PL167059B1

PL167059B1 - Sposób wytwarzania wirusowego polipeptydu PT-NANBH

Info

Publication number: PL167059B1
Application number: PL28830090A
Authority: PL
Inventors: Peter E Highfield; Brian C Rodgers; Richard S Tedder; John A J Barbara
Original assignee: Wellcome Found
Priority date: 1989-12-18
Filing date: 1990-12-17
Publication date: 1995-07-31
Also published as: PL288300A1; PL168925B1

Abstract

1. Sposób wytwarzania wirusowego polipeptydu PT-NANBH, znamienny tym, że klonuje się lub syntetyzuje się sekwencję DNa kodującą antygen o sekwencji aminokwasowej, homologicznej przynajmniej w 90% z sekwencją aminokwasowąpodanąw sekwencjach o numerach identyfikacyjnych: 3,4, 5, 18, 19, 20, 21 lub 22 przedstawionych odpowiednio na fig. 4, 5,6,7,8,9, 10, 11 lub jej fragment antygenowy, wstawia się tę sekwencję DNA do wektora ekspresyjnego zdolnego do ekspresji w odpowiednim gospodarzu, transformuje się komórki gospodarza wektorem ekspresyjnym, hoduje się tak stransformowane komórki gospodarza i izoluje się polipeptyd wirusowy.

Description

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest sposób wytwarzania wirusowego polipeptydu PT-NANBH.

Antygen wirusowy PT-NANBH odpowiedzialny jest za potransfuzyjne zapalenie wątroby typu nie-A nie-B (PT-NANBH).

167 059

Sekwencję DNA kodującą polipeptydy wirusowe PT-NANBH można stosować do oznaczania kwasu nukleinowego w celu diagnozowania PT-NANBH.

Polipeptydy wirusowe PT-NANBH, lub poliklonalne bądź monoklonalne przeciwciała skierowane przeciwko takim polipeptydom, mogą być stosowane w badaniach immunologicznych, w celu diagnozowania PT-NANBH lub w szczepionce do zapobiegania tej chorobie.

Diagnoza zapalenia wątroby typu nie-A nie-B (NANBH) jest z definicji diagnozą przez wykluczenie. Na ogół wykorzystuje się ją do opisu przypadków infekcji wirusowych wywołujących zapalenie wątroby, które to infekcje nie są spowodowane wirusami zapalenia wątroby typu A lub B. Chociaż w większości takich przypadków nie zidentyfikowano przyczyn infekcji, na podstawie danych klinicznych i epidemiologicznych uważa się, że odpowiedzialne za nie są liczne czynniki, których przeglądu dokonali Shih i inni (Prog. Liver Dis., 1985,8,433-452). W samych Stanach Zjednoczonych Ameryki do 10% transfuzji krwi może zakończyć się NANBH, co czyni je znaczącym problemem. Nawet dla PT-NANBH może istnieć co najmniej kilka czynników wirusowych odpowiedzialnych za infekcję, i przez kilka lat czyniono wiele prób identyfikacji czynnika, wielokrotnie zastrzegano sposób identyfikacji tego czynnika z których żadnego nie udowodniono.

W europejskim zgłoszeniu patentowym nr 88310922.5 opisano izolację i charakterystykę czynnika etiologicznego odpowiedzialnego za PT-NANBH, który w tym zgłoszeniu określa się także jako wirus zapalenia wątroby typu C (HCV). Z wirusowego kwasu nukleinowego, otrzymanego z organizmu szympansa zainfekowanego PT-NANBH, przygotowano bibliotekę CDNA i przeszukano ją stosując ludzkie antysurowice. Wyizolowano i zsekwencjonowano liczne liczne klony dodatnie. Otrzymane dane dotyczące sekwencji kwasów nukleinowych i sekwencji aminokwasowych, które opisano w tym zgłoszeniu, stanowią około 70% genomu wirusowego o długości l0 Kb i pochodzą w całości z jego końca 3’, odpowiadającego niestrukturalnemu regionowi kodującemu.

Autorzy niniejszego wynalazku wyizolowali i scharakteryzowali polipeptydy wirusowe PT-NANBH poprzez sklonowanie i ekspresję sekwencji DNA kodujących takie polipeptydy. Nieoczekiwanie okazało się, że dane dotyczące zarówno sekwencji kwasów nukleinowych, jak sekwencji aminokwasowych, wykazują znaczne różnice w porównaniu z odpowiadającymi im danymi według europejskiego zgłoszenia patentowego nr 88310922.5. Całkowite różnice wynoszą około 20% na poziomie kwasu nukleinowego i około 15% na poziomie aminokwasowym, lecz w pewnych regionach sekwencji znaleziono nawet większe różnice. Całkowity poziom różnic jest dużo wyższy niż możnaby było oczekiwać w przypadku dwóch izolatów tego samego wirusa, nawet uwzględniając czynniki geograficzne, i sądzi się, że różnice te spowodowane są przez jedną z dwóch możliwych przyczyn.

Po pierwsze, autorzy niniejszego wynalazku i autorzy wspomnianego powyżej europejskiego zgłoszenia patentowego zastosowali różne źródła kwasu nukleinowego użytego do klonowania CDNA. W szczególności według europejskiego zgłoszenia patentowego, stosowano jako źródło wirusowego kwasu nukleinowego, będącego materiałem wyjściowym, osocze szympansa, zawierające wirusa dwukrotnie pasażowanego w organiźmie szympansa. PTNANBH jest oczywiście chorobą ludzką i wynikiem pasażowania wirusa w organiźmie obcego gospodarza, nawetjeśli jest on blisko spokrewniony z ludźmi, jest prawdopodobnie dużaczęstość mutacji wirusowego kwasu nukleinowego. Zgodnie z tym, dane sekwencyjne zawarte w europejskim zgłoszeniu patentowym nr 88310922.5 mogą nie być na prawdę reprezentatywne dla czynnika wirusowego odpowiedzialnego za PT-NANBH u ludzi. W przeciwieństwie do wspomnianego stanu techniki autorzy niniejszego wynalazku wykorzystali jako materiał wyjściowy do klonowania cDNA wirusowy kwas nukleinowy z osocza ludzkiego. Jest znacznie bardziej prawdopodobne, że tak otrzymane dane sekwencyjne odpowiadają natywnej sekwencji kwasu nukleinowego i sekwencji aminokwasowej PT-NANBH.

Po drugie, możliwe jest, że czynnik wirusowy istnieje w postaci więcej, niż jednego podtypu, i dane sekwencyjne opisano w europejskim zgłoszeniu patentowym oraz przedstawiono przez autorów niniejszego wynalazku, odpowiadają oddzielnym i odmiennym podtypom tego samego czynnika wirusowego. Alternatywnie, możliwe jest, że poziom różnic pomiędzy dwiema grupami danych sekwencyjnych spowodowany jest obydwoma wyżej omawianymi czynnikami.

167 0559

Według wynalazku sposób wytwarzania wirusowego polipeptydu PT-NANBH polega na tym, że klonuje się lub syntetyzuje się sekwencję DNA kodującą antygen o sekwencji aminokwasowej, homologicznej przynajmniej w 90% z sekwencją aminokwasową podaną w sekwencjach o numerach identyfikacyjnych: 3,4,5,18,19,20,21 lub 22 przedstawionych odpowiednio na fig. 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 lub jej fragment antygenowy, wstawia się tę sekwencję DNA do wektora ekspresyjnego zdolnego do ekspresji w odpowiednim gospodarzu, transformuje się komórki gospodarza wektorem ekspresyjnym, hoduje się tak stransformowane komórki gospodarza i izoluje się polipeptyd wirusowy.

Sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 3, 4, 5, 18, 19, 20, 21 lub 22 przedstawiają sekwencję aminokwasową wywnioskowaną z sekwencji kwasu nukleinowego. Korzystnie, sekwencja aminokwasowa jest co najmniej w 95% lub nawet 98% homonologiczna z sekwencją aminokwasową przedstawioną w sekwencjach o numerach identyfikacyjnych: 3, 4, 5, 18, 19, 20,21 lub 22. Ewentualnie antygen poddaje się fuzji z polipeptydem heterologicznym.

Stosuje się razem dwa lub większą liczbę antygenów albo w połączeniu, albo po fuzji jako pojedynczy polipeptyd. Zastosowanie dwóch lub większej liczby antygenów w oznaczeniu diagnostycznym zapewnia bardziej wiarygodne wyniki przy stosowaniu oznaczenia w testowaniu krwi pod kątem wirusa PT-NANBH. Korzystnie, jeden antygen otrzymuje się ze strukturalnego regionu kodującego, (koniec 5’), a drugi antygen otrzymuje się z niestrukturalnego regionu kodującego (koniec 3’). Szczególnie korzystnym sposobem przeprowadzenia fuzji antygenów jest otrzymywanie pojedynczego polipeptydu technikami rekombinacyjnymi. Ten drugi sposób ma liczne zalety polegające na tym, że pojedyncze antygeny łączy się w określonym wcześniej, stałym stosunku (zazwyczaj równomolowym) i zachodzi potrzeba wytworzenia, oczyszczenia i scharakteryzowania tylko pojedynczego polipeptydu.

Antygenowy fragment antygenu posiadającego sekwencję aminokwasową homologiczną co najmniej w 90% z sekwencją przedstawioną w sekwencjach o numerach identyfikacyjnych: 3,4,5, 18,19,20,21 lub 22 korzystnie zawiera minimum pięć, sześć, siedem, osiem, dziewięć lub dziesięć, piętnaście, dwadzieścia, trzydzieści, czterdzieści lub pięćdziesiąt aminokwasów. Miejsca antygenowe takich antygenów identyfikuje się przy zastosowaniu znanych sposobów. Mogą one obejmować fragmentację samego polipeptydu z zastosowaniem enzymów lub czynników chemicznych, a następnie określanie zdolności każdego fragmentu do wiązania przeciwciał lub wywoływania odpowiedzi immunologicznej, jeśli inokuluje się nimi zwierzę lub odpowiedni układ modelowy in vitro (Strohmaier i inni, J. Gen. Virol., 1982, 59, 205-306). Alternatywnie można fragmentować DNA kodujący polipeptyd przez trawienie enzymami restrykcyjnymi, lub stosując inne dobrze znane metody, a następnie wprowadzać do układu ekspresyjnego w celu wytworzenia fragmentów ewentualnie poddanych fuzji w dowolny sposób z polipeptydem, zazwyczaj pochodzenia bakteryjnego). Otrzymane fragmenty oznacza się jak opisano uprzednio (Spece i inni, J. Gen. Virol., 1989,70,2843-51; Smith i inni, Gene, 1984,29, 163-9). Można ponadto dokonywać syntezy na drodze chemicznej krótkich fragmentów peptydowych (o długości 3-20 aminokwasów; dogodnie o długości 6 aminokwasów) obejmujących całą sekwencję peptydu o pełnej długości, z każdym peptydem zachodzącym na przylegający peptyd. Ten region zachodzenia może posiadać długość 1-10 aminokwasów, lecz najlepiej n-1 aminokwasów, gdzie n jest długością peptydu; Geysen i inni, Proc. Natl, Acad, Sci., 1984, 81, 3998-4002). Każdy peptyd następnie oznacza się jak opisano uprzednio, z tym wyjątkiem, że peptyd zazwyczaj najpierw sprzęga się z jakąś cząsteczką nośnikową w celu ułatwienia indukcji odpowiedzi immunologicznej. Wreszcie, znane są metody przewidywania obejmujące analizę sekwencji pod kątem określonych cech, np. hydrofobowości, o których to cechach sądzi się, że związane są z miejscami ważnymi immunologicznie (Hopp i Woods, Prac, Natl, Acad, Sci., 1981, 78 3824-8; Berzofsky, Science, 1985, 229, 932-40). Przewidywane sekwencje można następnie testować stosując opisane uprzednio sposoby a dotyczące polipeptydów otrzymywanych technikami rekombinacyjnymi lub fragmentacji samego peptydu.

Według wynalazku, polipeptyd wirusowy wytwarza się korzystnie w postaci czystej, tj. wytwarza się polipeptyd o czystości wyższej niż 90% lub nawet 95%.

Polipeptyd wirusowy PT-NANBH wytworzony sposobem według wynalazku otrzymuje się przy zastosowaniu syntetyzatora aminokwasowego, w przypadku, jeśli jest on antygenem posiadającym nie więcej niż około trzydziestu reszt, lub sposobami rekombinacji DNA. W opisie niniejszego wynalazku ujawniono także sekwencję DNA kodującą polipeptyd wirusowy PTNANBH. Tę sekwencję DNA wytwarza się na drodze syntezy lub przez klonowanie. Korzystnie wytwarza się sekwencję DNA przedstawioną w sekwencjach o numerach identyfikacyjnych: 3, 4,5, 18, 19,20,21 lub 22.

W celu otrzymania polipeptydu wirusowego PT-NANBH obejmującego wiele antygenów, korzystnie dokonuje się fuzji pojedynczych sekwencji kodujących w jedną otwartą ramkę odczytu. Fuzję przeprowadza się w taki sposób, aby nie nastąpiło znaczące ograniczenie aktywności antygenowej każdego antygenu spowodowane jego położeniem w stosunku do innych antygenów. Szczególną uwagę należy oczywiście zwrócić na charakter sekwencji w miejscu połączeń pomiędzy antygenami. Sposoby za pomocą których otrzymuje się takie pojedyncze polipeptydy są ogólnie dobrze znane.

W opisie niniejszego wynalazku ujawniono także wektor ekspresyjny zawierający zdefiniowaną tu sekwencję DNA, który to wektor jest zdolny do ekspresji sekwencji DNA w odpowiednim gospodarzu w celu wytworzenia polipeptydu wirusowego PT-NANBH.

Wektor ekspresyjny zawiera zwykle fragmenty kontrolujące DNA, które umożliwiają zajście ekspresji sekwencji DNA w odpowiednim gospodarzu. Fragmenty różnią się w zależności od gospodarza, zazwyczaj jednak obejmują promotor, miejsce wiązania rybosomu, miejsca początku i końca translacji oraz miejsce terminacji transkrypcji. Przykłady takich wektorów obejmują plazmidy i wirusy. Wektory ekspresyjne ujawnione w niniejszym opisie obejmują zarówno pozachromosomalne, jak i wektory ulegające integracji z chromosomem komórki gospodarza. W przypadku wykorzystania wektora w E. coli, wektor ekspresyjny zawiera sekwencję DNA według postaci fuzji dowolnie połączonej z końcem albo 5’, albo 3’, sekwencji DNA kodującej, na przykład, B-galaktozydazę lub z końcem 3’ sekwencji DNA kodującej, na przykład, gen trp E. W przypadku wykorzystania wektora w układzie bakulowirusa owadów (AcNPV), sekwencję DNA ewentualnie łączy się z sekwencją kodującą poliedrynę.

Niniejszy opis ujawnia także komórkę gospodarza stransformowaną zdefiniowanym tu wektorem ekspresyjnym.

Przykłady komórek gospodarza, które stosuje się w sposobie według wynalazku obejmują komórki prokariotyczne i eukariotyczne, takie jak komórki bakterii, drożdży, ssaków i owadów. Zwłaszcza, stosuje się takie komórki, jak komórki E. coli, S. cerevisiae, P. pastoris, komórki jajnika chomika chińskiego i komórki myszy, oraz Spodoptera trugiperda i Tricoplusia ni, wybór komórki gospodarza zależy od licznych czynników, lecz w przypadku, gdy ważna jest potranslacyjna modyfikacja polipeptydu wirusowego PT-NANBH, korzystnie stosuje się komórki gospodarza eukariotycznego.

Sposób wytwarzania polipeptydu wirusowego PT-NANBH według wynalazku polega na tym, że klonuje się lub syntetyzuje się sekwencję DNA kodującą polipeptyd wirusowy PTNANBH, wstawia się tę sekwencję DNA do takiego wektora ekspresyjnego, który jest zdolny do ulegania ekspresji w odpowiednim gospodarzu, transformuje się komórki gospodarza wektorem ekspresyjnym, hoduje się stransformowane komórki gospodarza i izoluje się polipeptyd wirusowy.

Klonowanie sekwencji DNA prowadzi się znanymi sposobami. Istotne jest jednakże wykorzystanie danych sekwencyjnych ujawnionych w niniejszym opisie, tak aby ułatwić identyfikację i izolację pożądanej sklonowanej sekwencji DNA. Korzystnie, RNA izoluje się przez osadzanie wirusa z osocza zainfekowanych ludzi zidentyfikowanych dzięki ich udziałowi w przenoszeniu PT-NANBH. Wyizolowany RNA poddaje się odwrotnej transkrypcji na cDNA stosując albo startery losowe albo oligo-dT. Ewentualnie RNA poddaje się obróbce wstępnej w celu usunięcia wszystkich struktur drugorzędowych mogących interferować z syntezą cDNA, przykładowo przez ogrzewanie lub reakcję z wodorotlenkiem metylortęciowym. cDNA zazwyczaj modyfikuje się przez dodanie łączników, po którym następuje trawienie enzymem restrykcyjnym. Następnie wstawia się go do wektora klonującego, takiego jak pBR322 lub do pochodnej tego wektora, albo do wektorów lambda gt10 i gt11 (Huynch i inni, DNA Cloning, 1985, tom 1: A Practical Approach, Oxford, IRC Press) upakowywanych odpowiednio w wiriony i powstałą zrekombinowaną cząsteczkę DNA wykorzystuje się do transformowania E. coli, a zatem utworzenia pożądanej biblioteki, DNA.

Bibliotekę przeszukuje się stosując zwaną strategię przeszukiwania. Jeśli biblioteka jest biblioteką ekspresyjną, można ja przeszukiwać stosując metodę immunologiczną z antysurowicami otrzymanymi z tego samego źródła osocza z którego pochodził RNA, a także z antysurowicami pochodzącymi ze źródeł dodatkowych od ludzi, którzy, jak się przypuszcza, posiadają przeciwciała skierowane przeciwko PT-NANBH. Ponieważ ludzkie antysurowice zazwyczaj zawierają przeciwciała skierowane przeciwko E. coli, które mogą dawać wysokie tło podczas przeszukiwania, korzystnie wcześniej traktuje się te antysurowice lizatem niestransformowanej E. coli w celu usunięcia wszystkich takich przeciwciał. Korzystnie prowadzi się kontrolę negatywną stosując antysurowice z odpowiednich ludzkich dawców, to znaczy takich, których testowano wielokrotnie i nie znaleziono u nich przeciwciał przeciwko wirusowi. W alternatywnej strategii przeszukiwania, wykorzystuje się jeden lub większą liczbę znakowanych oligonukleotydów jako sondy hybrydyzacyjne. Zastosowanie oligonukleotydów w poszukiwaniu biblioteki cDNA jest ogólnie prostsze i bardziej wiarygodne niż przeszukiwanie za pomocą antysurowic. Oligonukleotydy te syntetyzuje się, korzystnie stosując ujawnione w niniejszym opisie informacje o sekwencji DNA. W celu charakteryzacji i identyfikacji dodatnich klonów przeprowadza się jedną lub większą liczbę dodatkowych rund przeszukiwania tym samym lub innym sposobem.

Posiadając zidentyfikowany pierwszy dodatni klon, bibliotekę ponownie przeszukuje się pod kątem dodatkowych dodatnich klonów, stosując pierwszy klon jako sondę hybrydyzacyjną. Alternatywnie, lub dodatkowo, przygotowuje się następnie biblioteki i przeszukuje sięje stosując testy immunologiczne lub sondy hybrydyzacyjne. W ten sposób otrzymuje się dalsze sekwencje DNA.

Alternatywnie, syntetyzuje się sekwencję DNA kodującą polipeptyd wirusowy PTNANBH. W pewnych okolicznościach synteza jest korzystniejsza od klonowania DNA (Gait, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, 1984 Oxford, IRL Press).

Sklonowaną lub zsyntezowaną pożądaną sekwencję DNA wstawia się do wektora ekspresyjnego stosując znane i standardowe techniki. Wektor ekspresyjny trawi się zwykle przy użyciu enzymów restrukcyjnych i sekwencję DNA wstawia się stosując ligację tępych lub lepkich końców. Cięcia dokonuje się zazwyczaj w miejscu restrykcyjnym w dogodnej pozycji wektora ekspresyjnego tak, że po wbudowaniu sekwencja DNA pozostaje pod kontrolą fragmentów funkcjonalnych DNA, co umożliwia ekspresję.

Transformację komórki gospodarza prowadzi się przy zastosowaniu znanych sposobów. Zazwyczaj do rozróżnienia pomiędzy transformantami, które z powodzeniem pobrały, a tymi które nie pobrały wektora ekspresyjnego, wykorzystuje się pewne markery fenotypowe. Stransformowane komórki gospodarza hoduje się znanymi sposobami i izoluje się polipeptyd wirusowy PT-NANBH przy zastosowaniu znanych technik.

Polipeptyd wytworzony sposobem według wynalazku stosuje się do wytwarzania przeciwciała specyficznego wobec polipeptydu wirusowego PT-NANBH. Wytwarza się przeciwciało poliklonalne lub monoklonalne. Przeciwciała takie stosuje się w kontroli jakości do testowania serii polipeptydu wirusowego PT-NANBH; do oczyszczania polipeptydu wirusowego PTNANBH lub lizatu wirusowego; mapowania epitopów; po wyznakowaniu, jako koniugat w oznaczeniu typu współzawodniczego, do wykrywania przeciwciał i do oznaczenia i wykrywania antygenów.

Przeciwciało poliklonalne skierowane przeciwko polipeptydowi wirusowemu PTNANBH wytworzonemu sposobem według wynalazku otrzymuje się przez iniekcje polipeptydu wirusowego PT-NANBH, dowolnie sprzężonego z nośnikiem w celu pobudzania odpowiedzi immunologicznej, gospodarzowi będącemu ssakiem, takim jak mysz, szczur, owca lub królik. Tak wytworzone przeciw ciało odzyskuje się. Polipeptyd wirusowy PT-NANBH podaje się na ogół w postaci odpowiedniej do iniekcji, w której polipeptyd jest zmieszany z fizjologicznie dopuszczalnym rozcieńczalnikiem. Do postaci tej można włączyć adiuwanty, takie jak kompletny adiuwant Freunda (FCA) lub niekompletny adiuwant Freunda (FIA). Tę postać wstrzykuje się zwykle gospodarzowi w ciągu odpowiedniego okresu czasu, w odpowiednich odstępach czasu pobiera się próbki osocza do oznaczania przeciwciała anty-wirus PT-NANBH. Po wykryciu odpowiedniego poziomu aktywności, pobiera się krew od gospodarza. Następnie, stosując standardowe techniki, np. chromatografię na białku A lub chromatografię jonowymienną, przeciwciało ekstrahuje się i oczyszcza z osocza krwi.

Przeciwciało monoklonalne skierowane przeciwko polipeptydowi wirusowemu PTNANBH wytworzonemu sposobem według wynalazku otrzymuje się na drodze fuzji komórek nieśmiertelnej linii komórkowej z komórkami wytwarzającymi przeciwciało skierowane przeciwko polipeptydowi wirusowemu. Następnie hoduje się otrzymaną na skutek fuzji nieśmiertelną linię komórkową. Zazwyczaj polipeptydem wirusowym inokuluje się gospodarza będącego ssakiem innym od człowieka, takiego jak mysz lub szczur. Po upływie odpowiedniego czasu potrzebnego do wytworzenia u gospodarza przeciwciał, usuwa się komórki wytwarzające przeciwciała, takie jak splenocyty. Komórki nieśmiertelnej linii komórkowej, takiej jak linii komórkowej szpiczaka myszy lub szczura, poddaje się fuzji z komórkami wytwarzającymi przeciwciała, i produkty fuzji testuje się w celu identyfikacji linii komórkowej, takiej jak hybrydoma, która wydziela pożądane przeciwciało monoklonalne. Powstałą w wyniku fuzji linię komórkową hoduje się, a przeciwciało monoklonalne oczyszcza się z podłoża hodowlanego w sposób podobny do oczyszczania przeciwciała poliklonalnego. Próby diagnostyczne oparte na sposobie wykrywania według wynalazku stosuje się do określania obecności lub nieobecności PT-NANBH. Stosuje się je również do monitowania leczenia takich infekcji, przykładowo w terapii interferonowej.

W próbie stosowanej w celu diagnozowania infekcji wirusowej stosuje się trzy zasadniczo różne sposoby obejmujące wykrywanie wirusowego kwasu nukleinowego, wykrywanie antygenu wirusowego lub przeciwciał skierowanych przeciwko wirusowi. Wirusowy kwas nukleinowy na ogół uważa się za najlepszy wskaźnik obecności samego wirusa służy on do diagnozowania w przypadku prawdopodobnie zainfekowanego materiału. Wykrywanie kwasu nukleinowego nie jest jednakże zazwyczaj tak proste jest wykrywanie antygenów lub przeciwciał, ponieważ poziom kwasu nukleinowego może być bardzo niski. Antygen wirusowy wykorzystuje się jako marker obecności wirusa i jako wskaźnik infekcyjności. W zależności od wirusa, ilość obecnego w próbce antygenu może być bardzo niska i trudna do wykrycia. Wykrywanie przeciwciał jest stosunkowo proste, ponieważ, w rzeczywistości, układ immunologiczny gospodarza wzmacnia odpowiedź na infekcję przez wytwarzanie dużych ilości krążących przeciwciał. Charakter odpowiedzi humoralnej często może być użyteczny klinicznie, na przykład, na niedawną infekcję wskazuje raczej klasa przeciwciał IgM niż IgG, lub odpowiedź na konkretny antygen wirusowy może być związana ze stopniem zniszczenia wirusa. A zatem, dokładne dopasowanie sposobu diagnozowania infekcji wirusowej zależy od konkretnych okoliczności i potrzebnych informacji. W przypadku PT-NANBH, oznaczenie diagnostyczne może wykorzystywać jeden z tych trzech sposobów.

Wirusowy kwas nukleinowy można wykrywać w ten sposób, że hybrydyzuje się wirusowy RNA obecny w testowanej próbce, lub cDNA syntezowany na matrycy takiego wirusowego RNA, o sekwencji DNA odpowiadającej sekwencji nukleotydowej o numerach identyfikacyjnych: 3,4,5 18, 19,20,21 lub 22, i testuje się powstałe hybrydy kwasów nukleinowych w celu identyfikacji wirusowego kwasu nukleinowego PT-NANBH. Zastosowanie tej metody wykrywania kwasu nukleinowego ogranicza się zazwyczaj do testowanej próbki odpowiedniej tkanki, takiej jak pochodząca z biopsji tkanka wątroby, w której prawdopodobna jest obecność wirusowego RNA na wysokim poziomie. Sekwencja DNA odpowiadająca sekwencjom nukleotydowym o numerach identyfikacyjnych: 3,4, 5, 18, 19, 20, 21 lub 22 może przybierać formę sekwencji oligonukleotydowej lub sekwencji cDNA ewentualnie zawartej w plazmidzie. Testowanie hybryd kwasów nukleinowych przeprowadza się korzystnie, stosując znakowaną sekwencję DNA. W celu dalszej charakteryzacji hybryd, a zatem identyfikacji wirusowego kwasu nukleinowego PT-NANBH, przeprowadza się jedną lub większą liczbę dodatkowych rund testowania tym samym lub innym sposobem. Etapy hybrydyzacji i testowania przeprowadza się zgodnie ze znanymi sposobami.

Z powodu ograniczonego zastosowania takiej metody w oznaczaniu wirusowego kwasu nukleinowego, korzystny i bardziej dogodny sposób polega na tym, że syntetyzuje się cDNA na

167 059 matrycy wirusowego RNA obecnego w testowanej próbce, amplifikuje się wstępnie wyselekcjonowaną sekwencję DNA odpowiadającą subsekwencji nukleotydowych o numerach identyfikacyjnych: 3,4, 5, 18, 19, 20,21 lub 22 i identyfikuje się wstępnie wyselekcjonowaną sekwencję DNA. Testowaną próbkę stanowi próbka każdej odpowiedniej tkanki lub płynu fizjologicznego, który korzystnie zatęża się pod względem obecnego wirusowego RNA. Przykłady odpowiedniej tkanki obejmują tkankę pochodzącą z biopsji wątroby. Przykłady odpowiednich płynów fizjologicznych obejmują mocz, osocze, surowicę, nasienie, łzy, ślinę lub płyn mózgowo-rdzeniowy. Korzystnie stosuje się surowicę i osocze.

Syntezę cDNA zwykle przeprowadza się na drodze odwrotnej transkrypcji z zastosowaniem starterów losowych, starterów określonych lub starterów oligo-dT. Korzystnie stosuje się sarter stanowiący oligonukleotyd o sekwencji nukleotydowej odpowiadającej sekwencji o numerach identyfikacyjnych: 3, 4, 5, 18, 19, 20, 21 lub 22, który przeznaczony jest do wzbogacania cDNA zawierającego wstępnie wyselekcjonowaną sekwencję.

Amplifikację wstępnie wyselekcjonowanej sekwencji DNA przeprowadza się stosując technikę reakcji łańcuchowej polimerazy (PGR) (Saiki i inni, Science, 1985, 230, 1350-4). W technice tej wykorzystuje się parę starterów oligonukleotydowych, z których jeden odpowiada części sekwencji nukleotydowej o numerach identyfikacyjnych: 3,4,5 18, 19,20,21 lub 22, a drugi z nich zlokalizowany jest po stronie 3' pierwszego startera i odpowiada części sekwencji komplementarnej. Para starterów określa zawartą między nimi wstępnie wyselekcjonowaną sekwencję DNA. Oligonukleotydy posiadają zazwyczaj długość przynajmniej 15, najkorzystniej 20 do 26 zasad 1, chociaż niewielkie błędy mogą być tolerowane przez zmianę warunków reakcji, koniec 3’ oligonukleotydów powinien być dokładnie komplementarny aby startery działały efektywnie. Odległość pomiędzy końcem 3’ oligonukleotydów może wynosić od około 100 do około 2000 zasad. Dogodnie, jednego z pary oligonukleotydów stosowanych w tej technice używa się także jako startera do syntezy cDNA. Za pomocą techniki PCR przeprowadza się syntezę z cDNA w formie jednoniciowej, stosując enzym, taki jak polimeraza Taq, i wydłuża startery oligonukleotydowe w 20-40 cyklach, zgodnie z opublikowanymi procedurami (Salki i inni, Science, 1988,239,487-491).

W celu udoskonalenia sposobu przeprowadza się kilka rund amplifikacji, z których w każdej stosuje się inną parę oligonukleotydów jako startery. A zatem, po pierwszej rundzie amplifikacji, w drugiej rundzie stosuje się wewnętrzną parę oligonukleotydów określających krótszą sekwencję dNa (o długości od 50 do 500 zasad). W tym nieco bardziej pewnym udoskonaleniu zwanym Nested PCR jest ona oczywiście końcową zamplifikowaną sekwencją DNA, która stanowi sekwencję wstępnie wyselekcjonowaną. (Kemp i inni, Proc. Natl, Acad, Sci., 1989,86(7), 2423-7 i Mullis i inni, Methods in Enzymology, 1987,155, 335-350).

Wyselekcjonowaną uprzednio sekwencję DNA identyfikuje się przez analizę produktów PCR na żelu agarozowym. Obecność prążka o masie cząsteczkowej obliczonej dla wyselekcjonowanej uprzednio sekwencji stanowi dodatni wskaźnik obecności wirusowego kwasu nukleinowego w testowanej próbce. Alternatywne sposoby identyfikacji obejmują metody oparte na blottingu Southema, dot-blottingu, trawieniu restrykcyjnym oligomerów i sekwencjonowaniu DNA.

Niniejszy opis ujawnia także zestaw testujący do wykrywania wirusowego kwasu nukleinowego PT-NANBH, który zawiera:

I) parę starterów oligonukleotydowych, z których jeden odpowiada części sekwencji nukleotydowej o numerach identyfikacyjnych: 3, 4, 5, 18, 19, 20, 21 lub 22, a drugi z nich zlokalizowany jest po stronie 3’ pierwszego startera i odpowiada części sekwencji komplementarnej. Para starterów określa zawartą między nimi wstępnie wyselekcjonowaną sekwencję DNA;

II) odwrotną transkryptazę do syntezy cDNA na matrycy RNA testowanej próbki na odcieku od startera odpowiadającego sekwencji nukleotydowej komplementarnej do sekwencji o numerach identyfikacyjnych: 3,4, 5 18, 19,20,21 lub 22;

III) enzym zdolny do amplifikacji wstępnie wyselekcjonowanej sekwencji DNA i ewentualnie;

IV) roztwory do przemywania i bufory reakcyjne.

167 059

Zestaw testujący może także dodatnią próbkę kontrolną ułatwiającą identyfikację wirusowego kwasu nukleinowego.

Charakterystyki starterów i enzymów są korzystnie takie jak opisano powyżej w związku z techniką PCR.

Sposób wykrywania antygenu wirusowego lub przeciwciała przeciwko temu wirusowi polega na tym, że kontaktuje się testowaną próbkę z polipeptydem wirusowym PT-NANBH wytworzonym według wynalazku, bądź też z poliklonalnym lub monoklonalnym przeciwciałem skierowanym przeciwko polipeptydowi, i określa się czy w testowanej próbce występuje jakieś wiązanie antygen-przeciwciało. Do tego celu służy zestaw testujący zawierający, zdefiniowany w niniejszym opisie, polipeptyd wirusowy PT-NANBH bądź monoklonalne lub poliklonalne przeciwciało skierowane przeciwko niemu, i sposób określania, czy występuje jakieś wiązanie z, przeciwciałem lub antygenem, odpowiednio, zawartym w testowanej próbce. Testowaną próbkę do wykrywania wirusowego kwasu nukleinowego pobiera się z każdej ze wspomnianych powyżej odpowiednich tkanek oraz z płynów fizjologicznych. Jeśli otrzymuje się płyn fizjologiczny ewentualnie zatęża się go pod kątem obecnego antygenu wirusowego lub przeciwciała skierowanego przeciwko wirusowi.

Stosuje się różne sposoby oznaczania. Polipeptyd wirusowy można zastosować do specyficznego wychwytywania przeciwciała skierowanego przeciwko PT-NANBH z roztworu, do specyficznego znakowania przeciwciała już wychwyconego lub do zarówno wychwytywania, jak i znakowania przeciwciała. Ponadto, polipeptyd wirusowy można zastosować w różnych homogennych sposobach oznaczenia, w których wykrywa się przeciwciało reaktywne wobec antygenu w roztworze, bez rozdziału faz.

Typy oznaczeń, w których do wychwytywania przeciwciała z roztworu stosuje się polipeptyd wirusowy PT-ANBH, obejmują immobilizację polipeptydu na stałej powierzchni. Powinno być możliwe przemywanie powierzchni w jakikolwiek sposób. Przykłady odpowiednich powierzchni obejmują polimery różnych typów (odlewanych w kształcie studzienek do mikromiareczkowania; perełek; różne typy prętów; końcówki aspiratora; elektrody i przyrządy optyczne), cząstki (na przykład lateks; stabilizowane krwinki czerwone; komórki bakteryjne lub grzybowe; zarodniki; złoto lub inne zole metaliczne lub zawierające metal i koloidy białkowe) o wielkości cząstek od 0,02 do 5 mikrometrów; membrany (np. nitrocelulozowe; papier; octan celulozy i membrany o dużej porowatości / dużej powierzchni z materiału organicznego lub nieorganicznego).

Wiązanie polipeptydu wirusowego PT-NANBH z powierzchnią może następować w wyniku biernej adsorbcji z roztworu o optymalnym składzie, który zawiera środki powierzchniowo czynne, rozpuszczalniki, sole i/lub czynniki chaotropowe, lub może następować na drodze aktywnego wiązania chemicznego. Aktywne wiązanie może zachodzić poprzez różnorodne reaktywne lub mogące ulegać aktywacji grupy funkcjonalne, które eksponowane są na powierzchni (na przykład czynniki kondensujące; aktywne estry kwasowe, halogenki i bezwodniki; grupy aminowe, hydroksylowe lub karboksylowe; grupy sulfhydrylowe; grupy karbonylowe; grupy diazowe lub nienasycone). Ewentualnie aktywne wiązanie może zachodzić poprzez białko (związane z powierzchnią biernie lub przez aktywne wiązanie), takie jak albumina lub kazeina, z którym chemicznie związuje się polipeptyd wirusowy przy zastosowaniu różnych metod. Ten sposób zastosowania białka może stanowić zaletę z powodu punktu izoelektrycznego, ładunku, hydrofilowości lub innych właściwości fizykochemicznych. Polipeptyd wirusowy można także związać z powierzchnią (zazwyczaj, choć niekoniecznie, membraną) po elektroforetycznym rozdziale mieszaniny reakcyjnej, takim jak immunoprecypitacja.

Po zetknięciu (reakcji) powierzchni niosącej polipeptyd wirusowy PT-NANBH z testowaną próbką, pozostawieniu czasu na przereagowanie i, jeśli jest to konieczne po usunięciu nadmiaru próbki jednym z wielu sposobów (takich jak przemywanie, wirowanie, sączenie, działanie magnetyczne lub kapilarne), wychwycone przeciwciało wykrywa się różnymi sposobami, takimi które zapewniają wykrywalny sygnał. Można to osiągnąć, na przykład, przez zastosowanie znakowanej cząsteczki lub cząstki, jak to opisano powyżej, która reaguje z wychwyconym przeciwciałem (na przykład białko A, białko G i podobne; przeciwciała skierowane przeciwko immunoglobulinom określonych gatunków lub podklasom immunoglobulin;

167 059 czynnik reumatoidalny lub przeciwciało skierowane przeciwko antygenowi, zastosowane w sposób współzawodniczący lub blokujący), lub każdej cząsteczki zawierającej epitop zawarty w polipeptydzie.

Wykrywalny sygnał może być sygnałem optycznym, radioaktywnym lub fizykochemicznym, i uzyskuje się go bezpośrednio przez znakowanie cząsteczki lub cząstki na przykład barwnikiem, znacznikiem radioaktywnym, aktywnym elektrycznie lub wykazującym rezonans magnetyczny lub fluoroforem, lub pośrednio, przez znakowanie cząsteczki lub cząstki enzymem zdolnym do wywołania mierzalnej zmiany jakiegokolwiek rodzaju. Alternatywnie, jeśli powierzchnia ma postać cząstek, wykrywalny sygnał można uzyskać stosując, na przykład, aglutynację, lub poprzez dyfrakcję lub efekt podwójnego załamania.

Oznaczenia, w których do znakowania przeciwciała już wychwyconego stosuje się sam polipeptyd wirusowy, wymagają pewnych form znakowania antygenu, które umożliwiać będą jego wykrycie. Znakowanie można przeprowadzać bezpośrednio przez chemiczne lub bierne wiązanie, na przykład, znacznika radioaktywnego, znacznika rezonansu magnetycznego, znacznika cząstkowego lub enzymatycznego z polipeptydem, lub pośrednio, przez wiązanie jakiejkolwiek postaci znacznika z cząsteczką, która sama będzie reagować z polipeptydem. Znacznik z polipeptydem wirusowym PT-NANB można wiązać bezpośrednio, przez grupę już obecną w polipeptydzie, taką jak grupa aminowa, lub przez grupę pośredniczącą, taką jak grupa maleimidowa. Przeciwciało może być wychwytywane przez każdy reagent na każdej ze wspomnianych już powierzchni dzięki biernej lub aktywowanej adsorpcji, której wynikiem będzie związanie przeciwciała lub kompleksów immunologicznych. W szczególności, przeciwciała mogą być wychwytywane przez przeciwciała skierowane przeciwko immunoglobulinom określonych gatunków lub podklasom immunoglobulin; czynnik reumatoidalny, białka A i G i podobne, lub przez każdą cząsteczkę zawierającą epitop zawarty w polipeptydzie.

Znakowany polipeptyd wirusowy PT-NANBH stosuje się we współzawodniczym sposobie wiązania, w którym jego wiązanie z każdą specyficzną cząsteczką na każdej z powierzchni podanych przykładowo powyżej blokuje antygen zawarty w próbce. Alternatywnie, polipetyd stosuje się w sposób niewspółzawodniczy, w którym antygen w próbce wiąże się specyficznie lub niespecyficznie z każdą z powierzchni podanych powyżej i wiąże się także ze specyficzną cząsteczką dwu- lub wielowartościową (np. przeciwciałem) o pozostałych wartościowościach walencyjnych, które wychwytują znakowany polipeptyd.

Często w homogennych sposobach oznaczania oddzielnie znakuje się polipeptyd wirusowy PT-NANBH i przeciwciało tak, że kiedy przeciwciało reaguje z polipeptydem wirusowym w wolnym roztworze, dwa znaczniki oddziaływują ze sobą, co umożliwia na przykład bezpromienisty transfer energii z jednego znacznika do drugiego, i stwarza możliwość detekcji wzbudzonego drugiego znacznika lub wygaszonego pierwszego (np. przez fluorymetrię, rezonans magnetyczny lub pomiar enzymatyczny). Wynikiem dodania w próbce polipeptydu wirusowego bądź przeciwciała jest ograniczenie oddziaływań pary znaczników, a zatem inny poziom sygnału w detektorze.

Odpowiednim oznaczeniem do wykrywania przeciwciała skierowanego przeciwko PTNANBH jest bezpośrednio oznaczenie immunoenzymatyczne typu sandwich (EIA). Polipeptydem wirusowym PT-NANBH opłaszcza się studzienki do mikromiareczkowania. Jednocześnie dodaje się testowaną próbkę oraz polipeptyd wirusowy PT-NANBH sprzężony z enzymem. Przeciwciała skierowane przeciwko PT-NANBH obecne w testowanej próbce wiążą się zarówno z polipeptydem wirusowym opłaszczającym studzienkę, jak i z polipeptydem wirusowym sprzężonym z enzymem. Zazwyczaj po obu stronach sandwicha stosuje się ten sam polipeptyd wirusowy. Po przepłukaniu, związany enzym wykrywa się stosując specyficzny substrat zmieniający barwę po przejściu w produkt. Zestaw testujący do stosowania w oznaczeniu EIA zawiera:

(1) polipeptyd wirusowy PT-NANBH znakowany enzymem;

(2) substrat enzymu;

(3) środek dostarczający powierzchni na której immobilizuje się polipeptyd wirusowy PT-NANBH; i (4) ewentualnie roztwory do przemywania i/lub bufory.

167 059

Polipeptydy wirusowe wytworzone sposobem według wynalazku włącza się do szczepionki przeznaczonej do indukcji odporności na PT-NANTH u człowieka. Do tego celu polipeptyd wirusowy może występować w połączeniu z farmakologicznie dopuszczalnym nośnikiem.

Polipeptyd wirusowy stosowany w szczepionce ewentualnie występujejako część fuzyjnej cząstki rdzenia wirusa zapalenia wątroby typu B, jak opisano w Clarke i inni, Nature, 1987,330, 381 -384, lubjako polimer oparty na polilizynie,jak opisano w Tam, PNAS, 1988,85,5409-5413. Alternatywnie, polipeptyd wirusowy można ewentualnie przyłączyć do struktury cząstkowej takiej jak liposomy lub ISCOMS.

Farmakologicznie dopuszczalne nośniki obejmują płynne podłoża odpowiednie do stosowania przy wprowadzaniu polipeptydu wirusowego do organizmu pacjenta. Przykładem takiego płynnego podłoża jest roztwór soli fizjologicznej. Sam polipeptyd wirusowy rozpuszcza się lub zawiesza się w postaci stałej w nośniku.

Szczepionka może także zawierać adiuwant do stymulacji odpowiedzi immunologicznej, wzmacniający działanie szczepionki. Przykłady adiuwantów obejmują wodorotlenek glinowy i fosforan glinowy.

Szczepionka zawiera polipeptyd wirusowy w stężeniu końcowym w zakresie od 0,01 do 5 mg/ml, korzystnie od 0,03 do 2 mg/ml. Szczepionkę wprowadza się do jałowego pojemnika, który następnie zamyka się i przechowuje w niskiej temperaturze, na przykład w temperaturze 4°C, lub liofizuje się ją.

W celu indukcji odporności ludzi na PT-NANBH, podaje się jedną lub więcej dawek szczepionki. Każda dawka ma objętość 0,1 do 2 ml, korzystnie 0,2 do 1 ml. Sposób indukowania odporności ludzi na PT-NANBH obejmuje podawanie skutecznej ilości szczepionki określonej powyżej.

Niniejszy opis ujawnia także sposób stosowania polipeptydu wirusowego PT-NANBH do wytwarzania szczepionki indukującej odporność na PT-NANBH u ludzi.

Szczepionki podaje się stosując dogodne sposoby podawania szczepionek, włącznie z podawaniem doustnym i pozajelitowym (np. przez iniekcje dożylne, podskórne lub domięśniowe). Podaje się pojedynczą dawkę szczepionki lub wiele dawek w ciągu pewnego okresu czasu.

Następujące stransformowane szczepy E. coli zdeponowano, w podanych dniach, w National Collection of Type Cultures (NCTC), Central Public Health Laboratory, 61 Colindake Avenue, Londyn, NW9 5HT;

I) E. coli TG1 stransformowany plazmidem pDX113 (WD001); numer depozytu NCTC 12369; 7 grudnia 1989 r.

II) E. coli TG1 stransformowany plazmidem pDX128 (WD002); numer depozytu NCTC 12382; 23 lutego 1990 r.

III) E. coli TG1 stransformowany plazmidem pl36/155 (WD003); numer depozytu NCTC 12-428; 28 listopada 1990 r.

IV) E. coli TG1 stransformowany plazmidem p 156/92 (WD004); numer depozytu NCTC 12429; 28 listopada 1990 r.

V) E. coli TG 1 stransformowany plazmidem p 129,/164 (WD005); numer depozytu NCTC 12430; 28 listopada 1990 r., oraz ponownie w dniu 8 stycznia 1991 pod tym samym numerem, z uwagi na to, że szczep zdeponowany w dniu 28 listopada 1990 r. okazał się być niezdolnym do przeżycia.

VI) E. coli TG1 stransformowany plazmidem pDX136 (WD006); numer depozytu NCTC 12431; 28 listopada 1990r.

Opis figur rysunku:

Figura 1 przedstawia wytwarzanie plazmidu pDX122 opisanego w przykładzie VII,

Figura 2 przedstawia wytwarzanie dwóch alternatywnie sfuzjowanych sekwencji opisanych w przykładzie XVII,

Figura 3 przedstawia mapy restrykcyjne sekwencji o numerach identyfikacyjnych 21 i 22,

Figura 4 przedstawia sekwencję o numerze identyfikacyjnym 3,

Figura 5 przedstawia sekwencję o numerze indentyfikacyjnym 4,

Figura 6 przedstawia sekwencję o numerze identyfikacyjnym 5,

Figura 7 przedstawia sekwencję o numerze identyfikacyjnym 18,

167 059

Figura 8 przedstawia sekwencję o numerze identyfikacyjnym 19,

Figura 9 przedstawia sekwencję o numerze identyfikacyjnym 20,

Figura 10 przedstawia sekwencję o numerze identyfikacyjnym 21,

Figura 11 przedstawia sekwencję o numerze identyfikacyjnym 22,

Figura 12 przedstawia sekwencję o numerze identyfikacyjnym 24,

Figura 13 przedstawia sekwencję o numerze identyfikacyjnym 25.

Następujące przykłady podano w celu zilustrowania niniejszego wynalazku.

Przykład I. Synteza cDNA. Połączone osocza (160 ml) pochodzące od dwóch osobników (określonych jako A i L), o których wiadomo było, że zostali zarażeni NANBH przez transfuzję rozcieńczono (1:2,5) solą fizjologiczną zbuforowaną fosforanem (PBS), a następnie wirowano przy 190 000 g (np. 30 000 rpm w rotorze MSE 8x50) przez 5 godzin w temperaturze 4°C. Supernatant zachowano jako źródło specyficznych przeciwciał do późniejszego przeszukiwania bibliotek cDNA. Osad ponownie zawieszono w 2 ml buforu o składzie: 20 mM Tris-HCl, 2 mM EDTA, 3% SDS, 0,2 M NaCl (2xPK), ekstrahowano trzykrotnie równą objętością fenolu, trzykrotnie chloroformem i raz eterem, a następnie 2,5 objętościami etanolu w temperaturze -20°C. Osad ponownie zawieszono w 10 gl buforu o składzie: 10 mM Tris-HCl, 1 ml EDTA o pH 8,0 (TE).

Kwas nukleinowy zastosowano jako matrycę w zestawie do syntezy cDNA (Amersham International plc, Amersham, Wielka Brytania), a jako startery zarówno oligo-dT jak i losowo wybrane heksanukleotydy. Warunki reakcji zastosowano zgodnie z zaleceniami dostawcy zestawu. Szczegółowo, do reakcji syntezy pierwszej nici zastosowano i 1 gl kwasu nukleinowego, którą wyznakowano [a-³²P]dCTP (Amersham; aktywność właściwa 3000 Ci/mmol) w objętości końcowej 20 gi i inbobowano w temperaturz2 42°C przez 1 dodzinę. Całąmieszani nę reakcyjną po syntezie pierwszej aici zastosowano następnie w reakcji syntezy drugiej nici. Mieszaninę reakcyjną zawierającą RNazę Η E. Coli (0,8 U) i polimerazę DNA I w objętości końcowej 100 gl inkubowano w przez 60 minut temperaturze 12°C, a następnie przez 60 minut w temperaturze 22°C. Całą mieszaninę reakcyjną inkubobaao następnie przez 10 minut w temperaturze 70°C, umieszczono na lodzie, dodano 1 U polimerazy DNA faga T4 i następnie iaknbobaao przez 10 minut w temperaturze 37°C. Reakcję zatrzymano przez dodanie 5 gl 0,2 M EDTA o pH 8.

^wbudowane nukleotydy usunięto z mieszaniny reakcyjnej na kolumnie NICK Pharmacia Ltd, Milton Keynes, Wielka Brytania). Następnie DNA ekstrahowano dwukrotnie fenolem, trzykrotnie chloroformem i raz eterem, a następnie, przed wytrąceniem 2,5 objętościami 100% etanolu, dodano 20 gg dekstranu.

P r z y k ł a dli. Wytwatzanie bibliotek ekspeesynnych

Wysuszony osad cDNA ponownie zawieszono w 5 gl jałowego TE i następnie inkubobana przez 3 godziny w temperaturze 15°C z 500 ng łączników EcoRI (Pharmacia; GGAATTCC ufosfornlabany) i 0,5 U ligazy DNA faga T4 (New England BioLabs, Beverley, MA, USA) w roztworze o objętości końcowej 10 gl zawierającym 20 mM Tris. HC1 pH 7,5 10 mM MgCh, 10 mM DTT, 1 mM ATP. Ligazę zinaktywobaao przez ogrzewanie w temperaturze 65°C przez 10 minut i cDNA trawiona przez 1 godzinę w temperaturze 37°C 180 U restpyetazy EcoRI (BCL, Lewes, Wielka Brytania) w końcowej objętości 100 gl. Dodano EDTA do stężenia końcowego 10 mM i i cłą miεeeznina rpwkeySya nałoaoaana kkom^nn z AcA34ZLXB).Zbieepnafrpkeye ( 50 gl) i mierzono ich radioaktywność w liczniku scyntylacyjnym. Zebrano pik cDNA w objętości elucyjnej (980 cpm), ekstrahowano dwukrotnie fenolem, trzykrotnie chloroformem i raz eterem, a następnie wytrącono etanolem.

Dbnaicioby cDNA ponownie zawieszaaa w 5 gl TE i ligowano przez noc w temperaturze 15°C z ramionami EcoRI faga lambda gt11 (Gibco, Paisley, Szkocja) w 10 gl mieszaniny reakcyjnej zawierającej 0,5 U ligazy DNA faga T4, 66 mM Tris-HCl, 10 mM MgCfe, 15 mM DTT, pH 7,6. Po inaktywacji ligazy przez ogrzewanie przez 10 minut w temperaturze 65°C, 5 gl mieszaniny reakcyjnej dodano do zestawu do pakowania do kapsydów Amersham i iaeubobaao w temperaturze 22°C przez 2 godziny. Miano upakowanego materiału określano na szczepie E. coli Y1090 (HuswC i in., 1985) i stwierdzono 2,6x104 rekombinantów.

167 059

Komórki do wysiewania (Y1090) przygotowano przez inokulację 10 ml L-bulionu pojedynczą kolonią z płytki agarowej i wytrząsanie przez noc w temperaturze 37°C. Następnego dnia 0,5 ml nocnej hodowli i rozcieńczono 10 ml świeżego L-bulionu i dodano 0,1 ml MgSO₄ oraz 0,1 ml 20% (w/v) maltozy. Hodowlę wytrząsano przez 2 godziny w temperaturze 37°C, bakterie zebrano przez wirowanie przy 5000 g przez 10 minut i ponownie zawieszono w 5 ml 10 mM MgSO₄ w celu przygotowania zawiesiny podstawowej komórek do wysiewania. Część (1 μΐ) upakowanego materiału zmieszano z 0,2 ml komórek przygotowanych do wysiewania, inkubowano przez 20 minut w temperaturze 37°C przed dodaniem 3 ml agaru i całą mieszaninę wylano jako wierzchnią warstwę na płytki o średnicy 90 mm z α-agarem. Po całonocnej inkubacji w temperaturze 37°C liczono łysinki na płytkach i określono całkowitą liczbę zrekombinowanych fagów. Pozostały upakowany materiał przechowywano w temperaturze 4°C.

W zasadniczo podobny sposób przygotowano dodatkowe biblioteki.

Przykład III. Przeszukiwanie bibliotek ekspresyjnych

Opisaną w przykładzie II początkową bibliotekę wysiano na szczep Y1090 E. coli w stężeniu około 5x10^Tjednostek łysinkotwórczych na płytkę o średnicy 140 mm i namnażano przez 2 godziny w temperaturze 37°C, dopóki łysinki nie stały się widoczne. Na 3 godziny pozostawiono w styczności z płytką jałowe sączki nitrocelulozowe impregnowane IPTG (izopropylotiogalaktozydem), i następnie usunięto je. Sączki najpierw blokowano przez inkubację z roztworem blokującym [3% (w/v) BSA (albumina surowicy bydlęcej)/TBS-Tween (10 mM Tris-HCl pH 8 150 mM NaCl, 0,05% (v/v) Tween 20) zawierającym 0,05% bronidoks] (20 ml/sączek), a następnie przeniesiono do buforu do wiązania [1% (w/v) BSA/TBS/Tween zawierającego 0,05% bronidoks) zawierającego oczyszczone (przez chromatografię jonowymienną) przeciwciała pochodzące z połączonych osoczy osobników A i L (20 μg/ml). Po inkubacji w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, sączki przemyto trzykrotnie TBS-Tween, a następnie inkubowano w buforze do wiązania zawierającym biotynylowane przeciwciała owcy skierowane przeciwko immunoglobulinom ludzkim (1:250). Po jednej godzinie w temperaturze pokojowej sączki trzykrotnie przemyto TBS/Tween, a następnie inkubowano w buforze do wiązania zawierającym kompleks streptawidyna/peroksydaza (1:100). Reakcje barwną wywoływano DAB (diaminobenzydyną). Dodatnia reakcja uwidaczniała się w postaci (zabarwionych) łysinek.

Spośród całkowitej liczby 2,6x10⁴ przetestowanych łysinek, w wyniku pierwszej rundy przeszukiwania otrzymano 8 dodatnich rekombinantów. Stosując sączki jako wzorzec przeniesiono, stosując jałowe pipety pasterowskie, regiony oryginalnych płytek odpowiadające tym dodatnim sygnałom. Czopy agaru zawieszono w 0,1 ml buforu SM i umożliwiono fagom oddyfundowanie. Na szczepie Y1090 E. coli określono miano faga z każdego czopa agarowego. Następnie zawiesinę podstawową fagów każdego czopa agarowego ponownie przetestowano jak uprzednio, na pojedynczych płytkach o średnicy 90 mm przy stężeniu około 1 x 10³jednostek łysinkotwórczych na płytkę. Spośród 8 dodatnich rekombinantów z pierwszej rundy, w drugiej rundzie jeden był wyraźnie dodatni, tj. dodatnich było >1 % łysinek, nazwano je JG2. Odpowiada częstości dodatnich rekombinantów w bibliotece 40/10⁶.

Ten i inne dodatnie fagi zidentyfikowane w podobny sposób w innych opisanych bibliotekach, oczyszczono przez powtórzone rundy testowania łysinek przy niższej gęstości (1-200 jednostek łysinkotwórczych/płytkę o średnicy 90 mm) do momentu aż 100% łysinek nie było dodatnich w testowaniu przeciwciałem pochodzącym z osoczy osobników A i L. Trzema takimi zrekombinowanymi fagami były JG1, JG2 i JG3.

Przykład IV. Powtórne testowanie JG1, JG2 i JG3 z zestawami surowic.

Każdy ze zrekombinowanych fagów, JG1, JG2 i JG3, oczyszczono z łysinek i przechowywano jako zawiesinę podstawową o określonym mianie w buforze SM w temperaturze 4°C. Fagi te mieszano (1:1) z zawiesiną faga określonego w przykładzie III jako ujemny i mieszaninę stosowano do infekowania szczepu Y1090 E. coli przy stężeniu 1000 jednostek łysinkotwórczych na płytkę. Białka z łysinek przenoszono na sączki i postępowano z nimi jak opisano w przykładzie III, z tym wyjątkiem, że sączki cięto na ćwiartki, a każdą ćwiartkę inkubowano z innym przeciwciałem; były to przeciwciała z połączonych surowic osobników A i L (20 μg/ml), osocze A (1:500), osocze L (1:500) i IgG pacjenta H (20 gg/ml). Oczekiwano, że pacjent H okaże

167 059 się dodatnim pod względem obecności przeciwciał skierowanych przeciwko PT-NANB, ponieważ był on chorym na hemofilię otrzymującym czynnik VIII nie poddawany obróbce cieplnej. Po zakończeniu reakcji każdy sączek oceniano jako dodatni (kiedy wyraźnie występowały dwie klasy sygnałów) lub ujemny (kiedy wszystkie łysinki dawały ten sam sygnał). Mogła to być ocena subiektywna, i dlatego porównywano oceny i tylko te sączki uznawano za dodatnie, gdzie zachodziła największa zgodność. Wyniki przedstawiono w tabeli 1.

Tabela 1

	A l L	A	L	H
JG1 JG2 JG3	+ + +	♦ + +	♦	+ ♦

JG1, jak się okazało, reagował tylko z przeciwciałami pacjenta A, ale nie reagował z przeciwciałami pacjenta L czy H; nie takiego wyniku możnaby oczekiwać w przypadku prawdziwego, związanego z PT-NANBH, polipeptydu otrzymanego metodami rekombinacyjnymi, a zatem JG1 wyeliminowano z analizy. Zarówno JG2, jak i JG3 dały jednakże wyraźne dodatnie reakcje z trzema surowicami skierowanymi przeciwko PT-NANBH; te rekombinanty analizowano dalej.

Opisany powyżej typ analizy powtórnie zastosowano dla JG2 i JG3, z tym wyjątkiem, że sączki pocięto na mniejsze części, które inkubowano z zestawami surowic dodatnich i ujemnych. Zestawy dodatnich surowic obejmowały zestaw 10 surowic chorych na hemofilię i zestaw 9 surowic osób uzależnionych, stosujących narkotyki dożylnie. Dawcy ci stanowią najlepsze źródła surowic dodatnich nawet pomimo tego, że proporcja surowic dodatnich była nieznana. Zestaw surowic ujemnych otrzymano dawców pewnych, którzy byli przez wiele lat dokładnie badani przez North London Blood Transfusion Centre, Deansbrook Road, Edgware, Middlesex, Wielka Brytania i nigdy nie wykazywali żadnych oznak infekcji różnymi czynnikami włącznie z PT-NANBH. Wyniki te przedstawiono w tabelach 2 i 3

Tabela 2

	Nr	identyfikacyjny	JG2	JG3
narkomani		V19146	4/4	0/5
		V27063	2/4	0/5
		V29779	0/4	0/5
		V12561	0/5	4/5
		V15444	524	5Z5
		V!6342	4/4	0/5
		V6403	3/4	0/5
		V20001	4/4	0/5
		V21213	524	0/5
Chorzy na		M1562	4/4	4/5
hemofilię		M1581	525	525
		M1575	3/5	0/5
		Ml 579	5/5	525
		M1585	5/5	0/5
		M1576	1/5	1/5
		M1580	1/5	0/5
		Ml 576	1/5	0/5
		M1587	1/5	525
		Ml 577	2/5	1/5

Dodatnie reakcje zaznaczono przez podkreślenia.

167 059

Tabela 3

Chorzy na Dawcy

Narkomani hemofilię ujemni

JG2	6/9	(66%)	5/10	(50%)	0/10	(07)
JG3	2/9	(22%)	4/10	(40%)	0/10	(0%)
JG2 + JG3	1/9	(11%)	3/10	(30%)	0/10	(07)
JG2 lUb JG3	7/9	(777)	6/10	(60%)	0/10	(07)

Dane zgodne są z hipotezą, że oba rekombinanty eksprymują polipeptydy związane z czynnikiem odpowiedzialnym za PT-NANBH, i że polipeptydy te nie są identyczne, lecz mogą posiadać takie same pewne miejsca antygenowe.

Przykład V. Mapowanie restrykcyjne i sekwencjonowanie DNA JD2 i JG3

Część (10 pl) zawiesiny podstawowej fagów zarówno JG2, jak i JG3 utrzymywano w temperaturze wrzenia w celu denaturacji fagów i ekspozycji DNA. DNA ten zastosowano następnie jako matrycę w amplifikacji PCR z zastosowaniem polimerazy Tag. Każda mieszanina reakcyjna zawierała w objętości końcowej 50 pl co następuje: 10 mM Tris-HCl, 50 mM KC1,

1,5 mM MgCl2, 0,1% żelatynę pH 8,3 w temperaturze 25°C oraz startery oligonukleotydowe d19 i d20 (sekwencje o numerach identyfikacyjnych, odpowiednio, 1 i 2; 200 ng każdego); startery te zlokalizowane są w sekwencji faga lambda flankującej miejsce Eco RI do klonowania, i dlatego mogą służyć jako startery amplifikacji każdej sekwencji sklonowanej w tym miejscu.

Część mieszaniny reakcyjnej analizowano na 1,0% żelu agarozowym i porównano z markerami. Dzięki amplifikacji JG2 otrzymano fragment o długości około 2 Kb; JG3 fragment o długości około 1 Kb. Pozostałość mieszaniny reakcyjnej ekstrahowano fenolem/chloroformem w obecności 10 mM EDTA i 1% SDS, i DNA odzyskano przez wytrącanie etanolem. Zamplifikowany materiał trawiono następnie przez 60 minut 20 U restryktazy EcoRI w temperaturze 37°C i rozdzielono na 1 % żelu agarozowym LGT w TAE. Fragmenty o zmniejszonej zgodnie z oczekiwaniami wielkości wyeluowano i oczyszczono stosując Elutips (S&S). Wstawki JG2 i JG3 zligowano z plazmidem pUC13 strawionym restryktazą EcoRI i transformowano nimi szczep TG1 E. coli. Rekombinanty identyfikowano jako kolonie o barwie białej na płytkach X-gal/L-amp (płytki z L-agarem wzbogaconym o 100 pg/ml ampicyliny, 0,5 mg/ml X-gal) i sporządzono przez preparatykę plazmidu na małą skalę i trawienie enzymem restrykcyjnym EcoRI w celu określenia wielkości wstawki DNA. Zrekombinowany plazmid zawierający wstawkę JG2 nazwano DM415, a plazmid zawierający wstawkę JG3 nazwano DM416.

Sekwencję wstawki JG2 określono przez bezpośrednie sekwencjonowanie dwuniciowego plazmidu DNA i sekwencjonowanie w wektorach do sekwencjonowania opartych na fagu M13, takich jak mp18 i mp19, po którym następowało sekwencjonowanie jednoniciowe. Sekwencję wstawki JG3 określono w podobny sposób. Otrzymane sekwencje DNA i wywnioskowane sekwencje aminokwasowe przedstawiono na sekwencjach o numerach identyfikacyjnych 3 i 4.

Przykład VI. Ekspresja polipeptydu PT-NANBH w E. coli.

Plazmid pDM416 (5 pg) strawiono restryktazą EcoRI (20 U) w objętości końcowej 20 pl. Wstawkę o długości 1 Kb odzyskano przez wyeluowanie z 1% żelu agarozowego LGT. Następnie wypełniono powstałe lepkie końce EcoRI stosując fragment Klenowa i mieszaninę dNTP. DNA odzyskano przez wytrącenie etanolem po ekstrakcji mieszaniną fenol/chloroform. Fragment o tępych końcach zligowano z trawionym restryktazą SmaI i zdefosforylowanym plazmidem pDEv107 (wektorem, który umożliwia klonowanie w końcu 3’ genu lac Z). Następnie transformowano komórki E. coli TG1. Nastąpił 30-krotny wzrost koloni w porównaniu z kontrolą, w której zastosowano sam wektor. Transformanty zawierające pożądany zrekombinowany plazmid zidentyfikowano przez hybrydyzację z radioaktywną sondą wytworzoną przez amplifikację PCR rekombinanta JG3. W celu określenia orientacji wstawki, dwadzieścia kolonii zanalizowano przez trawienie enzymem restrykcyjnym (SalI) plazmidu przygotowanego

167 059 przez preparatykę na małą skalę. W jednej czwartej rekombinantów wstawka znajdowała się w orientacji właściwej do ekspresji sekwencji PT-NANBH w postaci białek fuzyjnego z β-galaktozydazą. Do dalszej analizy wzięto jeden z tych rekombinantów.

Kolonię pDX113 zastosowano do inokulacji 50 ml L-bulionu, namnażano wytrząsając w temperaturze 37°C do osiągnięcia średniej fazy wzrostu logarytmicznego i indukowano ekspresję przez dodanie 20 mM IPTG. Po trzech godzinach komórki zebrano przez wirowanie przy 5 (003 gprzez 20minut, ponownie zawieszono w 50 ml PBS i odwirowano. Osadzone komórki ponownie zawieszono w 5 ml buforu (25 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA 1 mg/ml lizozymu, 0,2% (v/v) Nonidet-P40, pH 8,0), na gram osadu i inkubowano w temperaturze 0°C przez 2 godziny. Uwolniony bakteryjny DNA strawiono przez dodanie DNazy I i MgSO4 do stężeń końcowych, odpowiednio, 40 μg/ml i 2 mM w celu redukcji lepkości.

Ten nieoczyszczony lizat analizowano przez elektroforezę na żelu poliakrylamidowym (PAGE) i białka wybarwiono błękitem Coomasiego. W bakteriach zawierających pDX113 indukcji uległo białko o masie cząsteczkowej około 150 kDa o masie cząsteczkowej. Oszacowano, że białko to stanowi 10-15% całkowitej ilości białka. Białka z podobnych żeli przeniesiono na membranę PVDF (GRI, Dunmow, Essex, Wielka Brytania) i membranę inkubowano z surowicami dodatnimi i ujemnymi pod względem PT-NANBH); białko o masie cząsteczkowej około 150 kDA reagowało z surowicami A i L, ale nie reagowało z normalną surowicą ludzką. Ścieżki zawierające lizaty E. coli eksprymującej β-galaktozydazę nie reagowały z surowicami A i L oraz normalną surowicą ludzką.

Do nieoczyszczonego lizatu dodano mocznika do stężenia końcowego 6 M i nierozpuszczalny materiał usunięto przez wirowanie. Ekstrakt w 6 M moczniku zastosowano bezpośrednio do opłaszczania przez 1 godzinę w temperaturze 37°C studzienek do mikromiareczkowania. Studzienki trzykrotnie przemyto dwukrotnie destylowaną wodą i następnie blokowano w temperaturze 37°C przez dodanie na 20 minut 0,25 ml 0,2% BSA zawierającej 0,02% NaN3 na studzienkę. Następnie zawartość studzienek odessano. Płytki kontrolne, opłaszczone nieoczyszczonym lizatem szczepu E. coli wytwarzającego β-galaktozydazę (pXY461) przygotowano w ten sam sposób. Płytki te użyto do oznaczeń ELISA opisanych w Przykładzie X.

Przykład VII. Ekspresja polipeptydu PT-NANBH w komórkach owadów

Wstawkę PT-NANBH z JG3, wyizolowaną jak opisano w Przykładzie V, sklonowano w wektorze pAc360 (Lucków i Summers, Biotechnology, 1988,6,47-55) w jednej ramce odczytu z pierwszymi 34 nukleotydami poliedryny, wykorzystując znajomość ramki odczytu genu lacZ w wektorze gt11. Zsyntetyzowano oligonukleotydy zdolne do hybrydyzacji z sekwencją gt11 flankującą miejsce klonowania EcoRI i zdolną do amplifikacji wstawki przez PCR. Oligonekluotydy te zawierały odpowiednio zlokalizowane miejsca restrykcyjne BamHI, umożliwiające bezpośrednie sklonowanie w miejscu BamHI plazmidu pAc360, z umieszczeniem wstawionego genu w jednej ramce odczytu z aminokońcową sekwencją poliedryny.

Małą ilość rekombinanta faga gtii - JG3 utrzymywano w temperaturze wrzenia w celu ekspozycji DNA i następnie zastosowano w amplifikacji PCR z wykorzystaniem starterów oligonukleotydowych d75 i d76 (sekwencje o numerach identyfikacyjnych 6 i 7 ; 200 mg) i 0,5 U polimerazy Tag.

Po amplifikacji mieszaninę reakcyjną ekstrahowano równą objętością mieszaniny fenol/chloroform, wytrącono etanolem i strawiono 10 U restryktazy BamHI w objętości końcowej 30 μ!. Zamplifikowany fragment poddano elektroforezie na 1% żelu agarozowym, wyeluowano 1, w celu wytworzenia konstrukcji przenoszącej pDX119, zligowano ze strawionym BamHI plazmidem pAc360. Zrekombinowanym plazmidem (2 μg) i DNA AcNPV typu dzikiego (1 μg) kotransfekowano komórki owadów przez wytrącanie z fosforanem wapnia. Ujemnego pod względem obecności wstawki zrekombinowanego wirusa wyselekcjonowano wzrokowo. Po trzech rundach oczyszczania a łysinek, zrekombinowany wirus (BHC-5) namnożono i na podstawie elektroforezy na żelu poliakrylamidowym z SDS (SDS-PAGE), blottingu Western i testu ELISA oszacowano ekspresję otrzymanego metodami rekombinacyjnymi białka w komórkach owadów. Zainfekowane komórki obficie wytwarzają eksprymowane białko o masie cząsteczkowej około 70 kDa. Białko to reaguje z surowicami skierowanymi przeciwko PTNANBH w blottingu Western i w teście ELISA.

167 059

W celu włączenia sekwencji JG2 w dodatku do sekwencji IG3 obecnej w BHC-5 skonstruowano następnego rekombinanta bakulowirusa (BHC-7), jak przedstawiono na figurze 1. W celu wytworzenia plazmidu pDX118, sekwencje PT-NANBH obecne w JD2 zamplifikowano i sklonowano w wektorze pAc360 jak opisano w powyżej 1, w celu wytworzenia konstrukcji przenoszącej pDX122, połączono razem odpowiednie fragmenty BamHI/SaII kolejno plazmidów pDX119 i pDX116 w pAc360.

Zrekombinowane plazmidy zidentyfikowano przez hybrydyzację i określono orientację wbudowanego DNA przez analizę restrykcyjną. Zrekombinowane wirusy wytworzono jak opisano powyżej i eksprymowane białko analizowano przez SDS-PAGE, blotting Western i test ELISA. W zainfekowanych komórkach stwierdzono obecność bardzo dużej ilości (40% całkowitej ilości białka komórkowego) polipeptydu o masie cząsteczkowej 95 kDa, reagującego z surowicami skierowanymi przeciwko PT-NANBH.

Przykład VHI. Oczyszczanie polipeptydu DX113.

Szczep TG1 E. coli zawierający plazmid pD113 (oznaczony jako szczep WDL001) namnażano i indukowano przez 5 godzin w tanku fermentacyjnym o objętości 1,5 litra (model SET002, SGI, Newhaven, East Sussex, Wielka Brytania) w temperaturze 37°C. Komórki zebrano przez wirowanie przy 5 000 g przez 20 minut i traktowano w następujący sposób:

a) Ekstrakcja

Wilgotne komórki ponownie zawieszono (1:20, w/v) w Buforze A (50 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, i 1 mM EDTA, 5 mM DTT, 10% (v/v) glicerol, pH 8,0). Dodano lizozym w postaci stałej w stężeniu 5 mg na ml zawiesiny, i mieszaninę pozostawiono w temperaturze 4°C. Po 15 minutach mieszaninę sonifikowano (amplituda całkowita 6 μ m) w lodzie przez całkowity okres 3 minut (6 x 30 sekund). Dodano DNazę I w stężeniu 4 μg/ml zawiesiny i mieszaninę pozostawiono na dalsze 30 minut. Zawiesinę wirowano przez 20 minut przy 18000 g (maksymalnie) i supernatant odrzucono.

Osad ponownie zawieszono w buforze B (25 mM Hepes, 4 M mocznik, 5 mM DTT, pH 8,0) w stosunku 1:6 (w/v) w celu otrzymania drobnej zawiesiny. Wirowano ją przy 18000 g (maksymalnie) i supernatant odrzucono. Osad ponownie zawieszono w buforze C (25 mM Hepes, 8 M mocznik, 2 mM DTT, pH 8,0) w stosunku 1:6 (w/v); przed zawieszeniem dodano leupeptynę (^g/ml), pepstatynę (^g/ml) i E64 (^g/ml). Zawiesinę wirowano przez 30 minut przy 18000 g (maksymalnie) i supernatant zdekantowano i zatrzymano. Osad ponownie zawieszono w 25 mM Hepes, 1% SDS, pH 8,0.

b) Chromatografia.

Supernatant z frakcji z 8 M mocznikiem rozcieńczono 1:5 (v/v) w buforze zawierającym 25 mM Hepes, 8 M mocznik, 2 mM DTT, pH 8,0, i frakcjonowano na kolumnie z Q-Sepharose o objętości 7 ml. Białka eluowano gradientem stężenia soli 0-1 M NaCl. Chromatografię i obróbkę danych przeprowadzono w układzie FPLC (Pharmacia). DX113 ulegał elucji w około 500 mM NaCl i jest rzeczywiście homogenny według kryteriów SDS-PAGE i analizy techniką blottingu Western.

Przykład IX. Oczyszczanie polipeptydu BHC-5.

Komórki Sf9 (2x10⁹) zainfekowano zawiesiną podstawową zrekombinowanego wirusa HHC-5 (mol 5). Po inkubacji przez 2 dni w temperaturze 28°C komórki zebrano przez wirowanie, a następnie postępowano w następujący sposób:

a) E^^ti^alcc^j^.

Mokrą masę komórkową (1,2 g) ponownie zawieszono w 6 ml buforu A (25 mM Hepes, mM DTT, 1 μg/ml leupeptyny, 1 μg/ml pepstatyny, 1 μg/ml pepstatyny E64, pH 8,0). Zawieszone komórki umieszczono w lodzie i sonifikowano 3x15 sekund (amplituda całkowita μm) na zmianę z 30 sekundowymi przerwami. Zsonifikowaną zawiesinę wirowano przez 20 minut przy 18 000 g (maksymalnie) i supernatant odrzucono. Osad ponownie zawieszono w buforze A z dodatkiem 4M mocznika (6 ml) i przez 20 minut wirowano przy 18 000 g (maksymalnie). Supernatant odrzucono, a osad ponownie ekstrahowano buforem A z dodatkiem 8 M mocznika (6 ml). Po wirowaniu przez 30 minut przy 18 000 g (maksymalnie) supernatant zachowano i rozcieńczono 1:6 w buforze A z dodatkiem 8 M mocznika. Ekstrakt ten poddano chromatografii na kolumnie mono-Q zrównoważonej tym samym buforem. Kolumnę eluowano

167 059 objętościami kolumny gradientu stężenia soli (0-1,0 M NaCl). BHC-5 uległ wyeluowaniu przy około 0,45-0,55 M NaCl i był w więcej niż w 90% czysty jak oceniono na podstawie SDS-PAGE. Wydajność wynosiła około 70%.

Przykład X. Analiza polipeptydów DX113 oraz BHC-5 i 7 testem ELISA.

Płytki do testu Microelisa (96 studzienek, Nunc) opłaszczono bezpośrednio w 50 mM buforze wodorowęglanowym (50 mM wodorowęglan sodowy i 50 mM węglan sodowy, o pH 9,5) nieoczyszczonym lizatem BHC-5 w 6 M moczniku, albo oczyszczonym DX113. Płytki blokowano 0,2% BS A, a następnie inkubowano przez 30 minut w temperaturze 37°C z surowicami rozcieńczonymi 1:20 (bakulowirus) lub 1:100 (E. coli). Po przemyciu roztworem Tweensól fizjologiczna (0,85% NaCl, 0,05% Tween 20,0,01% Bronidoks) płytki inkubowano przez 30 minut w temperaturze37°C ze sprzężonymi z peroksydazą przeciwciałami skierowanymi przeciwko immunoglobulinom ludzkim (1:2000). Płytki przemyto następnie roztworem Tweensol fiziologiczna i wywołano zabarwienie przez dodanie chromogennego substratu TMB (tetrametylobenzydyna-HCl) (100 μΐ/studzienkę) i inkubację przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Reakcję zatrzymano 50 μΐ 2 M kwasu siarkowego i określano OD450 (tabela 4).

Tabela 4

Pośredni test ELISA z zastosowaniem przeciwciał skierowanych przeciwko immunoglobulinom ludzkim do wykrywania przeciwciał skierowanych przeciwko NANBH.

	Bakulowirus BHC-5 (faza stała)	E. coli DX113 (faza stała)
	>2	1, 670
	1, 655	1, 531
	1,081	1, 015
	1, 642	1, 558
	O, 525	O, 638
	>2	1,515
	1,623	1, 602
Surowice pacjen	1, 779	1,318
tów z grupy wy-	1, 122	O, 616
sokiego ryzyka	1,686	1,441
dodatnie w ozna-	O, 259	0, 205
czemu	O, 158	O, 120
	0, 298	O, 209
	O, 194	O, 1 1 1
	O, 282	O, 181
	0, 263	O, 165
	O, 184	0, 163
	0, 121	0, 099
	O, 243	0, 104
Dawcy ujemni	O, 224	0, 119

167 059

Surowice pacjentów z grupy o wysokim ryzyku infekcji PT-NANBH (osoby uzależnione, stosujące narkotyki dożylnie, chorzy na hemofilię) oznaczono jak opisano. Wszystkie dane wyrażono jako odczyty OD450 z dawcami ujemnymi jako kontrolą ujemną. W tej określonej grupie surowic 10/19 było dodatnich na obu fazach stałych.

Dodatkowo, oczyszczony DX113 skoniugowano z alkaliczną fosfatazą stosując redukcję SATA/maleimid i przeprowadzono oznaczenie immunometryczne. Znane, dodatnie i ujemne surowice NANBH rozcieńczono jak podano dla surowicy dawców ujemnych i dodano do fazy stałej opłaszczonej HHC-7. Albo jednocześnie, albo po inkubacji (30 minut w temperaturze 37°C) dodano koniugat DX113 (50 μΐ. 1:2000). Po inkubacji przez 30 minut w temperaturze 37°C, płytki przemyto 50 mM buforem wodorowęglanowym i wywołano zabarwienie stosując układ wzmacniający IQ Bio, i określano OD492 (tabela 5).

Tabela 5

Immunometryczny (ze znakowanym polipeptydem) test ELISA do wykrywania przeciwciał skierowanych przeciwko NANBH.

Surowice dodatnie	Surowice ujemne	Surowice
w oznaczeniu	w oznaczeniu	dawców ujemnych
>2	0, 217	0, 234
0, 821	0, 252
>2	0, 214
0, 542	0, 257
0, 876	0, 308
1, 583	0, 278
>2	0, 296
>2	0, 273
1, 830	0, 262
>2 ---- --- ,	0, 251

A zatem w obydwu typach oznaczeń - z zastosowaniem przeciwciał przeciwko immunoglobulinom i immunometrycznym - wszystkie próbki pochodzące z grup wysokiego ryzyka dawały zgodne wyniki.

Przykład XI. Szczepionka

Stosując następujące składniki we wskazanych ilościach, można przygotować, stosując konwencjonalne techniki, szczepionkę:

Polipeptyd wirusowy PT-NANBH > 0,36 mg

Thiomersal 0,04-0,2 mg

Chlorek sodowy < 8,5 mg

Woda do 1 ml

Przykład XII. Wytwarzanie przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciwko polipeptydom PT-NANBH

Wstawkę DNA z DM415 zsubklonowano w wektorze przenoszącym bakulowirusa p36C i metodą zasadniczo podobną do metody opisanej w przykładzie VII, wytworzono zrekombinowany wirus. Zrekombinowany wirus nazwano BHC-1 i eksprymował bardzo niskie poziomy białka specyficznego wobec PT-NANBH. Komórki Sf-9 (5x10⁷ komórek/ml) zainfekowane BHC-1 lizowano w PBS zawierającej 1 % (v/v) NP40 i wirowano przez 2 minuty przy 13 000 g.

167 059

Supematant oczyszczono na żelu Extractigel-D (Pierce Chemics^) w celu usunięcia detergentu, a następnie zmieszano w postaci emulsji w stosunku 1:1 z kompletnym adinwaatwm Freud^Myszom podano po 0,1 ml emulsji (równoważnik 5 x 106 komórek) drogą iniekcji podskórnych. 14 i 28 dnia po iniekcji myszy otrzymały dawki przypominające przez dotrzewaoww iniekcje 0,1 ml (równoważnik 5 x 10⁶ komórek) wolnego od detergentu ekstraktu komórek Sf-9 zainfekowanych BHC-5: BHC-5 zawiera wstawkę DNA DM416. Następnie pobierano z ogonów próbki krwi i oznaczano pod kątem aktywności aaty-PT-NANBH teście ELISA (przykład X). Dwie myszy z odpowiedzią specyficzną wobec PT-NANBH otrzymały dalszą dawkę przypominającą przez iniekcję dożylne wolnego od detergentu ekstraktu komórek Sf-9 zainfekowanych BHC-7; BHC zawiera wstawkę DNA wytworzoną przez ligację ze sobą zachodzących regionów DM415 i DM416 (przykład VII). Trzy dni później usunięto śledziony.

Komórki śledziony poddawano fuzji z komórkami szpiczaka NSo standardowymi technikami w obecności PEG1500. Otrzymane komórki hybrydom selekcjonowano przez wzrost w podłożu HAT (Cipoesantyna, aminopteiyna, tymidyna). 10-14 dni po fuzji supematanty testowano pod kątem aktywności anty-PT-NANBH w teście ELISA. Zidentyfikowano studzienki wykazujące reaktywność z oboma antygenami - DX113 i BHC-7 (przykład VII), i pojedyncze kolonie przeaiesiaaa do oddzielnych studzienek, namaażaao i ponownie testowano. Hybrydomy ze studzienki wykazujące specyficzną reaktywność na tym etapie dalej klonowano stosując rozcieńczenia ograniczające do osiągnięcia manokloaalaości.

Przykład XIII. Wykrywanie wirusowego kwasu nukleinowego u pacjentów serododatnicC

Surowice: próbki od 1400 dawców, włączonych do programu badań perspektywicznych potransfnzyjaego zapalenia wątroby, zamrożono w temperaturze -20°C. Podobnie przechowywano surowice pobrane przed transfuzją i kolejno po transfuzji od 260 biorców transfuzji. Próbki po transfuzji zbierano do trzeciego miesiąca co dwa tygodnie, do szóstego miesiąca co miesiąc a następnie do osiemnastego miesiąca co sześć miesięcy. Do badań dostępne były także zamrożone surowice dawców i biorców pochodzące z trzech przypadków PT-NANBH, które wystąpiły 1981 r. Diagnoza PT-NANBH oparta była ma wzroście aktywności aminotransferazy alaainobej (ALT) w surowicy przekraczającej 2,0-erotaie górny poziom normy w co najmniej dwóch oddzielnych próbkach potransfnzyJaycC. Inne wirusy hepatotropowe wykluczono przez testy serologiczne, a aiewirnsowe przyczyny uszkodzeń komórek wątroby wykluczono przez koaweacjoaalae badania kliniczne i laboratoryjne.

Oznaczenia immunologiczne: Próbki surowicy testowano retrospektywnie na obecność przeciwciał skierowanych przeciwko HCV (antygen C100) stosując zestaw do testu ELISA Ortho Diagnostics stosowanym zgodnie z instrukcjami producenta. Surowice powtarzalnie reaktywne miareczkowano do punktu końcowego w surowicy ludzkiej ujemnej pod względem obecności przeciwciał skierowanych przeciwko antygenowi C100.

Wykrywanie sekwencji wirusowych PT-NANBH: RNA surowicy lub osocza ekstrahowano, poddawano odwrotnej transkrypcji i amplifikowano jak opisano poniżej. Startery oligoaueleotydabe do odwrotnej transkrypcji/PCR pochodziły z sekwencji nukleotydowej klonu JG2 wyizolowanego w przykładzie III i zsyntetyzowanej w syntetyzatorze Applied Biosnstems 381A. Sekwencje czterech starterów oligoaukleotydobycC były następujące:

Oznaczenie	Numer identyfikacyjny sekwencji	Wielkość produktu
d94 seasaban	8
d90antnseasobny	9	729 bp
N1 sensowny	10
N2 aatyseasabay	1i	402 bp
(i) Ekstrakcja RNA

5-50 μΐ surowicy (lub osocza) uzupełniono do 200 μΐ przez dodanie jałowej wody destylowanej. 200 μl próbki dodano do równej objętości buforu 2 x PK (2 x PK = 0,2 M TrisCl, pH 7,5,25 mM EDTA, 0,3 M NaCl, 2% (w/v) SDS, proteinaza K 200 μg/ml, zmieszano i

167 059 indukowano przez 40 minut w temperaturze 37°C. Białka usunięto przez dwukrotną ekstrakcję mieszaniną fenol/chloroform i jedną samym chloroformem. Do fazy wodnej 20 μg glikogenu, a następnie wytrącono RNA przez dodanie 3 objętości schłodzonego lodem absolutnego etanolu. Po przechowywaniu przez 1 godzinę w temperaturze -70°C, RNA osadzono w wirówce Eppendorfa (15 minut, 14000 obrotów/minutę, 4°C). Osad przemyto raz 95% etanolem, wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem i rozpuszczono w 10 μl jałowej wody destylowanej. Roztwory RNA przemywano w temperaturze -70°C.

(ii) Synteza cDNA

Przygotowano 10 μl mieszaniny zawierającej 2 μl roztworu RNA, 50 ng syntetycznego oligonukleotydu d95,10 mM Hepes-HCl, pH 6,9 i 0,2 mM 8,0. Na tę 10 μl mieszaninę nałożono 2 krople oleju mineralnego, ogrzewano przez dwie minuty w łaźni wodnej o temperaturze 90°C i szybko schłodzono w lodzie. Syntezę cDNA przeprowadzono po doprowadzeniu składu mieszaniny reakcyjnej do zawartości 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 75 mM KCl, 3 mM MgCl₂, 10 mM DTT, 0,5 mM każdego z dATP, dCTP, dGTP i dTTP, 20 jednostek inhibitora RNazy (Pharamacia) i 15 jednostek klonowanej odwrotnej transkryptazy MLV (Pharmacia) w objętości końcowej 20 μΕ 20 μΐ mieszaniny inkubowano przez 90 minut w temperaturze 37°C. Po syntezie cDNA przechowywano w temperaturze -20°C.

(iii) Seryjna PCR

W trakcie tych badań unikano fałszywie dodatnich wyników PCR poprzez ścisłe stosowanie pomiarów unikania zanieczyszczeń według Kwok i Higuchi (naturę, 1989, 33^l9,237-238).

a) Runda 1

Łańcuchową reakcję polimerazy przeprowadzano w 50 μ l mieszaniny zawierającej 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl₂, 0,01% żelatynę, 1 jednostkę rekombinowanej polimerazy dNA Taq (Perkin Elimer Cetus), 200 μM każdego z dNTP, 30 ng każdego z zewnętrznych starterów (d94 i d95, sekwencje o numerach identyfikacyjnych odpowiednio 8

9) i 5 μl roztworu cDNA. Po początkowych 5 minutach denaturacji w temperaturze 94°C, przeprowadzono 35 cykli: 1,2 minuty w temperaturze 95°C, 1 minuta w temperaturze 56°C, 1 minuta w temperaturze 72°C, po których następowało końcowe 7-minutowe utrzymywanie w temperaturze 72°C (Techne pHc-1 Automated Thermal Cycler).

b) Runda 2

Mieszanina reakcyjna była taka jak opisana powyżej dla Rundy 1, ale w miejsce zewnętrznych starterów d94 i d95 zastosowano 125 ng każdego z wewnętrznych starterów (sekwencje o numerach identyfikacyjnych odpowiednio 10 i 11). Do 50 μl mieszaniny reakcyjnej z Rundy przeniesiono 1 μl produktu Rundy 1 PCR. Przeprowadzono 25 cykli: 1,2 minuty w temperaturze 95°C, 1 minuta w temperaturze 46°C, 1 minuta w temperaturze 72°C, po których następowało 7-minutowe utrzmywanie w temperaturze 72°C.

c) Analiza μl produktów Rundy 1 i Rundy 2 PCR analizowano przez elektroforezę na 2% żelu agarozowym. Prążki uwidoczniono przez barwienie bromkiem etydyny i fotografowano przy długości fali 302 nm.

Przewidywane wartości serologiczne anty-HCV i PCR w programie badań perspektywicznych: Stwierdzono, że sześciu spośród 1400 dawców (0,43%) posiada w surowicy przeciwciała skierowane przeciwko C100. Spośród tych sześciu dawców, dodatnich pod względem przeciwciał skierowanych przeciwko C100, infekcyjność stwierdzono tylko u jednego (dawca D6) sądząc po wystąpieniu PT-NANBH i serokonwersji przeciwciał skierowanych przeciwko C100 u biorcy (biorca R6) - patrz tabela 6 poniżej.

Przez PCR wykryto sekwencje wirusowe w surowicy dawcy 6, ale nie u któregokolwiek z pozostałych pięciu dawców serododatnich surowic. Biorca R6, u którego rozwinęło się PT-NANBH otrzymywał także krew od siedmiu innych dawców (D7 do D13). Przetestowano surowice tych dawców i stwierdzono, że są one zarówno ujemne pod względem przeciwciał, jak i PCR.

167 059

Tabela 6

Podsumowanie danych dawca/biorca: program badań perspektywicznych

1 Dawcy	Biorcy
Dawca	anty-HCV	PCR	Biorca	PT-NANBH	Serokon- wersja anty-HCV
Dl			R1	Nie	Nie
D2		-	R2	Nie	Nie
D3		-	R3	Nie	Nie
D4		-	R4	Nie	Nie
D5		-	R5	Nie	Nie
D6		+
D7	-	-
D8	-	-
D9	-	-	R6	Tak*	Tak+
D10	-	-
Dl 1	-	-
Dl 2	-	-
Dl 3	-	-

* okres inkubacji 1 miesiąc + serokonwersja wystąpiła w piątym miesiącu po transfuzji

Przykład XIV. Izolowanie i ekspresja dodatkowych sekwencji DNA PT-NANBH.

Przygotowaną w przykładzie II bibliotekę lambda gt11 przeszukiwano także stosując surowice pacjentów z grup wysokiego ryzyka PT-NANBH, które nie reagowały z antygenami wirusowymi DX113, BHC-5 i BHC-7. Przyczyną tego jest to, że mogą zawierać przeciwciała rozpoznające inne antygeny. Surowice PJ-5 (The Newcastle Royal Infirmary, Newcastle), Birm-64 (Queen Elizabeth Medical Centre, Birmingham), PG i Le (University Collage and Middlesex School of Medicine, Londyn) spełniają to kryterium i zastosowano je do przeszukiwania bibliotek według takiej samej procedury, jak opisana w przykładzie III i IV. W ten sposób zidentyfikowano liczne rekobinanty, z których żaden nie wykazywał krzyżowej hybrydyzacji z sondami wykonanymi z JG2 i JG3. Jeden z rekombinantów, BR11, zidentyfikowany przez reakcję z surowicą, wyselekcjonowano do dalszej analizy.

Klon BR11 zawierał wstawkę o długości około 900 bp, którą zamplifikowano przez PCR stosując startery d75 i d76 (sekwencje o numerach identyfikacyjnych 6 i 7), jak opisano w przykładzie VII. Zamplifikowaną sekwencję bezpośrednio sklonowano w bakulowirusowym wektorze pAc360, tworząc plazmid pDX128 zawierający otwartą ramkę odczytu w jednej fazie z pierwszymi 11 aminokwasami poliedryny. Zawiesinę rekombinowanego bakulowirusa (oznaczonego BHC-7 wytworzono według procedury opisanej w przykładzie VII. Komórki owadów zainfekowano oczyszczonym zrekombinowanym wirusem i w znakowanych radioaktywnie ekstraktach komórkowych otrzymano polipeptyd o masie cząsteczkowej około 22 kD.

Zamplifikowaną wstawkę BR 11 sklonowano także do sekwencjonowania w plazmidzie pUC 13 i wektorze fagowym M13; dane dotyczące sekwencji DNA i aminokwasowej przedstawiono na sekwencji o numerze identyfikacyjnym 5. Wstawka zawierała 834 bp plus dodane podczas klonowania łączniki EcoRI.

167 059

Przykład XV. Analiza polipeptydu BHC-9 testem ELISA

Test ELISA wykonano stosując opłaszczone ekstraktem komórki zainfekowanych BHC-9 studzienki do mikromiareczkowania i układ detekcji z koniugatem z przeciwciałami skierowanymi przeciwko ludzkim IgG według procedury opisanej w przykładzie X. Zestaw surowic pochodzący w grup wysokiego ryzyka oznaczano równolegle pod względem aktywności przeciwko BHC-7 i BHC-9 oraz sprawdzano także przez PCR stosując procedurę opisaną w przykładzie XIII. Wyniki przedstawiono w tabeli 7, w której podkreślono próbki dodatnie.

Tabela 7

Numer	PCR	BHC-7	BHC-9
1		2, 09	2, 00
2	+	2, 09	2, 00
3	+	1,89	1, 37
4	+	1, 57	0, 27
5	+	1,26	2, 00
6	+	0, 91	2, 00
7	-	0, 90	0, 51
8		0, 84	1. 19
9	-	0, 53	0, 43
10	-	0, 45	2, 00
11		0, 37	1,07
12	-	0, 32	2. 00
13	-	0, 23	0, 30
14	-	0, 15	0, 43
15	+	0, 16	0, 76
16	-	0, 09	1, 74
17	-	0, 27	2, 00
18	-	0, 15	2, 00
19	-	0, 12	2, 00
20	-	0, 08	0, 05
wartość	graniczna	0, 27	0, 29

Spośród tych 20 próbek, 50% jest wyraźnie dodatnich wobec BHC-7, podczas gdy 85% jest dodatnich wobec BHC-9. Dwie próbki (11 i 12), które są dodatnie z wartością zbliżoną do granicy wobec BHC-7, są wyraźnie dodatnie wobec BHC-9, a pewne próbki o wartościach zbliżonych lub poniżej wartości granicznej wobec BHC-7 są dodatnie z BHC-9. Ponadto, dwie próbki (11 i 15), które zbliżają się do wartości granicznej lub są ujemne wobec BHC-7, ale dodatnie wobec BHC-9, są dodatnie w PCR. Ogólnie są tylko dwie próbki ujemne (13 i 20) wobec obydwu polipeptydów i w PCR.

Przykład XVI. Izolowanie sekwencji DNA PT-NANB zachodzących na istniejące klony.

Poprzez opisane w przykładach III, IV i XIV immunologiczne przeszukiwanie bibliotek ekspresyjnych cDNA można zidentyfikować tylko te klony, które zawierają immunogenny region wirusa. Innym podejściem w wytwarzaniu klonów specyficznych wobec PT-NANB jest zastosowanie PCR do amplifikacji cząsteczek cDNA zachodzących na istniejące klony. Można

167 059 przygotować zestawy starterów, w których jeden z członków pary leży w sekwencji istniejącego klonu, a drugi położony jest na zewnątrz; podejście to można również rozciągać na seryjne pary starterów.

cDNA przygotowany jak opisano w przykładzie I zamplifikowano przez PCR z albo pojedynczymi albo seryjnymi parami starterów, stosując warunki reakcji opisane w przykładzie XIII. Podejście to ilustruje zastosowanie następujących par starterów: d164 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 12) i d137 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 13); d136 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 14) i d155 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 15); d 156 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 16) i d92 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 17). Jeden z członków każdej pary przeznaczony jest do służenia jako starter wewnątrz istniejącej sklonowanej sekwencji (d136 i d137 służą jako startery odpowiednio przy końcach 5' i 3’ BR11, d92 służy jako starter przy końcu 5’ JG3). Inne startery oparte są na sekwencjach dostępnych dla innych czynników PT-NANBH. Starter d164 odpowiada zasadom 10 do 31 na figurze 2 w Okamoto i in., Japan. J. Exp. Med., 1990, 60, 167-177. Startery dl55 i 156 odpowiadają odpowiednio pozycjom 462 do 489 oraz 3315 do 3337 na figurze 47 w europejskim zgłoszeniu patentowym 88310922. W celu wprowadzenia miejsc rozpoznawanych przez restryktazę EcoRI w pobliżu końca 5’ starterów, wykonano jedno lub więcej podstawień nukleotydowych. Wyjątkiem jest dl 64, gdzie wprowadzono miejsce rozpoznawane przez Bg12. Zmiany te ułatwiają późniejsze klonowanie zamplifikowanego produktu.

Produkty PCR trawiono odpowiednim enzymem (enzymami) restrykcyjnym, poddawano elektroforezie na żelu agarozowym, wycinano prążki o oczekiwanej wielkości i klonowano w wektorach zarówno plazmidowych, jak i bakteriofagowych jak opisano w przykładzie V. Sekwencje zamplifikowanych DNA 164/137 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 18), 136,/155 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 19) i 156/92 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 20) przedstawiono w zestawieniu sekwencji. Te nowe sekwencje pokrywają genom wirusa PT-NANBH w większym stopniu niż sekwencje otrzymane przez przeszukiwanie immunologiczne (sekwencje o numerach identyfikacyjnych 3, 4 i 5). Sekwencje te, wraz z innymi, leżącymi z regionach już opisanych, można połączyć w sekwencję leżącą w pobliżu końca 5’ (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 21) i końca 3’ (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 22) genu wirusa PT-NANBH.

Przykład XVII. Fuzja różnych antygenów PT-NANBH w pojedynczym zrekombinowanym polipeptydzie.

Dane przedstawione w tabeli 7 wskazują na to, że podczas gdy więcej próbek surowic wykryto jako dodatnie pod względem obecności przeciwciał stosując jako antygen docelowy raczej BHC-9 (17/20) niż BHC-7 (10/20), istnieją pewne próbki (np. nr 4), które są dodatnie tylko wobec BHC-7. Obraz ten potwierdza się przy szerokim testowaniu próbek. Zgodnie z tym, otrzymano konstrukcje fuzyjne stosując sekwencje BHC-7 i BHC-9.

Sekwencje z BHC-7 i BHC-9 można połączyć na różne sposoby; każda z sekwencji może być, w wyniku fuzji, położona przy końcu aminowym i różny może być charakter sekwencji łączącej. Możliwe sposoby połączenia sekwencji ilustruje figura 2.

Odpowiednie fragmenty restrykcyjne niosące odpowiednie miejsca restrykcyjne utworzono albo przez PCR z zastosowaniem specyficznych starterów, albo przez trawienie istniejących plazmidów enzymami rekstrykcyjnymi. Wektor przenoszący DX143 składa się z fragmentu BamH1/Pst1 z DX122 (figura 1; miejsce Pst w 1504 pozycji JG2, sekwencja o numerze identyfikacyjnym 3) połączony z końcem 5’ całego regionu kodującego BR 11 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 7), który zamplifikowano jako fragment Pst1/BamH1 stosując startery d24 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 23) i dl26 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 24); region łączący składa się z sześciu aminokwasów pochodzących ze startera dl26 i pozostałych sekwencji bakteriofaga lambda. Wektor przenoszący DX136 różni się od wektora DX143 tym, że fragment BR11 utworzono stosując startery d24 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 23) i d 132 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 25) i tak region łączący zawiera pięć lizyn. Te wektory przenoszące stosowano do kotransfekcji komórek owadów w hodowli dNa wirusa AcNPV i wytworzono zawiesinę zrekombinowanych bakulowirusów przez oczy167 059 szczanie łysinek jak opisano w przykładzie VII. W wyniku transfekcji DX143 wytworzono BHC-10, a wyniku transfekcji dX136 - BHC11.

Rekombinowane polipeptydy eksprymowane przez te dwa wirusy analizowano przez SDS-PAGE i blotting Western. BHC-10 wytwarzał polipeptyd o pozornej masie cząsteczkowej 118 kDa. BHC-11 wytwarzał polipeptyd o pozornej masie cząsteczkowej 96 kDa. Oba polipeptydy reagowały z surowicami, o których wiadomo było, że w teście ELISA reagują tylko z BHC-7 (np. surowica A) lub tylko z BHC-9 (surowica B64, przykład IV). Oba polipeptydy różnią się tylko sekwencją łącznikową, i może to wpływać na ich ruchliwość w SDS-PAGE, lub na sposób ich procesowania w zainfekowanych komórkach.

Przykład XVIII. Analiza fuzji antygenów testem ELISA.

Test ELISA wykonano stosując studzienki do mikromiareczkowania opłaszczone ekstraktami komórek zainfekowanych BHC-9 i koniugat przeciwciała skierowanego przeciwko immunoglobulinom zgodnie z procedurą opisaną w przykładzie X. W tabeli 8 przedstawiono dane dotyczące porównania dwóch fuzji z innymi rekombinowanymi antygenami PT-NANBH -BHC7 i BHC-11, jak również rekombinowanym białkiem wirusa HCV -C-100-3 (Ortho Diagnostics System, Raritan, New Jersey). Surowice pogrupowano według wzoru reakcji z BHC-7, BHC-9 i C-100-3. SSrowicc z grupy I siinie reagują zz wszystkimi ttzzma antygenamii surowice z grupy II sUnie reagują tylko z BHC-7 t z gmpy III sUme reagują yylko z BHC-9 t a grupy IV yylko z dwoma spośród trzech antygenów.

Tabela 8

Surowica	BHC-7	BHC-9	C- 100-3	BHC-9	BHC-11
Grupa I
AH	>2, 0	>2, 0	> 2, 0	>2, 0	>2, 0
CH	>2, 0	>2, 0	>2, 0	>2, 0	>2, 0
57	>2, 0	>2, 0	>2, 0	>2, 0	>2, 0
77	>2, 0	>2, 0	>2, 0	>2,0	>2, 0
64	1, 4	>2, 0	>2, 0	>2, 0	>2, 0
Grupa II
805-6	>2, 0	0, 261	0, 1	1,78	+ «
805-17	>2, 0	0. 181	0, 12	1, 37	+ *
805-149	>2, 0	0, 651	0, 084	1,57	+ + *
Grupa III
JS	0, 32	>2, 0	0, 17	>2, 0	>2, 0
805-57	0, 069	1,403	0, 25	1,9	+ *
805-82	0, 116	1,272	0, 4	1,85
805-94	0, 353	1,675	0, 2	>2, 0	♦ *
PJ1	0, 27	>2, 0	0, 2	>2, 0	1,85
Grupa IV
A	>2, 0	0, 14	>2, 0	>2, 0	>2, 0
KT	1, 57	0, 27	>2, 0	>2, 0	>2. 0
Le	0, 152	>2, 0	>2, 0	>2, 0	>2, 0
PJ5	0. 123	>2, 0	>2, 0	>2, 0	>2, 0
303-923	>2, 0	0, 9	0, 37	1, 9	+ *
303-939	>2, 0	1, 55	0, 268	2, 0	+ *

* Te próbki testowano wobec BHC-11 tylko przez blotting Western.

167 059

Dane te wykazują, że zarówno BHC-10, jak i BHC-ί 1 posiadają podobną reaktywność z tymi surowicami i, co ważniejsze, że obie aktywności antygenowe utrzymywały się w fuzji białkowej. Wszystkie surowice w grupach II i III, reagujące odpowiednio tylko z BHC-7 i BHC-9, dawały wyraźną reakcję z fuzjami białkowymi. Dodatkowo, istnieje wskazanie, że występowanie dwóch antygenów razem daje oznaczenie o wyższej czułości. Próbka KT, na przykład, dawała z BHC-7 i BHC-9 OD odpowiednio 1,57 i 0,27, podczas gdy dla fuzji OD wynosi > 2,0.

W poniższym wykazie sekwencji, scharakteryzowano sekwencje o numerach identyfikacyjnych 1-25

Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 1

Typ sekwencji: nukleotydowa

Długość sekwencji: 21 zasad o następującej sekwencji:

GGTGGCGACG ACTCCTGGAG C

Ilość nici: jedna

Topologia: liniowa

Typ cząsteczki: syntetyczny DNA

Pierwotny organizm źródłowy: bakteriofag lambda gt1L

Bezpośrednie źródło doświadczalne: syntetyzator oligonukleotydowy; oligonukleotyd d 19 Cechy: od 1do 21 zasady homologiczna z częścią genu lacZ leżącą w kierunku przeciwnym do kierunku transkrypcji flankującą miejsce restrykcyjne EcoR1 bakteriofaga lambda gt11. Właściwości: służy jako starter syntezy DNA z wektora fagowego na cDNA wbudowany w miejscu EcoR1

Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 2

Typ sekwencji: nukleotydowa

Długość sekwencji: 21 zasad o następującej sekwencji:

TTGACACCAG ACCAACTGGT A

Ilość nici: jedna

Topologia: liniowa

Typ cząsteczki: syntetyczny DNA

Pierwotny organizm źródłowy: bakteriofag lambda gt11

Bezpośrednie źródło doświadczalne: syntetyzator oligonukleotydowy; oligonukleotyd d20 Cechy: od 1 do 21 zasady homologiczna z częścią genu lacZ leżącą w kierunku zgodnym z kierunkiem transkrypcji flankującą miejsce restrykcyjne EcoR1 bakteriofaga lambda gt11 Właściwości: służy jako starter syntezy DNA z wektora fagowego na cDNA wbudowany w miejscu EcoR1

Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 3

Typ sekwencji: nukleotydowa z odpowiadającą białkową

Długość sekwencji: 1770 par zasad o sekwencji przedstawionej na fig. 4.

Ilość nici: jedna

Topologia: liniowa

Typ cząsteczki: cDNA otrzymany na podstawie genomowego RNA

Pierwotny organizm źródłowy: człowiek; surowica infekcyjna pod względem potransfuzyjnego zapalenia wątroby typu nie-A nie-B

Bezpośrednie źródło doświadczalne: klon JG2 pochodzący z biblioteki cDNA w bakteriofagu lambda gtU

Cechy: część poliproteiny PT-NANBH od 1 do 1770 bp.

Właściwości: prawdopodobnie koduje wirusowe białka niestrukturalne

Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 4

Typ sekwencji: nukleotydowa z odpowiadającą białkową

Długość sekwencji: 1035 par zasad o sekwencji przedstawionej na fig. 5.

Ilość nici: jedna

Topologia: liniowa

Typ cząsteczki: cDNA otrzymany na podstawie genomowego RNA

167 059

Bezpośrednie źródło doświadczalne: klon JG3 pochodzący z biblioteki cDNA w bakteriofagu lambda gt11

Cechy: część poliproteiny PT-NANBH od 1 do 1035 bp

Właściwości: prawdopodobnie koduje wirusowe białka niestrukturalne

Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 5

Typ sekwencji: nukleotydowa z odpowiadającą białkową

Długość sekwencji: 834 par zasad o sekwencji przedstawionej na fig. 6.

Ilość nici: jedna

Typologia: liniowa

Typ cząsteczki: cDNA otrzymany na podstawie genomowego RNA

Bezpośrednie źródło doświadczalne: klon BR11 pochodzący z biblioteki cDNA w bakteriofagu lambda gt11

Cechy: część poliproteiny PT-NANBH od 1 do 834 bp

Właściwości: prawdopodobnie koduje wirusowe białka strukturalne

Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 6

Typ sekwencji: nukleotydowa

Długość sekwencji: 31 zasad o następującej sekwencji:

TAAGGATCCC CCGTCAGTAT CGGCGGAATT C

Ilość nici: jedna

Topologia: liniowa

Typ cząsteczki: syntetyczny DNA

Pierwotny organizm źródłowy: bakteriofag lambda gt11

Bezpośrednie źródło doświadczalne: syntetyzator oligonukleotydowy; oligonukleotyd d75 Cechy: od 4 do 9 zasady miejsca BamH1 od 10 do 31 zasady homologiczna z częścią genu lacZ leżącą w kierunku przeciwnym do kierunku transkrypcji flankującą miejsce EeoR1 bakteriofaga lambda gt11 od 26 do 31 zasady miejsca EcoR1

Właściwości: służy jako starter syntezy DNA z wektora fagowego na cDNA wbudowany w miejsce EcoR1 i wprowadza miejsce BamH1 odpowiednie do późniejszego klonowania w wektorze ekspresyjnym

Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 7

Typ sekwencji: nukleotydowa

Długość sekwencji: 30 zasad o następującej sekwencji:

TATGGATCCG TAGCGACCGG CGCTCAGCTG

Ilość nici: jedna

Topologia: liniowa

Typ cząsteczki: syntetyczny DNA

Pierwotny organizm źródłowy: bakteriofag lambda gt11

Bezpośrednie źródło doświadczalne: syntetyzator oligonukleotydowy; oligonukleotyd d76 Cechy: od 4 do 9 zasady miejsca BamH 1od 10 do 30 zasady homologiczna z leżącą w kierunku zgodnym z kierunkiem transkrypcji częścią genu lacZ flankującą miejsce EcoR1 bakteriofaga gt11

Właściwości: służy jako starter syntezy DNA z wektora fagowego na cDNA wbudowany w miejsce EeoR1 i wprowadza miejsce BamH1 odpowiednie do późniejszego klonowania w wektorze ekspresyjnym.

Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 8

Typ sekwencji: nukleotydowa

Długość sekwencji: 19 zasad o następującej sekwencji:

ATGGGGCAAA GGACGTCCG

167 059

Ilość nici: jedna

Topologia: liniowa

Typ cząsteczki: syntetyczny DNA

Pierwotny organizm źródłowy: człowiek: surowica infekcyjna pod względem patransfuzyjnego zapalenia wątroby typu nie-A nie-B

Bezpośrednie źródło doświadczalaw:syntwtyzator oligoaneleotydowy; aligonuklwotyd d94 Cechy: od 1do 19 zasady homologiczna z zasadami 914 do 932 sensownej nici JG2 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 3)

Właściwości: służy jako starter syntezy DNA na ujemnej nici RNA/DNA geaemobego dla PT-NANBH

Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 9

Typ sekwencji: aukleotydowa

Długość sekwencji: 24 zasady o następującej sekwencji:

TACCTAGTCA TAGCCTCCGT GAAG

Ilość nici: jedna

Topologia: liniowa

Typ cząsteczki: syntetyczny DNA

Pierwotny organizm źródłowy: człowiek; surowica infekcyjna pod względem potraasfuzyjaego zapalenia wątroby typu nie-A nie-B

Bezpośrednie źródło doświadczalne: syntetyzator oligoankleotydoby; aligonnelwotyd d95 Cechy: od 1 do 24 zasady homologiczna z zasadami 1620-1643 aatyswneownej nici JG2 (numer identyfikacyjny sekwencji 3)

Właściwości: służy jako starter syntezy DNA na dodatniej nici RNA/DNA genomowego dla PT-NANBH

Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 10

Typ sekwencji: nukleotydowa

Długość sekwencji: 17 zasad o następującej sekwencji:

GAGGTTTTCT GCGTCCA

Ilość nici: jedna

Topologia: liniowa

Typ cząsteczki: syntetyczny DNA

Pierwotny organizm źródłowy: człowiek; surowica iafekcnJaa pod względem potpansfuzyjnego zapalania wątroby typu nie-A nie-B

Bezpośrednie źródło doświadczalne: syntetyzator oligonukleotydowy; aligonuklwotyd N1 Cechy: od 1 do 17 zasady homologiczna z zasadami 1033 do 1049 sensownej nici JG2 (numer identyfikacyjny sekwencji 3)

Właściwości: służy jako starter syntezy DNA na ujemnej nici RNA/DNA genomowego dla PT-NANBH

Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 11

Typ sekwencji: aueleotydowa

Długość sekwencji: 17 zasad o następującej sekwencji:

GCGATAGCCG CAGTTCT

Ilość nici: jedna

Topologia: liniowa

Typ cząsteczki: syntetyczny DNA

Bezpośrednie źródło doświadczalne: syntetyzator oligonukleotndoby; aligonnelwotyd N2 Cechy: od 1 do 17 zasady homologiczna z zasadami 1421 do 1437 antyswnsawnej nici JG2 (numer identyfikacyjny sekwencji 3)

Właściwości: służy jako starter syntezy DNA na dodatniej nici RNA/DNA gwaamowego dla PT-NANBH

Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 12

Typ sekwencji: aukleotndowa

167 059

Długość sekwencji: 22 zasady o następującej sekwencji:

CCACCATAGA TCTCTCCCCT GT

Ilość nici: jedna

Topologia: liniowa

Typ cząsteczki: syntetyczny DNA

Bezpośrednie źródło doświadczalne: syntetyzator oligonukleotydowy; oligonukleotyd d164 Cechy: od 1 do 22 zasady homologiczna z zasadami 10 do 31 sekwencji przedstawionej na fig. 2 w Okamoto 1 in., Japan. J. Exp. Med. 1990, (6) J17--77, zasada 22 zi^i^nii^n^ z A naT w celu wprowadzenia miejsca rozpoznawania Bg12 od 8 do 13 zasady miejsce rozpoznawania Bg12

Właściwości: służy jako starter syntezy DNA na ujemnej nici RNA/DNA genomowego dla

PT-NANBH i wprowadza miejsce Bg12

Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 13

Typ sekwencji: nukleotydowa

Długość sekwencji: 30 zasad o następującej sekwencji:

GCGAGAATTC GGGATAGGTT GTCGCCTTCC Ilość nici: jedna

Topologia: liniowa

Typ cząsteczki: syntetyczny DNA

Bezpośrednie źródło doświadczalne: syntetyzator oligonukleotydowy; oligonukleotyd d 137 Cechy: od 1 do 30 zasady homologiczna z zasadami 154 do 183 ujemnej nici BR11 (numer identyfikacyjny sekwencji 5); zasady 174, 177 i 178 zmodyfikowano w celu wprowadzenia miejsca EcoR1 od 5 do 10 zasady miejsce rozpoznawania EcoR1

Właściwości: służy jako starter syntezy DNA na dodatniej nici RNA/DNA genomowego dla PT-NANBH i wprowadza miejsce EcoR1 do klonowania Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 14 Typ sekwencji: nukleotydowa

Długość sekwencji: 27 zasad o następującej sekwencji:

GGGGAATTCC TCCCGCTGCT GGGTAGC

Ilość nici: jedna

Topologia: liniowa

Typ cząsteczki: syntetyczny DNA

Bezpośrednie źródło doświadczalne: syntetyzator oligonukleotydowy; oligonukleotyd d136 Cechy: od 1 do 27 zasady homologiczna z zasadami 672 do 698 dodatniej nici BR11 (numer identyfikacyjny sekwencji 5); zasadę 675 zmieniono na G w celu wprowadzenia miejsca EcoR1 od 4 do 9 zasady miejsce rozpoznawania EcoR1

Właściwości: służy jako starter syntezy DNA na ujemnej nici RNA/DNA genomowego dla PT-NANBH i wprowadza miejsce EcoR1 do klonowania Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 15 Typ sekwencji: nukleotydowa

Długość sekwencji: 28 zasad o następującej sekwencji:

ACGGGAATTC GACCAGGAC CTGGGTGT

Ilość nici: jedna

Topologia: liniowa

Typ cząsteczki: syntetyczny DNA

Pierwotny organizm źródłowy: szympans; surowica infekcyjna pod względem potransfuzyjnego zapalenia wątroby typu nie-A nie-B

167 059

Bezpośrednie źródło doświadczalne: syntetyzator oligonukleotydowy; oligonukleotyd d155 Cechy: od 1 do 28 zasady homologiczna z zasadami 462 do 489 nici ujemnej przedstawionej na fig. 47, europejskie zgłoszenie patentowe nr 88310922,5, zasady 483 i 485 zmieniono w celu wprowadzenia miejsca rozpoznawania EcoR1 od 5 do 10 zasady miejsce rozpoznawania EcoR1 Właściwości: służy jako starter syntezy DNA na dodatniej nici RNA/DNA genomowego dla PT-NANBH i wprowadza miejsce EcoR1 do klonowania

Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 16

Typ sekwencji: nukleotydowa

Długość sekwencji: 23 zasady o następującej sekwencji:

CTTGAATTCT GGGAGGGCGT CTT

Ilość nici: jedna

Topologia: liniowa

Typ cząsteczki: syntetyczny DNA

Pierwotny organizm źródłowy i szympans; surowica infekcyjna pod względem potransfuzyjnego zapalenia wątroby typu nie-A nie-B

Bezpośrednie źródło doświadczalne: syntetyzator oligonukleotydowej; oligonukleotyd d156 Cechy: od 1 do 23 zasady homologiczna z zasadami 3315 do 3337 nici dodatniej przedstawionej na fig. 47, europejskie zgłoszenie patentowe nr88310922.5, zasadę 3323 zmieniono na C w celu wprowadzenia miejsca rozpoznawania EcoR1 od 4 do 9 zasady miejsce rozpoznawania EcoR1

Właściwości: służy jako starter syntezy DNA na ujemnej nici RNA/DNA genomowego dla PT-NANBH i wprowadza miejsce EcoR1 do klonowania Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 17 Typ sekwencji: nukleotydowa

Długość sekwencji: 29 zasad o następującej sekwencji:

CGCCGAATTC ATGCCGCCAC AGGAGGTTG

Ilość nici: jedna

Topologia: liniowa

Typ cząsteczki: syntetyczny DNA

Bezpośrednie źródło doświadczalne: syntetyzator oligonukleotydowy; oligonukleotyd d92 Cechy: od 1 do 29 zasady homologiczna z zasadami 36 do 64 ujemnej nici JG2 (numer identyfikacyjny sekwencji 3); zasady 57, 58 i 60 zmieniono na w celu wprowadzenia miejsca EcoR1 od 5 do 10 zasady miejsce rozpoznawania EcoR1

Właściwości: służy jako starter syntezy DNA na dodatniej nici RNA/DNA genomowego dla

PT-NANBH i wprowadza miejsce EcoR1 do klonowania

Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 18

Typ sekwencji: nukleotydowa z odpowiadającym białkiem

Długość sekwencji: 504 pary zasad o sekwencji przedstawionej na fig. 7

Ilość nici: jedna

Topologia: liniowa

Typ cząsteczki: cDNA otrzymany na podstawie genomowego RNA

Bezpośrednie źródło doświadczalne: klon 164/137

Cechy: początek poliproteiny PT-NANBH od 308 do 504 bp

Właściwości: prawdopodobnie koduje strukturalne białka wirusa

Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 19

Typ sekwencji: nukleotydowa z odpowiadającym białkiem

Długość sekwencji: 1107 par zasad o sekwencji przedstawionej na fig. 8

Ilość nici: jedna

Topologia: liniowa

Typ cząsteczki: cDNA otrzymany na podstawie genomowego RNA

167 059

Bezpośrednie źródło doświadczalne: klon 136/155

Cechy: część poliproteiny PT-NANBH od 1 do 1107 bp

Właściwości: prawdopodobnie koduje się białka strukturalne wirusa

Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 20

Typ sekwencji: nukleotydowa z odpowiadającym białkiem

Długość sekwencji: 2043 par zasad o sekwencji przedstawionej na fig. 9

Ilość nici: jedna

Topologia: liniowa

Typ cząsteczki: cDNA otrzymany na podstawie genomowego RNA

Bezpośrednie źródło doświadczalne: klon 156/92

Cechy: część poliproteiny PT-NANBH od 1 do 2043 bp

Właściwości: prawdopodobnie koduje się wirusowe białka niestrukturalne.

Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 21

Typ sekwencji: nukleotydowa z odpowiadającym białkiem

Długość sekwencji: 2116 par zasad o sekwencji przedstawionej na fig. 10.

Ilość nici: jedna

Topologia: liniowa

Typ cząsteczki: cDNA otrzymany na podstawie genomowego RNA

Bezpośrednie źródło doświadczalne: przylegające sekwencje tworzone przez klony cDNA z końca 5’ genomu

Cechy: początek poliproteiny PT-NANBH od 306 do 2116 bp

Właściwości: wirusowe białka strukturalne i nie strukturalne

Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 22

Typ sekwencji: nukleotydowa z odpowiadającym białkiem

Długość sekwencji: 3750 par zasad o sekwencji przedstawionej na fig. 11

Ilość nici: jedna

Typologia: liniowa

Typ cząsteczki: cDNA otrzymany na podstawie genomowego RNA

Bezpośrednie źródło doświadczalne: przylegające sekwencje tworzone prze klony cDNA z końca 3’ genomu

Cechy: część poliproteiny PT-NANBH od 1 do 3750 bp

Właściwości: wirusowe białka niestrukturalne.

Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 23

Typ sekwencji: nukleotydowa

Długość sekwencji: 23 zasady o następującej sekwencji:

CGGGTTTAAC ATTACGGATT TCC

Ilość nici: jedna

Topologia: liniowa

Typ cząsteczki: syntetyczny DNA

Pierwotny organizm źródłowy: bakulowirus: wirus jądrowej poliedrozy Autographa califomica (AcNPV)

Bezpośrednie źródło doświadczalne: syntetyzator oligonukleotydowy; oligonukleotyd d24 Cechy: od 1 do 23 zasady homologiczna z częścią genu poliedryny AcNPV położoną w kierunku zgodnym z kierunkiem transkrypcji w stosunku do miejsca klonowania BamH1 w pAc360 i podobnych wektorach

Właściwości: służy jako starter syntezy DNA z sekwencji bakulowirusowego wektora transferowego flankującej DNA wstawiony w miejscu BamH1 Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 24 Typ sekwencji: nukleotydowa

Długość sekwencji: 31 zasad o sekwencji przedstawionej na fig. 12

Ilość nici: jedna

Topologia: liniowa

Typ cząsteczki: syntetyczny DNA

Pierwotny organizm źródłowy: bakulowirus: wirus jądrowej poliedrozy Autographa californica (AcNPV)

Bezpośrednie źródło doświadczalne: syntetyzator oligonukleotydowy: oligonukleotyd d126 Cechy: od 1 do 31 zasady homologiczna z położoną przeciwnie do kierunku transkrypcji sekwencją łączącą otrzymywaną gdy cDNA zamplifikowany przez d75 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 5) klonowana jest w miejscu klonowania BamH1 w pAc360 i podobnych wektorach: zmiany w zasadach 13 i 14 wprowadzają miejsce Pst1 od 1 do 10 zasady homologiczna z regionem miejsca BamH1 w pAc360 i podobnych wektorach od 4 do 9 zasady miejsce BamH1 od 12 do 17 zasady miejsce Pst1

Właściwości: służy jako starter syntezy DNA przy połączeniu sekwencji bakulowirusowego wektora transferowego i sekwencji uprzednio zamplifikowanej przez oligonukleotyd d75; wprowadza miejsce rozpoznawane przez Pst1 do późniejszego klonowania

Sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 25

Typ sekwencji: nukleotydowa

Długość sekwencji: 45 zasad o sekwencji przedstawionej na fig. 13

Ilość nici: jedna

Topologia: liniowa

Typ cząsteczki: syntetyczny DNA

Pierwotny organizm źródłowy: N/A

Bezpośrednie źródło doświadczalne: syntetyzator oligonukleotydowy; oligonukleotyd d 132 Cechy: od5do 10 zasady miejsce rozpoznawane przez Pst1 od 13do 27zasady łącznik kodujący pięć reszt lizyny od 28 do 45 zasady homologiczna z zasadami 4 do 21 BR11 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym 7)

Właściwości: służy jako starter syntezy DNA przy końcu 5’BR11 i wprowadza syntetyczną sekwencję kodującą pięć reszt lizyny, jak również miejsce rozpoznawane przez Pst do późniejszego klonowania.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wytwarzania wirusowego polipeptydu PT-NANBH, znamienny tym, że klonuje się lub syntetyzuje się sekwencję DNA kodującą antygen o sekwencji aminokwasowej, homologicznej przynajmniej w 90% z sekwencją aminokwasową podaną w sekwencjach o numerach identyfikacyjnych: 3,4,5,18,19,20,21 lub 22 przedstawionych odpowiednio na fig. 4, 5, 6,7,8,9, 10,11 lub jej fragment antygenowy, wstawia się tę sekwencję DNA do wektora ekspresyjnego zdolnego do ekspresji w odpowiednim gospodarzu, transformuje się komórki gospodarza wektorem ekspresyjnym, hoduje się tak stransformowane komórki gospodarza i izoluje się polipeptyd wirusowy.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się sekwencję aminokwasową homologiczną przynajmniej w 90% z sekwencją aminokwasową podaną w sekwencjach o numerach identyfikacyjnych 3, 4 lub 5, przedstawionych odpowiednio na fig. 4, 5, 6, lub jej fragment antygenowy.
3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że stosuje się sekwencję aminokwasową homologiczną z sekwencją aminokwasową podaną w sekwencjach o numerach identyfikacyjnych 3 lub 4, przedstawionych odpowiednio na fig. 4, 5, lub jej fragment antygenowy.
4. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że stosuje się sekwencję aminokwasową homologiczną przynajmniej w 90% z sekwencją aminokwasową podaną w sekwencji o numerze identyfikacyjnym 5, przedstawionej na fig. 6, lub jej fragment antygenowy.
5. Sposób według zastrz, 1, albo zastrz. 2, albo zastrz. 3, albo zastrz. 4, znamienny tym, że stosuje się sekwencję aminokwasową homologiczną przynajmniej w 95% z sekwencją aminokwasową podaną w sekwencjach o numerach identyfikacyjnych 3,4,5 18, 19, 20,21 lub 22 przedstawionych odpowiednio na fig. 4,5,6,7, 8,9, 10,11 lub jej fragment antygenowy.
6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że stosuje się sekwencję aminokwasową homologiczną przynajmniej w 98% z sekwencją aminokwasową podaną w sekwencjach o numerach identyfikacyjnych 3, 4, 5, 18, 19, 20, 21 lub 22 przedstawionych odpowiednio na fig. 4,5,6,7, 8 9, 10,11 lub jej fragment antygenowy.
7. Sposób wytwarzania wirusowego polipeptydu PT-NANBH, znamienny tym, że klonuje się lub syntetyzuje się sekwencję DNA kodującą antygen pochodzącą ze strukturalnego regionu kodującego genomu wirusowego i sekwencję DNA kodującą antygen pochodzącą z niestrukturalnego regionu kodującego genomu wirusowego, wstawia się tę sekwencję DNA do wektora ekspresyjnego zdolnego do ekspresji w odpowiednim gospodarzu, transformuje się komórki gospodarza wektorem ekspresyjnym, hoduje się stransformowane komórki gospodarza i izoluje się polipeptyd wirusowy.
8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że stosuje się antygen kodowany przez strukturalny region kodujący, który to antygen posiada sekwencję aminokwasową homologiczną przynajmniej w 90% z sekwencją aminokwasową podaną w sekwencji aminokwasowej o numerze identyfikacyjnym 5 przedstawionej na fig. 6 lub jej fragment antygenowy, i antygen kodowany przez niestrukturalny region kodujący, który to antygen posiada sekwencję aminokwasową homologiczną przynajmniej w 90% z sekwencją aminokwasową podaną w sekwencjach o numerach identyfikacyjnych 3 lub 4, przedstawionych odpowiednio na fig. 4, 5 lub jej fragment antygenowy.