PL168925B1 - Sposób wykrywania antygenu wirusowego PT-NANBH i przeciwciała przeciwko antygenowi wirusowemu PT-NANBH - Google Patents

Sposób wykrywania antygenu wirusowego PT-NANBH i przeciwciała przeciwko antygenowi wirusowemu PT-NANBH

Info

Publication number
PL168925B1
PL168925B1 PL30593090A PL30593090A PL168925B1 PL 168925 B1 PL168925 B1 PL 168925B1 PL 30593090 A PL30593090 A PL 30593090A PL 30593090 A PL30593090 A PL 30593090A PL 168925 B1 PL168925 B1 PL 168925B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
nanbh
sequence
viral
amino acid
acid sequence
Prior art date
Application number
PL30593090A
Other languages
English (en)
Inventor
Peter E Highfield
Brian C Rodgers
Richard S Tedder
John A J Barbara
Original Assignee
Wellcome Found
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GB898928562A external-priority patent/GB8928562D0/en
Priority claimed from GB909004814A external-priority patent/GB9004814D0/en
Application filed by Wellcome Found filed Critical Wellcome Found
Publication of PL168925B1 publication Critical patent/PL168925B1/pl

Links

Landscapes

  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

1. Sposób wykrywania antygenu wirusowego PT-NANBH i przeciwciała przeciwko antygenowi wirusowemu PT-NANBH, znamienny tym, że kontaktuje się testowaną próbkę z polipeptydem wirusowym PT-NANBH o sekwencji aminokwasowej, homologicznej przynajmniej w 90% z sekwencją aminokwasową podaną w sekwencjach o numerach identyfikacyjnych 3, 4, 5, 18, 19, 20, 21 lub 22 przedstawionych odpowiednio na fig. 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 lub jej fragmentem antygenowym, lub z poliklonalnym albo z monoklonalnym przeciwciałem przeciwko takiemu polipeptydowi wirusowemu i ustala się czy w testowanej próbce występuje jakiekolwiek wiązanie antygen-przeciwciało. 7. SposóS wyórywaniaprzeaiwziała przeciwkoantyoenowiwiwsowemoPT-NANBH, znamienny tym, ze kontaktuje się testowaną próbkę z jednym lub większą ilością wirusowych polipeptydów PT-NANBH, które to polipeptydy zawierają dwa lub większą ilość wirusowych antygenów PT-NANBH występujących w kombinacji albo połączonych przez fuzję i stanowiących pojedynczy polipeptyd, przy czym co najmniej jeden z tych antygenów pochodzi ze strukturalnego regionu kodującego wirusa i co najmniej jeden inny z tych antygenów pochodzi z ziesteuktueclzogo regionu kodującego wirusa i ustala się, czy w materiale testowanej próbki występuje jakiekolwiek wiązanie antygen-przeciwciało.

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wykrywania antygenu wirusowego PT-NANBH i przeciwciała przeciwko temu wirusowi.
Antygen wirusowy PT-NANBH wykrywany sposobem według wynalazku, odpowiedzialny jest za potransfuzyjne zapalenie wątroby typu nie-A nie-B /PT-NANBH/.
Sekwencję DNA kodującą polipeptydy wirusowe PT-NANBH można stosować do oznaczania kwasu nukleinowego w celu diagnozowania PT-NANBH.
Polipeptydy wirusowe PT-NANBH, lub poliklonalne bądź monoklonalne przeciwciała skierowane przeciwko takim polipeptydom, stosuje się do oznaczania immulogicznego stosowanego w celu diagnozowania PT-NANBH.
Diagnoza zapalenia wątroby typu nie-A nie-B /NANBH/ jest z definicji diagnozą przez wykluczenie. Na ogół wykorzystuje się ją do opisu przypadków infekcji wirusowych wywołujących zapalenie wątroby, które to infekcje nie są spowodowane wirusami zapalenia wątroby typu A lub B. Chociaż w większości takich przypadków nie zidentyfikowano przyczyn infekcji, na podstawie danych klinicznych i epidemiologicznych uważa się, że odpowiedzialne za nie są liczne czynniki, których przeglądu dokonali Shih i inni /Prog. Liver Dis., 1985, 8, 433 - 452/. W samych Stanach Zjednoczonych Ameryki do 10% transfuzji krwi może zakończyć się NANBH, co czyni je znaczącym problemem. Nawet dla PT-NANBH może istnieć co najmniej kilka czynników wirusowych odpowiedzialnych za infekcję i przez kilka lat czyniono wiele prób identyfikacji czynnika, wielokrotnie zastrzegano sposób identyfikacji tego czynnika, z których żadnego nie udowodniono.
W europejskim zgłoszeniu patentowym nr 88310922.5 opisano izolację i charakterystykę czynnika etiologicznego odpowiedzialnego za PT-NANBH, który w tym zgłoszeniu określa się także jako wirus zapalenia wątroby typu C /HCV/. Z wirusowego kwasu nukleinowego, otrzymanego z organizmu szympansa zainfekowanego PT-NANBH, przygotowano bibliotekę cDNA i przeszukano ją stosując ludzkie antysurowice. Wyizolowano i zsekwencjonowano liczne klony dodatnie. Otrzymane dane dotyczące sekwencji kwasów nukleinowych i sekwencji aminokwasowych, które opisano w tym zgłoszeniu, stanowią około 70% genomu wirusowego o długości 10 Kb i pochodzą w całości z jego końca 3', odpowiadającego niestrukturalnemu regionowi kodującemu.
Autorzy ni^^^jszego wynalazku wyizolowali i scharakteryzowali polipeptydy wirusowe PT-NANBH poprzez sklonowanie i ekspresję sekwencji DNA kodujących takie polipeptydy. Nieoczekiwanie okazało się, że dane dotyczące zarówno sekwencji kwasów nukleinowych, jak sekwencji aminokwasowych, wykazują znaczne różnice w porównaniu z odpowiadającymi im danymi według europejskiego zgłoszenia patentowego nr 88310922.5. Całkowite różnice wynoszą około 20% na poziomie kwasu nukleinowego i około 15% na poziomie aminokwasowym, lecz w pewnych regionach sekwencji znaleziono nawet większe różnice. Całkowity poziom różnic jest dużo wyższy niż możnaby było oczekiwać w przypadku dwóch izolatów tego samego wirusa, nawet uwzględniając czynniki geograficzne, i sądzi się, że różnice te spowodowane są przez jedną z dwóch możliwych przyczyn.
Po pierwsze, autorzy niniejszego wynalazku i autorzy wspomnianego powyżej europejskiego zgłoszenia patentowego zastosowali różne źródła kwasu nukleinowego użytego do klonowania cDNA. W szczególności według ouropejskiogo zgłoszenia patentowego, stosowano jako źródło wirusowego kwasu nukleinowego, będącego materiałem wyjściowym, osocze szympansa, zawierające wirusa dwukrotnie pasażowanego w organizmie szympansa. PT-NAnBH jest oczywiście chorobą ludzką i wynikiem pasażowania wirusa w organizmie obcego gospodarza, nawet jeśli jest on blisko spokrewniony z ludźmi, jest prawdopodobnie duża częstość mutacji wirusowego kwasu nukleinowego. Zgodnie z tym, dane sekwencyjne zawarte w europejskim zgłoszeniu patentowym nr 88310922.5 mogą nie być naprawdę reprezentatywne dla czynnika wirusowego odpowiedzialnego za PT-NANBH u ludzi. W przeciwieństwie do wspomnianego stanu techniki autorzy niniejszego wynalazku wykorzystali jako materiał wyjściowy do klonowania cDNA wirusowy kwas nukleinowy z osocza ludzkiego. Jest znacznie bardziej prawdopodobne, ze tak otrzymane dane sekwencyjne odpowiadają natywnej sekwencji kwasu nukleinowego i sekwencji aminokwasowej PT-NANBH.
168 925
Po drugie, możliwe jest, że czynnik wirusowy istnieje w postaci więcej, niż jednego podtypu, i dane sekwencyjne opisane w europejskim zgłoszeniu patentowym oraz przedstawione przez autorów ninieeszego wynalazku, odpowiadają oddzielnym i odmiennym podtypom tego samego czynnika wirusowego. Alternatywnie, możliwe jest, że poziom różnic pomiędzy dwiema grupami danych sekwencyjnych spowodowany jest obydwoma wyżej omawianymi czynnikami.
W wyniku przeprowadzonych doświadczeń okazało się, że wirusowy polipeptyd PTNANBH obejmuje antygen posiadający sekwencję aminokwasową homologiczną co najmniej w 90% z sekwencją aminokwasową przedstawioną w sekwencjach o numerach identyfikacyjnych: 3,4, 5, 18, 19, 20, 21 lub 22, lub stanowi fragment tego antygenu.
Sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 3, 4, 5, 18, 19, 20, 21 lub 22 przedstawiają sekwencję aminokwasową wywnioskowaną z sekwencji kwasu nukleinowego. Sekwencja aminokwasowa jest co najmniej w 95%, lub nawet 98% homologiczna z sekwencją aminokwasową przedstawioną w sekwencjach o numerach identyfikacyjnych: 3, 4, 5, 18, 19, 20, 21 lub 22. Ewentualnie antygen poddaje się fuzji z polipeptydem heterologicznym.
Stosuje się razem dwa lub większą liczbę antygenów albo w połączeniu, albo po fuzji jako pojedynczy polipeptyd. Zastosowanie dwóch lub większej liczby antygenów w oznaczeniu diagnostycznym zapewnia bardziej wiarygodne wyniki przy stosowaniu oznaczenia w testowaniu krwi pod kątem wirusa PT-NANBH. Jeden antygen otrzymuje się ze strukturalnego regionu kodującego, /koniec 5'/, a drugi antygen otrzymuje się z niestrukturalnego regionu kodującego, /koniec 3'/. Korzystną metodą przeprowadzania fuzji antygenów jest otrzymywanie pojedynczego polipeptydu technikami rekombinacyjnymi. Metoda ta ma liczne zalety polegające na tym, że pojedyncze antygeny łączy się w określonym wcześniej, stałym stosunku /zazwyczaj równomolowym/ i zachodzi potrzeba wytworzenia, oczyszczania i scharakteryzowania tylko pojedynczego polipeptydu.
Antygenowy fragment antygenu posiadającego sekwencję aminokwasową homologiczną co najmniej w 90% z sekwencją przedstawioną w sekwencjach o numerach identyfikacyjnych: 3, 4, 5, 18, 19, 20, 21 lub 22 korzystnie zawiera minimum pięć, sześć, siedem, osiem, dziewięć lub dziesięć, piętnaście, dwadzieścia, trzydzieści, czterdzieści lub pięćdziesiąt aminokwasów. Miejsca antygenowe takich antygenów identyfikuje się przy zastosowaniu znanych sposobów. Mogą one obejmować fragmentację samego polipeptydu z zastosowaniem enzymów lub czynników chemicznych, a następnie określanie zdolności każdego fragmentu do wiązania przeciwciał lub wywoływania odpowiedzi immunologicznej, jeśli inokuluje się nimi zwierzę lub odpowiedni układ modelowy in vitro (Strohmaier i inni, J. Gen. Virol., 1982, 59, 205 - 306). Alternatywnie można fragmentować DNA kodujący polipeptyd przez trawienie enzymami restrykcyjnymi, lub stosując inne dobrze znane metody, a następnie wprowadzać do układu ekspresyjnego w celu wytworzenia fragmentów ewentualnie poddanych fuzji w dowolny sposób z polipeptydem, zazwyczaj pochodzenia bakteryjnego). Otrzymane fragmenty oznacza się jak opisano uprzednio (Spece i inni, J. Ge. Virol., 1989,70, 2843 - 51; Smith i inni, Gene, 1984, 29, 163 - 9). Można ponadto dokonywać syntezy na drodze chemicznej krótkich fragmentów peptydowych (o długości 3-20 aminokwasów; dogodnie o długości 6 aminokwasów) obejmujących całą sekwencję peptydu o pełnej długości, z każdym peptydem zachodzącym na przylegający peptyd. Ten region zachodzenia może posiadać długość 1 - 10 aminokwasów, lecz najlepiej n-1 aminokwasów, gdzie n jest długością peptydu; Geysen i inni, Proc. Natl. Acad, Sci., 1984, 81, 3998 - 4002). Każdy peptyd następnie oznacza się jak opisano uprzednio, z tym wyjątkiem, że peptyd zazwyczaj najpierw sprzęga się z jakąś cząsteczką nośnikową w celu ułatwienia indukcji odpowiedzi immunologicznej. Wreszcie, znane są metody przewidywania obejmujące analizę sekwencji pod kątem określonych cech, np. hydrofobowości, o których to cechach sądzi się, ze związane są z miejscami ważnymi immunologicznie (Hopp i Woods, Prac, Natl. Acad. Sci., 1981, 78 3824 - 8; Borzofsky, Science, 1985, 229, 932-40). Przewidywane sekwencje można następnie testować stosując opisane uprzednio sposoby a dotyczące polipeptydów otrzymywanych technikami rekombinacyjnymi lub fragmentacji samego peptydu.
Wirusowy polipeptyd może być wytwarzany w postaci czystej tj. wytwarza się polipeptyd o czystości wyższej niz 90% lub nawet 95%.
168 925
Możliwe jest otrzymanie polipeptydu wirusowego PT-NANBH przy zastosowaniu syntetyzatora aminokwasowego, w przypadku, jeśli jest on antygenem posiadającym nie więcej niż około trzydziestu reszt, lub sposobami rekombinacji DNA.
W opisie niniejszego wynalazku ujawniono także sekwencję DNA kodującą polipeptyd wirusowy PT-NANBH. Tę sekwencję DNA wytwarza się na drodze syntezy lub przez klonowanie. Korzystnie wytwarza się sekwencję DNA przedstawioną w sekwencjach o numerach identyfikacyjnych: 3, 4, 5, 18, 19, 20, 21 lub 22.
W celu otrzymania polipeptydu wirusowego PT-NANBH obejmującego wiele antygenów, korzystnie dokonuje się fuzji pojedynczych sekwencji kodujących w jedną otwartą ramkę odczytu. Fuzję przeprowadza się w taki sposób, aby nie nastąpiło znaczące ograniczenie aktywności antygenowej każdego antygenu spowodowane jego położeniem w stosunku do innych antygenów. Szczególną uwagę należy oczywiście zwrócić na charakter sekwencji w miejscu połączeń pomiędzy antygenami. Sposoby za pomocą których otrzymuje się takie pojedyncze polipeptydy są ogólnie dobrze znane.
W opisie niniejszego wynalazku ujawniono także wektor ekspresyjny zawierający zdefiniowaną tu sekwencję DNA, który to wektor jest zdolny do ekspresji sekwencji DNA w odpowiednim gospodarzu w celu wytworzenia polipeptydu wirusowego PT-NANBH.
Wektor ekspresyjny zawiera zwykle fragmenty kontrolujące DNA, które umożliwiają zajście ekspresji sekwencji DNA w odpowiednim gospodarzu. Fragmenty różnią się w zależności od gospodarza, zazwyczaj jednak obejmują promotor, miejsce wiązania rybosomu, miejsca początku i końca translacji oraz miejsce terminacji transkrypcji. Przykłady takich wektorów obejmują plazmidy i wirusy. Wektory ekspresyjne ujawnione w niniejszym opisie obejmują zarówno wektory pozachromosomalne, jak i wektory ulegające integracji z chromosomem komórki gospodarza. W przypadku wykorzystania wektora w E. coli, wektor ekspresyjny zawiera sekwencję DNA według postaci fuzji dowolnie połączonej z końcem albo 5', albo 3', sekwencji DNA kodującej, na przykład, B-galaktozydazę lub z końcem 3' sekwencji DNA kodującej, na przykład, gen trp E. W przypadku wykorzystania wektora w układzie bakulowirusa owadów (AoNPV), sekwencję DNA ewentualnie łączy się z sekwencją kodującą poliedrynę.
Niniejszy opis ujawnia także komórkę gospodarza stransformowaną zdefiniowanym tu wektorem ekspresyjnym.
Przykłady komórek gospodarza obejmują komórki prokariotyczne i eukariotyczne, takie jak komórki bakterii, drożdży, ssaków i owadów. Zwłaszcza, stosuje się takie komórki jak komórki E. coli, S. cerevisiae, P. pastoris, komórki jajnika chomika chińskiego i komórki myszy, oraz Spodoptera trugiperda i Tricoplusia ni, wybór komórki gospodarza zależy od licznych czynników, lecz w przypadku, gdy ważna jest potranslacyjna modyfikacja polipeptydu wirusowego PT-NANBH, korzystnie stosuje się komórki gospodarza eukariotycznego.
Polipeptyd wirusowy PT-NANBH można wytwarzać w ten sposób, że klonuje się lub syntetyzuje się sekwencje DNA kodującą polipeptyd wirusowy PT-NANBH, wstawia się tę sekwencję DNA do takiego wektora ekspresyjnego, który jest zdolny do ulegania ekspresji w odpowiednim gospodarzu, transformuje się komórki gospodarza wektorem ekspresyjnym, hoduje się stransformowane komórki gospodarza i izoluje się polipeptyd wirusowy.
Klonowanie sekwencji DNA prowadzi się znanymi sposobami. Istotne jest jednakże wykorzystanie danych sekwencyjnych ujawnionych w niniejszym opisie, tak aby ułatwić identyfikację i izolację pożądanej sklonowanej sekwencji DNA. Pożądane jest aby RNA izolować przez osadzanie wirusa z osocza zainfekowanych ludzi zidentyfikowanych dzięki ich udziałowi w przenoszeniu PT-NANBH. Wyizolowany RNA poddaje się odwrotnej transkrypcji na cDNA stosując albo startery losowe albo oligo-dT. Ewentualnie RNA poddaje się obróbce wstępnej w celu usunięcia wszystkich struktur drugorzędowych mogących interferować z syntezą cDNA, przykładowo przez ogrzewanie lub reakcję z wodorotlenkiem metylortęciowym. cDNA zazwyczaj modyfikuje się przez dodanie łączników, po którym następuje trawienie enzymem restrykcyjnym. Następnie wstawia się go do wektora klonującego, takiego jak pBR322 lub do pochodnej tego wektora, albo do wektorów lambda gtlO i gtll (Huynch i inni, DNA Clonmg, 1985, tom 1: A Practical Approach, Oxford, IRC Press) upakowy wanych odpowiednio
168 925 w wiriony i powstałą zrekombinowaną cząsteczkę DNA wykorzystuje się do transformowania E. coli, a zatem utworzenia pożądanej biblioteki, DNA.
Bibliotekę przeszukuje się stosując znaną strategię przeszukiwania. Jeśli biblioteka jest biblioteką ekspresyjną, można ją przeszukiwać stosując metodę immunologiczną z antysurowicami otrzymanymi z tego samego źródła osocza z którego pochodził RNA, a także antysurowicami pochodzącymi ze źródeł dodatkowych od ludzi, którzy, jak się przypuszcza, posiadają przeciwciała skierowane przeciwko PT-NANBH. Ponieważ ludzkie antysurowice zazwyczaj zawierają przeciwciała skierowane przeciwko E. coli, które mogą dawać wysokie tło podczas przeszukiwania, korzystnie wcześniej traktuje się te antysurowice lizatem niestransformowanej E. coli w celu usunięcia wszystkich takich przeciwciał. Korzystnie prowadzi się kontrolę negatywną stosując antysurowice z odpowiednich ludzkich dawców, to znaczy takich, których testowano wielokrotnie i nie znaleziono w nich przeciwciał przeciwko wirusowi. W alternatywnej strategii przeszukiwania wykorzystuje się jeden lub większą liczbę znakowanych oligonukleotydów. Jako sondy hybrydyzacyjne zastosowanie oligonukleotydów w poszukiwaniu biblioteki cDNA jest ogólnie prostsze i bardziej wiarygodne niż przeszukiwanie za pomocą antysurowic. Oligonukleotydy te syntetyzuje się, korzystnie stosując ujawnione w niniejszym opisie informacje o sekwencji DNA. W celu charakteryzacji i identyfikacji dodatnich klonów przeprowadza się jedną lub większą liczbę dodatkowych rund przeszukiwania tym samym lub innym sposobem.
Posiadając zidentyfikowany pierwszy dodatni klon, bibliotekę ponownie przeszukuje się pod kątem dodatkowych dodatnich klonów, stosując pierwszy klon jako sondę hybrydyzacyjną. Alternatywnie, lub dodatkowo, przygotowuje się następne biblioteki i przeszukuje się je stosując testy immunologiczne lub sondy hybrydyzacyjne. W ten sposób otrzymuje się dalsze sekwencje DNA.
Alternatywnie, syntetyzuje się sekwencję DNA kodującą polipeptyd wirusowy PT-NANBH. W pewnych okolicznościach synteza jest korzystniejsza od klonowania DNA (Gait, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, 1984 Oxford, IRL Press).
Sklonowaną lub zsyntezowaną pożądaną sekwencję DNA wstawia się do wektora ekspresyjnego stosując znane i standardowe techniki. Wektor ekspresyjny trawi się zwykle przy użyciu enzymów restrykcyjnych i sekwencję DNA wstawia się stosując ligację tępych lub lepkich końców. Cięcia dokonuje się zazwyczaj w miejscu restrykcyjnym w dogodnej pozycji wektora ekspresyjnego tak, że po wbudowaniu sekwencja DNA pozostaje pod kontrolą fragmentów funkcjonalnych DNA, co uniemożliwia ekspresję.
Transformację komórki gospodarza prowadzi się przy zastosowaniu znanych sposobów. Zazwyczaj do rozróżnienia pomiędzy transformantami które z powodzeniem pobrały, a tymi które nie pobrały wektora ekspresyjnego, wykorzystuje się pewne markery fonotypowe. Stransformowane komórki gospodarza hoduje się znanymi sposobami i izoluje się polipeptyd wirusowy PT-NANBH przy zastosowaniu znanych technik.
Tak wytworzony polipeptyd stosuje się do wytwarzania przeciwciała specyficznego wobec polipeptydu wirusowego PT-NANBH. Wytwarza się przeciwciało poliklonalne lub monoklonalne. Przeciwciała takie stosuje się w kontroli jakości do testowania serii polipeptydu wirusowego PT-NANBH; do oczyszczania polipeptydu wirusowego PT-NANBH lub lizatu wirusowego; do mapowania epitopów; po wyznakowaniu, jako koniugat w oznaczaniu typu współzawodniczego, do wykrywania przeciwciał i do oznaczenia i wykrywania antygenów.
Przeciwciało poligonalne skierowane przeciwko polipeptydowi wirusowemu PT-NANBH otrzymuje się przez iniekcję polipeptydu wirusowego PT-NANBH, dowolnie sprzężonego z nośnikiem w celu pobudzania odpowiedzi immunologicznej, gospodarzowi będącemu ssakiem, takim jak mysz, szczur, owca lub królik. Tak wytworzone przeciwciało odzyskuje się. Polipeptyd wirusowy PT-NANBH podaje się na ogół w postaci odpowiedniej do iniekcji, w której polipeptyd jest zmieszany z fizjologicznie dopuszczalnym rozcieńczalnikiem. Do postaci tej można włączyć adiuwanty, takie jak kompletny adiuwant Freunda (FCA) lub niekompletny adiuwant Freunda (FIA). Tę postać wstrzykuje się zwykle gospodarzowi w ciągu odpowiedniego okresu czasu, w odpowiednich odstępach czasu pobiera się próbki osocza do oznaczania przeciwciała anty-wirus PT-NANBH. Po wykryciu odpowiedniego poziomu aktywności,
168 925 pobiera się krew od gospodarza. Następnie, stosując standardowe techniki, np. chromatografię na białku A lub chromatografię jonowymienną, przeciwciało ekstrahuje się i oczyszcza z osocza krwi.
Przeciwciało mozoklonalno skierowane przeciwko polipeptydowi wirusowemu PT-NANBH można otrzymać na drodze fuzji komórek nieśmiertelnej linii komórkowej z komórkami wytwarzającymi przeciwciało skierowane przeciwko polipeptydowi wirusowemu. Następnie hoduje się otrzymaną na skutek fuzji nieśmiertelną linię komórkową. Zazwyczaj polipeptydem wirusowym inokuluje się gospodarza będącego ssakiem innym od człowieka, takiego jak mysz lub szczur. Po upływie odpowiedniego czasu potrzebnego do wytworzenia u gospodarza przeciwciał, usuwa się komórki wytwarzające przeciwciała, takie jak splezocyty. Komórki nieśmiertelnej linii komórkowej, takiej jak linii komórkowej szpiczaka myszy lub szczura, poddaje się fuzji z komórkami wytwarzającymi przeciwciała, i produkty fuzji testuje się w celu identyfikacji linii komórkowej, takiej jak hybrydoma, która wydziela pożądane przeciwciało mozoklozalne. Powstałą w wyniku fuzji linię komórkową hoduje się, a przeciwciało monoklozalne oczyszcza się z podłoża hodowlanego w sposób podobny do oczyszczania przeciwciała poligonalnego. Próby diagnostyczne oparte na sposobie wykrywania według wynalazku stosuje się do określania obecności lub nieobecności PT-NANBH. Stosuje się je również do monitowania leczenia takich infekcji, przykładowo w terapii interferonowej.
W próbie stosowanej w celu diagnozowania infekcji wirusowej stosuje się trzy zasadniczo różne sposoby obejmujące wykrywanie wirusowego kwasu nukleinowego. Wykrywanie antygenu wirusowego lub przeciwciał skierowanych przeciwko wirusowi. Wirusowy kwas nukleinowy na ogół uważa się za najlepszy wskaźnik obecności samego wirusa, służy on do diagnozowania w przypadku prawdopodobnie zainfekowanego materiału. Wykrywanie kwasu nukleinowego nie jestjodnrkże zazwyczaj tak prostejak wykrywanie antygenów lub przeciwciał, ponieważ poziom kwasu nukleinowego może być bardzo niski. Antygen wirusowy wykorzystuje się jak marker obecności wirusa i jako wskaźnik infekcyjności. W zależności od wirusa, ilość obecnego w próbce antygenu może być bardzo niska i trudna do wykrycia. Wykrywanie przeciwciał jest stosunkowo proste, ponieważ, w rzeczywistości, układ immunologiczny gospodarza wzmacnia odpowiedź na infekcję przez wytwarzanie dużych ilości krążących przeciwciał. Charakter odpowiedzi humora^ej często może być użyteczny klinicznie, na przykład, na niedawną infekcję wskazuje raczej klasa przeciwciał IgM niż IgG, lub odpowiedź na konkretny antygen wirusowy może być związana ze stopniem zniszczenia wirusa. A zatem, dokładne dopasowanie sposobu diagnozowania infekcji wirusowej zależy od konkretnych okoliczności i potrzebnych informacji. W przypadku PT-NANBH, oznaczenie diagnostyczne może wykorzystywać jeden z tych trzech sposobów.
Pierwszy sposób wykrywania wirusowego kwasu nukleinowego polega na tym, ze hybradyzujo się wirusowy RNA obecny w testowanej próbce, lub cDNA syntezowany na matrycy takiego wirusowego RNA, o sekwencji DNA odpowiadającej sekwencji nukleotydowoj o numerach identyfikacyjnych: 3,4,5,18,19,20,21 lub 22, i testuje się powstałe hybrydy kwasów nukleinowych w celu identyfikacji wirusowego kwasu nukleinowego PT-NANBh. Zastosowanie tego sposobu ogranicza się zazwyczaj do testowanej próbki odpowiedniej tkanki, takiej jak pochodząca z biopsji tkanka wątroby, w której prawdopodobna jest obecność wirusowego RNa na wysokim poziomie. Sekwencja DNA odpowiadająca sekwencjom zukleotydowam o numerach identyfikacyjnych: 3, 4, 5, 18, 19, 20, 21 lub 22 może przybierać formę sekwencji oligozukleotadowej lub sekwencji cDNA ewentualnie zawartej w plazmidzie. Testowanie hybryd kwasów nukleinowych przeprowadza się stosując znakowaną sekwencję DNA. W celu dalszej charakteryzacji hybryd, a zatem identyfikacji wirusowego kwasu nukleinowego PT-NANBH, przeprowadza się jedną lub większą liczbę dodatkowych rund testowania tym samym lub innym sposobem. Etapy hybrydyzacji i testowania przeprowadza się zgodnie ze znanymi sposobami.
Z powodu ograniczonego zastosowania tego sposobu w oznaczaniu wirusowego kwasu nukleinowego, korzystna i bardziej dogodna metoda polega na tym, ze syntetyzuje się cDNA na matrycy wirusowego RNA obecnego w testowanej próbce, amplifikuje się wstępnie wyselekcjonowaną sekwencję DNA odpowiadającą sursekwezcji sekwencji zuklootydowych o numerach
168 925 identyfikacyjnych: 3, 4, 5, 18, 19, 20, 21 lub 22 i identyfikuje się wstępnie wyselekcjonowaną sekwencję DNA. Testowaną próbkę stanowi próbka każdej odpowiedniej tkanki lub płynu fizjologicznego, który korzystnie zatęża się pod względem obecnego wirusowego RNA. Przykłady odpowiedniej tkanki obejmują tkankę pochodzącą z biopsji wątroby. Przykłady odpowiednich płynów fizjologicznych obejmują mocz, osocze, krew, surowicę, nasienie, łzy, ślinę lub płyn mózgowo-rdzeniowy. Korzystnie stosuje się surowicę i osocze.
Syntezę cDNA zwykle przeprowadza się na drodze odwrotnej transkrypcji z zastosowaniem starterów losowych, starterów określonych lub starterów oligo-dT. Korzystnie stosuje się starter stanowiący oligonukleotyd o sekwencji nukleotydowej odpowiadającej sekwencji o numerach identyfikacyjnych: 3, 4, 5, 18, 19, 20, 21 lub 22, który przeznaczony jest do wzbogacenia cDNA zawierającego wstępnie wyselekcjonowaną sekwencję.
Amplifikację wstępnie wyselekcjonowanej sekwencji DNA przeprowadza się korzystnie stosując technikę reakcji łańcuchowej polimerazy (PGR) (Saiki i inni, Science, 1985, 230, 1350-4). W technice tej wykorzystuje się parę starterów oligonukleotydowych, z których jeden odpowiada części sekwencji nukleotydowej o numerach identyfikacyjnych: 3, 4, 5, 18, 19, 20, 21, lub 22, a drugi z nich zlokalizowany jest po stronie 3' pierwszego startera i odpowiada części sekwencji komplementarnej. Para starterów określa zawartą miedzy nimi wstępnie wyselekcjonowaną sekwencję DNA. Oligonukleotydy posiadają zazwyczaj długość przynajmniej 15, najkorzystniej 20 do 26 zasad 1, chociaż niewielkie błędy mogą być tolerowane przez zmianę warunków reakcji, koniec 3' oligonukleotydów powinien być dokładnie komplementarny aby startery działały efektywnie. Odległość pomiędzy końcem 3' oligonukleotydów może wynosić od około 100 do około 2000 zasad. Dogodnie, jednego z pary oligonukleotydów stosowanych w tej technice używa się także jako startera do syntezy cDNA. Samą technikę PGR przeprowadza się z cDNA w formie jednoniciowej, stosując enzym, taki jak polimeraza Taq, 1 nadmiar starterów oligonukleotydowych przez 20 - 40 cykli zgodnie z opublikowanymi procedurami (Salki i inni, Science, 1988, 239, 487 - 491).
W celu udoskonalenia sposobu przeprowadza się kilka rund amplifikacji, z których w każdej stosuje się inną parę oligonukleotydów jako startery. A zatem, po pierwszej rundzie amplifikacji, w drugiej rundzie stosuje się wewnętrzną parę oligonukleotydów określających krótszą sekwencję DNA (o długości od 50 do 500 zasad). W tym nieco bardziej pewnym udoskonaleniu zwanym Nested PCR jest ona oczywiście końcową zamplifikowaną sekwencją DNA, która stanowi sekwencję wstępnie wyselekcjonowaną. (Kemp i inni, Proc. Natl. Acad, Sci., 1989, 86(7), 2433-7 i Mullis i inni, Methods in Enzymology, 1987, 155, 335-350).
Wyselekcjonowaną uprzednio sekwencję DNA identyfikuje się przez analizę produktów PCR na żelu agarozowym. Obecność prążka o masie cząsteczkowej obliczonej dla wyselekcjonowanej uprzednio sekwencji stanowi dodatni wskaźnik obecności wirusowego kwasu nukleinowego w testowanej próbce. Alternatywne sposoby identyfikacji obejmują metody oparte na blottingu Southerna, dot-blottingu, trawieniu restrykcyjnym oligomerów i sekwencjonowaniu DNA.
Niniejszy opis ujawnia także zestaw testujący do wykrywania wirusowego kwasu nukleinowego PT-NANBH, który zawiera:
I) parę starterów oligonukleotydowych, z których jeden odpowiada części sekwencji nukleotydowej o numerach identyfikacyjnych: 3, 4, 5, 18, 20, 21 lub 22, a drugi z nich zlokalizowany jest po stronie 3' pierwszego startera i odpowiada części sekwencji komplementarnej. Para starterów określa zawartą miedzy nimi wstępnie wyselekcjonowaną sekwencję DNA;
II) odwrotną transkryptazę do syntezy cDNA na matrycy RNA testowanej próbki na odcinku od startera odpowiadającego sekwencji nukleotydowej komplementarnej do sekwencji o numerach identyfikacyjnych: 3, 4, 5, 18, 19, 20, 21 lub 22;
III) enzym zdolny do amplifikacji wstępnie wyselekcjonowanej sekwencji DNA i ewentualnie;
IV) roztwory do przemywania i bufory reakcyjne.
Zestaw testujący może także zawierać dodatnią próbkę kontrolną ułatwiającą identyfikację wirusowego kwasu nukleinowego.
168 925
Charakterystyki starterów i enzymów są korzystnie takie jak opisano powyżej w związku z techniką PCR.
Sposób wykrywania antygenu wirusowego PT-NANBH i przeciwciała przeciwko antygenowi wirusowemu PT-NANBH według wynalazku polega na tym, że kontaktuje się testowaną próbkę z polipeptydem wirusowym PT-NANBH o sekwencji aminokwasowej homologicznej przynajmniej w 90% z sekwencją aminokwasową podaną w sekwencjach o numerach identyfikacyjnych: 3, 4, 5, 18, 19, 20, 21 lub 22 przedstawionych odpowiednio na fig. 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 lub jej fragmentem antygenowym, lub z poliklonalnym albo z monoklonalnym przeciwciałem przeciwko takiemu polipeptydowi wirusowemu i ustala się czy w testowanej próbie występuje jakiekolwiek wiązanie antygen-przeciwciało. Testowaną próbkę do wykrywania wirusowego kwasu nukleinowego pobiera się z każdej ze wspomnianych powyżej odpowiednich tkanek oraz z płynów fizjologicznych. Jeśli otrzymuje się płyn fizjologiczny ewentualnie zatęża się go pod kątem obecnego antygenu wirusowego lub przeciwciała skierowanego przeciwko wirusowi.
W sposobie według wynalazku korzystnie testowaną próbkę kontaktuje się z sekwencją aminokwasową homologiczną przynajmniej w 90% z sekwencją aminokwasową podaną w sekwencjach o numerach identyfikacyjnych 3,4 lub 5, przedstawionych odpowiednio na fig. 4, 5, 6 lub jej fragment antygenowy. W sposobie wykrywania antygenu wirusowego PT-NANBH korzystnie stosuje się także sekwencję aminokwasową homologiczną z sekwencją aminokwasową podaną w sekwencjach o numerach identyfikacyjnych 3 lub 4, przedstawionych odpowiednio na fig. 4, 5, lub jej fragment antygenowy, lub także taką sekwencję aminokwasową, która jest homologiczna przynajmniej w 90% z sekwencją aminokwasową podaną w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 5, przedstawionej na fig. 6, lub jej fragment antygenowy. Jeszcze bardziej korzystnie stosuje się sekwencję aminokwasową, homologiczną przynajmniej w 95% z sekwencją aminokwasową podaną w sekwencjach o numerach identyfikacyjnych 3,4, 5, 18, 19, 20, 21 lub 22 przedstawionych odpowiednio na fig, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 lub jej fragment antygenowy, lub też sekwencję aminokwasową homologiczną przynajmniej w 98% z sekwencją aminokwasową podaną w sekwencjach o numerach identyfikacyjnych 3,4, 5,18, 19, 20, 21 lub 22 przedstawionych odpowiednio na fig. 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 lub jej fragment antygenowy.
Ponadto przedmiotem wynalazku jest także sposób wykrywania przeciwciała przeciwko antygenowi wirusowemu PT-NANBH, polegający na tym, że kontaktuje się testowaną próbkę z jednym lub większą ilością wirusowych polipeptydów PT-NANBH, które to polipeptydy zawierają dwa lub większą ilość wirusowych antygenów PT-NANBH występujących w kombinacji albo połączonych przez fuzję i stanowiących pojedynczy polipeptyd, przy czym co najmniej jeden z tych antygenów pochodzi ze strukturalnego regionu kodującego wirusa i co najmniej jeden inny z tych antygenów pochodzi z mestrukturalnego regionu kodującego wirusa i ustala się, czy w materiale testowanej próbki występuje jakiekolwiek wiązanie antygen-przeciwciało. Korzystnie stosowany w sposobie według wynalazku antygen kodowany przez strukturalny region kodujący, posiada sekwencję aminokwasową homologiczną przynajmniej w 90% z sekwencją aminokwasową podaną w sekwencji aminokwasowej o numerze identyfikacyjnym 5 przedstawionej na fig. 6 lub jej fragment antygenowy, i antygen kodowany przez niestrukturalny region kodujący, który to antygen posiada sekwencję aminokwasową homologiczną przynajmniej w 90% z sekwencją aminokwasową podaną w sekwencjach o numerach identyfikacyjnych 3 lub 4, przedstawionych odpowiednio na fig. 4, 5 lub jej fragment antygenowy.
Do tak przedstawionego sposobu wykrywania antygenu wirusowego dostosowane są różnorodne techniki i sposoby jego oznaczania.
Polipeptyd wirusowy można zastosować do specyficznego wychwytywania przeciwciała skierowanego przeciwko PT-NANBH z roztworu, do specyficznego znakowania przeciwciała już wychwyconego lub do zarówno wychwytywania, jak i znakowania przeciwciała. Ponadto, polipeptyd wirusowy można zastosować w różnych homogennych sposobach oznaczania, w których wykrywa się przeciwciała reaktywne wobec antygenu w roztworze, bez rozdziału faz.
Typy oznaczeń, w których do wychwytywania przeciwciała z roztworu stosuje się polipeptyd wirusowy PT-NANBH, obejmują immobilizację polipeptydu na stałej powierzchni. Powinno być możliwe przemywanie powierzchni w jakikolwiek sposób. Przykłady odpowied10
168 925 nich powierzchni obejmują polimery różnych typów (odlewanych w kształcie studzienek do mikromiareczkowania; perełek; różne typy prętów; końcówki aspiratora; elektrody i przyrządy optyczne), cząstki (na przykład lateks; stabilizowane krwinki czerwone; komórki bakteryjne lub grzybowe; zarodniki; złoto lub inne zole metaliczne lub zawierające metal i koloidy białkowe) o wielkości cząstek od 0,02 do 5 mikrometrów; membrany (np. nitrocelulozowe; papier; octan celulozy i membrany o dużej porowatości/dużej powierzchni z materiału organicznego lub nieorganicznego).
Wiązanie polipeptydu wirusowego PT-NANBH z powierzchnią może następować w wyniku biernej adsorpcji z roztworu o optymalnym składzie, który zawiera środki powierzchniowo czynne, rozpuszczalniki, sole i/lub czynniki chaotropowe, lub może następować na drodze aktywnego wiązania chemicznego. Aktywne wiązanie może zachodzić poprzez różnorodne reaktywne lub mogące ulegać aktywacji grupy funkcjonalne, które eksponowane są na powierzchni (na przykład czynniki kondensujące; aktywne estry kwasowe, halogenki i bezwodniki; grupy aminowe, hydroksylowe lub karboksylowe; grupy sulfhydrylowe; grupy karbonylowe; grupy diazowe lub nienasycone). Ewentualnie aktywne wiązanie może zachodzić poprzez białko (związane z powierzchnią biernie lub przez aktywne wiązanie), takie jak albumina lub kazeina, z którym chemicznie związuje się polipeptyd wirusowy przy zastosowaniu różnych metod. Ten sposób zastosowania białka może stanowić zaletę z powodu punktu izoelektrycznego, ładunku, hydrofilowości lub innych właściwości fizykochemicznych. Polipeptyd wirusowy można także związać z powierzchnią (zazwyczaj, choć niekoniecznie, membraną) po elektroforetycznym rozdziale mieszaniny reakcyjnej, takim jak immunoprecypitacja.
Po zetknięciu (reakcji) powierzchni niosącej polipeptyd wirusowy PT-NANBH z testowaną próbką, pozostawieniu czasu na przereagowanie i, jeśli jest to konieczne po usunięciu nadmiaru próbki jednym z wielu sposobów (takich jak przemywanie, wirowanie, sączenie, działanie magnetyczne lub kapilarne), wychwycone przeciwciało wykrywa się różnymi sposobami, takimi które zapewniają wykrywalny sygnał. Można to osiągnąć, na przykład, przez zastosowanie znakowanej cząsteczki lub cząstki, jak to opisano powyżej, która reaguje z wychwyconym przeciwciałem (na przykład białko A, białko G i podobne; przeciwciała skierowane przeciwko immunoglobulinom określonych gatunków lub podklasom immunoglobulin; czynnik reumatoidalny lub przeciwciało skierowane przeciwko antygenowi, zastosowano w sposób współzawodniczy lub blokujący, lub każdej cząsteczki zawierającej epitop zawarty w polipeptydzie.
Wykrywalny sygnał może być sygnałem optycznym, radioaktywnym lub fizykochemicznym, i uzyskuje się go bezpośrednio przez znakowanie cząsteczki lub cząstki na przykład barwnikiem, znacznikiem radioaktywnym, aktywnym elektrycznie lub wykazującym rezonans magnetyczny lub fluoroforem, lub pośrednio, przez znakowanie cząsteczki lub cząstki enzymem zdolnym do wywołania mierzalnej zmiany jakiegokolwiek rodzaju. Alternatywnie, jeśli powierzchnia ma postać cząstek, wykrywalny sygnał można uzyskać stosując, na przykład, aglutynację, lub poprzez dyfrakcję lub efekt podwójnego załamania.
Oznaczenia, w których do znakowania przeciwciała już wychwyconego stosuje się sam polipeptyd wirusowy, wymagają pewnych form znakowania antygenu, które umożliwiać będą jego wykrycie. Znakowanie można przeprowadzać bezpośrednio przez chemiczne lub bierne wiązanie, na przykład, znacznika radioaktywnego, znacznika rezonansu magnetycznego, znacznika cząstkowego lub enzymatycznego z polipeptydem, lub pośrednio, przez wiązanie jakiejkolwiek postaci znacznika z cząsteczką, która sama będzie reagować z polipeptydem. Znacznik z polipeptydem wirusowym PT-NANBH można wiązać bezpośrednio, przez grupę już obecną w polipeptydzie, taką jak grupa aminowa, lub przez grupę pośredniczącą, taką jak grupa maleimidowa. Przeciwciało może być wychwytywane przez każdy reagent na każdej ze wspomnianych już powierzchni dzięki biernej lub aktywnej adsorpcji której wynikiem będzie związanie przeciwciała lub kompleksów immunologicznych. W szczególności, przeciwciała mogą być wychwytywane przez przeciwciała skierowane przeciwko immunoglobulinom określonych gatunków lub podklasom immunoglobulin; czynnik reumatoidalny, białka A i C i podobne, lub przez każdą cząsteczkę zawierającą epitop zawarty w polipeptydzie.
168 925
Znakowany polipeptyd wirusowy PT-NANBH stosuje się we współzawodniczym sposobie wiązania, w którym jego wiązanie z każdą specyficzną cząsteczką na każdej z powierzchni podanych przykładowo powyżej blokuje antygen zawarty w próbce. Alternatywnie, polipeptyd można stosować w sposób, w którym antygen w próbce wiąże się specyficznie lub niespecyficznie z każdą z powierzchni podanych powyżej i wiąże się także ze specyficzną cząsteczką dwulub wielowartościową (np. przeciwciałem) o pozostałych wartościowościach walencyjnych, które wychwytują znakowany polipeptyd.
Często w homogoznych sposobach oznaczania oddzielnie znakuje się polipeptyd wirusowy PT-NANBH i przeciwciało tak, że kiedy przeciwciało reaguje z polipeptydem wirusowym w wolnym roztworze, dwa znaczniki oddziaływują ze sobą, co umożliwia na przykład bezpromiezisty transfer energii z jednego znacznika do drugiego, i stwarza możliwość detekcji wzbudzonego drugiego znacznika lub wygaszonego pierwszego (np. przez fluorymetrię, rezonans magnetyczny lub pomiar enzymatyczny). Wynikiem dodania w próbce polipeptydu wirusowego bądź przeciwciała jest ograniczenie oddziaływań pary znaczników, a zatem inny poziom sygnału w detektorze.
Odpowiednim oznaczeniem do wykrywania przeciwciała skierowanego przeciwko PT-NANBH jest bezpośrednie oznaczenie immunoenzymatyczno typu sazdwich (EIA). Aolipoptydem wirusowym PT-NANBH opłaszcza się studzienki do mikromiareczkowania. Jednocześnie dodaje się testowaną próbkę oraz polipeptyd wirusowy PT-NANBH sprzężony z enzymem. Przeciwciała skierowane przeciwko PT-NANBH obecne w testowanej próbce wiążą się zarówno z polipeptydem wirusowym opłaszczającym studzienkę, jak i z polipeptydem wirusowym sprzężonym z enzymem. Zazwyczaj po obu stronach sandwicha stosuje się ten sam polipeptyd wirusowy. Po przepłukaniu, związany enzym wykrywa się stosując specyficzny substrat zmieniający barwę po przejściu w produkt. Zestaw testujący do stosowania w oznaczeniu EIA zawiera:
(1) polipeptyd wirusowy PT-NANBH znakowany enzymem;
(2) substrat enzymu;
(3) rroeek dotrerkaająay pnwlekccnni na ^ο^ immobilizuie się polieeptyd wiruspwy PT-NANBH; i (4) ewentualnie roztwory do przemywania i/lub bufory.
Opis figur rysunku:
Fig. 1 przedstawia wytwarzanie plazmidu pDX122 opisanego w przykładzie VII.
Fig. 2 przedstawia wytwarzanie dwóch alternatywnie sfuzjowanach sekwencji opisanych w przykładzie XVII.
Fig. 3 przedstawia mapy restrykcyjne sokwencji o numerach identyfikacyjnych 21 i 22.
Fig. 4 przedstawia sekwencję o numerze identyfikacyjnym 3.
Fig. 5 przedstawia sekwencję o numerze identyfikacyjnym 4.
Fig. 6 przedstawia sekwencję o zumorzo identyfikacyjnym 5.
Fig. 7 przedstawia sekwencję o numerze identyfikacyjnym 18.
Fig. 8 przedstawia sekwencję o numerze identyfikacyjnym 19.
Fig. 9 przedstawia sekwencję o numerze identyfikacyjnym 20.
Fig. 10 przedstawia sekwencję o numerze identyfikacyjnym 21.
Fig. 11 przedstawia sekwencję o numerze identyfikacyjnym 22.
Fig. 12 przedstawia sekwencję o numerze identyfikacyjnym 24.
Fig. 13 przedstawia sekwencję o numerze identyfikacyjnym 25.
Następujące przykłady podano w celu zilustrowania ziniejszogo wynalazku.
Przykład I Synteza cDNA
Połączone osocza (160 ml) pochodzące od dwóch osobników (określonych jako A - L), o których wiadomo było, że zostali zarażeni NANBH przez transfuzję rozcieńczono (1:2,5) solą fizjologiczną zbuforowaną fosforanem (PBS), a następnie wirowano przy 190 000g (np. 30 000 rpm w roztworze MSE 8x50) przez 5 godzin w temperaturze 4°C. Supernatant zachowano jako źródło specyficznych przeciwciał do późniejszego przeszukiwania bibliotek cDNA. Osad ponownie zawieszono w 2 ml buforu o składzie: 20 mM Tris-HCl, 2 MM EDTA, 3% SDS, 0,2 M NaCl (2xPK), ekstrahowano trzykrotnie równą objętością fenolu, trzykrotnie chloroformem i
168 925 raz eterem, a następnie 2,5 objętościami etanolu w temperaturze -20°C. Osad ponownie zawieszano w 10 gl buforu o składzie: 10 mM Tris-HCl, i mM EDTA o pH 8,0 (TE).
Kwas nukleinowy zastosowano jako matrycę w zestawie do syntezy cDNA (Amersham International plc, Amersham, Wielka Brytania), a jako startery zarówno oligo-dT jak i losowo wybrane heksanukleotydy. Warunki reakcji zastosowano zgodnie z zaleceniami dostawcy zestawu. Szczegółowo, do reakcji syntezy pierwszej nici zastosowano 1 gl kwasu nukleinowego, którą wyznakowano [α-32ρ] dCTP (Amersham; aktywność właściwa 3000 Ci/mmol) w objętości końcowej 20gl i inkubowano w temperaturze 42°C przez 1 godzinę. Całą mieszaninę reakcyjną po syntezie pierwszej nici zastosowano następnie w reakcji syntezy drugiej nici. Mieszanina reakcyjna zawierająca RNazę H E. coli (0,8 U) i polimerazę DNA I w objętości końcowej 100 gl inkubowano w przez 60 minut temperaturze 12°C, a następnie przez 60 minut w temperaturze 22°C. Całą mieszaninę reakcyjną inkubowano następnie przez 10 minut w temperaturze 70°C, umieszczono na lodzie, dodano 1 U polimerazy DNA faga T4 i następnie inkubowano przez 10 minut w temperaturze 37°C. Reakcję zatrzymano przez dodanie 5μΐ 0,2 M EDTA o pH 8.
Niewbudowane nukleotydy usunięto z mieszaniny reakcyjnej na kolumnie NICK (Pharmacia Ltd, Milton Keynes, Wielka Brytania). Następnie DNA ekstrahowano dwukrotnie fenolem, trzykrotnie chloroformem i raz eterem, a następnie, przed wytrąceniem 2,5 objętościami 100% etanolu, dodano 20 μg dekstranu.
Przykład II. Wytwarzanie bibliotek ekspresyjnych
Wysuszony osad cDNA ponownie zawieszono w 5 μl jałowego TE i następnie inkubowano przez 3 godziny w temperaturze 15°C z 500 ng łączników EcoRI (Pharmacia; GGAATTCC ufosforylowany) i 0,5 U ligazy DNA faga T4 (New England BioLabs, Beverley, MA, USA) w roztworze o objętości końcowej 10 gl zawierającym 20 mM Tris-HCL pH 7,5, 10 mM MgCh, 10 mM DTT, 1 mM ATP. Ligazę zinaktywowano przez ogrzewanie w temperaturze 65°C przez 10 minut i cDNA trawiono przez 1 godzinę w temperaturze 37°C 180 U restryktazy EcoRI (BCL, Lewes, Wielka Brytania) w końcowej objętości 100 gl. Dodano EDTA do stężenia końcowego 10 mM i całą mieszaninę reakcyjną nałożono na kolumnę z AcA34 (LKB). Zbierano frakcje (50 gl) i mierzono ich radioaktywność w liczniku scyntylacyjnym. Zebrano pik cDNA w objętości elucyjnej (980 cpm), ekstrahowano dwukrotnie fenolem, trzykrotnie chloroformem i raz eterem, a następnie wytrącono etanolem.
Dwuniciowy cDNA ponownie zawieszono w 5 gl TE i ligowano przez noc w temperaturze 15°C z ramionami EcoRI faga lambda gtii (Gibco, Paisley, Szkocja) w 10μ1 mieszaniny reakcyjnej zawierającej 0,5 U ligazy DNA faga T4, 66 mM Tris-HCl, 10 mM MgCL, 15 mM DTT, pH 7,6. Po inaktywacji ligazy przez ogrzewanie przez 10 minut w temperaturze 65°C, 5 (gl mieszaniny reakcyjnej dodano do zestawu do pakowania do kapsydów Amersham i inkubowano w temperaturze 22°C przez 2 godziny. Miano upakowanego materiału określano na szczepie E. coli Y1090 (Huynh i in., 1985) i stwierdzono 2,6x104 rekombinantów.
Komórki do wysiewania (Y1090) przygotowano przez inokulację 10 ml L-bulionu pojedynczą kolonią z płytki agarowej i wytrząsanie przez noc w temperaturze 37°C. Następnego dnia 0,5 ml nocnej hodowli rozcieńczono 10 ml świeżego L-bulionu i dodano 0,1 ml MgSO4 oraz 0,1 ml 20% (w/v) maltozy. Hodowlę wytrząsano przez 2 godziny w temperaturze 37°C, bakterie zebrano przez wirowanie przy 5 000g przez 10 minut i ponownie zawieszono w 5 ml 10 mM MgS O4 w celu przygotowania zawiesiny podstawowej komórek do wysiewania. Część (1 gl) upakowanego materiału zmieszano z 0,2 ml komórek przygotowanych do wysiewania, inkubowano przez 20 minut w temperaturze 37°C przed dodaniem 3 ml agaru i całą mieszaninę wylano jako wierzchnią warstwę na płytki o średnicy 90 mm z L-agarem. Po całonocnej inkubacji w temperaturze 37°C liczono łysinki na płytkach i określono całkowitą liczbę zrekombinowanych fagów. Pozostały upakowany materiał przechowywano w temperaturze 4°C.
W zasadniczo podobny sposób przygotowano dodatkowe biblioteki.
Przykład III. Przeszukiwanie bibliotek ekspresyjnych
Opisaną w przykładzie II początkową bibliotekę wysiano na szczep Y1090 E. coli w stężeniu około 5x103jednostek łysinkotwórczych na płytkę o średnicy 140 mm i namnażano przez 2 godziny w temperaturze 37°C, dopóki łysinki nie stały się widoczne. Na 3 godziny
168 925 pozostawiono w styczności z płytką jałowe sączki nitrocelulozowe impregnowane IPTG (izopropylotiogalaktozydem), i następnie usunięto je. Sączki najpierw blokowano przez inkubację z roztworem blokującym [3% (w/v) BSA (albumina surowicy bydlęcej)/TBS-Tween (10 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 0,05% (v/v) Tween 20) zawierającym 0,05% bronidoks] (20 ml/sączek), a następnie przeniesiono do buforu do wiązania [1% (w/v) BSA/TBSTween zawierającego 0,05% bronidoks] zawierającego oczyszczone (przez chromatografię jonowymienną) przeciwciała pochodzące z połączonych osoczy osobników A i L (20 gg/ml). Po inkubacji w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, sączki przemyto trzykrotnie TBS-Tween, a następnie inkubowano w buforze do wiązania zawierającym biotynylowane przeciwciała owcy skierowane przeciwko immunoglobulinom ludzkim (1:250). Po jednej godzinie w temperaturze pokojowej sączki trzykrotnie przemyto TBS/Tween, a następnie inkubowano w buforze do wiązania zawierającym kompleks streptawidynOperoksydaza (1:100). Reakcję barwną wywoływano DAB (diaminobenzydyną). Dodatnia reakcja uwidaczniała się w postaci (zabarwionych) łysinek.
Spośród całkowitej liczby 2,6 x 104przetestowanych łysinek, w wyniku pierwszej rundy przeszukiwania otrzymano 8 dodatnich rekombinantów. Stosując sączki jako wzorzec przeniesiono, stosując jałowe pipety pasterowskie, regiony oryginalnych płytek odpowiadające tym dodatnim sygnałom. Czopy agaru zawieszono w 0,1 ml buforu SM i umożliwiono fagom oddyfundowanie. Na szczepie Y1090 E. coli określono miano faga z każdego czopa agarowego. Następnie zawiesinę podstawową fagów każdego czopa agarowego ponownie przetestowano j ak uprzednio, na pojedynczych płytkach o średnicy 90 mm przy stężeniu około 1 x 103jednostek łysinkotwórczych na płytkę. Spośród 8 dodatnich rekombinantów z pierwszej rundy, w drugiej rundzie jeden był wyraźnie dodatni, tj. dodatnich było >1 % łysinek, nazwano je JG2. Odpowiada częstości dodatnich rekombinantów w bibliotece 40/106.
Ten, i inne dodatnie fagi zidentyfikowane w podobny sposób w innych opisanych bibliotekach, oczyszczono przez powtórzone rudy testowania łysinek przy niższej gęstości (1 - 200 jednostek łysinkotwórczych/płytkę o średnicy 90 mm) do momentu aż 100% łysinek nie było dodatnich w testowaniu przeciwciałem pochodzącym z osoczy osobników A i L. Trzema takimi zrekombinowanymi fagami były JG1, JG2 i JG3.
Przykład IV. Powtórne testowanie JG1, JG2 i JG3 z zestawami surowic.
Każdy ze zrekombinowanych fagów, JG1, JG2 i JG3, oczyszczono z łysinek i przechowywano jako zawiesinę podstawową o określonym mianie w buforze SM w temperaturze 4°C. Fagi te mieszano (1:1) z zawiesiną faga określonego w przykładzie III jako ujemny, i mieszaninę stosowano do infekowania szczepu Y1090 E. coli przy stężeniu 1000 jednostek łysinkotwórczych na płytkę. Białka z łysinek przenoszono na sączki i postępowano z nimi jak opisano w przykładzie III, z tym wyjątkiem, że sączki cięto na ćwiartki, a każdą ćwiartkę inkubowano z innym przeciwciałem; były to przeciwciała z połączonych surowic osobników A i L (20 (ig/ml), osocze A (1:500), osocze L (1:500) i IgG pacjenta H (20 gg/ml). Oczekiwano, że pacjent H okaże się dodatnim pod względem obecności przeciwciał skierowanych przeciwko PT-NANBH, ponieważ był on chorym na hemofilię otrzymującym czynnik VIII nie poddawany obróbce cieplnej. Po zakończeniu reakcji każdy sączek oceniano jako dodatni (kiedy wyraźnie występowały dwie klasy sygnałów) lub ujemny (kiedy wszystkie łysinki dawały ten sam sygnał). Mogła to być ocena subiektywna, i dlatego porównywano oceny, i tylko te sączki uznawano za dodatnie, gdzie zachodziła największa zgodność. Wyniki przedstawiono w tabeli 1.
Tabela 1
A i L A L H
JG1 + + -
JG2 + + + +
JG3 + + + +
JG1, jak się okazało, reagował tylko z przeciwciałami pacjenta A, ale nie reagował z przeciwciałami pacjenta L czy H; nie takiego wyniku możnaby oczekiwać w przypadku
168 925 prawdziwego, związanego z PT-NANBH, polipeptydu otrzymanego metodami rekombinacyjnymi, a zatem JG1 wyeliminowano z analizy. Zarówno JG2, jak i JG3 dały jednakże wyraźne dodatnie reakcje z trzema surowicami skierowanymi przeciwko PT-NANBH; te rekombinanty analizowano dalej.
Opisany powyżej typ analizy powtórnie zastosowano dla JG2 i JG3, z tym wyjątkiem, że sączki pocięto na mniejsze części, które inkubowano z zestawami surowic dodatnich i ujemnych. Zestawy dodatnich surowic obejmowały zestaw 10 surowic chorych na hemofilię i zestaw 9 surowic osób uzależnionych, stosujących narkotyki dożylnie. Dawcy ci stanowią najlepsze źródła surowic dodatnich nawet pomimo tego, że proporcja surowic dodatnich była nieznana. Zestaw surowic ujemnych otrzymano dawców pewnych, którzy byli przez wiele lat dokładnie badani przez North London Blood Transfusion Centre, Deansbrook Road, Edgware, Middlesex, Wielka Brytania i nigdy nie wykazywali żadnych oznak infekcji różnymi czynnikami włącznie z PT-NANBH. Wyniki te przedstawiono w tabelach 2 i 3.
Tabela 2
Nr identyfikacyjny JG2 JG3
Narkomani V19146 4/4 0/5
V27083 2/4 0/5
V29779 0/4 0/5
V12561 0/5 4/5
VI5444 2/4 5/5
VI8342 4/4 0/5
V8403 2/4 0/5
V20001 4/4 0/5
V21213 2/4 0/5
Chorzy na hemofilię M1582 4/4 4/5
M1581 5/5 5/5
M1575 2/5 0/5
Ml 579 5/5 5/5
M1585 2/5 0/5
Ml 576 1/5 1/5
M158O 1/5 0/5
Ml 578 1/5 0/5
M1587 1/5 2/5
Ml 577 2/5 1/5
Dodatnie reakcje zaznaczono przez podkreślenia.
Tabela 3
Narkomani Chorzy na hemofilę Dawcy ujemni
JG2 6/9 (66%) 5/10 (50%) 0/10 (0%)
JG3 2/9 (22%) 4/10 (40%) 0/10 (0%)
JG2 + JG3 1/9(11%) 3/10 (30%) 0/10 (0%)
JG2 lub JG3 7/9 (77%) 6/10 (60%) 0/10 (0%)
Dane zgodne są z hipotezą, że oba rekombinanty eksprymują polipeptydy związane z czynnikiem odpowiedzialnym za PT-NANBH, i że polipeptydy te nie są identyczne, lecz mogą posiadać takie same pewne miejsca antygenowe.
Przykład V. Mapowanie restrykcyjne i sekwencjonowanie DNA JD2 i JG3
Część (10 μΐ) zawiesiny podstawowej fagów zarówno JG2, jak i JG3 utrzymywano w temperaturze wrzenia w celu denaturacji fagów i ekspozycji DNA. DNA ten zastosowano
168 925 następnie jako matrycę w amplifikacji PCR z zastosowaniem polimerazy Taq. Każda mieszanina reakcyjna zawierała w objętości końcowej 50 μl co następuje: 10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 0,1% żelatynę, pH 8,3 w temperaturze 25°C oraz startery ollgonukleotydowe dl9 i d20 (sekwencje o numerach identyfikacyjnych, odpowiednio, 1 i 2; 200 ng każdego); startery te zlokalizowane są w sekwencji faga lambda flankującej miejsce Eco RI do klonowania, i dlatego mogą służyć jako startery amplifikacji każdej sekwencji sklonowanej w tym miejscu.
Część mieszaniny reakcyjnej analizowano na 1,0% żelu agarozowym i porównano z markerami. Dzięki amplifikacji JG2 otrzymano fragment o długości około 2 Kb; JG3 fragment o długości około 1 Kb. Pozostałość mieszaniny reakcyjnej ekstrahowano fenolem/chloroformem w obecności 10 mM EDTA i 1% SDS, i DNA odzyskano przez wytrącanie etanolem. Zamplifikowany materiał trawiono następnie przez 60 minut 20 U restryktazy EcoRI w temperaturze 37°C i rozdzielono na 1% żelu agarozowym LGT w TAE. Fragmenty o zmniejszonej zgodnie z oczekiwaniami wielkości wyeluowano i oczyszczono stosując Elutips (S&S). Wstawki JG2 i JG3 zligowano z plazmidem pUC 13 strawionym restryktazą EcoRI i transformowano nimi szczep TG1 E. coli. Rekombinanty identyfikowano jako kolonie o barwie białej na płytkach X-gal/L-amp (płytki z L-agarem wzbogaconym o 100 gg/ml ampicyliny, 0,5 mg/ml X-gal) i sprawdzono przez preparatykę plazmidu na małą skalę i trawienie enzymem restrykcyjnym EcoRI w celu określenia wielkości wstawki DNA. Zrekombinowany plazmid zawierający wstawkę JG2 nazwano DM415, a plazmid zawierający wstawkę JG3 nazwano DM416.
Sekwencję wstawki JG2 określono przez bezpośrednie sekwencjonowanie dwuniciowego plazmidu DNA i sokwoncjonowanio w wektorach do sekwencjonowania opartych na fagu M13, takich jak mpl8 i mpl9, po którym następowało sekwencjonowanie jednoniciowo. Sekwencję wstawki JG3 określono w podobny sposób. Otrzymane sekwencje DNA i wywnioskowane sekwencje aminokwasowe przedstawiono na sekwencjach o numerach identyfikacyjnych 3 i 4.
Przykład VI. Ekspresja polipeptydu PT-NANBH w E. coli.
Plazmid pDM415 (5 gg) strawiono restryktazą EcoRI (20 U) w objętości końcowej 20 gl. Wstawkę o długości 1 Kb odzyskano przez wyeluowanie z 1% żelu agarozowego LGT. Następnie wypełniono powstałe lepkie końce EcoRI stosując fragment Klenowa i mieszaninę dNTP. DNA odzyskano przez wytrącenie etanolem po ekstrakcji mieszaniną fenol/chloroform. Fragment o tępych końcach zligowano z trawionym restryktazą Smal i zdefosforylowanym plazmidem pDEV107 (wektorem, który umożliwia klonowanie w końcu 3' genu lac Z). Następnie transformowano komórki E. coli TG1. Nastąpił 30-krotny wzrost koloni w porównaniu z kontrolą, w której zastosowano sam wektor. Transformanty zawierające pożądany zrekombinowany plazmid zidentyfikowano przez hybrydyzację z radioaktywną sondą wytworzoną przez amplifikację PCR rekombinanta JG3. W celu określenia orientacji wstawki, dwadzieścia kolonii zanalizowano przez trawienie enzymem restrykcyjnym (Sali) plazmidu przygotowanego przez preparatykę na małą skalę. W jednej czwartej rekombinantów wstawka znajdowała się w orientacji właściwej do ekspresji sekwencji PT-NANBH w postaci białka fuzyjnego z β-galaktozydazą. Do dalszej analizy wzięto jeden z tych rekombinantów.
Kolonię pDXl 13 zastosowano do inokulacji 50 ml L-bulionu, namnażano wytrząsając w temperaturze 37°C do osiągnięcia średniej fazy wzrostu logarytmicznego i indukowano ekspresję przez dodanie 20 mM IPTG. Po trzech godzinach komórki zebrano przez wirowanie przy 5 000g przez 20 minut, ponownie zawieszono w 50 ml PBS i odwirowano. Osadzone komórki ponownie zawieszono w 5ml buforu (25 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA. 1 mg/ml lizozymu, 0,2% (v/v) Nonidet -P40, pH 8,0) na gram osadu i inkubowano w temperaturze 0°C przez 2 godziny. Uwolniony bakteryjny DNA strawiono przez dodanie DNazy I i MgSO4 do stężeń końcowych, odpowiednio, 40 gg/ml i 2 mM w celu redukcji lepkości.
Ten nieoczyszczony lizat analizowano przez elektroforezę na żelu poliakrylamidowym (PAGE) i białka wybarwiono błękitem Coomasiego. W bakteriach zawierających pDX113 indukcji uległo białko o masie cząsteczkowej około 150 kDa o masie cząsteczkowej. Oszacowano, że białko to stanowi 10-15% całkowitej ilości białka. Białka z podobnych żeli przeniesiono na membranę PVFDF (GRI, Dunmow, ESSex, Wielka Brytania) i memmbranę inkubowano z surowicami dodatnimi i ujemnymi pod względem PT-NANBH); białko o masie cząsteczkowej około 150 kDA reagowało z surowicami A i L, ale nie reagowało z normalną surowicą ludzką.
168 925
Ścieżki zawierające lizaty E. coli eksprymującej β-galaktozydazę nie reagowały z surowicami A i L oraz normalną surowicą ludzką.
Do nieoczyszczonego lizatu dodano mocznika do stężenia końcowego 6M i nierozpuszczalny materiał usunięto przez wirowanie. Ekstrakt w 6M mocznika zastosowano bezpośrednio do opłaszczania przez 1 godzinę w temperaturze 37°C studzienek do mikromiareczkowania. Studzienki trzykrotnie przemyto dwukrotnie destylowaną wodą i następnie blokowano w temperaturze 37°C przez dodanie na 20 minut 0,25 ml 0,2% BSA zawierającej 0,02% NaN3 na studzienkę. Następnie zawartość studzienek odessano. Płytki kontrolne, opłaszczone nieoczyszczonym lizatem szczepu E. coli wytwarzającego β-galaktozydazę (pXY461) przygotowano w ten sam sposób. Płytki te użyto do oznaczeń ELISA opisanych w przykładzie X.
Przykład VII. Ekspresja polipeptydu PT-NANBH w komórkach owadów.
Wstawkę PT-NANBH z JG3, wyizolowaną jak opisano w przykładzie V, sklonowano w wektorze pAc360 (Lucków i Summers, Biotechnology, 1988,6,47-55) w jednej ramce odczytu z pierwszym 34 nukleotydami poliedryny, wykorzystując znajomość ramki odczytu genu lacZ w wektorze gtii. Zsyntetyzowano oligonukleotydy zdolne do hybrydyzacji z sekwencją gtii flankującą miejsce klonowania EcoRI i zdolną do amplifikacji wstawki przez PCR. Oligonukleotydy te zawierały odpowiednio zlokalizowane miejsca restrykcyjne BamHI, umożliwiające bezpośrednie sklonowanie w miejscu BaHI plazmidu pAc360, z umieszczeniem wstawionego genu w jednej ramce odczytu z aminokońcową sekwencją poliedryny.
Małą ilość rekombinanta faga gtii - JG3 utrzymywano w temperaturze wrzenia w celu ekspozycji DNA i następnie zastosowano w amplifikacji PCR z wykorzystaniem starterów oligonukleotydowych d75 i d76 (sekwencje o numerach identyfikacyjnych 6 i 7; 200 mg) i 0,5 U polimerazy Taq. Po amplifikacji mieszaninę reakcyjną ekstrahowano równą objętością mieszaniny fenol/chloroform, wytrącono etanolem i strawiono 10 U restryktazy BamHI w objętości końcowej 30 gl. Zamplifikowany fragment poddano elektroforezie na 1 % żelu agarozowym, wyeluowano i w celu wytworzenia konstrukcji przenoszącej pDX119, zligowano ze strawionym BamHI plazmidem pAc360. Zrekombinowanym plazmidem (2 gg) i DNA AcNPV typu dzikiego (1 μ g) kotransfekowano komórki owadów przez wytrącanie z fosforanem wapnia. Ujemnego pod względem obecności wstawki zrekombinowanego wirusa wyselekcjonowano wzrokowo. Po trzech rundach oczyszczania z łysinek, zrekombinowany wirus ((BHC-5) namnożono i na podstawie elektroforezy na żelu poliakrylamidowym z SDS (SDS-PAGE), blottingu Western i testu ELISA oszacowano ekspresję otrzymanego metodami rekombinacyjnymi białka w komórkach owadów. Zainfekowane komórki obficie wytwarzają eksprymowane białko o masie cząsteczkowej około 70 kDa. Białko to reaguje z surowicami skierowanymi przeciwko PT-NANBH w blottingu Western i w teście ELISA.
W celu włączenia sekwencji JG2 w dodatku do sekwencji JG3 obecnej w BHC-5 skonstruowano następnego rekombinanta bakulowirusa (BHC-7), jak przedstawiono na figurze 1. W celu wytworzenia plazmidu pDX1 18, sekwencje PT-NANBH obecne w JG2 zamplifikowano i sklonowano w wektorze pAc360 jak opisano powyżej i, w celu wytworzenia konstrukcji przenoszącej pDX122, połączono razem odpowiednie fragmenty BamHI/Sall kolejno plazmidów pDX119 i pDX118 w pAc360.
Zrekombinowane plazmidy zidentyfikowano przez hybrydyzację i określono orientację wbudowanego DNA przez analizę restrykcyjną. Zrekombinowane wirusy wytworzono jak opisano powyżej i eksprymowane białko analizowano przez SDS-PAGE, blotting Western i test ELISA. W zainfekowanych komórkach stwierdzono obecność bardzo dużej ilości (40% całkowitej ilości białka komórkowego) polipeptydu o masie cząsteczkowej 95 kDa, reagującego z surowicami skierowanymi przeciwko PT-NANBH.
Przykład VIII. Oczyszczanie polipeptydu DX113
Szczep TG1 E. coli zawierający plazmid pDX113 (oznaczony jako szczep WDL001) namnażano i indukowano przez 5 godzin w tanku fermentacyjnym o objętości 1,5 litra (model SET002, SGI, Newhaven. East Sussex, Wielka Brytania) w temperaturze 37°C. Komórki zebrano przez wirowanie przy 5 000g przez 20 minut i traktowano w następujący sposób:
a) Ekstrakcja
168 925
Wilgotne komórki ponownie zawieszono (1:20, w/v) w buforze A (50 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 5 mM DTT, 10% (v/v) glicerol, pH 8,0). Dodano lizozym w postaci stałej w stężeniu 5 mg na ml zawiesiny, i mieszaninę pozostawiono w temperaturze 4°C. Po 15 minutach mieszaninę sonifikowano (amplituda całkowita 6 pm) w lodzie przez całkowity okres 3 minut (6 x 30 sekund). Dodano DNazę I w stężeniu 4 pg/ml zawiesiny i mieszaninę pozostawiono na dalsze 30 minut. Zawiesinę wirowano przez 20 minut przy l8 000g (maksymalnie) i supernatant odrzucono.
Osad ponownie zawieszono w buforze B (25 mM Hepes, 4 M mocznik, 5 mM DTT, pH 8,0) w stosunku 1:6 (w/v) w celu otrzymania drobnej zawiesiny. Wirowano ją przy 18 000g (maksymalnie) i supernatant odrzucono. Osad ponownie zawieszono w buforze C (25 mM Hepes, 8 M mocznik, 2 mM DTT, pH 8,0) w stosunku 1:6 (w/v); przed zawieszeniem dodano leupeptynę (1pg/ml), pepstatynę (1 pg/ml) i E64 (1 pg/ml). Zawiesinę wirowano przez 30 minut przy 18 000g (maksymalnie) i supernatant zdekantowano i zatrzymano. Osad ponownie zawieszono w 25 mM Hepes, 1% SDS, pH 8,0.
b) Chromatografia
Supernatant z frakcji z 8 M mocznikiem rozcieńczono 1:5 (v/v) w buforze zawierającym 25 mM Hepes, 8 M mocznik, 2 mM DTT, pH 8,0, i frakcjonowano na kolumnie z Q-Sepharose o objętości 7 ml. Białka eluowano gradientem stężenia soli 0-1 M NaCl. Chromatografię i obróbkę danych przeprowadzono w układzie FPLC (Pharmacia). DX113 ulegał elucji w około 500 mM NaCl i jest rzeczywiście homogenny według kryteriów SDS-PAGE i analizy techniką blottingu Western.
Przykład DC. Oczyszczanie polipeptydu BHC-5
Komórki Sf9 (2 x 109) zainfekowano zawiesiną podstawową zrekombinowanego wirusa HHC-5 (mol 5). Po inkubacji przez 2 dni w temperaturze 28°C komórki zebrano przez wirowanie, a następnie postępowano w następujący sposób:
a) Ekstrakcja.
Mokrą masę komórkową (1,2g) ponownie zawieszono w 6 ml buforu A (25 mM Hepes, mM DTT, 1 pg/ml leupeptyny, 1 pg/ml pepstatyny, 1 pg/ml pepstatyny E64, pH 8,0). Zawieszone komórki umieszczono w lodzie i sonifikowano 3x15 sekund (amplituda całkowita pm) na zmianę z 30 sekundowymi przerwami. Zsonifikowaną zawiesinę wirowano przez 20 minut przy 18 000g (maksymalnie) i supernatant odrzucono. Osad ponownie zawieszono w buforze A z dodatkiem 4 M mocznika (6 ml) i przez 20 minut wirowano przy 18 000g (maksymalnie). Supernatant odrzucono, a osad ponownie ekstrahowano buforem A z dodatkiem 8 M mocznika (6 ml). Po wirowaniu przez 30 minut przy 18 000g (maksymalnie) supernatant zachowano i rozcieńczono 1:6 w buforze A z dodatkiem 8 M mocznika. Ekstrakt ten poddano chromatografii na kolumnie mono-Q zrównoważonej tym samym buforem. Kolumnę eluowano 12 objętościami kolumny gradientu stężenia soli (0-1,0 M NaCl). BHC-5 uległ wyeluowaniu przy około 0,45-0,55 M NaCl i był w więcej niż w 90% czysty jak oceniono na podstawie SDS-PAGE. Wydajność wynosiła około 70%.
Przykład X. Analiza polipeptydów DX113 oraz BHC-5 i 7 testem ELISA
Płytki do testu Microelisa (96 studzienek, Nunc) opłaszczono bezpośrednio w 50 mM buforze wodorowęglanowym (50 mM wodorowęglan sodowy i 50 mM węglan sodowy, o pH 9,5) nieoczyszczonym lizatem BHC-5 w 6 M moczniku, albo oczyszczonym DX113. Płytki blokowano 0,2% bSa, a następnie inkubowano przez 30 minut w temperaturze 37°C z surowicami rozcieńczonymi 1:20 (bakulowirus) lub 1:1000 (E.coli). Po przemyciu roztworem Tween-sól fizjologiczna (0,85% NaCl, 0,05% Tween 20,0,01% Bronidoks) płytki inkubowano przez 30 minut w temperaturze 37°C ze sprężonymi z peroksydazą przeciwciałami skierowanymi przeciwko immunoglobulinom ludzkim (1:2000). Płytki przemyto następnie roztworem Tween-sól fizjologiczna i wywołano zabarwienie przez dodanie chromogennego substratu TMB (tetrametylobenzydyna-HCl) (100 pl/studzienkę) i inkubację przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Reakcję zatrzymano 50 pl 2 M kwasu siarkowego i określano OD450 (tabela 4).
168 925
Tabela 4
Pośredni test ELISA z zastosowaniem przeciwciał skierowanych przeciwko immunoglpbulizom ludzkim do wykrywania przeciwciał skierowanych przeciwko NANBH
Bakulowirus BHC-5 (faza stała) E. coli DX113 (faza stała)
>2 1,670
1,855 1,531
1,081 1,015
1,842 1,558
0,526 0,638
>2 1,515
1,823 1,602
Surowice pacjentów z grupy 1,779 1,318
wysokiego ryzyka dodatnie 1,122 0,616
w oznaczeniu 1,686 1,441
0,259 0,205
0,158 0,120
0,298 0,209
0,194 0,111
0,282 0,181
0,263 0,165
0,184 0,163
0,121 0,099
0,243 0,104
Dawcy ujemni 0,224 0,119
Surowice pacjentów z grupy o wysokim ryzyku infekcji PT-NANBH (osoby uzależnione, stosujące narkotyki dożylnie, chorzy na hemofilię) oznaczono jak opisano. Wszystkie dane wyrażono jako odczyty OD450 z dawcami ujemnymi jako kontrolą ujemną. W tej określonej grupie surowic 10/19 było dodatnich na obu fazach stałych.
Dodatkowo, oczyszczony DX113 skoniugowanp z alkaliczną fosfatazą stosując redukcję SATA/mαloimiO i przeprowadzono oznaczenie immunomoteaczno. Znane, dodatnie i ujemne surowice NANBH rozcieńczono jak podano dla surowicy dawców ujemnych i dodano do fazy stałej opłaszczonej BHC-7. Albo jednocześnie, albo po inkubacji (30 minut w temperaturze 37°C) dodano koniugat DX113 (50 gl, 1:2000). Po inkubacji przez 30 minut w temperaturze 37°C, płytki przemyto 50 mM buforem wodorowęglanowym i wywołano zabarwienie stosując układ wzmacniający IQ Bio, i określano OD492 (tabela 5).
Tabela 5
Immuzomoteyckzy (ze znakowanym pplipopty0om) test ELISA do wykrywania przeciwciał skierowanych przeciwko NANBH
Surowice dodatnie w oznaczeniu Surowice ujemne w oznaczeniu Surowice dawców ujemnych
>2 0,217 0,234
0,821 0,252
>2 0,214
0,542 0,257
0,876 0,308
1,583 0,278
>2 0,296
>2 0,273
1,830 0,262
>2 0,251
168 925
A zatem w obydwu typach oznaczeń - z zastosowaniem przeciwciał przeciwko immunoglobulinom i immunometrycznym - wszystkie próbki pochodzące z grup wysokiego ryzyka dawały zgodne wyniki.
Przykład XI. Szczepionka
Stosując następujące składniki we wskazanych ilościach, można przygotować, stosując konwencjonalne techniki, szczepionkę:
Polipeptyd wirusowy PT-NANBH > 0,36 mg
Thiomersal 0,04-0,2 mg
Chlorek sodowy < 8555 mg
Woda do 1 ml
Przykład XII. Wytwarzanie przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciwko polipeptydom PT-NANBH
Wstawkę DNA z DM415 zsubklonowano w wektorze przenoszącym bakulowirusa p36C i, metodą zasadniczo podobną do metody opisanej w przykładzie VII, wytworzono zrekombinowany wirus. Zrekombinowany wirus nazwano BHC-1 i eksprymował bardzo niskie poziomy białka specyficznego wobec PT-NANBH. Komórki Sf-9 (5 x 107 komórek/ml) zainfekowane BHC-1 lizowano w PBS zawierającej 1% (v/v) NP40 i wirowano przez 2 minuty przy 13 000g. Supernatant oczyszczono na żelu Extractigel-D (Pierce Chemicals) w celu usunięcia detergentu, następnie zmieszano w postaci emulsji w stosunku 1:1 z kompletnym adiuwantem Freuda. Myszom podano po 0,1 ml emulsji (równoważnik 5 x 106 komórek) drogą iniekcji podskórnych. 14 i 28 dnia po iniekcji myszy otrzymały dawki przypominające przez dootrzewnowe iniekcje 0,1 ml (równoważnik 5 x 106 komórek) wolnego od detergentu ekstraktu komórek Sf-9 zainfekowanych BHC-5: BHC-5 zawiera wstawkę DNA DM416. Następnie pobierano z ogonów próbki krwi i oznaczano pod kątem aktywności anty-FT-NANBH w teście ELISA (przykład X). Dwie myszy z odpowiedzią specyficzną wobec PT-NANBH otrzymały dalszą dawkę przypominającą przez iniekcje dożylne wolnego od detergentu ekstraktu komórek Sf-9 zainfekowanych bHC-7 ; BHC zawiera wstawkę DNA wytworzoną przez ligację ze sobą zachodzących regionów DM415 i DM416 (przykład VII). Trzy dni później usunięto śledziony.
Komórki śledziony poddawano fuzji z komórkami szpiczaka NSo standardowymi technikami w obecności PEG 1500. Otrzymane komórki hybrydom selekcjonowano przez wzrost w podłożu HAT (hipoksantyną, aminopteryną, tymidyna). 10-14 dni po fuzji supernatanty testowano pod kątem aktywności anty-PT-NANBH w teście ELISA. Zidentyfikowano studzienki wykazujące reaktywność z oboma antygenami - DX113 i BHC-7 (przykład VII), i pojedyncze kolonie przeniesiono do oddzielnych studzienek, namnażano i ponownie testowano. Hybrydomy ze studzienki wykazujące specyficzną reaktywność na tym etapie dalej klonowano stosując rozcieńczenia ograniczające do osiągnięcia monoklonalności.
Przykład XIII. Wykrywanie wirusowego kwasu nukleinowego u pacjentów serododatnich
Surowice: próbki od 1400 dawców, włączonych do programu badań perspektywicznych potransfuzyjnego zapalenia wątroby, zamrożono w temperaturze -20°C. Podobnie przechowywano surowice pobrane przed transfuzją i kolejno po transfuzji od 260 biorców transfuzji. Próbki po transfuzji zbierano do trzeciego miesiąca co dwa tygodnie, do szóstego miesiąca co miesiąc a następnie do osiemnastego miesiąca co sześć miesięcy. Do badań dostępne były także zamrożone surowice dawców i biorców pochodzące z trzech przypadków PT-NANBH, które wystąpiły w 1981 r. Diagnoza PT-NANBH oparta była na wzroście aktywności aminotransferazy alaninowej (ALT) w surowicy przekraczającej 2,5-krotnie górny poziom normy w co najmniej dwóch oddzielnych próbkach potransfuzyjnych. Inne wirusy hepatotropowe wykluczono przez testy serologiczne, a niewirusowe przyczyny uszkodzeń komórek wątroby wykluczono przez konwencjonalne badania kliniczne i laboratoryjne.
Oznaczenia immunologiczne: Próbki surowicy testowano retrospektywnie na obecność przeciwciał skierowanych przeciwko HCV (antygen Cl 00) stosując zestaw do testu ELISA Ortho Diagnostics stosowanym zgodnie z instrukcjami producenta. Surowice powtarzalnie reaktywne miareczkowano do punktu końcowego w surowicy ludzkiej ujemnej pod względem obecności przeciwciał skierowanych przeciwko antygenowi C100.
168 925
Wykrywanie sekwencji wirusowych PT-NANBH: RNA surowicy lub osocza ekstrahowano, poddawano odwrotnej transkrypcji i amplifikowano jak opisano poniżej. Startery oligonukleotydowe do odwrotnej transkrypcji/PCR pochodziły z sekwencji nukleotydowej klonu JG2 wyizolowanego w przykładzie III i zsynetyzowanej w syntetyzatorze Applied Biosystems 381 A. Sekwencje czterech starterów oligonukleotydowych były następujące:
Numer identyfikacyjny Wielkość
Oznaczenie sekwencji produktu
d94 sensowny 8
d95 antysensowny 9 729 bp
N1 sensowny 10 402 bp
N2 antysensowny 11
(i) Ekstrakcja RNA
5-50gl surowicy (lub osocza) uzupełniono do 200 gl przez dodanie jałowej wody destylowanej. 200g1 próbki dodano do równej objętości buforu 2 x PK (2 x PK = 0,2 M TrisCl, pH 7,5, 25 mM eDtA, 0,3 M NaCl, 2% (w/v) SDS, proteinaza K 200 gg/ml), zmieszano i inkubowano przez 40 minut w temperaturze 37°C. Białka usunięto przez dwukrotną ekstrakcję mieszaniną fenol/chloroform i jedną samym chloroformem. Do fazy wodnej dodano 20gg glikogenu, a następnie wytrącono RNA przez dodanie 3 objętości schłodzonego lodem absolutnego etanolu. Po przechowywaniu przez 1 godzinę w temperaturze -70°C, RNA osadzono w wirówce Eppendorfa (15 minut, 14000 obrotów/minutę, 4°C). Osad przemyto raz 95% etanolem, wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem i rozpuszczono w 10gl jałowej wody destylowanej. Roztwory RNA przemywano w temperaturze -70°C.
(ii) Synteza cDNA
Przygotowano 10 gl mieszaniny zawierającej 2 gl roztworu RNA, 50 ng syntetycznego oligonukleotydu d95, 10 mM Hepes-HCl, pH 6,9 i 0,2 mM pH 8,0. Na tę 10 gl mieszaninę nałożono 2 krople oleju mineralnego, ogrzewano przez dwie minuty w łaźni wodnej o temperaturze 90°C i szybko schłodzono w lodzie. Syntezę cDNA przeprowadzono po doprowadzeniu składu mieszaniny reakcyjnej do zawartości 50 mM Tris-HCl pH 7,5,75 mM KC1,3 mM MgCh, 10 mM DTT, 0,5 mM każdego z dATP, dCTP, dGTP i dTTP, 20 jednostek inhibitora RNazy (Pharmacia) i 15 jednostek klonowanej odwrotnej transkryptazy mLv (Pharmacia) w objętości końcowej 20 gl. 20 gl mieszaniny inkubowano przez 90 minut w temperaturze 37°C. Po syntezie cDNA przechowywano w temperaturze -20°C.
(iii) Seryjna PCR
W trakcie tych badań unikano fałszywie dodatnich wyników PCR poprzez ścisłe stosowanie pomiarów unikania zanieczyszczeń według Kwok i Higuchi (Naturę, 1989, 339, 237-238).
a) Runda 1
Łańcuchową reakcję polimerazy przeprowadzono w 50 gl mieszaniny zawierającej 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 0,01% żelatynę, i jednostkę rekombinowanej polimerazy DNA Taq (Perkin Elmer Cetus), 200 gM każdego z dNTP, 30 ng każdego z zewnętrznych starterów (d94 i d95, sekwencje o numerach identyfikacyjnych odpowiednio 8 19) i 5 gl roztworu cDNA. Po początkowych 5 minutach denaturacji w temperaturze 94°C, przeprowadzono 35 cykli: 1,2 minuty w temperaturze 95°C, i minuta w temperaturze 56°C, i minuta w temperaturze 72°C, po których następowało końcowe 7-minutowe utrzymywanie w temperaturze 72°C (Techne PHC-1 Automated Thermal Cycler).
b) Runda 2
Mieszanina reakcyjna była taka jak opisana powyżej dla rundy 1, ale w miejsce zewnętrznych starterów d94 i d95 zastosowano 125ng każdego z wewnętrznych starterów (sekwencje o numerach identyfikacyjnych odpowiednio 10 i 11).Do50 gl mieszaniny reakcyjnej z Rundy 2 przeniesiono 1 gl produktu Rundy i PCR. Przeprowadzono 25 cykli: 1,2 minuty w temperaturze
168 925
95°C, 1 minuta w temperaturze 46°C, 1 minuta w temperaturze 72°C, po których następowało 7-minutowe utrzymywanie w temperaturze 72°C
c) Analiza
20gl produktów Rundy 1 i Rundy 2 PCR analizowano przez elektroforezę na 2% żelu agarozowym. Prążki uwidoczniono przez barwienio bromkiem etydyny i fotografowano przy długości fali 302 nm.
Przewidywane wartości serologiczne anty-HCV i PCR w programie badań perspektywicznych: Stwierdzono, że sześciu spośród 1400 dawców (0,43%) posiada w surowicy przeciwciała skierowane przeciwko C100. Spośród tych sześciu dawców, dodatnich pod względem przeciwciał skierowanych przeciwko C100, infekcyjność stwierdzono tylko u jednego (dawca D6) sądząc po wystąpieniu PT-NANBH i serokonwersji przeciwciał skierowanych przeciwko C100 u biorcy (biorca R6) - patrz tabela 6 poniżej.
Przez PCR wykryto sekwencje wirusowe w surowicy dawcy 6, ale nie u któregokolwiek z pozostałych pięciu dawców serododatnich surowic. Biorca R6, u którego rozwinęło się PT-NANBH otrzymywał także krew od siedmiu innych dawców (D7 do D13).
Przetestowano surowice tych dawców i stwierdzono, że są one zarówno ujemne pod względem przeciwciał, jak i PCR.
Tabela 6
Podsumowanie danych dawca/biorca: program badań perspektywicznych
Dawcy Biorcy
Dawca anty-HCV PCR Biorca PT-NANBH Serokonwersja
- anty-HCV
Dl + - R1 Nie Nie
D2 + - R2 Nie Nie
D3 + - R3 Nie Nie
D4 + - R4 Nie Nie
D5 + - R5 Nie Nie
D6 + +
D7 - -
D8 - -
D9 - -
D10 - - R6 Tak* Tak+
D11 - -
D12 - -
D13 - -
* okres inkubacji i miesiąc
- serokonwersja wystąpiła w piątym miesiącu po transfuzji
Przykład XIV. Izolowanie i ekspresja dodatkowych sekwencji DNA PT-NANBH
Przygotowaną w przykładzie II bibliotekę lambda gtii przeszukiwano także stosując surowice pacjentów z grup wysokiego ryzyka PT-NANBH, które nie reagowały z antygenami wirusowymi DX113, BHC-5 i BHC-7. Przyczyną tego jest to, że mogą zawierać przeciwciała rozpoznające inne antygeny. Surowice PJ-5 (The Newcastle Royal Infirmary, Newcastle), Birm-64 (Queen Elizabeth Medical Centre, Birmingham), PG i Le (University Collage and Middlesex School of Medicine, Londyn) spełniają to kryterium i zastosowano je do przeszukiwania bibliotek według takiej samej procedury, jak opisana w przykładzie III i IV. W ten sposób zidentyfikowano liczne rekombinanty, z których żaden nie wykazywał krzyżowej hybrydyzacji z sondami wykonanymi z JG2 i JG3. Jeden z rekombinantów, BR11, zidentyfikowany przez reakcję z surowicą, wyselekcjonowano do dalszej analizy.
Klon BR11 zawierał wstawkę o długości około 900 bp, którą zamplifikowano przez PCR stosując startery d75 i d76 (sekwencje o numerach identyfikacyjnych 6 i 7), jak opisano w przykładzie VII. Zamplifikowaną sekwencję bezpośrednio sklonowano w bakulowirusowym
168 925 wektorze pAc360, tworząc plazmid pDX128 zawierający otwartą ramkę odczytu w jednej fazie z pierwszymi 11 aminokwasami poliedryny. Zawiesinę rekombinowanego bakulowirusa (oznaczonego BHC-7) wytworzono według procedury opisanej w przykładzie VII. Komórki owadów zainfekowano oczyszczonym zrekombinowanym wirusem i w znakowanych radioaktywnie ekstraktach komórkowych otrzymano polipeptyd o masie cząsteczkowej około 22 kD.
Zamplifikowaną wstawkę BR11 sklonowano także do sekwencjonowania w plazmidzie pUC13 i wektorze fagowym M13; dane dotyczące sekwencji DNA i aminokwasowej przedstawiono na sekwencji o numerze identyfikacyjnym 5. Wstawka zawierała 834 bp plus dodane podczas klonowania łączniki EcoRI.
Przykład xV. Analiza polipeptydu BHC-9 testem ELISA
Test ELISA wykonano stosując opłaszczone ekstraktem komórek zainfekowanych BHC-9 studzienki do mikromiareczkowania i układ detekcji z koniugatem z przeciwciałami skierowanymi przeciwko ludzkim IgG według procedury opisanej w przykładzie X. Zestaw surowic pochodzący z grup wysokiego ryzyka oznaczano równolegle pod względem aktywności przeciwko BHC-7 i BhC-9 oraz sprawdzono także przez PCR stosując procedurę opisaną w przykładzie XIII. Wyniki przedstawiono w tabeli 7, w której podkreślono próbki dodatnie.
Tabela 7
Numer PCR BHC-7 BHC-9
1 + 2.09 2.00
2 + 2.09 2.00
3 + 1.89 1.37
4 + 1.57 0,27
5 + 1.26 2.00
6 + 0.91 2.00
7 - 0.90 0.51
8 + 0.84 112
9 - 0.53 ΩΧ
10 - 0.45 2.00
11 + 0,37 1.07
12 - 0,32 2.00
13 - 0,23 0,30
14 - 0,15 0.43
15 + 0,16 0.76
16 - 0,09 174
17 - 0,27 2.00
18 - 0,15 2.00
19 - 0,12 2.00
20 - 0,08 0,05
wartość graniczna 0,27 0,29
Spośród tych 20 próbek, 50% jest wyraźnie dodatnich wobec BHC-7, podczas gdy 85% jest dodatnich wobec BHC-9. Dwie próbki (11 i 12), które są dodatnie z wartością zbliżoną do granicy wobec BHC-7, są wyraźnie dodatnie wobec BHC-9, a pewne próbki o wartościach zbliżonych lub poniżej wartości granicznej wobec BHC-7 są dodatnie z BHC-9. Ponadto, dwie próbki (11 i 15), które zbliżają się do wartości granicznej lub są ujemne wobec BHC-7, ale dodatnie wobec BHC-9, są dodatnie w PCR. Ogólnie są tylko dwie próbki ujemne (13 i 20) wobec obydwu polipeptydów i w PCR.
Przykład XVI. Izolowanie sekwencji DNA PT-NANB zachodzących na istniejące klony
Poprzez opisane w przykładach III, IV i XIV immunologiczne przeszukiwanie bibliotek ekspresyjnych cDNA można zidentyfikować tylko te klony, które zawierają immunogenny region wirusa. Innym podejściem w wytwarzaniu klonów specyficznych wobec PT-NANB jest
168 925 zastosowanie PCR do amplifikacji cząsteczek cDNA zachodzących na istniejące klony. Można przygotować zestawy starterów, w których jeden z członków pary leży w sekwencji istniejącego klonu, a drugi położony jest na zewnątrz; podejście to można również rozciągnąć na seryjne pary starterów.
cDNA przygotowany jak opisano w przykładzie I zamplifikowano przez PCR z albo pojedynczymi albo seryjnymi parami starterów, stosując warunki reakcji opisane w przykładzie XHI. Podejście to ilustruje zastosowanie następujących par starterów: d164 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 12) i dl37 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 13); d136 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 14) i d155 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 15); dl56 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 16) i d92 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 17). Jeden z członków każdej pary przeznaczony jest do służenia jako starter wewnątrz istniejącej sklonowanej sekwencji (dl 36 i dl37 służą jako startery odpowiednio przy końcach 5' i 3' BR11, d92 służy jako starter przy końcu 5' JG3). Inne startery oparte są na sekwencjach dostępnych dla innych czynników PT-NANBH. Starter dl64 odpowiada zasadom 10 do 31 na figurze 2 w Okamoto i in., Japan. J. Exp. Med. 1990, 60, 167-177. Startery d155 i 156 odpowiadają odpowiednio pozycjom 462 do 489 oraz 3315 do 3337 na figurze 47 w europejskim zgłoszeniu patentowym 88310922.5. W celu wprowadzenia miejsc rozpoznawczych przez restryktazę EcoRI w pobliżu końca 5' starterów, wykonano jedno lub więcej podstawień nukleotydowych. Wyjątkiem jest dl 64, gdzie wprowadzono miejsce rozpoznawane przez Bgl 2. Zmiany te ułatwiają późniejsze klonowanie zamplifikowanego produktu.
Produkty PCR trawiono odpowiednim enzymem (enzymami) restrykcyjnym, poddawano elektroforezie na żelu agarozowym, wycinano prążki o oczekiwanej wielkości i klonowano w wektorach zarówno plazmidowych, jak i bakteriofagowych jak opisano w przykładzie V. Sekwencje zamplifikowanych DNA 164/137 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 18), 136/155 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 19) i 156/92 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 20) przedstawiono w zestawieniu sekwencji. Te nowe sekwencje pokrywają genom wirusa PT-NANBH w większym stopniu niż sekwencje otrzymane przez przeszukiwanie immunologiczne (sekwencje o numerach identyfikacyjnych 3,4 i 5). Sekwencje te, wraz z innymi, leżącymi w regionach już opisanych, można połączyć w sekwencję lezącą w pobliżu końca 5' (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 21) i końca 3' (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 22) genomu wirusa PT-NANBH.
Przykład XVII. Fuzja różnych antygenów PT-NANBH w pojedynczym zrekombinowanym pelipoptydzio
Dane przedstawione w tabeli 7 wskazują na to, że podczas gdy więcej próbek surowic wykryto jako dodatnie pod względem obecności przeciwciał stosując jako antygen docelowy raczej BHC-9 (17/20) niż BHC-7 (10/20), istnieją pewne próbki (np nr 4), które są dodatnie tylko wobec BHC-7. Obraz ten potwierdza się przy szerokim testowaniu próbek. Zgodnie z tym, otrzymano konstrukcje fuzyjne stosując sekwencje BHC-7 i BHC-9.
Sekwencje z BHC-7 i BHC-9 można połączyć na różne sposoby; każda z sekwencji może być, w wyniku fuzji, położona przy końcu aminowym i różny może być charakter sekwencji łączącej. Możliwe sposoby połączenia sekwencji ilustruje figura 2.
Odpowiednie fragmenty restrykcyjne niosące odpowiednie miejsca restrykcyjne utworzono albo przez PCR z zastosowaniem specyficznych starterów, albo przez trawienie istniejących plazmidów enzymami restrykcyjnymi. Wektor przenoszący DX143 składa się z fragmentu BamH1/Pstl z DX122 (figura 1; miejsce Pst w 1504 pozycji JG2, sekwencja o numerze identyfikacyjnym 3) połączony z końcem 5' całego regionu kodującego BR11 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 7), który zamplifikowane jako fragment Pst1/BamH1 stosując d24 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 23) i d126 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 24); region łączący składa się z sześciu aminokwasów pochodzących z startera d126 i pozostałych sekwencji bakteriofaga lambda. Wektor przenoszący DX136 różni się od wektora DX143 tym, że fragment BR 11 utworzono stosując startery d24 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 23) i d132 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 25) i tak region łączący zawiera pięć lizyn. Te wektory przenoszące stosowano do kotransfekcji komórek owadów w hodowli dNa wirusa AcNPV i wytworzono zawiesinę zrekombinowanych bakulowirusów przez oczyszczanie ły24
168 925 sinek jak opisano w przykładzie VII. W wyniku transfekcji DX143 wytworzono BHC-10, a wyniku transfekcji DX136 - BHC11.
Rekombinowane polipeptydy eksprymowane przez te dwa wirusy analizowano przez SDS-PAGE i blotting Western. BHC-10 wytwarzał polipeptyd o pozornej masie cząsteczkowej 118 kDa. BHC-11 wytwarzał polipeptyd o pozornej masie cząsteczkowej 96 kDa. Oba polipeptydy reagowały z surowicami, o których wiadomo było, że w teście ELISA reagują tylko z BHC-7 (np. surowica A) lub tylko z BHC-9 (surowica B64, przykład XIV). Oba polipeptydy różnią się tylko sekwencją łącznikową, i może to wpływać albo na ich ruchliwość w SDS-PAGE, lub na sposób ich procesowania w zainfekowanych komórkach.
Przykład XVIII. Analiza fuzji antygenów testem ELISA
Test ElISA wykonano stosując studzienki do mikromiareczkowania opłaszczone ekstraktami komórek zainfekowanych BHC-9 i koniugat przeciwciała skierowanego przeciwko immunoglobulinom zgodnie z procedurą opisaną w przykładzie X. W tabeli 8 przedstawiono dane dotyczące porównania dwóch fuzji z innymi rekombinowanymi antygenami PT-NANBH -BHC7 i BHC-11, jak również rekombinowanym białkiem wirusa HCV-C-100-3 (Ortho Diagnostics System, Raritan, New Jersey). Surowice pogrupowano według wzoru reakcji z BHC-7, BHC-9 i C-100-3. Surowice z Grupy I silnie reagują zz wszystkimi trzzma antygennmi; surowice z Grupy II sUnie tylko z BHC-7, z Grapy ΙΠ sUnie ^^t^g^ują tylko z BHC-9 , a Grapy IV tylko z dwoma spośród trzech antygenów.
Tabela 8
Surowica BHC-7 BHC-9 C-100-3 BHC-9 BHC-11
Grupa I AH >2,0 >2,0 >2,0 >2,0 >2,0
CH >2,0 >2,0 >2,0 >2,0 >2,0
57 >2,0 >2,0 >2,0 >2,0 >2,0
77 >2,0 >2,0 >2,0 >2,0 >2,0
84 1,4 >2,0 >2,0 >2,0 >2,0
Grupa II 805-6 >2,0 0,261 0,1 1,78 * +
805-17 >2,0 0,181 0,12 1,37 +
805-149 >2,0 0,651 0,084 1,57 * ++
Grupa III JS 0,32 >2,0 0,17 >2,0 >2,0
805-57 0,069 1,403 0,25 1,9 +
805-82 0,116 1,272 0,4 1,85 ++
805-94 0,353 1,675 0,2 >2,0 * +
PJ1 0,27 >2,0 0,2 >2,0 1,85
Grupa IV A >2,0 0,14 >2,0 >2,0 >2,0
KT 1,57 0,27 >2,0 >2,0 >2,0
Le 0,152 >2,0 >2,0 >2,0 >2,0
PJ5 0,123 >2,0 >2,0 >2,0 >2,0
303-923 >2,0 0,9 0,37 1,9 +
303-939 >2,0 1,55 0,268 2,0 +
* Te próbki testowano wobec BHC-11 tylko przez blotting Western.
Dane te wykazują, że zarówno BHC-10, jak i BHC-11 posiadają podobną reaktywność z tymi surowicami i, co ważniejsze, że obie aktywności antygenowe utrzymywały się w fuzji białkowej. Wszystkie surowice w grupach II i III, reagujące odpowiednio tylko z BHC-7 i BHC-9, dawały wyraźną reakcję z fuzjami białkowymi. Dodatkowo, istnieje wskazanie, że
168 925 występowanie dwóch antygenów razem daje oznaczenie o wyższej czułości. Próbka KT, na przykład, dawała z BHC-7 i BHC-9 OD odpowiednio 1,57 i 0,27, podczas gdy dla fuzji OD wynosi > 2,0
W poniższym wykazie sekwencji, scharakteryzowano sekwencje o numerach identyfikacyjnych 1-25.
Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 1 Typ sekwencji: nuklootydowα
Długość sekwencji: 21 zasad o następującej sekwencji:
GGTGGCGACG ACTCCTGGAG C Ilość ζϊοϊ: jedna
Topologia: liniowa
Typ cząsteczki: syntetyczny DNA
Pierwotny organizm źródłowy: bakteriofag lambda gtii
Bezpośrednie źródło doświadczalne: syntetyzator pligpnukloptydowa; pligonukloptyO d 19 Cechy: od 1do 21 zasady homologiczna z częścią genu lacZ leżącą w kierunku przeciwnym do kierunku transkrypcji flankującą miejsce restrykcyjne EcoR1 bakteriofaga lambda gtii
Właściwości: służy jako starter syntezy DNA z wektora fagowego na cDNA wbudowany w miejscu EcoR1.
Sekwencja o numerze identyfikacyjnym 2
Typ sekwencji: nukloptydowa
Długość sekwencji: 21 zasad o następującej sekwencji:
TTGACACCAG ACCAACTGGT A Ilość nici: jedna
Topologia: liniowa
Typ cząsteczki: syntetyczny DNA
Pierwotny organizm źródłowy: bakteriofag lambda gtii
Bezpośrednie źródło doświadczalne: syntetyzator pligonukloptydowa; oligpnukloρtyd d20 Cechy: od 1 do 21 zasady homologiczna z częścią genu lacZ leżącą w kierunku zgodnym z kierunkiem transkrypcji flankującą miejsce restrykcyjne EcoR1 bakteriofaga lanmbOa gtii Właściwości: służy jako starter syntezy DNA z wektora fagowego na cDNA wbudowany w miejscu EcoR1.
Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 3
Typ sekwencji: nukloptydowa z odpowiadającą białkową
Długość sekwencji: 1770 par zasad o sekwencji przedstawionej na fig. 4.
Ilość nici: jedna
Topologia: liniowa
Typ cząsteczki: cDNA otrzymany na podstawie gonomowogp RNA
Pierwotny organizm źródłowy: człowiek: surowica infekcyjna pod względem potransfuzajnogo zapalenia wątroby typu nie-A nie-B
Bezpośrednie źródło doświadczalne: klon JG2 pochodzący z biblioteki cDNA w bakteriofagu lambda gtii
Cechy: część poliprρtoiny PT-NANBH od 1 do 1770 bp.
Właściwości: prawdopodobnie koduje wirusowe białka niostrukturalno
Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 4
Typ sekwencji: nukloptydowa z odpowiadającą białkową
Długość sekwencji: 1035 par zasad o sekwencji przedstawionej na fig. 5.
Ilość nici: jedna
Topologia: liniowa
Typ cząsteczki: cDNA otrzymany na podstawie gonpmowogo RNA
Pierwotny organizm źródłowy: człowiek; surowica infekcyjna pod względem potransfuzyjzogo zapalenia wątroby typu nie-A nie-B
168 925
Bezpośrednie źródło doświadczalne: klon JG3 pochodzący z biblioteki cDNA w bakteriofagu lambda gtii
Cechy: część poliproteiny PT-NANBH od 1 do 1035 bp
Właściwości: prawdopodobnie koduje wirusowe białka niestrukturalne
Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 5
Typ sekwencji: nukleotydowa z odpowiadającą białkową
Długość sekwencji: 834 par zasad o sekwencji przedstawionej na fig. 6.
Ilość nici: jedna
Topologia: liniowa
Typ cząsteczki: cDNA otrzymany na podstawie genomowego RNA
Pierwotny organizm źródłowy: człowiek: surowica infekcyjna pod względem potransfuzyjnego zapalenia wątroby typu nie-A nie-B
Bezpośrednie źródło doświadczalne: klon BR11 pochodzący z biblioteki cDNA w bakteriofagu lambda gtii
Cech: część poliproteiny PT-NANBH od 1 do 834 bp
Właściwości: prawdopodobnie koduje wirusowe białka strukturalne
Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 6
Typ sekwencji: nukleotydowa
Długość sekwencji: 31 zasad o następującej sekwencji:
TAAGGATCCCCCGTCAGTATCGGCGGAATTC
Ilość nici: jedna
Topologia: liniowa
Typ cząsteczki: syntetyczny DNA
Pierwotny organizm źródłowy: bakteriofag lambda gtii
Bezpośrednie źródło doświadczalne: syntetyzator oligonukleotydowy; oligonukleotyd d75
Cechy: od 4 do 9 zasady miejsca BamH1
Od 10 do 31 zasady homologiczna z częścią genu lacZ leżącą w kierunku przeciwnym do kierunku transkrypcji flankującą miejsce EcoR1 bakteriofaga lamda gtii od 26 do 31 zasady miejsca EcoR1
Właściwości: służy jako starter syntezy DNA z wektora fagowego na cDNA wbudowany w miejsce EcoR1 i wprowadza miejsce BamH1 odpowiednie do późniejszego klonowania w wektorze ekspresyjnym.
Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 7
Typ sekwencji: nukleotydowa
Długość sekwencji: 30 zasad o następującej sekwencji:
TATGGATCCGTAGCGACCGGCGCTCAGCTG
Ilość nici: jedna
Topologia: liniowa
Typ cząsteczki: syntetyczny DNA
Pierwotny organizm źródłowy: bakteriofag lambda gtii
Bezpośrednie źródło doświadczalne: syntetyzator oligonukleotydowy; oligonukleotyd d76
Cechy: od 4 do 9 zasady miejsca BamH1 od 10 do 30 zasady homologiczna z leżącą w kierunku zgodnym z kierunkiem transkrypcji częścią genu lacZ flankującą miejsce EcoR1 Bakteriofaga gtii
Właściwości: służy jako starter syntezy DNA z wektora fagowego na cDNA wbudowany w miejsce EcoR1 i wprowadza miejsce BamH1 odpowiednie do późniejszego klonowania w wektorze ekspresyjnym.
Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 8
Typ sekwencji: nukleotydowa
Długość sekwencji: 19 zasad o następującej sekwencji:
168 925
ATGGGGCAAAGGACGTCCG Ilość nici: jedna Topologia: liniowa Typ cząsteczki: syntetyczny DNA
Pierwotny organizm źródłowy: człowiek; surowica infekcyjna pod względem potransfuzyjnego zapalenia wątroby typu nie-A nie-B
Bezpośrednie źródło doświadczalne: syntetyzator oligonukleotydowy: oligonukleotyd d94 Cechy: od 1 do 19 zasady homologiczna z zasadami 914 do 932 sensownej nici JG2 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 3)
Właściwości: służy jako starter syntezy DNA na ujemnej nici RNA/DNA genomowego dla PT-NANBH
Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 9 Typ sekwencji: nukleotydowa
Długość sekwencji: 24 zasady o następującej sekwencji:
TACCTAGTCATAGCCTCCGTGAAG
Ilość nici: jedna
Topologia: liniowa
Typ cząsteczki: syntetyczny DNA
Pierwotny organizm źródłowy: człowiek; surowica infekcyjna pod względem potransfuzyjnego zapalenia wątroby typu nie-A nie-B
Bezpośrednie źródło doświadczalne: syntetyzator oligonukleotydowy; oligonukleotyd d95 Cechy: od 1 do 24 zasady homologiczna z zasadami 1620-1643 antysensownej nici JG2 (numer identyfikacyjny sekwencji 3)
Właściwości: służy jako starter syntezy DNA na dodatniej nici RNA/DNA genomowego dla PT-NANBH
Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 10 Typ sekwencji: nukleotydowa
Długość sekwencji: 17 zasad o następującej sekwencji:
GAGGTTTTCTGCGTCCA Ilość nici: jedna Topologia: liniowa Typ cząsteczki: syntetyczny DNA
Pierwotny organizm źródłowy człowiek; surowica infekcyjna pod względem potransfuzyjnego zapalenia wątroby typu nie-A nie-B
Bezpośrednie źródło doświadczalne: syntetyzator oligonukleotydowy; oligonukleotyd N1 Cechy: od 1 do 17 zasady homologiczna z zasadami 1033 do 1049 sensownej nici JG2 (numer identyfikacyjny sekwencji 3)
Właściwości: służy jako starter syntezy DNA na ujemnej nici RNA/DNA genomowego dla PT-NANBH
Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 11
Typ sekwencji: nukleotydowa
Długość sekwencji: 17 zasad o następującej sekwencji:
GCGATAGCCG CAGTTCT Ilość nici: jedna
Topologia: liniowa
Typ cząsteczki: syntetyczny DNA
Pierwotny organizm źródłowy: człowiek; surowica infekcyjna pod względem potransfuzyjnego zapalenia wątroby typu nie-A nie-B
Bezpośrednie źródło doświadczalne: syntetyzator oligonukleotydowy; oligonukleotyd N2 Cechy: od 1do 17 zasady homologiczna z zasadami 1421 do 1437 antysensownej nici JG2 (numer identyfikacyjny sekwencji 3)
168 925
Właściwości: służy jako starter syntezy DNA na dodatniej nici RNA/DNA genomowego dla PT-NANBH
Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 12
Typ sekwencji: nukleotydowa
Długość sekwencji: 22 zasady o następującej sekwencji:
CCACCATAGATCTCTCCCCTGT
Ilość nici: jedna
Topologia: liniowa
Typ cząsteczki: syntetyczny DNA
Pierwotny organizm źródłowy: człowiek; surowica infekcyjna pod względem potransfuzyjnego zapalenia wątroby typu nie-A nie-B
Bezpośrednie źródło doświadczalne: syntetyzator oligonukleotydowy; oligonukleotyd dl 64
Cechy: od 1 do 22 zasady homologiczna z zasadami 10 do 31 sekwencji przedstawionej na fig. 2 w Okamoto i in., Japan. J. Exp. Med. 1990, 60
167-177, zasada 22 zmieniona z A na T w celu wprowadzenia miejsca rozpoznawania Bgl2 od 8 do 13 zasady miejsce rozpoznawania Bgl2
Właściwości: służy jako starter syntezy DNA na ujemnej nici RNA/DNA genomowego dla PT-NANBH i wprowadza miejsce Bgl2
Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 13
Typ sekwencji: nukleotydowa
Długość sekwencji: 30 zasad o następującej sekwencji:
GCGAGAATTCGGGATAGGTTGTCGCCTTCC
Ilość nici: jedna
Topologia: liniowa
Typ cząsteczki: syntetyczny DNA
Pierwotny organizm źródłowy: człowiek; surowica infekcyjna pod względem potransfuzyjnego zapalenia wątroby typu nie-A nie-B
Bezpośrednie źródło doświadczalne: syntetyzator oligonukleotydowy; oligonukleotyd dl 37
Cechy: od 1 do 30 zasady homologiczna z zasadami 154 do 183 ujemnej nici BR 11 (numer identyfikacyjny sekwencji 5); zasady 174, 177 i 178 zmodyfikowano w celu wprowadzenia miejsca EcoRI od 5 do 10 zasady miejsce rozpoznawania EcoRI
Właściwości: służy jako starter syntezy DNA na dodatniej nici RNA/DNA genomowego dla PT-NANBH i wprowadza miejsce EcoRI do klonowania
Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 14
Typ sekwencji: nukleotydowa
Długość sekwencji:27 zasad o następującej sekwencji:
GGGGAATTCCTCCCGCTGCTGGGTAGC
Ilość nici: jedna
Topologia: liniowa
Typ cząsteczki: syntetyczny DNA
Pierwotny organizm źródłowy człowiek; surowica infekcyjna pod względem potransfuzyjnego zapalenia wątroby typu nie-A nie-B
Bezpośrednie źródło doświadczalne: syntetyzator oligonukleotydowy; oligonukleotyd dl36
Cechy: od 1 do 27 zasady homologiczna z zasadami 672 do 698 dodatniej nici BR11 (numer identyfikacyjny sekwencji 5); zasadę 675 zmieniono na G w celu wprowadzenia miejsca EcoRI
168 925 od 4 do 9 zasady miejsce rozpoznawania EcoR1
Właściwości: służy jako starter syntezy DNA na ujemnej nici RNA/DNA genomowego dla PT-NANBH i wprowadza miejsce EcoR1 do klonowania
Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 15
Typ sekwencji: nukleotydowa
Długość sekwencji: 28 zasad o następującej sekwencji:
ACGGGAATTCGACCAGGCACCTGGGTGT
Ilość nici: jedna
Topologia: liniowa
Typ cząsteczki: syntetyczny DNA
Pierwotny organizm źródłowy: szympans; surowica infekcyjna pod względem potransfuzyjnego zapalenia wątroby typu nie-A nie-B
Bezpośrednie źródło doświadczalne: syntetyzator oligonukleotydowy; oligonukleotyd d 155
Cechy: od 1 do 28 zasady homologiczna z zasadami 462 do 489 nici ujemnej przedstawionej na fig. 47, europejskie zgłoszenie patentowe nr 88310922.5, zasady 483 i 485 zmieniono w celu wprowadzenia miejsca rozpoznawania EcoR1 od 5 do 10 zasady miejsce rozpoznawania EcoR1
Właściwości: służy jako starter syntezy DNA na dodatniej nici RNA/DNA genomowego dla PT-NANBH i wprowadza miejsce EcoR1 do klonowania
Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 16
Typ sekwencji: nukleotydowa
Długość sekwencji: 23 zasady o następującej sekwencji:
CTTGAATTCTGGGAGGGCGTCTT
Ilość nici: jedna
Topologia: liniowa
Typ cząsteczki: syntetyczny DNA
Pierwotny organizm źródłowy: szympans; surowica infekcyjna pod względem potransfuzyjnego zapalenia wątroby typu nie-A nie-B
Bezpośrednie źródło doświadczalne: syntetyzator oligonukleotydowy: oligonukleotyd dl56
Cechy:od 1 do 23 zasady homologiczna z zasadami 3315 do 3337 nici dodatniej przedstawionej na fig. 47, europejskie zgłoszenie patentowe nr 88310922.5, zasadę 3323 zmieniono na C w celu wprowadzenia miejsca rozpoznawania EcoR1 od 4 do 9 zasady miejsce rozpoznawania EcoR1
Właściwości: służy jako starter syntezy DNA na ujemnej nici RNA/DNA genomowego dla PT-NANBH i wprowadza miejsce EcoR1 do klonowania
Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 17
Typ sekwencji: nukleotydowa
Długość sekwencji: 29 zasad o następującej sekwencji:
CGCCGAATTCATGCCGCCACAGGAGGTTG
Ilość nici: jedna
Topologia: liniowa
Typ cząsteczki: syntetyczny DNA
Pierwotny organizm źródłowy: człowiek; surowica infekcyjna pod względem potransfuzyjnego zapalenia wątroby typu nie-A nie-B
Bezpośrednie źródło doświadczalne: syntetyzator oligonukleotydowy; oligonukleotyd d92
Cechy: od 1 do 29 zasady homologiczna z zasadami 36 do 64 ujemnej nici JG2 (numer identyfikacyjny sekwencji 3); zasady 57, 58 i 60 zmieniono na w celu wprowadzenia miejsca EcoR1 od 5 do 10 zasady miejsce rozpoznawania EcoR1
168 925
Właściwości: służy jako starter syntezy DNA na dodatniej nici RNA/DNA genomowego dla PT-NANBH i wprowadza miejsce EcoR1 do klonowania.
Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 18
Typ sekwencji: nukleotydowa z odpowiadającym białkiem
Długość sekwencji: 504 pary zasad o sekwencji przedstawionej na fig. 7
Ilość nici: jedna
Topologia: liniowa
Typ cząsteczki: cDNA otrzymany na podstawie genomowego RNA
Pierwotny organizm źródłowy: człowiek; surowica infekcyjna pod względem potransfuzyjnego zapalenia wątroby typu nie-A nie-B
Bezpośrednie źródło doświadczalne: klon 164/137
Cechy: początek poliproteiny PT-NANBH od 308 do 504 bp
Właściwości: prawdopodobnie koduje strukturalne białka wirusa
Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 19 Typ sekwencji: nukleotydowa z odpowiadającym białkiem Długość sekwencji: 1107 par zasad o sekwencji przedstawionej na fig. 8 Ilość nici: jedna
Topologia: liniowa
Typ cząsteczki: cDNA otrzymany na podstawie genomowego RNA
Pierwotny organizm źródłowy: człowiek; surowica infekcyjna pod względem potransfuzyjnego zapalenia wątroby typu nie-A nie-B
Bezpośrednie źródło doświadczalne: klon 136/155 Cechy: część poliproteiny PT-NANBH od 1 do 1107 bp Właściwości: prawdopodobnie koduje białka strukturalne wirusa
Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 20 Typ sekwencji: nukleotydowa z odpowiadającym białkiem Długość sekwencji: 2043 par zasad o sekwencji przedstawionej na fig. 9 Ilość nici: jedna
Topologia: liniowa
Typ cząsteczki: cDNA otrzymany na podstawie genomowego RNA Pierwotny organizm źródłowy: człowiek; surowica infekcyjna pod względem potransfuzyjnego zapalenia wątroby typu nie-A nie-B
Bezpośrednie źródło doświadczalne: klon 156/92 Cechy: część poliproteiny PT-NANBH od 1 do 2043 bp Właściwości: prawdopodobnie koduje wirusowe białka niestrukturalne
Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 21
Typ sekwencji: nukleotydowa z odpowiadającym białkiem
Długość sekwencji: 2116 par zasad o sekwencji przedstawionej na fig. 10
Ilość nici: jedna
Topologia: liniowa
Typ cząsteczki: cDNA otrzymany na podstawie genomowego RNA Pierwotny organizm źródłowy: człowiek; surowica infekcyjna pod względem potransfuzyjnego zapalenia wątroby typu nie-A nie-B
Bezpośrednie źródło doświadczalne: przylegające sekwencje tworzone przez klony cDNA z końca 5' genomu
Cechy: początek poliproteiny PT-NANBH od 308 do 2116 bp Właściwości: wirusowe białka strukturalne i nie strukturalne
Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 22
Typ sekwencji: nukleotydowa z odpowiadającym białkiem
168 925
Długość sekwencji: 3750 par zasad o sekwencji przedstawionej na fig. 11 Ilość nici: jedna Topologia: liniowa
Typ cząsteczki: cDNA otrzymany na podstawie genomowego RNA
Pierwotny organizm źródłowy: człowiek; surowica infekcyjna pod względem potransfuzyjnego zapalenia wątroby typu nie-A nie-B
Bezpośrednie źródło doświadczalne: przylegające sekwencje tworzone przez klony cDNA z końca 3' genomu
Cechy: część poliproteiny PT-NANBH od 1 do 3750 bp Właściwości: wirusowe białka niestrukturalne
Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 23
Typ sekwencji: nukleotydowa
Długość sekwencji: 23 zasady o następującej sekwencji:
CGGGTTTAACATTACGGATTTCC
Ilość nici: jedna
Topologia: liniowa
Typ cząsteczki: syntetyczny DNA
Pierwotny organizm źródłowy: bakulowirus: wirus jądrowej poliedrozy Autographa californica (AcNPV)
Bezpośrednie źródło doświadczalne: syntetyzator oligonukleotydowy; oligonukleotyd d24
Cechy: od 1 do 23 zasady homologiczna z częścią genu poliedryny AcNPV położoną w kierunku zgodnym z kierunkiem transkrypcji w stosunku do miejsca klonowania BamH1 w pAc360 i podobnych wektorach
Właściwości: służy jako starter syntezy DNA z sekwencji bakulowirusowego wektora transferowego flankującej DNA wstawiony w miejscu BamH1
Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 24
Typ sekwencji: nukleotydowa
Długość sekwencji: 31 zasad o sekwencji przedstawionej na fig. 12.
Ilość nici: jedna
Topologia: liniowa
Typ cząsteczki: syntetyczny DNA
Pierwotny organizm źródłowy: bakulowirus: wirus jądrowej poliedrozy Autographa californica (AcNPV)
Bezpośrednie źródło doświadczalne: syntetyzator oligonukleotydowy; oligonukleotyd dl26
Cechy: od 1do 31 zasady homologiczna z podłożoną przeciwnie do kierunku transkrypcji sekwencją łączącą otrzymywaną gdy cDNA zamplifikowany przez d75 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 5) klonowana jest w miejscu klonowania BamH1 w pAc360 i podobnych wektorach; zmiany w zasadach 13 i 14 wprowadzają miejsce Pstl od 1 do 10 zasady homologiczna z regionem miejsca BamH1 w pAc350 i podobnych wektorach od 4 do 9 zasady miejsce BamH1 od 12 do 17 zasady miejsce Pst1
Właściwości: służy jako starter syntezy DNA przy połączeniu sekwencji bakulowirusowego wektora transferowego i sekwencji uprzednio zamplifikowanej przez oligonukleotyd d75; wprowadza miejsce rozpoznawane przez Pst1 do późni^eszego klonowania
Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 25
Typ sekwencji: nukleotydowa
Długość sekwencji: 45 zasad o sekwencji przedstawionej na fig. 13
Ilość mci: jedna
Topologia: liniowa
168 925
Typ cząsteczki: syntetyczny DNA
Pierwotny organizm źródłowy: N/A
Bezpośrednie źródło doświadczalne: syntetyzator ellgonukloetydewy; ellgonuklootyd dl32
Cechy: od 5 do 10 zasady miejsce rozpoznawane przez Pst1 od 13 do 27 zasady łącznik kodujący pięć reszt lizyny od 28 do 45 zasady homologiczna z zasadami 4 do 21 BR11 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 7)
Właściwości: służy jako starter syntezy DNA przy końcu 5' BR11 i wprowadza syntetyczną sekwencję kodującą pięć reszt lizyny, jak również miejsce rozpoznawane przez Pst do późniejszego klonowania.
pDXII9
Fig. 1 pDXII8
A AA
BamHI Sali BamHI
AA A
BamHI Sali BamHI
I
750bp
I !350bp
A A BamHI Sali
A
Sali ▲
BamHI pDXI22
A A
BamHI Sali
NANBH ▲
BamHI
168 925
Fig. 2
BamHI Pstl Pstl 1 1 1 Ba mHI
1 DXII9 *-| C, BRII 0X143 (BHC-10)
ValSerAlaGluPheArg lambda
BamHI Pstl
Pstl
BamHI
DXI19
LYS-LYS-LYS-LYS-LYS
BRII
DXI36(BHC-II)
Va I Ly s Lys Lys Lys Lys
Fig. 3.
SEQ. ID N0.2K2II6 bps)
Ncol,49 1 Kpnl,546 I Ciał,674 1 1 BamHI, 1323 | Ncol,l395 Narl,l874
|-1-i-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-r
500 1000 1500 2000
J L,, I ,,,I, I
SEQ. ID No. 22 (3756 bas)
Pstl 535 l EcoRI 1687 1 Sali HindIII 2407 2827 1 l Pstl 34j85
f i—r ι | ι i 500 i · 1 ' Γ |“F 1000 1500 2000 , , , , I -τ I F , 2500 3000 I 1 1 1_1—1 J 1 L T,.γ-T—r- 3500 -^χ.Ι.α a.
168 925
CAA AAT CAC TTC CCA Pro 5 GAC GCT CAC CTC ATC CAC CCC AAC CTC CTG TCC 48
Gln Asn Asp Phe Asp Ala Asp Leu Ile 10 Glu Ala Asn Leu Leu 15 Trp
CGG CAT GAG ATG GGC GGG GAC ATT ACC CGC GTG GAG TCA GAG AAC AAG 96
Arg His Glu Met Cly Gly Asp Ile Thr. Arg Val Glu Ser Glu Asn Lys
20 25 30
GTA GTA ATC CTC GAC TCT TTC GAC CCG CTC CGA GCG GAG GAG GAT GAG 144
Val Val Ile Leu Asp Ser Phe Asp Pro Leu Arg Ala Glu Glu Asp Glu
35 40 45
CGG CAA CTC TCC CTC CCG CCG GAG ATC CTG CGC AAA TCC AAC AAA TTC 192
Arg Glu Val Ser Val Pro Ala Glu He Leu Arg Lys Ser Lys Lys Phe
50 55 60
F/σ. 4 (1)
168 925
CCA Pro 65 - -A Pro C SC A i u A · < Me: CCC CCA Pro Ala 70 i ον Irp w Ala CCC CCC GAT TAC AAC CCT CCG Pro CTG Leu 80 24C
Arg Pro Asp 75 Tyr Asn Pro
CTC GAG TCC TGG AAC GCC CCG GAC TAC CTC CCT CCA GTG GTA CAT GGG 288
Leu Glu Ser Trp Lys Ala Pro Asp Tyr Val Pro Pro Val Val His Gly
85 90 95
TGC CCA CTG CCA CCT ACT AAG ACC CCT CCT ATA CCA CCT CCA CGG AGA 336
cys Pro Leu Pro Pro Thr Lys Thr Pro Pro Ile Pro Pro Pro Arg Arg
100 105 110
AAC AGG ACA GTT GTT CTG ACA CAA TCC ACC GTC TCT TCT GCC CTG GGG 384
Lys Arg Thr Val Val Leu Thr Glu Ser Thr Val Sar Ser Ala Leu Ala
115 120 125
GAG CTT GCC ACA AAG CCT TTT GGT AGC TCC GGA CCG TCG GCC CTC GAC 432
Glu Leu Ala Thr Lys Ala Phe Gly Ser Ser Gly Pro Ser Ala Val Asp
130 135 140
AGC GGC ACG GCA ACC GCC CCT CCT CAC CAA TCC TCC GAC GAC GGC GGA 480
Ser ciy Thr Ala Thr Ala Pro Pro Asp Gln Ser Ser Asp Asp Gly Gly
145 150 155 160
GCA GGA TCT GAC GTT CAG TCG TAT TCC TCC ATG CCC CCC CTT GAG GGG 528
Ala Gly Ser Asp Val Glu Ser Tyr Ser Ser Mec Pro Pro Leu Glu Gly
165 170 175
GAG CCG GGG GAC CCC CAT CTC AGC GAC GGG TCT TGG TCT ACC CTG AGT 576
Glu Pro Gly Asp Pro Asp Leu Ser Asp Cly Ser Trp Ser Thr Val Ser
180 185 190
GAG GAG GCC GGT GAG GAC GTC GTC TGC TGC TCG ATG TCC TAC ACA TGG 624
Glu Glu Ala Gly Glu Asp Vol Val Cys Cys Ser Met Ser Tyr Thr Trp
195 200
205
168 925
ACń Thr CCC Gly 210 C L'7 Ala /-·*· - Leu ATC Ile AvC Tnr Pro 215 * V ~ Cys Ala GCG -.la CAG Glu Glu 220 Ser AAC Lys CTG Leu CCC Pro 0 < «-
ATC AAC ccc TTC ACC AAC TCT TTC CTC CCT CAC CAC AAC ATC CTC TAC 720
Ile Asn Ala Leu Ser Asn Ser Leu Leu Arg His His Asn Mec Val Tyr
225 230 235 240
CCT ACC ACA TCC CCC ACC CCA ACC CAC CCC CAC AAC AAC GTC ACC TTT 768
Ala Thr Thr Ser Arg Ser Ala Ser Gin -rg Gin Lys Lys Val Thr Phe
245 250 255
GAC AGA CTG CAA ATC CTG GAC CAT CAC TAC CAG GAC CTG CTC AAC GAG 816
Asp Arg Leu Gin Ile Leu Asp Asp His Tyr Gin Asp Val Leu Lys Clu
260 265 270
ATG AAG GCG AAG GCG TCC ACA GTT AAG GCT AAG CTT CTA TCA CTA CAG 864
Met Lys Ala Lys Ala Ser Thr Val Lys Ala Lys Leu Leu Ser Val Glu
275 280 285
GAA CCC TGC AAC CTC ACC CCC CCA CAT TCC GCC AAA TCT AAA TTT CCC 912
Glu Ala Cys Lys Leu Thr Pro Pro His Ser Ala Lys Ser Lys Phe Gly
290 295 300
TAT GGG GCA AAG GAC CTC CCG AAC CTA TCC ACC AAG GCC ATT AAC CAC 960
Tyr Gly Ala Lys Asp Val Arg Asn Leu Ser Ser Lys Ala Ile Asn His
305 310 315 320
ATC CCC TCC CTC TCC CAG GAC TTC TTC CAA CAC ACT CAA ACA CCA ATT 1008
Ile Arg Ser Val Trp Clu Asp Leu Leu Clu Asp Thr Clu Thr Pro Ile
325 330 335
GAC ACC ACC ATC ATG CCA AAA AAT CAC CTT TTC TCC GTC CAA CCA CAC 1056
Asp Thr Thr Ile Mec Ala Lys Asn Clu Val Phe Cys Val Cln Pro Clu
340 345 350
Fig. 4 (3)
168 925
110-
AC.··. Arg C.jA Gly CCC Cly 355 CCC Arg AAC Lys CCA Pro W V· . Ala — Arg 360 CTT Leu AT C Ile G 4 \j Val Phe CCA Pro 365 CAu Asp * * V Leu GGG Cly
GTC CCT CTC TCC CAC AAA ATG CCC CTC TAT GAC CTC CTC TCC ACC CTC
Val Arg Val Cys Clu Lys Mec Ala Leu Tyr Asp Val Var Ser Thr Leu
370 375 380
CCT CAG CCT CTG ATC CCC TCC TCC TAC CCA TTC CAG TAT TCT CCT GGA
Pro cTn Ala Val Mec Cly Ser Ser Tyr Cly Phe Cln Tyr Ser Pro Cly
385 390 395 400
CAC CCC CTC CAG TTC CTC CTC AAC GCC TGC AAA TCA AAG AAC ACC CCT
Cln Arg Val Clu Phe Leu Val Asn Ala Trp Lys Ser Lys Lys Thr Pro
405 410 415
ATC CCC TTT CCA TAT GAC ACC CCC TCT TTT GAC TCA ACA GTC ACT Gac
Mec Gly Phe Ala Tyr Asp Thr Arg Cys Phe Asp Ser Thr Val Thr Glu
-.20 425 430
AAT CAC ATC CGT GTA GAG GAG TCA ATT TAT CAA TCT TGT GAC TTG GCC
Asn Asp He Arg Val Clu Glu Ser Ile Tyr Gin cys cys Asp Leu Ala
435 440 445
CCC CAA CCC AGA CAG GCC ATA AGG TCG CTC ACA GAG CGG CTT TAT ATC
Pro Clu Ala Arg Cln Ala Ile Arg Ser Leu Thr Glu Arg Leu Tyr Ile
450 455 460
CCC GCT CCC CTC ACT AAT TCA AAA CGG CAG AAC TCC GGC TAT CCC CGG
Cly Gly Pro Leu Thr Asn Ser Lys Cly Cln Asn Cys Cly Tyr Arg Arg
465 470 475 480
TCC CCC CCC ACC CCC CTC CTC ACC ACT AGC TCC GCT AAT ACC CTC ACA
Cys Arg Ala Ser Gly Val Leu Thr Thr Ser Cys Cly Asn Thr Uu Thr
485 490 495
1152
1200
1248
1296
1344
1392
1440
Fig.i li)
1488
168 925
TCT Cys TAC Tyr TTC AAC GCC Ala TCT GCA GCC TGT CGA Arg GCT Ala CCA Ala AAG Lys CTC Leu 510 CAC Gin GAC Asp 1536
Leu Lys 500 Ser Ala Ala Cys 505
TCC ACu A x G CTC CTC TGC CGA GAu. CCC CTT CTC CTT ATC TCT GAG ACC 1584
cys Thr Mec Leu Val Cys Gly Asp Asp Leu Val Val Ile Cys Glu Ser
515 520 525
GCG GGA ACC CAC GAC GAC GCG GCG ACC CTA CGA GTC TTC ACG GAG GCT 1632
Ala Cly Thr Gir. C lu Asp Ala Ala Ser Leu Arg Val Phe Thr Glu Ala
530 535 540
ATG ACT AGG TAC TCT GCC CCC CCC GCG GAC CCG CCC CAA CCA GAA TAC 1680
Mec Thr Arg Tyr Ser Ala Pro Pro Gly Asp Pro Pro Gin Pro Glu Tyr
545 550 555 560
GAC CTG GAG TTC ATA ACA TCA TGC TCC TCC AAT GTG TCG GTC GCG CAC 1728
Asp Leu Glu Leu He Thr Ser Cys Ser Ser Asn Val Ser Val Ala His
565 570 575
GAT GCA TCT GGC AAA AGG GTA TAC TAC CTC ACC CCT GAC CCG 1770
Asp Ala Ser ciy Lys Arg Val Tyr Tyr Leu Thr Arg Asp Pro
580 585 590
Fig. 4 (5)
168 925
ACA Thr GAA Glu CTC Val GAT Asp CCC CTG CCC CTC CAC ACG Arg 10 TAC CCT CCC Pro CCC Ala TCC cys 15 AAA Lys
Gly 5 Val Arg Leu His Tyr Ala
CCT CTC CTA CCG GAG CAG CTC ACA TTC CAG CTC CGC CTC AAC CAA TAC
Pro Leu Leu Arg Glu Clu Val Thr Phe Gin Val Gly Leu Asn Gin Tyr
20 25 30
CTG GTT GGG TCG CAG CTC CCA TGC CAC CCC GAA CCG GAT CTA CCA CTC
Leu Val Cly Ser Gin Leu Pro Cys Clu Pro Glu Pro Asp Val Ala Val
35 40 45
CTC ACT TCC ATG CTC ACC CAC CCC TCC CAC ATC ACA CCA GAC ACG CCT
Leu Thr Ser Mec Leu Thr Asp Pro Ser His Ile Thr Ala Glu Thr Ala
50 55 60
192
Fig .5(1)
168 925
AAC Lys 65 CCC Arg A<»kj Arg CTC Leu CCC Ala AoC Arg 70 CCC C iy TCT Ser W U. Pro Pro TCC Ser 75 -»··»· <·» i i V Leu CCC Ala ACC Ser •r a w a Ser TCA Ser 80 2--
CCT ACC CAC TTC TCT GCC CCT TCC TCC AAC CCC ACA TAC ATT ACC CAA 288
Ala Ser Gln Leu Ser Gly Pro Ser Ser Lys Ala Thr Tyr Ile Thr Cln
85 90 95
AAT CAC TTC CCA GAC CCT GAC CTC ATC CAC CCC AAC CTC CTC TCG CGC 336
Asn Asp Phe Pro Asp Ala Asp Leu Ile Glu Ala Asn Leu Leu Trp Arg
100 105 110
CAT GAG ATG CCC CGG CAC ATT ACC CGC CTC GAG TCA GAG AAC AAC GTA 384
His Glu Met Gly Gly Asp Ile Thr Arg Val Glu Ser Glu Asn Lys Val
115 120 125
GTA ATC CTC GAC TCT TTC CAC CCC CTC CGA GCC GAG GAG CAT GAC CCC 432
Val He Leu Asp Ser Phe Asp Pro Leu Arg Ala Glu Clu Asp Glu Arg
130 135 140
GAA GTC TCC CTC CCC CCC GAG ATC CTC CGC AAA TCC AAC AAA TTC CCA 480
Glu Val Ser Val Pro Ala Glu Ile Leu Arg Lys Ser Lys Lys Phe Pro
145 150 15Ś 160
CCA CCC ATG CCC CCA TCG CCA CGC CCC GAT TAC AAC CCT CCG CTC CTC 528
Pro Ala Met Pro Ala Trp Ala Arg Pro Asp Tyr Asn Pro Pro Leu Leu
165 170 175
GAC TCC TCC AAC GCC CCC GAC TAC GTC CCT CCA GTC CTA CAT CCC TCC 576
Glu Ser Trp Lys Ala Pro Asp Tyr Val Pro Pro Val Val His Gly Cys
130 185 190
CCA CTC CCA CCT ACT AAC ACC CCT CCT ATA CCA CCT CCA CGC ACA AAC 624
Pro Leu Pro Pro Thr Lys Thr Pro Pro Ile Pro Pro Pro Arg Arg Ly·
195 200 205
168 925
* - Arg Aur. Tnr 210 «J i a Val V «. . Yal C i w Leu nLr. Thr GAA <. lu 215 Ser Thr Z~Q TCT •τ* <·-»> Ser 220 U V Ala CTG CCG GAG 672
Val Ser leu Ala Glu
CTT CCC ACA AAC CCT TTT z-*/*·*» w . AGC TCC CGA CCC TCG GCC GTC CAC AGC 720
Leu Ala Thr Lys Ala Phe Cly Ser Ser Cly Pro Ser Ala Val Asp Ser
225 230 235 240
CGC ACC CCA ACC CCC CCT CCT GAC CAA. TCC TCC GAC GAC GCC CGA GCA 768
Gly Thr Ala Thr Ala Pro Pro Asp Gln Ser Ser Asp Asp Gly Gly Ala
245 250 255
GGA TCT GAC GTT CAC TCG TAT TCC TCC ATG CCC CCC CTT GAG GGG GAG 816
Gly Ser Asp Val Glu Ser Tyr Ser Ser Met Pro Pro Leu Glu Gly Glu
260 265 270
CCG GCG CAC CCC GAT CTC ACC CAC GCG TCT TCG TCT ACC CTG AGT GAG 864
Pro Cly Asp Pro Asp Leu Ser Asp Gly Ser Trp Ser Thr Val Ser Glu
275 280 285
GAG GCC GCT GAG GAC CTC CTC TCC TCC TCG ATG TCC TAC ACA TGG ACA 912
Clu Ala Cly Glu Asp Val Val Cys Cys Ser Met Ser Tyr Thr Trp Thr
290 295 300
GGC GCT CTG ATC ACC CCA TGC GCT CCG CAC CAA AGC AAG CTG CCC ATC 960
Cly Ala Leu Ile Thr Pro Cys Ala Ala Glu Glu Ser Lys Leu Pro Ile
305 310 315 320
AAC GCG TTG AGC AAC TCT TTG CTG CC? CAC CAC AAC ATG GTC TAC GCT 1008
Asn Ala Leu Ser Asn Ser Leu Leu Arg Hls His Asn Met Val Tyr Ala
325 330 335
ACC ACA TCC CGC AGC CCA AGC CAG CGG 1035
Thr Thr Ser Arg Ser Ala Ser Gln Arg
340 343
Fi i .5 (3)
168 925
ACA AAA ACC AAA CCT AAC ACC AAC CTC CCC CCA CAG GAC CTC AGC TTC
Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn Leu Arg Pro Gin Asp Val Arg 15 Phe
5 10
CCC CGC GGT CCT CAC ATC CTT CCT GGA CTT TAC CTG TTC CCC CCC ACG
Pro Gly Gly Gly Gin Ile Val Ciy Ciy Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg
20 25 30
GGC CCC AGG TTG CCT CTG CCC CCC ACT ACC AAG ACT TCC CAG CCC TCC
Gly Pro Arg Leu ciy Val Arg Ala Thr Arg Lys Thr Ser Clu Arg Ser
35 40 45
CAA CCT CCT CCA AGC CCA CAA CCT ATC CCC AAC CCT CCC CAG CCC GAC
Gin Pro Arg ciy Arg Arg Cln Pro Ile Pro Lys Ala Arg Gin Pro Glu
50 55 60
144
192
Fig. 6 11)
168 925
\-i \-ł KC i\ ó 5 AGG GCC TGG i r p GCT CAC CCC Pro V» V G l· y TAG Tvr GGT Pro i Uw Trp 75 CCG Pro CTC Leu TAT Tyr CCC Cly AAC Asn 80 240
A - £ Λ X. O Aić Gir 70
CAG ccc ATC CCC TGG CCA GGA TCC CTC CTC TCA CCC CCT GCC TCC CCC 288
Glu Cly Met ciy Trp Ala Cly Trp Leu Leu Ser Pro Arg Cly Ser Arg
85 90 95
CCT AGT TCC CCC CCC ACT CAC CCC CGG CCT AGC TCC CCT AAT TTC CCT 336
Pro Ser Trp Cly Pro Thr Asp Pro Arg Arg Arg Ser Arg Asn Leu Gly
100 105 110
AAA CTC ATC GAT ACC CTC ACA TCC GCC TTC CCC GAC TCT CAT GGG CTA 384
Lys Val Ile Asp Thr Leu Thr cys Cly Phe Ala Asp Ser His Cly Val
115 120 125
CAT TCC CCT CCT CGC CCC TCC CTT AGC CCC CCT CCC ACC CCC CTG CCC 432
His Ser Ala Arg Arg Arg Ser Leu Arg Cly Ala Ala Arg Ala Leu Ala
130 135 140
CAT CCC GTC CCC CTT CTC CAC CAC CCC CTC AAC TAT CCA ACA GCC AAT 480
His ciy Val Arg Val Leu Clu Asp Cly Val Asn Tyr Ala Thr Cly Asn
145 150 155 160
TTA CCC GCT TGC TCT TTC TCT ATC TTC CTC TTG CCT TTG CTC TCC TGT 528
Leu Pro Gly cys Ser Phe Ser Ile Phe Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys
165 170 175
TTG ACC ATT CCA CCT TCC CCT TAT CAA CTC CCC AAC CTC TCC CCC ATC 576
Leu Thr Ile Pro Ala Ser Ala Tyr Clu Val Arg Asn Val Ser Cly Ile
180 185 190
TAC CAT CTC ACC AAC CAT TCC TCC AAC TCA ACC ATC CTC TAC CAC ACA 624
Tyr His Val Thr Asn Asp Cys Ser Asn Ser Ser Ile Val Tyr Clu Thr
195 200 205
Fig. 6 t2)
168 925
CCG Ala CAC Asp 210 ATC Me c ATC Ile ATC CAC ACC CCC CCG TCT CTC CCC TCT GTC Pro Cys Val 220 CCC Arg GAC Glu 672
Mer His Thr 215 Pro Gly Cys Val
GGT AAT TCC TCC CGC TCC TCC CTA CCG CTC ACT CCC ACG CTC CCG CCC 720
Gly Asn Ser Ser Arg cys Trp Val Ala Leu Thr Pro Thr Leu Ala Ala
225 230 235 240
AAG GAC GCC ACC ATC CCC ACT CCG ACA ATA CGA CGC CAC CTC GAT TTC 768
Lys Asp Ala Ser Ile Pro Thr Ala Thr Ile Arg Arg His Val Asp Leu
245 250 255
CTC CTT GGG GCC CCT CCC TTC TCG TCC GCT ATG TAC GTG CGG GAT CTC 816
Leu Val Gly Ala Ala Ala Phe Ser Ser Ala Met Tyr Val Gly Asp Leu
260 265 270
TGC GGA TCT GTT TTC CCG 834
Cys Gly Ser Val Phe Pro
275
Fig. 6 13)
168 925
CAT CACTCC - CTCTCACGAA ctactctctt cacccagaaa CCCTCTACCC ATCCCCTTAC óC'
TATCACTCTC CTCCACCCTo CAGoACCCCo CCTCCCCCCA C Al. ^CaTAGT cgtctccgca 120
ACCGGTGAGT acaccgcaat tcccaggacg ACCGCCTCCT TTCTTCGATT AACCCCCTCA 180
ATCCCTGGAG atttccgcct gcccccccaa CACTCCTAGC CCACTACTGT TCGGTCCCCA 240
AAGCCCTTCT cctactccct GATAGCCTCC TTCCGACTCC CCCCCCAGCT CTCCTAGACC 300
CTGCACC AT G ACC ACC AAT CCT AAA CCT CAA AGA AAA ACC AAA CCT AAC 349
Mec Ser Thr Asn Pro 5 Lys Pro Cln Arg Lys 10 Thr Lys Arg Asn
ACC AAC CCC CCC CCA CAG CAC CTC AAC TTC CCC GCC CCT CCT CAG ATC
Thr Asn Pro Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Cly Cly Cly Cln Ile
15 20 25 30
GTT GCT GGA CTT TAC CTG TTG CCC CGC AGG CGC CCC AGG TTG CGT GTC
Vai ciy g ly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Cly Prc Arg Leu ciy Val
35 40 45
CCC CCC ACT ACC AAC ACT TCC CAG CCG TCG
Arg Ala Thr Arg Lys Thr Ser Clu Arg Ser
50 55
CAA CCT CGT CCA AGG CCA 493 Cln Pro Arg Cly Arg Arg
CAA CCT ATC CC
Cln Pro Ile Pro
65
504
Fig. 7
168 925
TCC TCC CCC Arg TCC Cys TCC Trp 5 CTA Val CCC Ala CTC ACT CCC ACC Thr CTC CCC CCC AAC CAC 48
Ser Ser Leu Thr Pro 10 Leu Ala Ala Lys 15 Asp
GCC AGC ATC CCC ACT CCC ACA ATA CGA CGC CAC GTC GAT TTG CTC CTT 96
Ala Ser Ile Pro Thr Ala Thr Ile Arg Arg His Val Asp Leu Leu Val
20 25 30
GGG GCG GCT GCC TTC TGC TCC GCT ATG TAC GTG GGG GAT CTC TGC CGA 144
ciy Ala Ala Ala Phe Cys Ser Ala Met Tyr Val Gly Asp Leu cys Cly
35 40 45
TCT GTT TTC CTC GTC TCT CAC CTG TTC ACC TTC TCG CCT CGC CGA CAT 192
Ser Val Phe Leu Val Ser Cln Leu Phe Thr Phe Ser Pro Arg Arg His
50 55 60
Fig .8(1)
168 925
C-.G Gir. 65 ACC CTA νλν Gin GAC Asp TCC Cys 70 AA. Asr TGT Cys τ ca Ser ATC Iie TAT Tyr 75 CCC Pro GG Z Gly CAC His CTA Val TCA Ser 80 240
Tnr Val
CCT CAC CCC ATG CCT TCG GAT ATC ATC ATC AAC TCC TCA CCT ACA CCA 288
Ciy His Arg Me t Ala Trp Asp Me c Me c Me t Asn Trp Ser Pro Thr Ala
85 90 95
GCC CTA GTG CTA TCC CAG CTA CTC CGC ATC CCA CAA GCT GTC GTG GAC 336
Ala Leu Val Val Ser Gin Leu Leu Arg Ile Pro Gin Ala Val Val Asp
100 105 110
ATG GTG CCG GCG CCC CAC TCG CCA GTC CTG GCG CGC CTT ccc TAC TAT 384
Met Val Ala Gly Ala His Trp Gly Val Leu Ala Gly Leu Ala Tyr Tyr
115 120 125
TCC ATG GTC GGG AAC TCC CCT AAC CTC TTC GTT CTC ATG CTA CTC TTT 432
Ser Met Val Gly Asn Trp Ala Lys Val Leu Val Val Met Leu Leu Phe
130 135 140
CCC CCC CTT CAC CCC CAA CCT Tac ACG ACA CCC CCC ACA CAC GGC CCC 480
Ala Gly Val Asp Gly Glu Pro Tyr Thr Thr Gly Gly Thr His ciy Arg
145 150 155 160
CCC GCC CAC CGC CTT ACA TCC CTC TTC ACA CCT GGG CCG GCT CAG AAA 528
Ala Ala His Gly Leu Thr Ser Leu Phe Thr Pro Gly Pro Ala Cln Lys
165 170 175
ATC CAC ςττ CTA AAC ACC AAC GCC ACC TCC CAC ATC AAC ACA ACT GCC 576
Ile Cln Leu Val Asn Thr Asn Ciy Ser Trp His Ile Asn Arg Thr Ala
180 185 190
TTC AAC TCC AAT CAC TCC CTC CAA ACT CCG TTC CTT GCC GCC CTC TTC 624
Leu Asn Cys Asn Asp Ser Leu Cln Thr Ciy Phe Leu Ala Ala Leu Phe
195 200 205
Fig . 8 (2)
168 925
TAC Tyr ACG Thr 210 His Arg Pne AAT Asn CCC Ala 215 TCC Ser /-» z-> . UO. Giy X * cys X o.~. Ser vAC Glu 220 cc: Arg ATC i'.e t CCS Ala ag : Ser £72
TCC CGC CCC ATT CAC CAC TTC CAT CAG GGC TGG GGT CCC ATC ACT TAT 720
Cys Arg Pro Ile Asp Cln Phe Asp Cln Gly Trp Gly Pro Ile Thr Tyr
225 230 235 240
AAT CAC TCC CAC CCC TTC CAC CAC AGC CCC TAT TCC TGG CAC TAC GCA 768
Asn Clu Ser His Gly Leu Asp Cln Arg Pro Tyr cys Trp His Tyr Ala
245 250 255
CCT CAA CCG TGT GCT ATC GTC CCC CCC TTG CAG CTC TGT GGC CCA GTG 816
Pro Glu Pro Cys Gly Ile Val Pro Ala Leu Gin Val cys Gly Pro Val
260 265 270
TAC TCT TTC ACT CCA AGC CCT CTT CTC CTC GCG ACC ACC GAT CGT TTC 864
Tyr Cys Phe Thr Pro Ser Pro Val Val Val Gly Thr Thr Asp Arg Phe
275 280 285
GCC CCC CCT ACC TAC AGA TCC CCT CAC AAT GAC ACC CAC GTC CTG CTT 912
G-ly Ala Pro Thr Tyr Arg Trp Cly Glu Asn Clu Thr Asp Val Leu Leu
290 295 300
CTC AAC AAC ACG CGG CCC CCA CGC GGC AAC TGG TTC GCC TCT ACA TGG 960
Leu Asn Asn Thr Arg Pro Pro Arg Gly Asn Trp Phe ciy cys Thr Trp
305 310 315 320
ATG AAT AGC ACC GGC TTC ACC AAC ACG TGT GCG GGC CCC CCG TCC AAC 1008
Met Asn Ser Thr Gly Phe Thr Lys Thr Cys Gly Cly Pro Pro Cys Asn
325 330 335
ATC GCC GCC CTC GCC AAC AAC ACT TTC· ATC TCC CCC ACC CAC TCC TTC 1056
Ile Gly Gly Val ciy Asn Asn Thr Leu Ile Cys Pro Thr Asp Cys Phs
340 345 350
Fig .8 (31
lGo AAG CAT CCC Ga v U L· l. act tac acc AAA TGC C-CT οστ- CCT TGC
Arg Lvs His Pro Glu Ais Thr Tyr Thr Lys cys Cxy Ser ά ly Pro Trp
355 360 365
HO4
TTC
1107
Leu
Fig .8(4)
TCC Trp Gac Clu ccc C i\ CTC TTC AuA Thr CCC Cly CTC ACC Leu Thr CAC CTC GAT Asp GCC Ala CAC His TTC Phe 15 CTC Leu
Val Phe 5 His 10 Val
TCC CAA ACA AAC CAC CCA GGA CAC AAC TTC CCC TAC CTC GTC CCG TAC
Ser Gir. Thr Lys Cln Ala Cly Asp Asn Phe Pro Tyr Leu Val Ala Tyr
20 25 30
CAG GCT ACT GTC TGC CCT ACC CCC CAG CCC CCA CCT CCA TCA TGG GAT
Gln Ala Thr Val Cys Ala Arg Ala Cln Ala Pro Pro Pro Ser Trp Asp
35 40 45
CAA ATG TGG AAG TCT CTC ATA CGC CTA AAG CCT ACT CTC CCC GCG CCA
Cln Mec Trp Lys Cys Leu Ile Arg Leu Lys Pro Thr Leu Arg Gly Pro.
50 55 60
144
192
Fig. 9 (1)
168 925
ACA Tnr 65 CCC Pro TTG Leu CTG Leu TA ł Tyr ACC 70 CCA GCC C1C Yal Cln 75 Αλ w C.~»G GTC Yal ACC Tnr CTC Leu 80 2*·ύ
Leu G ly Alu Asn Clu
ACA CAC CCC ATA ACC AAA TTC ATC ATC GCA TCC ATG TCA CCC GAC CTC 288
Tnr His Pro Ile Thr Lys Phe Ile Met Ala cys Met Ser Ala Asp Leu
8 5 90 95
CAG CTC CTC ACG AGC ACC TCG CTC CTG CTC GGC GGG GTC CTT CCA CCT 336
Clu Val Val Thr Ser Thr Trp Val Leu Val Cly Gly Val Leu Ala Ala
100 105 110
CTG GCT GCC TAT TGC TTC ACA ACA CCC AGC GTC GTC ATT GTC GGT AGC 384
Leu Ala Ala Tyr Cys Leu Thr Thr Cly Ser Val Val Ile Val Gly Arg
115 120 125
ATC ATC TTC TCC CCC CGC CCC GCT ATT CTT CCC GAC ACC CAA GTC CTC 432
Ile Ile Leu Ser Cly Arg Pro Ala Ile Yal Pro Asp Arg Clu Val Leu
130 135 140
TAC CAG GAC TTC GAT CAC ATG GAA CAG TCC CCC TCC CAC CTC CCT TAC 480
Tyr Gln Clu Phe Asp Clu Met Clu Glu Cys Ala Ser His Leu Pro Tyr
145 150 155 160
ATC GAC CAG CGA ATC CAC CTC CCC GAG CAC TTC AAC CAA AAA CCC CTC 528
Ile Glu Gln Gly Met Cln Leu Ala Clu Gln Phe Lys Gln Lys Ala Leu
165 170 175
GGG TTG CTG CAG ACA CCC ACC AAC CAA CCC CAG GCC CCT GCT CCC GTC 576
ciy Leu Leu Gln Thr Ala Thr Lys Gln Ala Clu Ala Ala Ala Pro Val
180 185 190
GTC CAC TCC AAC TGC CCA CCC CTT CAG ACC TTC TGC GCC AAA CAC ATC 624
Yal Glu Ser Lys Trp Arg Ala Leu Glu Thr Phe Trp Ala Ly» Hit Met
195 200 205
Fig . 9 121
168 925
TGG Trp AAC Asn 210 TTC Pne ATG Ile ACC Ser GGG Gly ATA Ile 215 CAG Gin TAC Tyr TT? Leu CCr, Ala G vC Ciy 220 TTG Leu TCG Ser AC A Thr *-> w IV Leu 672
CCT CCC AAT CCC GCC ATT CCA TCA CTC ATC CCC TTC ACA CCC TCT CTC 720
Pro Gly Asn Pro Ala Ile Ala Ser Leu Mec Ala Phe Thr Ala Ser Val
225 230 235 240
ACT CCC CTC ACC ACC CAA TCT ACC CTC CTC CTT AAC ATC CTC GGC 768
Thr Ser Pro Leu Thr Thr Cln Ser Thr Leu Leu Leu Asn Ile Leu Gly
245 250 255
CGA TGG CTA GCC CCC CAA CTC CCT CCC CCC AGT CCT GCT TCA CCT TTC 816
Gly Trp Val Ala Ala Cln Leu Ala Pro Pro Ser Ala Ala Ser Ala Phe
260 265 270
GTA GGC CCC CCC ATT CCT CCT CCC GCT CTT GCC AGC ATA GGC CTT GCC 864
Val Gly Ala ciy Ile Ala ciy Ala Ala Val Cly Ser Ile Gly Leu Cly
275 280 285
aag GTG CTT CTC GAC ATC TTC CCC CCC TAT GCA CCA CCA CTG GCA GGC 912
Lys Va 1 Leu Val Asp Ile Leu Ala Gly Tyr Gly Ala Cly Val Ala Gly
290 295 300
GCG CTC CTC GCC TTT AAC GTC ATG AGC GGC CAA ATG CCC TCC ACC GAG 960
Ala Leu Val Ala Phe Lys Val Met Ser Cly Clu Met Pro Ser Thr Clu
305 310 315 320
GAC CTC CTT AAC TTA CTC CCT GCC ATC CTC TCT CCT CGT GCC CTG CTC 1008
Asp Leu Val Asn Leu Leu Pro Ala Ile Leu Ser Pro Cly Ala Leu Val
325 330 335
GTC GCC CTC CTG TCC CCA CCG ATA CTG CGT CCG CAC CTG GGT CCA GCC 1056
Val Gly Val Val Cys Ala Ala Ile Leu Arg Arg His Val Cly Pro Cly
340 345 350
Fig. 9 (3)
168 925
GAG Glu GGG Cly GCT ALa 355 CTC Val Cln TGG Trp ΛιG AAC Mec Asn 360 CCG Arg C i. G Leu ATA Ile CCG Ala iTo GoG Phe Ala 365 i w Ser CGG Arg 113-
CCT AAC CAT GTT TCC CCC ACG CAC TAT CTC CCA CAG AGC GAC GCC GCA 1152
C 1\ Asn His Val Ser Pro Thr His Tyr Val Pro Glu Ser Asp Ala Ala
370 375 380
CCA CCT CTC ACT CAC ATC CTC TCC GAC CTT ACT ATC ACC CAA CTC TTC 1200
Ala Arg Val Thr Gln Ile Leu Ser Asp Leu Thr Ile Thr Gln Leu Leu
385 390 395 400
AAC AGC CTC CAC CAG TGG ATT AAC GAG GAC TCC TCC ACG CCC TGC TCC 1248
Lys Arg Leu His Gln Trp Ile Asn Glu Asp cys Ser Thr Pro Cys Ser
405 410 415
GGC TCC TCC CTA AGC CAT CTT TCC GAC TCC ATA TCC ACA GTT TTG GCT 1296
Cly Ser Trp Leu Arg Asp Val Trp Asp Trp Ile cys Thr Val Leu Ala
420 425 430
CAC TTC AAC ACC TCC CTC CAC TCC AAC CTC CTC CCC CCA TTA CCC GCA 1344
Asp Phe Lys Thr Trp Leu Gln Ser Lys Leu Leu Pro Arg Leu Pro Cly
435 440 445
CTC CCC TTT TTC TCA TGC CAA CGT CGC TAC AAG GGG GTC TGG CGG GGA 1392
Val Pro Phe Phe Ser Cys Gln Arg Cly Tyr Lys Gly Val Trp Arg Gly
450 455 460
GAC GGC ATC ATC CAC ACC ACC TGC TCA TGT GGA CCA CAC ATC ACC GGA 1440
Asp Cly Ile Mec Cln Thr Thr Cys Ser cys Gly Ala Cln Ile Thr Cly
465 470 475 480
CAT GTC AAA AAC GCT TCC ATG ACC ATC GTT GGG CCT AAG ACC TGT ACT 1488
His Val Lys Asn Cly Ser Met Arg Ile Val Cly Pro Lys Thr Cys Ser
485 490 495
Fig .9 Ul
168 925
AAC Asr. ATG TCG C-.T his 500 G-GA a C - ΐ\ C Pne CCC Pro ATC Σ ie 505 AAC Asr. CCA TAC ACC ACC CCC CCC
Me: “ “· . Gly « · « - A.S Tyr T r. V 510 Ciy Prc
TCC ACC ccc TCC CCA CCG C vA AAC TAT TCC ACC CCC CTC TCC CCC CTC 1584
Cys Thr Pro Ser Pro Ala Pro Asp. Tyr Ser Arę Ara Leu Trp Arg Val
515 520 525
CCT GCT GAG CAC TAC CTC CAC CTT ACG CGC CTC CGG GAT TTC CAC TAC 1632
Ala Ala Clu Clu Tyr Val Clu Val Thr Arg Val Gly Asp Phe His Tyr
530 535 540
GTC ACG AGC ATG ACC ACT GAC AAC CTA AAA TGC CCC TGC CAG GTT CCA 1680
Vai Thr Ser Mec Thr Thr Asp Asn Val Lys cys Pro cys Gin Val Pro
545 550 555 560
GCC CCC CAA TTC TTC ACA CAA CTC GAT GCC CTC CCG CTG CAC ACC TAC 1728
Ala Pro Glu Phe Phe Thr Clu Val Asp Gly Val Arg Leu His Arg Tyr
565 570 575
GCT CCG GCG TCC AAA CCT CTC CTA CCC GAG CAC CTC ACA TTC CAG CTC 1776
Ala Pro Ala Cys Lys Pro Leu Leu Arg Glu Glu Val Thr Phe Gin Val
580 585 590
GGG CTC AAC CAA TAC CTG CTT GCC TCG CAG CTC CCA TGC GAG CCC GAA 1824
Gly Leu Asn Gin Tyr Leu Val Gly Ser Gin Leu Pro cys Clu Pro Glu
595 600 605
CCC CAT CTA GCA GTC CTC ACT TCC ATC CTC ACC CAC CCC TCC CAC ATC 1872
Pro Asp Val Ala Val Leu Thr Ser Mec Leu Thr Asp Pro Ser His Ile
610 615 620
ACA CCA CAG ACC CCT AAG CCC ACC CTC CCC ACC CCC TCT CCC CCC TCC 1920
Thr Ala Clu Thr Ala Lys Arg Arg Leu Ala Arg Ciy Ser Pro Pro Ser
625 630 635 640
Fig. 9 (5)
168 925
TTG CCC TCT TCA GC.T AuC CAS TTC TCT Γ'Γ·/’ V u»v L· w 1 TCC TCG AAG GCG 1968
Leu Ala Ser Ser Ser Ala Ser Gin Leu Ser Ala Pro Ser Ser Lys Ala
645 650 655
ACA TAC ATT ACC CAA AAT CAC TTC CCA GAC CCT GAC CTC ATC GAC GCC 2016
Thr Tyr I ie Thr Gin Asn Asp Phe Pro Asp Ala Asp Leu Ile Clu Ala
660 665 670
AAC CTC CTG TCC CCC CAT CAC ATC CGC 2043
Asn Leu Leu Trp Arg His Glu Met Gly
675 680
Fig . 9 (6)
168 925
GATCACTCCC CTGTGAGGAA CTACTGTCTT TATCACTCTC GTCCACCCTC CAGCACCCCC ACCCCTGACT ACACCCCAAT TCCCACGACC ATGCCTGGAG ATTTGGGCGT GCCCCCGCAA AAGGCCTTGT GGTACTGCCT GATAGGGTGC
CACGCAGAAA GCGTCTaGCC ATGGCGTTAC 60 CCTCCCCCGA CAGCCATAGT GGTCTGCCCA 120 ACCCGGTCCT TTCTTGGATT AACCCGCTCA 180 GACTGCTAGC CGACTAGTGT TGGGTCCCGA 240 TTGCGAGTGC CCCGGGAGGT CTCGTAGACC 300
GTGCACC ATG AGC ACC AAT CCT AAA
Met Ser Thr Asn Pro 5 Lys
ACC AAC CGC CGC CCA CAG GAC GTC
Thr Asn Pro Arg Pro Gln Asp Val
15 20
CTT CCT CGA GTT TAC CTC TTC CCG
Val Gly Gly Val Tyr 35 Leu Leu Pro
CCT CAA Pro Gln AGA Arg AAA Lys 10 ACC AAA CCT AAC 349
Thr Lys Arg Asn
AAG TTC CCG GGC CGT CGT CAG ATC 397
Lys Phe Pro Cly Cly Gly Cln Ile
25 30
CGC AGC CCC CCC AGC TTC CCT CTC 445
Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val
40 45
F ig .10 (1)
168 925
CGC Arg GCG ACT Thr AGC AAG ACT TCC Ser CAG CCS Arg 55 TCG CAA CCT CGT Arg GGA AGG CGA Arg 4 51
Arg 50 Lvs Ser Gir. Pro Cly 60 Arg
CAA CCT ATC CCC AAG CCT CCC CAC CCC GAG CGC ACC CCC TCG CCT CAC 541
Gin Pro Ile Pro Lys Ala Arg Gin Pro Clu Gly Arg Ala Trp Ala Gin
65 70 75
CCC z-'/*'kJ w TAC CCT TCC nv S* W CTC τ* τ ΙΛ i GCC AAC CAC CCC ATG CCG TCG CCA 58S
Pro Cly Tyr Pro Trp Pro Leu Tyr Cly Asn Clu Gly Met Cly Trp Ala
80 85 90
CCA TCG CTC CTC TCA CCC CCT CCC TCC ccc CCT AGT TGC CCC CCC ACT 637
Cly Trp Leu Leu Ser Pco Arg Cly Ser Arg Pro Ser Trp Cly Pro Thr
100 105 110 115
GAC CCC CGG CCT ACC TCG CCT AAT TTC GGT AAA GTC ATC GAT ACC CTC 685
Asp Pro Arg Arg Arg Ser Arg Asn Leu Cly Lys Val Ile Asp Thr Leu
120 125 130
ACA TCC GGC TTC GCC CAC CTC ATC GCG TAC ATT CCC CTC GTC CGC GCT 733
Thr cys Cly Phe Ala Asp Leu Męt Gly Tyr Ile Pro Leu Val Gly Ala
135 luO 145
CCC TTA CCG CGC CCT CCC ACC CCC CTG CCC CAT CCC CTC CCC CTT CTG 781
Pro Leu Gly Gly Ala Ala Arg Ala Leu Ala His Cly Val Arg Val Leu
150 155 160
GAC GAC ccc CTG AAC TAT CCA ACA GGC AAT TTA CCC CCT TGC TCT TTC 829
Glu Asp Gly Val Asn Tyr Ala Thr Cly Asn Leu Pro Cly Cys Ser Phe
165 170 175
TCT ATC TTC CTC TTG CCT TTC CTC TCC TCT TTC ACC ATT CCA GCT TCC 877
Ser Ile Phe Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys Leu Thr Ile Pro Ala Ser
180 185 190 195
Fig . 10 (2)
168 925
GCT TAT GAA GTG CGC Arr 200 AAC CTG Asn Val TCC GGG ATC TAC CAT CTC ACC AAC GAT 925
ALa. Tyr Glu Val Ser Ciy Ile 205 Tyr His Val Thr Asn Asp 210
TCC TCC AAC TCA ACC * ·τ» rrs l V/ CTC TAC CAC ACA CCC CAC ATC ATC ATC CAC 973
C/s Ser Asn Ser Ser Ile Val Tyr Glu Thr Ala Asp Mec Ile Mec His
215 220 225
ACC CCC CCC TCT CTC CCC TCT CTC CCC CAG CCT AAT TCC TCC CGC TCC 1021
Thr Pro Ciy Cys Vai Pro Cys Val Arg Clu Gly Asn Ser Ser Arg Cys
230 235 240
TGG GTA GCG CTC ACT CCC ACC CTC CCG CCC AAG GAC CCC AGC ATC CCC 1069
Trp Val Ala Leu Thr Pro Thr Leu Ala Ala Lys Asp Ala Ser Ile Pro
245 250 255
ACT CCC ACA ATA CGA CGC CAC GTC GAT TTG CTC CTT GGC GCG GCT CCC 1117
Thr Ala Thr Ile Arg Arg His Val Asp Leu Leu Val Gly Ala Ala Ala
260 265 270 275
TTC TGC TCC CCT ATC TAC GTG CGG GAT CTC TGC CCA TCT GTT TTC CTC 1165
Phe Cys Ser Ala Met Tyr Val Gly Asp Leu cys Gly Ser Val Phe Leu
280 285 290
GTC TCT CAG CTG TTC ACC TTC TCC CCT CGC CCA CAT CAG ACG GTA CAG 1213
Val Ser Cln Leu Phe Thr Phe Ser Pro Arg Arg His Gin Thr Val Gin
295 300 305
CAC TGC AAT TGT TCA ATC TAT CCC GCC CAC CTA TCA GGT CAC CGC ATC 1261
Asp Cys Asn Cys Ser Ile Tyr Pro Ciy His Val Ser Gly His Arg Mec
310 315 320
CCT TCG GAT ATC ATC ATC AAC TCC TCA CCT ACA GCA GCC CTA CTG GTA 1309
Ala Trp Asp Mec Mec Mec Asn Trp Ser Pro Thr Ala Ala Leu Val Vel
325 330 335
Fig- U (3)
168 925
i CC Ser 340 Cln CTA Leu CTC Leu CGC ATC CCA Pro CAA Gin GCT Ala GTC Val CTC CAC ATC CTC GCC GCC 1357
Arg Ile 34 5 Val 350 Asp Me C Val Ala Cly 355
GCC CAC TGG GGA CTC CTC CCC CCC CTT GCC TAC TAT TCC ATC GTG GGG 1405
Ais His Trp Cly Val Leu Ala Cly Leu Ala Tyr Tyr Ser Mec Val Cly
360 365 370
AAC TCG GCT AAG CTC TTG CTT CTC ATC CTA CTC TTT CCC CCC GTT GAC 1453
Asn Trp Ala Lys Val Leu Val Val Mec Leu Leu P'ne Ala Cly Val Asp
375 380 385
GCC GAA CCT TAC ACG ACA CGC GGC ACA CAC CCC CCC CCC GCC CAC GGC 1501
Cly Clu Pro Tyr Thr Thr Gly Cly Thr His Cly Arg Ala Ala His Gly
390 395 400
CTT ACA TCC CTC TTC ACA CCT CGC CCG CCT CAC AAA ATC CAC CTT CTA 1549
Leu Thr Ser Leu Phe Thr Pro ciy Pro Ala Gln Lys Ile Cln Leu Val
u05 410 415
AAC ACC AAC CCC ACC TCC CAC ATC AAC ACA ACT CCC TTC AAC TGC AAT 1597
Asn Thr Asn Cly Ser Trp His He Asn Arg Thr Ala Leu Asn Cys Asn
420 425 430 435
GAC TCC CTC CAA ACT GGG TTC CTT CCC GCG CTG TTC TAC ACG CAC ACG 1645
Asp Ser Leu Cln Thr ciy Phe Leu Ala Ala Leu Phe Tyr Thr His Arg
440 445 450
TTC AAT GCG TCC GGA TGC TCA CAC CGC ATG CCC AGC TGC CGC CCC ATT 1693
Phe Asn Ala Ser Gly Cys Ser Clu Arg Mec Ala Ser Cys Arg Pro Ile
455 460 465
GAC CAG TTC GAT CAC CGC TCG GCT CCC ATC ACT TAT AAT GAC TCC CAC 1741
Asp Gln Phe Asp Gln Gly Trp ciy Pro Ile Thr Tyr Asn Glu Ser His
470 475 480
Fig .10 (4 )
168 925
CCC Cly TTC GAC Gln ACu Arg CCC Pro TAT Tyr u90 -rr' - Cys TkjC Trp /* * r His .Au Tyr G uA Ala 495 CCT Pro CAA CCC TCT Gln Pro Cys 1789
Leu 485 Asp
ow X . --f' Λ - CTG CCC CCG TTG CAC GTG TGT GGC CCA CTC TAC TCT TTC ACT 1837
Cly Ile Val Pro Ala Leu Gln Yal cys Gly Pro Val Tyr cys Phe Thr
500 505 510 515
CCA ACC CCT CTT CTC GTG GCC ACC ACC GAT CGT TTC GGC GCC CCT ACC 1885
Pro Ser Pro Val Val Val Gly Thr Thr Asp Arg Phe Gly Ala Pro Thr
520 525 530
TAC AGA TCC CCT GAC AAT GAC ACC GAC CTC CTG CTT CTC AAC AAC ACG 1933
Tyr Arg Trp Gly Glu Asn Glu Thr Asp Val Leu Leu Leu Asn Asn Thr
535 540 545
CGC CCG CCA CCC CCC AAC TCC TTC GCC TCT ACA TGC ATG AAT AGC ACC 1981
Arg Pro Pro Arg Cly Asn Trp Phe Gly cys Thr Trp Mec Asn Ser Thr
550 555 560
CCC TTC ACC AAC ACC TCT CCC GCC CCC CCC TGC AAC ATC GGG GGG CTC 2029
Cly Pne Thr Lys Thr Cys ciy Cly Pro Pro Cys Asn Ile Gly Gly Val
565 570 575
GCC AAC AAC ACT TTG ATC TGC CCC ACC GAC TGC TTC CGG AAG CAT CCC 2077
ciy Asn Asn Thr Leu Ile Cys Pro Thr Asp Cys Phe Arg Lys His Pro
580 585 590 595
CAG GCC ACT TAC ACC AAA TGC GGT TCG GCC CCT TCG TTC 2116
Glu Ala Thr Tyr Thr Lys Cys Cly Ser Gly Pro Trp Leu
600 605
Fig 10(5)
168 925
TCC Trp GAG GGC CTC TTC ACA GGC Gly CTC ACC CAC CTC CAT GCC CAC TTC CTC 48
Glu Gly Val Phe 5 Thr Leu Thr His 10 Val Asp Ala His Phe 15 Leu
TCC CAA ACA AAG CAG GCA GGA GAC AAC TTC CCC TAC CTC GTG GCG TAC 96
Ser Cln Thr Lys Gln Ala ciy Asp Asn Phe Pro Tyr Leu Val Ala Tyr
20 25 30
CAC CCT ACT GTG TCC CCT AGG CCC CAC GCC CCA CCT CCA TCA TGC CAT 144
Gln Ala thr Val Cys Ala Arg Ala Gln Ala Pro Pro Pro Ser Trp Asp
35 40 45
CAA ATC TGC AAG TCT CTC ATA CCG CTA AAG CCT ACT CTG CCC CGG CCA 192
Cln Met Trp Lys Cys Leu Ile Arg Leu Lys Pro Thr Leu Arg Gly Pro
50 55 60
Fig . 11 (1 )
168 925
Thr 65 CCC Pro TTC Leu CTC Leu TAT Tyr ACC Arg 70 C i G Leu CGA Gly CCC CTC CAA AAC CAC GTC Val ACC Thr CTC Leu 80 24C
Ala Val Gin 75 Asn Glu
ACA CAC CCC ATA ACC AAA TTC ATC ATC CCA TGC ATG TCA CCC GAC CTC 288
Thr His Pro Ile Thr 85 Lys Phe Ile Met Ala 90 cys Met Ser Ala Asp 95 Leu
CAG GTC CTC ACC AGC ACC TCC GTG CTC GTC GGC GGG GTC CTT CCA GCT 336
Glu Val Val Thr 100 Ser Thr Trp Val Leu 105 Val Gly Gly Val Leu 110 Ala Ala
CTG GCT CCC TAT TGC TTG ACA ACA GGC ACC GTG CTC ATT GTG GCT AGG 384
Leu Ala Ala 115 Tyr cys Leu Thr Thr 120 Cly Ser Val Val Ile 125 Val Gly Arg
ATC ATC TTC TCC CGC CCC CCC CCT ATT GTT CCC GAC AGG GAA GTC CTC 432
Ile Ile 130 Leu Ser Cly Arg Pro 135 Ala Ile Val Pro Asp 140 Arg Glu Val Leu
TAC CAG GAC TTC GAT GAG ATC GAA GAG TGC GCC TCG CAC CTC CCT TAC 480
Tyr 145 Gin Clu Phe Asp Glu 150 Met Clu Glu Cys Ala 155 Ser His Leu Pro Tyr 160
ATC GAC CAG CCA ATG CAG CTC CCC GAC CAG TTC AAG CAA AAA GCG CTC 528
Ile Glu Gin Cly Met 165 Gin Leu Ala Glu Gin 170 Phe Lys Gin Lys Ala 175 Leu
GGG TTG Ć.TG CAC ACA GCC ACC AAG CAA GCG GAG GCC GCT GCT CCC CTG 576
Gly Leu Leu Cln 180 Thr Ala Thr Lys Gin 185 Ala Clu Ala Ala Ala 190 Pro Val
GTC GAC TCC AAG TGC CGA GCC CTT CAG ACC TTC TGG CCG AAA CAC ATG 624
Val Glu Ser 195 Ly. Trp Arg Ala Leu 200 Clu Thr Phe Trp Ala 205 Lya His Met
Fig. 11 (2)
168 925
TGo Trp AAC TTC ATC ACC CGG ATA CAC TAC TTA GCA CCC TTC TCC Ser ACT Thr CTC Leu 672
Asn 210 Pne Ile Ser Cly Ile Cln Tyr 215 Leu Ala Cly 220 Leu
CCT CGG AAT CCC GCC ATT GCA TCA CTG ATG GCG TTC ACA GCC TCT CTC 720
Pro Gly Asn Pro Ala Ile Ala Ser Leu Met Ala Phe Thr Ala Ser Val
225 230 235 240
ACT ACC CCC CTC ACC ACC CAA TCT ACC CTC CTC CTT AAC ATC CTC GGG 768
Thr Ser Pro Leu Thr Thr Cln Ser Thr Leu Leu Leu Asn Ile Leu Gly
245 250 255
GGA TGG CTA CCC CCC CAA CTC GCT CCC CCC ACT CCT CCT TCA CCT TTC 816
Gly Trp Val Ala Ala Cln Leu Ala Pro Pro Ser Ala Ala Ser Ala Phe
260 265 270
GTA GGC CCC CCC ATT GCT CCT CCC CCT CTT GGC ACC ATA GCC CTT GCC 864
Val Gly Ala Gly Ile Ala Cly Ala Ala Val Gly Ser Ile Gly Leu Cly
275 280 285
AAG GTG CTT GTG GAC ATC TTG GCC GGC TAT GGA CCA CGA CTG GCA GCC 912
Lys Val Leu Val Asp Ile Leu Ala Cly Tyr ciy Ala Gly Val Ala Gly
290 295 300
GCG CTC GTC GCC TTT AAG CTC ATG AGC GGC GAA ATG CCC TCC ACC GAG 960
Ala Leu Val Ala Phe Lys Val Met Ser Gly Glu Met Pro Ser Thr Glu
305 310 315 320
GAC CTG CTT AAC TTA CTC CCT GCC ATC CTC TCT CCT GGT GCC CTG CTC 1008
Asp Leu 7al Asn Leu Leu Pro Ala Ile Leu Ser Pro Gly Ala Leu Val
325 330 335
CTC GCC CTC GTC TCC CCA CCC ATA CTC CGT CCC CAC GTC GCT CCA GGC
Val Cly Val Val Cys Ala Ala Ile Leu Arg Arg His Val Cly Pro Gly
340 345 350
Fig .11 (3)
168 925
uAG GuG Glu Gly CCT Ala 355 CTC Val UAG Cln iUu AxG AAC uGG C x u Leu ATA Ile CCC Ala ί i V Pne 365 GCC /.ia TCG Ser Arg 110-
Trp Mec Asn 360 Arg
CCT AAC CAT GTT TCC CCC ACC CAC TAT CTG CCA CAC ACC GAC CCC CCA 1152
Ciy Asn His Val Ser Pro Thr His Tyr Val Pro Clu Ser Asp Ala Ala
370 375 380
CCA CCT CTC ACT CAC ATC CTC TCC CAC CTT ACT ATC ACC CAA CTC TTC 1200
Ala Arg Val Thr Gin Ile Leu Ser Asp Leu Thr Ile Thr Gin Leu Leu
385 390 395 400
AAC ACC CTC CAC CAC TCC ATT AAC GAC CAC TCC TCC ACC CCC TCC TCC 1248
Lvs Arg Leu His Gin Trp Ile Asn Clu Asp Cys Ser Thr Pro Cys Ser
405 410 415
GCC TCC TCC CTA AGC GAT GTT TCC GAC TGC ATA TGC ACA GTT TTG GCT 1296
Gly Ser * Ł r Leu Arg Asp Val Trp Asp Trp Ile Cys Thr Val Leu Ala
420 425 430
GAC TTC AAG ACC TGG CTC CAC TCC AAG CTC CTC CCG CCA TTA CCG GCA 1344
Asp Phe Lys Thr Trp Leu Gin Ser Lys Leu Leu Pro Arg Leu Pro Gly
435 440 445
GTC CCC TTT TTC TCA TCC CAA CCT GCG TAC AAG GGG CTC TGG CCC GGA 1392
Val Pro Phe Phe Ser Cys Gin Arg Gly Tyr Lys Gly Val Trp Arg Ciy
450 455 460
GAC CGC ATC ATC CAC ACC ACC TCC TCA TCT GCA CCA CAC ATC ACC CCA 1440
Asp Ciy Ile Mec Gin Thr Thr cys Ser Cys Gly Ala Cln Ile Thr Ciy
465 470 475 480
CAT CTC AAA AAC CCT TCC ATC ACG ATC GTT GCC CCT AAC ACC TCT ACT 1488
His Val Lys Asn Ciy Ser Met Arg Ile V*1 ciy Pro Lys Thr Cys Ser
485 490 495
Fig .11 (4)
168 925
AAC ATC TCC CAT GGA ACA TTC ccc Pro ATC Ile 505 AAC Asn GCA Ala TAC Tyr ACC ACo CGC CCC 1536
Asn Met Trp His 500 w i y Tnr Pne Thr Thr 510 Cly Pro
TCC ACC CCC TCC CCA CCC CCA AAC TAT TCC AGC GCC CTC TCC CGG GTG 1584
Cys Thr Pro Ser Pro Ala Pro Asn Tyr Ser Arg Ala Leu Trp Arg Val
515 520 525
GCT CCT CAC GAu TAC GTG CAG GTT ACC CCG CTC CCC GAT TTC CAC TAC 1632
Ala Ala Glu Glu Tyr Val Glu Val Thr Arg Val Gly Asp Phe His Tyr
530 535 540
GTG ACC ACC ATC ACC ACT GAC AAC GTA AAA TGC CCG TGC CAG GTT CCA 1680
Val Thr Ser Met Thr Thr Asp Asn Val Lys Cys Pro Cys Gln Val Pro
545 550 555 560
GCC CCC GAA TTC TTC ACA GAA GTC GAT GGC CTG CGC CTG CAC AGG TAC 1728
Ala Pro Glu Phe Phe Thr Glu Val Asp Gly Val Arg Leu His Arg Tyr
565 570 575
GCT CCG GCG TGC AAA CCT CTC CTA CGG GAG GAC CTC ACA TTC CAC GTC 1776
Ala Pro Ala cys Lys Pro Leu Leu Arg Glu Glu Val Thr Phe Gln Val
580 585 590
GGG CTC AAC CAA TAC CTC CTT GGC TCG CAC CTC CCA TCC GAG CCC GAA 1824
Gly Leu Asn Gln Tyr Leu Val Gly Ser Cln Leu Pro Cys Glu Pro Glu
595 600 605
CCC GAT GTA GCA GTG CTC ACT TCC ATC CTC ACC GAC CCC TCC CAC ATC 1872
Pro Asp Val Ala Val Leu Thr Ser Met Leu Thr Asp Pro Ser His Ile
610 615 620
ACA CCA GAC ACC GCT AAC CGC ACC CTC GCC ACG GCC TCT CCC CCC TCC 1920
Thr Ala Clu Thr Ala Lys Arg Arg Leu Ale Arg Gly Ser Pro Pro Ser
625 630 635 640
1 Fi g .))(5)
168 925
TTG CCC ACC TCT TCA CCT AGC Ser CAC Gir. TTG Le u TCT GCG CCT Pro TCC Ser TCG AAG GCG 1968
Leu Ala Ser Ser Ser Ala 645 Ser 650 Ala Ser Lys 655 Ala
ACA TAC ATT ACC CAA AAT GAC TTC CCA GAC GCT GAC CTC ATC GAG GCC 2016
Thr Tyr Ile Thr Gln Asn Asp Phe Pro Asp Ala Asp Leu Ile Glu Ala
660 665 670
AAC CTC CTG TGG CGG CAT GAG ATG GGC GGC GAC ATT ACC CGC GTG GAC 2064
Asn Leu Leu Trp Arg His Glu Met Gly Cly Asp Ile Thr Arg Val Glu
675 680 685
TCA GAC AAC AAG GTA GTA ATC CTC CAC TCT TTC GAC CCG CTC CGA GCC 2112
Ser Glu Asn Lys Val Val Ile Leu Asp Ser Phe Asp Pro Leu Arg Ala
690 695 700
CAC GAG GAT GAC CGC GAA CTG TCC CTC CCC GCG GAG ATC CTG CGC AAA 2160
Glu Glu Asp Glu Arg Glu Val Ser Val Pro Ala Glu Ile Leu Arg Lys
705 710 715 720
TCC AAC AAA TTC CCA CCA CCG ATG CCC CCA TGG GCA CGC CCG GAT TAC 2208
Ser Lys Lys Phe Pro Pro Ala Mec Pro Ala Trp Ala Arg Pro Asp Tyr
725 730 735
AAC CCT CCG CTG CTG GAG TCC TCG AAC GCC CCG GAC TAC GTC CCT CCA 2256
Asn Pro Pro Leu Leu Glu Ser Trp Lys Ala Pro Asp Tyr Val Pro Pro
740 745 750
GTG GTA CAT GGG TGC CCA CTG CCA CCT ACT AAG ACC CCT CCT ATA CCA 2304
Val Val His ciy Cys Pro Leu Pro Pro Thr Lys Thr Pro Pro Ile Pro
755 760 765
CCT CCA CGC ACG AAC ACC ACA GTT CTT CTC ACA CAA TCC ACC CTC TCT 2352
Pro Pro Arg Arg Ly· Arg Thr Val Val Leu Thr Clu Ser Thr Vel Ser
770 775 780
Fig.1 16)
168 925
TCT Ser 785 GCC CTC CCC CAG CTT Leu 790 CCC ACA AAC CCT TTC GGT ACC TCC GAA CCC 2400
Ala Leu Ala Clu Ala Thr Lys Ala Phe 795 Cly Ser Ser Clu Pro 800
TCC CCC GTC CAC AGC CCC ACC GCA ACC CCC CCT CCT GAC CAA CCC TCC 2448
Ser Ala Val Asp Ser Gly Thr Ala Thr Ala Pro Pro Asp Gin Pro Ser
805 810 815
CAC CAC CCC CGA CCA CCA TCT GAC GTT CAC TCC TAT TCC TCC ATC CCC 2496
Asp Asp Gly Gly Ala Gly Ser Asp Val Clu Ser Tyr Ser Ser Met Pro
820 825 830
CCC CTT CAG GCG CAG CCG GGC CAC CCC CAT CTC AGC GAC GGG TCT TGG 2544
Pro Leu Clu Gly Clu Pro Gly Asp Pro Asp Leu Ser Asp Cly Ser Trp
835 840 845
TCT ACC CTC AGT GAC GAC GCC GGT GAC GAC CTC GTC TGC TGC TCG ATG 2592
Ser Thr Val Ser Glu Glu Ala Gly Glu Asp Val Val Cys cys Ser Met
850 855 860
TCC TAC ACA TGG ACA GGC GCT CTG ATC ACG CCA TGC GCT GCG GAG GAA 2640
Ser Tyr Thr Trp Thr Gly Ala Leu Ile Thr Pro Cys Ala Ala Glu Glu
£65 870 875 880
AGC AAG CTG CCC ATC AAC GCG TTG ACC AAC TCT TTG CTG CCT CAC CAC 2688
Ser Lys Leu Pro Ile Asn Ala Leu Ser Asn Ser Leu Leu Arg His His
885 890 895
AAC ATG CTC TAC GCT ACC ACA TCC CCC AGC GCA AGC CAG CGG CAG AAC 2736
Asn Met Val Tyr Ala Thr Thr Ser Arg Ser Ala Ser Gin Arg Cln Lys
900 905 910
AAG CTC ACC TTT CAC AGA CTC CAA ATC CTC CAC CAT CAC TAC CAC GAC 2784
Lys Val Thr Phe Asp Arg Leu Gin Ile Leu Asp Asp His Tyr Cln Asp
915 920 925
Fig.11( 7)
168 925
CTC Val CTC AAG gag G lu ATC Me c AAC Lys GCG Ala 935 AA u Lys GCG TCC Ale Ser ACA Thr GTT Val 940 AAC Lys GCT Ala AAG Lys CTT Leu 28 3 2
Leu 930 Lys
CTA TCA CTA CAC GAA CCC TGC AAG CTC ACC CCC CCA CAT TCC GCC AAA 2880
Leu Ser Val Clu Clu Ala Cys Lys Leu Thr Pro Pro His Ser Ala Lys
945 950 955 960
TCT AAA TTT CCC TAT CCC CCA AAC CAC GTC CGG AAC CTA TCC AGC AAG 2928
Ser Lys Phe Cly Tyr Cly Ala Lys Asp Val Arg Asn Leu Ser Ser Lys
965 970 975
CCC ATT AAC CAC ATC CCC TCC GTG TGG GAG GAC TTG TTG GAA GAC ACT 2976
Ala Ile Asn His Ile Arg Ser Val Trp Glu Asp Leu Leu Glu Asp Thr
980 985 990
GAA ACA CCA ATT GAC ACC ACC ATC ATC GCA AAA AAT GAG GTT TTC TGC 3024
Clu Thr Pro Ile Asp Thr Thr Ile Mec Ala Lys Asn Clu Val Phe Cys
995 1000 1005
CTC CAA CCA GAC AGA CCA GGC CCC AAG CCA CCT CGC CTT ATC GTC TTC 3072
Yal Gln Pro Clu Arg Gly Gly Arg Lys Pro Ala Arg Leu Ile Val Phe
1010 1015 1020
CCA CAC TTC GGC CTC CGT CTG TGC GAG AAA ATG GCC CTC TAT GAC CTG 3120
Pro Asp Leu Cly Yal Arg Val cys Clu Lys Mec Ala Leu Tyr Asp Yal
1025 1030 1035 1040
CTC TCC ACC CTC CCT CAC CCT CTC ATG CCC TCC TCG TAC GGA TTC CAC 3168
Val Ser Thr Leu Pro Gln Ala Yal Mec Gly Ser Ser Tyr Cly Phe Cln
1045 1050 1055
TAT TCT CCT CGA CAC CCC CTC CAC TTC CTC CTC AAC CCC TCC AAA TCA 3216
Tyr Ser Pro Cly Gln Arg Yal CI*» Phe Leu Yal Aan Ala Trp Lya Sar
1060 1065 1070
Fig.1118)
168 925
AAG AAG ACC CCT ATC CCC TTT GCA TA~ C-AC ACC CCC TGT TTT GAC TCA 3264
Lys Lys Thr Pro Mer Ciy Pne Ala Tyr Asp Thr Arg Cys Phe Asp Ser
1075 1030 1085
ACA GTC ACT CAC AAT CAC ATC CCT CTA CAC CAG TCA ATT TAT CAA TCT 3312
Thr Val Thr Clu Asn Asp Ile Arg Val Clu Clu Ser Ile Tyr Cln Cys
1090 1095 1100
TGT GAC TTC GCC CCC GAA CCC AGA CAG CCC ATA AGG TCG CTC ACA CAC 3360
Cys Asp Leu Ala Pro Glu Ala Arg Gin Ala Ile Arg Ser Leu Thr Glu
1105 1110 1115 1120
CCG CTT TAT ATC GCG GGT CCC CTC ACT AAT TCA AAA GGC CAG AAC TCC 3408
Arg Leu Tyr Ile Gly Gly Pro Leu Tht Asn Ser Lys Gly Gin Asn Cys
1125 1130 1135
CGC TAT CGC CCG TCC CGC GCG AGC CCC CTG CTG ACG ACT AGC TGC GGT 3456
Gly Tyr Arg Arg Cys Arg Ala Ser Gly Val Leu Thr Thr Ser Cys Gly
1140 1145 1150
AAT ACC CTC ACA TCT TAC TTC AAC CCC TCT CCA CCC TCT CCA CCT GCA 3504
Asn Thr Leu Thr Cys Tyr Leu Lys Ala Ser Ala Ala Cys Arg Ala Ala
1155 1160 1165
AAG CTC CAG GAC TGC ACG ATG CTC CTG Val TGC GGA GAC GGC CTT GTC GTT
Lys Leu Cln 1170 Asp Cys Thr Met 1175 Leu Cys Ciy Asp L180 Asp Leu Val Val
ATC TGT 6AG AGC GCG GGA ACC CAG GAG GAC CCG GCC ACC CTA CGA CTC
Ile Cys Clu Ser Ala Gly Thr Cln Clu Asp Ala Ala Ser Leu Arg Val
1185 1190 1195 1200
TTC ACG GAC GCT ATC ACT AGG TAC TCT GCC CCC CCC CGC GAC CCG CCC
Phe Thr Glu Ala Met Thr Arg Tyr Ser Ala Pro Pro Gly Asp Pro Pro
1205 1210 1215
3552
3600
F ig .1119)
3648
168 925
CńA CCA GAA TAC GAC CTC GAG TTG ATA ACA TCA TGC TCC TCC AAT GTG 369Ó
Cln Pro Glu Tyr Asp Leu Glu Leu Ile Thr Ser Cys Ser Ser Asn Val
1220 1225 1230
TCG GTC GCG CAC GAT CCA TCT GGC AAA AGu CTA TAC TAC CTC ACC CGT 3744
Ser Val Ala His Asp Ala Ser Gly Lys Arg Val Tyr Tyr Leu Thr Arg
1235 1240 1245
GAC CCC 3750
Asp Pro
1250
Fig. 11 (10)
168 925
TAAGGATCCC CCT GCA CTA TCG GCG CAA TTC Ser Ala Val Ser Ala Glu Phe
Fig. i2
CTGCCTGCA GTA AAG AAC AAG AAG AAG AAA ACC AAA CCT AAC ACC A Val Lys Lys Lys Lys Lys Lys Thr Lys Arg Asn Leu
10
Fig. T3
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 1,50 zł

Claims (8)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Sposób wykrywania antygenu wirusowego PT-NANBH i przeciwciała przeciwko antygenowi wirusowemu PT-NANBH, znamienny tym, że kontaktuje się testowaną próbkę z polipeptydem wirusowym PT-NANBH o sekwencji aminokwasowej, homologicznej przynajmniej w 90% z sekwencją aminokwasową podaną w sekwencjach o numerach identyfikacyjnych 3,4, 5, 18, 19, 20, 21 lub 22 przedstawionych odpowiednio na fig. 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 lub jej fragmentem antygenowym, lub z poliklonalnym albo z monoklonalnym przeciwciałem przeciwko takiemu polipeptydowi wirusowemu i ustala się czy w testowanej próbce występuje jakiekolwiek wiązanie antygen-przeciwciało.
  2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się sekwencję aminokwasową homologiczną przynajmniej w 90% z sekwencją aminokwasową podaną w sekwencjach o numerach identyfikacyjnych 3, 4 lub 5, przedstawionych odpowiednio na fig. 4, 5, 6, lub jej fragment antygenowy.
  3. 3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że stosuje się sekwencję aminokwasową homologiczną z sekwencją aminokwasową podaną w sekwencjach o numerach identyfikacyjnych 3 lub 4, przedstawionych odpowiednio na fig. 4, 5, lub jej fragment antygenowy.
  4. 4. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że stosuje się sekwencję aminokwasową homologiczną przynajmniej w 90% z sekwencją aminokwasową podaną w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 5, przedstawionej na fig. 6, lub jej fragment antygenowy.
  5. 5. Sposób według zastrz. 1, albo zastrz. 2, albo zastrz. 3, albo zastrz. 4, znamienny tym, że stosuje się sekwencję aminokwasową, homologiczną przynajmniej w 95% z sekwencją aminokwasową podaną w sekwencjach o numerach identyfikacyjnych 3,4, 5, 18,19, 20, 21 lub 22 przedstawionych odpowiednio na fig. 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 lub jej fragment antygenowy.
  6. 6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że stosuje się sekwencję aminokwasową homologiczną przynajmniej w 98% z sekwencją aminokwasową podaną w sekwencjach o numerach identyfikacyjnych 3, 4, 5, 18, 19, 20, 21 lub 22 przedstawionych odpowiednio na fig. 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 lub jej fragment antygenowy.
  7. 7. Sposób wykrywania przeciwciała przeciwko antygenowi wirusowemu PT-NANBH, znamienny tym, że kontaktuje się testowaną próbkę z jednym lub większą ilością wirusowych polipeptydów PT-NANBH, które to polipeptydy zawierają dwa lub większą ilość wirusowych antygenów PT-NANBH występujących w kombinacji albo połączonych przez fuzję i stanowiących pojedynczy polipeptyd, przy czym co najmniej jeden z tych antygenów pochodzi ze strukturalnego regionu kodującego wirusa i co najmniej jeden inny z tych antygenów pochodzi z niestrukturalnego regionu kodującego wirusa i ustala się, czy w materiale testowanej próbki występuje jakiekolwiek wiązanie antygen-przeciwciało.
  8. 8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że stosuje się antygen kodowany przez strukturalny region kodujący, który to antygen posiada sekwencję aminokwasową homologiczną przynajmniej w 90% z sekwencją aminokwasową podaną w sekwencji aminokwasowej o numerze identyfikacyjnym 5 przedstawionej na fig. 6 lub jej fragment antygenowy i antygen kodowany przez niestrukturalny region kodujący, który to antygen posiada sekwencję aminokwasową homologiczną przynajmniej w 90% z sekwencją aminokwasową podaną w sekwencjach o numerach identyfikacyjnych 3 lub 4, przedstawionych odpowiednio na fig. 4, 5 lub jej fragment antygenowy.
    168 925
PL30593090A 1989-12-18 1990-12-17 Sposób wykrywania antygenu wirusowego PT-NANBH i przeciwciała przeciwko antygenowi wirusowemu PT-NANBH PL168925B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB898928562A GB8928562D0 (en) 1989-12-18 1989-12-18 Viral agent
GB909004814A GB9004814D0 (en) 1990-03-03 1990-03-03 Viral agent

Publications (1)

Publication Number Publication Date
PL168925B1 true PL168925B1 (pl) 1996-05-31

Family

ID=26296388

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL30593090A PL168925B1 (pl) 1989-12-18 1990-12-17 Sposób wykrywania antygenu wirusowego PT-NANBH i przeciwciała przeciwko antygenowi wirusowemu PT-NANBH
PL28830090A PL167059B1 (pl) 1989-12-18 1990-12-17 Sposób wytwarzania wirusowego polipeptydu PT-NANBH

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL28830090A PL167059B1 (pl) 1989-12-18 1990-12-17 Sposób wytwarzania wirusowego polipeptydu PT-NANBH

Country Status (1)

Country Link
PL (2) PL168925B1 (pl)

Also Published As

Publication number Publication date
PL288300A1 (en) 1991-09-23
PL167059B1 (pl) 1995-07-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2032381C (en) Viral agent
RU2130969C1 (ru) Композиция для диагностики гепатита c человека (варианты), способ и набор для обнаружения антител к вирусу гепатита c человека
US7198892B2 (en) Hepatitis-C virus type 4, 5 and 6
RU2155228C2 (ru) Hcv геномные последовательности для диагностических и терапевтических целей
JP2002528140A (ja) ヒトｐａｎ−ｈｃｖヒトモノクローナル抗体
US5218099A (en) Post-transfusion, non-A, non-B hepatitis virus polynucleotides
JP2004043470A (ja) 腸内伝達された非−ａ／非−ｂ肝炎ウィルス物質及びその特徴的なエピトープ
CA2170521A1 (en) Immunoreactive antigens of hepatitis e virus
US5747240A (en) Epitope mapping of the c33 region of HCV
US5620843A (en) Non-A non-B sequences
Yao et al. A serotype-specific epitope of dengue virus 1 identified by phage displayed random peptide library
WO1992009634A1 (en) Non-a non-b hepatitis virus antigen protein
PL168925B1 (pl) Sposób wykrywania antygenu wirusowego PT-NANBH i przeciwciała przeciwko antygenowi wirusowemu PT-NANBH
US7166287B1 (en) Viral agent
JPH06507552A (ja) 肝炎疾患の診断において有用なｄｎａ配列及びコードされたポリペプチド
CA2196195A1 (en) Methods and compositions for differential diagnosis of acute and chronic hepatitis c virus infection
EP0672066A1 (en) Peptides from the c33 region of hcv, antibodies thereto and methods for the detection of hcv
PT96223B (pt) Processo para a preparacao de um agente viral responsavel pela hepatite nao-a bnao-b de pos-transfusao
WO1994013699A1 (en) Hepatitis c virus (hcv) non-structural-3 peptides, antibodies thereto and methods for the detection of hcv
JPH0568563A (ja) Ｃ型肝炎ウイルス遺伝子およびその利用方法