozowego LGT. Następnie wypełniono powstałe lepkie końce EcoRI stosując fragment Klenowa i mieszaninę dNTP. DNA odzyskano przez wytrącenie etanolem po ekstrakcji mieszaniną fenol/chloroform. Fragment o tępych końcach zligowano z trawionym restryktazą Smal i zdefosforylowanym plazmidem pDEV107 (wektorem, który umożliwia klonowanie w końcu 3' genu lac Z). Następnie transformowano komórki E. coli TG1. Nastąpił 30-krotny wzrost koloni w porównaniu z kontrolą, w której zastosowano sam wektor. Transformanty zawierające pożądany zrekombinowany plazmid zidentyfikowano przez hybrydyzację z radioaktywną sondą wytworzoną przez amplifikację PCR rekombinanta JG3. W celu określenia orientacji wstawki, dwadzieścia kolonii zanalizowano przez trawienie enzymem restrykcyjnym (Sali) plazmidu przygotowanego przez preparatykę na małą skalę. W jednej czwartej rekombinantów wstawka znajdowała się w orientacji właściwej do ekspresji sekwencji PT-NANBH w postaci białka fuzyjnego z β-galaktozydazą. Do dalszej analizy wzięto jeden z tych rekombinantów.
Kolonię pDXl 13 zastosowano do inokulacji 50 ml L-bulionu, namnażano wytrząsając w temperaturze 37°C do osiągnięcia średniej fazy wzrostu logarytmicznego i indukowano ekspresję przez dodanie 20 mM IPTG. Po trzech godzinach komórki zebrano przez wirowanie przy 5 000g przez 20 minut, ponownie zawieszono w 50 ml PBS i odwirowano. Osadzone komórki ponownie zawieszono w 5ml buforu (25 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA. 1 mg/ml lizozymu, 0,2% (v/v) Nonidet -P40, pH 8,0) na gram osadu i inkubowano w temperaturze 0°C przez 2 godziny. Uwolniony bakteryjny DNA strawiono przez dodanie DNazy I i MgSO4 do stężeń końcowych, odpowiednio, 40 gg/ml i 2 mM w celu redukcji lepkości.
Ten nieoczyszczony lizat analizowano przez elektroforezę na żelu poliakrylamidowym (PAGE) i białka wybarwiono błękitem Coomasiego. W bakteriach zawierających pDX113 indukcji uległo białko o masie cząsteczkowej około 150 kDa o masie cząsteczkowej. Oszacowano, że białko to stanowi 10-15% całkowitej ilości białka. Białka z podobnych żeli przeniesiono na membranę PVFDF (GRI, Dunmow, ESSex, Wielka Brytania) i memmbranę inkubowano z surowicami dodatnimi i ujemnymi pod względem PT-NANBH); białko o masie cząsteczkowej około 150 kDA reagowało z surowicami A i L, ale nie reagowało z normalną surowicą ludzką.
168 925
Ścieżki zawierające lizaty E. coli eksprymującej β-galaktozydazę nie reagowały z surowicami A i L oraz normalną surowicą ludzką.
Do nieoczyszczonego lizatu dodano mocznika do stężenia końcowego 6M i nierozpuszczalny materiał usunięto przez wirowanie. Ekstrakt w 6M mocznika zastosowano bezpośrednio do opłaszczania przez 1 godzinę w temperaturze 37°C studzienek do mikromiareczkowania. Studzienki trzykrotnie przemyto dwukrotnie destylowaną wodą i następnie blokowano w temperaturze 37°C przez dodanie na 20 minut 0,25 ml 0,2% BSA zawierającej 0,02% NaN3 na studzienkę. Następnie zawartość studzienek odessano. Płytki kontrolne, opłaszczone nieoczyszczonym lizatem szczepu E. coli wytwarzającego β-galaktozydazę (pXY461) przygotowano w ten sam sposób. Płytki te użyto do oznaczeń ELISA opisanych w przykładzie X.
Przykład VII. Ekspresja polipeptydu PT-NANBH w komórkach owadów.
Wstawkę PT-NANBH z JG3, wyizolowaną jak opisano w przykładzie V, sklonowano w wektorze pAc360 (Lucków i Summers, Biotechnology, 1988,6,47-55) w jednej ramce odczytu z pierwszym 34 nukleotydami poliedryny, wykorzystując znajomość ramki odczytu genu lacZ w wektorze gtii. Zsyntetyzowano oligonukleotydy zdolne do hybrydyzacji z sekwencją gtii flankującą miejsce klonowania EcoRI i zdolną do amplifikacji wstawki przez PCR. Oligonukleotydy te zawierały odpowiednio zlokalizowane miejsca restrykcyjne BamHI, umożliwiające bezpośrednie sklonowanie w miejscu BaHI plazmidu pAc360, z umieszczeniem wstawionego genu w jednej ramce odczytu z aminokońcową sekwencją poliedryny.
Małą ilość rekombinanta faga gtii - JG3 utrzymywano w temperaturze wrzenia w celu ekspozycji DNA i następnie zastosowano w amplifikacji PCR z wykorzystaniem starterów oligonukleotydowych d75 i d76 (sekwencje o numerach identyfikacyjnych 6 i 7; 200 mg) i 0,5 U polimerazy Taq. Po amplifikacji mieszaninę reakcyjną ekstrahowano równą objętością mieszaniny fenol/chloroform, wytrącono etanolem i strawiono 10 U restryktazy BamHI w objętości końcowej 30 gl. Zamplifikowany fragment poddano elektroforezie na 1 % żelu agarozowym, wyeluowano i w celu wytworzenia konstrukcji przenoszącej pDX119, zligowano ze strawionym BamHI plazmidem pAc360. Zrekombinowanym plazmidem (2 gg) i DNA AcNPV typu dzikiego (1 μ g) kotransfekowano komórki owadów przez wytrącanie z fosforanem wapnia. Ujemnego pod względem obecności wstawki zrekombinowanego wirusa wyselekcjonowano wzrokowo. Po trzech rundach oczyszczania z łysinek, zrekombinowany wirus ((BHC-5) namnożono i na podstawie elektroforezy na żelu poliakrylamidowym z SDS (SDS-PAGE), blottingu Western i testu ELISA oszacowano ekspresję otrzymanego metodami rekombinacyjnymi białka w komórkach owadów. Zainfekowane komórki obficie wytwarzają eksprymowane białko o masie cząsteczkowej około 70 kDa. Białko to reaguje z surowicami skierowanymi przeciwko PT-NANBH w blottingu Western i w teście ELISA.
W celu włączenia sekwencji JG2 w dodatku do sekwencji JG3 obecnej w BHC-5 skonstruowano następnego rekombinanta bakulowirusa (BHC-7), jak przedstawiono na figurze 1. W celu wytworzenia plazmidu pDX1 18, sekwencje PT-NANBH obecne w JG2 zamplifikowano i sklonowano w wektorze pAc360 jak opisano powyżej i, w celu wytworzenia konstrukcji przenoszącej pDX122, połączono razem odpowiednie fragmenty BamHI/Sall kolejno plazmidów pDX119 i pDX118 w pAc360.
Zrekombinowane plazmidy zidentyfikowano przez hybrydyzację i określono orientację wbudowanego DNA przez analizę restrykcyjną. Zrekombinowane wirusy wytworzono jak opisano powyżej i eksprymowane białko analizowano przez SDS-PAGE, blotting Western i test ELISA. W zainfekowanych komórkach stwierdzono obecność bardzo dużej ilości (40% całkowitej ilości białka komórkowego) polipeptydu o masie cząsteczkowej 95 kDa, reagującego z surowicami skierowanymi przeciwko PT-NANBH.
Przykład VIII. Oczyszczanie polipeptydu DX113
Szczep TG1 E. coli zawierający plazmid pDX113 (oznaczony jako szczep WDL001) namnażano i indukowano przez 5 godzin w tanku fermentacyjnym o objętości 1,5 litra (model SET002, SGI, Newhaven. East Sussex, Wielka Brytania) w temperaturze 37°C. Komórki zebrano przez wirowanie przy 5 000g przez 20 minut i traktowano w następujący sposób:
a) Ekstrakcja
168 925
Wilgotne komórki ponownie zawieszono (1:20, w/v) w buforze A (50 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 5 mM DTT, 10% (v/v) glicerol, pH 8,0). Dodano lizozym w postaci stałej w stężeniu 5 mg na ml zawiesiny, i mieszaninę pozostawiono w temperaturze 4°C. Po 15 minutach mieszaninę sonifikowano (amplituda całkowita 6 pm) w lodzie przez całkowity okres 3 minut (6 x 30 sekund). Dodano DNazę I w stężeniu 4 pg/ml zawiesiny i mieszaninę pozostawiono na dalsze 30 minut. Zawiesinę wirowano przez 20 minut przy l8 000g (maksymalnie) i supernatant odrzucono.
Osad ponownie zawieszono w buforze B (25 mM Hepes, 4 M mocznik, 5 mM DTT, pH 8,0) w stosunku 1:6 (w/v) w celu otrzymania drobnej zawiesiny. Wirowano ją przy 18 000g (maksymalnie) i supernatant odrzucono. Osad ponownie zawieszono w buforze C (25 mM Hepes, 8 M mocznik, 2 mM DTT, pH 8,0) w stosunku 1:6 (w/v); przed zawieszeniem dodano leupeptynę (1pg/ml), pepstatynę (1 pg/ml) i E64 (1 pg/ml). Zawiesinę wirowano przez 30 minut przy 18 000g (maksymalnie) i supernatant zdekantowano i zatrzymano. Osad ponownie zawieszono w 25 mM Hepes, 1% SDS, pH 8,0.
b) Chromatografia
Supernatant z frakcji z 8 M mocznikiem rozcieńczono 1:5 (v/v) w buforze zawierającym 25 mM Hepes, 8 M mocznik, 2 mM DTT, pH 8,0, i frakcjonowano na kolumnie z Q-Sepharose o objętości 7 ml. Białka eluowano gradientem stężenia soli 0-1 M NaCl. Chromatografię i obróbkę danych przeprowadzono w układzie FPLC (Pharmacia). DX113 ulegał elucji w około 500 mM NaCl i jest rzeczywiście homogenny według kryteriów SDS-PAGE i analizy techniką blottingu Western.
Przykład DC. Oczyszczanie polipeptydu BHC-5
Komórki Sf9 (2 x 109) zainfekowano zawiesiną podstawową zrekombinowanego wirusa HHC-5 (mol 5). Po inkubacji przez 2 dni w temperaturze 28°C komórki zebrano przez wirowanie, a następnie postępowano w następujący sposób:
a) Ekstrakcja.
Mokrą masę komórkową (1,2g) ponownie zawieszono w 6 ml buforu A (25 mM Hepes, mM DTT, 1 pg/ml leupeptyny, 1 pg/ml pepstatyny, 1 pg/ml pepstatyny E64, pH 8,0). Zawieszone komórki umieszczono w lodzie i sonifikowano 3x15 sekund (amplituda całkowita pm) na zmianę z 30 sekundowymi przerwami. Zsonifikowaną zawiesinę wirowano przez 20 minut przy 18 000g (maksymalnie) i supernatant odrzucono. Osad ponownie zawieszono w buforze A z dodatkiem 4 M mocznika (6 ml) i przez 20 minut wirowano przy 18 000g (maksymalnie). Supernatant odrzucono, a osad ponownie ekstrahowano buforem A z dodatkiem 8 M mocznika (6 ml). Po wirowaniu przez 30 minut przy 18 000g (maksymalnie) supernatant zachowano i rozcieńczono 1:6 w buforze A z dodatkiem 8 M mocznika. Ekstrakt ten poddano chromatografii na kolumnie mono-Q zrównoważonej tym samym buforem. Kolumnę eluowano 12 objętościami kolumny gradientu stężenia soli (0-1,0 M NaCl). BHC-5 uległ wyeluowaniu przy około 0,45-0,55 M NaCl i był w więcej niż w 90% czysty jak oceniono na podstawie SDS-PAGE. Wydajność wynosiła około 70%.
Przykład X. Analiza polipeptydów DX113 oraz BHC-5 i 7 testem ELISA
Płytki do testu Microelisa (96 studzienek, Nunc) opłaszczono bezpośrednio w 50 mM buforze wodorowęglanowym (50 mM wodorowęglan sodowy i 50 mM węglan sodowy, o pH 9,5) nieoczyszczonym lizatem BHC-5 w 6 M moczniku, albo oczyszczonym DX113. Płytki blokowano 0,2% bSa, a następnie inkubowano przez 30 minut w temperaturze 37°C z surowicami rozcieńczonymi 1:20 (bakulowirus) lub 1:1000 (E.coli). Po przemyciu roztworem Tween-sól fizjologiczna (0,85% NaCl, 0,05% Tween 20,0,01% Bronidoks) płytki inkubowano przez 30 minut w temperaturze 37°C ze sprężonymi z peroksydazą przeciwciałami skierowanymi przeciwko immunoglobulinom ludzkim (1:2000). Płytki przemyto następnie roztworem Tween-sól fizjologiczna i wywołano zabarwienie przez dodanie chromogennego substratu TMB (tetrametylobenzydyna-HCl) (100 pl/studzienkę) i inkubację przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Reakcję zatrzymano 50 pl 2 M kwasu siarkowego i określano OD450 (tabela 4).
168 925
Tabela 4
Pośredni test ELISA z zastosowaniem przeciwciał skierowanych przeciwko immunoglpbulizom ludzkim do wykrywania przeciwciał skierowanych przeciwko NANBH
| Bakulowirus BHC-5 (faza stała) | E. coli DX113 (faza stała) | |
| >2 | 1,670 | |
| 1,855 | 1,531 | |
| 1,081 | 1,015 | |
| 1,842 | 1,558 | |
| 0,526 | 0,638 | |
| >2 | 1,515 | |
| 1,823 | 1,602 | |
| Surowice pacjentów z grupy | 1,779 | 1,318 |
| wysokiego ryzyka dodatnie | 1,122 | 0,616 |
| w oznaczeniu | 1,686 | 1,441 |
| 0,259 | 0,205 | |
| 0,158 | 0,120 | |
| 0,298 | 0,209 | |
| 0,194 | 0,111 | |
| 0,282 | 0,181 | |
| 0,263 | 0,165 | |
| 0,184 | 0,163 | |
| 0,121 | 0,099 | |
| 0,243 | 0,104 | |
| Dawcy ujemni | 0,224 | 0,119 |
Surowice pacjentów z grupy o wysokim ryzyku infekcji PT-NANBH (osoby uzależnione, stosujące narkotyki dożylnie, chorzy na hemofilię) oznaczono jak opisano. Wszystkie dane wyrażono jako odczyty OD450 z dawcami ujemnymi jako kontrolą ujemną. W tej określonej grupie surowic 10/19 było dodatnich na obu fazach stałych.
Dodatkowo, oczyszczony DX113 skoniugowanp z alkaliczną fosfatazą stosując redukcję SATA/mαloimiO i przeprowadzono oznaczenie immunomoteaczno. Znane, dodatnie i ujemne surowice NANBH rozcieńczono jak podano dla surowicy dawców ujemnych i dodano do fazy stałej opłaszczonej BHC-7. Albo jednocześnie, albo po inkubacji (30 minut w temperaturze 37°C) dodano koniugat DX113 (50 gl, 1:2000). Po inkubacji przez 30 minut w temperaturze 37°C, płytki przemyto 50 mM buforem wodorowęglanowym i wywołano zabarwienie stosując układ wzmacniający IQ Bio, i określano OD492 (tabela 5).
Tabela 5
Immuzomoteyckzy (ze znakowanym pplipopty0om) test ELISA do wykrywania przeciwciał skierowanych przeciwko NANBH
| Surowice dodatnie w oznaczeniu | Surowice ujemne w oznaczeniu | Surowice dawców ujemnych |
| >2 | 0,217 | 0,234 |
| 0,821 | 0,252 | |
| >2 | 0,214 | |
| 0,542 | 0,257 | |
| 0,876 | 0,308 | |
| 1,583 | 0,278 | |
| >2 | 0,296 | |
| >2 | 0,273 | |
| 1,830 | 0,262 | |
| >2 | 0,251 |
168 925
A zatem w obydwu typach oznaczeń - z zastosowaniem przeciwciał przeciwko immunoglobulinom i immunometrycznym - wszystkie próbki pochodzące z grup wysokiego ryzyka dawały zgodne wyniki.
Przykład XI. Szczepionka
Stosując następujące składniki we wskazanych ilościach, można przygotować, stosując konwencjonalne techniki, szczepionkę:
Polipeptyd wirusowy PT-NANBH > 0,36 mg
Thiomersal 0,04-0,2 mg
Chlorek sodowy < 8555 mg
Woda do 1 ml
Przykład XII. Wytwarzanie przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciwko polipeptydom PT-NANBH
Wstawkę DNA z DM415 zsubklonowano w wektorze przenoszącym bakulowirusa p36C i, metodą zasadniczo podobną do metody opisanej w przykładzie VII, wytworzono zrekombinowany wirus. Zrekombinowany wirus nazwano BHC-1 i eksprymował bardzo niskie poziomy białka specyficznego wobec PT-NANBH. Komórki Sf-9 (5 x 107 komórek/ml) zainfekowane BHC-1 lizowano w PBS zawierającej 1% (v/v) NP40 i wirowano przez 2 minuty przy 13 000g. Supernatant oczyszczono na żelu Extractigel-D (Pierce Chemicals) w celu usunięcia detergentu, następnie zmieszano w postaci emulsji w stosunku 1:1 z kompletnym adiuwantem Freuda. Myszom podano po 0,1 ml emulsji (równoważnik 5 x 106 komórek) drogą iniekcji podskórnych. 14 i 28 dnia po iniekcji myszy otrzymały dawki przypominające przez dootrzewnowe iniekcje 0,1 ml (równoważnik 5 x 106 komórek) wolnego od detergentu ekstraktu komórek Sf-9 zainfekowanych BHC-5: BHC-5 zawiera wstawkę DNA DM416. Następnie pobierano z ogonów próbki krwi i oznaczano pod kątem aktywności anty-FT-NANBH w teście ELISA (przykład X). Dwie myszy z odpowiedzią specyficzną wobec PT-NANBH otrzymały dalszą dawkę przypominającą przez iniekcje dożylne wolnego od detergentu ekstraktu komórek Sf-9 zainfekowanych bHC-7 ; BHC zawiera wstawkę DNA wytworzoną przez ligację ze sobą zachodzących regionów DM415 i DM416 (przykład VII). Trzy dni później usunięto śledziony.
Komórki śledziony poddawano fuzji z komórkami szpiczaka NSo standardowymi technikami w obecności PEG 1500. Otrzymane komórki hybrydom selekcjonowano przez wzrost w podłożu HAT (hipoksantyną, aminopteryną, tymidyna). 10-14 dni po fuzji supernatanty testowano pod kątem aktywności anty-PT-NANBH w teście ELISA. Zidentyfikowano studzienki wykazujące reaktywność z oboma antygenami - DX113 i BHC-7 (przykład VII), i pojedyncze kolonie przeniesiono do oddzielnych studzienek, namnażano i ponownie testowano. Hybrydomy ze studzienki wykazujące specyficzną reaktywność na tym etapie dalej klonowano stosując rozcieńczenia ograniczające do osiągnięcia monoklonalności.
Przykład XIII. Wykrywanie wirusowego kwasu nukleinowego u pacjentów serododatnich
Surowice: próbki od 1400 dawców, włączonych do programu badań perspektywicznych potransfuzyjnego zapalenia wątroby, zamrożono w temperaturze -20°C. Podobnie przechowywano surowice pobrane przed transfuzją i kolejno po transfuzji od 260 biorców transfuzji. Próbki po transfuzji zbierano do trzeciego miesiąca co dwa tygodnie, do szóstego miesiąca co miesiąc a następnie do osiemnastego miesiąca co sześć miesięcy. Do badań dostępne były także zamrożone surowice dawców i biorców pochodzące z trzech przypadków PT-NANBH, które wystąpiły w 1981 r. Diagnoza PT-NANBH oparta była na wzroście aktywności aminotransferazy alaninowej (ALT) w surowicy przekraczającej 2,5-krotnie górny poziom normy w co najmniej dwóch oddzielnych próbkach potransfuzyjnych. Inne wirusy hepatotropowe wykluczono przez testy serologiczne, a niewirusowe przyczyny uszkodzeń komórek wątroby wykluczono przez konwencjonalne badania kliniczne i laboratoryjne.
Oznaczenia immunologiczne: Próbki surowicy testowano retrospektywnie na obecność przeciwciał skierowanych przeciwko HCV (antygen Cl 00) stosując zestaw do testu ELISA Ortho Diagnostics stosowanym zgodnie z instrukcjami producenta. Surowice powtarzalnie reaktywne miareczkowano do punktu końcowego w surowicy ludzkiej ujemnej pod względem obecności przeciwciał skierowanych przeciwko antygenowi C100.
168 925
Wykrywanie sekwencji wirusowych PT-NANBH: RNA surowicy lub osocza ekstrahowano, poddawano odwrotnej transkrypcji i amplifikowano jak opisano poniżej. Startery oligonukleotydowe do odwrotnej transkrypcji/PCR pochodziły z sekwencji nukleotydowej klonu JG2 wyizolowanego w przykładzie III i zsynetyzowanej w syntetyzatorze Applied Biosystems 381 A. Sekwencje czterech starterów oligonukleotydowych były następujące:
| Numer identyfikacyjny | Wielkość | |
| Oznaczenie | sekwencji | produktu |
| d94 sensowny | 8 | |
| d95 antysensowny | 9 | 729 bp |
| N1 sensowny | 10 | 402 bp |
| N2 antysensowny | 11 |
(i) Ekstrakcja RNA
5-50gl surowicy (lub osocza) uzupełniono do 200 gl przez dodanie jałowej wody destylowanej. 200g1 próbki dodano do równej objętości buforu 2 x PK (2 x PK = 0,2 M TrisCl, pH 7,5, 25 mM eDtA, 0,3 M NaCl, 2% (w/v) SDS, proteinaza K 200 gg/ml), zmieszano i inkubowano przez 40 minut w temperaturze 37°C. Białka usunięto przez dwukrotną ekstrakcję mieszaniną fenol/chloroform i jedną samym chloroformem. Do fazy wodnej dodano 20gg glikogenu, a następnie wytrącono RNA przez dodanie 3 objętości schłodzonego lodem absolutnego etanolu. Po przechowywaniu przez 1 godzinę w temperaturze -70°C, RNA osadzono w wirówce Eppendorfa (15 minut, 14000 obrotów/minutę, 4°C). Osad przemyto raz 95% etanolem, wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem i rozpuszczono w 10gl jałowej wody destylowanej. Roztwory RNA przemywano w temperaturze -70°C.
(ii) Synteza cDNA
Przygotowano 10 gl mieszaniny zawierającej 2 gl roztworu RNA, 50 ng syntetycznego oligonukleotydu d95, 10 mM Hepes-HCl, pH 6,9 i 0,2 mM pH 8,0. Na tę 10 gl mieszaninę nałożono 2 krople oleju mineralnego, ogrzewano przez dwie minuty w łaźni wodnej o temperaturze 90°C i szybko schłodzono w lodzie. Syntezę cDNA przeprowadzono po doprowadzeniu składu mieszaniny reakcyjnej do zawartości 50 mM Tris-HCl pH 7,5,75 mM KC1,3 mM MgCh, 10 mM DTT, 0,5 mM każdego z dATP, dCTP, dGTP i dTTP, 20 jednostek inhibitora RNazy (Pharmacia) i 15 jednostek klonowanej odwrotnej transkryptazy mLv (Pharmacia) w objętości końcowej 20 gl. 20 gl mieszaniny inkubowano przez 90 minut w temperaturze 37°C. Po syntezie cDNA przechowywano w temperaturze -20°C.
(iii) Seryjna PCR
W trakcie tych badań unikano fałszywie dodatnich wyników PCR poprzez ścisłe stosowanie pomiarów unikania zanieczyszczeń według Kwok i Higuchi (Naturę, 1989, 339, 237-238).
a) Runda 1
Łańcuchową reakcję polimerazy przeprowadzono w 50 gl mieszaniny zawierającej 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 0,01% żelatynę, i jednostkę rekombinowanej polimerazy DNA Taq (Perkin Elmer Cetus), 200 gM każdego z dNTP, 30 ng każdego z zewnętrznych starterów (d94 i d95, sekwencje o numerach identyfikacyjnych odpowiednio 8 19) i 5 gl roztworu cDNA. Po początkowych 5 minutach denaturacji w temperaturze 94°C, przeprowadzono 35 cykli: 1,2 minuty w temperaturze 95°C, i minuta w temperaturze 56°C, i minuta w temperaturze 72°C, po których następowało końcowe 7-minutowe utrzymywanie w temperaturze 72°C (Techne PHC-1 Automated Thermal Cycler).
b) Runda 2
Mieszanina reakcyjna była taka jak opisana powyżej dla rundy 1, ale w miejsce zewnętrznych starterów d94 i d95 zastosowano 125ng każdego z wewnętrznych starterów (sekwencje o numerach identyfikacyjnych odpowiednio 10 i 11).Do50 gl mieszaniny reakcyjnej z Rundy 2 przeniesiono 1 gl produktu Rundy i PCR. Przeprowadzono 25 cykli: 1,2 minuty w temperaturze
168 925
95°C, 1 minuta w temperaturze 46°C, 1 minuta w temperaturze 72°C, po których następowało 7-minutowe utrzymywanie w temperaturze 72°C
c) Analiza
20gl produktów Rundy 1 i Rundy 2 PCR analizowano przez elektroforezę na 2% żelu agarozowym. Prążki uwidoczniono przez barwienio bromkiem etydyny i fotografowano przy długości fali 302 nm.
Przewidywane wartości serologiczne anty-HCV i PCR w programie badań perspektywicznych: Stwierdzono, że sześciu spośród 1400 dawców (0,43%) posiada w surowicy przeciwciała skierowane przeciwko C100. Spośród tych sześciu dawców, dodatnich pod względem przeciwciał skierowanych przeciwko C100, infekcyjność stwierdzono tylko u jednego (dawca D6) sądząc po wystąpieniu PT-NANBH i serokonwersji przeciwciał skierowanych przeciwko C100 u biorcy (biorca R6) - patrz tabela 6 poniżej.
Przez PCR wykryto sekwencje wirusowe w surowicy dawcy 6, ale nie u któregokolwiek z pozostałych pięciu dawców serododatnich surowic. Biorca R6, u którego rozwinęło się PT-NANBH otrzymywał także krew od siedmiu innych dawców (D7 do D13).
Przetestowano surowice tych dawców i stwierdzono, że są one zarówno ujemne pod względem przeciwciał, jak i PCR.
Tabela 6
Podsumowanie danych dawca/biorca: program badań perspektywicznych
| Dawcy | Biorcy | ||||
| Dawca | anty-HCV | PCR | Biorca | PT-NANBH | Serokonwersja |
| - | anty-HCV | ||||
| Dl | + | - | R1 | Nie | Nie |
| D2 | + | - | R2 | Nie | Nie |
| D3 | + | - | R3 | Nie | Nie |
| D4 | + | - | R4 | Nie | Nie |
| D5 | + | - | R5 | Nie | Nie |
| D6 | + | + | |||
| D7 | - | - | |||
| D8 | - | - | |||
| D9 | - | - | |||
| D10 | - | - | R6 | Tak* | Tak+ |
| D11 | - | - | |||
| D12 | - | - | |||
| D13 | - | - |
* okres inkubacji i miesiąc
- serokonwersja wystąpiła w piątym miesiącu po transfuzji
Przykład XIV. Izolowanie i ekspresja dodatkowych sekwencji DNA PT-NANBH
Przygotowaną w przykładzie II bibliotekę lambda gtii przeszukiwano także stosując surowice pacjentów z grup wysokiego ryzyka PT-NANBH, które nie reagowały z antygenami wirusowymi DX113, BHC-5 i BHC-7. Przyczyną tego jest to, że mogą zawierać przeciwciała rozpoznające inne antygeny. Surowice PJ-5 (The Newcastle Royal Infirmary, Newcastle), Birm-64 (Queen Elizabeth Medical Centre, Birmingham), PG i Le (University Collage and Middlesex School of Medicine, Londyn) spełniają to kryterium i zastosowano je do przeszukiwania bibliotek według takiej samej procedury, jak opisana w przykładzie III i IV. W ten sposób zidentyfikowano liczne rekombinanty, z których żaden nie wykazywał krzyżowej hybrydyzacji z sondami wykonanymi z JG2 i JG3. Jeden z rekombinantów, BR11, zidentyfikowany przez reakcję z surowicą, wyselekcjonowano do dalszej analizy.
Klon BR11 zawierał wstawkę o długości około 900 bp, którą zamplifikowano przez PCR stosując startery d75 i d76 (sekwencje o numerach identyfikacyjnych 6 i 7), jak opisano w przykładzie VII. Zamplifikowaną sekwencję bezpośrednio sklonowano w bakulowirusowym
168 925 wektorze pAc360, tworząc plazmid pDX128 zawierający otwartą ramkę odczytu w jednej fazie z pierwszymi 11 aminokwasami poliedryny. Zawiesinę rekombinowanego bakulowirusa (oznaczonego BHC-7) wytworzono według procedury opisanej w przykładzie VII. Komórki owadów zainfekowano oczyszczonym zrekombinowanym wirusem i w znakowanych radioaktywnie ekstraktach komórkowych otrzymano polipeptyd o masie cząsteczkowej około 22 kD.
Zamplifikowaną wstawkę BR11 sklonowano także do sekwencjonowania w plazmidzie pUC13 i wektorze fagowym M13; dane dotyczące sekwencji DNA i aminokwasowej przedstawiono na sekwencji o numerze identyfikacyjnym 5. Wstawka zawierała 834 bp plus dodane podczas klonowania łączniki EcoRI.
Przykład xV. Analiza polipeptydu BHC-9 testem ELISA
Test ELISA wykonano stosując opłaszczone ekstraktem komórek zainfekowanych BHC-9 studzienki do mikromiareczkowania i układ detekcji z koniugatem z przeciwciałami skierowanymi przeciwko ludzkim IgG według procedury opisanej w przykładzie X. Zestaw surowic pochodzący z grup wysokiego ryzyka oznaczano równolegle pod względem aktywności przeciwko BHC-7 i BhC-9 oraz sprawdzono także przez PCR stosując procedurę opisaną w przykładzie XIII. Wyniki przedstawiono w tabeli 7, w której podkreślono próbki dodatnie.
Tabela 7
| Numer | PCR | BHC-7 | BHC-9 |
| 1 | + | 2.09 | 2.00 |
| 2 | + | 2.09 | 2.00 |
| 3 | + | 1.89 | 1.37 |
| 4 | + | 1.57 | 0,27 |
| 5 | + | 1.26 | 2.00 |
| 6 | + | 0.91 | 2.00 |
| 7 | - | 0.90 | 0.51 |
| 8 | + | 0.84 | 112 |
| 9 | - | 0.53 | ΩΧ |
| 10 | - | 0.45 | 2.00 |
| 11 | + | 0,37 | 1.07 |
| 12 | - | 0,32 | 2.00 |
| 13 | - | 0,23 | 0,30 |
| 14 | - | 0,15 | 0.43 |
| 15 | + | 0,16 | 0.76 |
| 16 | - | 0,09 | 174 |
| 17 | - | 0,27 | 2.00 |
| 18 | - | 0,15 | 2.00 |
| 19 | - | 0,12 | 2.00 |
| 20 | - | 0,08 | 0,05 |
| wartość graniczna | 0,27 | 0,29 |
Spośród tych 20 próbek, 50% jest wyraźnie dodatnich wobec BHC-7, podczas gdy 85% jest dodatnich wobec BHC-9. Dwie próbki (11 i 12), które są dodatnie z wartością zbliżoną do granicy wobec BHC-7, są wyraźnie dodatnie wobec BHC-9, a pewne próbki o wartościach zbliżonych lub poniżej wartości granicznej wobec BHC-7 są dodatnie z BHC-9. Ponadto, dwie próbki (11 i 15), które zbliżają się do wartości granicznej lub są ujemne wobec BHC-7, ale dodatnie wobec BHC-9, są dodatnie w PCR. Ogólnie są tylko dwie próbki ujemne (13 i 20) wobec obydwu polipeptydów i w PCR.
Przykład XVI. Izolowanie sekwencji DNA PT-NANB zachodzących na istniejące klony
Poprzez opisane w przykładach III, IV i XIV immunologiczne przeszukiwanie bibliotek ekspresyjnych cDNA można zidentyfikować tylko te klony, które zawierają immunogenny region wirusa. Innym podejściem w wytwarzaniu klonów specyficznych wobec PT-NANB jest
168 925 zastosowanie PCR do amplifikacji cząsteczek cDNA zachodzących na istniejące klony. Można przygotować zestawy starterów, w których jeden z członków pary leży w sekwencji istniejącego klonu, a drugi położony jest na zewnątrz; podejście to można również rozciągnąć na seryjne pary starterów.
cDNA przygotowany jak opisano w przykładzie I zamplifikowano przez PCR z albo pojedynczymi albo seryjnymi parami starterów, stosując warunki reakcji opisane w przykładzie XHI. Podejście to ilustruje zastosowanie następujących par starterów: d164 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 12) i dl37 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 13); d136 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 14) i d155 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 15); dl56 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 16) i d92 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 17). Jeden z członków każdej pary przeznaczony jest do służenia jako starter wewnątrz istniejącej sklonowanej sekwencji (dl 36 i dl37 służą jako startery odpowiednio przy końcach 5' i 3' BR11, d92 służy jako starter przy końcu 5' JG3). Inne startery oparte są na sekwencjach dostępnych dla innych czynników PT-NANBH. Starter dl64 odpowiada zasadom 10 do 31 na figurze 2 w Okamoto i in., Japan. J. Exp. Med. 1990, 60, 167-177. Startery d155 i 156 odpowiadają odpowiednio pozycjom 462 do 489 oraz 3315 do 3337 na figurze 47 w europejskim zgłoszeniu patentowym 88310922.5. W celu wprowadzenia miejsc rozpoznawczych przez restryktazę EcoRI w pobliżu końca 5' starterów, wykonano jedno lub więcej podstawień nukleotydowych. Wyjątkiem jest dl 64, gdzie wprowadzono miejsce rozpoznawane przez Bgl 2. Zmiany te ułatwiają późniejsze klonowanie zamplifikowanego produktu.
Produkty PCR trawiono odpowiednim enzymem (enzymami) restrykcyjnym, poddawano elektroforezie na żelu agarozowym, wycinano prążki o oczekiwanej wielkości i klonowano w wektorach zarówno plazmidowych, jak i bakteriofagowych jak opisano w przykładzie V. Sekwencje zamplifikowanych DNA 164/137 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 18), 136/155 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 19) i 156/92 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 20) przedstawiono w zestawieniu sekwencji. Te nowe sekwencje pokrywają genom wirusa PT-NANBH w większym stopniu niż sekwencje otrzymane przez przeszukiwanie immunologiczne (sekwencje o numerach identyfikacyjnych 3,4 i 5). Sekwencje te, wraz z innymi, leżącymi w regionach już opisanych, można połączyć w sekwencję lezącą w pobliżu końca 5' (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 21) i końca 3' (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 22) genomu wirusa PT-NANBH.
Przykład XVII. Fuzja różnych antygenów PT-NANBH w pojedynczym zrekombinowanym pelipoptydzio
Dane przedstawione w tabeli 7 wskazują na to, że podczas gdy więcej próbek surowic wykryto jako dodatnie pod względem obecności przeciwciał stosując jako antygen docelowy raczej BHC-9 (17/20) niż BHC-7 (10/20), istnieją pewne próbki (np nr 4), które są dodatnie tylko wobec BHC-7. Obraz ten potwierdza się przy szerokim testowaniu próbek. Zgodnie z tym, otrzymano konstrukcje fuzyjne stosując sekwencje BHC-7 i BHC-9.
Sekwencje z BHC-7 i BHC-9 można połączyć na różne sposoby; każda z sekwencji może być, w wyniku fuzji, położona przy końcu aminowym i różny może być charakter sekwencji łączącej. Możliwe sposoby połączenia sekwencji ilustruje figura 2.
Odpowiednie fragmenty restrykcyjne niosące odpowiednie miejsca restrykcyjne utworzono albo przez PCR z zastosowaniem specyficznych starterów, albo przez trawienie istniejących plazmidów enzymami restrykcyjnymi. Wektor przenoszący DX143 składa się z fragmentu BamH1/Pstl z DX122 (figura 1; miejsce Pst w 1504 pozycji JG2, sekwencja o numerze identyfikacyjnym 3) połączony z końcem 5' całego regionu kodującego BR11 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 7), który zamplifikowane jako fragment Pst1/BamH1 stosując d24 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 23) i d126 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 24); region łączący składa się z sześciu aminokwasów pochodzących z startera d126 i pozostałych sekwencji bakteriofaga lambda. Wektor przenoszący DX136 różni się od wektora DX143 tym, że fragment BR 11 utworzono stosując startery d24 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 23) i d132 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 25) i tak region łączący zawiera pięć lizyn. Te wektory przenoszące stosowano do kotransfekcji komórek owadów w hodowli dNa wirusa AcNPV i wytworzono zawiesinę zrekombinowanych bakulowirusów przez oczyszczanie ły24
168 925 sinek jak opisano w przykładzie VII. W wyniku transfekcji DX143 wytworzono BHC-10, a wyniku transfekcji DX136 - BHC11.
Rekombinowane polipeptydy eksprymowane przez te dwa wirusy analizowano przez SDS-PAGE i blotting Western. BHC-10 wytwarzał polipeptyd o pozornej masie cząsteczkowej 118 kDa. BHC-11 wytwarzał polipeptyd o pozornej masie cząsteczkowej 96 kDa. Oba polipeptydy reagowały z surowicami, o których wiadomo było, że w teście ELISA reagują tylko z BHC-7 (np. surowica A) lub tylko z BHC-9 (surowica B64, przykład XIV). Oba polipeptydy różnią się tylko sekwencją łącznikową, i może to wpływać albo na ich ruchliwość w SDS-PAGE, lub na sposób ich procesowania w zainfekowanych komórkach.
Przykład XVIII. Analiza fuzji antygenów testem ELISA
Test ElISA wykonano stosując studzienki do mikromiareczkowania opłaszczone ekstraktami komórek zainfekowanych BHC-9 i koniugat przeciwciała skierowanego przeciwko immunoglobulinom zgodnie z procedurą opisaną w przykładzie X. W tabeli 8 przedstawiono dane dotyczące porównania dwóch fuzji z innymi rekombinowanymi antygenami PT-NANBH -BHC7 i BHC-11, jak również rekombinowanym białkiem wirusa HCV-C-100-3 (Ortho Diagnostics System, Raritan, New Jersey). Surowice pogrupowano według wzoru reakcji z BHC-7, BHC-9 i C-100-3. Surowice z Grupy I silnie reagują zz wszystkimi trzzma antygennmi; surowice z Grupy II sUnie tylko z BHC-7, z Grapy ΙΠ sUnie ^^t^g^ują tylko z BHC-9 , a Grapy IV tylko z dwoma spośród trzech antygenów.
Tabela 8
| Surowica | BHC-7 | BHC-9 | C-100-3 | BHC-9 | BHC-11 |
| Grupa I AH | >2,0 | >2,0 | >2,0 | >2,0 | >2,0 |
| CH | >2,0 | >2,0 | >2,0 | >2,0 | >2,0 |
| 57 | >2,0 | >2,0 | >2,0 | >2,0 | >2,0 |
| 77 | >2,0 | >2,0 | >2,0 | >2,0 | >2,0 |
| 84 | 1,4 | >2,0 | >2,0 | >2,0 | >2,0 |
| Grupa II 805-6 | >2,0 | 0,261 | 0,1 | 1,78 | * + |
| 805-17 | >2,0 | 0,181 | 0,12 | 1,37 | + |
| 805-149 | >2,0 | 0,651 | 0,084 | 1,57 | * ++ |
| Grupa III JS | 0,32 | >2,0 | 0,17 | >2,0 | >2,0 |
| 805-57 | 0,069 | 1,403 | 0,25 | 1,9 | + |
| 805-82 | 0,116 | 1,272 | 0,4 | 1,85 | ++ |
| 805-94 | 0,353 | 1,675 | 0,2 | >2,0 | * + |
| PJ1 | 0,27 | >2,0 | 0,2 | >2,0 | 1,85 |
| Grupa IV A | >2,0 | 0,14 | >2,0 | >2,0 | >2,0 |
| KT | 1,57 | 0,27 | >2,0 | >2,0 | >2,0 |
| Le | 0,152 | >2,0 | >2,0 | >2,0 | >2,0 |
| PJ5 | 0,123 | >2,0 | >2,0 | >2,0 | >2,0 |
| 303-923 | >2,0 | 0,9 | 0,37 | 1,9 | + |
| 303-939 | >2,0 | 1,55 | 0,268 | 2,0 | + |
* Te próbki testowano wobec BHC-11 tylko przez blotting Western.
Dane te wykazują, że zarówno BHC-10, jak i BHC-11 posiadają podobną reaktywność z tymi surowicami i, co ważniejsze, że obie aktywności antygenowe utrzymywały się w fuzji białkowej. Wszystkie surowice w grupach II i III, reagujące odpowiednio tylko z BHC-7 i BHC-9, dawały wyraźną reakcję z fuzjami białkowymi. Dodatkowo, istnieje wskazanie, że
168 925 występowanie dwóch antygenów razem daje oznaczenie o wyższej czułości. Próbka KT, na przykład, dawała z BHC-7 i BHC-9 OD odpowiednio 1,57 i 0,27, podczas gdy dla fuzji OD wynosi > 2,0
W poniższym wykazie sekwencji, scharakteryzowano sekwencje o numerach identyfikacyjnych 1-25.
Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 1 Typ sekwencji: nuklootydowα
Długość sekwencji: 21 zasad o następującej sekwencji:
GGTGGCGACG ACTCCTGGAG C Ilość ζϊοϊ: jedna
Topologia: liniowa
Typ cząsteczki: syntetyczny DNA
Pierwotny organizm źródłowy: bakteriofag lambda gtii
Bezpośrednie źródło doświadczalne: syntetyzator pligpnukloptydowa; pligonukloptyO d 19 Cechy: od 1do 21 zasady homologiczna z częścią genu lacZ leżącą w kierunku przeciwnym do kierunku transkrypcji flankującą miejsce restrykcyjne EcoR1 bakteriofaga lambda gtii
Właściwości: służy jako starter syntezy DNA z wektora fagowego na cDNA wbudowany w miejscu EcoR1.
Sekwencja o numerze identyfikacyjnym 2
Typ sekwencji: nukloptydowa
Długość sekwencji: 21 zasad o następującej sekwencji:
TTGACACCAG ACCAACTGGT A Ilość nici: jedna
Topologia: liniowa
Typ cząsteczki: syntetyczny DNA
Pierwotny organizm źródłowy: bakteriofag lambda gtii
Bezpośrednie źródło doświadczalne: syntetyzator pligonukloptydowa; oligpnukloρtyd d20 Cechy: od 1 do 21 zasady homologiczna z częścią genu lacZ leżącą w kierunku zgodnym z kierunkiem transkrypcji flankującą miejsce restrykcyjne EcoR1 bakteriofaga lanmbOa gtii Właściwości: służy jako starter syntezy DNA z wektora fagowego na cDNA wbudowany w miejscu EcoR1.
Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 3
Typ sekwencji: nukloptydowa z odpowiadającą białkową
Długość sekwencji: 1770 par zasad o sekwencji przedstawionej na fig. 4.
Ilość nici: jedna
Topologia: liniowa
Typ cząsteczki: cDNA otrzymany na podstawie gonomowogp RNA
Pierwotny organizm źródłowy: człowiek: surowica infekcyjna pod względem potransfuzajnogo zapalenia wątroby typu nie-A nie-B
Bezpośrednie źródło doświadczalne: klon JG2 pochodzący z biblioteki cDNA w bakteriofagu lambda gtii
Cechy: część poliprρtoiny PT-NANBH od 1 do 1770 bp.
Właściwości: prawdopodobnie koduje wirusowe białka niostrukturalno
Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 4
Typ sekwencji: nukloptydowa z odpowiadającą białkową
Długość sekwencji: 1035 par zasad o sekwencji przedstawionej na fig. 5.
Ilość nici: jedna
Topologia: liniowa
Typ cząsteczki: cDNA otrzymany na podstawie gonpmowogo RNA
Pierwotny organizm źródłowy: człowiek; surowica infekcyjna pod względem potransfuzyjzogo zapalenia wątroby typu nie-A nie-B
168 925
Bezpośrednie źródło doświadczalne: klon JG3 pochodzący z biblioteki cDNA w bakteriofagu lambda gtii
Cechy: część poliproteiny PT-NANBH od 1 do 1035 bp
Właściwości: prawdopodobnie koduje wirusowe białka niestrukturalne
Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 5
Typ sekwencji: nukleotydowa z odpowiadającą białkową
Długość sekwencji: 834 par zasad o sekwencji przedstawionej na fig. 6.
Ilość nici: jedna
Topologia: liniowa
Typ cząsteczki: cDNA otrzymany na podstawie genomowego RNA
Pierwotny organizm źródłowy: człowiek: surowica infekcyjna pod względem potransfuzyjnego zapalenia wątroby typu nie-A nie-B
Bezpośrednie źródło doświadczalne: klon BR11 pochodzący z biblioteki cDNA w bakteriofagu lambda gtii
Cech: część poliproteiny PT-NANBH od 1 do 834 bp
Właściwości: prawdopodobnie koduje wirusowe białka strukturalne
Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 6
Typ sekwencji: nukleotydowa
Długość sekwencji: 31 zasad o następującej sekwencji:
TAAGGATCCCCCGTCAGTATCGGCGGAATTC
Ilość nici: jedna
Topologia: liniowa
Typ cząsteczki: syntetyczny DNA
Pierwotny organizm źródłowy: bakteriofag lambda gtii
Bezpośrednie źródło doświadczalne: syntetyzator oligonukleotydowy; oligonukleotyd d75
Cechy: od 4 do 9 zasady miejsca BamH1
Od 10 do 31 zasady homologiczna z częścią genu lacZ leżącą w kierunku przeciwnym do kierunku transkrypcji flankującą miejsce EcoR1 bakteriofaga lamda gtii od 26 do 31 zasady miejsca EcoR1
Właściwości: służy jako starter syntezy DNA z wektora fagowego na cDNA wbudowany w miejsce EcoR1 i wprowadza miejsce BamH1 odpowiednie do późniejszego klonowania w wektorze ekspresyjnym.
Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 7
Typ sekwencji: nukleotydowa
Długość sekwencji: 30 zasad o następującej sekwencji:
TATGGATCCGTAGCGACCGGCGCTCAGCTG
Ilość nici: jedna
Topologia: liniowa
Typ cząsteczki: syntetyczny DNA
Pierwotny organizm źródłowy: bakteriofag lambda gtii
Bezpośrednie źródło doświadczalne: syntetyzator oligonukleotydowy; oligonukleotyd d76
Cechy: od 4 do 9 zasady miejsca BamH1 od 10 do 30 zasady homologiczna z leżącą w kierunku zgodnym z kierunkiem transkrypcji częścią genu lacZ flankującą miejsce EcoR1 Bakteriofaga gtii
Właściwości: służy jako starter syntezy DNA z wektora fagowego na cDNA wbudowany w miejsce EcoR1 i wprowadza miejsce BamH1 odpowiednie do późniejszego klonowania w wektorze ekspresyjnym.
Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 8
Typ sekwencji: nukleotydowa
Długość sekwencji: 19 zasad o następującej sekwencji:
168 925
ATGGGGCAAAGGACGTCCG Ilość nici: jedna Topologia: liniowa Typ cząsteczki: syntetyczny DNA
Pierwotny organizm źródłowy: człowiek; surowica infekcyjna pod względem potransfuzyjnego zapalenia wątroby typu nie-A nie-B
Bezpośrednie źródło doświadczalne: syntetyzator oligonukleotydowy: oligonukleotyd d94 Cechy: od 1 do 19 zasady homologiczna z zasadami 914 do 932 sensownej nici JG2 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 3)
Właściwości: służy jako starter syntezy DNA na ujemnej nici RNA/DNA genomowego dla PT-NANBH
Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 9 Typ sekwencji: nukleotydowa
Długość sekwencji: 24 zasady o następującej sekwencji:
TACCTAGTCATAGCCTCCGTGAAG
Ilość nici: jedna
Topologia: liniowa
Typ cząsteczki: syntetyczny DNA
Pierwotny organizm źródłowy: człowiek; surowica infekcyjna pod względem potransfuzyjnego zapalenia wątroby typu nie-A nie-B
Bezpośrednie źródło doświadczalne: syntetyzator oligonukleotydowy; oligonukleotyd d95 Cechy: od 1 do 24 zasady homologiczna z zasadami 1620-1643 antysensownej nici JG2 (numer identyfikacyjny sekwencji 3)
Właściwości: służy jako starter syntezy DNA na dodatniej nici RNA/DNA genomowego dla PT-NANBH
Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 10 Typ sekwencji: nukleotydowa
Długość sekwencji: 17 zasad o następującej sekwencji:
GAGGTTTTCTGCGTCCA Ilość nici: jedna Topologia: liniowa Typ cząsteczki: syntetyczny DNA
Pierwotny organizm źródłowy człowiek; surowica infekcyjna pod względem potransfuzyjnego zapalenia wątroby typu nie-A nie-B
Bezpośrednie źródło doświadczalne: syntetyzator oligonukleotydowy; oligonukleotyd N1 Cechy: od 1 do 17 zasady homologiczna z zasadami 1033 do 1049 sensownej nici JG2 (numer identyfikacyjny sekwencji 3)
Właściwości: służy jako starter syntezy DNA na ujemnej nici RNA/DNA genomowego dla PT-NANBH
Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 11
Typ sekwencji: nukleotydowa
Długość sekwencji: 17 zasad o następującej sekwencji:
GCGATAGCCG CAGTTCT Ilość nici: jedna
Topologia: liniowa
Typ cząsteczki: syntetyczny DNA
Pierwotny organizm źródłowy: człowiek; surowica infekcyjna pod względem potransfuzyjnego zapalenia wątroby typu nie-A nie-B
Bezpośrednie źródło doświadczalne: syntetyzator oligonukleotydowy; oligonukleotyd N2 Cechy: od 1do 17 zasady homologiczna z zasadami 1421 do 1437 antysensownej nici JG2 (numer identyfikacyjny sekwencji 3)
168 925
Właściwości: służy jako starter syntezy DNA na dodatniej nici RNA/DNA genomowego dla PT-NANBH
Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 12
Typ sekwencji: nukleotydowa
Długość sekwencji: 22 zasady o następującej sekwencji:
CCACCATAGATCTCTCCCCTGT
Ilość nici: jedna
Topologia: liniowa
Typ cząsteczki: syntetyczny DNA
Pierwotny organizm źródłowy: człowiek; surowica infekcyjna pod względem potransfuzyjnego zapalenia wątroby typu nie-A nie-B
Bezpośrednie źródło doświadczalne: syntetyzator oligonukleotydowy; oligonukleotyd dl 64
Cechy: od 1 do 22 zasady homologiczna z zasadami 10 do 31 sekwencji przedstawionej na fig. 2 w Okamoto i in., Japan. J. Exp. Med. 1990, 60
167-177, zasada 22 zmieniona z A na T w celu wprowadzenia miejsca rozpoznawania Bgl2 od 8 do 13 zasady miejsce rozpoznawania Bgl2
Właściwości: służy jako starter syntezy DNA na ujemnej nici RNA/DNA genomowego dla PT-NANBH i wprowadza miejsce Bgl2
Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 13
Typ sekwencji: nukleotydowa
Długość sekwencji: 30 zasad o następującej sekwencji:
GCGAGAATTCGGGATAGGTTGTCGCCTTCC
Ilość nici: jedna
Topologia: liniowa
Typ cząsteczki: syntetyczny DNA
Pierwotny organizm źródłowy: człowiek; surowica infekcyjna pod względem potransfuzyjnego zapalenia wątroby typu nie-A nie-B
Bezpośrednie źródło doświadczalne: syntetyzator oligonukleotydowy; oligonukleotyd dl 37
Cechy: od 1 do 30 zasady homologiczna z zasadami 154 do 183 ujemnej nici BR 11 (numer identyfikacyjny sekwencji 5); zasady 174, 177 i 178 zmodyfikowano w celu wprowadzenia miejsca EcoRI od 5 do 10 zasady miejsce rozpoznawania EcoRI
Właściwości: służy jako starter syntezy DNA na dodatniej nici RNA/DNA genomowego dla PT-NANBH i wprowadza miejsce EcoRI do klonowania
Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 14
Typ sekwencji: nukleotydowa
Długość sekwencji:27 zasad o następującej sekwencji:
GGGGAATTCCTCCCGCTGCTGGGTAGC
Ilość nici: jedna
Topologia: liniowa
Typ cząsteczki: syntetyczny DNA
Pierwotny organizm źródłowy człowiek; surowica infekcyjna pod względem potransfuzyjnego zapalenia wątroby typu nie-A nie-B
Bezpośrednie źródło doświadczalne: syntetyzator oligonukleotydowy; oligonukleotyd dl36
Cechy: od 1 do 27 zasady homologiczna z zasadami 672 do 698 dodatniej nici BR11 (numer identyfikacyjny sekwencji 5); zasadę 675 zmieniono na G w celu wprowadzenia miejsca EcoRI
168 925 od 4 do 9 zasady miejsce rozpoznawania EcoR1
Właściwości: służy jako starter syntezy DNA na ujemnej nici RNA/DNA genomowego dla PT-NANBH i wprowadza miejsce EcoR1 do klonowania
Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 15
Typ sekwencji: nukleotydowa
Długość sekwencji: 28 zasad o następującej sekwencji:
ACGGGAATTCGACCAGGCACCTGGGTGT
Ilość nici: jedna
Topologia: liniowa
Typ cząsteczki: syntetyczny DNA
Pierwotny organizm źródłowy: szympans; surowica infekcyjna pod względem potransfuzyjnego zapalenia wątroby typu nie-A nie-B
Bezpośrednie źródło doświadczalne: syntetyzator oligonukleotydowy; oligonukleotyd d 155
Cechy: od 1 do 28 zasady homologiczna z zasadami 462 do 489 nici ujemnej przedstawionej na fig. 47, europejskie zgłoszenie patentowe nr 88310922.5, zasady 483 i 485 zmieniono w celu wprowadzenia miejsca rozpoznawania EcoR1 od 5 do 10 zasady miejsce rozpoznawania EcoR1
Właściwości: służy jako starter syntezy DNA na dodatniej nici RNA/DNA genomowego dla PT-NANBH i wprowadza miejsce EcoR1 do klonowania
Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 16
Typ sekwencji: nukleotydowa
Długość sekwencji: 23 zasady o następującej sekwencji:
CTTGAATTCTGGGAGGGCGTCTT
Ilość nici: jedna
Topologia: liniowa
Typ cząsteczki: syntetyczny DNA
Pierwotny organizm źródłowy: szympans; surowica infekcyjna pod względem potransfuzyjnego zapalenia wątroby typu nie-A nie-B
Bezpośrednie źródło doświadczalne: syntetyzator oligonukleotydowy: oligonukleotyd dl56
Cechy:od 1 do 23 zasady homologiczna z zasadami 3315 do 3337 nici dodatniej przedstawionej na fig. 47, europejskie zgłoszenie patentowe nr 88310922.5, zasadę 3323 zmieniono na C w celu wprowadzenia miejsca rozpoznawania EcoR1 od 4 do 9 zasady miejsce rozpoznawania EcoR1
Właściwości: służy jako starter syntezy DNA na ujemnej nici RNA/DNA genomowego dla PT-NANBH i wprowadza miejsce EcoR1 do klonowania
Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 17
Typ sekwencji: nukleotydowa
Długość sekwencji: 29 zasad o następującej sekwencji:
CGCCGAATTCATGCCGCCACAGGAGGTTG
Ilość nici: jedna
Topologia: liniowa
Typ cząsteczki: syntetyczny DNA
Pierwotny organizm źródłowy: człowiek; surowica infekcyjna pod względem potransfuzyjnego zapalenia wątroby typu nie-A nie-B
Bezpośrednie źródło doświadczalne: syntetyzator oligonukleotydowy; oligonukleotyd d92
Cechy: od 1 do 29 zasady homologiczna z zasadami 36 do 64 ujemnej nici JG2 (numer identyfikacyjny sekwencji 3); zasady 57, 58 i 60 zmieniono na w celu wprowadzenia miejsca EcoR1 od 5 do 10 zasady miejsce rozpoznawania EcoR1
168 925
Właściwości: służy jako starter syntezy DNA na dodatniej nici RNA/DNA genomowego dla PT-NANBH i wprowadza miejsce EcoR1 do klonowania.
Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 18
Typ sekwencji: nukleotydowa z odpowiadającym białkiem
Długość sekwencji: 504 pary zasad o sekwencji przedstawionej na fig. 7
Ilość nici: jedna
Topologia: liniowa
Typ cząsteczki: cDNA otrzymany na podstawie genomowego RNA
Pierwotny organizm źródłowy: człowiek; surowica infekcyjna pod względem potransfuzyjnego zapalenia wątroby typu nie-A nie-B
Bezpośrednie źródło doświadczalne: klon 164/137
Cechy: początek poliproteiny PT-NANBH od 308 do 504 bp
Właściwości: prawdopodobnie koduje strukturalne białka wirusa
Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 19 Typ sekwencji: nukleotydowa z odpowiadającym białkiem Długość sekwencji: 1107 par zasad o sekwencji przedstawionej na fig. 8 Ilość nici: jedna
Topologia: liniowa
Typ cząsteczki: cDNA otrzymany na podstawie genomowego RNA
Pierwotny organizm źródłowy: człowiek; surowica infekcyjna pod względem potransfuzyjnego zapalenia wątroby typu nie-A nie-B
Bezpośrednie źródło doświadczalne: klon 136/155 Cechy: część poliproteiny PT-NANBH od 1 do 1107 bp Właściwości: prawdopodobnie koduje białka strukturalne wirusa
Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 20 Typ sekwencji: nukleotydowa z odpowiadającym białkiem Długość sekwencji: 2043 par zasad o sekwencji przedstawionej na fig. 9 Ilość nici: jedna
Topologia: liniowa
Typ cząsteczki: cDNA otrzymany na podstawie genomowego RNA Pierwotny organizm źródłowy: człowiek; surowica infekcyjna pod względem potransfuzyjnego zapalenia wątroby typu nie-A nie-B
Bezpośrednie źródło doświadczalne: klon 156/92 Cechy: część poliproteiny PT-NANBH od 1 do 2043 bp Właściwości: prawdopodobnie koduje wirusowe białka niestrukturalne
Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 21
Typ sekwencji: nukleotydowa z odpowiadającym białkiem
Długość sekwencji: 2116 par zasad o sekwencji przedstawionej na fig. 10
Ilość nici: jedna
Topologia: liniowa
Typ cząsteczki: cDNA otrzymany na podstawie genomowego RNA Pierwotny organizm źródłowy: człowiek; surowica infekcyjna pod względem potransfuzyjnego zapalenia wątroby typu nie-A nie-B
Bezpośrednie źródło doświadczalne: przylegające sekwencje tworzone przez klony cDNA z końca 5' genomu
Cechy: początek poliproteiny PT-NANBH od 308 do 2116 bp Właściwości: wirusowe białka strukturalne i nie strukturalne
Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 22
Typ sekwencji: nukleotydowa z odpowiadającym białkiem
168 925
Długość sekwencji: 3750 par zasad o sekwencji przedstawionej na fig. 11 Ilość nici: jedna Topologia: liniowa
Typ cząsteczki: cDNA otrzymany na podstawie genomowego RNA
Pierwotny organizm źródłowy: człowiek; surowica infekcyjna pod względem potransfuzyjnego zapalenia wątroby typu nie-A nie-B
Bezpośrednie źródło doświadczalne: przylegające sekwencje tworzone przez klony cDNA z końca 3' genomu
Cechy: część poliproteiny PT-NANBH od 1 do 3750 bp Właściwości: wirusowe białka niestrukturalne
Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 23
Typ sekwencji: nukleotydowa
Długość sekwencji: 23 zasady o następującej sekwencji:
CGGGTTTAACATTACGGATTTCC
Ilość nici: jedna
Topologia: liniowa
Typ cząsteczki: syntetyczny DNA
Pierwotny organizm źródłowy: bakulowirus: wirus jądrowej poliedrozy Autographa californica (AcNPV)
Bezpośrednie źródło doświadczalne: syntetyzator oligonukleotydowy; oligonukleotyd d24
Cechy: od 1 do 23 zasady homologiczna z częścią genu poliedryny AcNPV położoną w kierunku zgodnym z kierunkiem transkrypcji w stosunku do miejsca klonowania BamH1 w pAc360 i podobnych wektorach
Właściwości: służy jako starter syntezy DNA z sekwencji bakulowirusowego wektora transferowego flankującej DNA wstawiony w miejscu BamH1
Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 24
Typ sekwencji: nukleotydowa
Długość sekwencji: 31 zasad o sekwencji przedstawionej na fig. 12.
Ilość nici: jedna
Topologia: liniowa
Typ cząsteczki: syntetyczny DNA
Pierwotny organizm źródłowy: bakulowirus: wirus jądrowej poliedrozy Autographa californica (AcNPV)
Bezpośrednie źródło doświadczalne: syntetyzator oligonukleotydowy; oligonukleotyd dl26
Cechy: od 1do 31 zasady homologiczna z podłożoną przeciwnie do kierunku transkrypcji sekwencją łączącą otrzymywaną gdy cDNA zamplifikowany przez d75 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 5) klonowana jest w miejscu klonowania BamH1 w pAc360 i podobnych wektorach; zmiany w zasadach 13 i 14 wprowadzają miejsce Pstl od 1 do 10 zasady homologiczna z regionem miejsca BamH1 w pAc350 i podobnych wektorach od 4 do 9 zasady miejsce BamH1 od 12 do 17 zasady miejsce Pst1
Właściwości: służy jako starter syntezy DNA przy połączeniu sekwencji bakulowirusowego wektora transferowego i sekwencji uprzednio zamplifikowanej przez oligonukleotyd d75; wprowadza miejsce rozpoznawane przez Pst1 do późni^eszego klonowania
Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 25
Typ sekwencji: nukleotydowa
Długość sekwencji: 45 zasad o sekwencji przedstawionej na fig. 13
Ilość mci: jedna
Topologia: liniowa
168 925
Typ cząsteczki: syntetyczny DNA
Pierwotny organizm źródłowy: N/A
Bezpośrednie źródło doświadczalne: syntetyzator ellgonukloetydewy; ellgonuklootyd dl32
Cechy: od 5 do 10 zasady miejsce rozpoznawane przez Pst1 od 13 do 27 zasady łącznik kodujący pięć reszt lizyny od 28 do 45 zasady homologiczna z zasadami 4 do 21 BR11 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 7)
Właściwości: służy jako starter syntezy DNA przy końcu 5' BR11 i wprowadza syntetyczną sekwencję kodującą pięć reszt lizyny, jak również miejsce rozpoznawane przez Pst do późniejszego klonowania.
pDXII9
Fig. 1 pDXII8
A AA
BamHI Sali BamHI
AA A
BamHI Sali BamHI
I
750bp
I !350bp
A A BamHI Sali
A
Sali ▲
BamHI pDXI22
A A
BamHI Sali
NANBH ▲
BamHI
168 925
| Fig. 2 | |||
| BamHI Pstl Pstl 1 1 1 | Ba | mHI | |
| 1 DXII9 *-| C, | BRII | 0X143 (BHC-10) |
ValSerAlaGluPheArg lambda
BamHI Pstl
Pstl
BamHI
DXI19
LYS-LYS-LYS-LYS-LYS
BRII
DXI36(BHC-II)
Va I Ly s Lys Lys Lys Lys
Fig. 3.
SEQ. ID N0.2K2II6 bps)
| Ncol,49 1 | Kpnl,546 I Ciał,674 1 1 | BamHI, 1323 | Ncol,l395 | Narl,l874 |
|-1-i-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-r
500 1000 1500 2000
J L,, I ,,,I, I
| SEQ. ID No. 22 (3756 bas) | |||
| Pstl 535 l | EcoRI 1687 1 | Sali HindIII 2407 2827 1 l | Pstl 34j85 |
| f i—r ι | ι i 500 i · 1 | ' Γ |“F 1000 1500 2000 | , , , , I -τ I F , 2500 3000 I 1 1 1_1—1 J 1 L | T,.γ-T—r- 3500 -^χ.Ι.α a. |
168 925
| CAA AAT CAC TTC | CCA Pro 5 | GAC GCT CAC CTC ATC CAC CCC AAC CTC CTG TCC | 48 | |||||||||||||
| Gln Asn | Asp | Phe | Asp | Ala | Asp | Leu | Ile 10 | Glu | Ala Asn | Leu | Leu 15 | Trp | ||||
| CGG | CAT | GAG | ATG | GGC | GGG | GAC | ATT | ACC | CGC | GTG | GAG | TCA | GAG | AAC | AAG | 96 |
| Arg | His | Glu | Met | Cly | Gly | Asp | Ile | Thr. | Arg | Val | Glu | Ser | Glu | Asn | Lys | |
| 20 | 25 | 30 | ||||||||||||||
| GTA | GTA | ATC | CTC | GAC | TCT | TTC | GAC | CCG | CTC | CGA | GCG | GAG | GAG | GAT | GAG | 144 |
| Val | Val | Ile | Leu | Asp | Ser | Phe | Asp | Pro | Leu | Arg | Ala | Glu | Glu | Asp | Glu | |
| 35 | 40 | 45 | ||||||||||||||
| CGG | CAA | CTC | TCC | CTC | CCG | CCG | GAG | ATC | CTG | CGC | AAA | TCC | AAC | AAA | TTC | 192 |
| Arg | Glu | Val | Ser | Val | Pro | Ala | Glu | He | Leu | Arg | Lys | Ser | Lys | Lys | Phe | |
| 50 | 55 | 60 |
F/σ. 4 (1)
168 925
| CCA Pro 65 | - -A Pro | C SC A i u | A · < Me: | CCC CCA Pro Ala 70 | i ον Irp | w Ala | CCC CCC GAT | TAC AAC CCT | CCG Pro | CTG Leu 80 | 24C | |||||
| Arg | Pro | Asp 75 | Tyr | Asn | Pro | |||||||||||
| CTC | GAG | TCC | TGG | AAC | GCC | CCG | GAC | TAC | CTC | CCT | CCA | GTG | GTA | CAT | GGG | 288 |
| Leu | Glu | Ser | Trp | Lys | Ala | Pro | Asp | Tyr | Val | Pro | Pro | Val | Val | His | Gly | |
| 85 | 90 | 95 | ||||||||||||||
| TGC | CCA | CTG | CCA | CCT | ACT | AAG | ACC | CCT | CCT | ATA | CCA | CCT | CCA | CGG | AGA | 336 |
| cys | Pro | Leu | Pro | Pro | Thr | Lys | Thr | Pro | Pro | Ile | Pro | Pro | Pro | Arg | Arg | |
| 100 | 105 | 110 | ||||||||||||||
| AAC | AGG | ACA | GTT | GTT | CTG | ACA | CAA | TCC | ACC | GTC | TCT | TCT | GCC | CTG | GGG | 384 |
| Lys | Arg | Thr | Val | Val | Leu | Thr | Glu | Ser | Thr | Val | Sar | Ser | Ala | Leu | Ala | |
| 115 | 120 | 125 | ||||||||||||||
| GAG | CTT | GCC | ACA | AAG | CCT | TTT | GGT | AGC | TCC | GGA | CCG | TCG | GCC | CTC | GAC | 432 |
| Glu | Leu | Ala | Thr | Lys | Ala | Phe | Gly | Ser | Ser | Gly | Pro | Ser | Ala | Val | Asp | |
| 130 | 135 | 140 | ||||||||||||||
| AGC | GGC | ACG | GCA | ACC | GCC | CCT | CCT | CAC | CAA | TCC | TCC | GAC | GAC | GGC | GGA | 480 |
| Ser | ciy | Thr | Ala | Thr | Ala | Pro | Pro | Asp | Gln | Ser | Ser | Asp | Asp | Gly | Gly | |
| 145 | 150 | 155 | 160 | |||||||||||||
| GCA | GGA | TCT | GAC | GTT | CAG | TCG | TAT | TCC | TCC | ATG | CCC | CCC | CTT | GAG | GGG | 528 |
| Ala | Gly | Ser | Asp | Val | Glu | Ser | Tyr | Ser | Ser | Mec | Pro | Pro | Leu | Glu | Gly | |
| 165 | 170 | 175 | ||||||||||||||
| GAG | CCG | GGG | GAC | CCC | CAT | CTC | AGC | GAC | GGG | TCT | TGG | TCT | ACC | CTG | AGT | 576 |
| Glu | Pro | Gly | Asp | Pro | Asp | Leu | Ser | Asp | Cly | Ser | Trp | Ser | Thr | Val | Ser | |
| 180 | 185 | 190 | ||||||||||||||
| GAG | GAG | GCC | GGT | GAG | GAC | GTC | GTC | TGC | TGC | TCG | ATG | TCC | TAC | ACA | TGG | 624 |
| Glu | Glu | Ala | Gly | Glu | Asp | Vol | Val | Cys | Cys | Ser | Met | Ser | Tyr | Thr | Trp |
195 200
205
168 925
| ACń Thr | CCC Gly 210 | C L'7 Ala | /-·*· - Leu | ATC Ile | AvC Tnr | Pro 215 | * V ~ Cys | Ala | GCG -.la | CAG Glu | Glu 220 | Ser | AAC Lys | CTG Leu | CCC Pro | 0 < «- |
| ATC | AAC | ccc | TTC | ACC | AAC | TCT | TTC | CTC | CCT | CAC | CAC | AAC | ATC | CTC | TAC | 720 |
| Ile | Asn | Ala | Leu | Ser | Asn | Ser | Leu | Leu | Arg | His | His | Asn | Mec | Val | Tyr | |
| 225 | 230 | 235 | 240 | |||||||||||||
| CCT | ACC | ACA | TCC | CCC | ACC | CCA | ACC | CAC | CCC | CAC | AAC | AAC | GTC | ACC | TTT | 768 |
| Ala | Thr | Thr | Ser | Arg | Ser | Ala | Ser | Gin | -rg | Gin | Lys | Lys | Val | Thr | Phe | |
| 245 | 250 | 255 | ||||||||||||||
| GAC | AGA | CTG | CAA | ATC | CTG | GAC | CAT | CAC | TAC | CAG | GAC | CTG | CTC | AAC | GAG | 816 |
| Asp | Arg | Leu | Gin | Ile | Leu | Asp | Asp | His | Tyr | Gin | Asp | Val | Leu | Lys | Clu | |
| 260 | 265 | 270 | ||||||||||||||
| ATG | AAG | GCG | AAG | GCG | TCC | ACA | GTT | AAG | GCT | AAG | CTT | CTA | TCA | CTA | CAG | 864 |
| Met | Lys | Ala | Lys | Ala | Ser | Thr | Val | Lys | Ala | Lys | Leu | Leu | Ser | Val | Glu | |
| 275 | 280 | 285 | ||||||||||||||
| GAA | CCC | TGC | AAC | CTC | ACC | CCC | CCA | CAT | TCC | GCC | AAA | TCT | AAA | TTT | CCC | 912 |
| Glu | Ala | Cys | Lys | Leu | Thr | Pro | Pro | His | Ser | Ala | Lys | Ser | Lys | Phe | Gly | |
| 290 | 295 | 300 | ||||||||||||||
| TAT | GGG | GCA | AAG | GAC | CTC | CCG | AAC | CTA | TCC | ACC | AAG | GCC | ATT | AAC | CAC | 960 |
| Tyr | Gly | Ala | Lys | Asp | Val | Arg | Asn | Leu | Ser | Ser | Lys | Ala | Ile | Asn | His | |
| 305 | 310 | 315 | 320 | |||||||||||||
| ATC | CCC | TCC | CTC | TCC | CAG | GAC | TTC | TTC | CAA | CAC | ACT | CAA | ACA | CCA | ATT | 1008 |
| Ile | Arg | Ser | Val | Trp | Clu | Asp | Leu | Leu | Clu | Asp | Thr | Clu | Thr | Pro | Ile | |
| 325 | 330 | 335 | ||||||||||||||
| GAC | ACC | ACC | ATC | ATG | CCA | AAA | AAT | CAC | CTT | TTC | TCC | GTC | CAA | CCA | CAC | 1056 |
| Asp | Thr | Thr | Ile | Mec | Ala | Lys | Asn | Clu | Val | Phe | Cys | Val | Cln | Pro | Clu | |
| 340 | 345 | 350 |
Fig. 4 (3)
168 925
110-
| AC.··. Arg | C.jA Gly | CCC Cly 355 | CCC Arg | AAC Lys | CCA Pro | W V· . Ala | — Arg 360 | CTT Leu | AT C Ile | G 4 \j Val | Phe | CCA Pro 365 | CAu Asp | * * V Leu | GGG Cly |
| GTC | CCT | CTC | TCC | CAC | AAA | ATG | CCC | CTC | TAT | GAC | CTC | CTC | TCC | ACC | CTC |
| Val | Arg | Val | Cys | Clu | Lys | Mec | Ala | Leu | Tyr | Asp | Val | Var | Ser | Thr | Leu |
| 370 | 375 | 380 | |||||||||||||
| CCT | CAG | CCT | CTG | ATC | CCC | TCC | TCC | TAC | CCA | TTC | CAG | TAT | TCT | CCT | GGA |
| Pro | cTn | Ala | Val | Mec | Cly | Ser | Ser | Tyr | Cly | Phe | Cln | Tyr | Ser | Pro | Cly |
| 385 | 390 | 395 | 400 | ||||||||||||
| CAC | CCC | CTC | CAG | TTC | CTC | CTC | AAC | GCC | TGC | AAA | TCA | AAG | AAC | ACC | CCT |
| Cln | Arg | Val | Clu | Phe | Leu | Val | Asn | Ala | Trp | Lys | Ser | Lys | Lys | Thr | Pro |
| 405 | 410 | 415 | |||||||||||||
| ATC | CCC | TTT | CCA | TAT | GAC | ACC | CCC | TCT | TTT | GAC | TCA | ACA | GTC | ACT | Gac |
| Mec | Gly | Phe | Ala | Tyr | Asp | Thr | Arg | Cys | Phe | Asp | Ser | Thr | Val | Thr | Glu |
| -.20 | 425 | 430 | |||||||||||||
| AAT | CAC | ATC | CGT | GTA | GAG | GAG | TCA | ATT | TAT | CAA | TCT | TGT | GAC | TTG | GCC |
| Asn | Asp | He | Arg | Val | Clu | Glu | Ser | Ile | Tyr | Gin | cys | cys | Asp | Leu | Ala |
| 435 | 440 | 445 | |||||||||||||
| CCC | CAA | CCC | AGA | CAG | GCC | ATA | AGG | TCG | CTC | ACA | GAG | CGG | CTT | TAT | ATC |
| Pro | Clu | Ala | Arg | Cln | Ala | Ile | Arg | Ser | Leu | Thr | Glu | Arg | Leu | Tyr | Ile |
| 450 | 455 | 460 | |||||||||||||
| CCC | GCT | CCC | CTC | ACT | AAT | TCA | AAA | CGG | CAG | AAC | TCC | GGC | TAT | CCC | CGG |
| Cly | Gly | Pro | Leu | Thr | Asn | Ser | Lys | Cly | Cln | Asn | Cys | Cly | Tyr | Arg | Arg |
| 465 | 470 | 475 | 480 | ||||||||||||
| TCC | CCC | CCC | ACC | CCC | CTC | CTC | ACC | ACT | AGC | TCC | GCT | AAT | ACC | CTC | ACA |
| Cys | Arg | Ala | Ser | Gly | Val | Leu | Thr | Thr | Ser | Cys | Cly | Asn | Thr | Uu | Thr |
| 485 | 490 | 495 |
1152
1200
1248
1296
1344
1392
1440
Fig.i li)
1488
168 925
| TCT Cys | TAC Tyr | TTC AAC | GCC Ala | TCT GCA | GCC TGT | CGA Arg | GCT Ala | CCA Ala | AAG Lys | CTC Leu 510 | CAC Gin | GAC Asp | 1536 | |||
| Leu | Lys 500 | Ser | Ala | Ala | Cys 505 | |||||||||||
| TCC | ACu | A x G | CTC | CTC | TGC | CGA | GAu. | CCC | CTT | CTC | CTT | ATC | TCT | GAG | ACC | 1584 |
| cys | Thr | Mec | Leu | Val | Cys | Gly | Asp | Asp | Leu | Val | Val | Ile | Cys | Glu | Ser | |
| 515 | 520 | 525 | ||||||||||||||
| GCG | GGA | ACC | CAC | GAC | GAC | GCG | GCG | ACC | CTA | CGA | GTC | TTC | ACG | GAG | GCT | 1632 |
| Ala | Cly | Thr | Gir. | C lu | Asp | Ala | Ala | Ser | Leu | Arg | Val | Phe | Thr | Glu | Ala | |
| 530 | 535 | 540 | ||||||||||||||
| ATG | ACT | AGG | TAC | TCT | GCC | CCC | CCC | GCG | GAC | CCG | CCC | CAA | CCA | GAA | TAC | 1680 |
| Mec | Thr | Arg | Tyr | Ser | Ala | Pro | Pro | Gly | Asp | Pro | Pro | Gin | Pro | Glu | Tyr | |
| 545 | 550 | 555 | 560 | |||||||||||||
| GAC | CTG | GAG | TTC | ATA | ACA | TCA | TGC | TCC | TCC | AAT | GTG | TCG | GTC | GCG | CAC | 1728 |
| Asp | Leu | Glu | Leu | He | Thr | Ser | Cys | Ser | Ser | Asn | Val | Ser | Val | Ala | His | |
| 565 | 570 | 575 | ||||||||||||||
| GAT | GCA | TCT | GGC | AAA | AGG | GTA | TAC | TAC | CTC | ACC | CCT | GAC | CCG | 1770 | ||
| Asp | Ala | Ser | ciy | Lys | Arg | Val | Tyr | Tyr | Leu | Thr | Arg | Asp | Pro | |||
| 580 | 585 | 590 |
Fig. 4 (5)
168 925
| ACA Thr | GAA Glu | CTC Val | GAT Asp | CCC CTG CCC | CTC CAC | ACG Arg 10 | TAC CCT | CCC Pro | CCC Ala | TCC cys 15 | AAA Lys | ||||
| Gly 5 | Val Arg | Leu | His | Tyr | Ala | ||||||||||
| CCT | CTC | CTA | CCG | GAG | CAG | CTC | ACA | TTC | CAG | CTC | CGC | CTC | AAC | CAA | TAC |
| Pro | Leu | Leu | Arg | Glu | Clu | Val | Thr | Phe | Gin | Val | Gly | Leu | Asn | Gin | Tyr |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| CTG | GTT | GGG | TCG | CAG | CTC | CCA | TGC | CAC | CCC | GAA | CCG | GAT | CTA | CCA | CTC |
| Leu | Val | Cly | Ser | Gin | Leu | Pro | Cys | Clu | Pro | Glu | Pro | Asp | Val | Ala | Val |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| CTC | ACT | TCC | ATG | CTC | ACC | CAC | CCC | TCC | CAC | ATC | ACA | CCA | GAC | ACG | CCT |
| Leu | Thr | Ser | Mec | Leu | Thr | Asp | Pro | Ser | His | Ile | Thr | Ala | Glu | Thr | Ala |
| 50 | 55 | 60 |
192
Fig .5(1)
168 925
| AAC Lys 65 | CCC Arg | A<»kj Arg | CTC Leu | CCC Ala | AoC Arg 70 | CCC C iy | TCT Ser | W U. Pro | Pro | TCC Ser 75 | -»··»· <·» i i V Leu | CCC Ala | ACC Ser | •r a w a Ser | TCA Ser 80 | 2-- |
| CCT | ACC | CAC | TTC | TCT | GCC | CCT | TCC | TCC | AAC | CCC | ACA | TAC | ATT | ACC | CAA | 288 |
| Ala | Ser | Gln | Leu | Ser | Gly | Pro | Ser | Ser | Lys | Ala | Thr | Tyr | Ile | Thr | Cln | |
| 85 | 90 | 95 | ||||||||||||||
| AAT | CAC | TTC | CCA | GAC | CCT | GAC | CTC | ATC | CAC | CCC | AAC | CTC | CTC | TCG | CGC | 336 |
| Asn | Asp | Phe | Pro | Asp | Ala | Asp | Leu | Ile | Glu | Ala | Asn | Leu | Leu | Trp | Arg | |
| 100 | 105 | 110 | ||||||||||||||
| CAT | GAG | ATG | CCC | CGG | CAC | ATT | ACC | CGC | CTC | GAG | TCA | GAG | AAC | AAC | GTA | 384 |
| His | Glu | Met | Gly | Gly | Asp | Ile | Thr | Arg | Val | Glu | Ser | Glu | Asn | Lys | Val | |
| 115 | 120 | 125 | ||||||||||||||
| GTA | ATC | CTC | GAC | TCT | TTC | CAC | CCC | CTC | CGA | GCC | GAG | GAG | CAT | GAC | CCC | 432 |
| Val | He | Leu | Asp | Ser | Phe | Asp | Pro | Leu | Arg | Ala | Glu | Clu | Asp | Glu | Arg | |
| 130 | 135 | 140 | ||||||||||||||
| GAA | GTC | TCC | CTC | CCC | CCC | GAG | ATC | CTC | CGC | AAA | TCC | AAC | AAA | TTC | CCA | 480 |
| Glu | Val | Ser | Val | Pro | Ala | Glu | Ile | Leu | Arg | Lys | Ser | Lys | Lys | Phe | Pro | |
| 145 | 150 | 15Ś | 160 | |||||||||||||
| CCA | CCC | ATG | CCC | CCA | TCG | CCA | CGC | CCC | GAT | TAC | AAC | CCT | CCG | CTC | CTC | 528 |
| Pro | Ala | Met | Pro | Ala | Trp | Ala | Arg | Pro | Asp | Tyr | Asn | Pro | Pro | Leu | Leu | |
| 165 | 170 | 175 | ||||||||||||||
| GAC | TCC | TCC | AAC | GCC | CCC | GAC | TAC | GTC | CCT | CCA | GTC | CTA | CAT | CCC | TCC | 576 |
| Glu | Ser | Trp | Lys | Ala | Pro | Asp | Tyr | Val | Pro | Pro | Val | Val | His | Gly | Cys | |
| 130 | 185 | 190 | ||||||||||||||
| CCA | CTC | CCA | CCT | ACT | AAC | ACC | CCT | CCT | ATA | CCA | CCT | CCA | CGC | ACA | AAC | 624 |
| Pro | Leu | Pro | Pro | Thr | Lys | Thr | Pro | Pro | Ile | Pro | Pro | Pro | Arg Arg | Ly· | ||
| 195 | 200 | 205 |
168 925
| * - Arg | Aur. Tnr 210 | «J i a Val | V «. . Yal | C i w Leu | nLr. Thr | GAA <. lu 215 | Ser | Thr | Z~Q TCT | •τ* <·-»> Ser 220 | U V Ala | CTG CCG GAG | 672 | |||
| Val | Ser | leu | Ala | Glu | ||||||||||||
| CTT | CCC | ACA | AAC | CCT | TTT | z-*/*·*» w . | AGC | TCC | CGA | CCC | TCG | GCC | GTC | CAC | AGC | 720 |
| Leu | Ala | Thr | Lys | Ala | Phe | Cly | Ser | Ser | Cly | Pro | Ser | Ala | Val | Asp | Ser | |
| 225 | 230 | 235 | 240 | |||||||||||||
| CGC | ACC | CCA | ACC | CCC | CCT | CCT | GAC | CAA. | TCC | TCC | GAC | GAC | GCC | CGA | GCA | 768 |
| Gly | Thr | Ala | Thr | Ala | Pro | Pro | Asp | Gln | Ser | Ser | Asp | Asp | Gly | Gly | Ala | |
| 245 | 250 | 255 | ||||||||||||||
| GGA | TCT | GAC | GTT | CAC | TCG | TAT | TCC | TCC | ATG | CCC | CCC | CTT | GAG | GGG | GAG | 816 |
| Gly | Ser | Asp | Val | Glu | Ser | Tyr | Ser | Ser | Met | Pro | Pro | Leu | Glu | Gly | Glu | |
| 260 | 265 | 270 | ||||||||||||||
| CCG | GCG | CAC | CCC | GAT | CTC | ACC | CAC | GCG | TCT | TCG | TCT | ACC | CTG | AGT | GAG | 864 |
| Pro | Cly | Asp | Pro | Asp | Leu | Ser | Asp | Gly | Ser | Trp | Ser | Thr | Val | Ser | Glu | |
| 275 | 280 | 285 | ||||||||||||||
| GAG | GCC | GCT | GAG | GAC | CTC | CTC | TCC | TCC | TCG | ATG | TCC | TAC | ACA | TGG | ACA | 912 |
| Clu | Ala | Cly | Glu | Asp | Val | Val | Cys | Cys | Ser | Met | Ser | Tyr | Thr | Trp | Thr | |
| 290 | 295 | 300 | ||||||||||||||
| GGC | GCT | CTG | ATC | ACC | CCA | TGC | GCT | CCG | CAC | CAA | AGC | AAG | CTG | CCC | ATC | 960 |
| Cly | Ala | Leu | Ile | Thr | Pro | Cys | Ala | Ala | Glu | Glu | Ser | Lys | Leu | Pro | Ile | |
| 305 | 310 | 315 | 320 | |||||||||||||
| AAC | GCG | TTG | AGC | AAC | TCT | TTG | CTG | CC? | CAC | CAC | AAC | ATG | GTC | TAC | GCT | 1008 |
| Asn | Ala | Leu | Ser | Asn | Ser | Leu | Leu | Arg | Hls | His | Asn | Met | Val | Tyr | Ala | |
| 325 | 330 | 335 | ||||||||||||||
| ACC | ACA | TCC | CGC | AGC | CCA | AGC | CAG | CGG | 1035 | |||||||
| Thr | Thr | Ser | Arg | Ser | Ala | Ser | Gln | Arg | ||||||||
| 340 | 343 | |||||||||||||||
| Fi | i | .5 (3) |
168 925
| ACA AAA ACC AAA CCT AAC ACC AAC CTC CCC CCA CAG | GAC CTC AGC TTC | ||||||||||||||
| Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn Leu Arg | Pro Gin | Asp | Val | Arg 15 | Phe | ||||||||||
| 5 | 10 | ||||||||||||||
| CCC | CGC | GGT | CCT | CAC | ATC | CTT | CCT | GGA | CTT | TAC | CTG | TTC | CCC | CCC | ACG |
| Pro | Gly | Gly | Gly | Gin | Ile | Val | Ciy | Ciy | Val | Tyr | Leu | Leu | Pro | Arg Arg | |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| GGC | CCC | AGG | TTG | CCT | CTG | CCC | CCC | ACT | ACC | AAG | ACT | TCC | CAG | CCC | TCC |
| Gly | Pro | Arg | Leu | ciy | Val | Arg | Ala | Thr | Arg | Lys | Thr | Ser | Clu | Arg | Ser |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| CAA | CCT | CCT | CCA | AGC | CCA | CAA | CCT | ATC | CCC | AAC | CCT | CCC | CAG | CCC | GAC |
| Gin | Pro | Arg | ciy | Arg | Arg | Cln | Pro | Ile | Pro | Lys | Ala | Arg | Gin | Pro | Glu |
| 50 | 55 | 60 |
144
192
Fig. 6 11)
168 925
| \-i \-ł KC i\ ó 5 | AGG GCC | TGG i r p | GCT CAC | CCC Pro | V» V G l· y | TAG Tvr | GGT Pro | i Uw Trp 75 | CCG Pro | CTC Leu | TAT Tyr | CCC Cly | AAC Asn 80 | 240 | ||
| A - £ | Λ X. O | Aić | Gir 70 | |||||||||||||
| CAG | ccc | ATC | CCC | TGG | CCA | GGA | TCC | CTC | CTC | TCA | CCC | CCT | GCC | TCC | CCC | 288 |
| Glu | Cly | Met | ciy | Trp | Ala | Cly | Trp | Leu | Leu | Ser | Pro | Arg | Cly | Ser | Arg | |
| 85 | 90 | 95 | ||||||||||||||
| CCT | AGT | TCC | CCC | CCC | ACT | CAC | CCC | CGG | CCT | AGC | TCC | CCT | AAT | TTC | CCT | 336 |
| Pro | Ser | Trp | Cly | Pro | Thr | Asp | Pro | Arg | Arg | Arg | Ser | Arg | Asn | Leu | Gly | |
| 100 | 105 | 110 | ||||||||||||||
| AAA | CTC | ATC | GAT | ACC | CTC | ACA | TCC | GCC | TTC | CCC | GAC | TCT | CAT | GGG | CTA | 384 |
| Lys | Val | Ile | Asp | Thr | Leu | Thr | cys | Cly | Phe | Ala | Asp | Ser | His | Cly | Val | |
| 115 | 120 | 125 | ||||||||||||||
| CAT | TCC | CCT | CCT | CGC | CCC | TCC | CTT | AGC | CCC | CCT | CCC | ACC | CCC | CTG | CCC | 432 |
| His | Ser | Ala | Arg | Arg | Arg | Ser | Leu | Arg | Cly | Ala | Ala | Arg | Ala | Leu | Ala | |
| 130 | 135 | 140 | ||||||||||||||
| CAT | CCC | GTC | CCC | CTT | CTC | CAC | CAC | CCC | CTC | AAC | TAT | CCA | ACA | GCC | AAT | 480 |
| His | ciy | Val | Arg | Val | Leu | Clu | Asp | Cly | Val | Asn | Tyr | Ala | Thr | Cly | Asn | |
| 145 | 150 | 155 | 160 | |||||||||||||
| TTA | CCC | GCT | TGC | TCT | TTC | TCT | ATC | TTC | CTC | TTG | CCT | TTG | CTC | TCC | TGT | 528 |
| Leu | Pro | Gly | cys | Ser | Phe | Ser | Ile | Phe | Leu | Leu | Ala | Leu | Leu | Ser | Cys | |
| 165 | 170 | 175 | ||||||||||||||
| TTG | ACC | ATT | CCA | CCT | TCC | CCT | TAT | CAA | CTC | CCC | AAC | CTC | TCC | CCC | ATC | 576 |
| Leu | Thr | Ile | Pro | Ala | Ser | Ala | Tyr | Clu | Val | Arg | Asn | Val | Ser | Cly | Ile | |
| 180 | 185 | 190 | ||||||||||||||
| TAC | CAT | CTC | ACC | AAC | CAT | TCC | TCC | AAC | TCA | ACC | ATC | CTC | TAC | CAC | ACA | 624 |
| Tyr | His | Val | Thr | Asn | Asp | Cys | Ser | Asn | Ser | Ser | Ile | Val | Tyr | Clu | Thr | |
| 195 | 200 | 205 |
Fig. 6 t2)
168 925
| CCG Ala | CAC Asp 210 | ATC Me c | ATC Ile | ATC CAC | ACC CCC CCG TCT CTC | CCC TCT GTC Pro Cys Val 220 | CCC Arg | GAC Glu | 672 | |||||||
| Mer | His | Thr 215 | Pro Gly | Cys | Val | |||||||||||
| GGT | AAT | TCC | TCC | CGC | TCC | TCC | CTA | CCG | CTC | ACT | CCC | ACG | CTC | CCG | CCC | 720 |
| Gly | Asn | Ser | Ser | Arg | cys | Trp | Val | Ala | Leu | Thr | Pro | Thr | Leu | Ala | Ala | |
| 225 | 230 | 235 | 240 | |||||||||||||
| AAG | GAC | GCC | ACC | ATC | CCC | ACT | CCG | ACA | ATA | CGA | CGC | CAC | CTC | GAT | TTC | 768 |
| Lys | Asp | Ala | Ser | Ile | Pro | Thr | Ala | Thr | Ile | Arg | Arg | His | Val | Asp | Leu | |
| 245 | 250 | 255 | ||||||||||||||
| CTC | CTT | GGG | GCC | CCT | CCC | TTC | TCG | TCC | GCT | ATG | TAC | GTG | CGG | GAT | CTC | 816 |
| Leu | Val | Gly | Ala | Ala | Ala | Phe | Ser | Ser | Ala | Met | Tyr | Val | Gly | Asp | Leu | |
| 260 | 265 | 270 |
| TGC | GGA TCT | GTT | TTC | CCG | 834 |
| Cys | Gly Ser | Val | Phe | Pro | |
| 275 |
Fig. 6 13)
168 925
| CAT CACTCC - | CTCTCACGAA | ctactctctt | cacccagaaa | CCCTCTACCC | ATCCCCTTAC | óC' |
| TATCACTCTC | CTCCACCCTo | CAGoACCCCo | CCTCCCCCCA | C Al. ^CaTAGT | cgtctccgca | 120 |
| ACCGGTGAGT | acaccgcaat | tcccaggacg | ACCGCCTCCT | TTCTTCGATT | AACCCCCTCA | 180 |
| ATCCCTGGAG | atttccgcct | gcccccccaa | CACTCCTAGC | CCACTACTGT | TCGGTCCCCA | 240 |
| AAGCCCTTCT | cctactccct | GATAGCCTCC | TTCCGACTCC | CCCCCCAGCT | CTCCTAGACC | 300 |
| CTGCACC AT | G ACC ACC AAT CCT AAA | CCT CAA AGA | AAA ACC AAA CCT AAC | 349 |
| Mec | Ser Thr Asn | Pro 5 | Lys | Pro | Cln | Arg | Lys 10 | Thr | Lys | Arg | Asn | ||||
| ACC | AAC | CCC | CCC | CCA | CAG | CAC | CTC | AAC | TTC | CCC | GCC | CCT | CCT | CAG | ATC |
| Thr | Asn | Pro | Arg | Pro | Gln | Asp | Val | Lys | Phe | Pro | Cly | Cly | Cly | Cln | Ile |
| 15 | 20 | 25 | 30 | ||||||||||||
| GTT | GCT | GGA | CTT | TAC | CTG | TTG | CCC | CGC | AGG | CGC | CCC | AGG | TTG | CGT | GTC |
| Vai | ciy | g ly | Val | Tyr | Leu | Leu | Pro | Arg | Arg | Cly | Prc | Arg | Leu | ciy | Val |
| 35 | 40 | 45 |
| CCC | CCC | ACT | ACC | AAC | ACT | TCC | CAG | CCG | TCG |
| Arg | Ala | Thr | Arg | Lys | Thr | Ser | Clu | Arg | Ser |
| 50 | 55 |
CAA CCT CGT CCA AGG CCA 493 Cln Pro Arg Cly Arg Arg
| CAA | CCT | ATC | CC |
| Cln | Pro | Ile | Pro |
| 65 |
504
Fig. 7
168 925
| TCC TCC | CCC Arg | TCC Cys | TCC Trp 5 | CTA Val | CCC Ala | CTC ACT CCC | ACC Thr | CTC CCC CCC AAC CAC | 48 | |||||||
| Ser | Ser | Leu Thr | Pro 10 | Leu | Ala | Ala | Lys 15 | Asp | ||||||||
| GCC | AGC | ATC | CCC | ACT | CCC | ACA | ATA | CGA | CGC | CAC | GTC | GAT | TTG | CTC | CTT | 96 |
| Ala | Ser | Ile | Pro | Thr | Ala | Thr | Ile | Arg | Arg | His | Val | Asp | Leu | Leu | Val | |
| 20 | 25 | 30 | ||||||||||||||
| GGG | GCG | GCT | GCC | TTC | TGC | TCC | GCT | ATG | TAC | GTG | GGG | GAT | CTC | TGC | CGA | 144 |
| ciy | Ala | Ala | Ala | Phe | Cys | Ser | Ala | Met | Tyr | Val | Gly | Asp | Leu | cys | Cly | |
| 35 | 40 | 45 | ||||||||||||||
| TCT | GTT | TTC | CTC | GTC | TCT | CAC | CTG | TTC | ACC | TTC | TCG | CCT | CGC | CGA | CAT | 192 |
| Ser | Val | Phe | Leu | Val | Ser | Cln | Leu | Phe | Thr | Phe | Ser | Pro | Arg | Arg | His | |
| 50 | 55 | 60 |
Fig .8(1)
168 925
| C-.G Gir. 65 | ACC CTA | νλν Gin | GAC Asp | TCC Cys 70 | AA. Asr | TGT Cys | τ ca Ser | ATC Iie | TAT Tyr 75 | CCC Pro | GG Z Gly | CAC His | CTA Val | TCA Ser 80 | 240 | |
| Tnr | Val | |||||||||||||||
| CCT | CAC | CCC | ATG | CCT | TCG | GAT | ATC | ATC | ATC | AAC | TCC | TCA | CCT | ACA | CCA | 288 |
| Ciy | His | Arg | Me t | Ala | Trp | Asp | Me c | Me c | Me t | Asn | Trp | Ser | Pro | Thr | Ala | |
| 85 | 90 | 95 | ||||||||||||||
| GCC | CTA | GTG | CTA | TCC | CAG | CTA | CTC | CGC | ATC | CCA | CAA | GCT | GTC | GTG | GAC | 336 |
| Ala | Leu | Val | Val | Ser | Gin | Leu | Leu | Arg | Ile | Pro | Gin | Ala | Val | Val | Asp | |
| 100 | 105 | 110 | ||||||||||||||
| ATG | GTG | CCG | GCG | CCC | CAC | TCG | CCA | GTC | CTG | GCG | CGC | CTT | ccc | TAC | TAT | 384 |
| Met | Val | Ala | Gly | Ala | His | Trp | Gly | Val | Leu | Ala | Gly | Leu | Ala | Tyr | Tyr | |
| 115 | 120 | 125 | ||||||||||||||
| TCC | ATG | GTC | GGG | AAC | TCC | CCT | AAC | CTC | TTC | GTT | CTC | ATG | CTA | CTC | TTT | 432 |
| Ser | Met | Val | Gly | Asn | Trp | Ala | Lys | Val | Leu | Val | Val | Met | Leu | Leu | Phe | |
| 130 | 135 | 140 | ||||||||||||||
| CCC | CCC | CTT | CAC | CCC | CAA | CCT | Tac | ACG | ACA | CCC | CCC | ACA | CAC | GGC | CCC | 480 |
| Ala | Gly | Val | Asp | Gly | Glu | Pro | Tyr | Thr | Thr | Gly | Gly | Thr | His | ciy | Arg | |
| 145 | 150 | 155 | 160 | |||||||||||||
| CCC | GCC | CAC | CGC | CTT | ACA | TCC | CTC | TTC | ACA | CCT | GGG | CCG | GCT | CAG | AAA | 528 |
| Ala | Ala | His | Gly | Leu | Thr | Ser | Leu | Phe | Thr | Pro | Gly | Pro | Ala | Cln | Lys | |
| 165 | 170 | 175 | ||||||||||||||
| ATC | CAC | ςττ | CTA | AAC | ACC | AAC | GCC | ACC | TCC | CAC | ATC | AAC | ACA | ACT | GCC | 576 |
| Ile | Cln | Leu | Val | Asn | Thr | Asn | Ciy | Ser | Trp | His | Ile | Asn | Arg | Thr | Ala | |
| 180 | 185 | 190 | ||||||||||||||
| TTC | AAC | TCC | AAT | CAC | TCC | CTC | CAA | ACT | CCG | TTC | CTT | GCC | GCC | CTC | TTC | 624 |
| Leu | Asn | Cys | Asn | Asp | Ser | Leu | Cln | Thr | Ciy | Phe | Leu | Ala | Ala | Leu | Phe | |
| 195 | 200 | 205 | ||||||||||||||
| Fig | . 8 (2) |
168 925
| TAC Tyr | ACG Thr 210 | His | Arg | Pne | AAT Asn | CCC Ala 215 | TCC Ser | /-» z-> . UO. Giy | X * cys | X o.~. Ser | vAC Glu 220 | cc: Arg | ATC i'.e t | CCS Ala | ag : Ser | £72 |
| TCC | CGC | CCC | ATT | CAC | CAC | TTC | CAT | CAG | GGC | TGG | GGT | CCC | ATC | ACT | TAT | 720 |
| Cys | Arg | Pro | Ile | Asp | Cln | Phe | Asp | Cln | Gly | Trp | Gly | Pro | Ile | Thr | Tyr | |
| 225 | 230 | 235 | 240 | |||||||||||||
| AAT | CAC | TCC | CAC | CCC | TTC | CAC | CAC | AGC | CCC | TAT | TCC | TGG | CAC | TAC | GCA | 768 |
| Asn | Clu | Ser | His | Gly | Leu | Asp | Cln | Arg | Pro | Tyr | cys | Trp | His | Tyr | Ala | |
| 245 | 250 | 255 | ||||||||||||||
| CCT | CAA | CCG | TGT | GCT | ATC | GTC | CCC | CCC | TTG | CAG | CTC | TGT | GGC | CCA | GTG | 816 |
| Pro | Glu | Pro | Cys | Gly | Ile | Val | Pro | Ala | Leu | Gin | Val | cys | Gly | Pro | Val | |
| 260 | 265 | 270 | ||||||||||||||
| TAC | TCT | TTC | ACT | CCA | AGC | CCT | CTT | CTC | CTC | GCG | ACC | ACC | GAT | CGT | TTC | 864 |
| Tyr | Cys | Phe | Thr | Pro | Ser | Pro | Val | Val | Val | Gly | Thr | Thr | Asp | Arg | Phe | |
| 275 | 280 | 285 | ||||||||||||||
| GCC | CCC | CCT | ACC | TAC | AGA | TCC | CCT | CAC | AAT | GAC | ACC | CAC | GTC | CTG | CTT | 912 |
| G-ly | Ala | Pro | Thr | Tyr | Arg | Trp | Cly | Glu | Asn | Clu | Thr | Asp | Val | Leu | Leu | |
| 290 | 295 | 300 | ||||||||||||||
| CTC | AAC | AAC | ACG | CGG | CCC | CCA | CGC | GGC | AAC | TGG | TTC | GCC | TCT | ACA | TGG | 960 |
| Leu | Asn | Asn | Thr | Arg | Pro | Pro | Arg | Gly | Asn | Trp | Phe | ciy | cys | Thr | Trp | |
| 305 | 310 | 315 | 320 | |||||||||||||
| ATG | AAT | AGC | ACC | GGC | TTC | ACC | AAC | ACG | TGT | GCG | GGC | CCC | CCG | TCC | AAC | 1008 |
| Met | Asn | Ser | Thr | Gly | Phe | Thr | Lys | Thr | Cys | Gly | Cly | Pro | Pro | Cys | Asn | |
| 325 | 330 | 335 | ||||||||||||||
| ATC | GCC | GCC | CTC | GCC | AAC | AAC | ACT | TTC· | ATC | TCC | CCC | ACC | CAC | TCC | TTC | 1056 |
| Ile | Gly Gly | Val | ciy | Asn | Asn | Thr | Leu | Ile | Cys | Pro | Thr | Asp | Cys | Phs | ||
| 340 | 345 | 350 |
Fig .8 (31
| lGo | AAG | CAT | CCC | Ga v | U L· l. | act tac acc | AAA | TGC | C-CT | οστ- | CCT | TGC | |
| Arg | Lvs | His | Pro | Glu | Ais | Thr Tyr Thr | Lys | cys | Cxy | Ser | ά ly | Pro | Trp |
| 355 | 360 | 365 |
HO4
TTC
1107
Leu
Fig .8(4)
| TCC Trp | Gac Clu | ccc C i\ | CTC TTC | AuA Thr | CCC Cly | CTC ACC Leu Thr | CAC CTC | GAT Asp | GCC Ala | CAC His | TTC Phe 15 | CTC Leu | |||
| Val | Phe 5 | His 10 | Val | ||||||||||||
| TCC | CAA | ACA | AAC | CAC | CCA | GGA | CAC | AAC | TTC | CCC | TAC | CTC | GTC | CCG | TAC |
| Ser | Gir. | Thr | Lys | Cln | Ala | Cly | Asp | Asn | Phe | Pro | Tyr | Leu | Val | Ala | Tyr |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| CAG | GCT | ACT | GTC | TGC | CCT | ACC | CCC | CAG | CCC | CCA | CCT | CCA | TCA | TGG | GAT |
| Gln | Ala | Thr | Val | Cys | Ala | Arg | Ala | Cln | Ala | Pro | Pro | Pro | Ser | Trp | Asp |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| CAA | ATG | TGG | AAG | TCT | CTC | ATA | CGC | CTA | AAG | CCT | ACT | CTC | CCC | GCG | CCA |
| Cln | Mec | Trp | Lys | Cys | Leu | Ile | Arg | Leu | Lys | Pro | Thr | Leu | Arg | Gly | Pro. |
| 50 | 55 | 60 |
144
192
Fig. 9 (1)
168 925
| ACA Tnr 65 | CCC Pro | TTG Leu | CTG Leu | TA ł Tyr | ACC 70 | CCA GCC | C1C Yal | Cln 75 | Αλ w C.~»G | GTC Yal | ACC Tnr | CTC Leu 80 | 2*·ύ | |||
| Leu | G ly | Alu | Asn | Clu | ||||||||||||
| ACA | CAC | CCC | ATA | ACC | AAA | TTC | ATC | ATC | GCA | TCC | ATG | TCA | CCC | GAC | CTC | 288 |
| Tnr | His | Pro | Ile | Thr | Lys | Phe | Ile | Met | Ala | cys | Met | Ser | Ala | Asp | Leu | |
| 8 5 | 90 | 95 | ||||||||||||||
| CAG | CTC | CTC | ACG | AGC | ACC | TCG | CTC | CTG | CTC | GGC | GGG | GTC | CTT | CCA | CCT | 336 |
| Clu | Val | Val | Thr | Ser | Thr | Trp | Val | Leu | Val | Cly | Gly | Val | Leu | Ala | Ala | |
| 100 | 105 | 110 | ||||||||||||||
| CTG | GCT | GCC | TAT | TGC | TTC | ACA | ACA | CCC | AGC | GTC | GTC | ATT | GTC | GGT | AGC | 384 |
| Leu | Ala | Ala | Tyr | Cys | Leu | Thr | Thr | Cly | Ser | Val | Val | Ile | Val | Gly | Arg | |
| 115 | 120 | 125 | ||||||||||||||
| ATC | ATC | TTC | TCC | CCC | CGC | CCC | GCT | ATT | CTT | CCC | GAC | ACC | CAA | GTC | CTC | 432 |
| Ile | Ile | Leu | Ser | Cly | Arg | Pro | Ala | Ile | Yal | Pro | Asp | Arg | Clu | Val | Leu | |
| 130 | 135 | 140 | ||||||||||||||
| TAC | CAG | GAC | TTC | GAT | CAC | ATG | GAA | CAG | TCC | CCC | TCC | CAC | CTC | CCT | TAC | 480 |
| Tyr | Gln | Clu | Phe | Asp | Clu | Met | Clu | Glu | Cys | Ala | Ser | His | Leu | Pro | Tyr | |
| 145 | 150 | 155 | 160 | |||||||||||||
| ATC | GAC | CAG | CGA | ATC | CAC | CTC | CCC | GAG | CAC | TTC | AAC | CAA | AAA | CCC | CTC | 528 |
| Ile | Glu | Gln | Gly | Met | Cln | Leu | Ala | Clu | Gln | Phe | Lys | Gln | Lys | Ala | Leu | |
| 165 | 170 | 175 | ||||||||||||||
| GGG | TTG | CTG | CAG | ACA | CCC | ACC | AAC | CAA | CCC | CAG | GCC | CCT | GCT | CCC | GTC | 576 |
| ciy | Leu | Leu | Gln | Thr | Ala | Thr | Lys | Gln | Ala | Clu | Ala | Ala | Ala | Pro | Val | |
| 180 | 185 | 190 | ||||||||||||||
| GTC | CAC | TCC | AAC | TGC | CCA | CCC | CTT | CAG | ACC | TTC | TGC | GCC | AAA | CAC | ATC | 624 |
| Yal | Glu | Ser | Lys | Trp | Arg | Ala | Leu | Glu | Thr | Phe | Trp | Ala | Ly» | Hit | Met | |
| 195 | 200 | 205 | ||||||||||||||
| Fig | . 9 121 |
168 925
| TGG Trp | AAC Asn 210 | TTC Pne | ATG Ile | ACC Ser | GGG Gly | ATA Ile 215 | CAG Gin | TAC Tyr | TT? Leu | CCr, Ala | G vC Ciy 220 | TTG Leu | TCG Ser | AC A Thr | *-> w IV Leu | 672 |
| CCT | CCC | AAT | CCC | GCC | ATT | CCA | TCA | CTC | ATC | CCC | TTC | ACA | CCC | TCT | CTC | 720 |
| Pro | Gly | Asn | Pro | Ala | Ile | Ala | Ser | Leu | Mec | Ala | Phe | Thr | Ala | Ser | Val | |
| 225 | 230 | 235 | 240 | |||||||||||||
| ACT | CCC | CTC | ACC | ACC | CAA | TCT | ACC | CTC | CTC | CTT | AAC | ATC | CTC | GGC | 768 | |
| Thr | Ser | Pro | Leu | Thr | Thr | Cln | Ser | Thr | Leu | Leu | Leu | Asn | Ile | Leu | Gly | |
| 245 | 250 | 255 | ||||||||||||||
| CGA | TGG | CTA | GCC | CCC | CAA | CTC | CCT | CCC | CCC | AGT | CCT | GCT | TCA | CCT | TTC | 816 |
| Gly | Trp | Val | Ala | Ala | Cln | Leu | Ala | Pro | Pro | Ser | Ala | Ala | Ser | Ala | Phe | |
| 260 | 265 | 270 | ||||||||||||||
| GTA | GGC | CCC | CCC | ATT | CCT | CCT | CCC | GCT | CTT | GCC | AGC | ATA | GGC | CTT | GCC | 864 |
| Val | Gly | Ala | ciy | Ile | Ala | ciy | Ala | Ala | Val | Cly | Ser | Ile | Gly | Leu | Cly | |
| 275 | 280 | 285 | ||||||||||||||
| aag | GTG | CTT | CTC | GAC | ATC | TTC | CCC | CCC | TAT | GCA | CCA | CCA | CTG | GCA | GGC | 912 |
| Lys | Va 1 | Leu | Val | Asp | Ile | Leu | Ala | Gly | Tyr | Gly | Ala | Cly | Val | Ala | Gly | |
| 290 | 295 | 300 | ||||||||||||||
| GCG | CTC | CTC | GCC | TTT | AAC | GTC | ATG | AGC | GGC | CAA | ATG | CCC | TCC | ACC | GAG | 960 |
| Ala | Leu | Val | Ala | Phe | Lys | Val | Met | Ser | Cly | Clu | Met | Pro | Ser | Thr | Clu | |
| 305 | 310 | 315 | 320 | |||||||||||||
| GAC | CTC | CTT | AAC | TTA | CTC | CCT | GCC | ATC | CTC | TCT | CCT | CGT | GCC | CTG | CTC | 1008 |
| Asp | Leu | Val | Asn | Leu | Leu | Pro | Ala | Ile | Leu | Ser | Pro | Cly | Ala | Leu | Val | |
| 325 | 330 | 335 | ||||||||||||||
| GTC | GCC | CTC | CTG | TCC | CCA | CCG | ATA | CTG | CGT | CCG | CAC | CTG | GGT | CCA | GCC | 1056 |
| Val | Gly | Val | Val | Cys | Ala | Ala | Ile | Leu | Arg | Arg | His | Val | Cly | Pro | Cly | |
| 340 | 345 | 350 |
Fig. 9 (3)
168 925
| GAG Glu | GGG Cly | GCT ALa 355 | CTC Val | Cln | TGG Trp | ΛιG AAC Mec Asn 360 | CCG Arg | C i. G Leu | ATA Ile | CCG Ala | iTo GoG Phe Ala 365 | i w Ser | CGG Arg | 113- | ||
| CCT | AAC | CAT | GTT | TCC | CCC | ACG | CAC | TAT | CTC | CCA | CAG | AGC | GAC | GCC | GCA | 1152 |
| C 1\ | Asn | His | Val | Ser | Pro | Thr | His | Tyr | Val | Pro | Glu | Ser | Asp | Ala | Ala | |
| 370 | 375 | 380 | ||||||||||||||
| CCA | CCT | CTC | ACT | CAC | ATC | CTC | TCC | GAC | CTT | ACT | ATC | ACC | CAA | CTC | TTC | 1200 |
| Ala | Arg | Val | Thr | Gln | Ile | Leu | Ser | Asp | Leu | Thr | Ile | Thr | Gln | Leu | Leu | |
| 385 | 390 | 395 | 400 | |||||||||||||
| AAC | AGC | CTC | CAC | CAG | TGG | ATT | AAC | GAG | GAC | TCC | TCC | ACG | CCC | TGC | TCC | 1248 |
| Lys | Arg | Leu | His | Gln | Trp | Ile | Asn | Glu | Asp | cys | Ser | Thr | Pro | Cys | Ser | |
| 405 | 410 | 415 | ||||||||||||||
| GGC | TCC | TCC | CTA | AGC | CAT | CTT | TCC | GAC | TCC | ATA | TCC | ACA | GTT | TTG | GCT | 1296 |
| Cly | Ser | Trp | Leu | Arg | Asp | Val | Trp | Asp | Trp | Ile | cys | Thr | Val | Leu | Ala | |
| 420 | 425 | 430 | ||||||||||||||
| CAC | TTC | AAC | ACC | TCC | CTC | CAC | TCC | AAC | CTC | CTC | CCC | CCA | TTA | CCC | GCA | 1344 |
| Asp | Phe | Lys | Thr | Trp | Leu | Gln | Ser | Lys | Leu | Leu | Pro | Arg | Leu | Pro | Cly | |
| 435 | 440 | 445 | ||||||||||||||
| CTC | CCC | TTT | TTC | TCA | TGC | CAA | CGT | CGC | TAC | AAG | GGG | GTC | TGG | CGG | GGA | 1392 |
| Val | Pro | Phe | Phe | Ser | Cys | Gln | Arg | Cly | Tyr | Lys | Gly | Val | Trp | Arg | Gly | |
| 450 | 455 | 460 | ||||||||||||||
| GAC | GGC | ATC | ATC | CAC | ACC | ACC | TGC | TCA | TGT | GGA | CCA | CAC | ATC | ACC | GGA | 1440 |
| Asp | Cly | Ile | Mec | Cln | Thr | Thr | Cys | Ser | cys | Gly | Ala | Cln | Ile | Thr | Cly | |
| 465 | 470 | 475 | 480 | |||||||||||||
| CAT | GTC | AAA | AAC | GCT | TCC | ATG | ACC | ATC | GTT | GGG | CCT | AAG | ACC | TGT | ACT | 1488 |
| His | Val | Lys | Asn | Cly | Ser | Met | Arg | Ile | Val | Cly | Pro | Lys | Thr | Cys | Ser | |
| 485 | 490 | 495 |
Fig .9 Ul
168 925
| AAC Asr. | ATG TCG | C-.T his 500 | G-GA a C - | ΐ\ C Pne | CCC Pro | ATC Σ ie 505 | AAC Asr. | CCA TAC ACC ACC CCC CCC | ||||||||
| Me: | “ “· . | Gly | « · « - | A.S | Tyr | T r. V | 510 | Ciy | Prc | |||||||
| TCC | ACC | ccc | TCC | CCA | CCG | C vA | AAC | TAT | TCC | ACC | CCC | CTC | TCC | CCC | CTC | 1584 |
| Cys | Thr | Pro | Ser | Pro | Ala | Pro | Asp. | Tyr | Ser | Arę | Ara | Leu | Trp | Arg | Val | |
| 515 | 520 | 525 | ||||||||||||||
| CCT | GCT | GAG | CAC | TAC | CTC | CAC | CTT | ACG | CGC | CTC | CGG | GAT | TTC | CAC | TAC | 1632 |
| Ala | Ala | Clu | Clu | Tyr | Val | Clu | Val | Thr | Arg | Val | Gly | Asp | Phe | His | Tyr | |
| 530 | 535 | 540 | ||||||||||||||
| GTC | ACG | AGC | ATG | ACC | ACT | GAC | AAC | CTA | AAA | TGC | CCC | TGC | CAG | GTT | CCA | 1680 |
| Vai | Thr | Ser | Mec | Thr | Thr | Asp | Asn | Val | Lys | cys | Pro | cys | Gin | Val | Pro | |
| 545 | 550 | 555 | 560 | |||||||||||||
| GCC | CCC | CAA | TTC | TTC | ACA | CAA | CTC | GAT | GCC | CTC | CCG | CTG | CAC | ACC | TAC | 1728 |
| Ala | Pro | Glu | Phe | Phe | Thr | Clu | Val | Asp | Gly | Val | Arg | Leu | His | Arg | Tyr | |
| 565 | 570 | 575 | ||||||||||||||
| GCT | CCG | GCG | TCC | AAA | CCT | CTC | CTA | CCC | GAG | CAC | CTC | ACA | TTC | CAG | CTC | 1776 |
| Ala | Pro | Ala | Cys | Lys | Pro | Leu | Leu | Arg | Glu | Glu | Val | Thr | Phe | Gin | Val | |
| 580 | 585 | 590 | ||||||||||||||
| GGG | CTC | AAC | CAA | TAC | CTG | CTT | GCC | TCG | CAG | CTC | CCA | TGC | GAG | CCC | GAA | 1824 |
| Gly | Leu | Asn | Gin | Tyr | Leu | Val | Gly | Ser | Gin | Leu | Pro | cys | Clu | Pro | Glu | |
| 595 | 600 | 605 | ||||||||||||||
| CCC | CAT | CTA | GCA | GTC | CTC | ACT | TCC | ATC | CTC | ACC | CAC | CCC | TCC | CAC | ATC | 1872 |
| Pro | Asp | Val | Ala | Val | Leu | Thr | Ser | Mec | Leu | Thr | Asp | Pro | Ser | His | Ile | |
| 610 | 615 | 620 | ||||||||||||||
| ACA | CCA | CAG | ACC | CCT | AAG | CCC | ACC | CTC | CCC | ACC | CCC | TCT | CCC | CCC | TCC | 1920 |
| Thr | Ala | Clu | Thr | Ala | Lys | Arg | Arg | Leu | Ala | Arg | Ciy | Ser | Pro | Pro | Ser | |
| 625 | 630 | 635 | 640 |
Fig. 9 (5)
168 925
| TTG | CCC | TCT | TCA | GC.T | AuC | CAS | TTC | TCT | Γ'Γ·/’ V u»v | L· w 1 | TCC | TCG | AAG | GCG | 1968 | |
| Leu | Ala | Ser | Ser | Ser | Ala | Ser | Gin | Leu | Ser | Ala | Pro | Ser | Ser | Lys | Ala | |
| 645 | 650 | 655 | ||||||||||||||
| ACA | TAC | ATT | ACC | CAA | AAT | CAC | TTC | CCA | GAC | CCT | GAC | CTC | ATC | GAC | GCC | 2016 |
| Thr | Tyr | I ie | Thr | Gin | Asn | Asp | Phe | Pro | Asp | Ala | Asp | Leu | Ile | Clu | Ala | |
| 660 | 665 | 670 |
| AAC | CTC | CTG | TCC | CCC | CAT | CAC | ATC | CGC | 2043 |
| Asn | Leu | Leu | Trp | Arg | His | Glu | Met | Gly | |
| 675 | 680 |
Fig . 9 (6)
168 925
GATCACTCCC CTGTGAGGAA CTACTGTCTT TATCACTCTC GTCCACCCTC CAGCACCCCC ACCCCTGACT ACACCCCAAT TCCCACGACC ATGCCTGGAG ATTTGGGCGT GCCCCCGCAA AAGGCCTTGT GGTACTGCCT GATAGGGTGC
CACGCAGAAA GCGTCTaGCC ATGGCGTTAC 60 CCTCCCCCGA CAGCCATAGT GGTCTGCCCA 120 ACCCGGTCCT TTCTTGGATT AACCCGCTCA 180 GACTGCTAGC CGACTAGTGT TGGGTCCCGA 240 TTGCGAGTGC CCCGGGAGGT CTCGTAGACC 300
| GTGCACC | ATG AGC ACC AAT CCT AAA | ||||||
| Met | Ser Thr | Asn Pro 5 | Lys | ||||
| ACC | AAC | CGC | CGC | CCA | CAG | GAC | GTC |
| Thr | Asn | Pro | Arg | Pro | Gln | Asp | Val |
| 15 | 20 |
| CTT | CCT | CGA | GTT | TAC | CTC | TTC | CCG |
| Val | Gly | Gly | Val | Tyr 35 | Leu | Leu | Pro |
| CCT CAA Pro Gln | AGA Arg | AAA Lys 10 | ACC AAA CCT AAC | 349 | ||||
| Thr | Lys | Arg | Asn | |||||
| AAG | TTC | CCG | GGC | CGT | CGT | CAG | ATC | 397 |
| Lys | Phe | Pro | Cly | Cly | Gly | Cln | Ile | |
| 25 | 30 | |||||||
| CGC | AGC | CCC | CCC | AGC | TTC | CCT | CTC | 445 |
| Arg | Arg | Gly | Pro | Arg | Leu | Gly | Val | |
| 40 | 45 |
F ig .10 (1)
168 925
| CGC Arg | GCG | ACT Thr | AGC AAG | ACT | TCC Ser | CAG | CCS Arg 55 | TCG CAA CCT | CGT Arg | GGA AGG | CGA Arg | 4 51 | ||||
| Arg 50 | Lvs | Ser | Gir. | Pro | Cly 60 | Arg | ||||||||||
| CAA | CCT | ATC | CCC | AAG | CCT | CCC | CAC | CCC | GAG | CGC | ACC | CCC | TCG | CCT | CAC | 541 |
| Gin | Pro | Ile | Pro | Lys | Ala | Arg | Gin | Pro | Clu | Gly | Arg | Ala | Trp | Ala | Gin | |
| 65 | 70 | 75 | ||||||||||||||
| CCC | z-'/*'kJ w | TAC | CCT | TCC | nv S* W | CTC | τ* τ ΙΛ i | GCC | AAC | CAC | CCC | ATG | CCG | TCG | CCA | 58S |
| Pro | Cly | Tyr | Pro | Trp | Pro | Leu | Tyr | Cly | Asn | Clu | Gly | Met | Cly | Trp | Ala | |
| 80 | 85 | 90 | ||||||||||||||
| CCA | TCG | CTC | CTC | TCA | CCC | CCT | CCC | TCC | ccc | CCT | AGT | TGC | CCC | CCC | ACT | 637 |
| Cly | Trp | Leu | Leu | Ser | Pco | Arg | Cly | Ser | Arg | Pro | Ser | Trp | Cly | Pro | Thr | |
| 100 | 105 | 110 | 115 | |||||||||||||
| GAC | CCC | CGG | CCT | ACC | TCG | CCT | AAT | TTC | GGT | AAA | GTC | ATC | GAT | ACC | CTC | 685 |
| Asp | Pro | Arg | Arg | Arg | Ser | Arg | Asn | Leu | Cly | Lys | Val | Ile | Asp | Thr | Leu | |
| 120 | 125 | 130 | ||||||||||||||
| ACA | TCC | GGC | TTC | GCC | CAC | CTC | ATC | GCG | TAC | ATT | CCC | CTC | GTC | CGC | GCT | 733 |
| Thr | cys | Cly | Phe | Ala | Asp | Leu | Męt | Gly | Tyr | Ile | Pro | Leu | Val | Gly | Ala | |
| 135 | luO | 145 | ||||||||||||||
| CCC | TTA | CCG | CGC | CCT | CCC | ACC | CCC | CTG | CCC | CAT | CCC | CTC | CCC | CTT | CTG | 781 |
| Pro | Leu | Gly | Gly | Ala | Ala | Arg | Ala | Leu | Ala | His | Cly | Val | Arg | Val | Leu | |
| 150 | 155 | 160 | ||||||||||||||
| GAC | GAC | ccc | CTG | AAC | TAT | CCA | ACA | GGC | AAT | TTA | CCC | CCT | TGC | TCT | TTC | 829 |
| Glu | Asp | Gly | Val | Asn | Tyr | Ala | Thr | Cly | Asn | Leu | Pro | Cly | Cys | Ser | Phe | |
| 165 | 170 | 175 | ||||||||||||||
| TCT | ATC | TTC | CTC | TTG | CCT | TTC | CTC | TCC | TCT | TTC | ACC | ATT | CCA | GCT | TCC | 877 |
| Ser | Ile | Phe | Leu | Leu | Ala | Leu | Leu | Ser | Cys | Leu | Thr | Ile | Pro | Ala | Ser | |
| 180 | 185 | 190 | 195 |
Fig . 10 (2)
168 925
| GCT TAT GAA GTG | CGC Arr 200 | AAC CTG Asn Val | TCC GGG ATC TAC CAT CTC ACC AAC GAT | 925 | ||||||||||||
| ALa. | Tyr | Glu | Val | Ser | Ciy | Ile 205 | Tyr | His | Val | Thr | Asn Asp 210 | |||||
| TCC | TCC | AAC | TCA | ACC | * ·τ» rrs l V/ | CTC | TAC | CAC | ACA | CCC | CAC | ATC | ATC | ATC | CAC | 973 |
| C/s | Ser | Asn | Ser | Ser | Ile | Val | Tyr | Glu | Thr | Ala | Asp | Mec | Ile | Mec | His | |
| 215 | 220 | 225 | ||||||||||||||
| ACC | CCC | CCC | TCT | CTC | CCC | TCT | CTC | CCC | CAG | CCT | AAT | TCC | TCC | CGC | TCC | 1021 |
| Thr | Pro | Ciy | Cys | Vai | Pro | Cys | Val | Arg | Clu | Gly | Asn | Ser | Ser | Arg | Cys | |
| 230 | 235 | 240 | ||||||||||||||
| TGG | GTA | GCG | CTC | ACT | CCC | ACC | CTC | CCG | CCC | AAG | GAC | CCC | AGC | ATC | CCC | 1069 |
| Trp | Val | Ala | Leu | Thr | Pro | Thr | Leu | Ala | Ala | Lys | Asp | Ala | Ser | Ile | Pro | |
| 245 | 250 | 255 | ||||||||||||||
| ACT | CCC | ACA | ATA | CGA | CGC | CAC | GTC | GAT | TTG | CTC | CTT | GGC | GCG | GCT | CCC | 1117 |
| Thr | Ala | Thr | Ile | Arg | Arg | His | Val | Asp | Leu | Leu | Val | Gly | Ala | Ala | Ala | |
| 260 | 265 | 270 | 275 | |||||||||||||
| TTC | TGC | TCC | CCT | ATC | TAC | GTG | CGG | GAT | CTC | TGC | CCA | TCT | GTT | TTC | CTC | 1165 |
| Phe | Cys | Ser | Ala | Met | Tyr | Val | Gly | Asp | Leu | cys | Gly | Ser | Val | Phe | Leu | |
| 280 | 285 | 290 | ||||||||||||||
| GTC | TCT | CAG | CTG | TTC | ACC | TTC | TCC | CCT | CGC | CCA | CAT | CAG | ACG | GTA | CAG | 1213 |
| Val | Ser | Cln | Leu | Phe | Thr | Phe | Ser | Pro | Arg | Arg | His | Gin | Thr | Val | Gin | |
| 295 | 300 | 305 | ||||||||||||||
| CAC | TGC | AAT | TGT | TCA | ATC | TAT | CCC | GCC | CAC | CTA | TCA | GGT | CAC | CGC | ATC | 1261 |
| Asp | Cys | Asn | Cys | Ser | Ile | Tyr | Pro | Ciy | His | Val | Ser | Gly | His | Arg | Mec | |
| 310 | 315 | 320 | ||||||||||||||
| CCT | TCG | GAT | ATC | ATC | ATC | AAC | TCC | TCA | CCT | ACA | GCA | GCC | CTA | CTG | GTA | 1309 |
| Ala | Trp | Asp | Mec | Mec | Mec | Asn | Trp | Ser | Pro | Thr | Ala | Ala | Leu | Val | Vel | |
| 325 | 330 | 335 | ||||||||||||||
| Fig- | U (3) |
168 925
| i CC Ser 340 | Cln | CTA Leu | CTC Leu | CGC ATC | CCA Pro | CAA Gin | GCT Ala | GTC Val | CTC CAC ATC CTC GCC GCC | 1357 | ||||||
| Arg | Ile 34 5 | Val 350 | Asp | Me C | Val | Ala | Cly 355 | |||||||||
| GCC | CAC | TGG | GGA | CTC | CTC | CCC | CCC | CTT | GCC | TAC | TAT | TCC | ATC | GTG | GGG | 1405 |
| Ais | His | Trp | Cly | Val | Leu | Ala | Cly | Leu | Ala | Tyr | Tyr | Ser | Mec | Val | Cly | |
| 360 | 365 | 370 | ||||||||||||||
| AAC | TCG | GCT | AAG | CTC | TTG | CTT | CTC | ATC | CTA | CTC | TTT | CCC | CCC | GTT | GAC | 1453 |
| Asn | Trp | Ala | Lys | Val | Leu | Val | Val | Mec | Leu | Leu | P'ne | Ala | Cly | Val | Asp | |
| 375 | 380 | 385 | ||||||||||||||
| GCC | GAA | CCT | TAC | ACG | ACA | CGC | GGC | ACA | CAC | CCC | CCC | CCC | GCC | CAC | GGC | 1501 |
| Cly | Clu | Pro | Tyr | Thr | Thr | Gly | Cly | Thr | His | Cly | Arg | Ala | Ala | His | Gly | |
| 390 | 395 | 400 | ||||||||||||||
| CTT | ACA | TCC | CTC | TTC | ACA | CCT | CGC | CCG | CCT | CAC | AAA | ATC | CAC | CTT | CTA | 1549 |
| Leu | Thr | Ser | Leu | Phe | Thr | Pro | ciy | Pro | Ala | Gln | Lys | Ile | Cln | Leu | Val | |
| u05 | 410 | 415 | ||||||||||||||
| AAC | ACC | AAC | CCC | ACC | TCC | CAC | ATC | AAC | ACA | ACT | CCC | TTC | AAC | TGC | AAT | 1597 |
| Asn | Thr | Asn | Cly | Ser | Trp | His | He | Asn | Arg | Thr | Ala | Leu | Asn | Cys | Asn | |
| 420 | 425 | 430 | 435 | |||||||||||||
| GAC | TCC | CTC | CAA | ACT | GGG | TTC | CTT | CCC | GCG | CTG | TTC | TAC | ACG | CAC | ACG | 1645 |
| Asp | Ser | Leu | Cln | Thr | ciy | Phe | Leu | Ala | Ala | Leu | Phe | Tyr | Thr | His | Arg | |
| 440 | 445 | 450 | ||||||||||||||
| TTC | AAT | GCG | TCC | GGA | TGC | TCA | CAC | CGC | ATG | CCC | AGC | TGC | CGC | CCC | ATT | 1693 |
| Phe | Asn | Ala | Ser | Gly | Cys | Ser | Clu | Arg | Mec | Ala | Ser | Cys | Arg | Pro | Ile | |
| 455 | 460 | 465 | ||||||||||||||
| GAC | CAG | TTC | GAT | CAC | CGC | TCG | GCT | CCC | ATC | ACT | TAT | AAT | GAC | TCC | CAC | 1741 |
| Asp | Gln | Phe | Asp | Gln | Gly | Trp | ciy | Pro | Ile | Thr | Tyr | Asn | Glu | Ser | His | |
| 470 | 475 | 480 |
Fig .10 (4 )
168 925
| CCC Cly | TTC GAC | Gln | ACu Arg | CCC Pro | TAT Tyr u90 | -rr' - Cys | TkjC Trp | /* * r His | .Au Tyr | G uA Ala 495 | CCT Pro | CAA CCC TCT Gln Pro Cys | 1789 | |||
| Leu 485 | Asp | |||||||||||||||
| ow X | . --f' Λ - | CTG | CCC | CCG | TTG | CAC | GTG | TGT | GGC | CCA | CTC | TAC | TCT | TTC | ACT | 1837 |
| Cly | Ile | Val | Pro | Ala | Leu | Gln | Yal | cys | Gly | Pro | Val | Tyr | cys | Phe | Thr | |
| 500 | 505 | 510 | 515 | |||||||||||||
| CCA | ACC | CCT | CTT | CTC | GTG | GCC | ACC | ACC | GAT | CGT | TTC | GGC | GCC | CCT | ACC | 1885 |
| Pro | Ser | Pro | Val | Val | Val | Gly | Thr | Thr | Asp | Arg | Phe | Gly | Ala | Pro | Thr | |
| 520 | 525 | 530 | ||||||||||||||
| TAC | AGA | TCC | CCT | GAC | AAT | GAC | ACC | GAC | CTC | CTG | CTT | CTC | AAC | AAC | ACG | 1933 |
| Tyr | Arg | Trp | Gly | Glu | Asn | Glu | Thr | Asp | Val | Leu | Leu | Leu | Asn | Asn | Thr | |
| 535 | 540 | 545 | ||||||||||||||
| CGC | CCG | CCA | CCC | CCC | AAC | TCC | TTC | GCC | TCT | ACA | TGC | ATG | AAT | AGC | ACC | 1981 |
| Arg | Pro | Pro | Arg | Cly | Asn | Trp | Phe | Gly | cys | Thr | Trp | Mec | Asn | Ser | Thr | |
| 550 | 555 | 560 | ||||||||||||||
| CCC | TTC | ACC | AAC | ACC | TCT | CCC | GCC | CCC | CCC | TGC | AAC | ATC | GGG | GGG | CTC | 2029 |
| Cly | Pne | Thr | Lys | Thr | Cys | ciy | Cly | Pro | Pro | Cys | Asn | Ile | Gly | Gly | Val | |
| 565 | 570 | 575 | ||||||||||||||
| GCC | AAC | AAC | ACT | TTG | ATC | TGC | CCC | ACC | GAC | TGC | TTC | CGG | AAG | CAT | CCC | 2077 |
| ciy | Asn | Asn | Thr | Leu | Ile | Cys | Pro | Thr | Asp | Cys | Phe | Arg | Lys | His | Pro | |
| 580 | 585 | 590 | 595 | |||||||||||||
| CAG | GCC | ACT | TAC | ACC | AAA | TGC | GGT | TCG | GCC | CCT | TCG | TTC | 2116 | |||
| Glu | Ala | Thr | Tyr | Thr | Lys | Cys | Cly | Ser | Gly | Pro | Trp | Leu | ||||
| 600 | 605 |
Fig 10(5)
168 925
| TCC Trp | GAG GGC CTC | TTC ACA | GGC Gly | CTC ACC CAC CTC CAT GCC CAC TTC CTC | 48 | |||||||||||
| Glu Gly | Val | Phe 5 | Thr | Leu Thr His 10 | Val | Asp | Ala | His | Phe 15 | Leu | ||||||
| TCC | CAA | ACA | AAG | CAG | GCA | GGA | GAC | AAC | TTC | CCC | TAC | CTC | GTG | GCG | TAC | 96 |
| Ser | Cln | Thr | Lys | Gln | Ala | ciy | Asp | Asn | Phe | Pro | Tyr | Leu | Val | Ala | Tyr | |
| 20 | 25 | 30 | ||||||||||||||
| CAC | CCT | ACT | GTG | TCC | CCT | AGG | CCC | CAC | GCC | CCA | CCT | CCA | TCA | TGC | CAT | 144 |
| Gln | Ala | thr | Val | Cys | Ala | Arg | Ala | Gln | Ala | Pro | Pro | Pro | Ser | Trp | Asp | |
| 35 | 40 | 45 | ||||||||||||||
| CAA | ATC | TGC | AAG | TCT | CTC | ATA | CCG | CTA | AAG | CCT | ACT | CTG | CCC | CGG | CCA | 192 |
| Cln | Met | Trp | Lys | Cys | Leu | Ile | Arg | Leu | Lys | Pro | Thr | Leu | Arg | Gly | Pro | |
| 50 | 55 | 60 |
Fig . 11 (1 )
168 925
| Thr 65 | CCC Pro | TTC Leu | CTC Leu | TAT Tyr | ACC Arg 70 | C i G Leu | CGA Gly | CCC CTC CAA | AAC CAC | GTC Val | ACC Thr | CTC Leu 80 | 24C | |||
| Ala | Val | Gin 75 | Asn | Glu | ||||||||||||
| ACA | CAC | CCC | ATA | ACC | AAA | TTC | ATC | ATC | CCA | TGC | ATG | TCA | CCC | GAC | CTC | 288 |
| Thr | His | Pro | Ile | Thr 85 | Lys | Phe | Ile | Met | Ala 90 | cys | Met | Ser | Ala | Asp 95 | Leu | |
| CAG | GTC | CTC | ACC | AGC | ACC | TCC | GTG | CTC | GTC | GGC | GGG | GTC | CTT | CCA | GCT | 336 |
| Glu | Val | Val | Thr 100 | Ser | Thr | Trp | Val | Leu 105 | Val | Gly | Gly | Val | Leu 110 | Ala | Ala | |
| CTG | GCT | CCC | TAT | TGC | TTG | ACA | ACA | GGC | ACC | GTG | CTC | ATT | GTG | GCT | AGG | 384 |
| Leu | Ala | Ala 115 | Tyr | cys | Leu | Thr | Thr 120 | Cly | Ser | Val | Val | Ile 125 | Val | Gly | Arg | |
| ATC | ATC | TTC | TCC | CGC | CCC | CCC | CCT | ATT | GTT | CCC | GAC | AGG | GAA | GTC | CTC | 432 |
| Ile | Ile 130 | Leu | Ser | Cly | Arg | Pro 135 | Ala | Ile | Val | Pro | Asp 140 | Arg | Glu | Val | Leu | |
| TAC | CAG | GAC | TTC | GAT | GAG | ATC | GAA | GAG | TGC | GCC | TCG | CAC | CTC | CCT | TAC | 480 |
| Tyr 145 | Gin | Clu | Phe | Asp | Glu 150 | Met | Clu | Glu | Cys | Ala 155 | Ser | His | Leu | Pro | Tyr 160 | |
| ATC | GAC | CAG | CCA | ATG | CAG | CTC | CCC | GAC | CAG | TTC | AAG | CAA | AAA | GCG | CTC | 528 |
| Ile | Glu | Gin | Cly | Met 165 | Gin | Leu | Ala | Glu | Gin 170 | Phe | Lys | Gin | Lys | Ala 175 | Leu | |
| GGG | TTG | Ć.TG | CAC | ACA | GCC | ACC | AAG | CAA | GCG | GAG | GCC | GCT | GCT | CCC | CTG | 576 |
| Gly | Leu | Leu | Cln 180 | Thr | Ala | Thr | Lys | Gin 185 | Ala | Clu | Ala | Ala | Ala 190 | Pro | Val | |
| GTC | GAC | TCC | AAG | TGC | CGA | GCC | CTT | CAG | ACC | TTC | TGG | CCG | AAA | CAC | ATG | 624 |
| Val | Glu | Ser 195 | Ly. | Trp | Arg | Ala | Leu 200 | Clu | Thr | Phe | Trp | Ala 205 | Lya | His | Met |
Fig. 11 (2)
168 925
| TGo Trp | AAC TTC | ATC ACC | CGG ATA CAC TAC TTA GCA CCC TTC | TCC Ser | ACT Thr | CTC Leu | 672 | |||||||||
| Asn 210 | Pne | Ile | Ser | Cly | Ile Cln Tyr 215 | Leu | Ala Cly 220 | Leu | ||||||||
| CCT | CGG | AAT | CCC | GCC | ATT | GCA | TCA | CTG | ATG | GCG | TTC | ACA | GCC | TCT | CTC | 720 |
| Pro | Gly | Asn | Pro | Ala | Ile | Ala | Ser | Leu | Met | Ala | Phe | Thr | Ala | Ser | Val | |
| 225 | 230 | 235 | 240 | |||||||||||||
| ACT | ACC | CCC | CTC | ACC | ACC | CAA | TCT | ACC | CTC | CTC | CTT | AAC | ATC | CTC | GGG | 768 |
| Thr | Ser | Pro | Leu | Thr | Thr | Cln | Ser | Thr | Leu | Leu | Leu | Asn | Ile | Leu | Gly | |
| 245 | 250 | 255 | ||||||||||||||
| GGA | TGG | CTA | CCC | CCC | CAA | CTC | GCT | CCC | CCC | ACT | CCT | CCT | TCA | CCT | TTC | 816 |
| Gly | Trp | Val | Ala | Ala | Cln | Leu | Ala | Pro | Pro | Ser | Ala | Ala | Ser | Ala | Phe | |
| 260 | 265 | 270 | ||||||||||||||
| GTA | GGC | CCC | CCC | ATT | GCT | CCT | CCC | CCT | CTT | GGC | ACC | ATA | GCC | CTT | GCC | 864 |
| Val | Gly | Ala | Gly | Ile | Ala | Cly | Ala | Ala | Val | Gly | Ser | Ile | Gly | Leu | Cly | |
| 275 | 280 | 285 | ||||||||||||||
| AAG | GTG | CTT | GTG | GAC | ATC | TTG | GCC | GGC | TAT | GGA | CCA | CGA | CTG | GCA | GCC | 912 |
| Lys | Val | Leu | Val | Asp | Ile | Leu | Ala | Cly | Tyr | ciy | Ala | Gly | Val | Ala | Gly | |
| 290 | 295 | 300 | ||||||||||||||
| GCG | CTC | GTC | GCC | TTT | AAG | CTC | ATG | AGC | GGC | GAA | ATG | CCC | TCC | ACC | GAG | 960 |
| Ala | Leu | Val | Ala | Phe | Lys | Val | Met | Ser | Gly | Glu | Met | Pro | Ser | Thr | Glu | |
| 305 | 310 | 315 | 320 | |||||||||||||
| GAC | CTG | CTT | AAC | TTA | CTC | CCT | GCC | ATC | CTC | TCT | CCT | GGT | GCC | CTG | CTC | 1008 |
| Asp | Leu | 7al | Asn | Leu | Leu | Pro | Ala | Ile | Leu | Ser | Pro | Gly | Ala | Leu | Val | |
| 325 | 330 | 335 |
| CTC | GCC | CTC | GTC | TCC | CCA | CCC | ATA | CTC | CGT | CCC | CAC | GTC | GCT | CCA | GGC |
| Val | Cly | Val | Val | Cys | Ala | Ala | Ile | Leu | Arg | Arg | His | Val | Cly | Pro | Gly |
| 340 | 345 | 350 |
Fig .11 (3)
168 925
| uAG GuG Glu Gly | CCT Ala 355 | CTC Val | UAG Cln | iUu AxG AAC uGG | C x u Leu | ATA Ile | CCC Ala | ί i V Pne 365 | GCC /.ia | TCG Ser | Arg | 110- | ||||
| Trp | Mec | Asn 360 | Arg | |||||||||||||
| CCT | AAC | CAT | GTT | TCC | CCC | ACC | CAC | TAT | CTG | CCA | CAC | ACC | GAC | CCC | CCA | 1152 |
| Ciy | Asn | His | Val | Ser | Pro | Thr | His | Tyr | Val | Pro | Clu | Ser | Asp | Ala | Ala | |
| 370 | 375 | 380 | ||||||||||||||
| CCA | CCT | CTC | ACT | CAC | ATC | CTC | TCC | CAC | CTT | ACT | ATC | ACC | CAA | CTC | TTC | 1200 |
| Ala | Arg | Val | Thr | Gin | Ile | Leu | Ser | Asp | Leu | Thr | Ile | Thr | Gin | Leu | Leu | |
| 385 | 390 | 395 | 400 | |||||||||||||
| AAC | ACC | CTC | CAC | CAC | TCC | ATT | AAC | GAC | CAC | TCC | TCC | ACC | CCC | TCC | TCC | 1248 |
| Lvs | Arg | Leu | His | Gin | Trp | Ile | Asn | Clu | Asp | Cys | Ser | Thr | Pro | Cys | Ser | |
| 405 | 410 | 415 | ||||||||||||||
| GCC | TCC | TCC | CTA | AGC | GAT | GTT | TCC | GAC | TGC | ATA | TGC | ACA | GTT | TTG | GCT | 1296 |
| Gly | Ser | * Ł r | Leu | Arg | Asp | Val | Trp | Asp | Trp | Ile | Cys | Thr | Val | Leu | Ala | |
| 420 | 425 | 430 | ||||||||||||||
| GAC | TTC | AAG | ACC | TGG | CTC | CAC | TCC | AAG | CTC | CTC | CCG | CCA | TTA | CCG | GCA | 1344 |
| Asp | Phe | Lys | Thr | Trp | Leu | Gin | Ser | Lys | Leu | Leu | Pro | Arg | Leu | Pro | Gly | |
| 435 | 440 | 445 | ||||||||||||||
| GTC | CCC | TTT | TTC | TCA | TCC | CAA | CCT | GCG | TAC | AAG | GGG | CTC | TGG | CCC | GGA | 1392 |
| Val | Pro | Phe | Phe | Ser | Cys | Gin | Arg | Gly | Tyr | Lys | Gly | Val | Trp | Arg | Ciy | |
| 450 | 455 | 460 | ||||||||||||||
| GAC | CGC | ATC | ATC | CAC | ACC | ACC | TCC | TCA | TCT | GCA | CCA | CAC | ATC | ACC | CCA | 1440 |
| Asp | Ciy | Ile | Mec | Gin | Thr | Thr | cys | Ser | Cys | Gly | Ala | Cln | Ile | Thr | Ciy | |
| 465 | 470 | 475 | 480 | |||||||||||||
| CAT | CTC | AAA | AAC | CCT | TCC | ATC | ACG | ATC | GTT | GCC | CCT | AAC | ACC | TCT | ACT | 1488 |
| His | Val | Lys | Asn | Ciy | Ser | Met | Arg | Ile | V*1 | ciy | Pro | Lys | Thr | Cys | Ser | |
| 485 | 490 | 495 |
Fig .11 (4)
168 925
| AAC ATC | TCC CAT GGA ACA TTC | ccc Pro | ATC Ile 505 | AAC Asn | GCA Ala | TAC Tyr | ACC ACo CGC CCC | 1536 | ||||||||
| Asn | Met | Trp | His 500 | w i y | Tnr | Pne | Thr | Thr 510 | Cly | Pro | ||||||
| TCC | ACC | CCC | TCC | CCA | CCC | CCA | AAC | TAT | TCC | AGC | GCC | CTC | TCC | CGG | GTG | 1584 |
| Cys | Thr | Pro | Ser | Pro | Ala | Pro | Asn | Tyr | Ser | Arg | Ala | Leu | Trp | Arg | Val | |
| 515 | 520 | 525 | ||||||||||||||
| GCT | CCT | CAC | GAu | TAC | GTG | CAG | GTT | ACC | CCG | CTC | CCC | GAT | TTC | CAC | TAC | 1632 |
| Ala | Ala | Glu | Glu | Tyr | Val | Glu | Val | Thr | Arg | Val | Gly | Asp | Phe | His | Tyr | |
| 530 | 535 | 540 | ||||||||||||||
| GTG | ACC | ACC | ATC | ACC | ACT | GAC | AAC | GTA | AAA | TGC | CCG | TGC | CAG | GTT | CCA | 1680 |
| Val | Thr | Ser | Met | Thr | Thr | Asp | Asn | Val | Lys | Cys | Pro | Cys | Gln | Val | Pro | |
| 545 | 550 | 555 | 560 | |||||||||||||
| GCC | CCC | GAA | TTC | TTC | ACA | GAA | GTC | GAT | GGC | CTG | CGC | CTG | CAC | AGG | TAC | 1728 |
| Ala | Pro | Glu | Phe | Phe | Thr | Glu | Val | Asp | Gly | Val | Arg | Leu | His | Arg | Tyr | |
| 565 | 570 | 575 | ||||||||||||||
| GCT | CCG | GCG | TGC | AAA | CCT | CTC | CTA | CGG | GAG | GAC | CTC | ACA | TTC | CAC | GTC | 1776 |
| Ala | Pro | Ala | cys | Lys | Pro | Leu | Leu | Arg | Glu | Glu | Val | Thr | Phe | Gln | Val | |
| 580 | 585 | 590 | ||||||||||||||
| GGG | CTC | AAC | CAA | TAC | CTC | CTT | GGC | TCG | CAC | CTC | CCA | TCC | GAG | CCC | GAA | 1824 |
| Gly | Leu | Asn | Gln | Tyr | Leu | Val | Gly | Ser | Cln | Leu | Pro | Cys | Glu | Pro | Glu | |
| 595 | 600 | 605 | ||||||||||||||
| CCC | GAT | GTA | GCA | GTG | CTC | ACT | TCC | ATC | CTC | ACC | GAC | CCC | TCC | CAC | ATC | 1872 |
| Pro | Asp | Val | Ala | Val | Leu | Thr | Ser | Met | Leu | Thr | Asp | Pro | Ser | His | Ile | |
| 610 | 615 | 620 | ||||||||||||||
| ACA | CCA | GAC | ACC | GCT | AAC | CGC | ACC | CTC | GCC | ACG | GCC | TCT | CCC | CCC | TCC | 1920 |
| Thr | Ala | Clu | Thr | Ala | Lys | Arg | Arg | Leu | Ale | Arg | Gly | Ser | Pro | Pro | Ser | |
| 625 | 630 | 635 | 640 | |||||||||||||
| 1 | Fi | g | .))(5) |
168 925
| TTG CCC | ACC TCT TCA CCT | AGC Ser | CAC Gir. | TTG Le u | TCT GCG | CCT Pro | TCC Ser | TCG AAG GCG | 1968 | |||||||
| Leu | Ala | Ser | Ser | Ser Ala 645 | Ser 650 | Ala | Ser | Lys 655 | Ala | |||||||
| ACA | TAC | ATT | ACC | CAA | AAT | GAC | TTC | CCA | GAC | GCT | GAC | CTC | ATC | GAG | GCC | 2016 |
| Thr | Tyr | Ile | Thr | Gln | Asn | Asp | Phe | Pro | Asp | Ala | Asp | Leu | Ile | Glu | Ala | |
| 660 | 665 | 670 | ||||||||||||||
| AAC | CTC | CTG | TGG | CGG | CAT | GAG | ATG | GGC | GGC | GAC | ATT | ACC | CGC | GTG | GAC | 2064 |
| Asn | Leu | Leu | Trp | Arg | His | Glu | Met | Gly | Cly | Asp | Ile | Thr | Arg | Val | Glu | |
| 675 | 680 | 685 | ||||||||||||||
| TCA | GAC | AAC | AAG | GTA | GTA | ATC | CTC | CAC | TCT | TTC | GAC | CCG | CTC | CGA | GCC | 2112 |
| Ser | Glu | Asn | Lys | Val | Val | Ile | Leu | Asp | Ser | Phe | Asp | Pro | Leu | Arg | Ala | |
| 690 | 695 | 700 | ||||||||||||||
| CAC | GAG | GAT | GAC | CGC | GAA | CTG | TCC | CTC | CCC | GCG | GAG | ATC | CTG | CGC | AAA | 2160 |
| Glu | Glu | Asp | Glu | Arg | Glu | Val | Ser | Val | Pro | Ala | Glu | Ile | Leu | Arg | Lys | |
| 705 | 710 | 715 | 720 | |||||||||||||
| TCC | AAC | AAA | TTC | CCA | CCA | CCG | ATG | CCC | CCA | TGG | GCA | CGC | CCG | GAT | TAC | 2208 |
| Ser | Lys | Lys | Phe | Pro | Pro | Ala | Mec | Pro | Ala | Trp | Ala | Arg | Pro | Asp | Tyr | |
| 725 | 730 | 735 | ||||||||||||||
| AAC | CCT | CCG | CTG | CTG | GAG | TCC | TCG | AAC | GCC | CCG | GAC | TAC | GTC | CCT | CCA | 2256 |
| Asn | Pro | Pro | Leu | Leu | Glu | Ser | Trp | Lys | Ala | Pro | Asp | Tyr | Val | Pro | Pro | |
| 740 | 745 | 750 | ||||||||||||||
| GTG | GTA | CAT | GGG | TGC | CCA | CTG | CCA | CCT | ACT | AAG | ACC | CCT | CCT | ATA | CCA | 2304 |
| Val | Val | His | ciy | Cys | Pro | Leu | Pro | Pro | Thr | Lys | Thr | Pro | Pro | Ile | Pro | |
| 755 | 760 | 765 | ||||||||||||||
| CCT | CCA | CGC | ACG | AAC | ACC | ACA | GTT | CTT | CTC | ACA | CAA | TCC | ACC | CTC | TCT | 2352 |
| Pro | Pro | Arg | Arg | Ly· | Arg | Thr | Val | Val | Leu | Thr | Clu | Ser | Thr | Vel | Ser |
770 775 780
Fig.1 16)
168 925
| TCT Ser 785 | GCC CTC CCC CAG | CTT Leu 790 | CCC ACA AAC CCT | TTC GGT ACC TCC GAA CCC | 2400 | |||||||||||
| Ala | Leu | Ala | Clu | Ala Thr | Lys Ala | Phe 795 | Cly | Ser | Ser | Clu | Pro 800 | |||||
| TCC | CCC | GTC | CAC | AGC | CCC | ACC | GCA | ACC | CCC | CCT | CCT | GAC | CAA | CCC | TCC | 2448 |
| Ser | Ala | Val | Asp | Ser | Gly | Thr | Ala | Thr | Ala | Pro | Pro | Asp | Gin | Pro | Ser | |
| 805 | 810 | 815 | ||||||||||||||
| CAC | CAC | CCC | CGA | CCA | CCA | TCT | GAC | GTT | CAC | TCC | TAT | TCC | TCC | ATC | CCC | 2496 |
| Asp | Asp | Gly | Gly | Ala | Gly | Ser | Asp | Val | Clu | Ser | Tyr | Ser | Ser | Met | Pro | |
| 820 | 825 | 830 | ||||||||||||||
| CCC | CTT | CAG | GCG | CAG | CCG | GGC | CAC | CCC | CAT | CTC | AGC | GAC | GGG | TCT | TGG | 2544 |
| Pro | Leu | Clu | Gly | Clu | Pro | Gly | Asp | Pro | Asp | Leu | Ser | Asp | Cly | Ser | Trp | |
| 835 | 840 | 845 | ||||||||||||||
| TCT | ACC | CTC | AGT | GAC | GAC | GCC | GGT | GAC | GAC | CTC | GTC | TGC | TGC | TCG | ATG | 2592 |
| Ser | Thr | Val | Ser | Glu | Glu | Ala | Gly | Glu | Asp | Val | Val | Cys | cys | Ser | Met | |
| 850 | 855 | 860 | ||||||||||||||
| TCC | TAC | ACA | TGG | ACA | GGC | GCT | CTG | ATC | ACG | CCA | TGC | GCT | GCG | GAG | GAA | 2640 |
| Ser | Tyr | Thr | Trp | Thr | Gly | Ala | Leu | Ile | Thr | Pro | Cys | Ala | Ala | Glu | Glu | |
| £65 | 870 | 875 | 880 | |||||||||||||
| AGC | AAG | CTG | CCC | ATC | AAC | GCG | TTG | ACC | AAC | TCT | TTG | CTG | CCT | CAC | CAC | 2688 |
| Ser | Lys | Leu | Pro | Ile | Asn | Ala | Leu | Ser | Asn | Ser | Leu | Leu | Arg | His | His | |
| 885 | 890 | 895 | ||||||||||||||
| AAC | ATG | CTC | TAC | GCT | ACC | ACA | TCC | CCC | AGC | GCA | AGC | CAG | CGG | CAG | AAC | 2736 |
| Asn | Met | Val | Tyr | Ala | Thr | Thr | Ser | Arg | Ser | Ala | Ser | Gin | Arg | Cln | Lys | |
| 900 | 905 | 910 | ||||||||||||||
| AAG | CTC | ACC | TTT | CAC | AGA | CTC | CAA | ATC | CTC | CAC | CAT | CAC | TAC | CAC | GAC | 2784 |
| Lys | Val | Thr | Phe | Asp | Arg | Leu | Gin | Ile | Leu | Asp | Asp | His | Tyr | Cln | Asp | |
| 915 | 920 | 925 |
Fig.11( 7)
168 925
| CTC Val | CTC AAG | gag G lu | ATC Me c | AAC Lys | GCG Ala 935 | AA u Lys | GCG TCC Ale Ser | ACA Thr | GTT Val 940 | AAC Lys | GCT Ala | AAG Lys | CTT Leu | 28 3 2 | ||
| Leu 930 | Lys | |||||||||||||||
| CTA | TCA | CTA | CAC | GAA | CCC | TGC | AAG | CTC | ACC | CCC | CCA | CAT | TCC | GCC | AAA | 2880 |
| Leu | Ser | Val | Clu | Clu | Ala | Cys | Lys | Leu | Thr | Pro | Pro | His | Ser | Ala | Lys | |
| 945 | 950 | 955 | 960 | |||||||||||||
| TCT | AAA | TTT | CCC | TAT | CCC | CCA | AAC | CAC | GTC | CGG | AAC | CTA | TCC | AGC | AAG | 2928 |
| Ser | Lys | Phe | Cly | Tyr | Cly | Ala | Lys | Asp | Val | Arg | Asn | Leu | Ser | Ser | Lys | |
| 965 | 970 | 975 | ||||||||||||||
| CCC | ATT | AAC | CAC | ATC | CCC | TCC | GTG | TGG | GAG | GAC | TTG | TTG | GAA | GAC | ACT | 2976 |
| Ala | Ile | Asn | His | Ile | Arg | Ser | Val | Trp | Glu | Asp | Leu | Leu | Glu | Asp | Thr | |
| 980 | 985 | 990 | ||||||||||||||
| GAA | ACA | CCA | ATT | GAC | ACC | ACC | ATC | ATC | GCA | AAA | AAT | GAG | GTT | TTC | TGC | 3024 |
| Clu | Thr | Pro | Ile | Asp | Thr | Thr | Ile | Mec | Ala | Lys | Asn | Clu | Val | Phe | Cys | |
| 995 | 1000 | 1005 | ||||||||||||||
| CTC | CAA | CCA | GAC | AGA | CCA | GGC | CCC | AAG | CCA | CCT | CGC | CTT | ATC | GTC | TTC | 3072 |
| Yal | Gln | Pro | Clu | Arg | Gly | Gly | Arg | Lys | Pro | Ala | Arg | Leu | Ile | Val | Phe | |
| 1010 | 1015 | 1020 | ||||||||||||||
| CCA | CAC | TTC | GGC | CTC | CGT | CTG | TGC | GAG | AAA | ATG | GCC | CTC | TAT | GAC | CTG | 3120 |
| Pro | Asp | Leu | Cly | Yal | Arg | Val | cys | Clu | Lys | Mec | Ala | Leu | Tyr | Asp | Yal | |
| 1025 | 1030 | 1035 | 1040 | |||||||||||||
| CTC | TCC | ACC | CTC | CCT | CAC | CCT | CTC | ATG | CCC | TCC | TCG | TAC | GGA | TTC | CAC | 3168 |
| Val | Ser | Thr | Leu | Pro | Gln | Ala | Yal | Mec | Gly | Ser | Ser | Tyr | Cly | Phe | Cln | |
| 1045 | 1050 | 1055 | ||||||||||||||
| TAT | TCT | CCT | CGA | CAC | CCC | CTC | CAC | TTC | CTC | CTC | AAC | CCC | TCC | AAA | TCA | 3216 |
| Tyr | Ser | Pro | Cly | Gln | Arg | Yal | CI*» | Phe | Leu | Yal | Aan | Ala | Trp Lya | Sar | ||
| 1060 | 1065 | 1070 |
Fig.1118)
168 925
AAG AAG ACC CCT ATC CCC TTT GCA TA~ C-AC ACC CCC TGT TTT GAC TCA 3264
Lys Lys Thr Pro Mer Ciy Pne Ala Tyr Asp Thr Arg Cys Phe Asp Ser
1075 1030 1085
ACA GTC ACT CAC AAT CAC ATC CCT CTA CAC CAG TCA ATT TAT CAA TCT 3312
Thr Val Thr Clu Asn Asp Ile Arg Val Clu Clu Ser Ile Tyr Cln Cys
1090 1095 1100
TGT GAC TTC GCC CCC GAA CCC AGA CAG CCC ATA AGG TCG CTC ACA CAC 3360
Cys Asp Leu Ala Pro Glu Ala Arg Gin Ala Ile Arg Ser Leu Thr Glu
1105 1110 1115 1120
CCG CTT TAT ATC GCG GGT CCC CTC ACT AAT TCA AAA GGC CAG AAC TCC 3408
Arg Leu Tyr Ile Gly Gly Pro Leu Tht Asn Ser Lys Gly Gin Asn Cys
1125 1130 1135
CGC TAT CGC CCG TCC CGC GCG AGC CCC CTG CTG ACG ACT AGC TGC GGT 3456
Gly Tyr Arg Arg Cys Arg Ala Ser Gly Val Leu Thr Thr Ser Cys Gly
1140 1145 1150
AAT ACC CTC ACA TCT TAC TTC AAC CCC TCT CCA CCC TCT CCA CCT GCA 3504
Asn Thr Leu Thr Cys Tyr Leu Lys Ala Ser Ala Ala Cys Arg Ala Ala
1155 1160 1165
| AAG CTC CAG GAC TGC | ACG ATG CTC | CTG Val | TGC GGA GAC | GGC CTT GTC GTT | |||||
| Lys Leu Cln 1170 | Asp | Cys | Thr Met 1175 | Leu | Cys Ciy | Asp L180 | Asp Leu | Val Val | |
| ATC TGT 6AG | AGC | GCG | GGA ACC | CAG | GAG | GAC CCG | GCC | ACC CTA | CGA CTC |
| Ile Cys Clu | Ser | Ala | Gly Thr | Cln | Clu | Asp Ala | Ala | Ser Leu | Arg Val |
| 1185 | 1190 | 1195 | 1200 | ||||||
| TTC ACG GAC | GCT | ATC | ACT AGG | TAC | TCT | GCC CCC | CCC | CGC GAC | CCG CCC |
| Phe Thr Glu | Ala | Met | Thr Arg | Tyr | Ser | Ala Pro | Pro | Gly Asp | Pro Pro |
| 1205 | 1210 | 1215 |
3552
3600
F ig .1119)
3648
168 925
| CńA | CCA | GAA | TAC | GAC | CTC | GAG | TTG ATA | ACA | TCA | TGC | TCC | TCC | AAT | GTG | 369Ó |
| Cln | Pro | Glu | Tyr | Asp | Leu | Glu | Leu Ile | Thr | Ser | Cys | Ser | Ser | Asn | Val | |
| 1220 | 1225 | 1230 | |||||||||||||
| TCG | GTC | GCG | CAC | GAT | CCA | TCT | GGC AAA | AGu | CTA | TAC | TAC | CTC | ACC | CGT | 3744 |
| Ser | Val | Ala | His | Asp | Ala | Ser | Gly Lys | Arg | Val | Tyr | Tyr | Leu | Thr | Arg | |
| 1235 | 1240 | 1245 |
GAC CCC 3750
Asp Pro
1250
Fig. 11 (10)
168 925
TAAGGATCCC CCT GCA CTA TCG GCG CAA TTC Ser Ala Val Ser Ala Glu Phe
Fig. i2
CTGCCTGCA GTA AAG AAC AAG AAG AAG AAA ACC AAA CCT AAC ACC A Val Lys Lys Lys Lys Lys Lys Thr Lys Arg Asn Leu
10
Fig. T3
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 1,50 zł
Claims (8)
- Zastrzeżenia patentowe1. Sposób wykrywania antygenu wirusowego PT-NANBH i przeciwciała przeciwko antygenowi wirusowemu PT-NANBH, znamienny tym, że kontaktuje się testowaną próbkę z polipeptydem wirusowym PT-NANBH o sekwencji aminokwasowej, homologicznej przynajmniej w 90% z sekwencją aminokwasową podaną w sekwencjach o numerach identyfikacyjnych 3,4, 5, 18, 19, 20, 21 lub 22 przedstawionych odpowiednio na fig. 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 lub jej fragmentem antygenowym, lub z poliklonalnym albo z monoklonalnym przeciwciałem przeciwko takiemu polipeptydowi wirusowemu i ustala się czy w testowanej próbce występuje jakiekolwiek wiązanie antygen-przeciwciało.
- 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się sekwencję aminokwasową homologiczną przynajmniej w 90% z sekwencją aminokwasową podaną w sekwencjach o numerach identyfikacyjnych 3, 4 lub 5, przedstawionych odpowiednio na fig. 4, 5, 6, lub jej fragment antygenowy.
- 3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że stosuje się sekwencję aminokwasową homologiczną z sekwencją aminokwasową podaną w sekwencjach o numerach identyfikacyjnych 3 lub 4, przedstawionych odpowiednio na fig. 4, 5, lub jej fragment antygenowy.
- 4. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że stosuje się sekwencję aminokwasową homologiczną przynajmniej w 90% z sekwencją aminokwasową podaną w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 5, przedstawionej na fig. 6, lub jej fragment antygenowy.
- 5. Sposób według zastrz. 1, albo zastrz. 2, albo zastrz. 3, albo zastrz. 4, znamienny tym, że stosuje się sekwencję aminokwasową, homologiczną przynajmniej w 95% z sekwencją aminokwasową podaną w sekwencjach o numerach identyfikacyjnych 3,4, 5, 18,19, 20, 21 lub 22 przedstawionych odpowiednio na fig. 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 lub jej fragment antygenowy.
- 6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że stosuje się sekwencję aminokwasową homologiczną przynajmniej w 98% z sekwencją aminokwasową podaną w sekwencjach o numerach identyfikacyjnych 3, 4, 5, 18, 19, 20, 21 lub 22 przedstawionych odpowiednio na fig. 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 lub jej fragment antygenowy.
- 7. Sposób wykrywania przeciwciała przeciwko antygenowi wirusowemu PT-NANBH, znamienny tym, że kontaktuje się testowaną próbkę z jednym lub większą ilością wirusowych polipeptydów PT-NANBH, które to polipeptydy zawierają dwa lub większą ilość wirusowych antygenów PT-NANBH występujących w kombinacji albo połączonych przez fuzję i stanowiących pojedynczy polipeptyd, przy czym co najmniej jeden z tych antygenów pochodzi ze strukturalnego regionu kodującego wirusa i co najmniej jeden inny z tych antygenów pochodzi z niestrukturalnego regionu kodującego wirusa i ustala się, czy w materiale testowanej próbki występuje jakiekolwiek wiązanie antygen-przeciwciało.
- 8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że stosuje się antygen kodowany przez strukturalny region kodujący, który to antygen posiada sekwencję aminokwasową homologiczną przynajmniej w 90% z sekwencją aminokwasową podaną w sekwencji aminokwasowej o numerze identyfikacyjnym 5 przedstawionej na fig. 6 lub jej fragment antygenowy i antygen kodowany przez niestrukturalny region kodujący, który to antygen posiada sekwencję aminokwasową homologiczną przynajmniej w 90% z sekwencją aminokwasową podaną w sekwencjach o numerach identyfikacyjnych 3 lub 4, przedstawionych odpowiednio na fig. 4, 5 lub jej fragment antygenowy.168 925
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB898928562A GB8928562D0 (en) | 1989-12-18 | 1989-12-18 | Viral agent |
| GB909004814A GB9004814D0 (en) | 1990-03-03 | 1990-03-03 | Viral agent |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL168925B1 true PL168925B1 (pl) | 1996-05-31 |
Family
ID=26296388
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL30593090A PL168925B1 (pl) | 1989-12-18 | 1990-12-17 | Sposób wykrywania antygenu wirusowego PT-NANBH i przeciwciała przeciwko antygenowi wirusowemu PT-NANBH |
| PL28830090A PL167059B1 (pl) | 1989-12-18 | 1990-12-17 | Sposób wytwarzania wirusowego polipeptydu PT-NANBH |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL28830090A PL167059B1 (pl) | 1989-12-18 | 1990-12-17 | Sposób wytwarzania wirusowego polipeptydu PT-NANBH |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (2) | PL168925B1 (pl) |
-
1990
- 1990-12-17 PL PL30593090A patent/PL168925B1/pl unknown
- 1990-12-17 PL PL28830090A patent/PL167059B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL167059B1 (pl) | 1995-07-31 |
| PL288300A1 (en) | 1991-09-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA2032381C (en) | Viral agent | |
| RU2130969C1 (ru) | Композиция для диагностики гепатита c человека (варианты), способ и набор для обнаружения антител к вирусу гепатита c человека | |
| RU2155228C2 (ru) | Hcv геномные последовательности для диагностических и терапевтических целей | |
| JP3514751B2 (ja) | Ｃ型肝炎ウイルス（ｈｃｖ）ポリペプチド | |
| US7198892B2 (en) | Hepatitis-C virus type 4, 5 and 6 | |
| JP2002528140A (ja) | ヒトｐａｎ−ｈｃｖヒトモノクローナル抗体 | |
| JP2006104207A (ja) | Ｎａｎｂｖの診断用薬 | |
| JP2004043470A (ja) | 腸内伝達された非−ａ／非−ｂ肝炎ウィルス物質及びその特徴的なエピトープ | |
| CA2170521A1 (en) | Immunoreactive antigens of hepatitis e virus | |
| JP4641695B2 (ja) | 新規なｈｅｖ抗原性ペプチド及び方法 | |
| US5747240A (en) | Epitope mapping of the c33 region of HCV | |
| EP0551275B1 (en) | Non-a non-b sequences | |
| Yao et al. | A serotype-specific epitope of dengue virus 1 identified by phage displayed random peptide library | |
| WO1992009634A1 (fr) | Proteine anti-genique du virus de l'hepatite non a et non b | |
| PL168925B1 (pl) | Sposób wykrywania antygenu wirusowego PT-NANBH i przeciwciała przeciwko antygenowi wirusowemu PT-NANBH | |
| Chang et al. | Artificial NS4 mosaic antigen of hepatitis C virus | |
| US7166287B1 (en) | Viral agent | |
| EP0672066A1 (en) | Peptides from the c33 region of hcv, antibodies thereto and methods for the detection of hcv | |
| PT96223B (pt) | Processo para a preparacao de um agente viral responsavel pela hepatite nao-a bnao-b de pos-transfusao | |
| JPH08505131A (ja) | 肝炎ｃ型ウイルス（ｈｃｖ）非構造−３−ペプチド、該ペプチドに対する抗体及びｈｃｖの検出方法 | |
| JPH0568563A (ja) | Ｃ型肝炎ウイルス遺伝子およびその利用方法 |