RU2189254C2 - Вакцины против вирусов гепатита - Google Patents
Вакцины против вирусов гепатита Download PDFInfo
- Publication number
- RU2189254C2 RU2189254C2 RU97107000/14A RU97107000A RU2189254C2 RU 2189254 C2 RU2189254 C2 RU 2189254C2 RU 97107000/14 A RU97107000/14 A RU 97107000/14A RU 97107000 A RU97107000 A RU 97107000A RU 2189254 C2 RU2189254 C2 RU 2189254C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- hepatitis
- virus
- hcv
- gene product
- amino acids
- Prior art date
Links
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims abstract description 22
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title abstract description 26
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 title abstract description 11
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 title abstract description 9
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 claims abstract description 121
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 110
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 103
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 101
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 claims abstract description 34
- 101150010882 S gene Proteins 0.000 claims abstract description 34
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 34
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 34
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 34
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 claims abstract description 16
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims abstract description 15
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 claims abstract description 7
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 claims description 106
- 108700039791 Hepatitis C virus nucleocapsid Proteins 0.000 claims description 68
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 claims description 46
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 43
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 42
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 42
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 42
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 37
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 22
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 claims description 21
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 19
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 claims description 16
- 101150075200 S-2 gene Proteins 0.000 claims description 15
- 101150027674 S1 gene Proteins 0.000 claims description 13
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 claims description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 10
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 claims description 6
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 3
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 claims 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 abstract description 20
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 abstract description 13
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 abstract description 8
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 abstract description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 54
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 49
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 35
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 29
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 27
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 23
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 20
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 13
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 13
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 12
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 12
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 11
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 10
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 9
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 9
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 9
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 9
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 9
- 230000004044 response Effects 0.000 description 9
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 8
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 7
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 7
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 7
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 6
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 6
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 6
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 6
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 5
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 5
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 5
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 5
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 5
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 5
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 4
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 4
- 108090001074 Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 description 4
- 108010076039 Polyproteins Proteins 0.000 description 4
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- CVSVTCORWBXHQV-UHFFFAOYSA-N creatine Chemical compound NC(=[NH2+])N(C)CC([O-])=O CVSVTCORWBXHQV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 4
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 4
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 3
- 102100034349 Integrase Human genes 0.000 description 3
- 206010067125 Liver injury Diseases 0.000 description 3
- 241000283923 Marmota monax Species 0.000 description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 3
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 3
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 3
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 231100000234 hepatic damage Toxicity 0.000 description 3
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 3
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 3
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 3
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 3
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 3
- 230000008818 liver damage Effects 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 3
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 2
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 2
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 2
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 description 2
- 241000725618 Duck hepatitis B virus Species 0.000 description 2
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 2
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 description 2
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 description 2
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 2
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 2
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 2
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 2
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 2
- 102000003505 Myosin Human genes 0.000 description 2
- 108060008487 Myosin Proteins 0.000 description 2
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 2
- 101001028244 Onchocerca volvulus Fatty-acid and retinol-binding protein 1 Proteins 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N benzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1 WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 2
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 230000007882 cirrhosis Effects 0.000 description 2
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 description 2
- 229960003624 creatine Drugs 0.000 description 2
- 239000006046 creatine Substances 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 208000010710 hepatitis C virus infection Diseases 0.000 description 2
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 2
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- LCCNCVORNKJIRZ-UHFFFAOYSA-N parathion Chemical compound CCOP(=S)(OCC)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 LCCNCVORNKJIRZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000009696 proliferative response Effects 0.000 description 2
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 2
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 2
- 201000009410 rhabdomyosarcoma Diseases 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 108010087967 type I signal peptidase Proteins 0.000 description 2
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 2
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 1
- LEBVLXFERQHONN-UHFFFAOYSA-N 1-butyl-N-(2,6-dimethylphenyl)piperidine-2-carboxamide Chemical compound CCCCN1CCCCC1C(=O)NC1=C(C)C=CC=C1C LEBVLXFERQHONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 1
- 101150096316 5 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000030090 Acute Disease Diseases 0.000 description 1
- 102100027211 Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 241000272517 Anseriformes Species 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 241000713826 Avian leukosis virus Species 0.000 description 1
- 239000005711 Benzoic acid Substances 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000701083 Bovine alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 206010008909 Chronic Hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 102100031673 Corneodesmosin Human genes 0.000 description 1
- 101710139375 Corneodesmosin Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 108010031111 EBV-encoded nuclear antigen 1 Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100038132 Endogenous retrovirus group K member 6 Pro protein Human genes 0.000 description 1
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 101710142246 External core antigen Proteins 0.000 description 1
- 241000710831 Flavivirus Species 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 208000037319 Hepatitis infectious Diseases 0.000 description 1
- 206010019799 Hepatitis viral Diseases 0.000 description 1
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 1
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- 241000701076 Macacine alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 101800001892 Mature core protein Proteins 0.000 description 1
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000713333 Mouse mammary tumor virus Species 0.000 description 1
- 108091007491 NSP3 Papain-like protease domains Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 101710150451 Protein Bel-1 Proteins 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 230000004570 RNA-binding Effects 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000711798 Rabies lyssavirus Species 0.000 description 1
- 101900083372 Rabies virus Glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 108700022715 Viral Proteases Proteins 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101710086987 X protein Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001409 amidines Chemical class 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 229940051881 anilide analgesics and antipyretics Drugs 0.000 description 1
- 150000003931 anilides Chemical class 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 230000037429 base substitution Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 235000010233 benzoic acid Nutrition 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 229960003150 bupivacaine Drugs 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 210000002230 centromere Anatomy 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 1
- YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N chloroform;phenol Chemical compound ClC(Cl)Cl.OC1=CC=CC=C1 YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 230000007012 clinical effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000010502 episomal replication Effects 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 229940011871 estrogen Drugs 0.000 description 1
- 239000000262 estrogen Substances 0.000 description 1
- 102000036444 extracellular matrix enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108091007167 extracellular matrix enzymes Proteins 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 description 1
- 208000005252 hepatitis A Diseases 0.000 description 1
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 1
- 244000052637 human pathogen Species 0.000 description 1
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 1
- 150000003840 hydrochlorides Chemical class 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000644 isotonic solution Substances 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 150000002605 large molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000003589 local anesthetic agent Substances 0.000 description 1
- 229960005015 local anesthetics Drugs 0.000 description 1
- 230000005923 long-lasting effect Effects 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N n-methyl-1-(2-naphthalen-1-ylsulfanylphenyl)methanamine Chemical compound CNCC1=CC=CC=C1SC1=CC=CC2=CC=CC=C12 OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 229940021222 peritoneal dialysis isotonic solution Drugs 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 231100000572 poisoning Toxicity 0.000 description 1
- 230000000607 poisoning effect Effects 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 229940023143 protein vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 239000002510 pyrogen Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000009711 regulatory function Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 101150101059 ro-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 1
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 1
- 235000017709 saponins Nutrition 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 210000004927 skin cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000003270 steroid hormone Substances 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 102000055501 telomere Human genes 0.000 description 1
- 108091035539 telomere Proteins 0.000 description 1
- 210000003411 telomere Anatomy 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- 150000003673 urethanes Chemical class 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 239000005526 vasoconstrictor agent Substances 0.000 description 1
- 201000001862 viral hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 230000017613 viral reproduction Effects 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
- C12N2730/00011—Details
- C12N2730/10011—Hepadnaviridae
- C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
- C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
- C12N2770/24222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии и генной терапии и касается вакцины против вирусов гепатита. Сущность изобретения включает молекулу нуклеиновой кислоты, которая содержит неполный геном слитых вирусов гепатита С и гепатита В или неполный геном вируса гепатита С, включающие нуклеотидную последовательность, кодирующую полный коровый белок гепатита С и S-генный белок гепатита В, или неполный вирусный геном гепатита С, включающий нуклеотидную последовательность, кодирующую полный коровый белок гепатита С, операбельно соединенную с регуляторными элементами, функциональными в человеческих клетках. Описываются также фармацевтические композиции, содержащие такие конструкции. Преимущество изобретения заключается в создании генных конструкций, которые могут быть эффективны для защиты против вирусов гепатита В и/или гепатита С. 8 с. и 6 з.п.ф-лы, 3 ил.
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к генным конструкциям, которые пригодны в качестве компонентов вакцин против вируса гепатита С в протоколах генетической иммунизации, к способам защиты индивидуумов от заражения вирусом гепатита С, к способам лечения индивидуумов, страдающих от заражения вирусом гепатита С, к рекомбинантным химерным генным конструкциям, которые полезны в качестве компонентов вакцин против вируса гепатита В и/или вируса гепатита С в протоколах генетической иммунизации, к способам защиты индивидуумов от заражения вирусом гепатита В и/или вирусом гепатита С и к способам лечения индивидуумов, страдающих от заражения вирусом гепатита В и/или вирусом гепатита С. Настоящая заявка родственна заявке на патент США, зарегистрированной 5 октября 1994, регистрационный номер 08/318248, и заявке на патент США, зарегистрированной 6 июня 1995, регистрационный номер 08/467859, которые обе включены в настоящее изобретение в качестве ссылок.
Изобретение относится к генным конструкциям, которые пригодны в качестве компонентов вакцин против вируса гепатита С в протоколах генетической иммунизации, к способам защиты индивидуумов от заражения вирусом гепатита С, к способам лечения индивидуумов, страдающих от заражения вирусом гепатита С, к рекомбинантным химерным генным конструкциям, которые полезны в качестве компонентов вакцин против вируса гепатита В и/или вируса гепатита С в протоколах генетической иммунизации, к способам защиты индивидуумов от заражения вирусом гепатита В и/или вирусом гепатита С и к способам лечения индивидуумов, страдающих от заражения вирусом гепатита В и/или вирусом гепатита С. Настоящая заявка родственна заявке на патент США, зарегистрированной 5 октября 1994, регистрационный номер 08/318248, и заявке на патент США, зарегистрированной 6 июня 1995, регистрационный номер 08/467859, которые обе включены в настоящее изобретение в качестве ссылок.
Предпосылки создания изобретения
Вирус гепатита С (HCV), основной этиологический фактор приобретаемого при трансфузии не-А и не-В гепатита, ответственен приблизительно за 150000 новых случаев острого вирусного гепатита в США ежегодно. См. Greenberger, N. J. , 1983, "New Approaches for Hepatitis C", Contemporary Internal Medicine Feb:64. Примерно половина этих случаев заражения переходит в хронические инфекционные заболевания, которые могут ассоциироваться с циррозом и/или печеночно-клеточным раком (Alter, et al., Science, 1992, 258, 135-140; и Alter, et al. , New Eng. J. Med., 1992, 327, 1899-1905). Кроме того, HCV-инфекция является независимым фактором риска для развития печеночно-клеточного рака, как показывает широкое распространение антител против HCV (Colombo, et al., Lancet, 1989, ii, 1006-1008; Saito, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87, 6547-6549; Simonetti, et al., An. Int. Med., 1992, 116, 97-102; и Tsukuma, et al., New Eng. J. Med., 1993, 328, 1797-1801).
Вирус гепатита С (HCV), основной этиологический фактор приобретаемого при трансфузии не-А и не-В гепатита, ответственен приблизительно за 150000 новых случаев острого вирусного гепатита в США ежегодно. См. Greenberger, N. J. , 1983, "New Approaches for Hepatitis C", Contemporary Internal Medicine Feb:64. Примерно половина этих случаев заражения переходит в хронические инфекционные заболевания, которые могут ассоциироваться с циррозом и/или печеночно-клеточным раком (Alter, et al., Science, 1992, 258, 135-140; и Alter, et al. , New Eng. J. Med., 1992, 327, 1899-1905). Кроме того, HCV-инфекция является независимым фактором риска для развития печеночно-клеточного рака, как показывает широкое распространение антител против HCV (Colombo, et al., Lancet, 1989, ii, 1006-1008; Saito, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87, 6547-6549; Simonetti, et al., An. Int. Med., 1992, 116, 97-102; и Tsukuma, et al., New Eng. J. Med., 1993, 328, 1797-1801).
HCV представляет собой оболочечный, плюс-нитевой РНК-вирус, длиной приблизительно в 9500 нуклеотидов, который в последнее время относят к отдельному роду в семействе Flavivirus (Heinz, F.X., Аrсh. Virol. (Suppl.), 1992, 4, 163-171). Различные иэоляты показывают большое разнообразие нуклеотидных последовательностей, приводящее к подразделению геномов HCV по крайней мере на восемь генотипов (Simmonds, et al., J. Gen. Virol., 1993, 74, 2391-2399). Во всех генотипах вирусный геном содержит большую открытую рамку считывания (ORF), которая кодирует белок-предшественник из 3010-3033 аминокислот приблизительно в 330 кД (Choo, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, 88, 2451-2455; Inchauspe, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, 88, 10292-10296; Kato, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87, 9524-9528; Okamoto, et al., J. Gen. Virol., 1991, 72, 2697-2704; и Takamizava, et al., J. Gen. Virol., 1991, 65, 1105-1113).
Отдельные полипептиды HCV продуцируются протеолитическим процессингом полипептида-предшественника с образованием корового белка (С), белков оболочки (El, E2) и неструктурных белков (NS2-NS5) (Bartenschlager, et al., J. Gen. Virol., 1993, 67, 3835-3844; Grakoui, et al., J. Gen. Virol., 1993, 67, 2832-2843; и Selby, et al., J. Gen. Virol., 1993, 74, 1103-1113). Такой протеолиз катализируется сочетанием как клеточных, так и вирусных кодированных протеаз.
Помимо транслируемой области, геном HCV содержит как 5'-нетранслируемую область (5'-UTR), так и 3'-нетранслируемую область (3'-UTR). 5'-UTR из 324-341 нуклеотидов представляет наиболее консервативную последовательность среди всех изолятов, о которых приводятся данные (Han, et al., Proc. Natl. Acad. Scl. USA, 1991, 88, 1711-1715; и Bukh, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89, 4942-4946). Постулировано, что эта 5'-UTR содержит важные регуляторные элементы для репликации и/или трансляции РНК HCV. 5'-UTR также содержит несколько небольших открытых рамок считывания (ORF), но в настоящее время нет оснований полагать, что эти ORF-последовательности действительно являются транслируемыми.
Коровый ген HCV может представлять собой важную мишень для противовирусного подхода, основанного на нуклеиновых кислотах. Полагают, что первые 191 аминокислот полипротеинового предшественника HCV представляют собой вирусный нуклеокапсидный белок. Этот белок состоит из основного РНК-связывающего аминоконцевого домена и высокогидрофобной области карбоксильного конца (Bukh, et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91, 8239-8243; и Santolini et al., J. Virol., 1994, 68, 3631-3641). Зрелый коровый белок в 21 кД отщепляется от полипротеинового предшественника клеточной сигнальной пептидазой, и есть основания предполагать, что нуклеокапсидный белок HCV устойчиво ассоциируется с цитоплазматической поверхностью мембраны эндоплазматического ретикулума (Hijikata, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, 88, 5547-5551; и Santolini, et al. , J. Virol., 1994, 68, 3631-3641). В противоположность гликопротеинам оболочки, которые включают гипервариабельную область в аминоконцевой области Е2 (Weiner, et al., Virol., 1991, 180, 842-848; и Weiner, et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89, 3468-3472), коровый белок является весьма консервативным среди различных генотипов HCV и генерирует иммунный ответ организма-хозяина (Bukh, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91, 8239-8243; и Houghton, et al., Hepatology, 1991, 14, 381-388). Предыдущие исследования показали, что большинство инфицированных HCV индивидуумов вырабатывают антитела к коровому белку HCV в начале заражения. (Chiba, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, 88, 4641-4645; Hosein, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, 88, 3647-3651; Hsu, et al., Hepatology, 1993, 17, 763-771; Katayama, et al., Hepatology, 1992, 15, 391-394; Nasoff, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, 88, 5462-5466; и Okamoto, et al., Hepatology, 1992, 15, 180-186). Более того, нуклеокапсидный белок представляется важной мишенью для клеточного иммунного ответа против HCV (Botarelli, et al., Gastroenterol., 1993, 104, 580-587; Koziel, et al., J. Virol., 1993, 67, 7522-7532; и Shirai, et al., J. Virol. , 1993, 68, 3334-3342). Наконец, последние наблюдения позволяют предположить, что коровый белок HCV может также иметь некоторые регуляторные функции (Shin, et al., J. Virol., 1993, 67, 5823-5832). Мутация вирусного генома с высокой частотой происходит, вероятно, во время репликации генома вируса и через иммунную селекцию. Это явление может быть связано с установлением персистентной вирусной инфекции и последующим хроническим характером болезни (Weiner, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89, 3468-3472; Kato, et al., Biochem.Biophys. Res. Comm., 1992, 189, 119-127; и Alter, et al., New Eng. J. Med., 1992, 327, 1899-1905).
Клеточные иммунные события, вовлеченные в повреждение печени и вирусный клиренс во время HCV-инфекции, установлены только частично. При попытке изучить потенциальную патогенную роль инфильтрирующих печень лимфоцитов у пациентов с хронической HCV-инфекцией, Koziel, et al. изучили ответ цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) таких клеток и продемонстрировали НLA класса I-ограниченный СD8+ЦТЛ-ответ, направленный против как структурных, так и неструктурных областей HCV-полипептидов (Koziel, et аl., J. Virol., 1993, 67, 7522-7532; и Koziel, et al., J. Immunol., 1992, 149, 3339-3344). Другие исследователи также отметили наличие ЦТЛ в популяциях мононуклеарных клеток периферической крови, которые во время хронической HCV-инфекции распознают эпитопы на коровом и других родственных вирусных белках (Kita, et аl., Hepatol., 1993, 18, 1039-1044; и Cerny, et al., Intl. Symp. Viral. Hepatitis Liver Dis., 1993, 83 (реферат)).
Botarelli, et al., (Botarelli, et al., Gastroenterol.,1993, 104, 580-587) и Ferrari, et al., (Ferrari et al., Hepatol., 1994, 19, 286-295) обнаружили HLA класса II-ограниченный CD4+ опосредуемый Т-клетками пролиферативный ответ на некоторые рекомбинантные белки, полученные из различных областей HCV, у пациентов с хронической HCV-инфекцией. Примечательно, что существовала корреляция между ответами Т-клеток на коровый белок HCV и клинически доброкачественным течением болезни печени так же, как и последующим уничтожением вируса. Однако подобные исследования показали, что пролиферативный ответ на коровый белок HCV не предсказывает доброкачественное клиническое течение относительно серьезности болезни печени (Schupper, et al., Hepatol. , 1993, 18, 1055-1060). Таким образом, важно прояснить связь между активным клеточным иммунитетом и клиническим течением вирусной инфекционной болезни в отношении типа повреждения печени и клинической реакции HCV-инфекции на интерфероновую (IFN) терапию. В этом отношении проводились исследования, включающие ответы мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) на рекомбинантный GST-HCV коровый слитый белок, которые включали оценку способности таких клеток продуцировать IFN-γ; и проводились корреляции с различными клиническими результатами заражения HCV. Обнаружено, что мононуклеарные клетки 24 из 46 пациентов (52%) с хронической болезнью печени отвечали на коровый белок; бессимптомные носители HCV показали низкую степень ответа (15%, р<0,05). Что более существенно, пациенты, которые получили лечение IFN-α и пришли к клинической и вирусологической эмиссии, имели более высокую степень реакции (75%, р<0,05) к коровому белку HCV по сравнению с пациентами с постоянным гепатитом, лечение которых не удалось (31%). Из 25 пациентов, мононуклеарные клетки которых реагировали на коровый белок HCV, 18 имели заметную реакцию на один или несколько пептидов; 12 пациентов реагировали на пептидную смесь, содержащую гидрофильные последовательности. Аминокислотная последовательность корового пептида 140-160 распознавалась 9 пациентами. Интересно, что 7 из 8 пациентов, несущих HLA DR4 и гаплотипы w53, узнавали пептидную последовательность 140-160. Таким образом, оказалось, что ответ мононуклеарных клеток ограничен HLA DR, и отвечающие клетки идентифицированы как CD4+ Т-клетки. Это исследование показывает присутствие иммунодоминантных Т-клеточных эпитопов в коровом белке HCV в ассоциации с фенотипами HLA DR у пациентов с заболеванием печени, связанным с HCV.
Вирус гепатита В (HBV) является основным человеческим патогеном, для которого не существует эффективного лечения. Установлено, что более 300 миллионов человек в мире хронически инфицированы этим вирусом. Воздействие HBV может привести к острому или хроническому гепатиту, циррозу печени и развитию печеночно-клеточного рака. Клинические последствия этой серьезной инфекционной болезни являются предметом особого отношения в разработках всего мира, особенно там, где HBV-инфекция является одной из ведущих причин смертности, а также является основной причиной острых или хронических болезней печени в Соединенных Штатах, как и в Европе. HBV является эталонным членом семейства hepadnavirus, группы близкородственных вирусов (Ganem, et al. , Annu. Rev. Blochem., 1987, 56, 651-693), которая включает, среди прочих, вирус гепатита В утки (DHBV) и вирус гепатита лесного североамериканского сурка (WHV). Экспериментально инфицированные утки или лесные американские сурки точно воспроизводили многие признаки болезни человека, такой как острая или хроническая инфекционная болезнь, и, в случае хронически инфицированных лесных американских сурков развитие печеночно-клеточного рака (Shodel, et al. , "The Biology of Avian Hepatitis В viruses", в Molecular Biology of the Hepatitis В Virus, 1991, Vol. 3, CRC Press, Boca Raton, FL, pp. 53-80; Korba, et al., J. Virol., 1989, 63, 1360-1370; и Коrbа, et al., Hepatology, 1989, 9, 461-470). Хотя вирусные репликативные промежуточные формы обнаружены в других тканях, печень является органом-мишенью, и гепатоцитное повреждение ассоциируется с персистентной вирусной инфекцией. Представляется, что сам по себе HBV не является цитопатическим вирусом. Поэтому вероятно, что иммунный ответ организма-хозяина, продуцированный против вирусных эпитопов, продуцирует повреждение печени, и стратегия лечения, разработанная для уменьшения геномной репликации вируса в печени, может иметь положительное клиническое действие.
Геном HBV кодирует 4 открытые рамки считывания (ORF), которые включают 1) 5-ген, кодирующий белок оболочки, с 2 полипептидами pre-Sl и pre-S2 внутри рамки; 2) полимеразную ORF, кодирующую белок обратную транскриптазу, которая ответственна за обратную транскрипцию предгеномной РНК в 3,6 кб в ДНК; 3) коровый ген, кодирующий белок, который собран для завершения вирусного нуклеокапсида; и 4) НВх ORF, которая кодирует белок неизвестной функции. Ген ро1 заключает в себе 80% генома и перекрывает три другие ORF. Коровый ген предваряется внутрирамочной последовательностью, которая кодирует сигнальный пептид, и последующее протеолитическое расщепление приводит к антигенно отличному белку, названному HBeAg. Обнаружено, что НВх-белок не является существенным для вирусного жизненного цикла in vitro (Blum, et al., J. Virol. , 1992, 66, 123-127), но выясняется, что он является необходимым для установления продуктивной инфекции in vivo (Chen, et al., J. Virol., 1993, 67, 1218-1226). НВх может функционировать как транскрипционный трансактиватор на множестве клеточных и вирусных генов, и предполагается, что он может вносить вклад в развитие НСС (Schek, et аl., "The Hepadnaviral X Protein" в Molecular Biology of the Hepatitis В Virus, 1991, Vol. 3, CRC Press, Boca Raton, FL, pp. 181-192).
Прямая инъекция ДНК животным является перспективным способом доставки специфических антигенов в целях иммунизации (Barry, et al., Bio Techniques, 1994, 16, 616-619; Davis, et al., Hum. Mol. Genet., 1993, 11, 1847-1851; Tang, et al., Nature, 1992, 356, 152-154; Wang, et al., J. Virol., 1993, 67, 3338-3344; и Wolff, et al., Science, 1990, 247, 1465-1468). Такой подход с успехом применяют для создания защитного иммунитета против вируса гриппа у мышей и кур, против бычьего вируса 1 герпеса у мышей и крупного рогатого скота и против вируса бешенства у мышей (Сох, et al., J. Virol., 1993, 67, 5664-5667; Fynan, et al., DNA and Cell Biol., 1993, 12, 785-789; Ulmer, et al. , Science, 1993, 259, 1745-1749; и Xiang, et al., Virol., 1994, 199, 132-140). В большинстве случаев с контролем инфекции ассоциируются сильное, но высоковариабельное антитело и цитотоксические Т-клеточные ответы. В действительности, возможность генерации ЦТЛ с долго сохраняющейся памятью без использования печеночного переносчика делает такой подход особенно привлекательным по сравнению со способами, включающими вакцины с убитыми вирусами и генерирования реакции ЦТЛ, которая не только защищает против острой инфекции, но также может быть благоприятной при уничтожении персистентной вирусной инфекции (Wolff, et al., Science, 1990, 247, 1465-1468; Wolff, et al., Hum. Mol. Genet., 1992, 1, 363-369; Manthorpe, et al., Human Gene Therapy, 1993, 4, 419-431; Ulmer, et al., Science, 1993, 259, 1745-1749; Yankauckas, et al. , DNA and Cell Biol., 1993, 12, 777-783; Montgomery, et al., DNA and Cell Biol., 1993, 12, 777-783; Fynan, et al., DNA and Cell Blol., 1993, 12, 785-789; Wang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90, 4156-4160; Wang, et al. , DNA and Cell Biol., 1993, 12, 799-805; Xiang, et al., Virol., 1994, 199, 132-140; и Davis, et al., Hum. Mol. Genet., 1993, 11, 1847-1851), а заражение HCV и HBV являются заболеваниями человека, имеющими значение во всем мире.
В настоящее время не существует универсального высокоэффективного способа лечения хронической HBV- и/или HCV-инфекции. Разработка вакцинной стратегии против HBV и/или HCV осложнена не только значительной гетерогенностью изолятов HBV и HCV, но также смесью гетерогенных геномов в пределах изолята (Martell, et al. , J. Virol., 1992, 66, 3225). Кроме того, вирус содержит высоковариабельную область оболочки.
Вакцинация и иммунизация обращаются, главным образом, к введению невирулентного фактора, против которого иммунная система индивидуума может инициировать иммунный ответ, который затем будет полезен для защиты против заражения патогеном. Иммунная система идентифицирует вторгающиеся "чужеродные" композиции и факторы, в первую очередь, путем опознавания белков и других больших молекул, которые, по природе, отсутствуют у индивидуума. Чужеродный белок представляет мишень, против которой осуществляется иммунный ответ.
В заявке на международный патент PCT/US90/01348 дается информация о последовательностях клонов генома HCV, аминокислотных последовательностях белков вируса HCV и способах приготовления и применения таких композиций, включая вакцины против HCV, содержащие белки HCV и пептиды, полученные из них.
В каждой из заявок на патент США, зарегистрированных 26 января 1993, регистрационный номер 08/008342, 11 марта 1993, регистрационный номер 08/029336, 21 сентября 1993, регистрационный номер 08/125012, в заявке на международный патент, зарегистрированной 26 января 1994, регистрационный номер PCT/US94/00899, и в заявке на патент США, зарегистрированной 1 апреля 1994, регистрационный номер 08/221579, содержится описание протоколов генетической иммунизации. В каждой из них описываются вакцины против HCV.
В заявке на патент США, зарегистрированной 5 октября 1994, регистрационный номер 08/318248, которая включена в настоящее изобретение в качестве ссылки, описываются генетические конструкции, содержащие нуклеотидные последовательности, кодирующие коровый белок HCV, которые пригодны в качестве вакцины. Вакцина на основе корового белка HCV экспрессирует высокий уровень корового антигена in vitro и индуцирует сильный иммунный ответ in vivo.
Сохраняется потребность в вакцинах, пригодных для защиты индивидуумов от заражения вирусом гепатита В и/или вирусом гепатита С. Сохраняется и потребность в способах защиты индивидуумов от заражения вирусом гепатита В и/или вирусом гепатита С.
Краткое изложение сущности изобретения
Настоящее изобретение относится к молекулам рекомбинантной нуклеиновой кислоты, содержащим нуклеотидную кодирующую последовательность, которая кодирует слитый белок. Слитый белок содержит S-генный продукт вируса гепатита В, соединенный с аминокислотами 1-69 корового белка вируса гепатита С.
Настоящее изобретение относится к молекулам рекомбинантной нуклеиновой кислоты, содержащим нуклеотидную кодирующую последовательность, которая кодирует слитый белок. Слитый белок содержит S-генный продукт вируса гепатита В, соединенный с аминокислотами 1-69 корового белка вируса гепатита С.
Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей молекулу рекомбинантной нуклеиновой кислоты, которая содержит нуклеотидную кодирующую последовательность, которая кодирует слитый белок. Слитый белок содержит S-генный продукт вируса гепатита В, соединенный с аминокислотами 1-69 корового белка вируса гепатита С. Нуклеотидная кодирующая последовательность, которая кодирует слитый белок, операбельно связана с регуляторными элементами, функциональными в человеческих клетках. Фармацевтическая композиция также содержит фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.
Настоящее изобретение относится к способам иммунизации индивидуума, восприимчивого к или инфицированного вирусом гепатита С и/или вирусом гепатита В, которые включают стадию введения такому индивидууму фармацевтической композиции, содержащей молекулу рекомбинантной нуклеиновой кислоты, которая содержит нуклеотидную кодирующую последовательность, которая кодирует слитый белок. Слитый белок содержит S-генный продукт вируса гепатита В, соединенный с аминокислотами 1-69 корового белка вируса гепатита С. Нуклеотидная кодирующая последовательность, которая кодирует слитый белок, операбельно связана с регуляторными элементами, функциональными в человеческих клетках. Фармацевтическая композиция также содержит фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель. Индивидуум получает количество, эффективное для индуцирования защитного или лечебного иммунного ответа против гепатита В и/или гепатита С.
Настоящее изобретение относится к молекулам нуклеиновой кислоты, содержащим неполный вирусный геном гепатита С, включающий послед. 14.
Настоящее изобретение относится к молекулам нуклеиновой кислоты, содержащим неполный вирусный геном гепатита С, включающий нуклеотидную последовательность, которая кодирует коровый белок HCV, и по крайней мере последние 9 нуклеотидов 5'-нетранслируемой области.
Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, которая содержит молекулу нуклеиновой кислоты, имеющую неполный вирусный геном гепатита С и по крайней мере кодирующие последовательности послед. 14, операбельно соединенные с регуляторными элементами, функциональными в человеческих клетках.
Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, которая содержит молекулу нуклеиновой кислоты, имеющую неполный вирусный геном гепатита С, включающий нуклеотидную последовательность, которая кодирует коровый белок HCV, и по крайней мере последние 9 нуклеотидов 5'-нетранслируемой области, операбельно связанные с регуляторными элементами, функциональными в человеческих клетках.
Настоящее изобретение относится к способу иммунизации индивидуума, восприимчивого к или инфицированного вирусом гепатита С, включающему стадию введения индивидууму количества плазмиды pHCV2-1 или плазмиды pHCV4-2, эффективного для индуцирования защитного или лечебного иммунного ответа против гепатита С.
Краткое описание чертежей
На фиг.1 дается схематическое изображение некоторых конструкций, содержащих коровый ген HCV, S-ген HBV, pre S1 ген HBV и pre S2 ген HBV.
На фиг.1 дается схематическое изображение некоторых конструкций, содержащих коровый ген HCV, S-ген HBV, pre S1 ген HBV и pre S2 ген HBV.
На фиг. 2 приводится диаграмма экспрессионного вектора, в который могут быть вставлены кодирующие последовательности, кодирующие химерный слитый белок HCV/HBV, или в который вставляют кодирующую последовательность HCV, чтобы получить плазмиды pHCV2-1 и pHCV4-2.
На фиг.3 изображаются способы построения гибридных конструкций HBV/HCV.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится к композициям и способам, которыми иммунизируют индивидуум для профилактики и/или лечения от HBV- и/или HCV-инфекции. Для иммунизации против HBV- и/или HCV-инфекции индивидууму вводят молекулы рекомбинантной нуклеиновой кислоты, содержащие нуклеотидную кодирующую последовательность, которая кодирует слитый белок, который содержит S-генный продукт HBV, соединенный с аминокислотами 1-69 корового белка HCV. Слитый белок, кодированный генной конструкцией, экспрессируется клетками индивидуума и служит в качестве иммуногенной мишени, против которой индуцируются анти-HBV и/или анти-HCV иммунные ответы. Для иммунизации против заражения HCV индивидууму вводят генетический материал, содержащий неполный геном вируса гепатита С, но который кодирует коровый белок HCV. Белок, кодированный генной конструкцией, экспрессируется клетками индивидуума и служит в качестве иммуногенной мишени, против которой индуцируется анти-HCV иммунный ответ. Получающиеся в результате иммунные ответы являются вполне фундаментальными; кроме гуморального иммунного ответа выявляются обе ветви клеточного иммунного ответа. Способы настоящего изобретения пригодны для создания профилактического и лечебного иммунитета. Таким образом, способ иммунизации включает как способы защиты индивидуума от заражения HBV и/или HCV, так и способы лечения индивидуума, страдающего от заражения HBV и/или HCV.
Настоящее изобретение относится к композициям и способам, которыми иммунизируют индивидуум для профилактики и/или лечения от HBV- и/или HCV-инфекции. Для иммунизации против HBV- и/или HCV-инфекции индивидууму вводят молекулы рекомбинантной нуклеиновой кислоты, содержащие нуклеотидную кодирующую последовательность, которая кодирует слитый белок, который содержит S-генный продукт HBV, соединенный с аминокислотами 1-69 корового белка HCV. Слитый белок, кодированный генной конструкцией, экспрессируется клетками индивидуума и служит в качестве иммуногенной мишени, против которой индуцируются анти-HBV и/или анти-HCV иммунные ответы. Для иммунизации против заражения HCV индивидууму вводят генетический материал, содержащий неполный геном вируса гепатита С, но который кодирует коровый белок HCV. Белок, кодированный генной конструкцией, экспрессируется клетками индивидуума и служит в качестве иммуногенной мишени, против которой индуцируется анти-HCV иммунный ответ. Получающиеся в результате иммунные ответы являются вполне фундаментальными; кроме гуморального иммунного ответа выявляются обе ветви клеточного иммунного ответа. Способы настоящего изобретения пригодны для создания профилактического и лечебного иммунитета. Таким образом, способ иммунизации включает как способы защиты индивидуума от заражения HBV и/или HCV, так и способы лечения индивидуума, страдающего от заражения HBV и/или HCV.
Показано, что многие белки, известные ранее для индуцирования гуморального и клеточного иммунного ответа после иммунизации ДНК, являются либо нативными белками клеточной поверхности, либо секретируемыми белками, такими как, например, NP вируса гриппа, HBsAg и гликопротеины вируса бешенства. Хотя вакцина на основе коровой ДНК HCV экспрессирует коровый антиген на высоком уровне in vitro и индуцирует иммунный ответ in vivo, вероятно, что коровый белок HCV остается фиксированным в цитоплазме и не экспрессируется на поверхности клетки или не выделяется из клетки. Следовательно, иммунная реакция может быть увеличена посредством обеспечения экспрессии белка на клеточной поверхности и/или секреции белка. Соответственно, в одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения нуклеотидная кодирующая последовательность, кодирующая коровый белок HCV, соединяется с областями нуклеотидной кодирующей последовательности, кодирующей поверхностный антиген HBV, как показано на фиг.1. Таким образом, слитый химерный белок HBV/HBC может индуцировать иммунный ответ к HBV и/или HCV.
Используемое здесь выражение "неполный геном вируса гепатита С" означает молекулу нуклеиновой кислоты, которая не содержит полной кодирующей последовательности для полипротеина HCV, который кодируется вирусным геномом HCV. Включение неполного генома HCV в клетку не привносит достаточной генетической информации для продуцирования инфекционного вируса.
Используемый здесь термин "коровый белок HCV" означает белок, относящийся к усеченным коровым белкам HCV, таким как белки, имеющие аминокислотную последовательность, представленную послед. 1 и послед. 2, которая содержит 154 аминокислоты, или коровый белок HCV полной длины, имеющий аминокислотную последовательность, представляемую послед. 14 и послед. 15, которая является аминокислотной последовательностью корового белка HCV специфического изолята HCV. Полноразмерный коровый белок HCV обычно имеет 191 аминокислоту, но для целей настоящего изобретения, относящихся к усеченному коровому белку HCV, С-концевые 37 аминокислот (аминокислоты 155-191) удаляют, чтобы усилить способность к секреции слитого белка. Постулировано, что двадцать С-концевых аминокислот полноразмерного корового белка HCV содержат сайты связывания с эндоплазматическим ретикулумом, что приводит, в результате, к удержанию корового белка внутри клеточной цитоплазмы. Кроме того, термин "коровый белок HCV" относится к соответствующим коровым белкам HCV, полноразмерным или усеченным, из дополнительных изолятов HCV, которые могут изменяться. Специалисты в этой области техники могут легко идентифицировать коровый белок HCV из дополнительных изолятов. Нуклеотидные и аминокислотные последовательности корового белка HCV описываются в заявке на патент США, зарегистрированный 5 октября 1994, регистрационный номер 08/318248, которая включена в настоящее изобретение в качестве ссылки. Следует иметь в виду, что нуклеотидные замещения в кодоне могут быть приемлемыми, когда кодирована та же аминокислота. Кроме того, следует также иметь в виду, что нуклеотидные изменения могут быть приемлемыми, когда при этом в результате нуклеотидного замещения получается консервативная аминокислота.
Замечено, что коровый белок HCV существует в двух различных формах в форме закрепленного (заякоренного) корового белка и в форме корового белка вириона. Во время трансляции HCV полипептид-предшественник транслируется и затем процессируется клеточными протеазами и вирусными протеазами, образуя индивидуальные вирусные полипептиды. Полагают, что клеточная сигнальная пептидаза расщепляется в сайте, который отделяет часть полипротеина, которая становится коровым белком, отчасти, которая становится белком оболочки, освобождая, посредством этого, закрепленный коровый белок от белка оболочки. Закрепленный коровый белок, который ассоциирован с эндоплазматическим ретикулумом, затем процессируется до зрелого вирионного корового белка. Закрепленный коровый белок отличается от корового белка вириона тем, что он содержит 18 дополнительных аминокислот на С-конце. В действительности, на вирусных частицах закрепленный белок не обнаружен.
Используемый здесь термин "генная конструкция" относится к молекуле рекомбинантной нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную кодирующую последовательность, которая кодирует слитый белок, который содержит по крайней мере 69 N-концевых аминокислот корового белка HCV и полный S-генный продукт HCV, или полноразмерный коровый белок HCV, а также сигналы инициации и терминации, операбельно соединенные с регуляторными элементами, включающими промотор и сигнал полиаденилирования, способные регулировать экспрессию в клетках вакцинированного индивидуума. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения генная конструкция также содержит энхансер, последовательность Козака (GCCGCCATG, послед. 13) и, по крайней мере, фрагмент 5'-UTR HCV.
Используемый здесь термин "генетическая вакцина" относится к фармацевтическому препарату, который содержит генную конструкцию. Генетические вакцины включают фармацевтические препараты, пригодные для индукции профилактического и/или терапевтического иммунного ответа к HCV и/или HBV.
В соответствии с настоящим изобретением, генные конструкции вводят в клетки индивидуума, где они экспрессируются, продуцируя, таким образом, слитый белок корового белка HCV и поверхностного антигена HBV или полноразмерный коровый белок HCV. Регуляторные элементы генных конструкций изобретения способны управлять экспрессией в человеческих клетках. Регуляторные элементы включают промотор и сигнал полиаденилирования. Кроме того, в генную конструкцию также могут включаться другие элементы, такие как энхансер и последовательность Козака.
При захвате клеткой генная конструкция настоящего изобретения может оставаться в клетке в качестве функционирующей внехромосомной молекулы, или она может объединиться с хромосомной ДНК клетки. ДНК может быть введена в клетки, где она остается как отдельный генетический материал в форме плазмиды. С другой стороны, в клетку может быть введена линейная ДНК, которая может объединяться с хромосомой. При введении ДНК в клетку могут быть добавлены реагенты, которые промотируют интеграцию ДНК с хромосомой. В молекулу ДНК также могут быть включены ДНК-последовательности, которые пригодны для промотирования интеграции. С другой стороны, в клетку можно ввести РНК. Также предполагается создать генную конструкцию в виде линейной минихромосомы, включающей центромеру, теломеры и источник репликации.
В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения генная конструкция содержит молекулы рекомбинантной нуклеиновой кислоты, содержащие нуклеотидную кодирующую последовательность, которая кодирует слитый белок, содержащий области S-генного продукта HBV, соединенного с коровым белком HCV, предпочтительно с усеченным коровым белком HCV.
В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения молекула рекомбинантной нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную кодирующую последовательность, которая кодирует слитый белок, содержащий полный S-генный продукт HBV, соединенный с аминокислотами 1-69 корового белка HCV. Нуклеотиды, кодирующие С-концевые аминокислоты S-генного продукта HBV, соединяются с нуклеотидами, кодирующими N-концевые аминокислоты усеченного корового белка HCV.
В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения молекула рекомбинантной нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную кодирующую последовательность, которая кодирует слитый белок, содержащий полный S-генный продукт HBV, соединенный с аминокислотами (1-70)-(1-154) усеченного корового белка HCV. Усеченный коровый белок HCV может содержать аминокислоты 1-70, 1-71, 1-72, 1-73, 1-74, ..., 1-150, 1-151, 1-152, 1-153 или 1-154. Использованные здесь обозначения" (1-70)-(1-154)" или "1-70, 1-71, 1-72, 1-73, 1-74, . .., 1-150, 1-151, 1-152, 1-153 или 1-154" применяются как взаимозаменяемые для описания каждой из аминокислотных последовательностей фрагментов усеченного корового белка HCV, которые включают аминокислоты 1-69 плюс дополнительные С-концевые остатки до 154 остатка. Нуклеотиды, кодирующие С-концевые аминокислоты S-генного продукта HBV, соединены с нуклеотидами, кодирующими N-концевые аминокислоты усеченного корового белка HCV.
В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения молекула рекомбинантной нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную кодирующую последовательность, которая кодирует слитый белок, содержащий фрагмент рrе S2-генного продукта HBV, соединенного с полным S-генным продуктом HBV, соединенного с аминокислотами 1-69 усеченного корового белка HCV. Фрагмент рrе S2-генного продукта HBV может включать С-концевую аминокислоту, или 2 С-концевых аминокислоты, или 3 С-концевых аминокислоты, или 4 С-концевых аминокислоты, . . . , или полный рrе S2-генный продукт HBV. Используемое здесь выражение "фрагмент рrе S2-генного продукта HBV может включать С-концевую аминокислоту, или 2 С-концевых аминокислоты, или 3 C-концевых аминокислоты, или 4 C-концевых аминокислоты, ..., или полный рrе S2-генный продукт HBV" предназначено для описания аминокислотных последовательностей, которые включают фрагменты pre S2-генного продукта HBV, начиная с фрагмента, который включает только С-концевой остаток, до фрагментов, которые включают дополнительные остатки непосредственно от N-концевого до С-концевого остатка, т. е. последний С-концевой остаток, последние два С-концевых остатка, последние три С-концевых остатка и так далее до присутствия полного pre S2 белка. Нуклеотиды, кодирующие С-концевые аминокислоты pre S2-генного продукта HBV, соединяются с нуклеотидами, кодирующими N-концевые аминокислоты S-генного продукта HBV. Нуклеотиды, кодирующие С-концевые аминокислоты S-генного продукта HBV, в свою очередь, соединяются с нуклеотидами, кодирующими N-концевые аминокислоты усеченного корового белка HCV.
В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения молекула рекомбинантной нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную кодирующую последовательность, которая кодирует слитый белок, содержащий фрагмент pre S2-генного продукта HBV, соединенный с полным S-генным продуктом HBV, соединенным с аминокислотами (1-70)-(1-154) усеченного корового белка HCV. Фрагмент pre S2-генного продукта HBV может включать С-концевую аминокислоту, или 2 С-концевых аминокислоты, или 3 С-концевых аминокислоты, или 4 С-концевых аминокислоты, ..., или полный pre S2-генный продукт HBV. Усеченный коровый белок HCV может содержать аминокислоты 1-70, 1-71, 1-72, 1-73, 1-74, . . ., 1-150, 1-151, 1-152, 1-153 или 1-154. Нуклеотиды, кодирующие С-концевые аминокислоты pre S2-генного продукта HBV, соединяются с нуклеотидами, кодирующими N-концевые аминокислоты S-генного продукта HBV. Нуклеотиды, кодирующие С-концевые аминокислоты S-генного продукта HBV, в свою очередь, соединяются с нуклеотидами, кодирующими N-концевые аминокислоты усеченного корового белка HCV.
В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения молекула рекомбинантной нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную кодирующую последовательность, которая кодирует слитый белок, содержащий фрагмент pre S1-генного продукта HBV, соединенного с полным S-генным продуктом HBV, соединенного с аминокислотами 1-69 усеченного корового белка HCV. Фрагмент pre S1-генного продукта HBV может включать С-концевую аминокислоту, или 2 С-концевых аминокислоты, или 3 С-концевых аминокислоты, или 4 С-концевых аминокислоты, . .., или полный pre S1-генный продукт HBV. Используемое здесь выражение "фрагмент pre S1-генного продукта HBV может включать С-концевую аминокислоту, или 2 С-концевых аминокислоты, или 3 С-концевых аминокислоты, или 4 С-концевых аминокислоты, ..., или полный pre S1-генный продукт HBV" предназначено для описания аминокислотных последовательностей, которые включают фрагменты pre S1-генного продукта HBV, начиная с фрагмента, который включает только С-концевой остаток, до фрагментов, которые включают дополнительные остатки непосредственно от N-концевого до С-концевого остатка, т. е. последний С-концевой остаток, последние два С-концевых остатка, последние три С-концевых остатка и так далее до присутствия полного pre S1 белка. Фрагмент pre S2-генного продукта HBV может включать С-концевую аминокислоту, или 2 С-концевых аминокислоты, или 3 С-концевых аминокислоты, или 4 С-концевых аминокислоты, ..., или полный pre S2-генный продукт HBV. Нуклеотиды, кодирующие С-концевые аминокислоты pre S1-генного продукта HBV, соединяются с нуклеотидами, кодирующими N-концевые аминокислоты pre S2-генного продукта HBV. Нуклеотиды, кодирующие С-концевые аминокислоты pre S2-генного продукта HBV, в свою очередь, соединяются с нуклеотидами, кодирующими N-концевые аминокислоты S-генного продукта HBV. Нуклеотиды, кодирующие С-концевые аминокислоты S-генного продукта HBV, в свою очередь, соединяются с нуклеотидами, кодирующими N-концевые аминокислоты усеченного корового белка HCV.
В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения молекула рекомбинантной нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную кодирующую последовательность, которая кодирует слитый белок, содержащий фрагмент pre S1-генного продукта HBV, соединенный с фрагментом pre S2-генного продукта HBV, соединенного с S-генным продуктом HBV, соединенным с аминокислотами (1-70)-(1-154) усеченного корового белка HCV. Усеченный коровый белок HCV может содержать аминокислоты 1-70, 1-71, 1-72, 1-73, 1-74, ..., 1-150, 1-151, 1-152, 1-153 или 1-154. Фрагмент pre S1-генного продукта HBV может включать С-концевую аминокислоту или 2 С-концевых аминокислоты, или 3 С-концевых аминокислоты, или 4 С-концевых аминокислоты, ..., или полный pre S1-генный продукт HBV. Фрагмент pre S2-генного продукта HBV может включать С-концевую аминокислоту, или 2 С-концевых аминокислоты, или 3 С-концевых аминокислоты, или 4 С-концевых аминокислоты, ..., или полный pre S2-генный продукт HBV. Нуклеотиды, кодирующие С-концевые аминокислоты pre S1-генного продукта HBV, соединяются с нуклеотидами, кодирующими N-концевые аминокислоты pre S2-генного продукта HBV. Нуклеотиды, кодирующие С-концевые аминокислоты pre S2-генного продукта HBV, в свою очередь, соединяются с нуклеотидами, кодирующими N-концевые аминокислоты S-генного продукта HBV. Нуклеотиды, кодирующие С-концевые аминокислоты S-генного продукта HBV, в свою очередь, соединяются с нуклеотидами, кодирующими N-концевые аминокислоты усеченного корового белка HCV.
Предполагается, что нуклеотидные кодирующие последовательности могут быть соединены одна с другой с помощью или без помощи нуклеотидных спейсеров или линкеров, таким образом, что нуклеотидная кодирующая последовательность в прямом направлении остается в рамке. Таким образом, нуклеотидные кодирующие последовательности могут быть соединены непосредственно, т.е. без каких-либо нуклеотидных спейсеров. С другой стороны, между соседними нуклеотидными последовательностями может быть вставлен спейсер, содержащий от 3 до 60 нуклеотидов. Например, нуклеотидный спейсер может быть вставлен между нуклеотидными кодирующими последовательностями для S-гена HBV и усеченного корового гена HCV, между pre S2-геном HBV и pre S-геном HBV, и pre S1-геном HBV и pre S2-геном HBV. Спейсер или линкер может содержать сайты для рестрикционных эндонуклеаз для целей клонирования.
Также предполагается, что молекула рекомбинантной нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеотидную кодирующую последовательность, которая кодирует слитый белок, который может содержать менее полного S-генного продукта HBV, соединенного
с аминокислотами 1-69 усеченного корового белка HCV, по существу, не изменяет эффективности вакцины. Также предполагается, что нуклеотидные замещения могут быть осуществлены в нуклеотидной кодирующей последовательности, не затрагивая аминокислотную последовательность слитого белка. Также предполагается, что замещения консервативных аминокислот могут быть осуществлены в слитом белке без существенного уменьшения иммуногенной активности слитого белка.
с аминокислотами 1-69 усеченного корового белка HCV, по существу, не изменяет эффективности вакцины. Также предполагается, что нуклеотидные замещения могут быть осуществлены в нуклеотидной кодирующей последовательности, не затрагивая аминокислотную последовательность слитого белка. Также предполагается, что замещения консервативных аминокислот могут быть осуществлены в слитом белке без существенного уменьшения иммуногенной активности слитого белка.
В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения генная конструкция включает по крайней мере фрагмент 5'-UTR HCV, содержащий последние 9 нуклеотидов 5'-UTR HCV. Используемый здесь термин "последние 9 нуклеотидов 5'-UTR HCV" предназначается для обозначения 9 самых крайних 3'-нуклеотидов 5'-UTR, иными словами для обозначения 9 нуклеотидов 5'-UTR, которые непосредственно предшествуют кодирующей последовательности. Последние 9 нуклеотидов 5'-UTR HCV предпочтительного варианта осуществления изобретения показаны как послед. 3.
В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения фрагмент 5'-UTR, который включает последние 9 нуклеотидов 5'-UTR HCV, содержит последние 25 нуклеотидов 5'-UTR HCV. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения фрагмент 5'-UTR, который включает последние 9 нуклеотидов 5'-UTR HCV, содержит последние 50 нуклеотидов 5'-UTR HCV. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения фрагмент 5'-UTR, который включает последние 9 нуклеотидов 5'-UTR HCV, содержит последние 75 нуклеотидов 5'-UTR HCV. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения фрагмент 5'-UTR, который включает последние 9 нуклеотидов 5'-UTR HCV, содержит последние 100 нуклеотидов 5'-UTR HCV. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения фрагмент 5'-UTR, который включает последние 9 нуклеотидов 5'-UTR HCV, содержит последние 150 нуклеотидов 5'-UTR HCV. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения фрагмент 5'-UTR, который включает последние 9 нуклеотидов 5'-UTR HCV, содержит последние 200 нуклеотидов 5'-UTR HCV. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения фрагмент 5'-UTR, который включает последние 9 нуклеотидов 5'-UTR HCV, содержит последние 250 нуклеотидов 5'-UTR HCV. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения фрагмент 5'-UTR, который включает последние 9 нуклеотидов 5'-UTR HCV, содержит последние 300 нуклеотидов 5'-UTR HCV.
В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения генная конструкция включает полную 5'-UTR HCV. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения генная конструкция включает 9 самых крайних 3'-нуклеотидов 5'-UTR HCV. Полная 5'-UTR HCV предпочтительного варианта осуществления изобретения приводится как послед. 4.
В соответствии с другими аспектами настоящего изобретения генная конструкция включает кодирующие последовательности, которые кодируют полноразмерный коровый белок HCV. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения генная конструкция кодирует "якорную" форму полноразмерного корового белка HCV. Закрепленный коровый белок является предпочтительным в некоторых вариантах осуществления изобретения по следующим причинам. Во-первых, полагают, что желательно правильно компартментализировать коровый белок в эндоплазматический ретикулум, где коровый белок обнаруживается в первую очередь в естественно инфицированных клетках. Если белок компартментализирован неправильно, существует опасность снижения общей экспрессии этого белка вследствие разрушения или отравления клетки. Далее, так как считается, что клеточная протеаза расщепляет закрепленный коровый белок до корового вирионного, оба вида могут присутствовать в клетках, экспрессирующих закрепленную форму. Если между двумя видами существуют различия в антигенности, экспрессией закрепленной формы полноразмерного корового белка потенциально генерируется более широкий иммунный ответ против ядра. Более того, дополнительные 18 аминокислот в закрепленном коровом белке могут содержать либо эпитопы для антител, либо эпитопы для цитотоксических Т-клеток, либо то и другое, экспрессия закрепленной формы обеспечивает присутствие этих областей, которые могут расширить иммунный ответ к коровому белку.
В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения генная конструкция кодирует полноразмерный коровый белок, который состоит из аминокислотной последовательности послед. 14 и послед. 15. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения генная конструкция содержит кодирующую последовательность в послед. 14.
В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения генная конструкция содержит послед. 14.
В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения используемый вектор выбирают среди векторов, описанных на фиг.2. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения в скелет А вставляют нуклеотиды 342-923 послед. 14, чтобы образовать плазмиду pHCV2-l. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения в скелет А вставляют нуклеотидную послед. 14, чтобы образовать плазмиду pHCV4-2.
В плазмидах pHCV2-l и pHCV4-2 кодирующая последовательность, кодирующая полноразмерный коровый белок HCV, находится под регуляторным контролем немедленно-раннего промотора CMV и SV-40-минорного сигнала полиаденилирования. Конструкции могут, необязательно, содержать точку начала репликации SV-40.
Регуляторные элементы, необходимые для генной экспрессии молекулы ДНК, включают промотор, инициирующий кодон, стоп-кодон и сигнал полиаденилирования. Кроме того, для экспрессии гена часто требуются энхансеры. Необходимо, чтобы эти элементы были операбельно соединены с последовательностью, которая кодирует слитый белок или полноразмерный коровый белок HCV, и чтобы регуляторные элементы являлись операбельными в организме индивидуума, которому они вводятся.
Вообще, считается, что инициирующие кодоны и стоп-кодоны являются частью нуклеотидной последовательности, которая кодирует слитый белок или полноразмерный коровый белок HCV.
Используемые промоторы и сигналы полиаденилирования должны быть функциональными в пределах клеток индивидуума. Для максимального продуцирования белка в конструкцию вводят регуляторные последовательности, которые можно выбрать среди последовательностей, которые вполне соответствуют экспрессии гена в клетках. Кроме того, могут быть выбраны кодоны, которые наиболее эффективно транскрибируются в клетке. Специалист в этой области техники может получить ДНК-конструкции, которые являются функциональными в клетках.
Примеры промоторов, пригодных для осуществления настоящего изобретения, особенно при получении генетической вакцины для людей, включают, но не ограничиваются перечисленными: промоторы из вируса 40 обезьян (SV40), промотор вируса опухоли молочной железы мышей (MMTV), вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), такой как промотор длинного концевого повтора (LTR) ВИЧ, вируса Молони, ALV, цитомегаловируса (CMV), такой как немедленно-ранний промотор CMV, вируса Эпштейна-Барр (EBV), вируса саркомы Рауса (RSV), а также промоторы из человеческих генов, такие как человеческий актин, человеческий миозин, человеческий гемоглобин, человеческий мышечный креатин и человеческий металлотионеин.
Примеры сигналов полиаденилирования, пригодных для осуществления настоящего изобретения, особенно при получении генетической вакцины для людей, включают, но не ограничиваются перечисленными: сигналы полиаденилирования SV-40 и сигналы полиаденилирования LTR. В частности, используют сигнал полиаденилирования SV-40, который присутствует в плазмиде рСЕР4 (Invitrogen, Сан-Диего, СА), упоминаемый как сигнал полиаденилирования SV-40.
Помимо регуляторных элементов, необходимых для экспрессии гена, в генную конструкцию также могут включаться другие элементы, к таким дополнительным элементам относятся энхансеры. Энхансер можно выбрать из группы, включающей, но не ограничивающейся перечисленными: человеческий актин, человеческий миозин, человеческий гемоглобин, человеческий мышечный креатин и вирусные энхансеры, такие как энхансеры из CMV, RSV и EBV.
Генные конструкции могут снабжаться точкой начала репликации млекопитающего, чтобы сохранить конструкцию вне хромосомы и продуцировать множество копий конструкции в клетке. Плазмиды pCEP4 и pREP4 от Invitrogen (Сан-Диего, СА) содержат точку начала репликации вируса Эпштейна-Барр и кодирующую область ядерного антигена EBNA-1, которая продуцирует высококопийную эписомальную репликацию без интеграции.
В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения используемую генную конструкцию выбирают среди векторов, показанных на фиг.2. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения нуклеотидную кодирующую последовательность, кодирующую слитый белок, вставляют в скелет А.
В экспрессирующих векторах настоящего изобретения нуклеотидная кодирующая последовательность, кодирующая слитый белок, находится под регуляторным контролем немедленно-раннего промотора CMV и минорного сигнала полиаденилирования SV-40. Конструкции могут содержать, необязательно, точку начала репликации SV-40.
Способы введения включают, но не ограничиваются перечисленными: внутримышечный, интраперитонеальный, интрадермальный, подкожный, внутривенный, внутриартериальный, внутриглазной и пероральный способ, а также трансдермальное введение или введение с помощью ингаляции или суппозитория. Предпочтительными способами введения являются внутримышечный, интраперитонеальный, интрадермальный и подкожная инъекция. Доставка генных конструкций, которые кодируют химерный белок HBV/HCV или полноразмерный коровый белок HCV, может создать защитные свойства слизистых оболочек у индивидуумов, иммунизированных посредством способа введения, при котором материал присутствует в тканях, связанных с мукозальным иммунитетом. Так, в некоторых примерах генную конструкцию доставляют посредством введения в щечный карман рта индивидуума.
Генные конструкции могут вводиться средствами, к которым относятся, но не ограничиваются перечисленными: традиционные шприцы, устройства для безыгольных инъекций или "бомбардирующие микрочастицами генные пушки" ("microprojectile bombardment gene guns"). С другой стороны, генную вакцину можно различными способами вводить в клетки, которые удалены из индивидуума. Такие способы включают, например, трансфекцию ех vivo, электропорацию, микроинъекцию и бомбардировку микрочастицами. После захвата клетками генной конструкции их реплантируют индивидууму. Предполагается, что индивидууму могут быть имплантированы другие неиммуногенные клетки, в которые включены генные конструкции, даже если вакцинированные клетки первоначально взяты от другого индивидуума.
В соответствии с некоторыми предпочтительными вариантами осуществления настоящего изобретения генную конструкцию вводят индивидууму, используя устройство для безыгольных инъекций. В соответствии с некоторыми предпочтительными вариантами осуществления настоящего изобретения генную конструкцию вводят индивидууму, одновременно интрадермально, подкожно и внутримышечно, используя устройство для безыгольных инъекций. Устройства для безыгольных инъекций хорошо известны и широко доступны. Специалист в этой области техники может, следуя данным здесь указаниям, использовать устройства для безыгольных инъекций для доставки генетического материала к клеткам индивидуума. Устройства для безыгольных инъекций хорошо подходят для доставки генетического материала в любую ткань. Они особенно пригодны для доставки генетического материала в клетки кожи и мышечные клетки. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения устройство для безыгольных инъекций может использоваться для продвижения жидкости, которая содержит молекулы ДНК, к поверхности кожи индивидуума. Жидкость продвигается с достаточной скоростью, такой, что после "соударения" с кожей жидкость пропитывает поверхность кожи, проходит в кожу и мышечную ткань под ней. Таким образом, генетический материал вводится одновременно интрадермально, подкожно и внутримышечно. В некоторых вариантах осуществления изобретения устройство для безыгольных инъекций может применяться для доставки генетического материала к тканям других органов, чтобы ввести молекулу нуклеиновой кислоты в клетки этого органа. Генетические вакцины по настоящему изобретению содержат от 1 нанограмма до 1000 микрограммов ДНК. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения вакцины содержат от 10 нанограммов до 800 микрограммов ДНК. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения вакцины содержат от 0,1 до 500 микрограммов ДНК. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения вакцины содержат от 1 до 350 микрограммов ДНК. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения вакцины содержат от 25 до 250 микрограммов ДНК. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения вакцины содержат около 100 микрограммов ДНК.
Генетические вакцины по настоящему изобретению составляются в соответствии со способом введения, который используют. Специалист в этой области техники может легко составить фармацевтическую композицию, которая содержит генную конструкцию. В некоторых случаях используют изотонический состав. Как правило, добавки для придания изотоничности могут включать хлорид натрия, декстрозу, маннит, сорбит и лактозу. В некоторых случаях предпочтительны такие изотонические растворы, как забуференный фосфатом физиологический раствор. К стабилизаторам относятся желатин и альбумин. В некоторых вариантах осуществления изобретения к составу добавляют сосудосуживающее средство. Фармацевтические препараты по настоящему изобретению относятся к стерильным и свободным от пирогенов.
Генные конструкции изобретения могут быть составлены или могут вводиться в сочетании со средствами, которые увеличивают поглощение и/или экспрессию генной конструкции клетками по сравнению с поглощением и/или экспрессией генной конструкции клетками, которые присутствуют, когда идентичную генетическую вакцину вводят в отсутствие таких средств. Такие средства и протоколы их введения в сочетании с генными конструкциями описаны в заявках на патент США, зарегистрированных 26 января 1993, регистрационный номер 08/008342, 11 марта 1993, регистрационный номер 08/029336, 21 сентября 1993, регистрационный номер 08/125012, заявке на международный патент, зарегистрированной 26 января 1994, регистрационный номер PCT/US94/00899, и в заявке на патент США, зарегистрированной 1 апреля 1994, регистрационный номер 08/221579, которые все включены в настоящее изобретение в качестве ссылок. Примерами таких средств являются СаРО4, декстран DEAE, анионогенные липиды; активные ферменты внеклеточного матрикса; сапонины; лектины; эстрогенные соединения и стероидные гормоны; низшие гидроксилированные алкилы; диметилсульфоксид (ДМСО); мочевина; и сложные эфиры, анилиды, амидины, уретаны бензойной кислоты и их гидрохлориды, такие как относящиеся к группе местных анестетиков. Кроме того, генные конструкции инкапсулируют или вводят в сочетании с липидными и поликатионными комплексами.
ПРИМЕРЫ
Пример 1. Конструирование и построение плазмид экспрессии HBV/HCV
Создают большой S НВ клон, содержащий полные последовательности рrе S1, pre S2 и S (adr-l). Нуклеотидные и аминокислотные последовательности гена pre Sl/pre S2/S изображаются в послед. 5. Коротко, 100 мкл сыворотки, полученной от пациента с хроническим гепатитом, связанным с HBV, инкубируют при 70oС в течение 3 часов в смеси с протеиназой К (100 мкг/мл), 0,5% ДСН, 5 мМ ЭДТК и 10 мМ трис-HCl, рН 8,0. Раствор экстрагируют фенол-хлороформом, и осаждают ДНК этанолом. Проводят реакцию ПЦР в 100 мкл смеси, содержащей 10 мкл образца сывороточной ДНК, 2,5 Е Taq-полимеразы (Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT), по 50 мкМ каждого дезоксинуклеозид-5'-трифосфата (dNTP) и 0,4 мкМ праймера HBs-3 5'-GGGTCACCATATTCTTGGGAA- 3' (послед. 6) и HBs-1 5'-GCAGCAAAGCCCAAAAGACCC-3' (послед. 7). Реакционная смесь проходит 35 реакционных циклов. Амплифицированную ДНК клонируют в векторе pCRТМ, используя набор для клонирования ТА (Invitrogen). Также создают клон HCV (ТН, генотип II) от пациента с хроническим инфекционным гепатитом С, как описано в работе Wakita, et al. , J. Biol. Chem., 1994, 269, 1405-1410, которая включена в настоящее изобретение в качестве ссылки.
Пример 1. Конструирование и построение плазмид экспрессии HBV/HCV
Создают большой S НВ клон, содержащий полные последовательности рrе S1, pre S2 и S (adr-l). Нуклеотидные и аминокислотные последовательности гена pre Sl/pre S2/S изображаются в послед. 5. Коротко, 100 мкл сыворотки, полученной от пациента с хроническим гепатитом, связанным с HBV, инкубируют при 70oС в течение 3 часов в смеси с протеиназой К (100 мкг/мл), 0,5% ДСН, 5 мМ ЭДТК и 10 мМ трис-HCl, рН 8,0. Раствор экстрагируют фенол-хлороформом, и осаждают ДНК этанолом. Проводят реакцию ПЦР в 100 мкл смеси, содержащей 10 мкл образца сывороточной ДНК, 2,5 Е Taq-полимеразы (Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT), по 50 мкМ каждого дезоксинуклеозид-5'-трифосфата (dNTP) и 0,4 мкМ праймера HBs-3 5'-GGGTCACCATATTCTTGGGAA- 3' (послед. 6) и HBs-1 5'-GCAGCAAAGCCCAAAAGACCC-3' (послед. 7). Реакционная смесь проходит 35 реакционных циклов. Амплифицированную ДНК клонируют в векторе pCRТМ, используя набор для клонирования ТА (Invitrogen). Также создают клон HCV (ТН, генотип II) от пациента с хроническим инфекционным гепатитом С, как описано в работе Wakita, et al. , J. Biol. Chem., 1994, 269, 1405-1410, которая включена в настоящее изобретение в качестве ссылки.
На фиг. 3 изображаются предпочтительные способы, применяемые для получения гибридных конструкций HCV/HBV. Первая стадия требует ПЦР-амплификации корового гена усеченного HCV. Коротко, 10 мкг ТН-ДНК амплифицируют RPCRP-1-праймером 5'-CGGGATCCATGAGCACGAATCCTAAACC-3' (послед. 8) и праймером 2C154XBA-R 5'-TCTCTAGATTACTAGCCATGCGCCAAGGCCCTGG-3' (послед. 9). Продукт ПЦР расщепляют BamHI и XbaI, и лигируют в вектор pcDNA3 (Invitrogen). Последние 20 аминокислот усеченного корового белка HCV прочно связывают с ER-мембраной. Учитывая эту информацию, в отношении секреции слитого белка, удаляют конечные 37 аминокислот полноразмерного корового белка HCV (аминокислоты со 155 по 191). Также получают другую плазмиду, кодирующую коровый ген укороченного или усеченного HCV (коровые аминокислоты HCV с 1 по 69), так как возможно, что слитые белки, содержащие коровые аминокислоты HCV с 1 по 154, будут слишком длинными, чтобы быть секретированными. Чтобы получить укороченную или усеченную HCV-конструкцию, амплифицированную ДНК расщепляют BamHI и NaeI и лигируют в сайт BamHI сайт EcoRI в векторе pcDNA3.
Наконец, осуществляют ПЦР НВs-продукта между праймером HBs-стоп-ВаmНI 5'-CATGGATCCAATGTATACCCAAAGACA-3' (послед. 10) и праймером Hind pSl 5'-AGACACAAGCTTATGGGAGGTTGGTCTTCCAAAC-3' (послед. 11) или праймером Kz Hind pS2 5'-AGACACAAGCTTGCCGCCATGCAGTGGAACT-3' (послед. 12). Амплифицированную ДНК расщепляют BamHI и HindIII, и лигируют в сайт BamHI - сайт HindIII вектора pcDNA3, который включает коровый ген HCV. Ген, кодирующий малый S, продуцируют путем расщепления продукта ПЦР среднего S (pre S2-S) Xho-I с последующей обработкой по Кленову. В последовательность обратного направления слитых конструкций pre-S2-S-HCV в праймер Kz Hind pS2 включают последовательность Козака (GCCGCCATG, послед. 13), и все это добавляют к конструкции preS2-S-HCV, поскольку конструкция preS2-S-HCV без последовательности Козака часто транслируется от кодона ATG гена НВs (малый S), а не от кодона ATG гена pre S2. Как показано на фиг.1, получают шесть гибридных конструкций. Осуществляют полный анализ последовательностей всех конструкций, и не обнаруживают мутаций, индуцированных ПЦР. Наконец, эти шесть HB-HCV вставок лигируют с сайтом Pvu-II вакцинного экспрессионного вектора.
Специалист в этой области техники, имеющий ДНК-последовательности, кодирующие усеченный коровый белок HCV, белок pre S1, белок pre S2 и белок S, может создать праймеры для получения любой из химерных генных конструкций настоящего изобретения. Кроме того, можно осуществить замещения нуклеотидных оснований без нарушения связывания праймеров. Кроме того, праймеры могут быть получены с эндонуклеазными сайтами для целей клонирования и лигирования, что известно специалистам в этой области техники. Таким образом, специалист в этой области техники может получить любую генную конструкцию настоящего изобретения посредством конструирования подходящих праймеров и осуществления ПЦР-амплификации. Продукты ПЦР лигируют в экспрессирующий вектор.
Плазмиды, содержащие нуклеотидную кодирующую последовательность для слитых белков HBV/HCV, описанных выше, содержат, каждая, нуклеотидную кодирующую область для слитого белка, размещенную под транскрипционным контролем промотора CMV и энхансерного элемента RSV.
Плазмидный скелет А имеет длину в 3969 пар оснований. Он содержит точку начала репликации PBR для репликации в E.coli. Он также содержит ген устойчивости к канамицину, так что плазмида может быть селектирована в E.coli. Вставки, такие как усеченный или полноразмерный коровый ген HCV, клонируют в полилинкерной области, которая размещает вставку между промотором и сигналом полиаденилирования, операбельно соединенными. Транскрипция клонированных вставок находится под контролем CMV-промоторного и RSV-энхансерного элементов. Сигнал полиаденилирования обеспечен присутствием сигнала SV-40 поли А, расположенного точно в 3' сайта клонирования.
Пример 2. Конструирование и построение экспрессионных пдазмид полноразмерного HCV
Для экспрессии закрепленного корового белка HCV конструируют обе плазмиды pHCV2-1 и pHCV4-2. Закрепленный коровый белок, клеточный предшественник корового вирионного белка, остается ассоциированным с мембраной за счет гидрофобных карбоксильных концов.
Для экспрессии закрепленного корового белка HCV конструируют обе плазмиды pHCV2-1 и pHCV4-2. Закрепленный коровый белок, клеточный предшественник корового вирионного белка, остается ассоциированным с мембраной за счет гидрофобных карбоксильных концов.
Каждая плазмидная конструкция содержит область, кодирующую полноразмерный коровый белок HCV, размещенную под транскрипционным контролем CMV-промотора и RSV-энхансерного элемента. Плазмида pHCV2-1 содержит 9-нуклеотидный фрагмент 5' UTR HCV, который включает 9 концевых 3'-нуклеотидов 5' UTR HCV. Плазмида pHCV4-2 отличается от плазмиды pHCV2-1 тем, что она также содержит полную 5'-UTR HCV.
Специфические для HCV последовательности амплифицируют полимеразной цепной реакцией (ПЦР), используя в качестве матрицы pUC-T7-HCVTH (HCV типа 2), и олигонуклеотиды в качестве праймеров ПЦР содержат последовательности 16, 17 и 18.
Праймеры 5'-ПЦР - послед. 16 и послед. 18 - содержат сайты NatI, а праймер 3'-ПЦР послед. 17 имеет сайт SalI. Три стоп-кодона создают в послед. 17. Послед. 18 и послед. 17 используют в качестве праймеров для генерации продукта ПЦР, который картируется от положения 1 до положения 810 генома HCV, и который содержит полную 5'-нетранслируемую область HCV и коровую кодирующую область.
Использование послед. 16 и послед. 18 в качестве праймеров дает, в результате, продукт ПЦР, картирующийся от положения 333 до положения 810 генома HCV. Этот продукт содержит последние 9 нуклеотидов 5'-нетранслируемой области HCV и полную коровую кодирующую область.
Оба продукта ПЦР расщепляют NatI и SalI (NED), очищают на геле и лигируют в сайты NatI-SalI плазмидного скелета А, показанного на фиг.2, и генерируют pHCV4-2 и pHCV2-l.
Плазмидный скелет А имеет длину в 3969 пар оснований. Он содержит точку начала репликации PBR для репликации в E.coli. Он также содержит ген устойчивости к канамицину, так что плазмида может быть селектирована в E.coll. Вставки, такие как полноразмерный коровый ген HCV, клонируют в полилинкерной области, которая размещает вставку между промотором и сигналом полиаденилирования, операбельно соединенными. Транскрипция клонированных вставок находится под контролем CMV-промоторного и RSV-энхансерного элементов. Сигнал полиаденилирования обеспечен присутствием сигнала SV-40 поли А, расположенного точно в 3' сайта клонирования.
Пример 3. Анализ экспрессии in vitro
Экспрессию полноразмерного корового белка HCV из pHCV2-1 и pHCV4-1 проверяют in vitro в клеточной линии рабдомиосаркомы (RD). Клетки котрансфектируют pHCV2-1 и описанной β-галактозидазной плазмидой pCMVB (Clontech), pHCV4-2 и pCMVB, плазмидным вектором и pCMVB, или псевдотрансфектируют. Все анализы проводят через 48 часов после трансфекции. Эффективность трансфекции определяют, измеряя специфическую активность β-галактозидазы в клеточных лизатах.
Экспрессию полноразмерного корового белка HCV из pHCV2-1 и pHCV4-1 проверяют in vitro в клеточной линии рабдомиосаркомы (RD). Клетки котрансфектируют pHCV2-1 и описанной β-галактозидазной плазмидой pCMVB (Clontech), pHCV4-2 и pCMVB, плазмидным вектором и pCMVB, или псевдотрансфектируют. Все анализы проводят через 48 часов после трансфекции. Эффективность трансфекции определяют, измеряя специфическую активность β-галактозидазы в клеточных лизатах.
Трансфецированные клетки анализируют посредством непрямой иммунофлуоресценции, используя в качестве первичных антител либо антикоровое моноклональное антитело, либо смешанные сыворотки от больных HCV. в качестве вторичных антител используют помеченный ФИТЦ антимышиный IgG (Sigma) и помеченный ФИТЦ античеловеческий IgG (Sigma) соответственно. Иммунное окрашивание заметно в клетках, которые трансфецированы либо pHCV2-l, либо pHCV4-2, но не в клетках, трансфецированных плазмидным вектором или псевдотрансфецированных. Иммунофлуоресценция в фиксированных клетках наблюдается в виде окрашенных пятен, локализованных в цитоплазме, когда в качестве источника первичного антитела используют либо моноклональное антитело, либо смешанные сыворотки пациентов. Оказывается, что нет различий в уровне окрашивания между клетками, трансфецированными pHCV2-l и pHCV4-2. He наблюдается окрашивания в нефиксированных клетках, что указывает, что экспрессированный коровый белок, вероятно, не ассоциирован с поверхностью клеточной мембраны.
Лизаты трансфецированных клеток также анализируют посредством Вестерн-блоттинга и иммунопреципитации. Оказывается, что присутствие или отсутствие 5'-UTR HCV имеет незначительное влияние на экспрессию корового белка, так как pHCV2-l и pHCV4-2 экспрессируют эквивалентные количества корового белка в проверяемых клеточных линиях.
Пример 4. Инокуляция ДНК
Гуморальный иммунитет в группе из шести мышей оценивают после однократной внутримышечной инокуляции 100 мкг pHCV4-2 с добавлением 0,25% бупивакаина. Установлено, что все мыши видоизменяют серологическую специфичность через 21 день после инокуляции ДНК. Гуморальная реакция устойчива в течение нескольких месяцев. В настоящее время исследования продолжаются в направлении оценки действия при многократном дозировании.
Гуморальный иммунитет в группе из шести мышей оценивают после однократной внутримышечной инокуляции 100 мкг pHCV4-2 с добавлением 0,25% бупивакаина. Установлено, что все мыши видоизменяют серологическую специфичность через 21 день после инокуляции ДНК. Гуморальная реакция устойчива в течение нескольких месяцев. В настоящее время исследования продолжаются в направлении оценки действия при многократном дозировании.
Такая вакцина на основе коровой ДНК HCV экспрессирует высокий уровень корового антигена in vitro и индуцирует сильную иммунную реакцию in vivo.
Claims (14)
1. Молекула рекомбинантной нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеотидную кодирующую последовательность, которая кодирует слитый белок, содержащий S-генный продукт вируса гепатита В, соединенный с аминокислотами 1-69 корового белка вируса гепатита С.
2. Молекула рекомбинантной нуклеиновой кислоты по п. 1, отличающаяся тем, что нуклеотидная кодирующая последовательность операбельно соединена с цитомегаловирусными промотором, энхансером вируса саркомы Рауса, последовательностью полиаденилирования и, необязательно, 5'-UTR вируса гепатита С.
3. Молекула рекомбинантной нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеотидную кодирующую последовательность, которая кодирует слитый белок, содержащий S-генный продукт вируса гепатита В, соединенный с аминокислотами (1-70)-(1-154) корового белка вируса гепатита С.
4. Молекула рекомбинантной нуклеиновой кислоты по п. 3, отличающаяся тем, что нуклеотидная кодирующая последовательность операбельно соединена с цитомегаловирусным промотором, энхансером вируса саркомы Рауса, последовательностью полиаденилирования и, необязательно, 5'-UTR вируса гепатита С.
5. Молекула рекомбинантной нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеотидную кодирующую последовательность, которая кодирует слитый белок, содержащий фрагмент рre S2-генного продукта вируса гепатита В, соединенный с S-генным продуктом вируса гепатита В, соединенным с аминокислотами 1-69 корового белка вируса гепатита С.
6. Молекула рекомбинантной нуклеиновой кислоты по п. 5, отличающаяся тем, что нуклеотидная кодирующая последовательность операбельно соединена с цитомегаловирусным промотором, энхансером вируса саркомы Рауса, последовательностью полиаденилирования и, необязательно, 5'-UTR вируса гепатита С.
7. Молекула рекомбинантной нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеотидную кодирующую последовательность, которая кодирует слитый белок, содержащий фрагмент pre S2-генного продукта вируса гепатита В, соединенный с S-генным продуктом вируса гепатита В, соединенным с аминокислотами (1-70)-(1-154) корового белка вируса гепатита С.
8. Молекула рекомбинантной нуклеиновой кислоты по п. 7, отличающаяся тем, что упомянутая нуклеотидная кодирующая последовательность операбельно соединена с цитомегаловирусным промотором, энхансером вируса саркомы Рауса, последовательностью полиаденилирования и, необязательно, 5'-UTR вируса гепатита С.
9. Молекула рекомбинантной нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеотидную кодирующую последовательность, которая кодирует слитый белок, содержащий фрагмент pre S1-генного продукта вируса гепатита В, соединенный с фрагментом pre S2-генного продукта вируса гепатита В, соединенным с S-генным продуктом вируса гепатита В, соединенным с аминокислотами 1-69 корового белка вируса гепатита С.
10. Молекула рекомбинантной нуклеиновой кислоты по п. 9, отличающаяся тем, что упомянутая нуклеотидная кодирующая последовательность операбельно соединена с цитомегаловирусным промотором, энхансером вируса саркомы Рауса, последовательностью полиаденилирования и, необязательно, 5'-UTR вируса гепатита С.
11. Молекула рекомбинантной нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеотидную кодирующую последовательность, которая кодирует слитый белок, содержащий фрагмент pre S1-генного продукта вируса гепатита В, соединенный с фрагментом pre S2-генного продукта вируса гепатита В, соединенным с S-генным продуктом вируса гепатита В, соединенным с аминокислотами (1-70)-(1-54) корового белка вируса гепатита С.
12. Молекула рекомбинантной нуклеиновой кислоты по п. 11, отличающаяся тем, что упомянутая нуклеотидная кодирующая последовательность операбельно соединена с цитомегаловирусным промотором, энхансером вируса саркомы Рауса, последовательностью полиаденилирования и, необязательно, 5'-UTR вируса гепатита С.
13. Композиция, вызывающая иммунный ответ против вируса гепатита С, содержащая: а) молекулу рекомбинантной нуклеиновой кислоты по любому из предшествующих пунктов, операбельно связанную с регуляторными элементами, функциональными в человеческих клетках, и б) фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.
14. Способ вызывания иммунного ответа против вируса гепатита С, заключающийся во введении эффективного количества молекулы рекомбинантной нуклеотидной последовательности по любому из пп. 1-12.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US08/318,248 | 1994-10-05 | ||
US46785995A | 1995-06-06 | 1995-06-06 | |
US08/467,859 | 1995-06-06 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU97107000A RU97107000A (ru) | 1999-05-10 |
RU2189254C2 true RU2189254C2 (ru) | 2002-09-20 |
Family
ID=23857451
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU97107000/14A RU2189254C2 (ru) | 1995-06-06 | 1995-10-05 | Вакцины против вирусов гепатита |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US6025341A (ru) |
RU (1) | RU2189254C2 (ru) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7078500B1 (en) * | 1998-01-30 | 2006-07-18 | The General Hospital Corporation | Genetic immunization with nonstructural proteins of hepatitis C virus |
CU22871A1 (es) * | 1998-12-02 | 2003-10-21 | Ct Ingenieria Genetica Biotech | Formulaciones conteniendo partículas semejantes a virus como inmunopotenciadores por vía mucosal |
US6887464B1 (en) * | 1999-02-02 | 2005-05-03 | Biocache Pharmaceuticals, Inc. | Advanced antigen presentation platform |
AU2977500A (en) * | 1999-02-02 | 2000-08-25 | Biocache Pharmaceuticals, Llc | Advanced antigen presentation platform |
Family Cites Families (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5196194A (en) * | 1979-05-24 | 1993-03-23 | The Regents Of The University Of California | Vaccines containing Hepatitis B S-protein |
US5204096A (en) * | 1984-03-07 | 1993-04-20 | New York Blood Center, Inc. | Pre-S gene coded peptide hepatitis B immunogens, vaccines, diagnostics, and synthetic lipid vesicle carriers |
EP0278940A3 (en) * | 1987-01-30 | 1988-12-07 | Smithkline Biologicals S.A. | Hepatitis b virus surface antigens and hybrid antigens containing them |
US5703055A (en) * | 1989-03-21 | 1997-12-30 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery |
EP0485209A1 (en) * | 1990-11-08 | 1992-05-13 | Immuno Japan Inc. | Non A, non B hepatitis virus related antigen, antibody detection systems, polynucleotides and polypeptides |
JPH0692996A (ja) * | 1991-12-28 | 1994-04-05 | Kunitada Shimotoono | C型肝炎ウィルス粒子を構成する蛋白質およびその発現 |
AU666176B2 (en) * | 1992-01-31 | 1996-02-01 | Abbott Laboratories | Mammalian expression systems for HCV proteins |
AU3610293A (en) * | 1992-02-04 | 1993-09-01 | Chiron Viagene, Inc. | Hepatitis therapeutics |
JPH06141870A (ja) * | 1992-03-12 | 1994-05-24 | Tokyo Met Gov Rinshiyou Igaku Sogo Kenkyusho | 非a非b型肝炎ウイルス抗原をコードするdna断片 |
DK0681483T3 (da) * | 1993-01-26 | 2005-11-21 | Univ Pennsylvania | Præparater og fremgangsmåder til administration af genetisk materiale |
US5593972A (en) * | 1993-01-26 | 1997-01-14 | The Wistar Institute | Genetic immunization |
-
1995
- 1995-10-05 RU RU97107000/14A patent/RU2189254C2/ru not_active IP Right Cessation
-
1997
- 1997-05-12 US US08/854,531 patent/US6025341A/en not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
ЖДАНОВ В.М. и др. Вирусные гепатиты. - М.: 1986, с.130-136. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US6025341A (en) | 2000-02-15 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Major et al. | DNA-based immunization with chimeric vectors for the induction of immune responses against the hepatitis C virus nucleocapsid | |
Lechmann et al. | Vaccine development for hepatitis C | |
US8071561B2 (en) | Immunogen platform | |
US6831169B2 (en) | Hepatitis C virus vaccine | |
Saito et al. | Plasmid DNA-based immunization for hepatitis C virus structural proteins: immune responses in mice | |
US7351413B2 (en) | Stabilized HBc chimer particles as immunogens for chronic hepatitis | |
Encke et al. | DNA vaccines | |
US20090214593A1 (en) | Immunogen platform | |
JP4647870B2 (ja) | Hbv/hcvウイルス様粒子 | |
RU2189254C2 (ru) | Вакцины против вирусов гепатита | |
EP0789563B1 (en) | Hepatitis virus b and c vaccines | |
AU746258B2 (en) | Genetic immunization with nonstructural proteins of hepatitis C virus | |
US20070032444A1 (en) | Genetic immunization with nonstructural proteins of hepatitis C virus | |
AU741876B2 (en) | Hepatitis virus vaccines | |
AU2298602A (en) | Hepatitis virus vaccines | |
SALARI et al. | Priming Hepatitis B Surface (HBsAg)-and Core Antigen (HBcAg)-Specific Immune Responses by Chimeric, HBcAg with a HBsAg ‘a’Determinant |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20041006 |