JPH07503614A - Ｈｃｖ蛋白のための哺乳動物発現システム - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、Ｃ型ウィルス性肝炎（ＨＣＶ）に関し、更に詳しくはＨＣＶ蛋白を産 生ずることのできる哺乳動物発現システムおよびこれらの蛋白の使用法に関する 。

黄痘を引き起こす肝炎疾患についての記述は、古くから知られている。種々の伝 播経路を介した種々の重症度の肝損傷の肝炎を引き起こすウィルス性肝炎は、現 在、特有のウィルス性構成蛋白構造および複製様式を有するウィルス因子の群を 含めて知られている。急性ウィルス性肝炎は、黄痘、肝圧痛および高水準の肝ト ランスアミナーゼ（例えば、アスパラギン酸トランスアミナーゼおよびアラニン トランスアミナーゼ）を含めた充分明確にされた患者の症状により臨床的に診断 される。

現在、Ａ型肝炎およびＢ型肝炎間の更なる識別に血清学的アッセイが採用されて いる。非Ａ非Ｂ型肝炎（Ｎ　Ａ　Ｎ　ｎ　）Ｉ）は、Ａ型つィルス性肝炎または Ｂ型つィルス性肝炎のいずれによっても引き起こされない輸血後肝炎のケースを 記載した１９７５年に初めて使われた用語である。Ｆｓｉｅｔｌｏ＊＊等、　Ｎ ｒｗ　ＥＢｌ、Ｊ。

Ｍｅｄ、　２９２：　４５４−４５７　ｆ１９７ｓ年１゜ＮＡＮＢＩＩの診断は 、主として、＾型肝炎およびＢ型肝炎の存在の有無の血清学的分析に基づき消去 法により為されてきた。輸血後肝炎の約９０％のケースは、ＮＡＮＢＨが原因で ある。１ｌｏｌｌｉａｌｅｒ等、ｉｎ　Ｎ、Ｒ，Ｒｏｓｅ等編、　Ｍｓａｓｉｌ 　ｏｆ　Ｃ１１ｎｉｃＩＩ　Ｉ■−ａｎｏｌｏｇ２．　Ａｍｔ＋１ｃｓｅ　５ｏ ｃｉｅ１７１ｏｒ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ（７，ワシントンＩ１．Ｃ，，５ａｉ ｌ−５７２（１９８６年）。

公知の肝炎ウィルスの一つとのゲノミック近似性によりＮＡＮ　Ｂ　Ｈウィルス を同定する試みは、これまで成功せず、ＮＡＮｎ　Ｈが特有のゲノミック構成お よび構造を有することを示唆している。Ｆ＋＋ｖｌ！＋等、Ｉ、Ｍｃｄ、Ｖｉｔ Ｏｌ、１２：　２０５−２Ｎ　（１９８３年）。

Ｗｃ１ｎｅｒ等、］、Ｗｅｄ、ＶｉｔＯｌ、２１＋　２３９−２４７　（１Ｉｌ ７年１　。ＮＡＮＢＨに特異的な抗体を検出するためのアッセイ法の開発におけ る前進は、このウィルスに関連した抗原の確認がむずかしいため阻まれてきた。

Ｗ１τＯ等、米国特許第４．８７０．０７６；　Ｗ動ｒｄ＋等、Ｐｒｏｃ、Ｎ５ １１．　＾ｃ＋ｄ、Ｓｃｉ、８３：　６６０Ｂ−６６１２（１９８６年）；　Ｈ ｏ＋ｉＭｅｄ、　Ｖｉｔａｌ、２０；　４３−５６　（１９Ｈ年）。

１９８８年５月、カイロンコ〒ボレーシラン（Ｃｈｉ＋ｕ＋　Ｃｏｒｐｓ＋ｓｉ ｉｏｍ）とセンターズフォーディジーズコントロール（（Ｈｌｔｔｓｌｏｔ　ｌ １ｉｔｔ＊ｔｅ　Ｃｏｗ目６＋）との共同研究の成果は、ＮＡＮＢ因子、Ｃ型ウ ィルス性肝炎（ＨＣＶ）とされるものを確認に帰した。

Ｍ、　ＬＢｈｌｏｎ等は、チンパンジーの感染性血しょうから得たＮＡＮＢ因子 をＥ、　ｃｏｌｉ中でクローンおよび発現させた。０１０等、５ｃＩｅｎｃｅ　 ２４４：３５９−３６１　ｆ１９１１９年）；　Ｃｂｏｏ等、５ｃｉｔｓｃｅ　 ２４４：３６２−３６４　（１９８９年）。臨床的にＮＡＮＢＩ（であると診断 された患者のほとんどに存在する抗体と免疫学的に反応する抗原をコードするＨ ＣＶ由来のｃＤＮＡ配列が同定された。入手可能な情報およびＨＣＶの分子構造 に基づくウィルスの遺伝学的構成は、１つの連続した翻訳のための転写解読枠を 有する分子量約９．５ｋｂの一本鎖ＲＮＡ　（正鎖）から成る。１．　Ａ、　Ｃ ｔｌｋｂｔｔｌ。

Ａｓａｒ、　１．１ｌｅｄ、　Ｓｔｉ、　２９９：３４Ｇ−３５５ｔ１９９０年 ）。これは、フラビウィルスと似ている小粒子のエンベロープを持つウィルスで ある。研究者等は、感染した個体の肝細胞における超構造的変化によりＮＡＮＢ 因子の同定を試みた。Ｉｆ、　Ｇｗｐｌ＊、　Ｌｉｔｅｒ　Ｉ：１Ｉｌ−１１５ （１９Ｈ年）；　Ｄ、ｗ、Ｂ＋５ｌｌｙ、１．　ＶｉｔＯｌ、Ｍｓｌｈｏｄｔ　 １１）：３０７−３１９　（１９８５年）。感染性ＨＣＶ血しようで実験的に感 染させたチンパンジーにおけるのと同様にＮ　Ａ　Ｎ　Ｂ　Ｈ患者においても、 肝細胞における同様の超構造的変化およびＰＣＲ法により増幅したＨ　ＣＶ　Ｒ Ｎ　Ａ配列が検出された。Ｔ、　Ｓｈｉｍｉｔａ等、Ｐｒｏｃ。

Ｎ１１．＾ｃｔｄ、Ｓｃｉ、８７：６４４１−６４４４　ｆ１９９０年）。

輸血後Ｎ　Ａ　Ｎ　Ｂ　Ｈの発症因子としてＨＣＶが関係していると（１９９０ 年）。ＨＣＶ抗体の検出により血液供給システムから得たＮ　Ａ　Ｎ　Ｂ　ＩＩ 感染血液の７０から８０％が排除されるが、この疾患の慢性期には抗体が明かに 容易に検出される一方で、急性ＮＡＮＢＨ期から得たサンプルでは６０％のみが ＨＣＶ抗体陽性である。Ｈ，Ａｌｔｅｒ等、Ｎｅｗ　ＥＢ、ＪｌｌＩｅｄ、３２ ＋＋１４９４ｉ５００（１９８９年）。ｉｔ　ｃ　ｖに対する露出と抗体検出の 間の長期の間隔、および種々の構造および非構造蛋白に対する免疫応答のプロフ ィールに関する適切な情報の欠如は、潜伏期における患者の感染状態およびＮ　 Ａ　Ｎ　Ｂ　Ｈ感染期間中の抗体陰性段階に関する疑問を提起する。

上記で考察したような推定される）ＩＣＶ発症因子の発見以来、研究者等は、推 定されるＨＣＶ蛋白をヒト発現システムに都いて発現させ、またウィルスを単離 しようと試みてきた。現在までに、ＨＣＶが哺乳動物発現システムにおいて効率 的に発現したという報告は公表されてシらず、ウィルスは組織培養システムにお いて増殖されていない。

従って、現在市販的に入手可能なてツセイ法により検出されないような急性感染 およびウィルス卯症の有無を見分けるアッセイ試薬および゛アッセイシステムの 開発の必要性がある。、これらのツールは、予防および／または治療方法を開発 するために、自然治癒されると思われるものと急性感染ないし持続感染、進行中 および／または慢性感染との識別を容易にし、ＮＡＮＢＨ感染の予後を定めるた めに必要である。また、これらのグリコジル化抗原の分泌を可能にする発現シス テムは、診断薬および治療薬を生産し精製するのに役に立つ。

発明の概要 本発明は、ＨＣＶが高水準に発現した蛋白の産生が可能な新規な哺乳動物発現シ ステムを提供する。詳しくは、ＨＣｖの全鎖長構造断片が、アミロイド前駆蛋白 （ＡＰＰ）またはヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）分泌シグナルとの融合物として発 現する。

これらの新規な発現システムは、このシステムにおけるウィルス性蛋白の適切な プロセシング、グリコジル化および折たたみに寄与し、もって高水準のＨＣＶ蛋 白の産生を可能にする。

特に、本発明は、プラスミドｐＨＣＶ−１６２、ｐＨＣＶ−１６７、ｐＨＣＶ− １６８、ｐＨＣＶ−１６９およびｐｔ−ｔｃｖ−１７０を提供する。また、哺乳 動物発現ベクター、ｐＨＣＶ−１６２およびｐ）ＩＣＶ−１６７１ｍより発現し たＡＰＰ−ＨＣＶ−Ｅ２融合蛋白も含まれる。更に、哺乳動物発現ベクター、ｐ ＨＣＶ−１６８、ｐｌｌｃＶ−１６９およびｐＨＣＶ−４７０により発現したＨ ＧＨ−ＨＣＶ−Ｅ２融合蛋白が提供される。

また、本発明は、哺乳動物発現システムにおいて産生じたグリコジル化ＨＣＶ抗 原と検査サンプルとを接触させることから成る改良点を特徴とする、ＨＣＶ抗原 または抗体を含有する疑いのある検査サンプルにおけるＨＣＶ抗原または抗体検 出法をも提供する。更に、哺乳動物発現システムにおいて産生じたグリコジル化 ＨＣＶ抗原を用いることにより産生じた抗体と検査サンプルとを接触させること から成る改良を特徴とする、ＨｃＶ抗原または抗体を含有する疑いのある検査サ ンプルにおける）ｆ　Ｃ−Ｖ抗原または抗体検出法を提供する。抗体はモノクロ ーナルでもポリクローナルでも良い。

本発明は、更に、哺乳動物発現システムにおいて産生じたグリコジル化ＨＣＶ抗 原を含有する容器から成ることを特徴とする、このＨＣＶ抗原または抗体を含有 する疑いのある検査サンプルにおけるＨＣＶ抗原または抗体の存在を検出するた めの検査キットを提供する。また、検査キットは、哺乳動物発現システムにおい て産生じたグリコジル化ＨＣＶ抗原を用いることにより産生じた抗体を含むこと もできる。本発明により提供される別の検査キットは、哺乳動物発現システムに おいて産生じたグリコジル化ＨＣＶ抗原を用いることにより産生じた抗体を含有 する容器から成る。検査キットにより提供される抗体は、モノクローナルまたは ポリクローナル抗体であってもよい。

図面の簡単な説明 図１は、ＨＣＶＣソゲッククローンを産生させ組み立てるために用いた手順の図 式説明を示す。

図２は、哺乳動物発現ベクターｐＨＣＶ−１６２およびｐＨＣＶ−１６７１，： より発現したＡＰＰ−ＨＣＶ−Ｅ２Ｍｋ合蛋白の位置およびアミノ酸組成の図式 説明を示す。

図３は、哺乳動物発現ベクターｐＲＣ／ＣＭＶの図式説明を示す。

図４は、ＨＣＶ抗体陽性ヒト血清を用いＨＥＫ−２９３細鉋内でｐＨｃＶ−１６ ２１，Ｚより発現したＡＰＰ−ＨＣＶ−Ｒ２１１に合蛋白により得られたＲＩＰ Ａの電気泳動結果を示す。

図５は、合成ペプチドに対するラビットポリクローナル血清を用い５ＥＥＫ−２ ９３細胞内でｐ）（ＣＶ−１６２１＝よりＲ１１またＡＰＰ−ＨＣＶ−Ｅ２融合 蛋白により得られたＲＩＰＡの電気泳動結果を示す。

図６は、Ｉｆ　ＣＶ抗体陽性ヒト血清を用いＩＩＥＫ−２９３細胞内でｐＨＣＶ −１６７１：より発現したＡＰＰ−ＨＣＶ−Ｅ２融合蛋白により得られたＲＩＰ Ａの電気泳動結果を示す。

図７は、ＨＥＫ−２９３細胞内でｐＨＣＶ−１６２お！びｐＨＣＶ−１６７１， ：より発現した免疫沈澱したＡＰＰ−ＨＣＶ−Ｅ２融合蛋白のエンドグリコシダ ーゼ−）Ｉ消化の電気泳動結果を示す。

図８は、アメリカ人のＨＣＶ抗体陽性血清がＨＥＫ−２９３細胞内でｐＨＣＶ− １６２１：より発現したＡＰＰ−ＨＣＶ−Ｅ２融合蛋白に対してスクリーニング された時点で得られたＲＩＰＡの電気泳動結果を示す。

図９は、日本人の血液提供志願者から得た血清がＨＥ　Ｋ　−２９３細胞内でｐ ＨＣＶ−１６２４，：より発現したＡＰＰ−ＩＣＶ−Ｅ２融合蛋白に対してスク リーニングされた時点で得られたＲＩＰＡの電気泳動結果を示す。

図１０は、日本人の血液提供志願者から得た血清がＨＥ　Ｋ　−２９３細胞内− Ｃ−ｐＨＣ，Ｖ−１６２１：、にり発現したＡＰＰ−）ＩＣＶ−Ｅ２融合蛋白に 対してスクリーニングされた時点で得られたＲＩＰＡの電気泳動結果を示す。

図１１は、哺乳動物発現ベクターｐＣＤＮＡ−１の図式説明を示す。

図１２は、哺乳動物発現ベクターｐＨＣＶ−１６８により発現したＨＧＨ−ＨＣ Ｖ−Ｅｌ融合蛋白の位置およびアミノ酸組成の図式説明を示す。

図１３は、哺乳動物発現ベクターｐＨＣＶ−１６９およびｐＨＣＶ−１７０１， ：より発現したＨＧＨ−ＨＣＶ−Ｅ２融合蛋白の位置およびアミノ酸組成の図式 説明を示す。

図１４は、ＨＣＶ　Ｅ２抗体陽性血清カＩ（ＥＫ−２９３細１１１ｉ内’ｔ’ｐ ＨｃＶ−１６８１，ｍより発現したＩＩＧＨ−１（ＣＶ−Ｅｌ融合蛋白に対しス クリーニングされた時点で得られたＲＩＰＡの電気泳動結果を示す。

図１５は、ＨＣＶＥ２抗体陽性血清がＨＥＫ−２９３細胞内でｐＨＣＶ−１６９ およびｐＨＣＶ−１７０１ニーより発現したｆ（ＧＨ−ＨＣＶ−Ｅ２融合蛋白に 対しスクリーニングされた時点で得られたＲＩＰＡの電気泳動結果を示す。

発明の詳細な説明 本発明は、種々の態様において有用な全鎖長ゲノミッククローンを提供する。こ のような全鎖長ゲノミッククローンは、種々の目的に有用なＨＣＶウィルスの培 養を可能にする。ＨＣＶウィルス培養の成功により、ウィルス複製阻害剤、診断 用途用ウィルス性蛋白、治療用ウィルス性蛋白、および特に、例えば１（ＣＶの 推定されるエンベロープ、Ｔ（ＣＶの推定されるＥ１断片およびＩ（ＣＶの推定 されるＥ２断片を含む構造ウィルス性抗原の開発を可能にする。

ウィルス複製に用いることのできる細胞系は多数あり、以下のものに限定される ものではないが、例えば−次肝細胞、永久または半永久肝細胞、形質転換ウィル スまたは形質転換遺伝子でトランスフェクションした培養物が挙げられる。特に 有用な細胞系としては、例えば、特定のＲＮＡポリメラーゼ配列の制御下でＨＣ Ｖ　ＲＮＡ配列を増幅する種々の非相同ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子のいずれかを 継続的に発現する永久肝細胞培養物が挙げられる。

構造抗原をコードするＩ（ＣＶウィルスの配列の起源としては、推定上のコア断 片、推定上のＥ１断片および推定上のＥ２断片が挙げられる。原核細胞および真 核細胞系のいずれでも発現を遂行することができる。哺乳動物発現システムでＨ ＣＶ蛋白の発現をすることにより、ＥｌおよびＥ２蛋白のようなグリコジル化蛋 白の製造をも考慮に入れることができる。これらのグリコジル化蛋白は、例えば スクリーニング用アッセイシステムおよび予後の用途を含む種々の態様における 診断有用性を有する。

ＨＣＶウィルス蛋白の哺乳動物発現については、特定のウィルス付着部位または 配列および／または、感染しゃすい細胞の型、例えば肝細胞等に関するウィルス 受容体の解明を含めた阻害剤の研究を考慮に入れることができる。　哺乳動物発 現システムにおいてここで述べた通りに開発した特定の発現クローンの獲得は、 例えば急性感染に対する進行中または持続性感染、および／または最近の感染か 過去の露出かのようなＨＣＶ感染の段階を決定することができる診断アッセイ用 抗原を提供する。また、これらの特定の発現クローンは、ＨＣＶにより引き起こ される慢性肝炎へ移行するか、或いは疾患の軽減につながるかを区別するような 疾患軽減の予後のマーカーをも提供する。グリコジル化構造抗原への初期の血清 学的変換は、これらの哺乳動物発現システムにおいて生産した蛋白を用いること により検出可能になるかもしれないと考えられる。また、モノクローナル抗体お よびポリクローナル抗体の両方が、これらの哺乳動物発現システムから誘導され た蛋白からも産生ずることができ、これらは、次いで、診断、予後および治療用 途に用いることができる。また、ここで述べたこれらの新規な発現システムから 生産した試薬は、他の感染剤の定性およびまたは単離に有用である。

これらの哺乳動物発現システムから生産した蛋白および、これらの蛋白から生産 した試薬は、アッセイを行うのに便利なように適当な容器に入れ検査キットとし てパックすることができる。本発明の他の態様としては、固相に付着、したＨ　 ＣＶエピトープおよび、固相に付着したＨＣＶエピトープに対する抗体から成る ポリペプチドが含まれる。また、ポリペプチドの発現を可能にする条件下、Ｉ（ ＣＶエピトープを含有するポリペプチドをコードする配列を含有する哺乳動物発 現ベクターで形質転換した宿主細胞をインキュベートすることから成る、ＨＣｖ エピトープを含有するポリペプチドの製法および、この方法により生産されるＨ 　ＣＶエピ５トープ含有ポリペプチドも含まれる。

本発明は、本発明により提供される組換えまたは合成ポリペプチドを利用するア ッセイ法および、ここで説明した種々の抗体を提供し、そのアッセイにおいては シグナル生成化合物を用いてもよい。シグナル生成化合物を用いないアッセイ法 における検出手段も提供される。説明したアッセイ法のすべてが、通常、体厚も しくは環体のいず些か又は両方を検出し、検査サンプルとここで提供される少な くとも１種の試薬とを接触させ少なくとも１種の抗原／抗体複合体を形成しこの 複合体の存在を一出することを含む。これらのアッセイ法については、以下に詳 細に説明する。

ＨＣＶエピトープを含有する哺乳動物発現システムから得た免疫原性ペプチドか ら成るＨＣＶ感染治療用ワク４チン、またはＨＣＶの不活化ないし弱毒化調製物 も本発明に含まれる。更に、接種された個体内で免疫応答を生じさせるのに充分 な量の、ＨＣＶエピトープを含有する単離した免疫原性ポリペプチドを個体に投 与することから成る、ＨＣＶに対する抗体を産生させる方法も本発明に含まれる 。

更に、）ＩＣＶに感染させた組織培養成長細胞も本発明により提供される。

′抗体を含有する体成分′　（または検査サンプル）とは、目的の抗体の起源で ある個体成分を増す。これらの成分は、当業者に周知である。これらのサンプル には、ここで述べた本発明の方法により検査できる生物学的サンプルが含まれ、 全血、血清、血しょう、脳を髄液、尿、リンパ液、および呼吸、腸および尿生殖 器管の種々の外部切片、涙、唾液、乳、白血球、骨随履等のようなヒトおよび動 物の体液、細胞培養上澄のような生物学的液体、固定した組織検体および固定し た細胞検体が挙げられる。

本発明により説明したように、組換え蛋白調製後、この組換え蛋白を、抗原また はＨＣＶに対する抗体のいずれかの存在を検出する本明細書で述べたような新規 なアッセイ法を開発するために用いることができる。また、これらの組成物は、 現場で所望されるＨＣＶの免疫学的エピトープに特異的に結合する特異的−組換 え蛋白を用いてモノクローナルおよび／またはポリクローナル抗体を開発するた めにも用いることができる。また、本発明の少なくとも１種の組換え蛋白は、当 業者に公知の以下の方法によりワクチ／ンを開発するために用いることができる と考えられる。

アッセイに用いる試薬は、バイアルおよびびんのような１つ以上の容器を備えた キットの形態で提供することができると考えられ、各容器には、アッセイに用い る、モノクローナル抗体、または複数のモノクローナル抗体のカクテル、または ポリペプチド（組換えもしくは合成）のような試薬を別々に入れる。

′固相′（′固形支持物′）は、当業者等に公知であり、反応トレーのウェルの 壁、試験管、ポリスチレンビーズ、磁気ビーズ、ニトロセルロースストリップ、 膜、ラテックス粒子のような微粒予信が挙げられる。′固相′の選定は重要では なく、当業者によって選ばれる。従って、ラテックス粒子、微粒子、磁気もしく は非磁気ビーズ、膜、プラスチック管、マイクロタイターウェルの壁、ガラスも しくはシリコンチップおよびヒツジの赤血球は、すべて好適な例である。固相上 にペプチドを固定する適切な方法としては、イオン的、疎水的、共有的相互作用 等が挙げられる。ここで用いた′固相′とは、不溶性であるかまたは後の反応に より不溶性にすることができるいずれの物質をも指す。固相は、捕獲試薬を引き 付は固定するその本来の能力により選ばれる。あるいは、固相は、捕獲試薬を引 き付は固定する能力を有する付加受容体を保持することができる。付加受容体は 、捕獲試薬それ自体とは反対に荷電した荷電物質、または捕獲試薬と結合した荷 電物質を挙げることができる。ま　−た他には、受容体分子は、固相に固定（結 合）され、特異的結合反応を介して捕獲試薬を固定する能力を有するいずれの特 異的結合メンバーであってもよい。受容体分子は、アッセイ実施前またはアッセ イ実施中に、捕獲試薬の固相物質への間接的結合を可能にする。従って、固相は 、プラスチック、誘導プラスチック、磁気もしくは非磁気金属、試験管のガラス もしくはシリコン表面、マイクロタイターウェル、シート、ビーズ、微粒子、チ ップおよび当業者等に公知の他の形状物であってもよい。

本発明の範囲内で、固相は、抗体によるアクセスを可能にするのに充分な空げき 率および、抗原を結合させるのに適した表面観相性を有する適切な多孔性物質か ら成ることもできると考えられる。微細孔構造が一般に好ましいが、加水状態で ゲル構造を有する物質も同様に用いることができる。このような有用な固形支持 物としては、寒天、アガロース、架橋アルギン酸、置換もしくは架橋グアガム、 セルロースエステル類、特に硝酸およびカルボン酸とのそれ、混合セルロースエ ステル類、およびセルロースエーテル類のような天然の高分子炭水化物およびそ の合成による変形物、架橋もしくは置換誘導体；架橋もしく・は改変ゼラチ、シ 類を含む、蛋白および誘導体のような窒素を含有する天然の重合体；ラテックス およびゴムのような天然の炭化水素重合体；ポリエチレン、ポリプロピレン、ポ リスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリ酢酸ビニルおよびその部分的に加水分解した 誘導体を含むビニルポリマー類、ポリアクリルアミド類、ポリメタアクリレート 類、ポリエステル類、ポリアミド類のようなポリ縮合物の共重合物および三元共 重合物、およびポリウレタン類もしくはポリエポキシド類のような他の重合体の ような適切に多孔構造を有するように調製することのできる合成重合体；硫酸バ リウム、硫酸カルシウム、炭酸カルシウムを含むアルカリ土類金属およびマグネ シウムの硫酸塩または炭酸塩、アルカリおよびアルカリ土類金属、アルミニウム およびマグネシウムのケイ酸塩のような多孔性無機物質；ならびに粘土、アルミ ナ、タルク、カオリン、ゼオライト、ンリカゲル、もしくはガラスのようなアル ミニウムもしくはシリコン酸化物もしくは水加物（これらの材料は、上記高分子 材料と共に充填剤として用いることができる）；ならびに既に存在する天然の重 合体上で合成重合体の重合を開始させることにより得られるグラフト共重合体の ような、上記族の混合物もしくは共重合体が挙げられる。これらの材料のすべて をフィルム、シートもしくはプレートのような適切な形状で用いることができる し又は、ベーパー、ガラス、プラスチックのフィルムもしくは織物のような適当 な不活性担体にコート又は結合又は積層することができる。

ニトロセルロースの多孔構造は、モノクローナル抗体を含む種々の試薬に対し卓 越した吸収および吸着特性を有する〜。ナイロンも同様の特徴を有しており、や はり適している。上記のこのような多孔性固形支持物は、約０．０１から０．５ ミリ、好ましくは約０．１ミリ厚さのシートの形態が好ましいと考えられる。孔 のサイズは、広い制限内で変えることができ、好ましくは約０．０２５から１５ ミクロン、特に好ましくは約０．１５から１５ミクロンである。このような支持 物の表面は、抗原または抗体の支持物と共有結合しやすいよう、化学的処理によ り活性化することができる。しかしながら、抗原または抗体の不可逆的結合は、 一般に、よく解明されていない疎水力による多孔性物質に対する吸着により得ら れる。また、適切な固形支持物については、米国特許出願番号第２２７．２７２ に記載されている。

″指示薬′は、ＨＣＶの特異的結合メンバーと共役した（結合した）、外的手段 により検出測定可能なシグナルを生じる′シグナル生成化合物′　（標識）から 成る。ここでいう′特異的結合メンバー′とは、特異的結合対のメンバーを意味 し、２つの異なる分子の１方が化学的または物理的手段を介して２番目の分子に 特異的に結合している。攬示薬は、）ＩＣＶの特異的結合対の抗体メンバーに加 えて、ビオチンもしくは抗−ビオチン、アビジンもしくはビオチン、炭水化物も しくはレクチン、相補的ヌクレオチド配列、エフェクターもしくは受容体分子、 酵素の補因子および酵素、酵素の阻害剤もしくは酵素等のようなハプテン−抗− ハブテンシステムのいずれかを含むいずれかの特異的結合対のメンバーでもよい 。免疫反応的に特異的な結合メンバーは、サンドイッチアッセイにおけるＨＣＶ 、拮抗的アッセイにおける捕獲試薬、または間接アッセイにおける補助的特異的 結合メンバーのいずれかと結合することのできる、抗体、抗原または抗体／抗原 複合体であってもよい。

考えられる種々の′シグナル生成化合物′　（標識）としては、色原体、酵素の ような触媒、フルオレセンおよびローダミンのような発光化合物、アクリジニウ ム、フエナントリジニウムおよびジオキセタン化合物のような化学発光化合物、 放射性元素および直接口で見える標識が挙げられる。酵素の例としては、アルカ リ性ホスファターゼ、セイヨウワサビパーオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ 等が挙げられる。標識の選択は重要ではないが、それ自体によりまたは１つ以上 の更なる物質と共にシグナルを生成することが可能であるべきである。

種々の他の固相を用いる別の態様も考えられるが、これも本発明の範囲内に入る 。例えば、液相免疫化学反応をすばやく成し遂げるために、ＥＰ特許出願０３２ ６１００に対応する同時係属中の米国特許出願番号１５０，２７８、および米国 特許出願番号３７５．０２９　（ＥＰ特許出願０４０６４７３）（いずれも本出 願人によるもので、参照により本明細書に含めるものとする）に記載された、マ イナスに荷電−した重合体で固定可能な反応複合体を固定するイオン捕獲手法を 、本発明に用いることができる。固定可能な免疫複合体は、マイナスに荷電した ポリ陰イオン／免疫複合体と予め処理したプラスに荷電した多孔性マトリックス 間のイオン的相互作用により残余の反応混合物と分離され、ＥＰＯ特許出願０　 ２７３．１１５に対応する同時係属中の米国特許出願番号９２１．９７９　（こ れは本出願人によるもので、参照により本明細書に含めるものとする）に記載が あるような化学発光シグナル測定のところで述べたものを含む前述の種々のシグ ナル生成システムを用いることにより検出される。

また、本発明の方法は、固相が微粒子から成る、自動化および半自動化システム を含めた微粒子技術を利用するシステムにおける用途にも適用することができる 。このようなシステムとしては、それぞれ公表されたＥＰＯ特許出願ＥＰ　０４ ２５６３３およびＥＰ　０　４２４　６３４に対応する係属中の米国特許出願４ ２５，６５１、および４２５．６４３　（参照によりこれらを本明細書に含める ものとする）に記載されたものが挙げられる。

また、イムノアッセイ用走査型プローブ顕微鏡検査法（ＳＰＭ）の使用も本発明 のモノクローナル抗体に容易に適用できる技術である。走査型プローブ顕微鏡検 査法、特に原子力顕微鏡検査法において、捕獲相、例えば本発明のモノクローナ ル抗体の少なくとも１つは、固相に付着しており、走査型プローブ顕微鏡を用い て、固相表面に存在するかもしれない抗原／抗体複合物を検出する。走査型トン ネル顕微鏡検査法を使えば、抗原／抗体複合体を検出する多数のイムノアッセイ システムにおいて通常用いられる標識が不要となる。このようなシステムについ ては、係属中の米国特許出願番号６６２，１４７　（これは本出願人によるもの で、参照により本明細書に含めるものとする）に記載がある。

特異的結合反応をモニターするＳＰＭの利用には、多くの方法がある。一つの態 様において、特異的結合相手の１メン、（−（本発明のモノクローナル抗体であ るアナライト特異的物質）は、走査対象表面に結合している。アナライト特異的 物質の結合は、当業者等に公知の方法に従い、プラスチックまたは金属表面の固 相から成る試験片への吸着によってもよい。または、試験片が誘導プラスチック 、金属、シリコンまたはガラスの固相から成るところの試験片への特異的結合相 手（アナライト特異的物質）の共有結合を利用することもできる。共有結合法は 、当業者等に公知であり、特異的結合相手を試験片に不可逆的に結合させる種々 の手段が含まれる。試験片がシリコンまたはガラスであれば、特異的結合相手を 結合させる前に表面を活性化する必要がある。トリエトキシアミノプロピルシラ ン（シグマケミカル社、セントルイス、ＭＯｌより入手可能）、トリエトキシビ ニルシラン（オルトリッチケミカル社、ミルウォーキー、ＷＴ）および（３−メ ルカプト−プロピル）−トリメトキシシラン（シグマケミカル社、セントルイス 、ＭＯ）のような活性シラン化合物は、それぞれ、アミノ、ビニル、およびチオ ールのような反応基を導入するために用いられる。このような活性化表面を利用 して結合相手を直接結合させる（アミノまたはチオールの場合）こともできるし 又は、活性化表面を更にゲルタールアルデヒド、ビス（スクシンイミジル）スペ レート、５ＰＦＤ（スクシンイミジル３−　［２−ピリジルジチオ］プロピオネ ート）　、ＳＭＣＣ（スクシンイミジル−４−［Ｎ−マレイミドメチルコシクロ ヘキサン−１−カルボキシレート）、５ＩＡＢ（スクシンイミジル［４−ヨード アセチルコアミノベンゾエート）およびＳＭＰＨ（スクシンイミジル４−　［１ −マレイミドフェニル］ブチレート）のようなリンカ−と反応させて表面から結 合相手を分離することもできる。ビニル基を酸化して共有結合の手段を提供する ことができる。これは、特異的結合相手との複数の結合箇所を提供することので きるポリアクリル酸のような種々の重合体の重合用アンカーとしても用いること ができる。アミノ表面は、種々の分子量の酸化デキストラン類と反応させて、異 なるサイズおよび容量の親水性リンカ−を提供することができる。酸化可能デキ ストランの例としては、デキストランＴ−４０（分子量４万ダルトン）、デキス トランＴ−１１０（分子量１１万ダルトン）、デキストランＴ−５００（分子量 ５０万ダルトン）、デキストランＴ−２Ｍ　（分子量２百万ダルトン）（これら のすべてがファルマシア社から入手可能である）またはフィコール（分子量７万 ダルトン）（シグマケミ男ル社、セントルイス、ＭＯ，から入手可能）が挙げら れる。また、１９８８年１月２９日に出願された係属中の米国特許出願番号１５ ０，２７８および、１９８９年７月７日に出願された出願番号３７５．０２９　 （これらは各々本出願人によるもので、参照により本明細書に含めるものとする ）に記載された技術および化学を用いることにより、ポリエレクトロライト相互 作用を利用して試験片の表面上に特異的結合相手を固定することもできる。好ま しい結合方法は、共有手段によるものである。特異的結合メンバーを結合させた 後、血清、蛋白または他のブロッキング剤のような物質で表面を更に処理して非 特異的結合を最小にすることができる。また、アッセイ目的の好適性を確保する ために、製造現場または使用現場のいずれで表面を走査してもよい。走査処理が 試験片の特異的結合特性を変化させるとは考えられない。

′サンドイッチ′イムノアッセイおよび拮抗プローブアッセイを含む種々の他の アッセイ形式を用いることもできる。例えば、本発明の蛋白から生産したモノク ローナル抗体を種々のアッセイシステムに採用して、試験サンプル中のＨＣＶ蛋 白の存在の有無を測定することができる。提供されるこれらのモノクローナル抗 体の断片を用いることもできる。例えば、第一のアッセイ形式において、固相上 に塗布されている、ポリクローナルもしくはモノクローナル抗−ＨＣＶ抗体また はその断片、またはこれら抗体の組み合わせを、ＨＣＶ蛋白を含有する可能性の ある試験サンプルと接触させて混合物を形成させる。この混合物を、抗原／抗体 複合体を形成させるのに充分な条件下で一定時間インキユベートする。次いで、 ＨＣＶ断片に特異的に結合するモノクローナルもしくはポリクローナル抗体また はその断片、またはこれらの抗体の組み合わせから成りシグナル生成化合物が結 合した指示薬を、抗原／抗体複合体と接触させて２番目の混合物を形成させる。

この２番目の混合物を、次いで、抗体／抗原／抗体複合体を形成させるのに充分 な条件下で一定時間インキユベートする。試験サンプル中に存在し固相上に捕獲 されたＨ　ＣＶ抗原の存在の有無を、シグナル生成化合物により生成した測定可 能シグナルを検出することにより測定する。

試験サンプル中に存在する）（ＣＶ抗原の量は、生成するシグナルに比例する。

あるいは、固形支持物に結合しているポリクローナルもしくはモノクローナル抗 −ｆＴ　ＣＶ抗体またはその断片またはこれらの抗体の組み合わせ、試験サンプ ルおよび、ＨＣＶ抗原に特異的に結合するモノクローナルもしくはポリクローナ ル抗体またはその断片またはこれらの抗体の組み合わせから成りシグナル生成化 合物が結合した指示薬を接触させて混合物を形成させる。

この混合物を、抗体／抗原／抗体複合体を形成させるのに充分な条件下で一定時 間インキユベートする。試験サンプル中に存在し固相上に捕獲されたＨ　ＣＶ蛋 白の存否を、シグナル生成化合物により生成した測定可能なシグナルを検出する ことにより測定する。試験サンプル中に存在するＨ　ＣＶ蛋白の量は、生成する シグナルに比例する。

別の代替アッセイ形式において、本発明のモノクローナル抗体の１種または２種 以上の組み合わせを、ＨＣｖ蛋白に対する抗体を検出するための拮抗プローブと して採用することができる。例えば、ＨＣＶ蛋白は、単独でまたは組み合わせて 固相上に塗布することができる。ＨＣＶ抗原に対する抗体を含有する疑いのある 試験サンプルは、次に、シグナル生成化合物および本発明のモノクローナル抗体 の少なくとも１種から成る指示薬と共に、固相に結合した試験サンプルおよび指 示薬または固相に結合した指示薬のいずれかの抗原／抗体複合体を形成させるの に充分な条件下で一定時間インキユベートする。固相に対するモノクローナル抗 体の結合の減少を定量的に測定することができる。確認された陰極ＮＡＮＯ肝炎 試験サンプルから生じたシグナルと比較した、シグナルの測定可能な減少は、試 験サンプル中の抗−ＨＣＶ抗体の存在を示す。

更に別の検出方法において、本発明の各モノクローナル抗体は、免疫組織化学分 析による固定した組織切片および固定細胞におけるＨ　ＣＶ抗原の検出に用いる ことができる。

更に、これらのモノクローナル抗体は、ＣＮＵｒ−活性イヒセファロースに類似 したマトリックスに結合させ、細胞培養物または、血液および肝臓のような生物 学的組織からの特異的ＨＣＶ蛋白の親和力精製に用いることができる。

また、本発明のモノクローナル抗体は、治療の用途また＋ｉ　５３１１の類似の 用途用のキメラ抗体の産生に用０ることもできる。

モノクローナル抗体またはそれらの断片（家、ＨＣＶ抗原を検出するために個々 に提供することができる。ここで１１０１されるモノクローナル抗体（およびそ れらの断片）の組み合わせ１よ、各々異なる結合特異性を有する、本発明の少な くとも１種の抗−ＨＣＶ抗体と他のＨＣＶ領域に対する抗体との混合物もしくは ″カクテル′中の成分として一緒に用０ること力（できる。従って、このカクテ ルは、ＨＣＶ蛋白に向けられる本発明のモノクローナル抗体および、ＨＣＶゲノ ムの他の抗原決定基喀こ対する別のモノクローナル抗体を含むこと力（できる。

アッセイ形式に用いることのできるポリクローナル抗（本またはその断片は、特 異的ＨＣＶ領域またはアッセイ喜ご用（するイ也のＨＣＶ蛋白に特異的に結合す ることを要する。用０るボ１ツクローナル抗体は、好ましくは哺乳動物起源であ り、ヒト、ヤギ、ラビットまたはヒツジの抗−ＨＣＶポリクローナル抗体を用い ることができる。最も好ましくは、ポリクローナル抗体は、ラビットポリクロー ナル抗−ＨＣＶ抗体である。アッセイに用いるポリクローナル抗体は、単独でま たは複数のポリクローナル抗体のカクテルとして用いることができる。アッセイ 形式に用いるカクテルは、異なるＨ　ＣＶ特異性を有するモノクローナル抗体ま たはポリクローナル抗体のいずれかから成り、ＨＣｖ惑染の診断、評価および予 後、ならびにＨＣＶ蛋白の識別および特異性の研究に有用である。

別のアッセイ形式において、ＨＣＶに対する抗体および／または抗原の存在は、 下記の通りの同時アッセイで検出することができる。固相に結合した第一のアナ ライトに対して特異的な第一の結合メンバーから成る第一のアナライトの捕獲試 薬および、第二の固相に結合した第二のアナライトのための第一の結合メンバー から成る第二のアナライト用捕獲試薬を試験サンプルと同時に接触させることに より混合物を形成させる。この混合物を、捕獲試薬／第一のアナ、ライトおよび 捕獲試薬／第二のアナライト複合体を形成させるのに充分な条件下で一定時間イ ンキュベートした。このように形成させたこれらの複合体を、次いで、シグナル 生成化合物で標識した第一のアナライトに特異的な結合対のメンバーから成る指 示薬および、シグナル生成化合物で標識した第二のアナライトに特異的な結合対 のメンバーから成る指示薬と接触させて２番目の混合物を形成させる。

この２番目の混合物を、捕獲試薬／第一のアナライト／指示薬複合体および、捕 獲試薬／第二のアナライト／指示薬複合体を形成させるのに充分な条件下で一定 時間インキユベートする。

１種以上のアナライトの存在を、試験サンプル中の１種以上のアナライトの存在 の指標として、いずれかまたは両方の固相上に形成された複合体と関係して生じ たシグナルを検出することにより測定する。このアッセイ形式において、ヒト発 現システムから誘導された蛋白は、ここで述べたような哺乳動物発現システムか ら誘導された蛋白により生産したモノクローナル抗体同様用いることができる。

このようなアッセイシステムについては、１９９０年８月２９日に出願された５ １５ｗ１ｌ■ｅｏｗｓ＾ＩＩＩマ１６Ｉ　ＤｅｌｅｅｌｉＢ　Ｏａｅ　Ｏｒ　Ｍ ａｒｅ　Ａｎｓｌｙｌｅｓと題された係属中の米国特許出願番号０７１５７４． ８２１　（これは本出願人によるもので、参照により本明細書に含めるものとす る）により詳細に記載がある。

更に別のアッセイ形式において、試験サンプル中の抗−ＨＣＶの存在を検出する のに組換え蛋白を用いることができる。例えば、少なくとも１種の組換え蛋白が 結合している固相と共に試験サンプルをインキュベートする。抗原／抗体複合体 を形成するのに充分な条件下で一定時間反応させる。インキュベーション後、抗 原／抗体複合体を検出する。選択したアッセイシステムに依存して、検出を容易 にするために指示薬を用いることができる。他のアッセイ形式において、試験サ ンプルを、ここで述べた通りに産生じた組換え蛋白が結合した固相と接触させ、 好ましくは指示薬で標識されている、この蛋白に特異的なモノクローナルまたは ポリクローナル抗体とも接触させる。抗体／抗原複合体を形成するのに充分な条 件下で一定時間インキユベーションした後、遊離相から固相を分離し、ＨＣＶ抗 体存在の指標としての標識を、固相または遊離相のいずれかにおいて検出する。

本発明の蛋白を用いる他のアッセイ形式も考えられる。

これらは、試験サンプルと、哺乳動物発現システムで産生じた少なくとも１種の 組換え蛋白が結合している固相とを接触させ、抗原／抗体複合体を形成するのに 充分な条件下で固相および試験サンプルを一定時間インキユベートした後、固相 と標識組換え抗原とを接触させることを含む。このようなアッセイその他につい ては、係属中の米国特許出願番号０７／７８７．７１０（これは本出願人による もので、参照により本明細書に含めるものとする）に記載がある。

本発明は、固相の使用が好ましいものであることを開示しているが、本発明の蛋 白は、非固相アッセイシステムに用いることができると考えられる。これらのア ッセイシステムは、当業者等に公知であり、本発明の範囲内に入るものと考えら れる。

本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の精神および範囲はこれによ って制限されるものではない。

実施例 実施例１：ＨｃＶゲノミッククローンの調製ＨＣＶで実験的に感染させたチンパ ンジーの血清もしくは血しょうから単離したＲＮＡ　（’　Ｃｏ’と命名）また はＨＣＶ陽性血清のヒト患者の血清もしくは血しようから単離したＲＮＡ（’Ｌ Ｇ’と命名）を、基本型ＨＣＶ−１配列から誘導された任意の６員プライマーま たは特異的アンチセンスプライマーのいずれかを用い、逆転写酵素を用いてｃＤ ＮＡに転写した。

この配列は、Ｃｔ＋ｏｏ等（Ｃｂｅｏ等、Ｆ「ｅｅ、Ｎ１’　１．　＾ｃｏｄ、 Ｓｃｉ、ＵＳＡ８８：２４５１−２４５５　［１９９１１、ゲンバンクデータベ ースより入手可能、登録番号Ｍ６２３２１）により報告されている。このｃＤＮ Ａを、次いで、特定のアンチセンスプライマーの約ｔｏｏｏ−２０００ヌクレオ チド上流に位置する第２センスプライマーまたは、ＨＣＶの１０００−２０００ ヌクレオチド断片の両側に並べた１対のセンスおよびアンチセンスプライマーの いずれかを用い、ＰＣＲ法およびアンブリタック（Ａｍｐ　ｌ　１Ｔａｑ）　Ｒ ＤＮＡポリメラーゼ（パーキンエルマーシータス、ノルウオーク、コネチカット ０６８５９よりジーンアンプキラーとして入手可能）を用いて増幅した。当業者 に公知の標準手法に従って２５から３５サイクル増幅した後、この反応混合液の 一部を、オリジナルの対のＰＣＲプライマーの内部に位置する１対のセンスおよ びアンチセンスプライマーを用い、２組目のＰＣＲプライマー中に存在するエン ドヌクレアーゼ認識配列を用いて分析およびサブクローニングに充分な量にＨＣ Ｖ遺伝子セグメントを更に増幅させるところのネスト化ＰＣＲ法（または’　Ｐ ＣＲ−２’　）に供した。このようにして、７つの隣接した）ＩｃＶ　ＤＮＡ断 片を得、次いでこれらを、図１に示した一般的クローニング手法を用いて組み立 てた。この方法で用いた特定のプライマーの位置を表１に示し、Ｃｈｏｏ等（ゲ ンバンクデータベース、登録番号Ｍ６２３２１）により報告されたＨＣＶ−１配 列によって番号を付した。組み立て以前に、個々の断片の各ＤＮＡ配列を決定し 、それぞれＣＯおよびＬＧ用の配列番号それぞれ１および２に示したゲノミック アミノ酸配列に翻訳した。ＣＯのゲノミックポリペプチドとＨＣＶ−１のそれと の比較すると、９８のアミノ酸に相違があった。ＣＯのゲノミックポリペプチド とＬＧのそれとでは、１５０のアミノ酸に相違を示した。ＬＧのゲノミックボリ ベブチドとＨＣＶ−１のそれとでは、１３４のアミノ酸に相違を示した。

実施例２．アミロイド前駆体蛋白（Ａ　Ｐ　Ｐ）との融合物としてのＩＩＣＶＥ ２蛋白の発現 実施例１で述べたように開発したＣＯ由来のＨＣＶＥ２蛋白を、アミロイド前駆 体蛋白（Ａ　Ｐ　Ｐ）との融合物として発現させた。ＡＰＰについては、Ｋ１１ １！等、　Ｎｔｌａｒｅ　３２５ニア３３−７３６（１９８７年）に記載がある 。手短にいうと、図２に示すようにＣＯ単離物（７）３８４−７４９番目の１１ Ｃｖアミノ酸を用１．ＩＡＰＰをコードする配列の大部分を置換した。ＡＰＰの アミノ末端の６６個のアミノ酸に相当するＨｉｎｄｍ−３ｔｙｌ　ＤＮＡ断片お よびカルボキシル末端の１０５個のアミノ酸に相当するＢｇｔＩＩ−ＸｂａＴ断 片を、各々その５′および３′末端に５ｔｙｌおよびＢｇｌ１１制限部位を含有 する３８４−７４９番目のＨＣＶアミノ酸を表すＣＯ由来のＰＣＲ法誘導ＨＣＶ 断片に連結した。このＡＰＰ−ＨＣＶ−Ｅ２融合遺伝子カセットを、次いで、図 ３に示す市販入手可能な哺乳動物発現ベクターｐＲＣ／ＣＭＶ　（インビトロゲ ン、サンディエゴ、ＣＡよす入手可能）中のそれぞれ１個しかないｔ（ｔ　ｎ　 ｄ　ＩＩ［およびＸｂａ１部位にクローンした。Ｅ、ｃｏｌｉ　ＤＩ１５ａ内に 形質転換した後、ＡＰＰ−ＨＣＶ−Ｅ２融合遺伝子カセットの発現が強力なＣＭ Ｖプロモーターニヨり制御される、ｐｌｉｃＶ−１６２と命名したクローンを単 離した。哺乳動物発現ベクターｐｉ−（ＣＶ−１６２の完全なヌクレオチド配列 を配列番号３に示す。ヌクレオチド９２２番目から２５３５番目の翻訳により、 配列番号４に示すような、ｐＨＣＶ−１６２により発現されるＡＰＰ−ＨＣＶ− Ｅ２融合蛋白の完全なアミノ酸配列を得た。

）ＩＥＫ−２９３と命名した、ヒ］・アデノウィルス５型で形質転換した１次ヒ ト胎児腎臓細胞系を、すべてのトランスフエフシランおよび発現分析に用いた。

１０％仔牛脂児血清（Ｆｅ２）、ペニシリンおよびストレプトマイシンを追加し た最小必須培地（Ｍ　Ｅ　Ｍ）にＨＥＫ−２９３細胞を維持した。

Ｃｈｃｎ等、Ｍｏ１ｅｃ＠１ａｒｉｎｄ　Ｃｅ１ｌａｌ＋＋　ＢｉｏｌｏＨ７（ ８）：２７４５−２７５２（１８７年）により報告されたものを改変した燐酸カ ルシウムプロトコールを用い、ｐＨＣＶ−１６２から得た約２０μｇの精製ＤＮ ＡをＨＥＫ−２９３細胞内にトランスフェクシヨンした。

燐酸カルシウム−ＤＮＡ溶液をＨＥＫ−２９３１１１胞上で約１５から２４時間 インキュベートした。溶液を除去し、細胞をＭＥＭ培地で２回洗浄した後、細胞 をＭＥＭ培地中で更に２４から４８時間インキュベートした。蛋白の発現を分析 するために、トランスフエクシラ゛ンした細ｍｔ−１ｔｏｏμ（ｉ　／　ｍ　ｌ 　（ＯＳ　−３５メチオニンおよびシスティンで１２から１８時間代謝的に標識 した。培養培地を取りだして蓄え、細胞をＭＥＭ培地で洗浄した後、ＰＢＳ−Ｔ ＤＳと命名された、１％トリトンＸ−１００（シグマケミカル社、セントルイス 、ＭＯより入手可能）、０．１９６ドデンル硫酸ナトリウム（Ｓ　Ｄ　Ｓ）およ び０．５％デオキシクロエートを含有する燐酸塩緩衝塩水（ＰＢＳ）中で溶解さ せた。この細胞溶解物を、次いで、−７０℃で２から２４時間冷凍し、氷上で解 凍し、次に４℃で１時間５０、ＯＱＯＸｇで遠心分離することにより清澄にした 。次に、これらの標識細胞溶解物および／または培養培地について標準放射線免 疫沈降法（ＲＩＰＡ）を行った。手短にいうと、標識細胞溶解物および／または 培養培地を２から５μｌの特定の血清と共に４℃で１時間インキュベートした。

次いで、プロティンＡセファロースを加え、サンプルを更に４℃で１時間撹拌し ながらインキュベートした。次いで、サンプルを遠心分離し、ベレットをＰｎＳ −ＴＤＳ緩衝液で数回洗浄した。免疫沈降法により回収した蛋白を、電気泳動サ ンプル緩衝液（５０ｍＭのトリフ、−ＨＣｌ、ｐＨ６，８，１００ｍＭのジチオ トレイトール［ＤＴＴ］　、２％ＳＤＳ、０．１％ブロモフェノールブルー、お よび１０９６グリセロール）中で９５℃で５分間加熱することにより溶出した。

溶出した蛋白を、次いで、ＳＤＳポリアクリ、　Ｒ ルアミドゲルにより分離した後、Ｅｎｌ　ｉｇｈｔｅｎｚｎｇ（、ＮＥＮ［デュ ポン社］ボストン、ＭＡより入手可能）のようなフルオログラフィー用試薬で処 理し、真空下で乾燥し、増感スクリーンを用いて一７０℃でＸ線フィルムに露出 した。図４は、正常ヒト血清（ＮＨ３）で沈澱させたｐＨＣＶ−１６２）ランス フェクシランＨＥＫ細胞溶解物、この構築物内で置換されるＡＰＰ配列に対する モノクローナル抗体（ＭＡＲ）、およびＨＣＶ抗体陽性ヒト血清（＃　２５）の ＲＩＰＡ分析を示す。

また、同じＩ（ＣＶ抗体陽性ヒト血清（＃　２５）で沈澱させた培養培地（上澄 ）も図４に示す。約７５にダルトンのＴＴ　ＣＶ特異的蛋白はｐＨＣＶ−１６２ でトランスフエフシコンしたＨＥＫ−２９３細胞の培養培地中に低水準しか検出 されていないが、高水準の約７０にダルトンのＡＰＰ−１１ＣＶ−Ｒ２融合蛋白 の細胞内蛋白発現が明白であることは、図４により認められる。

このＡＰＰ−１１ＣＶ−Ｒ２融合蛋白を更に解析するために、合成ペプチドに対 するラビットポリクローナル抗体を同様のＲＩＰＡに用い、その結果を図５に示 す。この図かられかるように、正常ラビット血清（ＮＲ３）は７０にダルトンた んばくを沈澱させないが、一方、ＨＣＶアミノ酸５０９−５５１（６５１２）、 ＨＣＶアミノ酸３８０−４３６　（６５２１）、およびＡＰＰアミノ酸４５−６ ２　（抗−Ｎ−末端）に対するラビット血清は７０にダルトンＡＰＰ−ＨＣＶ− Ｒ２融合蛋白に非常に特異的である。

このＡＰＰ−１（ＣＶ−Ｒ２融合蛋白の分泌を増強するために、ＡＰ−Ｐのアミ ノ末端の６６個のアミノ酸のみを融合した、ＨＣＶ−Ｒ２配列に対する推定上の 分泌シグナル配列を含有する別のクローンを作成した。更に、ポテンシャルトラ ンスメンブレンスパニング領域と認められたＨＣＶ−Ｒ２配列のカルボキシル末 端の強固な疎水性配列を欠失させた。その結果できたクローンをｐＨＣＶ−１６ ７と命名し、図２に図式的に示した。哺乳動物発現ベクターｐ）ＩＣＶ−１６７ の完全なヌクレオチド配列を配列番号５に示す。ヌクレオチド９２２から２０２ ５の翻訳により、配列番号６に示すようなｐＨＣＶ−１６７により発現したＡＰ Ｐ−ＨＣＶ−Ｒ２融合蛋白の完全なアミノ酸配列を得る。ｐＨＣＶ−１６７（７ ）精製ＤＮＡをＩ（ＥＫ−２９３細胞内にトランスフエフシランし、本明細書で 既に述べたようなＲＩＰＡおよびポリアクリルアミドＳＤＳゲルにより分析した 。正常ヒト血清サンプル（ＮＨ３）が、ｐＨＣＶ−１６７でトランスフェクシヨ ンしたＨＥＫ−２９３細胞の細胞溶解物または細胞上澄のいずれかに存在するＡ ＰＰ−ＨＣＶ−Ｒ２融合蛋白を認識できなかったという結果を、図６は示す。こ れに対して、陽性の対照ＨＣＶ血清サンプル（Ｒ２５）＋ｉ、ｐＨＣＶ−１６７ でトランスフエフシコンしたＨＥＫ−２９３細胞の細胞溶解物に存在する約６５ にダルトンのＡＰＰ−ＨＣＶ−Ｒ２融合蛋白を沈澱させた。更に、かなりの量の 約７０にダルトンの分泌したＡＰＰ−ＨＣＶ−Ｒ２蛋白は、血清＃２５により培 養培地から沈澱した。

１１ＥＫ−２９３細胞内でｐＨＣＶ−１６７およびｐ　ＨＣＶ　−１６２により 発現したＡＰＰ−ＨＣＶ−Ｒ２融合蛋白におけるＮ−結合グリコシル化の程度お よび組成を確認するために、エンドグリコシダーゼ−Ｈ（Ｅｎｄｏ−Ｈ）で消化 した。ｐ　ＨＣＶ−１６２およびｐＨＣＶ−１６７）５：ｚＸ７ｚクシ＊ンＨＥ Ｋ−２９３細胞から得た標識細胞溶解物のほとんどが、前記のようなＨＣＶ　Ｒ ２に対する抗体を含有するヒト血清＃５０と共に沈澱した。免疫沈降蛋白−抗体 複合体を含有するプロティンＡセファロースペレットを、次に、Ｅｎｄｏ−Ｈ（ シグマ社）を１ｍｌ当り０．０５単位を含有または非含有の緩衝液（７５ｍＭの 酢酸ナトリウム、０．０５％５ＤＳ）に再懸濁した。

３７℃で１２から１８時間消化を行い、すべてのサンプルを前記のようなポリア クリルアミドＳＤＳゲルにより分析した。図７は、Ｅｎｄｏ−ＩＩ消化の結果を 示す。炭素−１４標識した分子量標準（ＭＷ）（アマージャム社、アーリントン ハイツ、ＴＬ、より入手した）は、すべてのゲルに関して共通であり、それぞれ 、２００に、９２．５に、６９に、４６に、３０におよび１４．３にダルトンを 表す。正常ヒト血清（ＮＨ３）は、ｐＩ（ＣＶ−１６２またはｐＨＣＶ−１６７ （７）いｆｔＬか１．ｍ、にり発現したＡＰＰ−ＨＣＶ−Ｒ２融合蛋白を免疫沈 降させないが、一方、ＨＣＶ　Ｒ２抗体に陽性ノヒト血清（Ｒ５０）は、ｐｔ− ｔＣＶ−１６２中（７）７２にダルト：／（Ｆ）ＡＰＰ−）（ＣＶ−Ｒ２融合蛋 白およびｐｌ（ＣＶ−１６７中（７）６５にダルト：ｚＡＰＰ−ＨＣＶ−Ｅ２融 合蛋白を容易に検出する。これらの免疫沈降した蛋白のＥｎｄｏ−Ｈ（Ｒ５０− Ｅｎｄｏ−Ｔ（）非存在下でのインキュヘーションハ、ｐＴ（ＣＶ−１６２また はｐＨＣＶ−１６７のいずれかで発現した蛋白の量または移動度に有意に影響し ない。しかしながら、Ｅｎｄｏ−Ｈ（Ｒ５０−Ｅｎｄｏ−Ｈ）存在下でのインキ ュベージクンは、ｐＨＣＶ−１６２およびｐＨＣＶ−１６７により発現した蛋白 の移動度を顕著に減少させ、サイズの異なる分布を示す。ｐＨＣＶ−１６２の非 グリコジル化ポリペプチド骨格の予想分子量は、約５９にダルトンである。

ｐＨＣＶ−１６２（７）Ｅｎｄｏ−Ｈ処理は、ｐＨＣＶ−１６２１：より産生じ たＡＰＰ−ＨＣＶ−Ｒ２融合蛋白がカルボキシル末端で蛋白分解により切断され たことを示す、最小の約４４にダルトンに移動度を低下させる。約４４にダルト ンの大きさは、ＨＣＶアミノ酸７２０の位置またはその付近での切断と一致する 。同様に、ｐＨＣＶ−１６７のＥｎｄｏ−Ｈ処理は、ｐＨＣＶ−１６７１，：よ り発現する無傷のＡＰＩ’−ＴＩＣＶ−Ｅ２融合蛋白の予想される分子量約４０ にダルトンと都合よく匹敵する、最小の約４１にダルトンに移動度を低下させる 。

実施例３．ＨＣＶＥ２抗体の検出 既に述べた放射線免疫沈降法（Ｒ［ＰＡ）およびポリアクリルアミドＳＤＳゲル 分析を用い、ＨＣＶ　Ｅ２エピトープに対する抗体の存在を多数の血清サンプル からスクリーニングした。

ｐ　ＨＣＶ　−１６２テトラ：／　７．７　エフ’／　ｅ　：／　Ｌ　タＨＥ　 Ｋ　−２９３細飽を代謝的に標識し、細胞溶解物を前述のように調製した。

ＲＩＰＡ分析に加え、Ａｂｂｏｔｔ　ＭａｔｒｉｘＲシステム（本出願人から入 手可能、米国特許５，０７５，０７７）を用い、ＨＣＶゲノムの明白な領域を表 す特異的ＩＩ　ＣＶ組換え抗原に対する抗体の存在をすべての血清サンプルにつ いてスクリーニングした。表２から７に示したマトリックスデータにおいて、Ｃ １００酵母＋ｉ　ＩＩ　ＣＶ　アミノ酸１５６９−１９３０を含有するＮＳ４領 域を表し、０１００大腸菌はＨＣＶアミノ酸１６７６−１９３０を表し、ＮＳ３ はＨＣＶアミノ酸１１９２−１４５７を表し、Ｃ０ＲＥはＨＣｖアミノ酸１１５ ０を表す。

図８は、ＨＣＶ抗体陽性アメリカ人血液提供者および輸液受領者をスクリーニン グするためにｐＨＣＶ−１６２細胞溶解物を用いて得られた代表的ＲＩＰＡの結 果を示す。表２は、これら種々のアメリカ人血液サンプルの抗体についてのプロ フィールをまとめたものであり、１７サンプルの内７つ（４１％）が１１ＣＶＥ ２抗体を示している。Ｅ２領域におけるゲノム変異の故に、異なる■Ｃ■単離物 、特に地理的に異なる単離物間に抗体応答における相違をもたらす可能性がある 。そこで、２６人の日本人の自発的血液提供者および、１１　ＣＶ抗体を含有す ることが既に分かっている２０人のスペイン人の血液透析患者にツイテ、ｐ　Ｉ Ｉ　ＣＶ　１６２１．：より発現したＡＰＰ−１（ＣＶ　Ｅ２融合蛋白に特異的 な抗体の存在をスクリーニングした。図９および１０は、２６人の日本人の自発 的血液提供者に関するＲＩＰＡ分析を示す。検査した血清サンプルのいくつかが 約７２にダルトンのＡＰＰ−ＨＣＶ−Ｅ２融合蛋白の特異的免疫沈降を示してお り、陽性対照ヒト血清（＃　５０）および分子量標準（ＭＷ）は両図に示した。

表３は、検査した２６人の日本人の各サンプルの抗体のプロフィールをまとめる ＡＩ’Ｐ−ＨＣＶ−Ｅ２　ＲＩＰＡおよびアボットマトリックスＲの両方の結果 を示す。表４は、検査した２０人のスペイン人の血液透析患者の同様のデータを 示す。表５は、これらの種々のサンプル中のＨＣＶＥ２特異的抗体を検出すルタ めｌ：ｐＨｃＶ−１６２を用いて得られたＲＩＰＡ結果をまとめている。日本人 の自発的血液提供者２６人のうち１８人（６９％）、スペイン人の血液透析患者 ２０人のうち１４人（７０％）、アメリカ人血液提供者または輸液受領者１４人 のうち７人（４１％）は、ＨＣＶＥ２融合蛋白に対する特異的抗体応答を示した 。ｐ　ＨＣＶ　−１６２により発現したＡＰＰ−ＨＣＶ−Ｅ２融合蛋白により示 された広範な免疫反応性は、ＨＣＶＥＺ内に保存されたエピトープの認識を示唆 する。

ＨＣＶ抗体にセロコンバージランした５人の輸液受領者から得た経時的ブリード もｐＨＣＶ−１６２により発現したＡＰＰ−ＨＣＶ−Ｅ２融合蛋白を用いてスク リーニングした。この分析は、ＨＣＶに露出後、Ｅ２特異的抗体が検出され得る までの時間を確認するために行った。表６は、輸血の１５４日後（ＤＰＴ）１． ニー、ＮＳ３にセロコンバージランした患者（ＡＮ）！＋＜１名出現したことを 示す。ＨＣＶ　Ｅ２に対する抗体は、２７１ＤＰＴまではＲＴＰＡによって検出 されなかった。表７は、７６ＤＰＴ以前にＣ０ＲＥにセロコンバージョンし、次 の入手可能ナブリードデータ（１０３０ＰＴ）には）（ＣＶ　Ｅ２抗体に陽性と なった別の患者（ＷＡ）を示す。表８は、（ａ）セロコンバージョンにおける一 般的抗体プロフィール（ＡＢ状況）；（ｂ）ＥＬＩＳＡ検査がまずＨＣＶ抗体を 検出すると思われる輸血ｆｉの日数（２，０ＧＥＮ）；　（ｃ）ＨＣＶ　Ｅ２抗 体がＲＩＰＡにより検出されたサンプル（Ｅ２　ＡＢ状況）；および（ｄ）検査 されたブリードデータにより網羅される時間（検査したサンプル）を示す、これ らの５人の輸液受領者から得た血清学的結果をまとめている。結果は、本明細書 で述べたＲＩＰＡ手法により検出されるようなＨＣＶ　Ｅ２に対する抗体が、少 なくとも１つの他のＨＣｖマーカー（ＣＯＲＥＳＮＳ３、Ｃ１００等）へのセロ コンバージョンよりも後に出現し、一度それが出現したなら事実上持続すること を示している。更に、構造遺伝子Ｃ０ＲＥに対する抗体の不在は、別の推定上の 構造抗原Ｅ２に対する検出可能な抗体の不在と非常に相関があると考えられる。

）ＩＣＶ遺伝子特異的抗体の存在または不在と、疾患の進行および／またはＨＣ Ｖウィルス性抗原に対する露出以来の時間間隔とを相関させて更なる研究を行っ ている。

実施例４．ヒト成長ホルモン分泌シグナルを用いたＨＣＶＥｌおよびＥ２の発現 ＨＣＶ　Ｅｌを表すＨＣＶ　Ｄ　Ｎ　Ａ断片（ｌ（ＣＶ７ミ／酸１９２から３８ ４）およびＨＣＶ　Ｅ２を表すＨＣＶ　ＤＮＡ断片（ＨＣＶ７ミ／酸３８４−７ ５０および３８４−６８４）を、実施例２で述べたようなＰＣＲ法を用いてＣＯ 単離物から調製した。ＥｃｏＲＩ制限部位を用いて、これらのＨＣＶ配列の５′ 末端にヒト成長ホルモン（ＨＧ　Ｈ）分泌シグナル（Ｂｌ＊に等、　０＋ｃｏＨ ｅｎｅ、３１２９−Ｎ６．　１９８８年）をコードする合成オリゴヌクレオチド を結合させた。その結果できた断片を、次いで、図１１に示すように市販入手可 能な哺乳動物発現ベクターｐＣＤＮＡ−１（インビトロゲン、サンジエゴ、ＣＡ より入手可能）中にクローンした。Ｅ、ｃｏｌｉ　ＭＣ１０６１／Ｐ３中に形質 転換し、その結果できたクローンは、クローン配列の発現が強力なＣＭＶプロモ ーターにより制御される。上記に概説した方法に従い、一番端のアミノ末端でＨ Ｇ　Ｈ分泌シグナルを用いＨＣＶ−Ｅｌ　（ＨＣＶ７ミ／酸１９２−３８４）を 発現する性能のあるクローンを単離した。このクローンを、ＨＣＶ−１６８と命 名し、図１２に図示した。同様に、ＨＧ　Ｈ分泌シグナルを用いＨＣＶ−Ｅ２　 （ＨＣＶアミノ酸３８４−７５０または３８４−６８４）を発現する性能のある クローンを単離し、ソｔ１．ソｔｔｐ　ｔｔ　ＣＶ−１６９およびｐＨＣＶ−１ ７０と命名し、図１３に図示した。哺乳動物発現ベクターｐｉ（ＣＶ−１６８、 ｐＨＣＶ−１６９およびｐＨＣＶ−１７０（７）完全なヌクレオチド配列をそれ ぞれ配列番号７．９および１１に示す。ヌクレオチド２２２７から２９１３まで の翻訳により、配列番号８に示シタ、ｐ）ＩＣＶ−１６８１：より発現し？、： ＨＧＨ−ＨＣＶ−Ｅ１融合蛋白の完全なアミノ酸配列に帰する。ヌクレオチド２ ２２７から３４２６までの翻訳により、配列番号１０に示した、ｐＨＣＶ−１６ ９１＝より発現したＨＧＨ−）ＩＣＶ−Ｅ２融合蛋白の完全なアミノ酸配列を得 る。ヌクレオチド２２２７から３２２８までの翻訳により、配列番号１２に示し た、ｐＨＣＶ−１７０１：より発現しｔ：ｆｌ　Ｇ　Ｈ−ＨＣＶ−Ｅ　２融合１ ｉ白（７）完全なアミノ酸配列を得る。ｐＨＣＶ−１６８、ｐＨＣＶ−１６９［ 、びｐＨＣＶ−１７０から得た精製ＤＮＡを、ＨＥＫ−２９３細胞内にトランス フエフシロンし、次いで、代謝的に標識し、細胞溶解物を調製し、前述したよう にＲＴＰＡ分析を行ツタ。ｐＨＣＶ−１６２１＝、にり発現したＡＰＰ−ＨＣＶ −Ｅ２融合蛋白に対する抗体を含有することが既に分かっている７ツノ血清サン プルを、ｐｌ（ＣＶ−１６８、ｐＨＣＶ−１６９およびｐＨＣＶ−１７０の標識 細胞溶解物に対してスクリーニングシタ。図１４は、ｐＨＣＶ−１６８のＲＩＰ Ａ分析を示しており、）ＩＣＶ　Ｅ２抗体を含有する５つの血清は約３３にダル トンＨＧ　Ｈ−ｔ（ＣＶ　−Ｅ　１融合蛋白に対すルＨＣＶ　Ｅ　１抗体をも含 有している（＃２５．５０．１２１．５０３、および７２８）が、一方、他の２ つの血清はこれらの抗体を含有していない（４７６および５０５）ことを示した 。図１５は、上記の同じ血清を、ｐｔ−ｔｃｖ−１６９またはｐＨＣＶ−１７０ １７）１１ずれかの標識細胞溶解物に対してスクリーニングした際に得られたＲ ＩＰＡ結果を示す。７つすべてのＨＣＶＥＩ抗体陽性血清は、ｐｔｔｃｖ−１６ ｇでトランスフェクシヨンした細胞中に約７０におよび７５にダルトンの２つの 蛋白種を検出した。

これらの２つの異なるＨＧＨ−ＨＣＶ−Ｅ２蛋白種は、カルボキシル末端（もし くはＨＣＶアミノ酸７２０付近）におけるＨＣＶ　Ｅ２配列の不完全な蛋白分解 による切断、または２種間の炭水化物プロセシングにおける相違に起因すると考 えられる。

全７−）（７）ＨＣＶ　Ｅ２抗体陽性血清は、ｐＨＣＶ−１７０１：より発現し たＨＧ）Ｉ−ＨＣＶ−Ｅ２融合蛋白の約６２にダルトンの単一の蛋白種を検出し た。表９は、ｐＨＣＶ−１７０によって発現したＨＧＩ（−ＨＣＶ−Ｅｌ融合蛋 白に対しスクリーニングされた７つのＨｃＶ　Ｅ２抗体陽性血清のうちの６つに ついて、血清学的プロフィールをまとめている。■Ｃｖ遺伝子特異的抗体の存在 または不在と、疾患の進行および／またはＨＣＶウィルス性抗原に対する露出以 来の時間間隔とを相関させて更なる研究を行っている。

りｏ−ンｐＨＣＶ−１６７およびｐＨＣＶ−１６２＋ｉ、”ｊ９ペスト条約の規 定に基づき１９９２年１月１７日アメリカンタイプカルチャーコレクシラン（１ ２３０１ＰａｒｋｌａｗｎＤｒｉｖｅ、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎ ｄ。

２０８５２）に以下のＡＴＣＣ受託番号で寄託した：クローンｐＨＣＶ−１６７ １ｔＡＴＣＣ受託番号６８８９３であり、クローンＴ）ＨＣＶ−１６２はＡＴＣ Ｃ受託番号６８８９４である。

りＯ−：／Ｉ）ＨＣＶ−１６８、ｐＨＣＶ−１６９およびｐＨＣｖ−１７０は、 ブタペスト条約の規定に基づき１９９３年１月２６日アメリカンタイプカルチャ ーコレクション（１２３０１Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ、　Ｒｏｃｋｖｉｌ ｌｅ。

Ｍａｒｙｌａｎｄ、２０８５２）に以下のＡＴＣＣ受託番号で寄託した：クロー ンｐＨＣＶ−１６８はＡＴＣＣ受託番号６９２２８であり、９０−：／１）ＨＣ Ｖ−１６９はＡＴＣＣ受託番号６９２２９”ｌ？あり、りｏ　−ンｐ　ＨＣＶ　 −１７０１！　Ａ　丁ＣＣ受託番号６９２３０である。これらの寄託物は、寄託 口より３０年間、もしくは最後の寄託物要請後５年間：または米国特許の行使期 間のいずれかより長い期間維持される。これらの寄託物およびここで述べた他の 寄託物質は、便宜のみを旨とするものであり、本明細書の説明を考慮して本発明 を実施するのに必ずしも必要ではない。すべての寄託物質中のＨＣＶ　ｅ　Ｄ　 ＮＡ配列を、参照により本明細書に含めるものとする。

本明細書で提供した蛋白および哺乳動物発現システムの使用法の他の種々の応用 については、当業者等に明白である。よって、本発明は、添付したクレームによ ってのみ制限されるものである。

表１ 断片　センス　アンチセンス　センス　アンチセンス５　５２２９〜５２４９　 ６９７７−６９９６　５２７３−５２９２　６９４０−６９６２表４ スペイン人血液透析患者 Ｃ１００Ｃ１００ 酵母大腸菌ＮＳ３　Ｃ０ＲＥ　Ｅ２ 試料　Ｓ／Ｃｏ　Ｓ／Ｃｏ　Ｓ／Ｃｏ　Ｓ／Ｃｏ　ＲＩＰ＾１　０．０　Ｇ、３ 　１８１１．６　−０．０　−２　１２９．３　１４２．８　１６５．４　２０ １．０　＋３　１１３．７　１２８．５　１５４．５　２８３．３　＋５　１３ ０．６　１４３．８　１３３．４　１８６．１　＋６　５６．２　６３．４　９ ３．６　３２．０　＋７　０．０　０．２　７２．１　２１１．５　＋８　１５ ６．７　１７１．９　１５５．１　２２７．０　＋９　６５．３　７８．９　７ ６．１　１０２．６　＋ｔｏ　ｆ３６．７　１４９Ｊ　１２９．４　１９０．２ 　＋１１　０．０　０．７　１５５．７　２７２．４　＋１２　１．０　１．９ 　１４３．６　２１０．６　＋１３　０．０　０．３　１１１．２　９１．１　 −１４　１．１　３．１　９４．７　２１４．８　−１５　４５．９　６６．１ 　１０６．３　１６８．２　＋１６　３６．３　６８．８　１４９．３　０．１ 　−１７　１２１．０　１２９．９　１１３．４　２２７．８　＋１８　６４． ８　９９．７　１３８．９　０．２　−１９　２５．６　３４．１　１５７．４ 　２５４．９　＋２０　１０４．９　１２５．１　１２６．８　２１８．３　＋ ２１　４８．１　６８．５　０．８　４９．４　−表５ ＨＣＶ蛋白に対する抗体応答 Ｃ１００Ｃ１００ 酵母　大腸菌　ＮＳ３　Ｃ０ＲＥ　Ｅ２Ｓ／Ｃｏ　Ｓ／Ｃｏ　Ｓ／Ｃｏ　Ｓ／Ｃ ｏ　ＲＩＰＡ血液　１１／１７　１２／１７　１４／１７　１５／１７　７／１ ７提供者 スペイン人 血液透析　１６／２０　１６／２０　１９／２０　１？／２０　１４／２０患者 日本人 血液　１２／２６　１４／２６　２０／２６　２６／２６　１ｇ／２６提供者 表９ 選択したＨＣＶ　Ｅ２抗体陽性サンプルｃ＋ｏｏ　ＣＩＧＯ 酵母　大腸菌　ＮＳ３　Ｃ０ＲＥ　Ｅ２試料　Ｓ／Ｃｏ　Ｓ／Ｃｏ　Ｓ／Ｃｏ　 Ｓ／Ｃｏ　ＲＩＰＡ５Ｇ　１０１．０４　１３３．６９　１６３．６５　２６３ ．７２　＋１２１　１．２８　４．７７　１？２．６５　２９１．８２　＋５０ ３　１１３．７　１２８．５　１５４．５　２８３．３　＋５０５　１３０．６ 　１４３．８　１３３．４　１８６．１　−４７６０．３７　１．２９　１４４ ．６６　３０２．３５　−７２８　−０．０１　Ｇ、２６　９０．３７　２４６ ＪＯ＋〔跣列蒸） （２）　工ＮＦＯＲＭＡＴ工ＯＮ　ＦＯＲＳＥＱ　ｒＤ　ＮＯ：１；（ｉｌ　５ ＥＱＵＥｔＪＣＥ　ＣＨＡＲＡＣＴＥＲ工ＳＴ工Ｃ５＋（ＡＩ　ＬＥＮＧＴＨ： 　１０１１　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ（Ｂ）ＴＹＰＥ：　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ （ＣＩ　５ＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ＋　ｓｉｎｇｌｅ＋Ｄｉ　ＴＯＰＯＬＯＧＹ ＋　１ｉｎｅａｒｆｉｉｌ　ＭＯＬＥＣυＬＥ　ＴＹＰＥ：　ｐｒｏｅれｎｆｘ ｉｌ　５ＥＱＵＥＮＣＥ　ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮ：　ｓεＱ　ＩＤ　ｔＪＯ＋ １＋＋４＠ｔ　Ｓ＠ｒ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ａ ｒｇ　Ｌｙｅ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ａｓ■ ｌ　５　１０　Ｌ５ Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｏｌｎ　Ａｍｐ　ＶａＩＬｙｅ　Ｐｈ＠Ｐｒｏ　Ｇｉ ｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｑｌｎ　Ｘ１＊　Ｖａｌ　ＧｌｙＣ１ｙ　Ｖａｎ　Ｔｙｒ 　Ｌｅｕ　Ｌｓｕ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ 　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　八１ａＴｈｒ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　５ｅｒ　 Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｓ＠ｔ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　 Ｇｌｎ　Ｐｒ。

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Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. １．プラスミドｐＨＣＶ−１６２。
2. ２．プラスミドｐＨＣＶ−１６７。
3. ３．プラスミドｐＨＣＶ−１６８。
4. ４．プラスミドｐＨＣＶ−１６９。
5. ５．プラスミドｐＨＣＶ−１６０。
6. ６．哺乳動物発現ベクターｐＨＣＶ−１６２により発現されるＡＰＰ−ＨＣＶ− Ｅ２融合蛋白。
7. ７．哺乳動物発現ベクターｐＨＣＶ−１６７により発現されるＡＰＰ−ＨＣＶ− Ｅ２融合蛋白。
8. ８．哺乳動物発現ベクターｐＨＣＶ−１６８により発現されるＨＧＨ−ＨＣＶ− Ｅ２融合蛋白。
9. ９．哺乳動物発現ベクターｐＨＣＶ−１６９により発現されるＨＧＨ−ＨＣＶ− Ｅ２融合蛋白。
10. １０．哺乳動物発現ベクターｐＨＣＶ−１７０により発現されるＨＧＨ−ＨＣＶ −Ｅ２融合蛋白。
11. １１．ＨＣＶ抗原または抗体を含有する疑いのある試験サンプル内のＨＣＶ抗原 または抗体を検出する方法であって、試験サンプルと哺乳動物発現システムにお いて産生したグリコシル化ＨＣＶ抗原とを接触させることを特徴とする前記方法 。
12. １２．ＨＣＶ抗原または抗体を含有する疑いのある試験サンプル内のＨＣＶ抗原 または抗体を検出する方法であって、試験サンプルと、哺乳動物発現システムに おいて産生したグリコシル化ＨＣＶ抗原を用いることにより産生した抗体とを接 触させることを特徴とする前記方法。
13. １３．当該抗体がモノクローナル抗体であるところの、請求項１２に記載の方法 。
14. １４．当該抗体がポリクローナル抗体であるところの、請求項１２に記載の方法 。
15. １５．ＨＣＶ抗原または抗体を含有する疑いのある試験サンプル内のＨＣＶ抗原 またはＨＣＶ抗体の存在を検出する検査キットであって、哺乳動物発現システム において産生したグリコシル化ＨＣＶ抗原を入れた容器から成ることを特徴とす る、前記検査キット。
16. １６．更に、哺乳動物発現システムにおいて産生したグリコシル化ＨＣＶ抗原を 用いることにより産生した抗体を含む、請求項１５に記載の検査キット。
17. １７．ＨＣＶ抗原またはＨＣＶ抗体を含有する疑いのある試験サンプル内のＨＣ Ｖ抗原またはＨＣＶ抗体の存在を検出する検査キットであって、哺乳動物発現シ ステムにおいて産生したグリコシル化ＨＣＶ抗原を用いて産生した抗体を入れた 容器から成る前記検査キット。
18. １８．当該抗体がポリクローナル抗体であるところの請求項１７に記載の検査キ ット。
19. １９．当該抗体がモノクローナル抗体であるところの請求項１７に記載の検査キ ット。