JP4647870B2 - Ｈｂｖ／ｈｃｖウイルス様粒子 - Google Patents

Description

【０００１】
（発明の技術分野）
本発明は、組換えワクチンの領域に関する。これは、ワクチン（特にＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）およびＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のための組み合わせワクチン）における使用のためのキメラ抗原およびウイルス様粒子の分野に特に関連する。
【０００２】
（発明の背景）
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は、世界人口の約１％に感染し、そして深刻な健康問題を生じる。急性的に感染した個体の７５％以上が、肝硬変、肝不全、および肝細胞癌を生じ得る慢性保有状態に最終的に進行する。非常に少数の慢性的に感染した患者は、自然にＨＣＶをクリアし、そして慢性肝炎を解消する。例えば、Ａｌｔｅｒら（１９９２）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２７；１８９９−１９０５；ＲｅｓｎｉｃｋおよびＫｏｆｆ（１９９３）Ａｒｃｈ．Ｉｎｔｅｍ．Ｍｅｄ．１５３：１６７２−１６７７；Ｓｅｅｆｆ（１９９５）Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ．Ｄｉｓ．６：２０−２７；Ｔｏｎｇら（１９９５）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３２：１４６３−１４６６を参照のこと。ＨＣＶ（Ｉｓｈｉｉら（１９９８）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２８：１１１７−１１２０）を含む、いくつかのフラビウイルス（例えば、Ｋｏｎｉｓｈｉら（１９９２）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８８：７１４−７２０を参照のこと）のＥ２糖タンパク質に対する免疫は、感染に対して保護し得る。しかし、組換えＨＣＶ Ｅ１およびＥ２糖タンパク質を発現する試みは、これらのタンパク質は、宿主細胞から分泌されず、小胞体内で保持されるという事実によって挫折してきた（Ｄｕｂｕｉｓｓｏｎら（１９９４）Ｊ．Ｖｒｏｌｏｇｙ ６８：６１４７−６１６０）。
【０００３】
試みられたＨＣＶおよび他のウイルスについてのワクチンを作製する１つのアプローチは、Ｂ型肝ウイルス炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）の異種抗原（例えば、ＨＣＶタンパク質の一部）との融合体からなるキメラ抗体を調製することである。例えば、Ｉｎｃｈａｕｓｐｅら（１９９８）Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄ．９２：１６２−１６８；Ｎａｋａｎｏら（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９７）７１：７１０１−７１０９；およびＩｎｃｈａｕｓｐｅら（１９９７）Ｖａｃｃｉｎ １５：８５３−８５６を参照のこと。ＨＢｓＡｇの使用は、ワクチンのような免疫原性組成物の生成のために魅力的である。なぜなら、ＨＢｓＡｇは高度に免疫原性であり、そしてウイルス様粒子の形態で培養細胞から分泌される（米国特許第５，０９８，７０４号）。ウイルスタンパク質の小さな部分をＨＢｓＡｇに導入する試みは、ウイルス様粒子の生成において成功した（例えば、Ｄｅｌｐｅｙｒｏｕｘら（１９９０）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６４：６０９０−６１００を参照のこと、彼らは、ポリオウイルスキャプシドタンパク質の１１アミノ酸セグメントをＨＢｓＡｇに挿入した）。しかし、１つの研究において、ＨＣＶ Ｅ２の異なった親水性ドメインと組み合わせたＨＢｓＡｇを含む６つの融合タンパク質のうちの２つのみが、ウイルス様粒子として培養液中に分泌された（Ｌｅｅら（１９９６）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．５０：１４５−１５１）。おそらくＥ２インサートが大きすぎたかまたは親水性であったためである。異種エピトープ部位のＨＢｓＡｇへの挿入部位は、重要な因子であり得る。ＨＢＶヌクレオキャプシドのエピトープ（ＨＢｓＡｇ）を種々の位置でＨＢｓＡｇに挿入した研究は、ＨＢｓＡｇの内部部位への挿入は、ＨＢｃＡｇについて免疫原性であるキメラタンパク質を生じたが、Ｃ末端での挿入は、弱く免疫原性であった（Ｓｃｈｏｄｅｌら（１９９２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６６：１０６−１１４）。Ｎ末端での挿入は、得られた粒子中のＨＢｃＡｇエピトープの表面アクセスを妨げ、そして非免疫原性（Ｉｄ）であった。明らかに、エピトープが提示される分子含有物は、免疫原性を決定する際に重要であり、おそらくタンパク質二次構造および三次構造の適切な変更のためである。この原理は、Ｅｃｋｈａｒｔら（（１９９６）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７７：２００１−２００８）によってさらに説明され、彼らは、ＨＩＶ−１ ｇｐ４１タンパク質の保存的な６つのアミノ酸エピトープをインフルエンザ赤血球凝集素に導入し、そして中性抗体を得たが、同じエピトープがＨＢｓＡｇに挿入された場合、中性抗体を産生し得なかった。より小さい単離されたエピトープは、免疫原性タンパク質の大きい部分よりもこのような効果に対してより感受性であるようである。
【０００４】
免疫における使用のためのウイルス様粒子中のＨＣＶの全体のＥ１またはＥ２糖タンパク質を発現する方法は現在利用可能でない。利用可能な方法は、ＨＢｓＡｇに依存したキメラタンパク質を、ごく小さいＥ２の単離されたドメインの挿入に限定し、これは、ネイティブな免疫原性構造を有し得るかまたは有し得ない。従って、ウイルス様粒子の免疫原性形態におけるＨＣＶ抗原を発現するために使用され得る方法および材料について、当該分野において必要性が残る。
【０００５】
（発明の要旨）
免疫原性組成物における使用のためのＨＢＶ／ＨＣＶキメラ抗原を提供することは、本発明の目的である。ＨＢＶ／ＨＣＶキメラ抗原を含むウイルス様粒子およびこのようなウイルス様粒子を生成するための方法および材料を提供することは、さらなる本発明の目的である。ＨＢＶ／ＨＣＶ組み合わせワクチンを提供することは、本発明の別の目的である。本発明のこれらおよび他の目的は、以下に記載される１つ以上の実施形態によって提供される。
【０００６】
本発明の１つの実施形態は、免疫原としてかまたはワクチンの成分としての使用のためのウイルス様粒子を提供することである。このウイルス様粒子は、第１のＨＢｓＡｇ（Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原）およびキメラ抗原を含む。このキメラ抗原は、ＨＣＶ免疫原性ポリペプチドに連結された第２のＨＢｓＡｇを含む。この第１および第２のＨＢｓＡｇの各々は、実質的に完全なＳドメインを含む。
【０００７】
本発明の別の実施形態は、免疫原性としてかまたはワクチンの成分としての使用のための別のウイルス様粒子を提供する。このウイルス様粒子は、第１のＨＢｓＡｇおよび第１および第２のキメラ抗原を含む。この第１のキメラ抗原は、ＨＣＶ Ｅ１糖タンパク質またはそのフラグメントを含む第１の免疫原性ポリペプチドに連結される第２のＨＢｓＡｇを含む。この第２のキメラ抗原は、ＨＣＶ Ｅ２糖タンパク質またはそのフラグメントを含む第２の免疫原性ポリペプチドに連結された第３のＨＢｓＡｇを含む。第１、第２、および第３のＨＢｓＡｇの各々は、実質的に完全なＳドメインを含む。
【０００８】
本発明のなお別の実施形態は、ＨＢｓＡｇの実質的に完全なＳドメインおよびポリペプチドを含む融合タンパク質を提供する。１つの融合タンパク質において、このポリペプチドは、（ａ）ＨＣＶ−１ポリタンパク質のアミノ酸残基１９２〜３３０、または（ｂ）他のＨＣＶ分離物の対応する残基、または（ｃ）（ａ）または（ｂ）に対して少なくとも約８０％の配列同一性を有する免疫原性配列を含む。別の融合タンパク質において、このポリペプチドは、（ａ）ＨＣＶ−１ポリタンパク質のアミノ酸残基３８４〜６６１、または（ｂ）他のＨＣＶ分離物の対応する残基、または（ｃ）（ａ）または（ｂ）に対して少なくとも約８０％の配列同一性を有する免疫原性配列を含む。
【０００９】
本発明のなお別の実施形態は、ＨＢｓＡｇの実質的に完全なＳドメインおよびポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする核酸分子を提供する。１つの融合タンパク質において、このポリペプチドは、（ａ）ＨＣＶ−１ポリタンパク質のアミノ酸残基１９２〜３３０、または（ｂ）他のＨＣＶ分離物の対応する残基、または（ｃ）（ａ）または（ｂ）に対して少なくとも約８０％の配列同一性を有する免疫原性配列を含む。別の融合タンパク質において、このポリペプチドは、（ａ）ＨＣＶ−１ポリタンパク質のアミノ酸残基３８４〜６６１、または（ｂ）他のＨＣＶ分離物の対応する残基、または（ｃ）（ａ）または（ｂ）に対して少なくとも約８０％の配列同一性を有する免疫原性配列を含む。これらの核酸分子は、免疫原性組成物の成分として使用され、これらは、さらなる実施形態である。
【００１０】
本発明の別の実施形態は、融合タンパク質をコードする核酸分子を含むベクターを提供する。これらの融合タンパク質は、ＨＢｓＡｇの実質的に完全なＳドメイン、およびＨＣＶ−１ポリタンパク質の免疫原性フラグメントを含むポリペプチドを含む。
【００１１】
本発明のさらなる実施形態は、ウイルス様粒子を生成する方法を提供する。細胞は、培養液中で培養され、それによって、この細胞は、第１のＨＢｓＡｇおよびキメラ抗原を含むウイルス様粒子を発現する。このキメラ抗原は、ＨＣＶ免疫原性ポリペプチドに連結された第２のＨＢｓＡｇを含む。第１および第２のＨＢｓＡｇの各々は、実質的に完全なＳドメインを含む。次いで、このウイルス様粒子は、培養液から単離される。
【００１２】
なお別の実施形態は、ウイルス様粒子を発現する細胞株を産生する方法である。細胞は、第１のＨＢｓＡｇおよびキメラ抗原を含むウイルス様粒子を発現するベクターでトランスフェクトされる。このキメラ抗原は、ＨＣＶ免疫原性ポリペプチドに連結された第２のＨＢｓＡｇを含む。第１および第２のＨＢｓＡｇの各々は、実質的に完全なＳドメインを含む。この細胞は培養され、ウイルス様粒子を発現する細胞株を産生する。
【００１３】
本発明のさらに他の実施形態は、ウイルス様粒子を発現する細胞株である。１つの細胞株において、このウイルス様粒子は、第１のＨＢｓＡｇおよびキメラ抗原を含む。このキメラ抗原は、ＨＣＶ免疫原性ポリペプチドに連結された第２のＨＢｓＡｇを含む。この第１および第２のＨＢｓＡｇの各々は、実質的に完全なＳドメインを含む。別の型の細胞株において、このウイルス様粒子は、第１のＨＢｓＡｇならびに第１および第２のキメラ抗原を含む。この第１のキメラ抗原は、ＨＣＶ Ｅ１糖タンパク質またはそのフラグメントを含む第１の免疫原性ポリペプチドに連結される第２のＨＢｓＡｇを含み、そして第２のキメラ抗原は、ＨＣＶ Ｅ２糖タンパク質またはそのフラグメントを含む第２の免疫原性ポリペプチドに連結される第３のＨＢｓＡｇを含む。第１、第２、および第３のＨＢｓＡｇの各々は、実質的に完全なＳドメインを含む。
【００１４】
従って、本発明は、ＨＢＶ／ＨＣＶ組み合わせワクチンの生成のための新規の方法および材料を用いる技術を提供する。
【００１５】
（発明の詳細な説明）
本発明を実施するために使用され得る標準的技術および手順の要約は以下である。この要約は、本発明についての制限ではないが、むしろ使用され得る例を提供する。しかし、必要とはされない。
【００１６】
本発明の実施は、示されない限り、当該分野の技術内である分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学の従来技術を使用する。このような技術は、以下の文献に全て説明される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ Ｌｏｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版（１９８９）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ、第Ｉ巻および第ｉｉ巻（Ｄ．Ｎ Ｇｌｏｖｅｒ編、１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８６）；ｔｈｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ｓｅｒｉｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）、特に第１５４巻および第１５５巻；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、１９８７、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ編、（１９８７）、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ）。
【００１７】
本明細書および添付された特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、内容が明確に指示されない限り、複数の対象を含むことに注意しなければならない。従って、例えば、参考として「ａｎ ａｎｔｉｇｅｎ」は、２以上の抗原の混合物などを含む。
【００１８】
ヌクレオチドおよびアミノ酸について標準的な略語が本明細書中で使用される。例えば、以下のアミノ酸の略語が、本文全体にわたって使用される：
アラニン：Ａｌａ（Ａ） アルギニン：Ａｒｇ（Ｒ）
アスパラギン：Ａｓｎ（Ｎ） アスパラギン酸：Ａｓｐ（Ｄ）
システイン；Ｃｙｓ（Ｃ） グルタミン：Ｇｌｕ（Ｇ）
グルタミン酸：Ｇｌｕ（Ｅ） グリシン：Ｇｌｙ（Ｇ）
ヒスチジン：Ｈｉｓ（Ｈ） イソロイシン：Ｉｌｅ（Ｉ）
ロイシン：Ｌｅｕ（Ｌ） リジン：Ｌｙｓ（Ｋ）
メチオニン：Ｍｅｔ（Ｍ） フェニルアラニン：Ｐｈｅ（Ｆ） プロリン：Ｐｒｏ（Ｐ） セリン：Ｓｅｒ（Ｓ）
スレオニン：Ｔｈｒ（Ｔ） トリプトファン：Ｔｒｐ（Ｗ）
チロシン：Ｔｙｒ（Ｙ） バリン：Ｖａｌ（Ｖ）
（Ｉ．定義）
本発明を記載する場合に、以下の用語が使用され、そして下記されるように定義されることが意図される。
【００１９】
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、本明細書中で相互に交換可能に使用され、アミノ酸残基の重合体を言い、そして最短の産物に限定されない。従って、ペプチド、オリゴペプチド、ダイマー、マルチマーなどは、この定義の中に含まれる。タンパク質全長およびこれらのフラグメントの両方が、この定義により包含される。この用語はまた、ポリペプチドの発現後の改変（例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化など）を含む。さらに、本発明の目的のために、「ポリペプチド」は、タンパク質が所望される活性を保持する限り、天然の配列への改変（例えば、欠失、付加および置換（一般的に、天然では保存的））を含むタンパク質を言う。これらの改変は、部位関連の変異原性のように意図的であり得るか、またはタンパク質もしくはＰＣＲ増幅に起因する誤りを生成する宿主の変異のように偶発的であり得る。
【００２０】
ＨＣＶポリペプチドは、上記に定義されたようなポリペプチドであり、ＨＣＶポリタンパク質に由来する。ＨＣＶは、３０００以上アミノ酸残基を有する単一のポリタンパク質をコードする（Ｃｈｏｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）２４４：３５９〜３６２；Ｃｈｏｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９１）８８：２４５１〜２４５５；Ｈａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９１）８８：１７１１〜１７１５）。ポリタンパク質は、翻訳と同時および翻訳後に、構造タンパク質および非構造（ＮＳ）タンパク質の両方にプロセスされる。
【００２１】
特に、いくつかのタンパク質は、ＨＣＶゲノムによりコードされる。ポリタンパク質の切断産物の順番および命名は以下のようである：ＮＨ₂−Ｃ−Ｅ１−Ｅ２−ＮＳ２−ＮＳ３−ＮＳ４ａ−ＮＳ４ｂ−ＮＳ５ａ−ＮＳ５ｂ−ＣＯＯＨ。ＨＣＶポリタンパク質の最初の切断は、３つの構造タンパク質（Ｎ末端ヌクレオカプシドタンパク質（用語「コア」）および２つのエンベロープ糖タンパク質（「Ｅ１」（Ｅとしても公知））および（「Ｅ２」（Ｅ２／ＮＳ１としても公知））、ならびにウイルスの酵素を含む非構造（ＮＳ）タンパク質を遊離する宿主プロテアーゼにより触媒される。ＮＳ領域は、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４およびＮＳ５と命名される。ＮＳ２は、タンパク質分解活性を有する不可欠な膜タンパク質である。ＮＳ２は、単独またはＮＳ３との組み合わせのいづれかで、ＮＳ２−ＮＳ３シスル（ｓｉｓｓｌｅ）結合を切断し、順番にＮＳ３Ｎ末端を生成し、そしてセリンプロテアーゼおよびＲＮＡヘリカーゼの両方の活性を含む巨大ポリタンパク質を放出する。ＮＳ３プロテアーゼは、残っているポリタンパク質をプロセスするのに役立つ。成熟ポリタンパク質の完成は、ＮＳ３−ＮＳ４ａの連結での自己触媒的切断によって開始され、ＮＳ３セリンプロテアーゼにより触媒される。次に続くＨＣＶポリタンパク質のＮＳ３媒介切断は、別のポリペプチドのＮＳ３分子によるポリタンパク質切断連結の認識に関連するようである。これらの反応において、ＮＳ３は、ＮＳ３補因子（ＮＳ４ａ）、未知の機能を有する２つのタンパク質（ＮＳ４ｂおよびＮＳ５ａ）、およびＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＮＳ５ｂ）を遊離する。これらのタンパク質の任意の１つ、およびこれらの免疫原性フラグメントは、被験体キメラ抗原を用いる使用を見出す。
【００２２】
キメラ抗原での使用のためのポリペプチドは、物理的にＨＣＶに由来する必要はないが、合成でまたは組換えで産生され得る。さらに、ポリペプチドは、種々のＨＣＶ種のいくつか（例えば、ＨＣＶの種１、２、３、または４）に由来し得る（以下にさらに記載される）。多数の保存領域および可変領域は、これらの種間で公知であり、一般的に、これらの領域に由来するエピトープのアミノ酸配列は、高度な配列相同性、例えば、２つの配列がアラインメントされた場合、アミノ酸配列の相同性は、３０％以上、好ましくは４０％以上、好ましくは５０％以上、好ましくは約７５％以上、より好ましくは約８０％〜８５％以上、好ましくは約９０％以上、および最も好ましくは少なくとも約９５％〜９８％の配列相同性、またはそれ以上の配列相同性を有する。従って、例えば、用語「Ｅ２」ポリペプチドは、以下にさらに定義されるように、任意の種々のＨＣＶ種、ならびにＥ２アナログ、ムテインおよび免疫原性フラグメント由来のネイティブＥ２タンパク質を言う。
【００２３】
用語「アナログ」および「ムテイン」は、所望の活性（例えば、本明細書中で記載されるような免疫学的活性）を保持する参照分子、またはこれらの誘導体のフラグメントの生物学的に活性な誘導体を言う。一般的に、用語「アナログ」は、ネイティブな分子に対して１以上のアミノ酸付加、置換（一般的に天然では保存的）、および／または欠失を有するネイティブなポリペプチド配列および構造を有する化合物を（この改変が免疫原活性を壊さない限り）言う。用語「ムテイン」は、１以上のペプチド模倣物（「ペプトイド（ｐｅｐｔｏｉｄ）」）を有するペプチドを言う（例えば、国際公開番号 ＷＯ９１／０４２８２に記載された）。好ましくは、アナログまたはムテインは、少なくともネイティブ分子と同じ免疫活性を有する。ポリペプチドアナログおよびムテインを作製する方法が、当該分野で公知であり、そして以下にさらに記載される。
【００２４】
特に好ましいアナログは、本質的に保存的な置換（すなわち、それらの側鎖に関連するアミノ酸のファミリー内に生じる置換）を含む。詳細には、アミノ酸は一般に、４つのファミリーに分割される：（１）酸性−アスパラギン酸、およびグルタミン酸；（２）塩基性−リジン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性−アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および（４）非荷電極性−グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、時々、芳香族アミノ酸としてまとめて分類される。例えば、ロイシンのイソロイシンまたはバリンでの孤立置換、アスパラギン酸のグルタミン酸での孤立置換、トレオニンのセリンでの孤立置換、またはアミノ酸の構造的に関連するアミノ酸での類似の置換が、生物学的活性に主要な効果を与えないことは合理的に予測可能である。例えば、目的のポリペプチドは、この分子の所望の機能がインタクトなままである限り、約５〜１０までの保存的もしくは非保存的アミノ酸置換、または約１５〜２５までの保存的もしくは非保存的アミノ酸置換でさえ、または５〜２５の間の任意の整数を含み得る。当業者は、当該分野で周知のＨｏｐｐ／ＷｏｏｄｓおよびＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅプロットを参照することにより、変化に耐え得る目的の分子の領域を容易に決定し得る。
【００２５】
「フラグメント」とは、インタクトな全長ポリペプチド配列および構造の一部のみからなるポリペプチドを意図する。このフラグメントは、ネイティブなポリペプチドのＣ末端欠失および／またはＮ末端欠失を含み得る。特定のＨＣＶタンパク質の「免疫原性フラグメント」は、全長分子の少なくとも約５〜１０連続するアミノ酸残基、好ましくは全長分子の少なくとも約１５〜２５連続するアミノ酸残基、およびより好ましくは全長分子の少なくとも２０〜５０連続するアミノ酸残基（エピトープを規定する）、または５アミノ酸と全長配列との間の任意の整数（ただし、この該当のフラグメントが、以下に規定されるような免疫応答を誘発する能力を保持する場合）を一般に含む。例えば、好ましい免疫原性フラグメントとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ＨＣＶコアのフラグメント（これは、例えば、ポリタンパク質のアミノ酸１０〜４５、１０〜５３、６７〜８８、８１〜１３０、８６〜１００、１２０〜１３０、１２１〜１３５および１２１〜１７０アミノ酸（Ｃｈｏｏら（１９９１）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８８：２４５１に示されたＨＣＶ−１配列に対して番号付けされた）、ならびにＨＣＶポリタンパク質のｃ３３領域由来の規定されたエピトープ、ならびにＨＣＶコア、Ｅ１、Ｅ２、ＮＳ３およびＮＳ４領域から同定された他の種々のエピトープのいずれか。例えば、Ｃｈｉｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９：１００１１〜１００１５；Ｃｈｉｅｎら、Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔ．Ｈｅｐａｔｏｌ．（１９９３）８：Ｓ３３〜３９；Ｃｈｉｅｎら、国際公開番号ＷＯ９３／００３６５；Ｃｈｉｅｎ，Ｄ．Ｙ．国際公開番号ＷＯ ９４／０１７７８；および米国特許第６，１５０，０８７号を参照のこと。Ｅ１およびＥ２ポリペプチドの代表的フラグメントとしては、これらの分子のＣ末端短縮改変体（例えば、アミノ酸３６９およびそれより下で終止するＥ１ポリペプチドなど、例えば、アミノ酸３５１、３５２、３５３などで終わるＥ１ポリペプチドなど、ならびに約アミノ酸７３０で終止するＥ２ポリペプチド、例えば、アミノ酸７１６、７１７、７１８などで終わるＥ２ポリペプチドなど）が挙げられる。これらの分子は、例えば、米国特許第６，１２１，０２０号に記載されている。
【００２６】
「抗原性決定基」とは、特定の抗体分子または特定の細胞表面レセプターが結合する、抗原またはハプテン上の部位をいう。
【００２７】
本明細書において用いる場合、用語「エピトープ」とは、少なくとも約３〜５、好ましくは約５〜１０または１５、そして約１，０００アミノ酸以下（またはそれらの間の任意の整数）の配列をいう。この用語は、それ自体でまたはより大きい配列の一部として配列を規定し、この配列は、抗原が提示された場合、宿主の免疫系を刺激して、細胞性の抗原特異的免疫応答を誘発するか、または体液性抗体応答を誘発する。本発明における使用のためのエピトープは、それが誘導される親のタンパク質の一部の正確な配列を有するポリペプチドには限定されない。実際、ウイルスゲノムは、定常流（ｃｏｎｓｔａｎｔ ｆｌｕｘ）の状態であり、そしていくつかの可変ドメイン（単離体の間で比較的高い程度の可変性を示す）を含む。従って、用語「エピトープ」は、ネイティブ配列に同一の配列、およびネイティブ配列に対する改変（例えば、欠失、付加および置換（一般に事実上は保存的））を包含する。
【００２８】
エピトープを含む所定のポリペプチドの領域は、当該分野で周知の多数のエピトープマッピング技術を用いて同定され得る。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（以下の）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第６６巻（Ｇｌｅｎｎ Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ編、１９９６）Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙを参照のこと。例えば、線状エピトープは、固体支持体上で多数のペプチド（このペプチドはこのタンパク質分子の部分に対応する）を同時に合成することによって、および（このペプチドがこの支持体上に結合したままで）このペプチドを抗体と反応させることによって、例えば、決定され得る。このような技術は、当該分野で公知であり、そして例えば、米国特許第４，７０８，８７１号；Ｇｅｙｓｅｎら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：３９９８〜４００２；Ｇｅｙｓｅｎら（１９８６）Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：７０９〜７１５に記載されている。同様に、コンフォメーションの（高次構造の）エピトープは、例えば、Ｘ線結晶学および２次元核磁気共鳴法などによって、アミノ酸の空間的コンフォメーションを決定することにより容易に同定される。例えば、前出のＥｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓを参照のこと。タンパク質の抗原性領域はまた、標準的抗原性プロットおよび疎水性親水性指標プロット（例えば、Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒｏｕｐから入手可能なＯｍｉｇａバージョン１．０ソフトウェアプログラムを用いて算出されたプロットなど）を用いて同定され得る。このコンピュータープログラムは、抗原性プロフィールを決定するため、Ｈｏｐｐ／Ｗｏｏｄｓ法（Ｈｏｐｐら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９８１）７８：３８２４〜３８２８）を、そして疎水性親水性指標プロットについては、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ技術（Ｋｙｔｅら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８２）１５７：１０５〜１３２）を、使用する。
【００２９】
本明細書において用いる場合、用語「コンフォメーション（高次構造、立体配置）エピトープ（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｅｐｉｔｏｐｅ）」とは、全長タンパク質の一部、またはそのアナログもしくはムテイン（全長の天然タンパク質内のエピトープをコードするアミノ酸配列に対してネイティブな構造的特徴を有する）をいう。ネイティブな構造的特徴とは、グリコシル化および３次元構造が挙げられるがこれらに限定されない。好ましくは、コンフォメーションエピトープは、組み換え的に産生され、そして所望される構造的特徴を保存する（例えば、エピトープの変性なし）条件下でそのエピトープが抽出され得る細胞において発現される。このような細胞としては、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞が挙げられる。ＨＣＶポリタンパク質由来の組み換えコンフォメーションエピトープの発現および単離は、例えば、国際公開番号ＷＯ ９６／０４３０１、ＷＯ９４／０１７７８、ＷＯ９５／３３０５３、ＷＯ９２／０８７３４に記載される。
【００３０】
本明細書において用いる場合、用語「Ｔ細胞エピトープ」とは、ペプチド構造または関連するハプテンに対してＴ細胞免疫を誘導し得るペプチド構築物の特徴をいう。Ｔ細胞エピトープは、一般に、ＭＨＣ分子のペプチド結合間隙（ｃｌｅｆｔ）内の拡張された高次構造（コンフォメーション）を想定する線状ペプチド決定基を含む（Ｕｎａｎｕｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８７）２３６：５５１〜５５７）。ＭＨＣクラスＩＩ関連線状ペプチド決定基（一般に５〜１４アミノ酸長）へのポリペプチドの変換は、「抗原プロセシング」と呼ばれ、抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって実行される。より詳細には、Ｔ細胞エピトープは、短いペプチド構造の局所的特徴（例えば、荷電および疎水性に関与する一次アミノ酸配列特異性）、および螺旋構造のような特定の型の二次構造（ポリペプチド全体の折り畳みに依存しない）によって規定される。さらに、ヘルパーＴ細胞によって認識し得る短いペプチドは、一般に疎水性側（ＭＨＣ分子との相互作用について）および親水性側（Ｔ細胞レセプターとの相互作用について）を含む両親媒性構造である（Ｍａｒｇａｌｉｔら、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔ−ｃｅｌｌ Ｅｐｉｔｏｐｅｓ，Ｎｅｗ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ Ｍａｒｃｅｌ−Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ，編、Ｇ．Ｃ．Ｗｏｏｄｒｏｗら（１９９０）１０９〜１１６頁）こと、そしてさらに、この両親媒性構造は、α螺旋構造を有する（例えば、Ｓｐｏｕｇｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８７）１３８：２０４〜２１２；Ｂｅｒｋｏｗｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８６）１３６：２４９８〜２５０３）ことが考えられる。
【００３１】
従って、Ｔ細胞エピトープを含むタンパク質のセグメントは、多くのコンピュータープログラムを用いて容易に推定され得る。（例えば、Ｍａｒｇａｌｉｔら、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔ−ｃｅｌｌ Ｅｐｉｔｏｐｅｓ，Ｎｅｗ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ Ｍａｒｃｅｌ−Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ，編、Ｇ．Ｃ．Ｗｏｏｄｒｏｗら（１９９０）１０９〜１１６頁を参照のこと）。このようなプログラムは、一般にペプチドのアミノ酸配列を、Ｔ細胞応答を誘導することが公知の配列と比較し、そしてＴ細胞エピトープに必要であると考えられるアミノ酸のパターンを検索する。
【００３２】
ポリペプチドまたは組成物に対する「免疫学的応答」は、目的の組成物中に存在する分子に対する体液性免疫応答および／または細胞性免疫応答の被験体における発生である。本発明の目的のためには、「体液性免疫応答」とは、抗体分子によって媒介される免疫応答をいい、一方、「細胞性免疫応答」は、Ｔリンパ球および／または他の白血球により媒介される応答である。細胞性免疫応答の１つの重要な局面は、細胞傷害性Ｔ細胞（「ＣＴＬ」）による抗原特異的応答を含む。ＣＴＬは、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）によりコードされるタンパク質と会合して提示され、そして細胞の表面に発現される、ペプチド抗原について特異性を有する。ＣＴＬは、細胞内マイクロプローブの細胞内破壊の誘導および促進、またはこのようなマイクロプローブに感染した細胞の溶解を補助する。細胞性免疫の別の局面は、ヘルパーＴ細胞による抗原特異的応答を含む。ヘルパーＴ細胞は、細胞の表面上でＭＨＣ分子と会合するペプチド抗原を提示する細胞に対する非特異的エフェクター細胞の機能の刺激を補助し、そしてその活性に集中するのを補助するように働く。「細胞免疫応答」はまた、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞から誘導されるものを含む、サイトカイン、ケモカインおよび他のこのような分子（活性化Ｔ細胞および／または他の白血球細胞により産生される）の産生をいう。
【００３３】
組成物（免疫原性組成物など）、またはワクチン（細胞性免疫応答を惹起する）は、細胞表面でＭＨＣ分子と会合した抗原の提示により脊椎動物被験体を感作するように働き得る。細胞媒介性免疫応答は、その表面で抗原を提示する細胞に、またはその近くに指向される。さらに、抗原特異的Ｔリンパ球が生成され、免疫された宿主の将来の防御を可能にし得る。
【００３４】
特定の抗原または組成物が細胞媒介性免疫応答を刺激する能力は、多数のアッセイによって、例えば、リンパ球増殖（リンパ球活性化）アッセイ、ＣＴＬ細胞傷害性アッセイによって、または感作された被験体における抗原に特異的なＴリンパ球をアッセイすることによって、決定され得る。このようなアッセイは、当該分野で周知である。例えば、Ｅｒｉｃｋｓｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９３）１５１：４１８９〜４１９９；Ｄｏｅら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）２４：２３６９〜２３７６；および以下の実施例を参照のこと。
【００３５】
従って、本明細書において用いる場合、免疫学的応答は、ＣＴＬの生成および／またはヘルパーＴ細胞の生成もしくは活性化を刺激する応答であり得る。目的の抗原はまた、抗体媒介性免疫応答を惹起し得る。従って、免疫学的応答は、以下の効果の１つ以上を含み得る：Ｂ細胞による抗体の生成；ならびに／または目的の組成物もしくはワクチンに存在する抗原（単数または複数）に対して特異的に指向されるサプレッサーＴ細胞および／もしくはγδＴ細胞の活性化。これらの応答は、感染性を中和し、そして／または抗体補体、または抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を媒介して、免疫された宿主に防御を提供するように働き得る。このような応答は、当該分野で周知の標準的免疫アッセイおよび中和アッセイを用いて決定され得る。
【００３６】
「免疫原性」ポリペプチドまたは組成物は、上記のような免疫原性応答を惹起するものである。
【００３７】
「組み換え」タンパク質は、所望の活性を保持し、そして上記のような組み換えＤＮＡ技術によって調製されたタンパク質である。一般に、目的の遺伝子は、クローニングされ、次いで以下にさらに記載するような、形質転換された生物体において発現される。この宿主生物体は、外来遺伝子を発現し、発現条件下でこのタンパク質を生成する。
【００３８】
「単離された」とは、ポリペプチドについて言及する場合、示された分子が、生物体全体から分離され個別にされていることを意味する。ここでは、この分子は、同じタイプの他の生物学的高分子の実質的に非存在下で、実質的に見出されるかまたは存在する。ポリヌクレオチドに関して、用語「単離された」は、以下の全体または一部が全くない、核酸分子である：そのポリヌクレオチドに天然に通常関連する配列；または配列が天然に存在する場合は、それに関連する異種配列を有する配列；または染色体から分離した分子。
【００３９】
「相同性」とは、２つのポリヌクレオチドの間、または２つのポリペプチド部分の間の同一性パーセントをいう。２つのＤＮＡ、または２つのポリペプチド配列は、この配列がこの分子の規定された長さにわたって、少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約８０％〜８５％、好ましくは少なくとも約９０％、そして最も好ましくは、少なくとも約９５％〜９８％の配列同一性を示す場合、お互いに対して「実質的に相同」である。本明細書において用いる場合、実質的に相同とは、また、特定のＤＮＡまたはポリペプチド配列に対して完全な同一性を示す配列をいう。
【００４０】
一般に、「同一性」とは、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の、それぞれ、正確なヌクレオチド対ヌクレオチド対応、またはアミノ酸対アミノ酸対応をいう。同一性パーセントは、配列を整列すること、２つの整列された配列の間の正確なマッチの数をカウントすること、より短い配列の長さで割ること、およびこれに１００を掛けることによる、２つの分子の間の配列情報の直接比較により決定され得る。容易に利用可能なコンピュータープログラムが、分析（例えば、ＡＬＩＧＮ、Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．（以下の中の）Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ編、補遺５、３：３５３〜３５８、Ｎａｔｉｏｎａｌ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ（これは、ペプチド分析のための、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ Ａｄｖａｎｃｅｓ（Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２〜４８９、１９８１）の局所相同性アルゴリズムに適合する））において補助するために用いられ得る。ヌクレオチド配列同一性を決定するためのプログラムは、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，バージョン８（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩから入手可能）例えば、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＧＡＰプログラム（これもＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズムによる）において利用可能である。これらのプログラムは、業者によって推奨される、そして上記のＷｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅにおいて記載されるデフォルトパラメーターを用いて容易に利用される。例えば、参照配列に対する特定のヌクレオチド配列の同一性パーセントは、デフォルトスコアリングテーブルおよび６ヌクレオチド位置のギャップペナルティーを用いるＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの相同性アルゴリズムを用いて決定され得る。
【００４１】
本発明の文脈においてパーセント同一性を確立するための別の方法は、Ｊｏｈｎ Ｆ．ＣｏｌｌｉｎｓおよびＳｈａｎｅ Ｓ．Ｓｔｕｒｒｏｋによって開発され、そしてＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）によって配布された、エジンバラ大学が著作権を有するプログラムのＭＰＳＲＣＨパッケージを用いることである。この一組のパッケージから、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムが使用され得る。ここではデフォルトパラメーターをスコアリングテーブルに用いる（例えば、ギャップオープンペナルティーは１２、ギャップ伸長ペナルティーは１、そしてギャップは６）。このデータから、生じた「マッチ（適合）」値は、「配列同一性」を反映する。配列の間の同一性パーセントまたは類似性を算出するために適切な他のプログラムは、一般に当該分野で公知である。例えば、別の整列プログラムは、ＢＬＡＳＴであり、デフォルトパラメーターとともに用いられる。例えば、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰは、以下のデフォルトパラメーターを用いて用いられ得る：遺伝子コード＝標準；フィルター＝なし；鎖＝両方；カットオフ＝６０；期待値＝１０；マトリックス（Ｍａｔｒｉｘ）＝ＢＬＯＳＵＭ６２；デスクリプション（Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ）＝５０、配列；ソートバイ（〜の順にソートする）（ｓｏｒｔ ｂｙ）＝ＨＩＧＨ ＳＣＯＲＥ；データベース＝非重複（ｎｏｎ−ｒｅｄｕｎｄａｎｔ），ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ翻訳＋Ｓｗｉｓｓタンパク質＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、以下のインターネットアドレスで見出され得る：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴ。
【００４２】
あるいは、相同性は、相同性領域の間で安定な二重鎖を形成する条件下でのポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション、続いて一本鎖特異的ヌクレアーゼでの消化、および消化したフラグメントのサイズ決定によって決定され得る。実質的に相同なＤＮＡ配列は、特定の系について規定されたような、例えば、ストリンジェントな条件下での、サザンハイブリダイゼーション実験において同定され得る。適切なハイブリダイゼーション条件を規定することは、当業者の範囲内である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ（前出）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（前出）を参照のこと。
【００４３】
「コード配列」または選択されたポリペプチドを「コードする」配列とは、適切な調節配列の制御下に配置された場合、インビトロまたはインビボで転写され（ＤＮＡの場合）、そしてポリペプチドに翻訳される（ｍＲＮＡの場合）、核酸分子である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドン、および３’（カルボキシ）末端の翻訳終止コドンによって決定される。転写終止配列は、コード配列の３’に配置され得る。
【００４４】
「作動可能に連結される」とは、このように記載される成分が、それらの望ましい機能を実行するように構成されるエレメントの配置をいう。従って、コード配列に作動可能に連結される所与のプロモーターが、適切な転写因子などが存在する場合、コード配列の発現を行い得る。プロモーターは、その発現を指向するように機能する限り、コード配列と連続である必要はない。従って、例えば、介在する翻訳されないが転写される配列は、プロモーター配列とコード配列との間に存在し得、これは、転写イントロンであり得、そしてプロモーター配列は、なお、コード配列に「作動可能に連結される」と考えられ得る。
【００４５】
「組換え体」は、核酸分子を記載するために本明細書中で使用される場合、その起源または操作によって、天然には関連していないポリヌクレオチドの全部または一部と関連していない、ゲノム、ｃＤＮＡ、ウイルス、半合成、または合成起源のポリヌクレオチドを意味する。用語「組換え体」は、タンパク質またはポリペプチドに関して使用される場合、組換えポリヌクレオチドの発現によって産生されるポリペプチドを意味する。一般的に、目的の遺伝子がクローン化され、次いで以下にさらに記載されるように、形質転換された生物において発現される。宿主生物は、発現条件下でタンパク質を産生するために外来遺伝子を発現する。
【００４６】
「制御エレメント」は、それが連結するコード配列の発現に役立つポリヌクレオチド配列をいう。この用語は、プロモーター、転写終結配列、上流調節ドメイン、ポリアデニル化シグナル、非翻訳領域（５’−ＵＴＲおよび３’−ＵＴＲを含む）、適切な場合、リーダー配列およびエンハンサー（宿主細胞においてコード配列の転写および翻訳を集合的に提供する）を含む。
【００４７】
「プロモーター」は、本明細書中で使用される場合、宿主細胞においてＲＮＡポリメラーゼに結合し得、そしてそれらに作動可能に連結される下流（３’方向）コード配列の転写を開始し得るＤＮＡ調節領域である。本発明の目的のために、プロモーター配列は、目的の遺伝子の転写をバックグラウンドよりも上の検出可能なレベルで開始するのに必要な塩基またはエレメントの最小数を含む。プロモーター配列内に、転写開始部位、そしてＲＮＡポリメラーゼの結合に責任のあるタンパク質結合部位（コンセンサス配列）がある。真核生物プロモーターは、しばしば、必ずではないが、「ＴＡＴＡ」ボックスおよび「ＣＡＴ」ボックスを含む。
【００４８】
制御配列は、ＲＮＡポリメラーゼがプロモーター配列に結合し、そしてコード配列をｍＲＮＡに転写し、次いで、このｍＲＮＡが、コード配列によってコードされるポリペプチドに翻訳される場合、細胞中のコード配列の「転写を指向する」。
【００４９】
「発現カセット」または「発現構築物」は、目的の配列または遺伝子の発現を指向させ得るアセンブリをいう。発現カセットは、上記のような制御エレメント（例えば、目的の配列または遺伝子に作動可能に連結する（その転写を指向する））プロモーターを含み、しばしば、ポリアデニル化配列もまた含む。本発明の特定の実施形態において、本明細書中に記載される発現カセットは、プラスミド構築物を含み得る。発現カセットの成分に加えて、プラスミド構築物はまた、１つ以上の選択マーカー、プラスミド構築物が単鎖ＤＮＡ（例えば、Ｍ１３複製起点）として存在し得るシグナル、少なくとも１つの複数クローニング部位、および「哺乳動物」複製起点（例えば、ＳＶ４０またはアデノウイルス複製起点）を含み得る。
【００５０】
「形質転換」は、本明細書中で使用される場合、挿入のために使用される方法に関わらない、宿主細胞への外来ポリヌクレオチドの挿入をいう。例えば、直接取り込み、トランスフェクションなどによる形質転換。トランスフェクションの特定の方法は、さらに以下を参照のこと。外来性ポリヌクレオチドは、非組み込みベクター（例えば、エピソーム）として維持され得るか、あるいは、宿主ゲノムに組み込まれ得る。
【００５１】
「宿主細胞」は、外来性ＤＮＡ配列によって形質転換されているかまたは形質転換し得る細胞である。
【００５２】
「核酸免疫化」とは、抗原のインビボ発現のために、１つ以上の選択された抗原をコードする核酸分子の宿主細胞への導入を意味する。核酸分子は、例えば、注入、吸引、経口投与、鼻腔内投与、および粘膜投与などによってレシピエントの被験体に直接導入され得るか、あるいは、エキソビボで宿主から取り除かれた細胞に導入され得る。後者の場合において、形質転換された細胞は、免疫応答がこの核酸分子によってコードされる抗原に対してマウントされ得る被験体に再導入される。
【００５３】
本明細書中で使用される場合、「処置」は、（ｉ）伝統的なワクチンにおけるような、感染または再感染の予防、（ｉｉ）症状の減少または除去および（ｉｉｉ）問題の病原体の実質的な除去または完全な除去のいずれかをいう。処置は、予防的（感染の前）または治療的に（感染に続いて）行われ得る。
【００５４】
「脊椎動物被験体」とは、ｓｕｂｐｈｙｌｕｍ ｃｏｒｄａｔａの任意のメンバーを意味し、これには、限定しないが、ヒトおよび他の霊長類動物（チンパンジーおよび他のサル（ａｐｅ、ｍｏｎｋｅｙ）種のような非ヒト霊長類動物を含む）；ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、およびウマのような家畜；イヌおよびネコのような家畜；マウス、ラット、およびモルモットのようなげっ歯類動物を含む実験動物；ニワトリ、シチメンチョウ、および他の家禽のトリ、アヒル、ガチョウなどのような飼いならされたトリ、野生のトリおよび狩猟鳥を含むトリが挙げられる。この用語は、特定の年齢を示さない。従って、成体の個体と新生仔の個体との両方がカバーされることを意図する。本明細書に記載される本発明は、上記脊椎動物種のいずれかにおける使用を意図する。なぜなら、これらの脊椎動物の全ての免疫系は、同様に作動するからである。
【００５５】
（ＩＩ．本発明を実行する形式）
本発明を詳細に記載する前に、本発明が、特定の処方物またはプロセスパラメーターに限定されないことが理解され、これらはもちろん変化し得る。本明細書中で使用される用語法は、本発明の特定の実施形態を記載するためのみにあり、限定することを意図しないことも理解される。
【００５６】
本明細書中に記載されるものに類似するかまたは等価な多くの組成物および方法が本発明の実施のために使用され得るが、好ましい材料および方法は、本明細書中に記載される。
【００５７】
上に記載されるように、ＨＢｓＡｇとＨＣＶタンパク質の部分を組み合わせるキメラ抗原は、ＨＢｓＡｇの強い抗原性に起因して弱い免疫原性のＨＣＶタンパク質の免疫系に対する提示を高める。ウイルス様の粒子は、代表的に、１つ以上のウイルスエンベロープタンパク質を組み込まれた膜エンベロープを含む。ウイルス様粒子は、ウイルスに感染した細胞または１つ以上のウイルスタンパク質をコードする核酸分子でトランスフェクトされた細胞によって分泌される。
【００５８】
ウイルス様粒子は、抗原提示の特に有利な形態である。ＨＢｓＡｇキメラを含むウイルス様粒子は、ＨＢｓＡｇ自身の高い抗原性の性質を、特定の調製物の表面における他の抗原の所望の提示と組み合わせる。
【００５９】
本発明は、免疫原性組成物（例えば、ワクチン）の産生のためにウイルス様粒子の形態でキメラＨＢＶ／ＨＣＶの産生を可能にする方法および材料を提供する。キメラ抗原を一緒に伴うＨＢｓＡｇの同時発現を使用して、ウイルス様粒子の形態でＨＢｓＡｇに融合されるＨＣＶエンベロープ糖タンパク質の大きなセグメントを含むことが現在可能である。このような粒子は、免疫原性組成物における使用に特に適切である。
【００６０】
ＨＢＶ／ＨＣＶウイルス様粒子を調製するための戦略は、最初に、粒子におけるディスプレイのための１つ以上のキメラ抗原の産生に依存する。このようなキメラ抗原は、ＨＢｓＡｇポリペプチド（本明細書において「ｓＡｇ」と呼ばれる）の実質的に完全なＳドメインおよび免疫原性ＨＣＶポリペプチドまたはそのフラグメントを含む融合タンパク質である。ＨＢｓＡｇのＳドメインまたは本発明の任意の他のポリペプチドは、Ｎ末端領域、Ｃ末端領域、またはポリペプチド内からの１つまたは数個のアミノ酸の少しの欠失を伴うかまたは伴わないポリペプチドのネイティブな配列を含む場合、「実質的に完全」である。例えば、ＨＢｓＡｇ Ｓドメインは、その抗原性またはウイルス様粒子の形成を引き起こす能力のいずれにも大きく影響しないで、数個のアミノ酸（すなわち、約３、５、７、または１０個のアミノ酸）だけ短縮され得る。任意の所望の長さのリンカー配列（好ましくは、数個以下のアミノ酸）は、融合タンパク質を形成するために一緒に結合されるポリペプチド間に加えられ得る。ＨＢｓＡｇのｐｒｅＳ２（形式的に、ｐｒｅＳと呼ばれる）またはｐｒｅＳ２とｐｒｅＳ１ドメインの両方のいずれかはまた、望ましい場合、ＨＢｓＡｇポリペプチドのアミノ末端において含まれ得る。
【００６１】
Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ，ｅｔ ａｌ．（１９８２）Ｎａｔｕｒｅ ２９８：３４７−３５０は、ＨｂｓＡｇの遺伝子を記載する。Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ，ｅｔ ａｌ．（１９７９）Ｎａｔｕｒｅ ２８０：８１５−８１９も参照のこと。ＨＢＶ表面から誘導されるタンパク質（例えば、表面抗原ｓＡｇ）ならびにプレ表面配列（ｐｒｅＳ１およびｐｒｅＳ２）、およびこれらの配列の任意の組み合わせは、適切な宿主細胞における発現のとき（例えば、哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母細胞、またはＸｅｎｏｐｕｓ細胞における発現のとき）自発的に粒子を形成し得る。従って、上で説明されるように、本発明における使用のためにＨＣＶ／ＨＢＶウイルス様粒子は、ｓＡｇ、ｐｒｅＳ１および／またはｐｒｅＳ２の粒子形成ポリペプチド、ならびにｓＡｇ／ｐｒｅＳ１、ｓＡｇ／ｐｒｅＳ２、およびｓＡｇ／ｐｒｅＳ１／ｐｒｅＳ２のような、上記の任意の組み合わせ由来の粒子形成ポリペプチドを含み得る。例えば、「ＨＢＶ Ｖａｃｃｉｎｅｓ−ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｔｏ ｌｉｃｅｎｓｅ：ａ ｃａｓｅ ｓｔｕｄｙ」、Ｍａｃｋｅｔｔ，Ｍ．ａｎｄ Ｗｉｌｌｉａｒｎｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．，Ｈｕｍａｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｎｄ Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ，ｐｐ．１５９−１７６（ＨＢＶ構造の議論について）；ならびに米国特許第４，７２２，８４０号、同第５，０９８，７０４、同第５，３２４，５１３号、同第５，９６５，１４０号、Ｂｅａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．（１９９５）６９：６８３３−６８３８、Ｂｉｍｂａｕｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．（１９９０）６４：３３１９−３３３０、Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．（１９９１）６５：５４５７−５４６４（種々のＨＢＶ粒子の組換え産生の記載について）を参照のこと。
【００６２】
ＨＣＶは、約９．５ｋｂの単一のオープンリーディングフレームを含むゲノムを有し、このオープンリーディングフレームは、ポリタンパク質に転写される。ＨＣＶポリタンパク質は、少なくとも１０個の異なる生成物（これらは、ＮＨ、−−コア−−Ｅ１−−Ｅ２−−ｐ７−−ＮＳ２−−ＮＳ３−−ＮＳ４ａ−−ＮＳ４ｂ−−ＮＳ５ａ−−ＮＳ５ｂ−−ＣＯＯＨである）を形成するように切断される。ＨＣＶ Ｅ１およびＥ２タンパク質は、翻訳後にグリコシル化される。ポリタンパク質の全長配列は、欧州公開番号第３８８，２３２号および米国特許第６，１５０，０８７号に開示される。さらに、上記ＨＣＶポリタンパク質生成物、およびそれらから誘導される免疫原性ポリペプチドについての配列は、公知である（例えば、米国特許第５，３５０，６７１号を参照のこと）。例えば、多くの一般的なおよび特異的な免疫原性のポリペプチド（ＨＣＶポリタンパク質から誘導される）が記載されている。例えば、Ｈｏｕｇｈｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，欧州公開番号第３１８，２１６号および同第３８８，２３２号；Ｃｈｏｏ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）２４４：３５９−３６２；Ｋｕｏ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）２４４：３６２−３６４；Ｈｏｕｇｈｔｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ（１９９１）１４：３８１−３８８；Ｃｈｉｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９：１００１１−１００１５；Ｃｈｉｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔ．Ｈｅｐａｔｏｌ．（１９９３）８：Ｓ３３−３９；Ｃｈｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，国際公開番号ＷＯ ９３／００３６５；Ｃｈｉｅｎ，Ｄ．Ｙ．，国際公開番号ＷＯ ９４／０１７７８を参照のこと。これらの刊行物は、一般的に、ＨＣＶについてそしてＨＣＶポリペプチド免疫原性試薬の製造および使用について、広範なバックグラウンドを提供する。
【００６３】
任意の望ましいＨＣＶポリペプチドは、例えば、ＨＣＶのＥ１および／またはＥ２エンベロープ糖タンパク質を含む、キメラ抗原の一部として利用され得る。Ｅ１糖タンパク質は、アミノ酸残基１９２〜３８３に対応し、そしてＥ２は、大部分のＨＣＶ株においておよそアミノ酸３８４〜アミノ酸７４６にわたる。Ｃｈｏｏ ｅｔ ａｌ（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：２４５１−２４５５を参照のこと。好ましいＥ１ポリペプチドは、ＨＣＶポリタンパク質の位置１９２〜３６０から任意のアミン酸残基で始まり、残基３８３までで３８３を含む任意の所望の長さにおよぶものである。好ましいＥ２ポリペプチドは、ＨＣＶポリタンパク質の位置３８４〜７２５から任意のアミン酸残基で始まり、残基７４６までで７４６を含む任意の所望の長さにおよぶものである。キメラ抗原に使用されるＥ１またはＥ２糖タンパク質のフラグメントは、好ましくは、エピトープ、ドメイン、または免疫原性である他の構造的ユニットを含むべきである。
【００６４】
キメラ抗原における使用のためのＥ１またはＥ２糖タンパク質あるいはそのフラグメントは、好ましくは、そのネイティブなコンフォメーションを保持するかまたは似ている。実質的にネイティブなコンフォメーションは、ＨＢｓＡｇを含む融合タンパク質においてＨＣＶポリペプチドに保持される場合、ＨＣＶポリペプチドに対して生成される抗体は、ＨＣＶにおける対応するポリペプチドを認識し結合する。
【００６５】
他のＨＣＶポリペプチドもまた、本発明のキメラ抗原に使用され得る。例えば、コア領域から誘導されるＨＣＶポリペプチド（例えば、アミノ酸１〜１９１；アミノ酸１０〜５３；アミノ酸１０〜４５；アミノ酸６７〜８８；アミノ酸８６〜１００；８１〜１３０；アミノ酸１２１〜１３５；アミノ酸１２０〜１３０；アミノ酸１２１〜１７０の間に見出される領域から誘導されるポリペプチド；ならびに例えば、Ｈｏｕｇｈｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，３５０，６７１号；Ｃｈｉｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９：１００１１−１００１５；Ｃｈｉｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔ．Ｈｅｐａｔｏｌ．（１９９３）８：Ｓ３３−３９；Ｃｈｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，国際公開番号ＷＯ ９３／００３６５；Ｃｈｉｅｎ，Ｄ．Ｙ．，国際公開番号ＷＯ ９４／０１７７８；および米国特許第６，１５０，０８７号に同定されるコアエピトープの任意）が、本発明のキメラ分子とともに用途を見出す。
【００６６】
さらに、ウイルスの非構造的領域から誘導されるポリペプチドはまた、本明細書中において用途を見出す。ＨＳＶポリタンパク質のＮＳ３／４ａ領域が、記載され、そしてこのタンパク質のアミノ酸配列および全体の構造が、Ｙａｏ ｅｔ ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １９９９）７：１３５３−１３６３に開示される。Ｄａｓｍａｈａｐａｔｒａ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，８４３，７５２号も参照のこと。上に説明されるように、ネイティブな配列または免疫原性アナログのいずれかが、本発明の処方物に使用され得る。Ｄａｓｍａｈａｐａｔｒａ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，８４３，７５２号およびＺｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，９９０，２７６号はともに、ＮＳ３／４ａのアナログおよびこれを作製する方法を記載する。
【００６７】
さらに、マルチエピトープ融合抗原（「ＭＥＦＡ」と呼ばれる）は、国際公開番号ＷＯ ９７／４４４６９に記載され、本発明のキメラにおいて使用され得る。このようなＭＥＦＡは、二つ以上の種々のウイルス領域誘導されるマルチエピトープを含む。エピトープは、好ましくは、１つより多くのＨＣＶ株由来であり、従って、単一のワクチンにおいてＨＣＶの複数の株に対して保護するさらなる能力を提供する。
【００６８】
さらに、本発明のキメラにおける使用のためのポリペプチドは、ＨＣＶポリタンパク質のＮＳ３領域から誘導され得る。多くのこのようなポリペプチド（限定しないが、ｃ３３ｃおよびｃ１００領域から誘導されるポリペプチド）ならびにｃ２５のようなＮＳ３エピトープを含む融合タンパク質が公知である。これらおよび他のＮＳ３ポリペプチドは、本発明の組成物に有用であり、当該分野において公知であり、そして例えば、Ｈｏｕｇｈｔｏｎ ｅｔ ａｌ，米国特許第５，３５０，６７１号；Ｃｈｉｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９：１００１１−１００１５；Ｃｈｉｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔ．Ｈｅｐａｔｏｌ．（１９９３）８：Ｓ３３−３９；Ｃｈｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，国際公開番号ＷＯ ９３／００３６５；Ｃｈｉｅｎ，Ｄ．Ｙ．，国際公開番号ＷＯ ９４／０１７７８；および米国特許第６，１５０，０８７号に記載される。
【００６９】
多くのＨＣＶポリペプチドは、問題のＨＣＶに対する免疫応答を提供するために、本発明のキメラ分子において使用され得るか、またはそれらとともに同時投与され得ることが容易に明かである。
【００７０】
上で説明されるように、ＨＣＶ抗原は、それらの全体またはその免疫原性フラグメントに使用され得、そして免疫原性改変体は、当該分野で利用可能な標準的な技術を使用して、適切なリーディングフレームにおいて、所望のポリペプチド配列をコードする遺伝子配列に融合によってキメラ抗原を形成するためにＨＢｓＡｇポリペプチドと組み合わせられ得る。従って、本発明における使用について記載されるＨＢＶまたはＨＣＶポリペプチドは、欠失、挿入、または保存的アミノ酸置換によって改変されるが、但し、実質的にネイティブなコンフォメーションが免疫原としての使用のために意図されるＨＣＶエピトープに保持される。好ましくは、ＨＣＶポリペプチドまたはポリペプチドのフラグメントは、ＨＢｓＡｇを有する融合タンパク質において発現される場合、それが誘導されるＨＣＶタンパク質の対応する部分のネイティブなコンフォメーション（すなわち、成熟ＨＣＶビリオンに存在するおよそのコンフォメーション）を実質的に保持するように選択される。
【００７１】
便宜上、種々のＨＣＶ領域は、Ｃｈｏｏら（１９９１）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８８：２４５１に記載されるように、ＨＣＶ−１ａの遺伝子によってコードされたポリペプチドに対する核酸の数に関して一般に規定されることに注意されるべきであり、イニシエーターメチオニンが、位置１と命名される。しかし、本発明での使用のためのポリペプチドは、ＨＣＶ−１ａ配列から誘導されるポリペプチドに限定されない。ＨＣＶの任意の株または単離体は、本発明での使用のために抗原配列を提供するために基礎として役立ち得る。これに関連して、別のＨＣＶ単離体中での対応する領域は、配列を最大配列にもたらす様式で、２つの単離体から配列を整列化することで容易に決定され得る。
【００７２】
ＨＣＶの種々の株または単離体は、当該分野で公知であり、これは、ヌクレオチドとアミノ酸配列での変化によって互いに異なる。例えば、単離体ＨＣＶＪ１．１は、Ｋｕｂｏら（１９８９）Ｊａｐａｎ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：１０３６７−１０３７２；Ｔａｋｅｕｃｈｉら（１９９０）Ｇｅｎｅ ９１：２８７−２９１；Ｔａｋｅｕｃｈｉら（１９９０）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．およびＴａｋｅｕｃｈｉら（１９９０）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １８：４６２６に記載される。２つの独立した単離体ＨＣＶ−ＪおよびＢＫの完全コード配列は、それぞれ、Ｋａｔｏｅｔら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：９５２４−９５２８およびＴａｋａｍｉｚａｗａら，（１９９１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：１１０５−１１１３に記載される。ＨＣＶ−１単離体は、Ｃｈｏｏら（１９９０）Ｂｒｉｔ．Ｍｅｄ．Ｂｕｌｌ．４６：４２３−４４１；Ｃｈｏｏら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：２４５１−２４５５およびＨａｎ ら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１７１１−１７１５によって記載される。ＨＣＶ単離体ＨＣ−Ｊ１およびＨＣ−Ｊ４は、Ｏｋａｍｏｔｏら（１９９１）Ｊａｐａｎ Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ ６０．１６７−１７７に記載されている。ＨＣＶ単離体（ＨＣＴ１８〜、ＨＣＴ２３，Ｔｈ、ＨＣＴ２７、ＥＣ１およびＥＣ１０）は、Ｗｅｉｎｅｒら（１９９１）Ｖｉｒｏｌ．１８０：８４２−８４８に記載される。ＨＣＶ単離体（Ｐｔ−１、ＨＣＶ−Ｋ１０およびＨＣＶ−Ｋ２）は、Ｅｎｏｍｏｔｏら（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７０：１０２１に記載される。ＨＣＶ単離体Ａ，Ｃ，Ｄ ＆ Ｅは、Ｔｓｕｋ¡ｙａｍａ−Ｋｏｈａｒａら（１９９１）Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ ５：２４３に記載されている。
【００７３】
本発明の核酸分子またはベクターにおける使用のための、天然に存在するＨＣＶポリペプチドのコード配列は、いずれかの上記で引用されたＨＣＶの株から、または感染した患者の組織または流体から単離された、新しく発見された単離体から得られ得る。本発明のキメラ抗体での使用のための異なるＨＣＶ株由来のＨＣＶポリペプチドまたはそれらのフラグメントの選択において、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列は、菌株間の最大重複ついて整列化されることが好ましい。これは、例えば、菌株間の最大の可能な重複が、キメラ抗体内に取り込むために配列を選択する前に得られるように、アミノ酸の挿入または欠失ついて補正することによって達成される。本明細書中に記載される配列が別のＨＣＶ株から選択される場合、好ましくは、対応する配列（すなわち、開示された配列の可能な最大数で同定されるように整列化される配列）が、選択される。天然に存在しない改変配列がまた、使用され得る。本発明に従う「核酸分子」は、ＤＮＡもしくはＲＮＡ（一本鎖もしくは二本鎖のいずれか）のような任意の核酸、または本発明の融合タンパク質もしくはその一部、または任意のＨＢｓＡｇもしくはその一部をコードする任意のアナログもしくはその化学的誘導体であり得る。
【００７４】
本発明の核酸分子は、発現ベクターにクローニングされ、そして例えば、細菌、酵母、植物、昆虫、または哺乳動物細胞にトランスフェクトされ得、その結果、本発明のキメラ抗原およびウイルス様粒子が、細胞培養において発現され、そして単離され得る。核酸分子が、プラスミド（例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ、ＣｏｌＥ１）、もしくは関連するプラスミド（例えば、ｐＣＭＶ６）（例えば、米国特許第５，６８８，６８８を参照のこと）またはそれらから誘導されたプラスミド中に含まれ得る。核酸分子はまた、アデノウイルス、Ｓｉｎｄｂｉｓウイルス、シミアンウイルス４０、サイトメガロウイル、ならびにレトロウイルス（例えば、マウス肉腫ウイルス、マウス乳腺癌ウイルス、モロニーネズミ白血病、およびラウス肉腫ウイルウイルス）由来の任意のベクターのようなウイルスベクター内に含まれ得る。細菌ベクター（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｓｐ．、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐｐ．、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔｒａｉｎ ＢＣＧ、およびＬｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）がまた、使用され得る。ミニ染色体（例えば、ＭＣおよびＭＣ１、バクテリオファージ、コスミド、およびレプリコン）が、十分使用され得る。
【００７５】
任意の適切な発現ベクターは、本発明のＨＢｓＡｇまたは任意のキメラ抗原の任意の形態を発現するために構築または利用され得る。好ましいベクターは、ｐＣＭＶＩＩ（哺乳動物での発現のために設計されたｐＵＣ１９−ベースクローニングベクター）である。ｐＣＭＶＩＩは、以下の要素を含む：ヒトＣＭＶ ＩＥエンハンサー／プロモーター、ヒトＣＭＶイントロンＡ、ヒト組織プラスミノゲン活性薬（ｔＰＡ）リーダー、ウシ成長ホルモンポリＡターミネーター（ＢＧＨｔ）、リプリコンのＣｏｌＥ１起点、およびＡｍｐ Ｒ アンプリコン抵抗遺伝子（図１Ａおよび１Ｂ−１Ｆ、配列番号１）。ｐＣＭＶＩＩ−ｐＳ２−ｓＡｇは、ｐｒｅＳ２−ＨＢｓＡｇの発現のために使用され得る（図２Ａおよび２Ｂ−２Ｉ、配列番号２および３）。ｐＣＭＶＩＩ−ｐＳ２−ｓＡｇにおいて、ｐｒｅＳ２およびＨＢｓＡｇのＳドメインのコード配列は、ＣＭＶイントロンＡとＢＧＴｔとの間のｐＣＭＶＩＩに挿入された：このベクターはまた、ｐｒｅＳ１ドメインのコード配列を添加することによって、またはｐｒｅＳ２ドメインを取り除くことによって改変され得る。ＨＢｓＡｇをＨＣＶタンパク質のエピトープと共に含むキメラ抗原は、ｐＣＭＶＩＩ ｏｐｔｉ ３３０Ｅ１／ｓＡｇ（図３Ａおよび３Ｂ−３Ｉ、配列番号４および５）またはｐＣＭＶＩＩ−Ｅ２６６１−ｓＡｇ（図４Ａおよび４Ｂ−４Ｆ、配列番号６および７）と同様に構築され得る。これらのベクターは、例として提供され、そして本発明の範囲を限定することを意図しない。インサートコードＨＢｓＡｇまたはキメラ抗体を含む、単離されかつ精製されたｐＣＭＶＩＩベクターは、使用の前に、滅菌０．９％生理食塩水緩衝液または別の適切な緩衝液に溶解され得る。
【００７６】
免疫原として使用するためのキメラ抗原の発現は、発現ベクターを用いる真核生物細胞のトランスフェクションを必要とする。任意の適切な真核細胞株は、例えば、ＣＨＯ細胞ＣＯＳ細胞を使用し得る。キメラ抗原をコードする核酸分子は、トランスフェクションに適切なベクター（例えば、プラスミドベクターまたはウイルスベクター）に取り込まれ得る。ウイルスベクターが使用される場合、好ましくは、ワクチンの調製において感染性ウイルスとの汚染の危険性を最小にするように、不完全非感染性ウイルス粒子を産生する。
【００７７】
トランスフェクションは、任意の公知の方法によって実施され得、そして過渡的なトランスフェクションまたは安定的なトランスフェクションのいずれかが得られ得る。適切なトランスフェクションは、ＨＢＶ／ＨＣＶウイルス様粒子を産生する細胞株を構築するのに好ましい。安定的なトランスフェクションを得るための方法としては、例えば、自発的に安定的なトランスフェクタントの選択、不死化遺伝子でのトランスフェクション（例えば、Ｋａｔａｋｕｒａら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．（１９９８）５７：６９−９１を参照のこと）、ならびにヒグロマイシンＢおよびネオマイシンのような抗生物質に対する耐性を与える遺伝子の選択が挙げられる。ＣＨＯ細胞の好ましい方法としては、メトトレキレートを使用する導入遺伝子の増幅後に、ジヒドロ葉酸レダクターゼでトランスフェクトされた細胞の選択が挙げられる（Ｗｕｒｍら、Ａｍｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９６）７８２：７０−７８を参照のこと）。
【００７８】
ＨＢｓＡｇを用いたキメラ抗原の同時発現は、ウイルス様粒子の形成および分泌において得られる。ウイルス様粒子の最適分泌は、キメラ抗原の発現に関連するＨＢｓＡｇの発現の十分な量を必要とし、そしてＨｂｓＡｇのより高度の量は、一般に、キメラ抗原分泌の効果を一般に改善する。ウイルス様粒子としてキメラ抗原の分泌は、キメラ抗体のコード配列に対するＨＢｓＡｇのコード配列の比を変化させることで最適化され得る。一般に、ウイルス様粒子の有用な分泌は、約１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、７：１、１０：１、２０：１、３０：１、４０：１、５０：１、または１００：１のＨＢｓＡｇコード配列：キメラ抗原コード配列の比で得られる。１：１未満の比は、キメラ抗原を含むウイルス様粒子の減少した収率を提供する一方で、１００：１より大きな高い比率は、キメラ抗原を希釈させ、そして最終的に、ＨＢｓＡｇでのキメラ抗原の希釈のために、粒子の有用性を減少させる。
【００７９】
本発明のベクターで宿主細胞をトランスフェクトするための一つの戦略は、ウイルス様粒子のインビトロ産生または核酸ワクチンを使用する宿主有機体の免疫化のいずれかのために、２以上の別々のベクター、キメラ抗原を各々コードし、これにより、ＨＢｓＡｇをコードする一つのベクター、およびそれぞれキメラ抗体をコードする一つ以上のベクターを提供する。別の戦略は、ＨＢｓＡｇおよび１以上のキメラ抗体の両方を単一構築物中に含むことである。例えば、単一のオープンリーディングフレームを有する発現ベクターは、プロモーターの制御下で、ＨＢｓＡｇのコード配列を有し、続いて、内部リボソーム全部位によって、各々先行される１以上のキメラ抗原をコードする配列を有する（ＩＲＥＳ、例えば、Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｓａｌａｓ（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０：４５８−４６４を参照のこと）。従って、本発明は、単一のウイルス様粒子中に、単一の免疫原ポリペプチドまたは複数の別の免疫原ポリペプチドのいずれかの使用を含む。必要に応じて、免疫原ポリペプチドの発現は、トランスフェクトされた細胞中に導入された活性剤に応答する、発現ベクター中のプロモーターおよび／またはエンハンサー配列を有することによって調節され得る。
【００８０】
ＨＢｓＡｇと共にキメラＨＢＶ／ＨＣＶを発現するプラスミドまたはウイルスベクターを用いてトランスフェクトされた細胞は、各抗原が、ウイルス様粒子の形態において発現されて、そして分泌されるかどうかを決定するために分析され得る。任意の標準的な免疫アッセイを使用して、ＨＢＶおよびＨＣＶを検出し得、このアッセイとしては、例えば、化学ルミネセンスアッセイ（例えば、Ｍａｇｉｃ Ｌｉｔｅ ａｓｓａｙ ｉｎ Ｅｘａｍｐｌｅｓ １−４；Ｗｏｏｄｈｅａｄ，Ｊ．Ｓ．およびＷｅｅｋｓ，Ｉ．（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌｕｍｉｎ．Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎ．４：６１１−１４を参照のこと）、ＥＬＩＳＡ、および放射免疫アッセイが挙げられる。抗原が、培養中にトランスフェクトされた細胞によって産生される場合、抗原の培養培地中への分泌の量は、培養培地中での抗原の量を、溶解細胞中に残存量を有する培養培地中の抗原の量と比較することによって確認され得る。ウイルス様粒子の存在は、培養培地から密度勾配（例えば、スクロース密度勾配）へのこのような粒子の沈降によって確認され得る（実施例１−３を参照のこと）。
【００８１】
哺乳動物細胞中の発現が好ましいが、他のシステムがまた使用されて、本発明のウイルス様粒子を発現するために使用され得る。例えば、酵母細胞培養が使用され得（例えば、米国特許第５，０９８，７０４号を参照のこと）、この場合において、ウイルス様粒子は、ガラスビーズとの攪拌または別の適切な方法を使用して、細胞を分裂させることによって回収され得る。
【００８２】
一般に、本発明のタンパク質は、天然で会合し、発現宿主中で粒子を形成する。液体膜コートを有する、この粒子は、包まれ得、これは、ウイルスでコードされた膜タンパク質を含んでも、含まなくてもよい。あるいは、この粒子は、液体膜を含み得ないか、またはこの膜が、最初に存在してもよく、全部または一部取り除かれてもよい。米国特許第４，７２２，８４０号および５，９６５，１４０号は、非相同ポリペプチドに融合される、ウイルス由来の構造タンパク質の粒子形成フラグメント（例えば、Ｂ型肝炎（ＨＢＳ）表面抗原（ＨＢｓＡｇ）のフラグメントの粒子形成フラグメント）からなるハイブリッド粒子を記載する。
【００８３】
ＨＢＶ／ＨＣＶウイルス様粒子は、培養培地または細胞懸濁から回収した後、および免疫原組成物中で使用される前に精製され得る。周囲タンパク質、液体、核酸、膜、インタクトな細胞などからウイルス様粒子またはウイルスを分離する、公知の任意の方法が、使用され得る。親和性クロマトグラフィー方法が、特に好ましい；例えば、ＧＢｓＡｇに特異的な免疫化モノクローナル抗体が使用され得る。さらに安定な方法は、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、および密度勾配共沈である。キメラウイルス様粒子を単離するための方法は、米国特許第４，７２２，８４０号および同第５，９６５，１４０号に記載される。
【００８４】
本発明の任意の組成物（例えば、融合タンパク質、ウイルス様粒子、または核酸分子）は、「免疫原組成物」といして使用され得る。免疫原組成物は、好ましくは、投与される動物において、上記に規定されるように免疫応答（例えば、抗体応答またはＴ細胞応答）が生じる。本発明の免疫原組成物（例えば、１以上の免疫原に対して免疫応答を生じる免疫原組成物）としては、ワクチンまたはワクチンの組合せがあり得るが、これに限定されない。さらに、本発明のキメラタンパク質は、「抗原組成物」（例えば、特定の抗体分子または特定の細胞表面レセプターが結合するエピトープを含む組成物）に処方され得る。
【００８５】
ＨＢＶ／ＨＣＶウイルス様粒子またはウイルス様粒子を形成するタンパク質をコードする核酸を含む、免疫原組成物および抗原組成物は、哺乳動物（例えば、マウス、ラビット、ヒヒ、チンパンジー、またはヒト）に投与して、インビボで抗−ＨＣＶ抗体を惹起し得る。本発明の免疫原組成物の注射は、好ましくは、宿主中でウイルス様粒子の合成により得られる。従って、核酸を含む組成物は、ＨＢｓＡｇおよびキメラ抗原の両方（例えば、ＨＢｓＡｇ−Ｅ１および／またはＧＢｓＡｇ−Ｅ２融合タンパク質）をコードする配列、ならびに他のＨＣＶポリペプチドを含む融合体を含むべきである。ＨＢｓＡｇをコードする核酸：キメラ抗原をコードする核酸の重量比は、好ましくは、１：１、２：１、５：１、１０：１、２０：１、３０：１、５０：１、または１００：１であり、そして宿主の細胞中でのウイルス様粒子の形成および宿主内での分泌が生じる。より好ましくは、この比は、５：１〜２０：１の範囲である。
【００８６】
抗原組成物または免疫原組成物のウイルス様粒子または核酸分子は、アジュバンド、免疫刺激性分子、またはキャリアと組合され得、これには、以下が挙げられるが、限定されない：ＭＦ（下記）、ポリ（ｄ１−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）マクロ粒子（ＰＬＬ、例えば、Ｄｅｌｇａｄｏら（１９９９）Ｖａｃｃｉｎｅ１７：２９２７−１９３８を参照のこと）、ＬＴトキシン、免疫刺激性複合体（ＩＳＣＯＭＳ、例えば、Ｍｏｗａｔら（１９９９）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．６５：１３３−１４０を参照のこと）、およびＱＳ２１（Ｓｉｎｇｈ ＆ Ｏ’Ｈａｇａｎ（１９９９）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：１０７５−１０８１を参照のこと）。
【００８７】
例えば、組成物の効果を増強するための好ましいアジュバンドは、以下の（１）〜（８）が挙げられるが、これらに限定されない：（１）アルミニウム塩（ａｌｕｍ）（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなど）；（２）水中油のエマルジョン処方物（他の免疫刺激剤（例えば、ムラミルペプチド（下記）または細菌細胞壁成分）を有するか、または有さない）であって、例えば、以下（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を含む、処方物：（ａ）５％のＳｑｕａｌｅｎｅ、０．５％のＴｗｅｅｎ ８０、および０．５％のＳｐａｎ ８５を含む、ＭＦ５９（ＰＣＴ公開番号ＷＯ ９０／１４８３７）（必要とされないが、種々の量のＭＴＰ−ＰＥを必要に応じて含む（以下を参照のこと））（これは、Ｍｏｄｅｌ １１０Ｙミクロ流動化器（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，Ｎｅｗｔｏｎ，ＭＡ）を使用して、サブミクロン粒子に処方される）、（ｂ）ＳＡＦであって、１０％のＳｑｕａｌａｎｅ、０．４％のＴｗｅｅｎ ８０、５％のプルオニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）ブロックポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰ（以下を参照のこと）を含む、ＳＡＦ（これは、サブミクロン粒子にミクロ流動化されるか、大きな粒子サイズのエマルジョンを生成するためにボルテックスされるかのいずれかである）、および（ｃ）２％のＳｑｕａｌｅｎｅ、０．２％のＴｗｅｅｎ ８０ならびにモノホスホリピドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）および細胞壁骨格（ＣＷＳ）（好ましくは、ＭＰＬ＋ＣＷＳ（Ｄｅｔｏｘ^TM））からなる群から選択される、１以上の細菌細胞壁成分を含む、ＲｉｂｉＴＭアジュバンドシステム（ＲＡＳ）（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）；（３）使用され得る、サポニンアジュバンド（例えば、Ｓｔｉｍｕｌｏｎ^TM）（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，ＭＡ）またはそこから生成される、ＩＳＣＯＭ（免疫刺激性複合体）のような粒子；（４）フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）およびフロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）；（５）サイトカイン（例えば、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２など）、インターロイキン（例えば、γインターフェロン）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）など）；（６）細菌ＡＤＰ−リボシル化毒素（例えば、コレラ毒素（ＣＴ）、百日咳毒素（ＰＴ）、またはＥ．ｃｏｌｉ熱不安定毒素（ＬＴ））の解毒改変体（特に、ＬＴ−Ｋ６３、ＬＴ−Ｒ７２、ＣＴ−Ｓ１０９、ＰＴ−Ｋ９／Ｇ１２９）；例えば、ＷＯ９３／１３３０２およびＷＯ９２／１９２６５を参照のこと；（７）組成物の有効性を増強するために免疫刺激剤として作用する他の物質；ならびに（８）吸収された高分子を含むミクロ粒子（係属中の米国特許出願０９／２８５，８５５（１９９９年４月２日出願）および国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９９／１７３０８に記載される）。ＡｌｕｍおよびＭＦ５９が好ましい。
【００８８】
上記のように、ムラミルペプチドとしては、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’，２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８９】
免疫原性組成物はまた、薬学的に受容可能なキャリアを含有し得る。薬学的に受容可能なキャリアは、当業者に周知である。そのようなキャリアとしては、大きく、ゆっくりと代謝される高分子（例えば、タンパク質、ポリサッカリド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマー性アミノ酸、アミノ酸コポリマー、および不活性なウイルス粒子）が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、米国特許第５，４２２，１２０号、ＷＯ９５／１３７９６、ＷＯ９１／１４４４５、またはＥＰ５２４，９６８Ｂ１に記載されるリポソーム、ならびにポリ（ｄｌ−ラクチド−コ−グリコリド）微粒子（ＰＬＧ、例えば、Ｄｅｌｇａｄｏら（１９９０）Ｖａｃｃｉｎｅ１７：２９２７−２９３８を参照のこと）もまた、本発明の組成物のためのキャリアとして使用され得る。
【００９０】
薬学的に受容可能な塩（例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、または硫酸塩のような無機酸の塩、および酢酸、プロピオン酸、マロン酸、または安息香酸のような有機酸の塩）もまた、本発明の組成物中に使用され得る。
【００９１】
本発明の組成物は、一般に、水、生理食塩水、グリセロール、およびエタノールのような薬学的に受容可能な賦形剤、ならびに湿潤剤、乳化剤、またはｐＨ緩衝化剤のような物質を含む。
【００９２】
本発明のキメラ分子は、標準的な遺伝子送達プロトコールを使用して、核酸免疫化のために使用され、適切な免疫応答（例えば、ＨＣＶ特異的Ｔ細胞の活性化）を生じ得る。当該分野において公知の任意の方法を使用して、本発明の核酸分子（免疫原性組成物中の核酸分子を含む）をパッケージングおよび送達し得る。遺伝子送達のための方法が、当該分野において公知である。例えば、米国特許第５，３９９，３４６号、同５，５８０，８５９号、同５，５８９，４６６号を参照のこと。例えば、コード配列を、ウイルスベクター中に、脂質と合わせて、ペプトイド賦形剤中に、ＰＬＧ処方物中に、または金粒子中にパッケージングし得る。好ましくは、免疫原性組成物は、裸のＤＮＡまたは裸のＲＮＡとして送達される。発現された免疫原性ポリペプチドは、好ましくは、天然の翻訳後修飾、構造、およびコンフォメーションをともなって、宿主免疫系に提示される。
【００９３】
例えば、構築物を、細胞への送達前に、リポソーム中にパッケージングし得る。脂質カプセル化は、一般に、核酸に安定に結合するか、または核酸を捕獲し（ｅｎｔｒａｐ）、そして保持し得るリポソームを使用して、達成される。濃縮されたＤＮＡと脂質調製物との比率は、変化し得るが、一般的に約１：１である（ｍｇ ＤＮＡ：マイクロモル脂質）か、または脂質がより多い。核酸送達のためのキャリアとしてのリポソームの使用についての総説について、ＨｕｇおよびＳｌｅｉｇｈｔ、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．（１９９１）１０９７：１−１７；Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１８９３），Ｖｏｌ．１０１、ｐｐ．５１２−５２７を参照のこと。
【００９４】
本発明を用いる使用のためのリポソーム調製物としては、カチオン性調製物（正に荷電）、アニオン性調製物（負に荷電）、および中性調製物が挙げられ、カチオン性リポソームが特に好ましい。カチオン性リポソームは、容易に利用可能である。例えば、Ｎ［１−２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）リポソームが、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎの商標のもと、ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ．から入手可能である（Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８７）８４：７４１３−７４１６も参照のこと）。他の市販の脂質としては、トランスフェクテース（ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｃｅ）（ＤＤＡＢ／ＤＯＰＥ）およびＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ（Ｂｏｅｒｈｉｎｇｅｒ）が挙げられる。他のカチオン性リポソームは、当該分野において周知の技術を使用して、容易に入手可能な材料から調製され得る。例えば、ＤＯＴＡＰ（１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン）リポソームの合成の記載について、Ｓｚｏｋａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７８）７５：４１９４−４１９８；ＰＣＴ公開公報ＷＯ ９０／１１０９２を参照のこと。種々のリポソーム−核酸複合体が、当該分野において公知の方法を使用して調製される。例えば、Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒら、ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（１９８３），Ｖｏｌ．１０１，ｐｐ．５１２−５２７；Ｓｚｏｋａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７８）７５：４１９４−４１９８；Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（１９７５）３９４：４８３；Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ（１９７９）１７：７７）；ＤｅａｍｅｒおよびＢａｎｇｈａｍ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（１９７６）４４３：６２９；Ｏｓｔｒｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９７７）７６：８３６；Ｆｒａｌｅｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７９）７６：３３４８）；ＥｎｏｃｈおよびＳｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７９）７６：１４５）；Ｆｒａｌｅｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８０）２５５：１０４３１；ＳｚｏｋａおよびＰａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７８）７５：１４５；ならびにＳｃｈａｅｆｅｒ−Ｒｉｄｄｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８２）２１５：１６６を参照のこと。
【００９５】
ＤＮＡもまた、Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．（１９７５）３９４：４８３−４９１に記載される脂質組成物と類似の渦巻形の脂質組成物中で、送達され得る。米国特許第４，６６３，１６１号および同４，８７１，４８８号もまた、参照のこと。
【００９６】
多数のウイルスベースの系が、哺乳動物細胞への遺伝子移入のために開発されている。例えば、レトロウイルス（例えば、マウス肉腫ウイルス、マウス乳腺癌ウイルス、マウスモロニー白血病ウイルスおよびラウス肉腫ウイルス）は、遺伝子送達系のための便利なプラットホームを提供する。当該分野において公知の技術を使用して、選択された遺伝子をベクター中に挿入して、レトロウイルス粒子中にパッケージングし得る。次に、組換えウイルスを、単離して、インビボまたはエキソビボのいずれかにおいて、被検体の細胞中に送達し得る。多数のレトロウイルス系が、記載されている（米国特許第５，２１９，７４０号；ＭｉｌｌｅｒおよびＲｏｓｍａｎ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９８９）７：９８０−９９０；Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９０）１：５−１４；Ｓｃａｒｐａら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９１）１８０：８４９−８５２；Ｂｕｒｎｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９３）９０：８０３３−８０３７；ならびにＢｏｒｉｓ−ＬａｗｒｉｅおよびＴｅｍｉｎ，Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．（１９９３）３：１０２−１０９）。手短には、本発明のレトロウイルス遺伝子送達ビヒクルは、広範なレトロウイルス（例えば、Ｂ、Ｃ、およびＤ型レトロウイルスならびにスプマウイルス属およびレンチウイル（例えば、ＦＩＶ、ＨＩＶ、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２およびＳＩＶ）を含む（ＲＮＡ Ｔｕｍｏｒ Ｖｉｒｕｓｅｓ、第二版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８５を参照のこと））から、容易に構築し得る。そのようなレトロウイルスは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「ＡＴＣＣ」；１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１１０−２２０９）のような寄託機関または収集機関から容易に入手可能であり得るか、または一般的に利用可能な技術を使用して、公知の供給源から単離し得る。
【００９７】
多数のアデノウイルスベクター（例えば、２型および５型アデノウイルスベクター）もまた、記載されている。宿主ゲノムに組み込まれるレトロウイルスとは異なり、アデノウイルスは、染色体の外に残り、従って、挿入による変異誘発に伴う危険を最小限にする（Ｈａｊ−ＡｈｍａｄおよびＧｒａｈａｍ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）５７：２６７−２７４；Ｂｅｔｔら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）６７：５９１１−５９２１；Ｍｉｔｔｅｒｅｄｅｒら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４）５：７１７−７２９；Ｓｅｔｈら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９４）６８：９３３−９４０；Ｂａｒｒら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４）１：５１−５８；Ｂｅｒｋｎｅｒ，Ｋ．Ｌ．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９８８）６：６１６−６２９；ならびにＲｉｃｈら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９３）４：４６１−４７６）。
【００９８】
分子結合体ベクター（例えば、Ｍｉｃｈａｅｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９３）２６８：６８６６−６８６９およびＷａｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９：６０９９−６１０３に記載されるアデノウイルスキメラベクター）もまた、遺伝子送達のために使用し得る。
【００９９】
アルファウイルスのメンバー（例えば、限定されることはないが、シンドビスウイルス、セムシキ森林ウイルス、ＶＥＥ由来のベクター）もまた、目的の遺伝子の送達のためのウイルスベクターとしての使用を見出す。本発明の方法の実施のために有用なシンドビスウイルス由来のベクターの記載について、Ｄｕｂｅｎｓｋｙら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９６）７０：５０８−５１９；および国際公開公報ＷＯ９５／０７９９５およびＷＯ９６／１７０７２を参照のこと。
【０１００】
他のベクター（シミアンウイルス４０、サイトメガロウイルスが挙げられるがこれに限定されない）も使用し得る。細菌ベクター（例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｓｐ．、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐｐ．、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ、ミコバクテリウム属のＢＣＧ株、およびＬｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）を使用し得る。ミニクロモソーム（例えば、ＭＣおよびＭＣ１）、バクテリオファージ、コスミド（ファージラムダｃｏｓ部位が挿入されたプラスミド）およびレプリコン（細胞内において、それ自体の制御のもとで、複製し得る遺伝子エレメント）もまた使用し得る。
【０１０１】
キメラ構築物もまた、微粒子キャリア内に、カプセル化されるか、吸着されるか、または会合し得る。そのようなキャリアは、免疫系に対して、選択された分子の複数のコピーを提示し、そして局所的なリンパ節内での分子の捕捉および保持を促進する。粒子は、マクロファージによって貪食され得、そしてサイトカインの放出を介して、抗原提示を促進し得る。微粒子キャリアの例としては、ポリメチルメチルメタクリレートポリマー由来のキャリア、ならびにポリ（ラクチド）およびポリ（ラクチド−コ−グリコリド）由来の微粒子（ＰＬＧとして公知）が挙げられる。例えば、Ｊｅｆｆｅｒｙら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．（１９９３）１０：３６２−３６８；およびＭｃＧｅｅら、Ｊ Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐ．（１９９６）を参照のこと。
【０１０２】
広範な他の方法を使用して、構築物を細胞に送達し得る。そのような方法としては、ＤＥＡＥデキストラン媒介性トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリリジン−またはポリオルニチン−媒介性トランスフェクション、または他の不溶性無機塩（例えば、リン酸ストロンチウム、ベントナイトおよびカオリンを包含するケイ酸アルミニウム、酸化クロム、ケイ酸マグネシウム、タルクなど）を使用する沈殿が挙げられる。他の有用なトランスフェクション方法としては、エレクトロポーレション、ソノポーレーション（ｓｏｎｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、プロトプラスト融合、リポソーム、ペプトイド送達、またはマイクロインジェクションが挙げられる。例えば、目的の細胞の形質転換のための技術の考察について、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）；および遺伝子移入のために有用な送達系の総説についてＦｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ（１９９０）５：１６３−１８７を参照のこと。エレクトロポーレーションを使用するＤＮＡ送達の１つの特に有用な方法は、国際公開公報ＷＯ００／４５８２３に記載される。
【０１０３】
さらに、微粒子キャリア（例えば、金およびタングステン）を使用する微粒子銃送達系が、本発明の構築物を送達するのに有用である。粒子は、送達される構築物で被覆され、高速に加速され、一般的には減圧下で、「遺伝子銃」から発射された銃粉末を使用する。そのような技術、およびその技術のために有用な装置の記載について、例えば、米国特許第４，９４５，０５０号；同５，０３６，００６号；同５，１００，７９２号；同５，１７９，０２２号；同５，３７１，０１５号および同５，４７８，７４４号を参照のこと。
【０１０４】
キメラ構築物を、脊椎動物被験体に対して直接的にか、あるいはエキソビボで、被験体由来の細胞および被験体に再移植された細胞に対してかのいずれかで、送達し得る。例えば、構築物を、プラスミドＤＮＡとして（例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣまたはＣｏｌＥ１のようなプラスミド内に含まれて）送達し得る。
【０１０５】
本発明の免疫原性組成物を、使用される特定の組成物と適合する様式において、そして抗ＨＣＶポリペプチド抗体力価（例えば、抗Ｅ２抗体力価または抗Ｅ１抗体力価）を惹起する有効量で、投与される。投与は、当該分野で公知の任意の手段（筋肉内注射、皮内注射、腹膜内注射または皮下注射（生物学的な弾道銃（「遺伝子銃」）を使用する注入を含む）を含む）によって、なされ得る。エレクトロポーレーションまたはイオン導入法もまた、使用し得る。投与は、鼻腔内または経口であり得る。免疫原性組成物の経口投与のために、タンパク質キャリアを、好ましくは、含ませる。免疫原性組成物（裸のＤＮＡまたは裸のＲＮＡを含む組成物を含む）は、好ましくは、筋肉内で、大きな哺乳動物（例えば、ヒヒ、チンパンジー、またはヒト）に対して、０．５、０．７５、１．０、１．５、２．０、２．５、５または１０ｍｇ／ｋｇの用量で注入される。ウイルス様粒子を含む組成物は、好ましくは、筋肉内で、大きな哺乳動物（例えば、ヒト）に対して、０．０１、０．０５、０．５、０．７５、１．０、１．５、２．０、２．５、５または１０ｍｇタンパク質／ｋｇ体重の用量で注入される。
【０１０６】
組成物の直接的送達は、一般に、皮下、腹腔内、静脈内、または筋肉内のいずれかの注射によってされ得るか、あるいは組織の間質空間内に送達され得る。組成物はまた、病変中に投与され得る。他の投与の様式として、経口、鼻腔内、および肺の投与、坐薬、および経皮的（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌまたはｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）適用（例えば、ＷＯ９８／２０７３４）、針、および遺伝子銃またはハイポスプレー（ｈｙｐｏｓｐｒａｙ）が挙げられる。投薬量処置は、単回投与スケジュールであっても、複数回投薬量スケジュールであってもよい。組成物を、他の免疫調節性因子と組み合わせて投与し得る。
【０１０７】
形質転換した細胞の被験体へのエキソビボ送達および再移植のための方法は、当該分野で公知であり、そして例えば、ＷＯ９３／１４７７８に記載されている。エキソビボ適用に有用である細胞の例は、例えば、幹細胞、特に、造血細胞、リンパ細胞、マクロファージ、樹状細胞または腫瘍細胞を含む。一般的に、エキソビボ適用およびインビトロ適用の両方のための核酸の送達は、以下の手順：例えば、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、ポリヌクレオチドのリポソーム内へのカプセル化、およびＤＮＡの核への直接の微量注入（これらはすべて当該分野で周知である）で達成され得る。
【０１０８】
ＨＢＶ／ＪＣＶウイルス様粒子またはこのようなウイルス用粒子をコードしそして発現する核酸を含む免疫原性組成物は、ＨＣＶに感染していない哺乳動物に投与され得るか、またはＨＣＶに感染した哺乳動物に投与され得る。ウイルス様粒子または核酸の特定の投薬量は、その組成物が投与される哺乳動物の種、年齢および全身状態、ならびにその組成物の投与様式を含むがこれらに限定されない多くの因子に依存する。本発明の組成物の有効量は、慣用的な実験を使用して容易に決定され得る。インビボモデルは周知であり、そして適切な用量を同定するために使用され得る。所望の場合、同時刺激性分子またはアジュバントもまた、これらの免疫原性組成物の前、後、または同時に提供され得る。免疫原性組成物は、効果的な免疫に必要とされる場合には、１回より多く投与され得る。ウイルス様粒子を含む免疫原性組成物の投与は、核酸を含む免疫原性組成物の前後いずれかで行われ得、その結果、一方の形態（タンパク質または核酸）が、一次免疫を提供し、もう一方の形態が、免疫応答をブーストする。
【０１０９】
（ＩＩＩ．実験）
以下は、本発明の実施のための特定の実施形態の例である。これらの実施例は、例示目的のみに提供され、そして本発明の範囲を限定することはいかようにも意図されない。当業者は、本発明が、本開示の教示を考慮して種々の様式で行われ得ることを容易に認識する。
【０１１０】
使用する数（例えば、量、温度など）に関して正確性を確実にするように努力がなされてたが、いくらかの実験誤差および偏差は、もちろん、許容されるべきである。
【０１１１】
（実施例１）
（スクロース密度勾配沈降を使用するＨＢＶウイルス様粒子の検出）
精製組換えＨＢｓＡｇ粒子を、Ｃｈｒｉｏｎ Ｃｏｒｐ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔからＢ型肝炎ワクチンの形態で入手した。２５０μＬの、０．０３Ｍ クエン酸、０．２６Ｍ ＮａＣｌ、０．００５％ ポリソルベート８０中の３７μｇ／ｍＬ懸濁液を、５〜３０％（重量−容量）スクロース勾配上にロードし、そしてＢｅｃｋｍａｎ ＳＷ４１ローター中で、４０，０００ｒｐｍで４時間遠心分離した。１０個のフラクションを取り出し、そしてＭａｇｉｃ ＬｉｔｅアッセイによってＨＢｓＡｇについてアッセイした。結果を図５に示す。
【０１１２】
（Ｍａｇｉｃ Ｌｉｔｅアッセイ）
これは、ＨＢＶおよびＨＣＶ抗原を検出するために使用される、非常に高感度な免疫化学発光アッセイである。１００μＬのサンプルを、１２×７５ｍｍポリスチレンチューブに添加した。１００μＬ（３０μｇ）の「捕捉」抗体を、このサンプルに添加した。この捕捉抗体は、６：１の常磁性粒子：抗体の混合物をグルタルアルデヒド架橋することによって、常磁性粒子に共有結合的に連結した。チューブをボルテックスし、そして３７℃の水浴中で２０分間インキュベートした。次いで、チューブを磁性ラック上に置き、ここで、常磁性粒子（ＰＭＰ）が凝集し得る。これにより、洗浄およびデカントした。３回目の洗浄後、１００μＬの「検出」抗体（これは、ジメチルアクリジニウムに共有結合的に連結した）を添加し、そしてチューブをボルテックスした。チューブを２０分間、３７℃で再度インキュベートし、次いで、磁性ラックに置いて洗浄およびデカントした。３回目の洗浄後、チューブを、Ｃｉｂａ Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｍａｇｉｃ Ｌｉｔｅ化学ルミノメーターに置き、結合した分析物を測定した。結果は、光強度の任意の単位で表した（相対光単位、ＲＬＵ）。
【０１１３】
（抗体）
抗ｓＡｇは、Ｃｈｉｒｏｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｗａｌｐｏｌｅ，ＭＡ）によって提供され、そしてこれらは、血清型ＡＹＷおよびＡＤＷに対するものであった。ＭＡｂ ５Ｅ５／Ｈ７を、免疫原としてＨｅＬａＥ１／Ｅ２アミノ酸１〜９６７を使用して、マウスから得て、これは、Ｅ２エピトープ３８４−６５５を認識する。ＭＡｂ ３Ｄ５／Ｃ３もまた、ＨｅＬａＥ１／Ｅ２アミノ酸１〜９６７を使用して、マウスから得て、これは、Ｅ１エピトープ２１１−２１７を認識する。
【０１１４】
（実施例２）
（ＣＯＳ７細胞におけるキメラＨＢｓＡｇ−Ｅ２−６６１抗原を含有するＨＢＶ／ＨＣＶウイルス様粒子の発現）
５μｇのｐＣＭＶ−ＩＩ−Ｅ２６６１−ｓＡｇ（図４Ａ）および漸増量のｐＣＭＶ−ＩＩｐＳ２−ｓＡｇ（図２Ａ）を調製した。ｐＣＭＶ−ＩＩｐＳ２−ｓＡｇからの発現は、約５〜２０％のｐｒｅＳ２−Ｓ−ポリペプチドの混合物を生じ、その残りは、Ｓ−ポリペプチドであった。使用したｓＡｇプラスミド：Ｅ２６６１−ｓＡｇプラスミドの比は、１μｇ ＤＮＡ基準で、０：１、１：１、５：１および１０：１であった。各チューブ中のＤＮＡの総量を、ｐＣＭＶ−ｋｍ−Ｂｇａｌの添加によって５５μｇに正規化した。この混合物を、以下に記載のように、Ｐａｎｖｅｒａ製のＬＴ１トランスフェクション試薬を用いて、ＣＯＳ７細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション後４８時間で、培地および可溶性溶解物（０．１％ ＮＰ４０を含むＰＢＳ中で細胞単層をインキュベートしそして遠心分離して不溶性細片を除去することによって得られる）を取り出し、Ｍａｇｉｃ Ｌｉｔｅアッセイによってアッセイした。このアッセイでは、抗ｓＡｇによって捕捉し、その後、結合体化抗Ｅ２ ＭＡｂ（５Ｅ５／Ｈ７、実施例１を参照のこと）（図６）またはＭＡｂ ｓＡｇ（図６Ｂ）を用いて検出した。Ｅ２およびｓＡｇの両方は、ｓＡｇ：Ｅ２６６１−ｓＡｇの比が増加するにつれて、培地中に多く分泌され、至適分泌は、５：１〜１０：１の範囲の比で生じた。
【０１１５】
ウイルス様粒子を特徴付けるために、各条件からの１ｍＬの培養培地を、５〜３０％のスクロース勾配上にロードした。これらのサンプルを、Ｂｅｃｋｍａｎ ＳＷ４１ローターを使用して、４０，０００ｒｐｍで４時間遠心分離した。１１個のフラクションを取り出し、Ｍａｇｉｃ ＬｉｔｅアッセイによってＥ２（図７Ａ）またはｓＡｇ（図７Ｂ）についてアッセイした。Ｅ２およびｓＡｇの両方は、フラクション４中で最も高い量で観察された。これは、ＨＢｓＡｇ含有ウイルス様粒子のピーク分布について同じ勾配位置であった（図５）。
【０１１６】
（トランスフェクションプロトコル）
細胞を、トランスフェクションの前日に６ウェルプレートに播種し、トランスフェクション時点で５０〜６０％のコンフルエンシーを達成した。Ｏｐｔｉ−ｍｅｎ（１００μＬ）およびＬＴ−１トランスフェクション試薬（１２μＬ）を、滅菌ポリプロピレンチューブに添加し、そして室温で５分間インキュベートした。次いで、３μｇのＤＮＡをチューブに添加し、チューブをさらに５分間室温でインキュベートした。このインキュベーション期間中に、細胞を、Ｏｐｔｉ−ｍｅｎ（２ｍｌ／ウェル）で洗浄した。２ｍＬのＯｐｔｉ−ｍｅｎを各ウェルに添加し、次いで、１００μＬのこのＯｐｔｉ−ｍｅｎ／ＬＴ−１／ＤＮＡ混合物を添加した。次いで、細胞を、３７℃で４時間インキュベートし、その後、吸引しそして培養培地を添加した（１．５ｍＬ／ウェルのＤＭＥＭ＋１０％ ＦＢＳ）。トランスフェクション後４８時間で、培地を回収し、そして細胞単層を、０．１％ ＮＰ−４０を含むＰＢＳを使用して可溶化した。回収した培地および可溶化した細胞を、遠心分離して細片を除去した。
【０１１７】
（実施例３）
（ＣＯＳ７細胞におけるキメラＨＢｓＡｇ−Ｅ１−３３０抗原を含有するＨＢＶ／ＨＣＶウイルス様粒子の発現）
ｐＣＭＶ−ＩＩ−ｏｐｔｉＥ１３３０−ｓＡｇ（２．５μｇ ＤＮＡ）および種々の量のｐＣＭＶ−ＩＩ−ｐＳ２−ｓＡｇの混合物を、０：１（コントロール）、１：１、５：１、１０：１および２０：１の比のｓＡｇプラスミド：Ｅ１６６１−ｓＡｇプラスミドを提供するよう調製した。ｐＣＭＶ−ＩＩ−ｐＳ２−ｓＡｇからの発現は、約５〜２０％のｐｒｅＳ２−Ｓ−ポリペプチドの混合物を生じ、その残りは、Ｓ−ポリペプチドであった。各チューブ中のＤＮＡの総量を、ｐＣＭＶ−ｋｍ−βｇａｌの添加によって５２．５μｇに正規化した。この混合物を、Ｐａｎｖｅｒａ製のＬＴ１トランスフェクション試薬を用いて、ＣＯＳ７細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション後４８時間で、培地および可溶性溶解物を取り出し、Ｍａｇｉｃ Ｌｉｔｅアッセイによってアッセイした。捕捉は、抗ｓＡｇで行い、その後、結合体化抗Ｅ１ ＭＡｂ（ｅＤ５／Ｃ７３）（図８Ａ）またはＭＡｂ ｓＡｇ（図８Ｂ）を用いて検出した。Ｅ１およびｓＡｇの両方は、ｓＡｇ：Ｅ２６６１−ｓＡｇの比が増加するにつれて、培地中に多く分泌され、至適分泌は、５：１〜２０：１の範囲の比で生じた。
【０１１８】
ウイルス様粒子を特徴付けるために、各条件からの１ｍＬの培養培地を、５〜３０％のスクロース勾配上にロードした。これらのサンプルを、Ｂｅｃｋｍａｎ ＳＷ４１ローターを使用して、４０，０００ｒｐｍで４時間遠心分離した。１１個のフラクションを取り出し、Ｍａｇｉｃ ＬｉｔｅアッセイによってＥ１（図９Ａ）またはｓＡｇ（図９Ｂ）についてアッセイした。Ｅ１およびｓＡｇの両方は、フラクション４〜６中で最も高い量で観察された。これは、ＨＢｓＡｇ含有ウイルス様粒子のピーク分布について同じ勾配位置に類似する（図５）。
【０１１９】
（実施例４）
（ＣＯＳ７細胞におけるＨＢｓＡｇ−Ｅ２−６６１およびＨＢｓＡｇ−Ｅ１−３３０キメラ抗原の両方を含有するＨＢＶ／ＨＣＶウイルス様粒子の発現）
ｐＣＭＶＩＩ ｏｐｔｉ ３３０Ｅ１−ｓＡｇおよびｐＣＭＶ−ＩＩ−Ｅ２６６１−ｓＡｇの混合物（各プラスミドの０．５μｇ ＤＮＡ）を、漸増量のｐＣＭＶ−ＩＩｐＳ２−ｓＡｇと合わせた。各チューブ中のＤＮＡの総量を、ｐＣＭＶ−ｋＭ−βｇａｌの添加によって２６μｇに正規化した。この混合物を、Ｐａｎｖｅｒａ製のＬＴ１トランスフェクション試薬を用いて、ＣＯＳ７細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション後４８時間で、培地および可溶性溶解物を取り出し、Ｍａｇｉｃ Ｌｉｔｅアッセイによってアッセイした。このアッセイでは、抗ｓＡｇによって捕捉し、その後、結合体化抗Ｅ２または抗Ｅ１ ＭＡｂ（図１０Ａ）または抗ｓＡｇ（図１０Ｂ）を用いて検出した。
【０１２０】
（実施例５）
（免疫応答を生成するためのＨＢＶ／ＨＣＶウイルス様粒子の使用）
ＨＢＶ／ＨＣＶウイルス様粒子がインビボで免疫応答を生成する能力を試験するための、以下の実験を行った。１０匹のマウスの４グループ（グループ２は、９匹のマウスを有した）に、以下のいずれかをコードするＤＮＡを投与した：ＨＣＶ Ｅ２６６１およびｐＣＭＶ−ＩＩ（Ｅ２６６１に対して５倍のｐＣＭＶ−ＩＩの比で）（グループ１）；ｐＣＭＶ−ＩＩ−Ｅ２６６１−ｓＡｇ（図４Ａ）およびｐＣＭＶ−ＩＩ（ｐＣＭＶ−ＩＩ−Ｅ２６６１−ｓＡｇに対して５倍のｐＣＭＶ−ＩＩの比で）（グループ２）；ｐＣＭＶ−ＩＩ−Ｅ２６６１−ｓＡｇ（図４Ａ）およびｐＣＭＶ−ＩＩ−ｐＳ２−ｓＡｇ（図２Ａ）（ｐＣＭＶ−ＩＩ−Ｅ２６６１−ｓＡｇに対して５倍のｐＣＭＶ−ＩＩ−ｐＳ２−ｓＡｇの比で）（グループ３）；およびｐＣＭＶ−ＩＩおよびｐＣＭＶ−ＩＩ−ｐＳ２−ｓＡｇ（ｐＣＭＶ−ＩＩに対して５倍のｐＣＭＶ−ＩＩ−ｐＳ２−ｓＡｇの比で）（グループ４）。
【０１２１】
全てを、０日目および２１日目に、１回の免疫あたり９０μｇ（４５μｇ／脚）で２回免疫し、そして血液を収集した。抗体力価を、上記Ｍａｇｉｃ Ｌｉｔｅアッセイを使用して、短縮型Ｅ２分子、Ｅ２₇₁₅（これは、ＣＨＯ細胞中で発現させた）を使用するＥＬＩＳＡによってアッセイした。結果を、表１に示す。
【０１２２】
【表１】

第２の実験を、１グループあたり１０匹の動物を使用して（グループ５（５匹のマウスを有した）を除く）再度行った。これらのグループおよび結果を、表２に示す。処置プロトコルおよび抗体定量は、上記のとおりであった。
【０１２３】
【表２】

理解され得るように、Ｅ２₆₆₁免疫マウスにおけるＥ２に対する力価は、５×ｓＡｇの存在下で減少した。これは、小胞体へのドッキングについての競合から生じ得る。Ｅ２力価は、Ｅ２がｓＡｇに融合されている場合に、より高かった。ベクターに代わるｓＡｇの添加は、力価においてほとんど変化を生じなかった。この差異は小さいが、ｓＡｇとコントロールの比較は保証される。過剰なｓＡｇは、非融合抗原におけるＥ２力価の減少を生じたので、融合体の状況下では、明確な補償が存在した。これは、おそらく、融合物の分泌を促進する、ｓＡｇの能力を反映する。
【０１２４】
従って、キメラＨＣＶ／ＨＢＶウイルス粒子、ならびにそれを作製および使用する方法を開示する。前述から、本発明の特定の実施形態を、例示目的で説明してきたが、種々の改変が、添付の特許請求の範囲の精神および範囲を逸脱する異なくなされ得ることが理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１Ａおよび１Ｂ〜１Ｆは、発現ベクターｐＣＭＶＩＩ（図１Ａ）およびそのヌクレオチド配列（図１Ｂ〜１Ｆ；配列番号１）を示す。
【図２Ａ】 図２Ａは、発現ベクターｐＣＭＶＩＩ−ｐＳ２−ｓＡｇ（図２Ａ）およびそのヌクレオチド配列（図２Ｂ〜２Ｉおよび配列番号２；ｐｒｅＳ２コード配列は、ヌクレオチド位置１９８８で始まり、ヌクレオチド塩基２１５２で終わる。そしてＳＡｇコード配列は、塩基２１５３で始まり、２８３０で終わる）を示す。コードされたｐｒｅＳ２−Ｓポリペプチドのアミノ酸配列はまた、図２Ｂ〜２Ｉおよび配列番号３に表される。
【図２Ｂ】 図２Ｂは、発現ベクターｐＣＭＶＩＩ−ｐＳ２−ｓＡｇ（図２Ａ）およびそのヌクレオチド配列（図２Ｂ〜２Ｉおよび配列番号２；ｐｒｅＳ２コード配列は、ヌクレオチド位置１９８８で始まり、ヌクレオチド塩基２１５２で終わる。そしてＳＡｇコード配列は、塩基２１５３で始まり、２８３０で終わる）を示す。コードされたｐｒｅＳ２−Ｓポリペプチドのアミノ酸配列はまた、図２Ｂ〜２Ｉおよび配列番号３に表される。
【図２Ｃ】 図２Ｃは、発現ベクターｐＣＭＶＩＩ−ｐＳ２−ｓＡｇ（図２Ａ）およびそのヌクレオチド配列（図２Ｂ〜２Ｉおよび配列番号２；ｐｒｅＳ２コード配列は、ヌクレオチド位置１９８８で始まり、ヌクレオチド塩基２１５２で終わる。そしてＳＡｇコード配列は、塩基２１５３で始まり、２８３０で終わる）を示す。コードされたｐｒｅＳ２−Ｓポリペプチドのアミノ酸配列はまた、図２Ｂ〜２Ｉおよび配列番号３に表される。
【図２Ｄ】 図２Ｄは、発現ベクターｐＣＭＶＩＩ−ｐＳ２−ｓＡｇ（図２Ａ）およびそのヌクレオチド配列（図２Ｂ〜２Ｉおよび配列番号２；ｐｒｅＳ２コード配列は、ヌクレオチド位置１９８８で始まり、ヌクレオチド塩基２１５２で終わる。そしてＳＡｇコード配列は、塩基２１５３で始まり、２８３０で終わる）を示す。コードされたｐｒｅＳ２−Ｓポリペプチドのアミノ酸配列はまた、図２Ｂ〜２Ｉおよび配列番号３に表される。
【図２Ｅ】 図２Ｅ２Ｉは、発現ベクターｐＣＭＶＩＩ−ｐＳ２−ｓＡｇ（図２Ａ）およびそのヌクレオチド配列（図２Ｂ〜２Ｉおよび配列番号２；ｐｒｅＳ２コード配列は、ヌクレオチド位置１９８８で始まり、ヌクレオチド塩基２１５２で終わる。そしてＳＡｇコード配列は、塩基２１５３で始まり、２８３０で終わる）を示す。コードされたｐｒｅＳ２−Ｓポリペプチドのアミノ酸配列はまた、図２Ｂ〜２Ｉおよび配列番号３に表される。
【図２Ｆ】 図２Ｆは、発現ベクターｐＣＭＶＩＩ−ｐＳ２−ｓＡｇ（図２Ａ）およびそのヌクレオチド配列（図２Ｂ〜２Ｉおよび配列番号２；ｐｒｅＳ２コード配列は、ヌクレオチド位置１９８８で始まり、ヌクレオチド塩基２１５２で終わる。そしてＳＡｇコード配列は、塩基２１５３で始まり、２８３０で終わる）を示す。コードされたｐｒｅＳ２−Ｓポリペプチドのアミノ酸配列はまた、図２Ｂ〜２Ｉおよび配列番号３に表される。
【図２Ｇ】 図２Ｇは、発現ベクターｐＣＭＶＩＩ−ｐＳ２−ｓＡｇ（図２Ａ）およびそのヌクレオチド配列（図２Ｂ〜２Ｉおよび配列番号２；ｐｒｅＳ２コード配列は、ヌクレオチド位置１９８８で始まり、ヌクレオチド塩基２１５２で終わる。そしてＳＡｇコード配列は、塩基２１５３で始まり、２８３０で終わる）を示す。コードされたｐｒｅＳ２−Ｓポリペプチドのアミノ酸配列はまた、図２Ｂ〜２Ｉおよび配列番号３に表される。
【図２Ｈ】 図２Ｈは、発現ベクターｐＣＭＶＩＩ−ｐＳ２−ｓＡｇ（図２Ａ）およびそのヌクレオチド配列（図２Ｂ〜２Ｉおよび配列番号２；ｐｒｅＳ２コード配列は、ヌクレオチド位置１９８８で始まり、ヌクレオチド塩基２１５２で終わる。そしてＳＡｇコード配列は、塩基２１５３で始まり、２８３０で終わる）を示す。コードされたｐｒｅＳ２−Ｓポリペプチドのアミノ酸配列はまた、図２Ｂ〜２Ｉおよび配列番号３に表される。
【図２Ｉ】 図２Ｉは、発現ベクターｐＣＭＶＩＩ−ｐＳ２−ｓＡｇ（図２Ａ）およびそのヌクレオチド配列（図２Ｂ〜２Ｉおよび配列番号２；ｐｒｅＳ２コード配列は、ヌクレオチド位置１９８８で始まり、ヌクレオチド塩基２１５２で終わる。そしてＳＡｇコード配列は、塩基２１５３で始まり、２８３０で終わる）を示す。コードされたｐｒｅＳ２−Ｓポリペプチドのアミノ酸配列はまた、図２Ｂ〜２Ｉおよび配列番号３に表される。
【図３Ａ】 図３Ａは、発現ベクターｐＣＭＶＩＩ ｏｐｔｉ ３３０ Ｅ１／ＳＡｇ（図３Ａ）およびそのヌクレオチド配列（図３Ｂ〜３Ｉおよび配列番号４；３３０ Ｅ１コード配列は、ヌクレオチド位置１９９２で始まり、ヌクレオチド塩基２４８３で終わる。そしてＳＡｇコード配列は、塩基２４８４で始まる）を示す。コードされたキメラ抗原ポリペプチドのアミノ酸配列はまた、図３Ｂ〜３Ｉおよび配列番号５に表される。
【図３Ｂ】 図３Ｂは、発現ベクターｐＣＭＶＩＩ ｏｐｔｉ ３３０ Ｅ１／ＳＡｇ（図３Ａ）およびそのヌクレオチド配列（図３Ｂ〜３Ｉおよび配列番号４；３３０ Ｅ１コード配列は、ヌクレオチド位置１９９２で始まり、ヌクレオチド塩基２４８３で終わる。そしてＳＡｇコード配列は、塩基２４８４で始まる）を示す。コードされたキメラ抗原ポリペプチドのアミノ酸配列はまた、図３Ｂ〜３Ｉおよび配列番号５に表される。
【図３Ｃ】 図３Ｃは、発現ベクターｐＣＭＶＩＩ ｏｐｔｉ ３３０ Ｅ１／ＳＡｇ（図３Ａ）およびそのヌクレオチド配列（図３Ｂ〜３Ｉおよび配列番号４；３３０ Ｅ１コード配列は、ヌクレオチド位置１９９２で始まり、ヌクレオチド塩基２４８３で終わる。そしてＳＡｇコード配列は、塩基２４８４で始まる）を示す。コードされたキメラ抗原ポリペプチドのアミノ酸配列はまた、図３Ｂ〜３Ｉおよび配列番号５に表される。
【図３Ｄ】 図３Ｄは、発現ベクターｐＣＭＶＩＩ ｏｐｔｉ ３３０ Ｅ１／ＳＡｇ（図３Ａ）およびそのヌクレオチド配列（図３Ｂ〜３Ｉおよび配列番号４；３３０ Ｅ１コード配列は、ヌクレオチド位置１９９２で始まり、ヌクレオチド塩基２４８３で終わる。そしてＳＡｇコード配列は、塩基２４８４で始まる）を示す。コードされたキメラ抗原ポリペプチドのアミノ酸配列はまた、図３Ｂ〜３Ｉおよび配列番号５に表される。
【図３Ｅ】 図３Ｅは、発現ベクターｐＣＭＶＩＩ ｏｐｔｉ ３３０ Ｅ１／ＳＡｇ（図３Ａ）およびそのヌクレオチド配列（図３Ｂ〜３Ｉおよび配列番号４；３３０ Ｅ１コード配列は、ヌクレオチド位置１９９２で始まり、ヌクレオチド塩基２４８３で終わる。そしてＳＡｇコード配列は、塩基２４８４で始まる）を示す。コードされたキメラ抗原ポリペプチドのアミノ酸配列はまた、図３Ｂ〜３Ｉおよび配列番号５に表される。
【図３Ｆ】 図３Ｆは、発現ベクターｐＣＭＶＩＩ ｏｐｔｉ ３３０ Ｅ１／ＳＡｇ（図３Ａ）およびそのヌクレオチド配列（図３Ｂ〜３Ｉおよび配列番号４；３３０ Ｅ１コード配列は、ヌクレオチド位置１９９２で始まり、ヌクレオチド塩基２４８３で終わる。そしてＳＡｇコード配列は、塩基２４８４で始まる）を示す。コードされたキメラ抗原ポリペプチドのアミノ酸配列はまた、図３Ｂ〜３Ｉおよび配列番号５に表される。
【図３Ｇ】 図３Ｇは、発現ベクターｐＣＭＶＩＩ ｏｐｔｉ ３３０ Ｅ１／ＳＡｇ（図３Ａ）およびそのヌクレオチド配列（図３Ｂ〜３Ｉおよび配列番号４；３３０ Ｅ１コード配列は、ヌクレオチド位置１９９２で始まり、ヌクレオチド塩基２４８３で終わる。そしてＳＡｇコード配列は、塩基２４８４で始まる）を示す。コードされたキメラ抗原ポリペプチドのアミノ酸配列はまた、図３Ｂ〜３Ｉおよび配列番号５に表される。
【図３Ｈ】 図３Ｈは、発現ベクターｐＣＭＶＩＩ ｏｐｔｉ ３３０ Ｅ１／ＳＡｇ（図３Ａ）およびそのヌクレオチド配列（図３Ｂ〜３Ｉおよび配列番号４；３３０ Ｅ１コード配列は、ヌクレオチド位置１９９２で始まり、ヌクレオチド塩基２４８３で終わる。そしてＳＡｇコード配列は、塩基２４８４で始まる）を示す。コードされたキメラ抗原ポリペプチドのアミノ酸配列はまた、図３Ｂ〜３Ｉおよび配列番号５に表される。
【図３Ｉ】 図３Ｉは、発現ベクターｐＣＭＶＩＩ ｏｐｔｉ ３３０ Ｅ１／ＳＡｇ（図３Ａ）およびそのヌクレオチド配列（図３Ｂ〜３Ｉおよび配列番号４；３３０ Ｅ１コード配列は、ヌクレオチド位置１９９２で始まり、ヌクレオチド塩基２４８３で終わる。そしてＳＡｇコード配列は、塩基２４８４で始まる）を示す。コードされたキメラ抗原ポリペプチドのアミノ酸配列はまた、図３Ｂ〜３Ｉおよび配列番号５に表される。
【図４Ａ】 図４Ａは、発現ベクターｐＣＭＶ−ＩＩ−Ｅ２６６１−ｓＡｇ（図４Ａ）およびそのヌクレオチド配列（図４Ｂ〜４Ｆおよび配列番号６；６６１ Ｅ２コード配列は、ヌクレオチド位置１９９７で始まり、ヌクレオチド塩基２９００で終わる。そしてｓＡｇコード配列は、塩基２９０７で始まる）を示す。コードされたキメラ抗原ポリペプチドのアミノ酸配列はまた、図４Ｂ〜４Ｆおよび配列番号７に表される。
【図４Ｂ】 図４Ｂは、発現ベクターｐＣＭＶ−ＩＩ−Ｅ２６６１−ｓＡｇ（図４Ａ）およびそのヌクレオチド配列（図４Ｂ〜４Ｆおよび配列番号６；６６１ Ｅ２コード配列は、ヌクレオチド位置１９９７で始まり、ヌクレオチド塩基２９００で終わる。そしてｓＡｇコード配列は、塩基２９０７で始まる）を示す。コードされたキメラ抗原ポリペプチドのアミノ酸配列はまた、図４Ｂ〜４Ｆおよび配列番号７に表される。
【図４Ｃ】 図４Ｃは、発現ベクターｐＣＭＶ−ＩＩ−Ｅ２６６１−ｓＡｇ（図４Ａ）およびそのヌクレオチド配列（図４Ｂ〜４Ｆおよび配列番号６；６６１ Ｅ２コード配列は、ヌクレオチド位置１９９７で始まり、ヌクレオチド塩基２９００で終わる。そしてｓＡｇコード配列は、塩基２９０７で始まる）を示す。コードされたキメラ抗原ポリペプチドのアミノ酸配列はまた、図４Ｂ〜４Ｆおよび配列番号７に表される。
【図４Ｄ】 図４Ｄは、発現ベクターｐＣＭＶ−ＩＩ−Ｅ２６６１−ｓＡｇ（図４Ａ）およびそのヌクレオチド配列（図４Ｂ〜４Ｆおよび配列番号６；６６１ Ｅ２コード配列は、ヌクレオチド位置１９９７で始まり、ヌクレオチド塩基２９００で終わる。そしてｓＡｇコード配列は、塩基２９０７で始まる）を示す。コードされたキメラ抗原ポリペプチドのアミノ酸配列はまた、図４Ｂ〜４Ｆおよび配列番号７に表される。
【図４Ｅ】 図４Ｅは、発現ベクターｐＣＭＶ−ＩＩ−Ｅ２６６１−ｓＡｇ（図４Ａ）およびそのヌクレオチド配列（図４Ｂ〜４Ｆおよび配列番号６；６６１ Ｅ２コード配列は、ヌクレオチド位置１９９７で始まり、ヌクレオチド塩基２９００で終わる。そしてｓＡｇコード配列は、塩基２９０７で始まる）を示す。コードされたキメラ抗原ポリペプチドのアミノ酸配列はまた、図４Ｂ〜４Ｆおよび配列番号７に表される。
【図４Ｆ】 図４Ｆは、発現ベクターｐＣＭＶ−ＩＩ−Ｅ２６６１−ｓＡｇ（図４Ａ）およびそのヌクレオチド配列（図４Ｂ〜４Ｆおよび配列番号６；６６１ Ｅ２コード配列は、ヌクレオチド位置１９９７で始まり、ヌクレオチド塩基２９００で終わる。そしてｓＡｇコード配列は、塩基２９０７で始まる）を示す。コードされたキメラ抗原ポリペプチドのアミノ酸配列はまた、図４Ｂ〜４Ｆおよび配列番号７に表される。
【図５】 図５は、精製された組換えＨＢｓＡｇウイルス様粒子のスクロース密度勾配遠沈の結果を示す。実験は、実施例１に記載される。
【図６】 図６Ａおよび図６Ｂは、ＣＯＳ７細胞でのＨＣＶＥ２−ＨＢｓＡｇ融合タンパク質の発現を図示する。増加する量のｓＡｇコードプラスミドは、ＨＣＶＥ２−ｓＡｇ融合プラスミドと一緒に発現される。実験は、実施例２に記載される。捕獲抗体は、ＭＡｂ ｓＡｇであり、検出抗体は、ＭＡｂ Ｅ２（図６Ａ）またはＭＡｂ ｓＡｇ（図６Ｂ）であった。
【図７】 図７Ａおよび７Ｂは、異なる比のｓＡｇ：Ｅ２−ｓＡｇ融合タンパク質で過渡的にトランスフェクトされたＣＯＳ７細胞から発現されたウイルス様粒子の沈降プロフィールを示す。実験は、実施例２に記載される。捕獲抗体は、ＭＡｂ ｓＡｇであり、検出抗体は、ＭＡｂ Ｅ２（図７Ａ）またはＭＡｂ ｓＡｇ（図７Ｂ）であった。
【図８】 図８Ａおよび８Ｂは、ＣＯＳ７細胞におけるＨＣＶＥ１−ＨＢｓＡｇ融合タンパク質の発現を示す。増加する量のｓＡｇコードプラスミドは、ＨＣＶＥ１−ｓＡｇ融合プラスミドと一緒に発現された。実験は、実施例３に記載される。捕獲抗体は、ＭＡｂ ｓＡｇであり、検出抗体は、ＭＡｂ Ｅ２（図８Ａ）またはＭＡｂ ｓＡｇ（図８Ｂ）であった。
【図９】 図９Ａおよび９Ｂは、５：１の比のｓＡｇ：Ｅ１−ｓＡｇ融合タンパク質で過渡的にトランスフェクトされたＣＯＳ７細胞から発現されたウイルス様粒子の沈降プロフィールを示す。実験は、実施例３に記載される。捕獲抗体は、ＭＡｂ ｓＡｇであり、検出抗体は、ＭＡｂ Ｅ１（図９Ａ）またはＭＡｂ ｓＡｇ（図９Ｂ）であった。
【図１０】 図１０Ａおよび１０Ｂは、ＣＯＳ７細胞中のＥ１−ｓＡｇおよびＥ２−ｓＡｇ融合タンパク質の同時発現および分泌を示す。増加する量のｓＡｇコードプラスミドは、一定量のＥ１−ｓＡｇおよびＥ２−ｓＡｇ融合プラスミドの両方と一緒に発現された。この実験は、実施例４に記載される。図１０Ａにおいて、Ｅ１およびＥ２についての検出抗体が使用され、Ｅ１およびＥ２由来のポリペプチド両方の培地への分泌を示した。図１０Ｂにおいて、検出抗体は、ＭＡｂ ｓＡｇであった。
【配列表】

Claims (29)

1. 免疫原としての使用のためのウイルス様粒子であって、該粒子は、第１のＢ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）およびキメラ抗原を含み、該キメラ抗原は、ＨＣＶ免疫原性ポリペプチドに共有結合された第２のＨＢｓＡｇを含み、そして該第１および該第２のＨＢｓＡｇの各々が、完全なＳドメインを含む、ウイルス様粒子。
2. 前記第１のＨＢｓＡｇがプレＳ２ドメインおよびＳドメインからなる、請求項１に記載のウイルス様粒子。
3. 前記第１のＨＢｓＡｇがプレＳ１ドメイン、プレＳ２ドメイン、およびＳドメインからなる、請求項２に記載のウイルス様粒子。
4. 前記ＨＣＶ免疫原性ポリペプチドのカルボキシ末端が、前記第２のＨＢｓＡｇのアミノ末端に連結されている、請求項１に記載のウイルス様粒子。
5. 前記第１のＨＢｓＡｇが、前記キメラ抗原と比較して過度に発現される、請求項１に記載のウイルス様粒子。
6. 請求項５に記載のウイルス様粒子であって、前記第１のＨＢｓＡｇが、前記キメラ抗原を発現するために使用されるＤＮＡの量の１倍〜１００倍の量のＤＮＡを使用して発現される、ウイルス様粒子。
7. 請求項１に記載のウイルス様粒子であって、前記ＨＣＶ免疫原性ポリペプチドが、ＨＣＶ Ｅ１糖タンパク質、ＨＣＶ Ｅ１糖タンパク質のフラグメント、ＨＣＶ Ｅ２糖タンパク質、またはＨＣＶ Ｅ２糖タンパク質のフラグメントを含む、ウイルス様粒子。
8. 請求項１に記載のウイルス様粒子であって、前記ＨＣＶ免疫原性ポリペプチドが、ＨＣＶ Ｅ１糖タンパク質、ＨＣＶ Ｅ１糖タンパク質のフラグメント、ＨＣＶ Ｅ２糖タンパク質、またはＨＣＶ Ｅ２糖タンパク質のフラグメントからなる、ウイルス様粒子。
9. 請求項７に記載のウイルス様粒子であって、前記ＨＣＶ免疫原性ポリペプチドが、（ａ）ＨＣＶ−１ポリタンパク質のアミノ酸残基１９２〜３３０；または（ｂ）他のＨＣＶ分離物の対応する残基；または（ｃ）１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失および／もしくは付加によって（ａ）もしくは（ｂ）から誘導された、免疫原性活性を有するアミノ酸配列を含む、ウイルス様粒子。
10. 請求項７に記載のウイルス様粒子であって、前記ＨＣＶ免疫原性ポリペプチドが、（ａ）ＨＣＶ−１ポリタンパク質のアミノ酸残基３８４〜６６１；または（ｂ）他のＨＣＶ分離物の対応する残基；または（ｃ）１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失および／もしくは付加によって（ａ）もしくは（ｂ）から誘導された、免疫原性活性を有するアミノ酸配列を含む、ウイルス様粒子。
11. 前記ＨＣＶ免疫原性ポリペプチドが、ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸残基３８４〜６６１からなる、請求項１０に記載のウイルス様粒子。
12. 前記ＨＣＶ免疫原性ポリペプチドが、（１）ＨＣＶ Ｅ１糖タンパク質またはそのフラグメントおよび（２）ＨＣＶ Ｅ２糖タンパク質またはそのフラグメントを含む、請求項１に記載のウイルス様粒子。
13. 免疫原としての使用のためのウイルス様粒子であって、該ウイルス粒子は、第１のＨＢｓＡｇならびに第１および第２のキメラ抗原を含み、該第１のキメラ抗原は、第１の免疫原性ポリペプチドに共有結合された第２のＨＢｓＡｇを含み、該第１の免疫原性ポリペプチドは、ＨＣＶ Ｅ１糖タンパク質またはそのフラグメントを含み、該第２のキメラ抗原は、第２の免疫原性ポリペプチドに共有結合された第３のＨＢｓＡｇを含み、該第２の免疫原性ポリペプチドは、ＨＣＶ Ｅ２糖タンパク質またはそのフラグメントを含み、該第１、第２、および第３のＨＢｓＡｇの各々が、完全なＳドメインを含む、ウイルス様粒子。
14. 前記第１のＨＢｓＡｇがプレＳ２ドメインおよびＳドメインからなる、請求項１３に記載のウイルス様粒子。
15. 前記第１のＨＢｓＡｇがプレＳ１ドメイン、プレＳ２ドメインおよびＳドメインからなる、請求項１３に記載のウイルス様粒子。
16. 請求項１３に記載のウイルス様粒子であって、前記第１の免疫原性ポリペプチドのカルボキシ末端が、前記第２のＨＢｓＡｇのアミノ末端に連結されており、そして前記第２の免疫原性ポリペプチドのカルボキシ末端が前記第３のＨＢｓＡｇのアミノ末端に連結されている、ウイルス様粒子。
17. 前記第１のＨＢｓＡｇが、前記第１および第２のキメラ抗原の総量と比較して過度に発現される、請求項１３に記載のウイルス様粒子。
18. 前記第１のＨＢｓＡｇが、前記第１および第２のキメラ抗原を発現するために使用されるＤＮＡの総量の１〜１００倍である量のＤＮＡを使用して発現される、請求項１７に記載のウイルス様粒子。
19. 請求項１３に記載のウイルス様粒子であって、前記第１の免疫原性ポリペプチドが、（ａ）ＨＣＶ−１ポリタンパク質のアミノ酸残基１９２〜３３０；または（ｂ）他のＨＣＶ分離物の対応する残基；または（ｃ）１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失および／もしくは付加によって（ａ）もしくは（ｂ）から誘導された、免疫原性活性を有するアミノ酸配列を含む、ウイルス様粒子。
20. 請求項１３に記載のウイルス様粒子であって、前記第２の免疫原性ポリペプチドが、（ａ）ＨＣＶ−１ポリタンパク質のアミノ酸残基３８４〜６６１；または（ｂ）他のＨＣＶ分離物の対応する残基；または（ｃ）１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失および／もしくは付加によって（ａ）もしくは（ｂ）から誘導された、免疫原性活性を有するアミノ酸配列を含む、ウイルス様粒子。
21. 請求項１３に記載のウイルス様粒子であって、前記第１の免疫原性ポリペプチドが、ＨＣＶ−１ポリタンパク質のアミノ酸残基１９２〜３３０からなり、そして第２の免疫原性ポリペプチドが、ＨＣＶ−１ポリタンパク質のアミノ酸残基３８４〜６６１からなる、ウイルス様粒子。
22. 免疫原性組成物であって、以下：
    第１のＨＢｓＡｇとキメラ抗原とを含むウイルス様粒子であって、該キメラ抗原が、ＨＣＶ免疫抗原ポリペプチドに連結された第２のＨＢｓＡｇを含み、そして、該第１および第２のＨＢａＡｇの各々が、完全なＳドメインを含む、ウイルス様粒子；ならびに
    薬学的に受容可能なキャリア、
    を含む、免疫原性組成物。
23. 前記第１のＨＢｓＡｇが、前記キメラ抗原と比較して過度に発現される、請求項２２に記載の免疫原性組成物。
24. 前記第１のＨＢｓＡｇが、前記キメラ抗原を発現するために使用されるＤＮＡの量の１倍〜１００倍の量のＤＮＡを使用して発現される、請求項２３に記載の免疫原性組成物。
25. 前記ＨＣＶ免疫原性ポリペプチドが、ＨＣＶ Ｅ１糖タンパク質、ＨＣＶ Ｅ１糖タンパク質のフラグメント、ＨＣＶ Ｅ２糖タンパク質、またはＨＣＶ Ｅ２糖タンパク質のフラグメントを含む、請求項２２に記載の免疫原性組成物。
26. 請求項２２に記載の免疫原性組成物であって、前記ＨＣＶ免疫原性ポリペプチドが、（ａ）ＨＣＶ−１ポリタンパク質のアミノ酸残基１９２〜３３０；または（ｂ）他のＨＣＶ分離物の対応する残基；または（ｃ）１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失および／もしくは付加によって（ａ）もしくは（ｂ）から誘導された、免疫原性活性を有するアミノ酸配列を含む、免疫原性組成物。
27. 前記ＨＣＶ免疫原性ポリペプチドが、（ａ）ＨＣＶ−１ポリタンパク質のアミノ酸残基１９２〜３３０；または（ｂ）他のＨＣＶ分離物の対応する残基からなる、請求項２２に記載の免疫原性組成物。
28. 請求項２２に記載の免疫原性組成物であって、ＨＣＶ免疫原性ポリペプチドが、（ａ）ＨＣＶ−１ポリタンパク質のアミノ酸残基３８４〜６６１；または（ｂ）他のＨＣＶ分離物の対応する残基；または（ｃ）１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失および／もしくは付加によって（ａ）もしくは（ｂ）から誘導された、免疫原性活性を有するアミノ酸配列を含む、免疫原性組成物。
29. 前記ＨＣＶ免疫原性ポリペプチドが、（ａ）ＨＣＶ−１ポリタンパク質のアミノ酸残基３８４〜６６１；または（ｂ）他のＨＣＶ分離物の対応する残基を含む、請求項２２に記載の免疫原性組成物。

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