DE60018601T2

DE60018601T2 - HBV/HCV Virus- hnliche Particle

Info

Publication number: DE60018601T2
Application number: DE60018601T
Authority: DE
Inventors: Mark Selby; Edward Glazer; Michael Houghton
Original assignee: Chiron Corp
Current assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Priority date: 1999-11-24
Filing date: 2000-11-22
Publication date: 2006-03-09
Anticipated expiration: 2020-11-23
Also published as: JP4647870B2; DE60018601D1; JP2003514576A; WO2001038358A3; EP1233783B9; AU1928201A; DE60018601T4; CA2392527A1; CA2392527C; EP1233783B1; EP1233783A2; ES2430368T3; WO2001038358A2; WO2001038358A9; ATE290399T1

Description

TECHNISCHER BEREICH DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft den Bereich rekombinanter Impfstoffe. Sie betrifft im Besonderen den Bereich chimärer Antigene und virusähnlicher Partikel, die in Impfstoffen verwendet werden, insbesondere eine Kombination der Impfstoffe für Hepatitis-B-Virus (HBV) und Hepatitis-C-Virus (HCV).
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Das Hepatitis-C-Virus (HCV) infiziert ungefähr 1 % der Weltbevölkerung und verursacht sehr ernste Gesundheitsprobleme bei etwa 75% der akut infizierten Personen kommt es letztendlich zu einem chronischen Trägerstadium, das in Zirrhose, Ausfall der Leberfunktion und hepatozellulärem Karzinom resultieren kann. Ein sehr kleiner Teil chronisch infizierter Patienten wird natürlicherweise frei von HCV und die chronische Hepatitis löst sich auf. Siehe Alter et al. (1992) N. Engl. J. Med. 327: 1899 – 1905; Resnick and Koff. (1933) Arch. Intern. Med. 153: 1672–1677; Seeff (1955) Gastrointest. Dis. 6: 20 – 27; Tong et al. (1995) N. Engl. J. Med. 332: 1463 – 1466. Immunisierung gegen E2-Glycoproteine einiger Flaviviren (siehe z. B. Konishi et al., (1992) Virology 188: 714 – 720), einschließlich HCV (Ishii et al., (1998) Hepatology 28: 1117 – 1120), kann gegen Infektion schützen. Versuche, rekombinante HCV-E1- und -E2-Glycoproteine zu exprimieren waren frustrierend aufgrund der Tatsache, dass diese Proteine nicht aus der Wirtszelle sekretiert werden, sondern innerhalb des endoplasmatischem Retikulums zurück behalten werden (Dubuisson et al. (1994), J. Virology 68: 6147 – 6160).
Ein Ansatz, der versucht wurde, um Impfstoffe für HCV und andere Viren herzustellen, ist chimäre Antigene herzustellen, die aus Fusionen von Hepatitis-B-Virus-Oberflächenantigen (HBsAg) mit einem heterologen Antigen bestehen, zum Beispiel einem Teil eines HCV-Proteins. Siehe z. B. Inchauspe et al. (1998), Dev. Biol. Stand. 92: 162 – 168; Nakamo et al. (1997) J. Virol. (1997), 71: 7101 – 7109; und Inchauspe et al. (1997), Vaccine 15: 853 – 856. Die Verwendung von HBsAg ist für die Herstellung von immunogenen Zusammensetzungen wie Impfstoffen verlockend, da HBsAg in hohem Maße immunogen ist und von gezüchteten Zellen in Form von virusähnlichen Partikeln sekretiert wird (U.S. Patent 5,098,704). Versuche kleine Teile viraler Proteine in HBsAg einzubringen sind durch die Herstellung virusähnlicher Partikel gelungen (siehe z. B. Delpeyroux et al. (1990), J. Virology 64: 6090 – 6100, die ein Segment von 11 Aminosäuren des Poliovirus-Capsid-Proteins in HBsAg eingebracht hatten). In einer Studie wurden jedoch nur zwei von sechs Fusionsproteinen, die HBsAg kombiniert mit verschiedenen hydrophilen Domänen von HCV-E2 enthielten, als virusähnliche Partikel in das Kulturmedium sekretiert (Lee et al. (1996), J. Med. Virol. 50: 145 – 151), möglicherweise weil die E2-Insertionen zu groß oder hydrophil waren. Die Insertionsstelle von heterologen Epitopen in HBsAg kann einen wichtigen Faktor darstellen. In einer Studie, in der ein Epitop des HBV-Nucleocapsids (HBcAg) an verschiedenen Positionen in HBsAg inseriert wurde, wurde gefunden, dass die Insertion in eine interne Stelle in HBsAg in einem chimären Protein resultierte, das für HBcAg immunogen war, während die Insertion am C-terminalen Ende schwach immunogen war (Schodel et al. (1992), J. Virology 66: 106 – 114). Die Insertion am N-terminalen Ende verhinderte den Oberflächenzugang des HBcAg-Epitops in den resultierenden Partikeln und war nicht immunogen (Id.). Offensichtlich ist der molekulare Zusammenhang, in dem ein Epitop präsentiert wird, bei der Bestimmung der Immunogenität wichtig, wahrscheinlich aufgrund feiner Änderungen der Protein-Sekundär- und -Tertiär-Struktur. Dieses Prinzip wurde von Eckhart und Mitarbeitern ((1996) J. Gen. Virol. 77: 2001 – 2008) weiter veranschaulicht, wobei diese ein konserviertes Epitop von sechs Aminosäuren des HIV-1-gp41-Proteins in Influenza-Hämagglutinin einbrachten und neutralisierende Antikörper erhielten, wobei aber keine neutralisierenden Antikörper erzeugt wurden, wenn das gleiche Epitop in HBsAg inseriert wurde. Kleinere isolierte Epitope sind mit größerer Wahrscheinlichkeit sensitiv für solche Wirkungen als größere Bereiche eines immunogenen Proteins.
Derzeit ist kein Verfahren erhältlich, um vollständige E1- oder E2-Glycoproteine von HCV in virusähnlichen Partikeln zur Verwendung bei Immunisierung zu exprimieren. Erhältliche Verfahren beschränken sich bei chimären Proteinen, die auf HBsAg beruhen, auf die Insertion von ausschließlich kleinen isolierten Domänen von E2, die eine native immunogene Struktur haben können oder nicht. Somit verbleibt im Stand der Technik ein Bedarf nach Verfahren und Materialien, die verwendet werden können, um HCV-Antigene in einer immunogenen Form in virusähnlichen Partikeln zu exprimieren.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es ist ein Gegenstand der Erfindung chimäre HBV/HCV-Antigene zur Verwendung als immunogene Zusammensetzungen bereitzustellen. Es ist ein weiterer Gegenstand der Erfindung, virusähnliche Partikel bereitzustellen, die chimäre HBV/HCV-Antigene umfassen, und Verfahren und Materialien zur Herstellung solcher virusähnlicher Partikel. Es ist ein anderer Gegenstand der Erfindung kombinierte HBV/HCV-Impfstoffe bereitzustellen. Diese und andere erfindungsgemäße Gegenstände werden durch eine oder mehrere der nachfolgend beschriebenen Ausführungsformen bereitgestellt.
Eine erfindungsgemäße Ausführungsform stellt ein virusähnliches Partikel zur Verwendung als ein Immunogen oder als eine Komponente eines Impfstoffs bereit. Das virusähnliche Partikel umfasst ein erstes HBsAg (Hepatitis B-Virus-Oberflächen-Antigen) und ein chimäres Antigen. Das chimäre Antigen umfasst ein zweites HBsAg, das mit einem immunogenen HCV-Polypeptid verbunden ist. Das erste und das zweite HBsAg umfassen jeweils eine im Wesentlichen vollständige S-Domäne.
Eine andere erfindungsgemäße Ausführungsform stellt ein anderes virusähnlich Partikel zur Verwendung als ein Immunogen oder als einen Bestandteil eines Impfstoffs bereit. Das virusähnliche Partikel umfasst ein erstes HBsAg und ein erstes und zweites chimäres Antigen. Das erste chimäre Antigen umfasst ein zweites HBsAg, das mit einem ersten immunogenen Polypeptid verbunden ist, das ein HCV-E1-Glycoprotein oder ein Fragment davon umfasst. Das zweite chimäre Antigen umfasst ein drittes HBsAg, das mit einem zweiten immunogenen Polypeptid verbunden ist, das ein HCV-E2-Glycoprotein oder ein Fragment davon umfasst. Das erste, zweite und dritte HBsAg umfassen jeweils eine im Wesentlichen vollständige S-Domäne.
Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform stellt ein Verfahren zur Herstellung von virusähnlichen Partikeln bereit. Eine Zelle wird in einem Kulturmedium gezüchtet, wobei die Zelle virusähnliche Partikel exprimiert, die ein erstes HBsAg und ein chimäres Antigen umfassen. Das chimäre Antigen umfasst ein zweites HBsAg, das mit einem immunogenen HCV-Polypeptid verbunden ist. Das erste und das zweite HBsAg umfassen jeweils eine im Wesentlichen vollständige S-Domäne. Die virusähnlichen Partikel werden dann aus dem Kulturmedium isoliert.
Noch eine andere Ausführungsform ist ein Verfahren zur Herstellung einer Zelllinie, die virusähnliche Partikel exprimiert. Eine Zelle wird mit einem Vektor transfiziert, der virusähnliche Partikel exprimiert, die ein erstes HBsAg und ein chimäres Antigen umfassen. Das chimäre Antigen umfasst ein zweites HBsAg, das mit einem immunogenen HCV-Polypeptid verbunden ist. Das erste und das zweite HBsAg umfassen jeweils eine im Wesentlichen vollständige S-Domäne. Die Zelle wird gezüchtet, um eine Zelllinie hervorzubringen, die virusähnliche Partikel exprimiert.
Noch andere erfindungsgemäße Ausführungsformen sind Zelllinien, die virusähnliche Partikel exprimieren. In einer Zelllinie umfasst das virusähnliche Partikel ein erstes HBsAg und ein chimäres Antigen. Das chimäre Antigen umfasst ein zweites HBsAg, das mit einem immunogenen HCV-Polypeptid verbunden ist. Das erste und das zweite HBsAg umfassen jeweils eine im Wesentlichen vollständige S-Domäne. In einem anderen Typ von Zelllinie umfassen die virusähnlichen Partikel ein erstes HBsAg und ein erstes und zweites chimäres Antigen. Das erste chimäre Antigen umfasst ein zweites HBsAg, das mit einem ersten immunogenen Polypeptid verbunden ist, das ein HCV-E1-Glycoprotein oder ein Fragment davon umfasst, und das zweite chimäre Antigen umfasst ein drittes HBsAg, das mit einem zweiten immunogenen Polypeptid verbunden ist, das ein HCV-E2-Glycoprotein oder ein Fragment davon umfasst. Das erste, zweite und dritte HBsAg umfassen jeweils eine im Wesentlichen vollständige S-Domäne.
Die Erfindung stellt somit für den gegenwärtigen Stand der Technik neue Verfahren und Materialien zur Herstellung von kombinierten HBV/HCV-Impfstoffen bereit.
KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
Die 1A und 1B – 1F zeigen den Expressionsvektor pCMVII (1A) und dessen Nucleotidsequenz (1B – 1F; SEQ ID NO:1).
Die 2A und 2B – 2I zeigen den Expressionsvektor pCMVII-pS-sAg (2A) und dessen Nucleotidsequenz (2B – 2I und SEQ ID NO:2; die prä-S2- codierende Sequenz beginnt an Nucleotid-Position 1988 und endet mit Nucleotid-Base 2151, und die SAg-codierende Sequenz beginnt mit Base 2153 und endet bei 2830). Die Aminosäuresequenz des codierten prä-S2-S-Polypeptids ist ebenfalls in den 2B – 2I und in SEQ ID NO:3 gezeigt.
Die 3A und 3B – 3I zeigen den Expressionsvektor pCMVII opti 330 E1/SAg (3A) und dessen Nucleotidsequenz (3B – 3I und SEQ ID NO:4; die 330 E1-codierende Sequenz beginnt an Nucleotid-Position 1992 und endet mit Nucleotid-Base 2483 und die SAg-codierende Sequenz beginnt bei Base 2484. Die Aminosäuresequenz des codierten chimären Antigen-Polypeptids ist ebenfalls in den 3B – 3I und in SEQ ID NO:5 gezeigt.
Die 4A und 4B – 4F zeigen den Expressionsvektor pCMV-II-E2661-sAg (4A) und dessen Nucleotidsequenz (4B – 4F und SEQ ID NO:6; die 661-E2-codierende Sequenz beginnt mit Nucleotid-Position 1997 und endet bei Nucleotid-Base 2900 und die sAg-codierende Sequenz beginnt mit Base 2907). Die Aminosäuresequenz des codierten chimären Antigen-Polypeptids ist ebenfalls in den 4B – 4F und in SEQ ID NO:7 gezeigt.
5 zeigt die Ergebnisse der Saccharose-Dichtegradienten-Zentrifugation von gereinigten rekombinanten HBsAg-virusähnlichen Partikeln. Das Experiment ist in Beispiel 1 beschrieben.
Die 6A und 6B illustrieren die Expression von HCV-E2-HBsAg-Fusionsprotein in COS7-Zellen. Ansteigende Mengen von sAg-codierendem Plasmid wurden zusammen mit HCVE2-sAg-Fusionsplasmid exprimiert. Das Experiment ist in Beispiel 2 beschrieben. Der Fang-Antikörper war MAb sAg und der Nachweis-Antikörper war MAb E2 (6A) oder MAb-sAg (6B).
Die 7A und 7B zeigen die Sedimentierungsprofile von virusähnlichen Partikeln, die von COS7-Zellen exprimiert wurden, die mit verschiedenen Verhältnissen von sAg:E2-sAg-Fusionsprotein transient transfiziert wurden. Das Experiment ist in Beispiel 2 beschrieben. Der Fang-Antikörper war MAb sAg und der Nachweis-Antikörper war MAb E2 (7A) oder MAb sAg (7B).
Die 8A und 8B zeigen die Expression von HCVE1-HBsAg-Fusionsprotein in COS7-Zellen. Ansteigende Mengen von sAg-codierendem Plasmid wurden zusammen mit HCVE1-sAg-Fusionsplasmid exprimiert. Das Experiment ist in Beispiel 3 beschrieben. Der Fang-Antikörper war MAb sAg und der Nachweis-Antikörper war MAb E2 (8A) oder MAb sAg (8B).
Die 9A und 9B zeigen die Sedimentierungsprofile von virusähnlichen Partikeln, die von COS7-Zellen exprimiert wurden, die mit einem 5:1-Verhältnis von sAg:E1-sAg-Fusionsprotein transient transfiziert wurden. Das Experiment ist in Beispiel 3 beschrieben. Der Fang-Antikörper war MAb sAg und der Nachweis-Antikörper war MAb E1 (9A) oder MAb sAg (9B).
Die 10A und 10B zeigen die Co-Expression und Sekretion von E1-sAg- und E2-sAg-Fusionsproteinen in COS7-Zellen. Ansteigende Mengen von sAg-codierendem Plasmid wurden zusammen mit konstanten Mengen von sowohl E1-sAg- und E2-sAg-Fusionsplasmiden exprimiert. Das Experiment ist in Beispiel 4 beschrieben. In 10A wurden Antikörper zum Nachweis von E1 und E2 verwendet, wobei die Sekretion sowohl von E1- als auch E2-abstammenden Polypeptiden in das Medium dargestellt wurde. In 10B war der Nachweis-Antikörper MAb sAg.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Es folgt eine Zusammenfassung von Standard-Techniken und -verfahren, die verwendet werden können, um die Erfindung durchzuführen. Diese Zusammenfassung ist keine Eingrenzung der Erfindung, sondern gibt vielmehr Beispiele, die verwendet werden können, aber die nicht erforderlich sind.
Die Durchführung der vorliegenden Erfindung verwendet, falls nicht anders angezeigt, herkömmliche Techniken aus der Molekularbiologie, Mikrobiologie, DNA-Rekombination und Immunologie, die im Erfahrungsbereich des Fachmanns vorliegen. Solche Techniken werden in der Literatur vollständig erklärt, z. B. in Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Zweite Auflage (1989); DNA Cloning, Bände I und II (Hrsg. D.N. Glover, 1985); Oligonucleotide Synthesis (Hrsg. M.J. Gait, 1984); Animal Cell Culture (Hrsg. R.I. Freshney, 1986); die Methods in Enzymology-Serien (Academic Press, Inc.), insbesondere die Bände 154 und 155; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Hrsg. J.H. Miller und M.P. Calos, 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Hrsg. Mayer und Walker, 1987; Academic Press, London).
Es muss erwähnt werden, dass die singulären Formen "ein", "eine", "eines" und "der", "die", "das", wie sie in dieser Beschreibung und den anhängigen Ansprüchen verwendet werden, pluralische Bezugnahmen beinhalten, falls es der Zusammenhang nicht eindeutig anders vorschreibt. So beinhaltet zum Beispiel der Bezug auf "ein Antigen" ein Gemisch von zwei oder mehreren Antigenen und ähnliches.

In dieser Beschreibung werden Standard-Abkürzungen für Nucleotide und Aminosäuren verwendet. Es werden zum Beispiel die nachfolgenden Aminosäure-Abkürzungen durchgehend im Text verwendet:

Alanin: Ala (A)	Arginin: Arg (R)
Asparagin: Asn (N)	Asparaginsäure: Asp (D)
Cystein: Cys (C)	Glutamin: Gln (Q)
Glutaminsäure: Glu (E)	Glycin: Gly (G)
Histidin: His (H)	Isoleucin: Ile (I)
Leucin: Leu (L)	Lysin: Lys (K)
Methionin: Met (M)	Phenylalanin: Phe (F)
Prolin: Pro (P)	Serin: Ser (S)
Threonin: Thr (T)	Tryptophan: Trp (W)
Tyrosin: Tyr (Y)	Valin: Val (V)

I. Definitionen
Bei der Beschreibung der vorliegenden Erfindung werden die nachfolgenden Begriffe verwendet und es ist beabsichtigt, dass sie, wie nachfolgend angegeben, definiert werden.
Die Begriffe "Polypeptid" und "Protein" werden hierin austauschbar verwendet und beziehen sich auf ein Polymer von Aminosäureresten und sind nicht auf eine minimale Länge des Produkts begrenzt. Somit sind Peptide, Oligopeptide, Dimere, Multimere und ähnliches innerhalb dieser Definition eingeschlossen. Es werden sowohl Proteine von vollständiger Länge und Fragmente davon durch die Definition umfasst. Die Begriffe beinhalten auch Modifikationen nach der Expression des Polypeptids, zum Beispiel Glycolisierung, Acetylierung, Phosphorylierung und ähnliches. Darüber hinaus bezieht sich ein "Polypeptid" für die Zwecke der vorliegenden Erfindung auf ein Protein, das Modifikationen bezüglich der nativen Sequenz beinhaltet, wie Deletionen, Additionen und Substitutionen (im Allgemeinen natürlicherweise konservativ), solange das Protein die gewünschte Aktivität beibehält. Diese Modifikationen können vorsätzlich sein, wie durch ortsgerichtete Mutagenese, oder können unbeabsichtigt sein, wie durch Mutationen der Wirte, die die Proteine herstellen, oder aufgrund von Fehlern durch die PCR-Amplifikation.
Ein HCV-Polypeptid ist ein Polypeptid, wie vorstehend definiert, das von dem HCV-Polyprotein abstammt. HCV codiert ein einzelnes Polyprotein, das mehr als 3000 Aminosäurereste besitzt (Choo et al., Sciene (1989) 244: 359 – 362; Choo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991) 88: 2451 – 2455; Han et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1991) 88: 1711 – 1715). Das Polyprotein wird co-translational und post-translational in sowohl strukturelle als auch nicht strukturelle (NS) Proteine prozessiert.
Genau gesagt werden einige Proteine durch das HCV-Genom codiert. Die Reihenfolge und Nomenklatur der Spaltprodukte des HCV-Polyproteins ist wie folgt:
NH₂ – C – E1 – E2 – NS2 – NS3 – NS4a – NS4b – NSSa – NS5b – COOH. Die anfängliche Spaltung des Polyproteins wird durch Wirtsproteasen katalysiert, die drei strukturelle Proteine freisetzen, das N-terminale Nucleocapsid-Protein (genannt "Kern") und zwei Hüll-Glycoproteine, "E1" (auch als E bekannt) und "E2" (auch als E2/NS1 bekannt), sowie nicht strukturelle (NS)-Proteine, die die viralen Enzyme enthalten. Die NS-Regionen werden mit NS2, NS3, NS4 und NS5 bezeichnet. NS2 ist ein integrales Membranprotein mit proteolytischer Aktivität. NS2 spaltet, entweder alleine oder zusammen mit NS3, die sissle NS2 – NS3-Bindung, was wiederum das NS3-N-terminale Ende erzeugt und ein großes Polyprotein freisetzt, das sowohl Serin-Protease- als auch RNA-Helicase-Aktivitäten beinhaltet. Die NS3-Protease dient dazu das verbleibende Polyprotein zu prozessieren. Die Fertigstellung der Polyprotein-Reifung wird durch autokatalytische Spaltung an der NS3 – NS4a-Verbindung initiiert, die durch die NS3-Serin-Protease katalysiert wird. Nachfolgende NS3-vermittelte Spaltungen des HCV-Polyproteins scheinen das Erkennen von Polyprotein-Spaltungsverknüpfungen durch ein NS3-Molekül eines anderen Polypeptids zu beinhalten. Bei diesen Reaktionen setzt NS3 einen NS3-Co-Faktor (NS4a), zwei Proteine mit unbekannter Funktion (NS4b und NS5a) und eine RNA- abhängige RNA-Polymerase (NS5b) frei. Jedes dieser Proteine sowie immunogene Fragmente davon, finden Verwendung bei den vorliegenden chimären Antigenen.
Das Polypeptid, das für chimäre Antigene verwendet werden soll, braucht physikalisch nicht von HCV abzustammen, sondern kann synthetisch oder rekombinant hergestellt werden. Darüber hinaus kann das Polypeptid von irgendeinem der verschiedenen HCV-Stämme abstammen, wie den Stämmen 1, 2, 3 oder 4 von HCV (nachfolgend weiter beschrieben). Eine Vielzahl konservierter und variabler Regionen zwischen diesen Stämmen sind bekannt und die Aminosäuresequenzen der Epitope, die von diesen Regionen abstammen, haben im Allgemeinen einen hohen Grad an Sequenz-Homologie, z. B. eine Aminosäuresequenz-Homologie von mehr als 30%, vorzugsweise mehr als 40%, vorzugsweise mehr als 50%, vorzugsweise mehr als etwa 75%, mehr bevorzugt mehr als etwa 80% bis 85%, vorzugsweise mehr als etwa 90% und am meisten bevorzugt mindestens etwa 95% bis 98% Sequenz-Übereinstimmung oder mehr, wenn die beiden Sequenzen aneinander ausgerichtet werden. Somit bezieht sich zum Beispiel der Begriff "E2"-Polypeptid auf das native E2-Protein von irgendeinem der verschiedenen HCV-Stämme sowie E2-Analoge, Muteine und immunogene Fragmente, wie sie nachfolgend weiter definiert werden.
Die Begriffe "Analog" und "Mutein" beziehen sich auf biologisch aktive Derivate der Bezugsmoleküle oder Fragmente solcher Derivate, die die gewünschte Aktivität beibehalten, wie die immunologische Aktivität, wie sie hierin beschrieben ist. Im Allgemeinen bezieht sich der Begriff "Analog" auf Verbindungen, die eine native Polypeptid-Sequenz und -Struktur mit einer oder mehreren Aminosäure-Additionen, -Substitutionen (im Allgemeinen natürlicherweise konservativ) und/oder -Deletionen in Bezug auf das native Molekül besitzen, solange die Modifikationen die immunogene Aktivität nicht zerstören. Der Begriff "Mutein" bezieht sich auf Peptide, die eine oder mehrere Peptid-Imitationen ("Peptoide") besitzen, wie diejenigen, die in der Internationalen Veröffentlichung Nr. WO 91/04282 beschrieben sind. Vorzugsweise hat das Analog oder Mutein mindestens die gleiche Immunaktivität wie das native Molekül. Verfahren zur Herstellung der Polypeptid-Analoge und -Muteine sind im Stand der Technik bekannt und werden nachfolgend weiter beschrieben.
Besonders bevorzugte Analoge beinhalten Substitutionen, die natürlicherweise konservativ sind, d. h. diejenigen Substitutionen, die innerhalb einer Familie von Aminosäuren stattfinden, die durch ihre Seitenketten miteinander verwandt sind. Spezifisch werden Aminosäuren im Allgemeinen in vier Familien eingeteilt: (1) saure – Aspartat und Glutamat; (2) basische – Lysin, Arginin, Histidin; (3) nicht polare – Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Methionin, Tryptophan; und (4) ungeladene polare – Glycin, Asparagin, Glutamin, Cystein, Serin, Threonin, Tyrosin. Phenylalanin, Tryptophan und Tyrosin werden manchmal als aromatische Aminosäuren klassifiziert. Es ist zum Beispiel einigermaßen vorhersagbar, dass ein einzelner Austausch von Leucin durch Isoleucin oder Valin, eines Aspartats durch ein Glutamat, eines Threonin durch ein Serin oder ein ähnlicher konservativer Austausch einer Aminosäure durch eine strukturell verwandte Aminosäure keinen großen Einfluss auf die biologische Aktivität haben wird. Das Polypeptid von Interesse kann zum Beispiel bis zu etwa 5 bis 10 konservative oder nicht konservative Aminosäure-Substitutionen beinhalten, oder sogar bis zu etwa 15–25 konservative oder nicht konservative Aminosäure-Substitutionen, oder jede beliebige ganze Zahl zwischen 5–25, solange die gewünschte Funktion des Moleküls erhalten bleibt. Ein Fachmann kann leicht die Regionen des Moleküls von Interesse, die Veränderungen tolerieren können, durch Bezugnahme auf Hopp/Woods und Kyte-Doolittle-Plots, die im Stand der Technik gut bekannt sind, bestimmen.
Der Begriff "Fragment" ist für ein Polypeptid gedacht, das aus nur einem Teil der vollständigen intakten Polypeptid-Sequenz und -Struktur besteht. Das Fragment kann eine C-terminale Deletion und/oder eine N-terminale Deletion des nativen Polypeptids beinhalten. Ein "immunogenes Fragment" eines bestimmten HCV-Proteins beinhaltet im Allgemeinen mindestens etwa 5 – 10 aufeinander folgende Aminosäurereste des Moleküls von vollständiger Länge, vorzugsweise mindestens etwa 15 – 25 aufeinander folgende Aminosäurereste des Moleküls von vollständiger Länge und am meisten bevorzugt mindestens etwa 20 – 50 oder mehr aufeinander folgende Aminosäurereste des Moleküls von vollständiger Länge, die ein Epitop definieren, oder jede beliebige ganze Zahl zwischen 5 Aminosäuren und der Sequenz von vollständiger Länge, sofern das fragliche Fragment die Fähigkeit beibehält eine Immunantwort, wie nachfolgend definiert, auszulösen. Bevorzugte immunogene Fragmente beinhalten zum Beispiel, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Fragmente des HCV-Kerns, die zum Beispiel die Aminosäuren 10 bis 45, 10 bis 53, 67 bis 88, 81 bis 130, 86 bis 100, 120 bis 130, 121 bis 135 und 121 bis 170 des Polyproteins umfassen, jeweils nummeriert mit Bezug auf die HCV-1a-Sequenz, die in Choo et al. (1991) Proc Natl Acad Sci USA 88: 2451 dargestellt ist, sowie definierte Epitope, die von der c33c-Region des HCV-Polyproteins abstammen, sowie irgendeines der anderen verschiedenen Epitope, die innerhalb der HCV-Kern-, E1-, E2-, NS3- und NS4-Regionen identifiziert wurden. Siehe z. B. Chien et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89: 10011 – 10015; Chien et al., J. Gastroent. Hepatol. (1993) 8: S33 – 39; Chien et al., Internationale Veröffentlichung Nr. WO 93/00365; Chien, D. Y., Internationale Veröffentlichung Nr. WO 94/01778; und U.S. Patent Nr. 6,150,087.
Repräsentative Fragmente von E1- und E2-Polypeptiden beinhalten C-terminal-verkürzte Varianten dieser Moleküle wie E1-Polypeptide, die mit z. B. den Aminosäuren 369 und niedriger enden, wie z. B. E1-Polypeptide, die mit den Aminosäuren 351, 352, 353 usw. enden, und E2-Polypeptide, die etwa mit den Aminosäuren 730 enden, wie E2-Polypeptide, die zum Beispiel mit den Aminosäuren 716, 717, 718 usw. enden. Diese Moleküle sind z. B. im U.S.-Patent Nr. 6,121,020 beschrieben.
"Antigene Determinanten" beziehen sich auf die Stelle eines Antigens oder Haptens, an die ein spezifisches Antikörper-Molekül oder ein spezifischer Zelloberflächen-Rezeptor bindet.
Der Begriff "Epitop", wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine Sequenz von mindestens etwa 3 bis 5, vorzugsweise etwa 5 bis 10 oder 15 und nicht mehr als etwa 1000 Aminosäuren (oder jede beliebige Zahl dazwischen), die eine Sequenz definiert, die selbst oder als Teil einer größeren Sequenz das Immunsystem eines Wirtes stimuliert, wobei eine zelluläre Antigen-spezifische Immunantwort, wenn das Antigen vorliegt, oder eine humorale Antikörper-Antwort stimuliert wird. Ein Epitop zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung ist nicht eingeschränkt auf ein Polypeptid, das die genaue Sequenz des Teils des elterlichen Proteins besitzt, von dem es abstammt. In der Tat sind virale Genome in einem Stadium von konstantem Fluss und enthalten einige variable Domänen, die unter den Isolaten relativ hohe Grade an Variabilität zeigen. Somit umfasst der Begriff "Epitop" Sequenzen, die mit der nativen Sequenz identisch sind, wie auch Modifikationen der nativen Sequenz wie Deletionen, Additionen und Substitutionen (im Allgemeinen natürlicherweise konservativ).
Bereiche eines vorgegebenen Polypeptids, die ein Epitop beinhalten, können unter Verwendung einer Anzahl von Epitop-Kartierungsverfahren identifiziert werden, die im Stand der Technik gut bekannt sind. Siehe z. B. Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Band 66 (Hrsg. Glenn E. Morris, 1996), Humana Press, Totowa, New Jersey. Zum Beispiel können lineare Epitope bestimmt werden durch z. B. gleichzeitige Synthese großer Zahlen von Peptiden an festen Trägern, wobei die Peptide Bereichen des Protein-Moleküls entsprechen, und Umsetzung der Peptide mit Antikörpern, während die Peptide weiterhin an den Trägermaterialien angeheftet bleiben. Solche Verfahren sind im Stand der Technik bekannt und z. B. beschrieben in; US-Patent Nr. 4,708,871; Geysen et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3998 – 4002; Geysen et al. (1986) Molec. Immunol. 23: 709 – 715. In ähnlicher Weise können Konformationsepitope leicht identifiziert werden, indem die räumliche Konformation der Aminosäuren bestimmt wird, wie z. B. durch Röntgenkristallographie und zweidimensionale Kernmagnetische Resonanz. Siehe z. B. Epitope Mapping Protocols, vorstehend. Antigene Bereiche von Proteinen können auch identifiziert werden, indem Standard-Antigenitäts- und Hydropathie-Plots wie diejenigen, die z. B. unter Verwendung des Omiga-Softwareprogramms, Version 1.0 berechnet wurden, das von der Oxford Molecular Group erhältlich ist. Dieses Computer-Programm verwendet das Hopp/Woods-Verfahren, Hopp et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1981) 78: 3824 – 3828 zur Bestimmung von Antigenitäts-Profilen und das Kyte-Doolittle-Verfahren, Kyte et al., J. Mol. Biol. (1982) 157: 105 – 132 für die Hydropathie-Plots.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "Konformationsepitop" auf einen Teil eines Proteins von vollständiger Länge oder ein Analog oder ein Mutein davon, das strukturelle Merkmale besitzt, die bei der Aminosäuresequenz natürlicherweise vorkommen, die das Epitop innerhalb des natürlichen Proteins von voller Länge codieren. Natürlicherweise vorkommende strukturelle Merkmale beinhalten, sind jedoch nicht beschränkt auf, Glycosylierung und dreidimensionale Struktur. Vorzugsweise wird ein Konformationsepitop rekombinant hergestellt und in einer Zelle exprimiert, aus der es unter Bedingungen extrahiert werden kann, die seine erwünschten strukturellen Merkmale erhalten, z. B. ohne Denaturierung des Epitops.
Solche Zellen beinhalten Bakterien, Hefe-, Insekten- und Säuger-Zellen. Die Expression und Isolierung von rekombinanten Konformationsepitopen aus dem HCV-Polyprotein sind z. B. in den Internationalen Veröffentlichungen Nrn. WO 96/04301, WO 94/01778, WO 95/33053, WO 92/08734 beschrieben.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "T-Zell-Epitop" auf ein Merkmal einer Peptidstruktur, das in der Lage ist, T-Zell-Immunität gegen die Peptidstruktur oder ein assoziiertes Hapten zu induzieren. T-Zell-Epitope umfassen im Allgemeinen lineare Peptid-Determinanten, die erweiterte Konformationen innerhalb der Peptidbindungs-Spalte von MHC-Molekülen annehmen (Unanue et al., Science (1987) 236: 551 – 557). Die Konvertierung der Polypeptide in MHC-Klasse II-assoziierte lineare Peptid-Determinanten (im Allgemeinen zwischen 5 bis 14 Aminosäuren Länge) wird als "Antigen-Prozessierung" bezeichnet, die von Antigen-präsentierenden Zellen (APCs) durchgeführt wird. Genauer gesagt wird ein T-Zell-Epitop durch lokale Merkmale einer kurzen Peptidstruktur definiert, wie primäre Aminosäuresequenz-Eigenschaften, die Ladung und Hydrophobizität beinhalten, und bestimmte Arten von sekundärer Struktur wie Helizität, die nicht von der Faltung des gesamten Polypeptids abhängen. Weiter glaubt man, dass kurze Peptide, die in der Lage sind von T-Helfer-Zellen erkannt zu werden, im Allgemeinen amphipathische Strukturen sind, die eine hydrophobe Stelle (für die Wechselwirkung mit dem MHC-Molekül) und eine hydrophile Stelle (für die Wechselwirkung mit dem T-Zell-Rezeptor) umfassen (Margalit et al., Computer Prediction of T-cell Epitopes, New Generation Vaccines Marcel-Dekker, Inc, Hrsg. G. C. Woodrow et al., (1990) S. 109 – 116) und weiter, dass die amphipathischen Strukturen eine α-helikale Konfiguration besitzen (siehe z. B. Spouge et al., J. Immunol. (1987) 138: 204 – 212; Berkower et al., J. Immunol. (1986) 136: 2498 – 2503).
Infolgedessen können Segmente von Proteinen, die T-Zell-Epitope beinhalten, unter Verwendung zahlreicher Computerprogramme leicht vorhergesagt werden (siehe z. B. Margalit et al., Computer Prediction of T-cell Epitopes, New Generation Vaccines Marcel-Dekker, Inc, Hrsg. G. C. Woddrow et al., (1990) S. 109 – 116). Solche Programme vergleichen im Allgemeinen die Aminosäuresequenz eines Peptids mit Sequenzen, die dafür bekannt sind eine T-Zell-Antwort zu induzieren und suchen nach Mustern von Aminosäuren, von denen man glaubt, dass sie für ein T-Zell-Epitop erforderlich sind.
Eine "immunologische Antwort" auf ein Polypeptid oder eine Zusammensetzung ist die Entwicklung einer humoralen und/oder einer zellulären Immunantwort gegen Moleküle, die in der interessierenden Zusammensetzung vorliegen. Für Zwecke der vorliegenden Erfindung bezieht sich eine "humorale Immunantwort" auf eine Immunantwort, die durch Antikörper-Moleküle vermittelt wird, während eine "zelluläre Immunantwort" eine Immunantwort darstellt, die durch T-Lymphocyten und/oder andere weiße Blutzellen vermittelt wird. Ein wichtiger Aspekt zellulärer Immunität beinhaltet eine Antigen-spezifische Antwort durch cytolytische T-Zellen ("CTLs"). CTLs haben Spezifität für Peptid-Antigene, die in Assoziation mit Proteinen präsentiert werden, die von dem Haupt-Histokompatibilitätskomplex (MHC) codiert werden und auf der Oberfläche von Zellen exprimiert werden. CTLs helfen dabei die intrazelluläre Zerstörung intrazellulärer Mikroben oder die Lyse von Zellen, die von solchen Mikroben infiziert sind, zu induzieren und zu verstärken. Ein anderer Aspekt zellulärer Immunität beinhaltet eine Antigen-spezifische Antwort von T-Helfer-Zellen. T-Helfer-Zellen wirken, indem sie helfen die Funktion von nicht spezifischen Effektorzellen gegen Zellen zu stimulieren, die Peptid-Antigene in Assoziation mit MHC-Molekülen auf ihrer Oberfläche zeigen und dabei deren Aktivität zu fokussieren. Eine "zelluläre Immunantwort" bezieht sich auch auf die Herstellung von Cytokinen, Chemokinen und anderer solcher Moleküle, die von aktivierten T-Zellen und/oder anderen weißen Blutzellen hergestellt werden, einschließlich denjenigen, die von CD4+- und CD8+-T-Zellen abstammen.
Eine Zusammensetzung wie eine immunogene Zusammensetzung oder ein Impfstoff, der eine zelluläre Immunantwort auslöst, kann dazu dienen, ein Wirbeltier-Individuum durch die Präsentation von Antigen in Assoziation mit MHC-Molekülen auf der Zelloberfläche zu sensibilisieren. Die Zell-vermittelte Immunantwort ist auf oder in die unmittelbare Umgebung von Zellen gerichtet, die das Antigen auf ihrer Oberfläche präsentieren. Zusätzlich können Antigen-spezifische T-Lymphocyten erzeugt werden, um den zukünftigen Schutz eines immunisierten Wirts zu gewährleisten.
Die Fähigkeit eines bestimmten Antigens oder einer Zusammensetzung eine Zell-vermittelte immunologische Antwort zu stimulieren kann durch eine Vielzahl von Tests bestimmt werden, wie durch Lymphoproliferations (Lymphoczyten-Aktivierung)-Tests, CTL-cytotoxische Zelltests oder durch Testen auf T-Lymphocyten, die in einem sensibilisierten Individuum für das Antigen spezifisch sind. Solche Tests sind im Stand der Technik gut bekannt. Siehe z. B. Erickson et al., J. Immunol. (1993) 151: 4189 – 4199; Doe et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24: 2369 – 2376; und die nachfolgenden Beispiele.
Somit kann eine immunologische Antwort, wie sie hierin verwendet wird, derart sein, dass sie die Herstellung von CTLs und/oder die Herstellung oder die Aktivierung von T-Helfer-Zellen stimuliert. Das Antigen von Interesse kann auch eine Antikörper-vermittelte Immunantwort auslösen. Infolgedessen kann eine immunologische Antwort eine oder mehrere der nachfolgenden Wirkungen beinhalten: die Herstellung von Antikörpern durch B-Zellen; und/oder die Aktivierung von Suppressor-T-Zellen und/oder yδ-T-Zellen, die spezifisch gegen ein Antigen oder Antigene gerichtet sind, das/die in der interessierenden Zusammensetzung oder dem interessierenden Impfstoff vorliegt/vorliegen. Diese Antworten können dazu dienen, die Infektiösität zu neutralisieren und/oder Antikörper-Komplement oder Antikörper-abhängige Zell-Cytotoxizität (ADCC) zum Schutz für einen immunisierten Wirt zu vermitteln. Solche Antworten können unter Verwendung von Standard-Immuntests und -Neutralisationstests bestimmt werden, die im Stand der Technik gut bekannt sind.
Ein/eine "immunogenes/immunogene" Polypeptid oder Zusammensetzung ist eines/eine, das/die eine immunologische Antwort auslöst, wie vorstehend definiert. Ein "rekombinantes" Protein ist ein Protein, das die gewünschte Aktivität erhält und das anhand von rekombinanten DNA-Verfahren hergestellt wurde, wie hierin beschrieben. Im Allgemeinen wird das interessierende Gen cloniert und dann in transformierten Organismen exprimiert, wie weiter nachfolgend beschrieben. Der Wirts-Organismus exprimiert das Fremdgen, wobei das Protein unter Expressionsbedingungen hergestellt wird.
Mit "isoliert", wenn man sich auf ein Polypeptid bezieht, ist gemeint, dass das angezeigte Molekül für sich allein stehend und getrennt von dem gesamten Organismus vorliegt, in dem das Molekül natürlicherweise gefunden wird, oder es im Wesentlichen frei von anderen biologischen Makromolekülen des gleichen Typs vorliegt. Der Begriff "isoliert" im Hinblick auf ein Polynucleotid bezeichnet ein Nucleinsäuremolekül, gänzlich oder teilweise ohne Sequenzen, mit denen es natürlicherweise assoziiert ist; oder eine Sequenz, wie sie natürlicherweise existiert, wobei jedoch heterologe Sequenzen mit dieser assoziiert sind; oder ein Molekül, das von dem Chromosom getrennt vorliegt.
"Homologie" bezieht sich auf die Prozentzahl-Identität zwischen zwei Polynucleotid- oder zwei Polypeptid-Einheiten. Zwei DNA- oder zwei Polypeptid-Sequenzen sind "im Wesentlichen homolog" miteinander, wenn die Sequenzen mindestens etwa 50%, vorzugsweise mindestens etwa 75%, mehr bevorzugt mindestens etwa 80% bis 85%, vorzugsweise mindestens etwa 90% und am meisten bevorzugt mindestens etwa 95 bis 95% Sequenz-Identität hinsichtlich einer definierten Länge der Moleküle zeigen. Wie hierin verwendet, bezieht sich im Wesentlichen homolog auch auf Sequenzen, die vollständige Identität mit der spezifizierten DNA- oder Polypeptid-Sequenz zeigen.
Im Allgemeinen bezieht sich "Identität" auf eine genaue Nucleotid zu Nucleotid- oder Aminosäure zu Aminosäure-Übereinstimmung von zwei Polynucleotid- bzw. Polypeptid-Sequenzen. Die Prozentzahl an Identität kann durch einen direkten Vergleich der Sequenzinformation zwischen zwei Molekülen bestimmt werden, indem die Sequenzen gegeneinander abgeglichen werden, wobei die genaue Anzahl an Übereinstimmungen zwischen den beiden gegeneinander abgeglichenen Sequenzen gezählt wird, durch die Länge der kürzeren geteilt und das Ergebnis mit 100 multipliziert wird. Leicht erhältliche Computer-Programme können verwendet werden, um die Analyse zu unterstützen, wie ALIGN, Dayhoff, M. O. in Atlas of Protein Sequence and Structure, Hrsg. M. O. Dayhoff, 5. Suppl. 3: 353 – 358, National Biomedical Research Foundation, Washington, DC, die den lokalen Homologie-Algorithmus von Smith and Waterman, Advances in Appl. Math. 2: 482 – 489, 1981, für Peptidanalysen anpasst. Programme zur Bestimmung der Nucleotidsequenz-Identität sind in dem Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 erhältlich (bereitgestellt von Genetics Computer Group, Madison, WI), zum Beispiel die BESTFIT-, FASTA- und GAP-Programme, die ebenfalls auf dem Smith and Waterman-Algorithmus beruhen. Diese Programme sind mit den voreingestellten Kenngrößen, die vom Hersteller empfohlen werden und in dem vorstehend durch Bezugnahme erwähnten Wisconsin Sequence Analysis Package beschrieben sind, leicht verwendbar. Die prozentuale Identität einer bestimmten Nucleotidsequenz mit einer Bezugs-Sequenz kann zum Beispiel unter Verwendung des Homologie- Algorithmus von Smith und Waterman mit einer voreingestellten Bewertungstabelle und einer Lückenpenalty von sechs Nucleotid-Positionen bestimmt werden.
Ein anderes Verfahren, um die Prozentzahl an Identität im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung zu ermitteln, ist die Verwendung des MPSRCH-Pakets von Programmen, die von der Universität von Edinburgh urheberrechtlich geschützt, von John F. Collins und Shane S. Sturrok entwickelt und von IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, CA) verteilt wurden. Anhand dieser Folge von Paketen kann der Smith-Waterman-Algorithmus verwendet werden, wobei voreingestellte Kenngrößen für die Bewertungstabelle verwendet werden (zum Beispiel offene Lückenpenalty von 12, Lückenerweiterungspenalty von eins und eine Lücke von sechs). Von den erzeugten Daten reflektiert der „Übereinstimmungs"-Wert die "Sequenz-Identität". Andere geeignete Programme für die Berechnung der Prozentzahl an Identität oder der Ähnlichkeit zwischen Sequenzen sind im Allgemeinen im Stand der Technik bekannt, zum Beispiel ist BLAST ein anderes Abgleich-Programm, das mit voreingestellten Kenngrößen verwendet wird. BLASTN und BLASTP können zum Beispiel verwendet werden, indem die nachfolgenden voreingestellten Kenngrößen eingesetzt werden: genetischer Code = Standard; Filter = keiner; Strang = beide; Ausschluss = 60; Erwartungswert = 10; Matrix = BLOSUM62; Beschreibungen = 50 Sequenzen; sortieren durch = HIGH SCORE; Datenbanken = nicht redundant, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS-Translationen + Swissprotein + Spupdate + PIR. Einzelheiten dieser Programme können auf den nachfolgenden Internetadressen gefunden werden: httpa/www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST.
Alternativ dazu können Homologien durch Hybridisierung von Polynucleotiden unter Bedingungen bestimmt werden, die stabile Duplexmoleküle zwischen homologen Regionen bilden, gefolgt von Spaltung mit (einer) Einzelstrang-spezifischen Nuclease(n) und Größenbestimmung der gespaltenen Fragmente. DNA-Sequenzen, die im Wesentlichen homolog sind, können in einem Southern-Hybridisierungsexperiment unter zum Beispiel stringenten Bedingungen identifiziert werden, wie für dieses spezielle System definiert. Die Bestimmung geeigneter Hybridisierungsbedingungen liegt innerhalb des Sachverstandes eines Fachmanns. Siehe z. B. Sambrook et al., vorstehend; DNA Cloning, vorstehend; Nucleic Adic Hybridization, vorstehend.
Eine "codierende Sequenz" oder eine Sequenz, die ein ausgewähltes Polypeptid "codiert", ist ein Nucleinsäure-Molekül, das, wenn es unter die Kontrolle von geeigneten regulatorischen Sequenzen platziert wird, in vitro oder in vivo transkribiert (im Fall von DNA) und in ein Polypeptid translatiert (im Fall von mRNA) wird. Die Enden der codierenden Sequenz werden durch ein Start-Codon am 5'-(Amino)-terminalen Ende und ein Translations-Stopp-Codon am 3'-(Carboxy)-terminalen Ende bestimmt. 3'- der codierenden Sequenz kann eine Transkriptions-Terminations-Sequenz lokalisiert sein.
"Funktionell verknüpft" bezieht sich auf eine Anordnung von Elementen, wobei die so beschriebenen Komponenten in der Form angeordnet sind, dass sie ihre erwünschte Funktion durchführen. Somit ist ein gegebener Promotor, der mit einer codierenden Sequenz funktionell verknüpft ist, in der Lage die Expression der codierenden Sequenz zu veranlassen, falls die geeigneten Transkriptionsfaktoren etc. vorliegen. Der Promotor braucht nicht zusammenhängend mit der codierenden Sequenz vorzuliegen, solange er funktioniert, um deren Expression zu steuern. So können zum Beispiel intervenierende nicht translatierte, jedoch transkribierte Sequenzen zwischen der Promotor-Sequenz und der codierenden Sequenz vorliegen, wie es auch transkribierte Introns können, und die Promotor-Sequenz kann noch immer als "funktionell verknüpft" mit der codierenden Sequenz betrachtet werden.
"Rekombinant", wie hierin verwendet, um ein Nucleinsäure-Molekül zu beschreiben, bedeutet ein Polynucleotid von genomischem, cDNA-, viralem, semi-synthetischem oder synthetischem Ursprung, das aufgrund seines Ursprungs oder seiner Manipulation nicht mit dem gesamten oder einem Teil des Polynucleotids assoziiert ist, mit dem es natürlicherweise assoziiert ist. Der Begriff "rekombinant", wie er im Hinblick auf ein Protein oder Polypeptid verwendet wird, bedeutet ein Polypeptid, das durch Expression eines rekombinanten Polynucleotids hergestellt wird. Im Allgemeinen wird das interessierende Gen cloniert und dann in transformierten Organismen exprimiert, wie weiter nachfolgend beschrieben. Der Wirtsorganismus exprimiert das fremde Gen, wobei das Protein unter Expressionsbedingungen hergestellt wird.
Ein "Kontrollelement" bezieht sich auf eine Polynucleotid-Sequenz, die bei der Expression einer codierenden Sequenz mithilft, an die es gekoppelt ist. Der Begriff beinhaltet Promotoren, Transkription-Terminations-Sequenzen, stromaufwärts liegende regulatorische Domänen, Polyadenylierungs-Signale, nicht translatierte Regionen, einschließlich 5'-UTRs und 3'-UTRs und, wenn angemessen, Leader-Sequenzen und Enhancer, die gemeinsam die Transkription und Translation einer codierenden Sequenz in einer Wirtszelle bereitstellen.
Ein "Promotor", wie hierin verwendet, ist eine DNA-regulatorische Region, die in der Lage ist, in einer Wirtszelle RNA-Polymerase zu binden und die Transkription einer stromabwärts (3'-Richtung) liegenden codierenden Sequenz zu initiieren, die damit funktionell verknüpft ist. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung beinhaltet eine Promotor-Sequenz die minimale Anzahl von Basen oder Elementen, die notwendig sind, um die Transkription eines interessierenden Gens in nachweisbaren Mengen gegenüber dem Hintergrund zu initiieren. Innerhalb der Promotor-Sequenz liegen eine Transkriptions-Initiationsstelle sowie Protein-bindende Domänen (Konsensus-Sequenzen), die für die Bindung von RNA-Polymerase verantwortlich sind. Eukaryontische Promotoren enthalten häufig, aber nicht immer, "TATA"-Boxen und "CAT"-Boxen.
Eine Kontroll-Sequenz "steuert die Transkription" einer codierenden Sequenz in einer Zelle, wenn RNA-Polymerase die Promotor-Sequenz bindet und die codierende Sequenz in mRNA transkribiert, die dann in das Polypeptid translatiert wird, das von der codierenden Sequenz codiert wird.
"Expressions-Kassette" oder "Expressions-Konstrukt" bezieht sich auf eine Zusammenfügung, die in der Lage ist die Expression der Sequenzen) oder des/der Gens (Gene) von Interesse zu steuern. Die Expressions-Kassette beinhaltet Kontrollelemente, wie vorstehend beschrieben, wie einen Promotor, der mit der/den Sequenz(en) oder dem/den Gen(en) von Interesse funktionell gekoppelt ist (derart, um die Transkription davon zu steuern) und beinhaltet häufig ebenfalls eine Polyadenylierungssequenz. Innerhalb bestimmter Ausführungsformen der Erfindung kann die hierin beschriebene Expressions-Kassette in einem Plasmid-Konstrukt enthalten sein. Zusätzlich zu den Komponenten der Expressions-Kassette kann das Plasmid-Konstrukt ebenfalls einen oder mehrere selektionierbare Marker, ein Signal, das dem Plasmid-Konstrukt erlaubt, als einzelsträngige DNA zu existieren (z. B., ein M13-Replikationsursprung), mindestens eine multiple Clonierungsstelle und einen" Säuger"-Replikationsursprung (z. B., einen SV40- oder Adenovirus-Replikationsursprung) einschließen.
"Transformation", wie hierin verwendet, bezieht sich auf das Einbringen eines exogenen Polynucleotids in eine Wirtszelle, unabhängig von dem Verfahren, das für das Einbringen verwendet wurde: zum Beispiel Transformation durch direkte Aufnahme, Transfektion, Infektion und ähnliches. Für besondere Verfahren der Transfektion siehe weiter nachfolgend. Das exogene Polynucleotid kann als ein nicht integrierter Vektor erhalten werden, zum Beispiel als ein Episom, oder kann alternativ in das Wirtsgenom integriert sein.
Eine "Wirtszelle" ist eine Zelle, die mit einer exogenen DNA-Sequenz transformiert wurde oder zur Transformation damit in der Lage ist.
Mit "Nucleinsäure-Immunisierung" ist das Einbringen eines Nucleinsäure-Moleküls, das ein oder mehrere ausgewählte Antigene codiert, in eine Wirtszelle, zur in vivo-Expression des Antigens oder der Antigene gemeint. Das Nucleinsäure-Molekül kann direkt in das Empfänger-Individuum eingebracht werden, etwa durch Injektion, Inhalation, durch orale, intranasale und mukosale Verabreichung oder ähnliches, oder kann ex vivo in Zellen eingebracht werden, die von dem Wirt entfernt wurden. In letzterem Fall werden die transformierten Zellen wieder in das Individuum eingebracht, wo eine Immunantwort gegen das Antigen, das von dem Nucleinsäure-Molekül codiert wird, aufgebaut werden kann.
Wie hierin verwendet bezieht sich "Behandlung" beliebig entweder auf (i) das Verhindern von Infektion oder Re-Infektion, wie bei einem traditionellen Impfstoff, (ii) die Verminderung oder Eliminierung von Symptomen und (iii) die wesentliche oder vollständige Eliminierung des fraglichen Pathogens. Die Behandlung kann prophylaktisch (vor der Infektion) oder therapeutisch (nach der Infektion) durchgeführt werden.
Mit "Wirbeltier-Individuum" ist jedes beliebige Mitglied des Unterstammes Cordata gemeint, einschließlich, ohne Eingrenzung, Menschen und andere Primaten, einschließlich nicht menschliche Primaten wie Schimpansen und andere Affen und Affenarten; Farmtiere wie Rind, Schaf, Schweine, Ziegen und Pferde; Haustiere wie Hunde und Katzen; Labortiere, einschließlich Nager wie Mäuse, Ratten und Meerschweinchen; Vögel, einschließlich Haus-, Wild- und Jagd-Vögel wie Hühner, Truthähne und andere Hühnervögel, Enten, Gänse und ähnliche. Der Begriff bezeichnet kein bestimmtes Alter. So ist beabsichtigt, dass sowohl ausgewachsene als auch neugeborene Individuen abgedeckt sind. Die hierin beschriebene Erfindung ist zur Verwendung mit jeder beliebigen der vorstehenden Wirbeltierarten beabsichtigt, da die Immunsysteme von all diesen Wirbeltieren in ähnlicher Weise arbeiten.
II. Arten, die Erfindung durchzuführen
Bevor die vorliegende Erfindung in Einzelheiten beschrieben wird, soll verstanden werden, dass diese Erfindung in Bezug auf bestimmte Formulierungen oder Verfahrens-Kenngrößen nicht eingeschränkt ist, da solche natürlich variieren können. Es soll auch verstanden werden, dass die hierin verwendete Terminologie ausschließlich zum Zweck der Beschreibung bestimmter Ausführungsformen der Erfindung gedacht ist und nicht als eingrenzend.
Obwohl eine Vielzahl von Zusammensetzungen und Verfahren bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, die mit den hierin beschriebenen ähnlich oder äquivalent sind, werden die bevorzugten Materialien und Verfahren hierin beschrieben.
Wie vorstehend angemerkt, verstärken chimäre Antigene, die HBsAg mit Teilen von HCV-Proteinen kombinieren, die Präsentation von schwach immunogenen HCV-Proteinen für das Immunsystem aufgrund der starken Antigenität von HBsAg. Virusähnliche Partikel enthalten typischerweise eine Hüllmembran, in die eines oder mehrere virale Hüllproteine eingebettet sind. Virusähnliche Partikel werden von einer Zelle, die mit einem Virus infiziert ist, oder einer Zelle, die mit einem Nucleinsäure-Molekül transfiziert wurde, das eines oder mehrere virale Proteine codiert, sekretiert.
Virusähnliche Partikel sind eine besonders vorteilhafte Form der Antigen-Präsentation. Virusähnliche Partikel, die HBsAg-Chimären enthalten, kombinieren die hoch antigene Natur von HBsAg selbst mit der gewünschten Präsentation anderer Antigene auf der Oberfläche einer bestimmten Präparation.
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren und Materialien für die Produktion von immunogenen Zusammensetzungen wie Impfstoffen bereit, die die Produktion von chimären HBV/HCV-Antigenen in Form von virusähnlichen Partikeln ermöglichen. Durch Verwendung von Co-Expression von HBsAG zusammen mit den chimären Antigenen ist es jetzt möglich große Segmente von HCV-Hüll-Glycoproteinen einzuschließen, die in Form von virusähnlichen Partikeln mit HBsAg fusioniert sind. Solche Partikel sind für die Verwendung in immunogenen Zusammensetzungen besonders gut geeignet.
Die Strategie zur Herstellung von HBV/HCV-virusähnlichen Partikeln hängt zuerst von der Herstellung von einem oder mehreren chimären Antigenen zur Darbietung in den Partikeln ab. Solche chimären Antigene sind Fusionsproteine, die eine im Wesentlichen vollständige S-Domäne eines HBsAg-Polypeptids (hierin mit "sAg" bezeichnet) und ein immunogenes HCV-Polypeptid oder Fragment davon umfassen. Eine S-Domäne von HBsAg oder jedes beliebige andere erfindungsgemäße Polypeptid ist "im Wesentlichen vollständig", wenn es die native Sequenz des Polypeptids mit oder ohne geringfügige Deletionen von einer oder einigen wenigen Aminosäuren von entweder den N-terminalen oder C-terminalen Bereichen oder innerhalb des Polypeptids enthält. Die HBsAg-S-Domäne kann zum Beispiel durch einige wenige Aminosäuren verkürzt sein, d. h. bis zu etwa 3, 5, 7 oder 10 Aminosäuren, ohne entweder dessen Antigenizität oder Fähigkeit die Bildung von virusähnlichen Partikeln auszulösen groß zu beeinträchtigen. Linker-Sequenzen von beliebiger gewünschter Länge, vorzugsweise nicht mehr als einige wenige Aminosäuren, können zwischen die Polypeptide angefügt werden, die miteinander verknüpft werden, um das Fusionsprotein zu bilden. Es können entweder prä-S2 (ehemals prä-S genannt) oder sowohl prä-S2- als auch prä-S1-Domänen von HBsAg ebenfalls an dem Amino-terminalen Ende des HBsAg-Polypeptid eingeschlossen sein, falls erwünscht.
Valenzuela, et al. (1982) Nature 298: 347 – 350, beschreiben das Gen für HBsAg. Siehe auch, Valenzuela, et al. (1979) Nature 280: 815 – 819. Proteine, die von der HBV-Oberfläche stammen, wie das Oberflächen-Antigen sAg, sowie die Prä-Oberflächen-Sequenzen, prä-S1 und prä-S2, und jede beliebige Kombination dieser Sequenzen können nach Expression in einer geeigneten Wirtszelle, wie etwa nach Expression in Säuger-, Insekten-, Hefe- oder Xenopus-Zellen, spontan Partikel bilden. Somit können HCV/HBV-virusähnliche Partikel für die erfindungsgemäße Verwendung, wie vorstehend erklärt, Partikel-bildende Polypeptide von sAg, prä-S1 und/oder prä-S2 sowie Partikel-bildende Polypeptide von jeder beliebigen Kombination des Vorstehenden beinhalten, wie sAg/prä-S1, sAg/prä-S2 und sAg/prä-S1/prä-S2. Siehe z. B. "HBV Vaccines – from the laboratory to license: a case study" in Mackett, M. and Williamson, J. D., Human Vaccines and Vaccination, S. 159 – 176, für eine Diskussion der HBV-Struktur; und die US-Patente mit den Nrn. 4,722,840, 5,098,704, 5,324,513, 5,965,140, Beames et al., J. Virol. (1995) 69: 6833 – 6838, Birnbaum et al., J. Virol. (1990) 64: 3319 – 3330, Zhou et al., J. Virol. (1990) 65: 5457 – 5464, für Beschreibungen der rekombinanten Herstellung verschiedener HBV-Partikel.
HCV besitzt ein Genom, das einen einzelnen offenen Leserahmen von etwa 9,5 kb enthält, der in ein Polyprotein transkribiert wird. Das HCV-Polyprotein wird gespalten, wobei mindestens zehn verschiedene Produkte gebildet werden, welche sind NH₂ – Kern – E1 – E2 – p7 – NS2 – NS3 – NS4a – NS4b – NS5a – NS5b – COOH. Die HCV-E1 und -E2-Proteine werden posttranslational glycosyliert. Die Sequenz des Polyproteins von vollständiger Länge ist in der Europäischen Veröffentlichung Nr. 388,232 und dem US-Patent mit der Nr. 6,150,087 offenbart. Darüber hinaus sind Sequenzen für die vorstehenden HCV-Polyprotein-Produkte und immunogenen Polypeptide, die davon abstammen, bekannt (siehe z. B. US-Patent Nr. 5,350,671). Es sind zum Beispiel eine Vielzahl von allgemeinen und spezifischen immunogenen Polypeptiden beschrieben worden, die von dem HCV-Polyprotein abstammen. Siehe z. B. Houghton et al., Europäische Veröffentlichungen Nrn. 318,216 und 388,232; Choo et al., Science (1989) 244: 359 – 362; Kuo et al. Science (1989) 244: 362 – 364; Houghton et al. Hepatology (1991) 14: 381 – 388; Chien et al.
Proc. Natl. Acad. Sci.USA (1992) 89: 10011 – 10015; Chien et al. J. Gastroent. Hepatol. (1993) 8: S33 – 39; Chien et al., Internationale Veröffentlichung Nr. WO 93/00365; Chien, D. Y., Internationale Veröffentlichung Nr. WO 94/01778. Die Veröffentlichungen stellen einen umfangreichen Hintergrund von HCV im Allgemeinen sowie über die Herstellung und Verwendungen von immunologischen Reagenzien des HCV-Polypeptids bereit.
Jedes gewünschte HCV-Polypeptid kann als Teil des chimären Antigens verwendet werden, einschließlich zum Beispiel die E1- und/oder E2-Hüllglycoproteine von HCV. Das E1-Glycoprotein entspricht den Aminosäureresten 192 bis 383 und E2 erstreckt sich in den meisten HCV-Stämmen von etwa Aminosäure 384 bis Aminosäure 746. Siehe Choo et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 2451 – 2455. Bevorzugte E1-Polypeptide sind diejenigen, die mit einem beliebigen Aminosäurerest von einer beliebigen der Positionen 192 bis 360 des HCV-Polyproteins beginnen und sich über eine beliebige wünschenswerte Länge bis zu und einschließlich dem Rest 383 erstrecken. Bevorzugte E2-Polypeptide sind diejenigen, die mit einem beliebigen Aminosäurerest von den Positionen 384 bis 725 des HCV-Polyproteins beginnen und sich auf eine beliebige Länge bis zu und einschließlich dem Rest 746 erstrecken. Ein Fragment der E1- oder E2-Glycoproteine, das in dem chimären Antigen verwendet wird, sollte vorzugsweise ein Epitop, eine Domäne oder eine andere strukturelle Einheit umfassen, die immunogen ist.
Ein E1- oder E2-Glycoprotein oder Fragment davon, das in einem chimären Antigen verwendet werden soll, wird vorzugsweise seine native Konformation erhalten oder dieser ähnlich sein. Wenn eine im Wesentlichen native Konformation des HCV-Polypeptids in dem Fusionsprotein erhalten ist, das HBsAg enthält, dann werden Antikörper, die gegen das HCV-Polypeptid gebildet werden, das entsprechende Polypeptid in HCV erkennen und daran binden.
Andere HCV-Polypeptide können ebenfalls in den erfindungsgemäßen chimären Antigenen verwendet werden. Zum Beispiel HCV-Polypeptide, die von der Kernregion abstammen, wie Polypeptide, die von der Region abstammen, die zwischen den Aminosäuren 1 – 191; Aminosäuren 10 – 53; Aminosäuren 10 – 45; Aminosäuren 67 – 88; Aminosäuren 86 – 100; 81 – 130; Aminosäuren 121 – 135; Aminosäuren 120 – 130; Aminosäuren 121 – 170 liegt; und jedes beliebige der Kern-Epitope, die identifiziert wurden, z. B. in Houghton et al., US-Patent Nr. 5,350,671; Chien et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89: 10011 – 10015; Chien et al. J. Gastroent. Hepatol. (1993) 8: S33 – 39; Chien et al., Internationale Veröffentlichung Nr. WO 93/00365; Chien, D. Y., Internationale Veröffentlichung Nr. WO 94/01778; und US-Patent Nr. 6,150,087, werden bei den vorliegenden chimären Molekülen Verwendung finden.
Zusätzlich werden auch Polypeptide hierin Verwendung finden, die von den nicht strukturellen Regionen des Virus abstammen. Die NS3/4a-Region des HCV-Polyproteins ist beschrieben worden und die Aminosäuresequenz und die gesamte Struktur des Proteins sind in Yao et al. Structure (November 1999) 7: 1353 – 1363 offenbart. Siehe auch Dasmahapatra et al., US-Patent Nr. 5,843,752. Wie vorstehend erklärt, können entweder die native Sequenz oder immunogene Analoge in den vorliegenden Formulierungen verwendet werden. Dasmahapatra et al., US-Patent Nr. 5,843,752 und Zhang et al., US-Patent Nr. 5,990,276, beschreiben beide Analoge von NS3/4a und Verfahren zur Herstellung derselbigen.
Zusätzlich können vielfache Epitop-Fusionsantigene (genannt "MEFAs"), wie in der Internationalen Veröffentlichung Nr. WO 97/44469 beschrieben, in den vorliegenden Chimären verwendet werden. Solche MEFAs beinhalten vielfache Epitope, die von zwei oder mehreren der verschiedenen viralen Regionen abstammen. Die Epitope stammen vorzugsweise von mehr als einem HCV-Stamm und stellen somit die zusätzliche Fähigkeit bereit in einem einzelnen Impfstoff gegen mehrere Stämme von HCV zu schützen.
Darüber hinaus können Polypeptide, die in den vorliegenden Chimären verwendet werden sollen, von der NS3-Region des HCV-Polyproteins abstammen. Eine Vielzahl solcher Polypeptide sind bekannt, einschließlich, jedoch nicht eingeschränkt auf, Polypeptide, die von den c33c- und c100-Regionen abstammen, sowie Fusionsproteine, die ein NS3-Epitop umfassen, wie c25. Diese und andere NS3-Polypeptide sind für die vorliegenden Zusammensetzungen zweckmäßig und sind im Stand der Technik bekannt und beschrieben in z. B. Houghton et al., US-Patent Nr. 5,350,671; Chien et al. Proc. Natl. Acad. Sci, USA (1992) 89: 10011 – 10015; Chien et al. J. Gastroent. Hepatol. (1993) 8: S33 – 39; Chien et al., Internationale Veröffentlichung Nr. WO 93/00365; Chien, D. Y., Internationale Veröffentlichung Nr. WO 94/01778; und US-Patent Nr. 6,150,087.
Es ist leicht offensichtlich, dass eine Vielzahl von HCV-Polypeptiden für die vorliegenden chimären Moleküle verwendet werden können oder mit diesen gemeinsam verabreicht werden können, um eine Immunantwort gegen das fragliche HCV-Antigen bereitzustellen.
Wie vorstehend erklärt, können die HCV-Antigene in ihrer Gesamtheit verwendet werden oder es können immunogene Fragmente davon sowie immunogene Varianten mit einem HBsAg-Polypeptid kombiniert werden, um durch Fusion der Gensequenzen, die die gewünschten Polypeptid-Sequenzen codieren, im richtigen Leserahmen das chimäre Antigen zu bilden, wobei Standardverfahren verwendet werden, die im Stand der Technik verfügbar sind. Somit können HBV- oder HCV-Polypeptide, die zur Verwendung in der Erfindung beschrieben sind, durch Deletionen, Insertionen oder konservative Aminosäure-Substitutionen modifiziert sein, vorausgesetzt, dass eine im Wesentlichen native Konformation für das HCV-Epitop erhalten wird, das für die Verwendung als ein Immunogen beabsichtigt ist. Vorzugsweise ist das HCV-Polypeptid oder Polypeptid-Fragment so ausgewählt, dass es nach Expression in einem Fusionsprotein mit HBsAg im Wesentlichen die native Konformation des entsprechenden Bereichs des HCV-Proteins erhält, von dem es abstammt, d. h. die annähernd gleiche Konformation, die in einem reifen HCV-Virion existiert.
Es sollte angemerkt werden, dass im Allgemeinen zweckmäßigerweise die verschiedenen HCV-Regionen hinsichtlich der Aminosäure-Nummer in Bezug auf das Polyprotein definiert sind, das von dem Genom des HCV-1a codiert wird, wie beschrieben in Choo et al. (1991) Proc Natl Acad Sci USA 88: 2451, wobei das Initiator-Methionin als Position 1 bezeichnet wird. Die Polypeptide zur Verwendung mit der vorliegenden Erfindung sind jedoch nicht eingeschränkt auf diejenigen, die von der HCV-1a-Sequenz abstammen. Jeder beliebige Stamm oder jedes beliebige Isolat von HCV kann als die Grundlage für die Bereitstellung antigener Sequenzen zur Verwendung im Rahmen der Erfindung dienen. In dieser Hinsicht können die entsprechenden Regionen in einem anderen HCV-Isolat durch Abgleich der Sequenzen von den beiden Isolaten derart, dass die Sequenzen maximal abgeglichen sind, leicht bestimmt werden.
Verschiedene Stämme und Isolate von HCV, die sich voneinander durch Austausche der Nucleotid- und Aminosäuresequenz unterscheiden, sind im Stand der Technik bekannt. Das Isolat HCV J1.1 ist zum Beispiel beschrieben in Kubo et al. (1989) Japan. Nucl. Acids. Res. 17: 10367 – 10372; Takeuchi et al. (1990) Gene 91: 287 – 291; Takeuchi et al. (1990) J. Gen. Virol. 71: 3027 – 3033; und Takeuchi et al (1990) Nucl. Acids Res. 18: 4626. Die vollständige codierende Sequenz von zwei unabhängigen Isolaten, HCV-J und BK, sind beschrieben von Kato et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 9524 – 9528 bzw. Takamizawa et al., (1991) J. Virol. 65: 1105 – 1113. HCV-1-Isolate sind beschrieben von Choo et al. (1990) Brit. Med. Bull. 46: 423 – 441; Choo et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 2451 – 2455 und Han et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 1711 – 1715. HCV-Isolate HC-J1 und HC-J4 sind beschrieben in Okamoto et al. (1991) Japan J. Exp. Med. 60: 167 – 177. HCV-Isolate HCT 18, HCT 23, Th, HCT 27, EC1 und EC10 sind beschrieben in Weiner et al. (1991) Virol. 180: 842 – 848. HCV-Isolate Pt-1, HCV-K1 und HCV-K2 sind beschrieben in Enomoto et al. (1990) Biochem. Biophys. Res. Commun. 170: 1021 – 1025. HCV-Isolate A, C, D und E sind beschrieben in Tsukiyama-Kohara et al. (1991) Virus Genes 5: 243 – 254.
Codierende Sequenzen für natürlicherweise vorkommende HCV-Polypeptide zur Verwendung in den erfindungsgemäßen Nucleinsäure-Molekülen oder Vektoren können von jedem beliebigen der vorstehend zitierten Stämme von HCV erhalten werden oder von neu entdeckten Isolaten, die aus Geweben oder Flüssigkeiten von Infizierten isoliert wurden. Bei der Auswahl von HCV-Polypeptiden oder deren Fragmenten von verschiedenen HCV-Stämmen zur Verwendung in einem erfindungsgemäßen chimären Antigen wird bevorzugt, dass die Nucleotid- oder Aminosäuresequenzen auf maximale Überlappung zwischen den Stämmen abgeglichen werden. Dies kann zum Beispiel erreicht werden, indem Insertionen oder Deletionen von Aminosäuren ausgeglichen werden, so dass die größtmögliche Überlappung zwischen Stämmen erhalten wird, bevor eine Sequenz zur Einfügung in das chimäre Antigen ausgewählt wird. Wenn eine hierin offenbarte Sequenz von einem anderen HCV-Stamm ausgewählt wird, dann wird vorzugsweise die übereinstimmende Sequenz ausgewählt, d. h. die Sequenz, die so abgeglichen wurde, dass sie in der größtmöglichen Anzahl von Resten mit der offenbarten Sequenz übereinstimmt. Es können auch modifizierte Sequenzen verwendet werden, die natürlicherweise nicht auftreten. Ein erfindungsgemäßes "Nucleinsäure-Molekül" kann jede beliebige Nucleinsäure, wie DNA oder RNA, entweder einzel- oder doppelsträngig, oder jedes beliebige analoge oder chemische Derivat davon, das ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein oder einen Teil davon codiert, oder jedes beliebige HBsAg oder ein Teil davon sein.
Erfindungsgemäße Nucleinsäure-Moleküle können in Expressionsvektoren cloniert und in diese transformiert werden, zum Beispiel Bakterien-, Hefe-, Pflanzen-, Insekten- oder Säuger-Zellen, derart, dass die erfindungsgemäßen chimären Antigene und virusähnlichen Partikel in der Zellkultur exprimiert und daraus isoliert werden können. Nucleinsäure-Moleküle können innerhalb eines Plasmids wie pBR322, pUC, ColE1 oder verwandten Plasmiden wie pCMV6a (siehe U.S. Patent 5.688.688) oder in Plasmiden, die davon abstammen, enthalten sein. Nucleinsäure-Moleküle können auch innerhalb eines viralen Vektors wie jedem beliebigen Vektor, der von Adenovirus, Sindbis-Virus, Affenvirus 40, Cytomegalie-Virus und Retroviren wie murines Sarcom-Virus, Maus-Mamma-Tumor-Virus, murines Moloney-Leukämie-Virus und Rous-Sarkom-Virus abstammt, enthalten sein. Bakterielle Vektoren wie Salmonella ssp., Yersinia enterocolitica, Shigilla ssp., Vibrio cholerae, Mycobacterium-Stamm BCG und Listeria monocytogenes können auch verwendet werden. Minichromosomen wie MC und MC1, Bakteriophagen, Cosmide und Replicons können ebenso verwendet werden.
Jeder geeignete Expressionsvektor kann konstruiert oder verwendet werden, um jede beliebige Form von HBsAg oder jedes beliebige erfindungsgemäße chimäre Antigen zu exprimieren. Ein bevorzugter Vektor ist pCMVII, ein auf pUC19 basierender Clonierungsvektor, der für die Expression in Säugerzellen entworfen wurde. pCMVII umfasst die nachfolgenden Elemente: den menschlichen CMV IE-Enhancer/Promotor, das menschliche CMV-Intron A, eine menschliche Gewebe-Plasminogen-Aktivator (tPA)-Leader-Sequenz, eine Rinder-Wachstumshormon-Poly A-Terminations-Sequenz (BGHt), einen ColE1-Replikationsursprung und ein AmpR-Ampicillin-Resistenzgen (1A und 1B – 1F, SEQ ID NO:1). pCMVII-pS2-sAg kann zur Expression von prä-S2-HBsAg verwendet werden (2A und 2B – 2I, SEQ ID NO:2 und 3). In pCMVII-pS2-sAg sind die codierenden Sequenzen für die prä-S2- und S-Domänen von HBsAg in pCMVII zwischen das CMV-Intron A und BGHt inseriert worden; dieser Vektor kann auch modifiziert werden, indem man die codierenden Sequenzen für die prä-S1-Domäne hinzufügt oder die prä-S2-Domäne entfernt. Chimäre Antigene, die HBsAg zusammen mit Epitopen von HCV-Proteinen enthalten, können in ähnlicher Weise wie pCMVII opti 330 E1/sAg (3A und 3B – 3I, SEQ ID NO:4 und 5) oder pCMVII-E 2661-sAg (4A und 4B – 4F, SEQ ID NO:6 und 7) konstruiert werden. Diese Vektoren werden als Beispiel bereitgestellt und es ist nicht beabsichtigt, dass sie den Schutzumfang der Erfindung einschränken. Isolierte und gereinigte pCMVII-Vektoren, die eine Insertion enthalten, die HBsAg oder ein chimäres Antigen codiert, können in sterilem 0,9%igem physiologischen Kochsalzpuffer oder einem anderen geeigneten Puffer gelöst werden, bevor sie verwendet werden.
Die Expression der chimären Antigene zur Verwendung als Immunogene erfordert die Transfektion von eukaryontischen Zellen mit einem Expressionsvektor. Jede beliebige eukaryontische Zelllinie kann verwendet werden, zum Beispiel CHO- Zellen oder COS-Zellen. Ein Nucleinsäure-Molekül, das ein chimäres Antigen codiert, kann in jeden beliebigen Vektor eingebaut werden, der zur Transfektion geeignet ist, zum Beispiel ein Plasmidvektor oder ein viraler Vektor. Falls ein viraler Vektor verwendet wird, produziert dieser vorzugsweise fehlerhafte, nicht infektiöse Viruspartikel, so dass das Risiko für eine Kontamination mit infektiösen Viren bei einer Impfstoffpräparation minimiert wird.
Die Transfektion kann durch jedes beliebige bekannte Verfahren durchgeführt werden und kann entweder in einer transienten Transfektion oder einer stabilen Transfektion resultieren. Um eine Zelllinie zu etablieren, die HBV/HCV-virusähnliche Partikel produziert, wird die stabile Transfektion bevorzugt. Verfahren zum Erhalten stabiler Transfektion sind gut bekannt und beinhalten zum Beispiel die Auswahl spontan stabiler Transfektanten, die Transfektion mit immortalisierenden Genen (siehe z. B. Katakura et al., Methods Cell Biol. (1998) 57: 69 – 91) und die Auswahl von Genen, die Resistenz gegen Antibiotika wie Hygromycin B und Neomycin bereit stellen. Ein bevorzugtes Verfahren für CHO-Zellen beinhaltet die Auswahl von Zellen, die mit Dihydrofolatreduktase transfiziert wurden, gefolgt von der Amplifikation des Transgens unter Verwendung von Methotrexat (siehe Wurm et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. (1996) 782: 70 – 78).
Die Co-Expression von chimären Antigenen mit HBsAg resultiert in der Bildung und Sekretion von virusähnlichen Partikeln. Die optimale Sekretion von virusähnlichen Partikeln erfordert eine ausreichende Menge an Expression von HBsAg in Bezug auf die Expression von chimärem Antigen und höhere Mengen an HBsAg-Expression verbessern im Allgemeinen die Wirksamkeit der Sekretion von chimärem Antigen. Die Sekretion von chimärem Antigen als virusähnliche Partikel kann optimiert werden, indem das Verhältnis der codierenden Sequenzen für HBsAg zu den codierenden Sequenzen für das chimäre Antigen variiert wird. Im Allgemeinen wird bei Verhältnissen von HBsAg-codierenden Sequenzen zu chimärem Antigen-codierenden Sequenzen von etwa 1 : 1, 2 : 1, 3 : 1, 4 : 1, 5 : 1, 7 1, 10 : 1, 20 : 1, 30 : 1, 40 : 1, 50 : 1 oder 100 : 1 eine zweckmäßige Sekretion virusähnlicher Partikel erhalten. Verhältnisse geringer als 1 : 1 stellen einen reduzierten Ertrag von virusähnlichen Partikeln, die chimäres Antigen enthalten, bereit, während hohe Verhältnisse größer als 100 : 1 das chimäre Antigen ausdünnen und schließlich die Verwendbarkeit der Partikel aufgrund von Verdünnung des chimären Antigens mit HBsAg einschränken.
Eine Strategie, um Wirtszellen mit den erfindungsgemäßen Vektoren zu transfizieren, entweder für die in vitro-Produktion von virusähnlichen Partikeln oder für die Immunisierung eines Wirtsorganismus, wobei ein Nucleinsäure-Impfstoff verwendet wird, ist zwei oder mehrere getrennte Vektoren bereitzustellen, wobei einer HBsAg codiert und einer oder mehrere jeweils ein chimäres Antigen codieren. Eine andere Strategie ist es, sowohl HBsAg als auch eines oder mehrere chimäre Antigene in einem einzelnen Konstrukt einzuschließen. Zum Beispiel ein Expressionsvektor, der einen einzigen offenen Leserahmen enthält, könnte eine codierende Sequenz für HBsAg unter der Kontrolle eines Promotors haben, gefolgt von Sequenzen, die eines oder mehrere chimäre Antigene codieren, wobei jedem eine interne ribosomale Eintrittsstelle vorausgeht IRES, siehe z. B. Martinez-Salas (1999) Curr. Op. Biotechnol. 10: 458 – 464). Somit umfasst die Erfindung die Verwendung von entweder einem einzelnen immunogenen Polypeptid oder von multiplen verschiedenen immunogenen Polypeptiden in einem einzelnen virusähnlichen Partikel. Die Expression der immunogenen Polypeptide kann gegebenenfalls reguliert werden, indem Promotor und/oder Enhancer-Sequenzen in den Expressionsvektor eingeschlossen werden, die auf Aktivatoren antworten, die in die transfizierten Zellen eingebracht werden.
Zellen, die mit einem Plasmid oder viralen Vektoren transfiziert wurden, die chimäre HBV/HCV-Antigene zusammen mit HBsAg exprimieren, können analysiert werden, um zu bestimmen, ob jedes Antigen exprimiert und in Form von virusähnlichen Partikeln sekretiert wird. Jeder beliebige Standard-Immuntest kann verwendet werden, um HBV- und HCV-Antigene nachzuweisen, einschließlich zum Beispiel Chemilumineszenz-Tests (siehe z. B. den Magic Lite-Test in den Beispielen 1 – 4; Woodhead, J. S. and Weeks, I. (1989) J. Biolumin. Chemilumin. 4: 611 – 14), ELISA und Radioimmuntests. Wo ein Antigen durch transfizierte Zellen in Kultur hergestellt wird, kann die Menge an Sekretion des Antigens in das Kulturmedium ermittelt werden, indem die Menge an Antigen in dem Kulturmedium mit der Menge verglichen wird, die in lysierten Zellen zurückbleibt. Die Anwesenheit von virusähnlichen Partikeln kann durch Absetzen solcher Partikel aus dem Kulturmedium in einem Dichtegradienten bestimmt werden, zum Beispiel einem Saccharose-Dichtegradienten (siehe Beispiele 1 – 3).
Während die Expression in einer Säugerzelllinie bevorzugt wird, können auch andere Systeme verwendet werden, um erfindungsgemäße virusähnliche Partikel zu exprimieren. Es kann zum Beispiel Hefe-Zellkultur verwendet werden (siehe US-Patent 5,098,704), in welchem Falle virusähnliche Partikel geerntet werden können, indem die Zellen unter Verwendung von Schütteln mit Glaskügelchen oder einer anderen geeigneten Methode aufgeschlossen werden.
Im Allgemeinen aggregieren die Proteine der vorliegenden Erfindung natürlicherweise, um in dem Expressionswirt Partikel zu bilden. Die Partikel können umhüllt sein, wobei sie einen Lipid-Membran-Mantel besitzen, der Membranproteine beinhalten kann, die von dem Virus codiert werden, oder nicht. Alternativ dazu können die Partikel die Lipid-Membran nicht einschließen oder die Membran kann anfänglich vorliegen oder kann entfernt werden, als Ganzes oder in Teilen. Die US-Patente Nr. 4,722,840 und 5,965,140 beschreiben Hybrid-Partikel, die aus einem Partikel-bildenden Fragment eines strukturellen Proteins eines Virus zusammengesetzt sind, wie ein Partikel-bildendes Fragment von Hepatitis B-Virus (HBV)-Oberflächen-Antigen (HBsAG), das mit einem heterologen Polypeptid fusioniert ist.
HBV/HCV-virusähnliche Partikel können aufgereinigt werden, nachdem sie aus einem Kulturmedium oder einer Zellsuspension abgeerntet wurden und bevor sie als eine immunogene Zusammensetzung verwendet werden. Jedes beliebige Verfahren, das bekannt ist dafür virusähnliche Partikel oder Viren von umgebenden Proteinen, Lipiden, Nucleinsäuren, Membranen, intakten Zellen und ähnlichem abzutrennen, kann verwendet werden. Besonders bevorzugt sind Affinitäts-Chromatogaphie-Verfahren; zum Beispiel kann eine immobilisierter monoclonaler Antikörper verwendet werden, der für HBsAg spezifisch ist. Zusätzliche geeignete Verfahren sind Gelfiltrations-Chromatogaphie, Ionenaustausch-Chromatographie und Dichtegradienten-Sedimentation. Verfahren für isolierte chimäre virusähnliche Partikel sind zum Beispiel in den US-Patenten Nr. 4,722,840 und 5,965,140 beschrieben.
Jede beliebige erfindungsgemäße Zusammensetzung wie ein virusähnliches Partikel oder ein Nucleinsäure-Molekül kann als eine "immunogene Zusammensetzung" verwendet werden. Eine immunogene Zusammensetzung erzeugt vorzugsweise eine Immunantwort, wie vorstehend definiert, etwa als eine Antikörper- oder T-Zell-Antwort in einem Säuger, dem sie verabreicht wurde. Eine erfindungsgemäße immunogene Zusammensetzung kann sein, ist jedoch nicht beschränkt auf, ein Impfstoff oder ein kombinierter Impfstoff, z. B. eine immunogene Zusammensetzung, die eine Immunantwort gegen mehr als ein Immunogen erzeugt. Darüber hinaus können die erfindungsgemäßen chimären Proteine in "antigene Zusammensetzungen" formliert sein, z. B. Zusammensetzungen, die Epitope beinhalten, an die ein spezifisches Antikörper-Molekül oder ein spezifischer Zelloberflächen-Rezeptor bindet.
Immunogene und antigene Zusammensetzungen, die HBV/HCV-virusähnliche Partikel oder ein Nucleinsäure-Molekül, das Proteine codiert, die virusähnliche Partikel bilden, umfassen, können einem Säuger wie einer Maus, einem Kaninchen, einem Pavian, einem Schimpansen oder einem Menschen verabreicht werden, um in vivo anti-HCV-Antikörper zu induzieren. Die Injektion einer erfindungsgemäßen immunogenen Zusammensetzung resultiert vorzugsweise in der Synthese virusähnlicher Partikel in dem Wirt. Deshalb sollten Zusammensetzungen, die Nucleinsäuren umfassen, Sequenzen einschließen, die sowohl HBsAg als auch chimäre Antigene wie HBsAg-E1- und/oder HBsAg-E2-Fusionsproteine sowie Fusionen mit anderen HCV-Polypeptiden codieren. Das Gewicht : Gewicht-Verhältnis von Nucleinsäuren, die HBsAg codieren, zu Nucleinsäuren, die chimäre Antigene codieren, beträgt vorzugsweise 1 : 1, 2 : 1, 5 : 1, 10 : 1, 20 : 1, 30 : 1, 50 : 1 oder 100 1 und resultiert in der Bildung von virusähnlichen Partikeln in den Wirtszellen und deren Sekretion innerhalb des Wirts. Mehr bevorzugt liegt das Verhältnis in dem Bereich von 5 : 1 bis 20 : 1.
Virusähnliche Partikel oder Nucleinsäure-Moleküle einer antigenen oder immunogenen Zusammensetzung können mit Adjuvantien, immunstimulatorischen Molekülen oder Trägern kombiniert werden, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, MF59 (nachfolgend beschrieben), Poly-(dl-Lactid-co-Glycolid)-Mikropartikel (PLG, siehe z. B. Delgado et al. (1999) Vaccine 17: 2927 – 2938), LT-Toxine, immunstimulatorische Komplexe (ISCOMS, siehe z. B. Mowat et al. (1999) Immunol. Lett. 65: 133 – 140) und QS21 (siehe Singh und O'Hagan (1999) Nat. Biotechnol. 17: 1075 – 1081).
Zum Beispiel beinhalten bevorzugte Adjuvantien, um die Wirksamkeit der Zusammensetzung zu verstärken, sind jedoch nicht eingeschränkt auf: (1) Aluminiumsalze (Alaun) wie Aluminiumhydroxid, Aluminiumphosphat, Aluminiumsulphat, etc; (2) Öl-in-Wasser-Emulsions-Formulierungen (mit oder ohne andere spezifische immunstimulatorische Mittel wie Muramyl-Peptide (siehe nachfolgend) oder bakterielle Zellwand-Komponenten), wie zum Beispiel (a) MF59 (PCT-Veröffentlichungs-Nr. WO 90/14837), das 5% Squalen, 0,5% Tween 80 und 0,5% Span 85 (gegebenenfalls verschiedene Mengen von MTP-PE enthaltend (siehe nachfolgend), obwohl nicht erforderlich), formuliert in Submicron-Partikel, wobei ein Microverflüssiger wie das Modell 100Y-Microverflüssiger (Microfluidics, Newton, MA) verwendet wird, (b) SAF, enthaltend 10% Squalen, 0,4% Tween 80, 5% Pluronic-geblocktes Polymer L121 und thr-MDP (siehe nachfolgend), entweder microverflüssigt in eine Submicron-Emulsion oder verwirbelt, um eine Emulsion aus höherer Partikelgröße zu erzeugen und (c) Ribi^TM-Adjuvanssystem (RAS), (Ribi Immunochem, Hamilton, MT), enthaltend 2% Squalen, 0,2% Tween 80 und eine oder mehrere bakterielle Zellwand-Komponenten, die ausgewählt sind aus Monophosphorylipid A (MPL), Trehalose-Dimycolat (TDM) und Zellwand-Skelett (CWS), vorzugsweise MPL + CWS (Detox^TM); (3) Saponin-Zusätze wie Stimulon^TM (Cambridge Bioscience, Worcester, MA) können verwendet werden oder Partikel, die davon erzeugt werden, wie ISCOMs (immunstimulierende Komplexe); (4) vollständiges Freundsches Adjuvans (CFA) und unvollständiges Freundsches Adjuvans (IFA); (5) Cytokine wie Interleukine (z. B. IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, etc.), Interferone (z. B. gamma-Interferon), Macrophagenkolonie-stimulierender Faktor (M-CSF), Tumornekrosefaktor (TNF), etc.; (6) detoxifizierte Mutanten eines bakteriellen ADP-ribosylierenden Toxins wie ein Cholera-Toxin (CT), ein Pertussis-Toxin (Keuchhusten-Toxin) (PT) oder ein hitzelabiles E. coli-Toxin (LT), insbesondere LT-K63, LT-R72, CT-S109, PT-K9/G129; siehe z. B. WO 93/13302 und WO 92/19265; (7) andere Substanzen, die als immunstimulierende Mittel wirken, um die Effektivität der Zusammensetzung zu verstärken; und (8) Micropartikel mit adsorbierten Macromolekülen, wie in der gemeinsamen anhängigen US-Patent-Anmeldung mit der Serien-Nr. 09/285,855 (eingereicht am 2. April 1999) und der Internationalen Patentanmeldung mit der Serien-Nr. PCT/US99/17308 (eingereicht am 29. Juli 1999) beschrieben. Alaun und MF59 sind bevorzugt.
Wie vorstehend erwähnt, beinhalten Muramyl-Peptide, sind aber nicht eingeschränkt auf, N-Acetyl-muramyl-L-threonyl-D-isoglutamin (thr-MDP), N-Acetylnormuramyl-L-alanyl-D-isoglutamin (nor-MDP), N-Acetyl-muramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanin-2-(1'-2'-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxy-phosphoryloxy)-ethylamin (MTP-PE), etc.
Eine immunogene Zusammensetzung kann auch einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfassen. Pharmazeutisch verträgliche Träger sind den Fachleuten gut bekannt. Solche Träger beinhalten, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, große langsam metabolisierte Macromoleküle wie Proteine, Polysaccharide, Poly-Milchsäuren, Polyglycolsäuren, polymere Aminosäuren, Aminosäure-Co-Polymere und inaktive Viruspartikel. Liposomen wie diejenigen, die in US 5,422,120 , WO 95/13796, WO 91/14445 oder EP 524,968 B1 beschrieben sind, sowie Poly-(dl-lactid-co-glycolid)-Micropartikel (PLG, siehe z. B. Delgado et al. (1999) Vaccine 17:2927-2938) können auch als ein Träger für eine erfindungsgemäße Zusammensetzung verwendet werden.
Pharmazeutisch verträgliche Salze könne ebenfalls in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen verwendet werden, zum Beispiel Mineralsalze wie Hydrochloride, Hydrobromide, Phosphate oder Sulfate sowie Salze von organischen Säuren wie Acetate, Proprionate, Malonate oder Benzoate.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen enthalten im Allgemeinen pharmazeutisch verträgliche Excipienten wie Wasser, physiologische Kochsalzlösung, Glycerin und Ethanol sowie Substanzen wie Benetzungsmittel, Emulgatoren oder pH-Wert-puffernde Mittel.
Die erfindungsgemäßen chimären Moleküle können für Nucleinsäure-Immunisierung verwendet werden, um eine geeignete Immunantwort zu erzeugen, wie etwa HCV-spezifische T-Zellen zu aktivieren, wobei standardisierte Gen-Verabreichungs-Protokolle verwendet werden. Jedes beliebige Verfahren, das im Stand der Technik bekannt ist, kann verwendet werden, um erfindungsgemäße Nucleinsäure-Moleküle zu verpacken und zu verabreichen, einschließlich Nucleinsäure-Moleküle in einer immunogenen Zusammensetzung. Verfahren zur Gen-Verabreichung sind im Stand der Technik bekannt. Siehe z. B. die US-Patente mit den Nrn. 5,399,346, 5,580,859, 5,589,466. Die codierenden Sequenzen können zum Beispiel in einem viralen Vektor verpackt sein, kombiniert mit Lipid, Peptoid- Excipienten, PLG-Formulierungen oder Gold-Partikeln. Vorzugsweise wird eine immunogene Zusammensetzung als nackte DNA oder nackte RNA verabreicht. Das exprimierte immunogene Polypeptid wird dem Immunsystem des Wirts vorzugsweise mit nativen posttranslationalen Modifikationen, nativer posttranslationaler Struktur und Gestalt präsentiert.
Die Konstrukte können zum Beispiel vor der Verabreichung an die Zellen in Liposomen verpackt werden. Eine Lipid-Verkapselung wird im Allgemeinen durchgeführt, wobei Liposomen verwendet werden, die in der Lage sind, Nucleinsäure stabil zu binden oder einzuschließen und festzuhalten. Das Verhältnis von kondensierter DNA zu Lipid-Präparation kann variieren, liegt aber im Allgemeinen etwa um 1:1 (mg DNA : Micromol Lipid) oder mehr Lipid. Als Übersichtsartikel zur Verwendung von Liposomen als Träger für die Verabreichung von Nucleinsäuren siehe Hug and Sleight, Biochem. Biophys. Acta. (1991) 1097: 1 – 17; Straubinger et al., in Methods of Enzymology (1983) Band 101, S. 512 – 527.
Liposomale Präparationen zur Verwendung im Rahmen der vorliegenden Erfindung beinhalten kationische (positiv geladen), anionische (negativ geladen) und neutrale Präparationen, wobei kationische Liposomen besonders bevorzugt sind. Kationische Liposomen sind leicht erhältlich. N-[1-2,3-(Dioleyloxy)-propyl]-N,N,N-triethylammonium, DOTMA)-Liposomen zum Beispiel sind unter dem Handelsnamen Lipofectin von GIBCO BRL, Grand Island, NY erhältlich. (Siehe auch Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1987) 84: 7413 – 7416). Andere kommerziell erhältliche Lipide beinhalten Transfectace (DDAB/DOPE) und DOTAP/DOPE (Boehringer). Andere kationische Liposomen können aus leicht erhältlichen Materialien hergestellt werden, wobei Verfahren verwendet werden, die im Stand der Technik gut bekannt sind. Siehe z. B. Szoka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1978) 75: 4194 – 4198; PCT-Veröffentlichung Nr. WO 90/11092 für die Beschreibung der Synthese von DOTAP (1,2-Bis-(oleoyloxy)-3-(trimethyl-ammonio)-propan)-Liposomen. Die verschiedenen Liposomen-Nucleinsäure-Komplexe werden hergestellt, wobei Verfahren verwendet werden, die im Stand der Technik gut bekannt sind. Siehe z. B. Straubinger et al., in METHODS OF IMMUNOLOGY (1983), Band 101, S. 512 – 527; Szoka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1978) 75: 4194 – 4198; Papahadjopoulos et al., Biochim. Biophys. Acta (1975) 394: 483; Wilson et al., Cell (1979) 17: 77); Deamer and Bangham, Biochim. Biophys. Acta (1976) 443: 629; Ostro et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. (1977) 76: 836; Fraley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1979) 76: 3348); Enoch and Strittmatter, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1979) 76: 145); Fraley et al., J. Biol. Chem. (1980) 255: 10431; Szoka and Papahadjopoulos, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1978) 75: 145; und Schaefer-Ridder et al., Science (1982) 215: 166.
Die DNA kann auch in Cochleat-Lipid-Zusammensetzungen verabreicht werden, die ähnlich denen sind, die von Papahadjopoulos et al., Biochem. Biophys. Acta. (1975) 394: 483 – 491 beschrieben sind. Siehe auch die US-Patente mit den Nrn. 4,663,161 und 4,871,488.
Eine Vielzahl Virus-basierter Systeme sind für den Gentransfer in Säugerzellen entwickelt worden. Retroviren zum Beispiel stellen eine geeignete Plattform für Gen-Verabreichungssysteme dar, wie Maus-Sarkom-Virus, Maus-Mamma-Tumor-Virus, murines Moloney-Leukämie-Virus und Rous-Sarkom-Virus. Ein ausgewähltes Gen kann in einen Vektor inseriert werden und in retrovirale Partikel verpackt werden, wobei Verfahren verwendet werden, die im Stand der Technik gut bekannt sind. Das rekombinante Virus kann dann isoliert werden und den Zellen des Individuums entweder in vivo oder ex vivo verabreicht werden. Eine Vielzahl retroviraler Systeme ist beschrieben worden (US-Patent Nr. 5,219,740; Miller and Rosman, BioTechniques (1989) 7: 980 – 990; Miller, A. D., Human Gene Therapy (1990) 1: 5 – 14; Scarpa et al., Virology (1991) 180: 849 – 852; Burns et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90: 8033 – 8037; und Boris-Lawrie and Temin, Curr. Opin. Genet. Develop. (1993) 3: 102 – 109. Kurz, erfindungsgemäße retrovirale Gen-Verabreichungs-Vehikel können aus einer großen Vielfalt von Retroviren, einschließlich zum Beispiel B, C und D-Typ-Retroviren sowie Spumaviren und Lentiviren wie FIV, HIV, HIV-1, HIV-2 und SIV (siehe RNA Tumor Viruses, zweite Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory, 1985) leicht konstruiert werden. Solche Retroviren können aus Hinterlegungen oder Sammlungen wie die American Type Culture Collection ("ATCC"; 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110 – 2209) leicht erhalten werden oder unter Verwendung von herkömmlich erhältlichen Verfahren aus bekannten Quellen isoliert werden.
Eine Vielzahl adenoviraler Vektoren sind beschrieben worden, wie Adenovirus Typ 2- und Typ 5-Vektoren. Im Gegensatz zu Retroviren, die in das Wirtsgenom integrieren, persistieren Adenoviren extrachromosomal, wobei sie das Risiko vermindern, das mit der Insertions-Mutagenese assoziiert ist (Haj-Ahmad and Graham, J. Virol. (1986) 57: 267 – 274; Bett et al., J. Virol. (1993) 67: 5911 – 5921; Mittereder et al., Human Gene Therapy (1994) 5: 717 – 729; Seth et al., J. Virol. (1994) 68: 933 – 940; Barr et al., Gene Therapy (1994) 1: 51 – 58; Berkner, K. L. BioTechniques (1998) 6: 616 – 629; und Rich et al., Human Gene Therapy (1993) 4: 461 – 476).
Molekulare konjugierte Vektoren wie die chimären Adenovirus-Vektoren, die beschrieben sind in Michael et al., J. Biol. Chem. (1993) 268: 6866 – 6869 und Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89: 6099 – 6103, können ebenfalls zur Gen-Verabreichung verwendet werden.
Mitglieder der Alphavirus-Gattung wie, jedoch nicht eingeschränkt auf, Vektoren, die von den Sindbis- und den Semliki Forest-Viren abstammen, VEE, finden auch Verwendung als virale Vektoren für die Verabreichung des Gens von Interesse. Für eine Beschreibung von Sindbis-Virus-abstammenden Vektoren, die für die Durchführung der gegenwärtigen Verfahren zweckmäßig sind, siehe Dubensky et al., J. Virol. (1996) 70: 508 – 519; und Internationale Veröffentlichungen Nrn. WO 95/07995 und WO 96/17072.
Andere Vektoren können verwendet werden, einschließlich, jedoch nicht eingeschränkt auf, Affenvirus 40, Cytomegalievirus. Bakterielle Vektoren wie Salmonella ssp., Yersinia enterocolitica, Shigella spp., Vibrio cholerae, Mycobacterium-Stamm BCG und Listeria monocytogenes können verwendet werden. Minichromosomen wie MC und MC1, Bakteriophagen, Cosmide (Plasmide, in die cos-Stellen des Phagen lambda inseriert wurden) und Replikons (genetische Elemente, die in einer Zelle unter ihrer eigenen Kontrolle zur Replikation befähigt sind) können auch verwendet werden.
Die chimären Konstrukte können auch mit besonderen Trägern verkapselt, daran angeheftet oder damit assoziiert sein. Solche Träger präsentieren dem Immunsystem multiple Kopien eines ausgewählten Moleküls und verstärken das Einfangen und das Festhalten von Molekülen in lokalen Lymphknoten. Die Partikel können von Macrophagen phagozytiert werden und die Antigen-Präsentation durch Cytokinfreisetzung verstärken. Beispiele für besondere Träger beinhalten diejenigen, die von Polymethyl-methacrylat-Polymeren abstammen, sowie Micropartikel, die von Poly-(lactiden) und Poly-(lactid-co-glycoliden) abstammen, bekannt als PLG. Siehe z. B. Jeffrey et al., Pharm. Res. (1993) 10: 362 – 368; und McGee et al., J. Microencap. (1996).
Eine große Vielfalt anderer Verfahren kann verwendet werden, um die Konstrukte an Zellen zu verabreichen. Solche Verfahren beinhalten DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion, Calciumphosphat-Präzipitation, Polylysin- oder Polyornithin-vermittelte Transfektion oder Präzipitation unter Verwendung von entweder unlöslichen anorganischen Salzen wie Strontiumphosphat, Aluminiumsilikate, einschließlich Bentonit und Kaolin, Chromoxid, Magnesium-Silikat, Talcum und ähnliches. Andere zweckmäßige Verfahren der Transfektion beinhalten Elektroporation, Sonoporation, Protoplasten-Fusion, Liposomen, Peptoid-Verabreichung oder Microinjektion. Siehe z. B. Sambrook et al., vorstehend für eine Diskussion von Verfahren zur Transformation von Zellen von Interesse; und Felgner, P. L., Advanced Drug Delivery Reviews (1990) 5: 163 – 187, als einen Übersichtsartikel für Verabreichungssysteme, die für Gentransfer zweckmäßig sind. Ein besonders wirkungsvolles Verabreichungsverfahren von DNA unter Verwendung von Elektroporation ist in der Internationalen Veröffentlichung Nr. WO/0045823 beschrieben.
Zusätzlich sind biolistische Verabreichungssysteme, die besondere Träger wie Gold und Wolfram verwenden, für die Verabreichung der erfindungsgemäßen Konstrukte zweckmäßig. Die Partikel werden mit dem zu verabreichenden Konstrukt beschichtet und auf hohe Geschwindigkeit beschleunigt, im Allgemeinen unter einem reduzierten Atmosphärendruck, wobei eine Gewehrpulver-Feuerung aus einem "Gen-Gewehr" verwendet wird. Für eine Beschreibung solcher Verfahren und von Geräten, die dafür zweckmäßig sind, siehe z. B. die US-Patente mit den Nrn. 4,945,050; 5,036,006; 5,100,792; 5,179,022; 5,371,015; und 5,478,744.
Die chimären Konstrukte können entweder direkt an das Wirbeltier-Individuum oder alternativ ex vivo an Zellen verabreicht werden, die von dem Individuum abstammen und die Zellen in das Individuum reimplantiert werden. Die Konstrukte können zum Beispiel als Plasmid-DNA verabreicht werden, z. B. enthalten in einem Plasmid wie pBR322, pUC oder ColE1.
Eine erfindungsgemäße immunogene Zusammensetzung wird auf eine Art und Weise, die mit der besonderen Zusammensetzung verträglich ist, die verwendet wird und in einer Menge verabreicht, die wirkungsvoll ist, um einen anti-HCV- Polypeptid-Antikörper-Titer wie einen anti-E2- oder anti-E1-Antikörper-Titer auszulösen. Die Verabreichung kann durch jedes beliebige Mittel, das im Stand der Technik bekannt ist, erfolgen, einschließlich intramuskuläre, intradermale, intraperitoneale oder subkutane Injektion, einschließlich die Injektion unter Verwendung eines biologischen ballistischen Gewehrs ("Gengewehr"). Elektroporation oder Iontophorese können auch verwendet werden. Die Verabreichung kann auch intranasal oder oral erfolgen. Für die orale Verabreichung einer immunogenen Zusammensetzung wird vorzugsweise ein Proteinträger mit eingeschlossen. Eine immunogene Zusammensetzung, einschließlich Zusammensetzungen, die nackte DNA oder RNA umfassen, wird einem großen Säuger wie einem Pavian, einem Schimpansen oder einem Menschen vorzugsweise in einer Dosis von 0,5, 0,75, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 5 oder 10 mg/kg intramuskulär injiziert. Eine Zusammensetzung, die virusähnliche Partikel umfasst, wird einem großen Säuger wie einem Menschen in einer Dosis von 0,01, 0,05, 0,5, 0,75, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 5 oder 10 mg Protein pro kg Körpergewicht vorzugsweise intramuskulär injiziert.
Die direkte Verabreichung der Zusammensetzungen wird im Allgemeinen durch Injektion durchgeführt, entweder subkutan, intraperitoneal, intravenös oder intramuskulär oder verabreicht an den Zwischenraum eines Gewebes. Die Zusammensetzungen können auch in eine Wunde verabreicht werden. Andere Arten der Verabreichung beinhalten orale, intranasale und pulmonale Verabreichung, Zäpfchen und transdermale oder transkutane Anwendungen (z. B. siehe WO 98/20734), Nadeln und Gen-Gewehre oder Hyposprays. Die Dosierung der Behandlung kann einem Zeitplan mit einer einzelnen Dosis oder einem Zeitplan mit mehreren Dosen entsprechen. Die Zusammensetzung kann in Verbindung mit anderen immunregulatorischen Mitteln verabreicht werden.
Verfahren für die ex vivo-Verabreichung und Reimplantation transformierter Zellen in ein Individuum sind im Stand der Technik bekannt und zum Beispiel in WO 93/14778 beschrieben. Beispiele für Zellen, die für ex vivo-Verabreichungen zweckmäßig sind, beinhalten zum Beispiel Stammzellen, insbesondere hematopoietische, Lymphzellen, Macrophagen, dentritische Zellen oder Tumorzellen. Im Allgemeinen kann die Verabreichung von Nucleinsäuren sowohl für ex vivo- als auch für in vitro-Anwendungen mit Hilfe der nachfolgenden Verfahren durchgeführt werden, zum Beispiel Dextran-vermittelte Transfektion, Calciumphosphat- Präzipitation, Polybren-vermittelte Transfektion, Protoplasten-Fusion, Elektroporation, Verkapselung des/der Polynucleotids/Polynucleotide in Liposomen und direkte Microinjektion der DNA in Kerne, die alle im Stand der Technik gut bekannt sind.
Immunogene Zusammensetzungen, die entweder HBV/HCV-virusähnliche Partikel oder Nucleinsäuren umfassen, die solche virusähnlichen Partikel codieren und exprimieren, können entweder einem Säuger verabreicht werden, der nicht mit HCV infiziert ist, oder können einem HCV-infizierten Säuger verabreicht werden. Die jeweilige Dosis virusähnlicher Partikel oder Nucleinsäuren hängt von einer Vielzahl von Faktoren ab, einschließlich, jedoch nicht begrenzt auf, der Art, dem Alter und dem allgemeinen Zustand des Säugers, an den die Zusammensetzung verabreicht wird, und der Art der Verabreichung der Zusammensetzung. Eine wirksame Menge der erfindungsgemäßen Zusammensetzung kann unter Verwendung von Routine-Experimenten leicht bestimmt werden. In vivo-Modelle sind gut bekannt und können eingesetzt werden, um geeignete Dosierungen zu identifizieren. Falls gewünscht, können co-stimulatorische Moleküle oder Adjuvantien vor, nach oder zusammen mit den immunogenen Zusammensetzungen ebenfalls bereitgestellt werden. Immunogene Zusammensetzungen können mehr als einmal verabreicht werden, je nachdem, was für eine wirkungsvolle Immunisierung erforderlich ist. Die Verabreichung von immunogenen Zusammensetzungen, die virusähnliche Partikel enthalten, kann entweder vor oder nach der Verabreichung von immunogenen Zusammensetzungen durchgeführt werden, die Nucleinsäuren enthalten, so dass eine Form (Protein oder Nucleinsäure) eine primäre Immunisierung bereitstellt und die andere Form die Immunantwort verstärkt.
III. Versuchsaufbau
Nachfolgend sind Beispiele für spezifische Ausführungsformen zur Durchführung der vorliegenden Erfindung aufgeführt. Die Beispiele werden ausschließlich für veranschaulichende Zwecke angeboten und es ist nicht beabsichtigt, dass sie den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung auf irgendeine Art und Weise eingrenzen. Die Fachleute können leicht einschätzen, dass die Erfindung auf eine Vielzahl von Arten durchgeführt werden kann, die durch die Lehren dieser Offenbarung bereitgestellt werden.
Es sind Anstrengungen unternommen worden, um die Exaktheit im Hinblick auf die verwendeten Zahlen (z. B. Mengen, Temperaturen etc.) sicherzustellen, es sollten aber natürlich einige experimentellen Irrtümer und Abweichungen erlaubt sein.
BEISPIEL 1
Nachweis von HBV-virusähnlichen Partikeln, wobei Saccharose-Dichtegradienten-Sedimentation verwendet wird
Gereinigte rekombinante HBsAg-Partikel wurden in Form eines Hepatitis B-Impfstoffes von Chiron Corp. Clinical Department erhalten. 250 μl einer 37 μg/ml Suspension in 0,03 M Citrat, 0,26 M NaCl, 0,005% Polysorbat 80 wurden auf einen 5 – 30% (Gew.-Vol.)-Saccharose-Gradienten geladen und 4 Stunden bei 40.000 UpM in einem Beckman SW41-Rotor zentrifugiert. Zehn Fraktionen wurden entfernt und mit Hilfe des Magic Lite Assay auf HbsAg getestet. Die Ergebnisse sind in 5 gezeigt.
Magic Lite Assay
Dieser beschreibt einen hochsensitiven Immun-Chemilumineszenz-Test, der verwendet wird, um HBV- und HCV-Antigene nachzuweisen. 100 μl Probe wurden in ein 12 × 75 mm-Polystyrol-Röhrchen gegeben. 100 μl (30 μg) eines "Fang"-Antikörpers wurden zu der Probe hinzugegeben. Der Fang-Antikörper wurde kovalent durch Glutaraldehyd-Vernetzung eines Gemisches von 6 : 1 paramagnetischen Partikeln : Antikörper an paramagnetische Partikel gekoppelt. Die Röhrchen wurden verwirbelt und 20 Minuten in einem 37°C-Wasserbad inkubiert. Als nächstes wurden die Röhrchen in einen magnetischen Ständer platziert, in dem die paramagnetischen Partikel (PMP) aggregieren können. Dieses erlaubte das Waschen und Dekantieren. Nach dem dritten Waschen wurden 100 μl eines "Nachweis"-Antikörpers zugegeben, der kovalent mit Dimethylacridinium gekoppelt war, und das Röhrchen wurde verwirbelt. Die Röhrchen wurden wieder 20 Minuten bei 37°C inkubiert und dann für das Waschen und Dekantieren in einen magnetischen Ständer platziert. Nach dem dritten Waschen wurden die Röhrchen in ein Ciba Magic Lite-Chemiluminometer platziert, um den gebundenen Analyten zu messen. Die Ergebnisse wurden in zufälligen Einheiten von Lichtintensität ausgedrückt (relative Lichteinheiten, RLU).
Antikörper
Anti-sAg wurde von Chiron Diagnostics (Walpole, MA) bereitgestellt und war gegen die Serotypen AYW und ADW gerichtet. MAb 5E5/H7 wurde aus Mäusen erhalten, wobei HeLa-E1/E2-Aminosäuren 1 – 967 als ein Immunogen verwendet wurden, und es erkennt das E2-Epitop 384 – 655. MAb 3D5/C3 wurde auch aus Mäusen erhalten, die mit HeLa-E1/E2 Aminosäuren 1 – 967 immunisiert wurden, und es erkennt das E1-Epitop 211 – 217.
BEISPIEL 2
Expression von HBV/HCV-virusähnlichen Partikeln, die chimäres HBsAg-E2-661-Antigen enthalten, in COS7-Zellen
Fünf μg pCMV-II-E2661-sAg (4A) und ansteigende Mengen von pCMV-II-pS2-sAg (2A) wurden hergestellt. Die Expression von pCMV-II-pS2-sAg resultierte in einem Gemisch von etwa 5 – 20% prä-S2-S-Polypeptid, wobei der Rest S-Polypeptid war. Die verwendeten Verhältnisse von sAg zu E2661-sAg-Plasmiden betrugen 0 : 1, 1 : 1, 5 : 1 und 10 : 1 auf einer μg DNA-Basis. Die Gesamtmenge an DNA in jedem Röhrchen wurde durch die Zugabe von pCMV-km-BgaI auf 55 μg normalisiert. Dieses Gemisch wurde in COS7-Zellen transfiziert, wobei das LT1-Transfektionsreagenz von Panvera, wie nachfolgend beschrieben, verwendet wurde. 48 Stunden nach Transfektion wurden die Medien und löslichen Lysate (erhalten durch Inkubation der einzelligen Zellschichten in PBS mit 0,1 % NP40 und Zentrifugation, um unlösliche Rückstände zu entfernen) entfernt und mit dem Magic Lite Assay getestet, wobei mit anti-sAg eingefangen wurde, gefolgt von dem Nachweis mit einem konjugierten anti-E2-MAb (5E5/H7, siehe Beispiel 1) (6A) oder MAb sAg (6B). Sowohl E2 als auch sAg wurden in ansteigenden Mengen in das Medium sekretiert, sobald das Verhältnis von sAg zu E2661-sAg erhöht wurde, wobei eine optimale Sekretion bei Verhältnissen im Bereich von 5 : 1 bis 10 : 1 erreicht wurde.
Um die virusähnlichen Partikel zu charakterisieren, wurde 1 ml Kulturmedium von jeder Bedingung auf einen 5 – 30%-Saccharose-Gradienten geladen. Die Proben wurden 4 Stunden bei 40.000 UpM zentrifugiert, wobei ein Beckman SW41-Rotor verwendet wurde. Elf Fraktionen wurden entfernt und mit Hilfe des Magic Lite Assay auf E2 (7A) oder sAg (7B) getestet. Sowohl E2 als auch sAg wurden in Fraktion 4 in den höchsten Mengen beobachtet, was der gleichen Gradientenposition für die Peakverteilung von HBsAg-enthaltenden virusähnlichen Partikeln entspricht (5).
Transfektionsprotokoll
Zellen wurden am Tag vor der Transfektion so in Platten mit 6 Vertiefungen ausgesät, dass zu dem Zeitpunkt der Transfektion 50 – 60% Konfluenz erreicht wurden. Opti-mem (100 μl) und LT-1-Transfektionsreagenz (12 μl) wurden in ein steriles Polypropylenröhrchen gegeben und fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Drei μg DNA wurden dann zu dem Röhrchen zugegeben, das weitere fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubiert wurde. Während dieser Inkubationsperiode wurden die Zellen mit Opti-mem (2 ml pro Vertiefung) gewaschen. Zwei ml Opti-mem wurden in jede Vertiefung zugegeben, gefolgt von 100 μl des Opti-mem/LT-1/DNA-Gemisches. Die Zellen wurden dann vier Stunden bei 37°C inkubiert, gefolgt von Absaugen und Zugabe des Kulturmediums (1,5 ml/Vertiefung von DMEM + 10% FBS). 48 Stunden nach Transfektion wurde das Medium abgeerntet und die einzelligen Zellschichten wurden unter Verwendung von PBS, das 0,1% NP-40 enthielt, solubilisiert. Sowohl das abgeerntete Medium als auch die solubilisierten Zellen wurden zentrifugiert, um Zelltrümmer zu entfernen.
BEISPIEL 3
Expression von HBV/HCV-virusähnlichen Partikeln, die chimäres HBsAg-E1-330-Antigen enthalten, in COS7-Zellen
Gemische von pCMV-II-optiE 1330-sAg (2,5 μg DNA) und verschiedenen Mengen pCMV-II-pS2-sAg wurden hergestellt, um Verhältnisse von sAg-Plasmid zu E1-sAg-Plasmid von 0 : 1 (Kontrolle), 1 : 1, 5 : 1, 10 : 1 und 20 : 1 bereitzustellen. Die Expression von pCMBV-II-pS2-sAg resultierte in einem Gemisch von etwa 5 – 20% prä-S2-S-Polypeptid, wobei der Rest S-Polypeptid war. Die Gesamtmenge an DNA in jedem Röhrchen wurde durch die Zugabe von pCMV-km-βgaI auf 52,5 μg normalisiert. Die Gemische wurden in COS7-Zellen transfiziert, wobei das LT1- Transfektionsreagenz von Panvera verwendet wurde. 48 Stunden nach Transfektion wurden die Medien und löslichen Lysate gewonnen und mit Hilfe des Magic Lite Assay getestet. Das Fangen erfolgte mit anti-sAg, gefolgt von dem Nachweis mit einem konjugierten anti-E1-MAb (eD5/C3) (8A) oder MAb sAg (8B). Sowohl E1 als auch sAg wurden in zunehmenden Mengen in das Medium sekretiert, sobald das Verhältnis von sAg : E2661-sAg erhöht wurde, wobei eine optimale Sekretion bei Verhältnissen im Bereich von 5 : 1 bis 20 : 1 erhalten wurde.
Um virusähnliche Partikel zu charakterisieren, wurde 1 ml Kulturmedium von jeder Bedingung auf einen 5 – 30%-Saccharosegradienten geladen. Die Proben wurden 4 Stunden bei 40.000 UpM zentrifugiert, wobei ein Beckman SW41-Rotor verwendet wurde. Elf Fraktionen wurden entfernt und auf E1 (9A) oder sAg (9B) mit Hilfe des Magic Lite Assay getestet. Sowohl E1 als auch sAg wurden in den Fraktionen 4 – 6 in der höchsten Menge beobachtet, was ähnlich ist mit der Gradientenposition für die Gipfelverteilung von HBsAg-enthaltenden virusähnlichen Partikeln (5).
BEISPIEL 4
Expression von HBV/HCV-virusähnlichen Partikeln, die sowohl chimäre HBsAg-E2-661- als auch HBsAg-E1-330-Antigene enthalten, in COS7-Zellen
Ein Gemisch von pCMVII opti 330 E1-sAg und pCMV-II-E2661-sAg (0,5 mg DNA von jedem Plasmid) wurde mit ansteigenden Mengen von pCMV-II-pS2-sAg vereint. Die Gesamtmenge an DNA in jedem Röhrchen wurde durch die Zugabe von pCMV-kM-βgaI auf 26 μg normalisiert. Das Gemisch wurde in COS7-Zellen transfiziert, wobei das LT1-Transfektionsreagenz von Panvera verwendet wurde. 48 Stunden nach Transfektion wurden Medien und lösliche Lysate zurückgewonnen und mit Hilfe des Magic Lite Assay getestet, wobei mit anti-sAg gefangen wurde, gefolgt vom Nachweis mit einem konjugierten anti-E2- oder anti-E1-MAb (10A) oder einem konjugierten anti-sAg (10B).
BEISPIEL 5
Verwendung von HBV/HCV-virusähnlichen Partikeln, um eine Immunantwort zu erzugen
Um die Fähigkeit der vorliegenden HBV/HCV-virusähnliche Partikel für die Erzeugung einer Immunantwort in vivo zu testen, wurde das nachfolgende Experiment durchgeführt. Vier Gruppen von 10 Mäusen (Gruppe 2 hatte 9 Mäuse) wurden verabreicht, entweder DNA, die HCV-E2661 und pCMV-II in einem Verhältnis von 5 × pCMV-II zu E2661 codierte (Gruppe 1); pCMV-II-E2661-sAg (4A) und pCMV-II in einem Verhältnis von 5 × pCMV-II zu pCMV-II-E2661-sAg (Gruppe 2); pCMV-II-E2661-sAg und pCMV-II-pS2-sAg (2A) in einem Verhältnis von 5 × pCMV-II-pS2-sAg zu pCMV-II-E2661-sAg (Gruppe 3) und pCMV-II und pCMV-II-pS2-sAg in einem Verhältnis von 5 × pCMV-II-pS2-sAg zu pCMV-II (Gruppe 4).
Alle wurden zweimal mit 90 μg (45 μg/Bein) pro Immunisierung am Tag 0 und am Tag 21 immunisiert und Blut wurde gesammelt. Die Antikörper-Titer wurden mit ELISA getestet, wobei ein verkürztes E2-Molekül, E2₇₁₅, verwendet wurde, das in CHO-Zellen exprimiert wurde, wobei der vorstehend beschriebene Magic Lite Assay verwendet wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.
Ein zweites Experiment wurde durchgeführt, wiederum unter Verwendung von 10 Tieren pro Gruppe, mit Ausnahme von Gruppe 5, die 5 Mäuse hatte. Die Gruppen und Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Das Behandlungsprotokoll und die Antikörper-Bestimmung waren, wie vorstehend beschrieben.
Es ist ersichtlich, dass die Titer für E2 in den E2661-immunisierten Mäusen in Anwesenheit von 5 × sAg reduziert waren. Dies könnte aus einer Kompetition für das Andocken an das endoplasmatische Retikulum resultieren. Die E2-Titer waren höher, wenn E2 mit sAg fusioniert war. Die Zugabe von sAg anstelle von Vektor resultierte in einer geringen Veränderung des Titers. Während dieser Unterschied gering ist, ist der Vergleich der Kontrolle mit sAg berechtigt. Da ein Überschuss an sAg in dem nicht fusionierten Antigen eine Verringerung der E2-Titer verursachte, gab es im Zusammenhang der Fusion eine offensichtliche Kompensation. Das reflektiert vermutlich die Fähigkeit von sAg die Sekretion des Fusionsmoleküls zu verstärken.
Somit sind chimäre virusähnliche HCV/HBV-Partikel sowie Verfahren zur Herstellung und Verwendung derselbigen offenbart. Von dem Vorausgehenden wird es offensichtlich, obwohl spezifische Ausführungsformen der Erfindung für Zwecke der Illustration hier beschrieben wurden, dass verschiedene Modifikationen durchgeführt werden können, ohne von dem Geist und dem Schutzumfang der anhängigen Ansprüche abzuweichen.
Sequenzprotokoll

Claims

Virusähnliches Partikel zur Verwendung als Immunogen, umfassend ein erstes Hepatitis-B-Virus-Oberflächen-Antigen (HBsAg) und ein chimäres Antigen, wobei das chimäre Antigen ein zweites HBsAg umfasst, das kovalent mit einem immunogenen HCV-Polypeptid verbunden ist, und wobei das erste und das zweite HBsAg jeweils eine im Wesentlichen vollständige S-Domäne umfassen.
Virusähnliches Partikel nach Anspruch 1, wobei das erste HBsAg im Wesentlichen aus preS2- und S-Domänen besteht.
Virusähnliches Partikel nach Anspruch 2, wobei das erste HBsAg im Wesentlichen aus preS1-, preS2- und S-Domänen besteht.
Virusähnliches Partikel nach Anspruch 1, wobei der Carboxy-Terminus des immunogenen HCV-Polypeptids mit dem Amino-Terminus des zweiten HBsAg verbunden ist.
Virusähnliches Partikel nach Anspruch 1, wobei das erste HBsAg im Vergleich zum chimären Antigen im Überschuss exprimiert wird.
Virusähnliches Partikel nach Anspruch 5, wobei das erste HBsAg unter Verwendung einer Menge von DNA exprimiert wird, die zwischen 1 und 100 Mal der Menge der DNA liegt, die verwendet wird, um das chimäre Antigen zu exprimieren.
Virusähnliches Partikel nach Anspruch 1, wobei das immunogene HCV-Polypeptid ein HCV-E1-Glycoprotein, ein immunogenes Fragment eines HCV- E1-Glycoproteins, ein HCV-E2-Glycoprotein oder ein immunogenes Fragment eines HCV-E2-Glycoproteins umfasst.
Virusähnliches Partikel nach Anspruch 1, wobei das immunogene HCV-Polypeptid im Wesentlichen aus einem HCV-E1-Glycoprotein, einem immunogenen Fragment eines HCV-E1-Glycoproteins, einem HCV-E2-Glycoprotein oder einem immunogenen Fragment eines HCV-E2-Glycoproteins besteht.
Virusähnliches Partikel nach Anspruch 7, wobei das immunogene HCV-Polypeptid (a) Aminosäurereste 192 bis 330 eines HCV-1-Polyproteins; oder (b) die korrespondierenden Reste anderer HCV-Isolate; oder (c) eine immunogene Sequenz, die mindestens 80% Sequenzidentität mit (a) oder (b) hat, umfasst.
Virusähnliches Partikel nach Anspruch 7, wobei das immunogene HCV-Polypeptid (a) Aminosäurereste 384 bis 661 eines HCV-1-Polyproteins; oder (b) die korrespondierenden Reste anderer HCV-Isolate; oder (c) eine immunogene Sequenz, die mindestens 80% Sequenzidentität mit (a) oder (b) hat, umfasst.
Virusähnliches Partikel nach Anspruch 10, wobei das immunogene HCV-Polypeptid im Wesentlichen aus Aminosäureresten 384 bis 661 eines HCV-Polyproteins besteht.
Virusähnliches Partikel nach Anspruch 1, wobei das immunogene HCV-Polypeptid (1) ein HCV-E1-Glycoprotein oder ein Fragment davon und (2) ein HCV-E2-Glycoprotein oder ein Fragment davon umfasst.
Virusähnliches Partikel zur Verwendung als Immunogen, umfassend ein erstes HBsAg und erste und zweite chimäre Antigene, wobei das erste chimäre Antigen ein zweites HBsAg umfasst, das mit einem ersten immunogenen Polypeptid kovalent verbunden ist, wobei das erste immunogene Polypeptid ein HCV-E1-Glycoprotein oder ein immunogenes Fragment davon umfasst, und wobei das zweite chimäre Antigen ein drittes HBsAg umfasst, das kovalent mit einem zweiten immunogenen Polypeptid verbunden ist, wobei das zweite immunogene Polypeptid ein HCV-E2-Glycoprotein oder ein immunogenes Fragment davon umfasst und wobei das erste, zweite und dritte HBsAg jeweils eine im Wesentlichen vollständige S-Domäne umfassen.
Virusähnliches Partikel nach Anspruch 13, wobei das erste HBsAg im Wesentlichen aus preS2- und S-Domänen besteht.
Virusähnliches Partikel nach Anspruch 13, wobei das erste HBsAg im Wesentlichen aus preS1-, preS2- und S-Domänen besteht.
Virusähnliches Partikel nach Anspruch 13, wobei der Carboxy-Terminus des ersten immunogenen Polypeptids mit dem Amino-Terminus des zweiten HBsAg und der Carboxy-Terminus des zweiten immunogenen Polypetids mit dem Amino-Terminus des dritten HBsAg verbunden ist.
Virusähnliches Partikel nach Anspruch 13, wobei das erste HBsAg im Vergleich zur Gesamtmenge der ersten und zweiten chimären Antigene im Überschuss exprimiert wird.
Virusähnliches Partikel nach Anspruch 17, wobei das erste HBsAg unter Verwendung einer Menge von DNA exprimiert wird, die zwischen 1 und 100 Mal der Gesamtmenge der DNA liegt, die verwendet wird, um die ersten und zweiten chimären Antigene zu exprimieren.
Virusähnliches Partikel nach Anspruch 13, wobei das erste immunogene Polypeptid (a) Aminosäurereste 192 bis 330 eines HCV-1-Polyproteins; oder (b) die korrespondierenden Reste anderer HCV-Isolate; oder (c) eine immunogene Sequenz, die mindestens 80% Sequenzidentität mit (a) oder (b) hat, umfasst.
Virusähnliches Partikel nach Anspruch 13, wobei das zweite immunogene Polypeptid (a) Aminosäurereste 384 bis 661 eines HCV-1-Polyproteins; oder (b) die korrespondierenden Reste anderer HCV-Isolate; oder (c) eine immunogene Sequenz, die mindestens 80% Sequenzidentität mit (a) oder (b) hat, umfasst.
Virusähnliches Partikel nach Anspruch 13, wobei das erste immunogene Polypeptid im Wesentlichen aus Aminosäureresten 192 bis 330 eines HCV-1-Polyproteins und das zweite immunogene Polypeptid im Wesentlichen aus Aminosäureresten 384 bis 661 eines HCV-1-Polyproteins besteht.
Immunogene Zusammensetzung, umfassend: ein virusähnliches Partikel, umfassend ein erstes HBsAg und ein chimäres Antigen, wobei das chimäre Antigen ein zweites HBsAg umfasst, das mit einem immunogenen HCV-Polypeptid verbunden ist, und wobei das erste und das zweite HBsAg jeweils eine im Wesentlichen vollständige S-Domäne umfassen; und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
Immunogene Zusammensetzung nach Anspruch 22, wobei das erste HBsAg im Vergleich mit dem chimären Antigen im Überschuss exprimiert wird.
Immunogene Zusammensetzung nach Anspruch 23, wobei das erste HBsAg unter Verwendung einer Menge von DNA exprimiert wird, die zwischen 1 und 100 Mal der Menge der DNA liegt, die verwendet wird, um das chimäre Antigen zu exprimieren.
Immunogene Zusammensetzung nach Anspruch 22, wobei das immunogene HCV-Polypeptid ein HCV-E1-Glycoprotein, ein immunogenes Fragment eines HCV-E1-Glycoproteins, ein HCV-E2-Glycoprotein oder ein immunogenes Fragment eines HCV-E2-Glycoproteins umfasst.
Immunogene Zusammensetzung nach Anspruch 22, wobei das immunogene HCV-Polypeptid (a) Aminosäurereste 192 bis 330 eines HCV-1-Polyproteins; oder (b) die korrespondierenden Reste anderer HCV-Isolate; oder (c) eine immunogene Sequenz, die mindestens 80% Sequenzidentität mit (a) oder (b) hat; umfasst.
Immunogene Zusammensetzung nach Anspruch 22, wobei das immunogene HCV-Polypeptid im Wesentlichen aus Aminosäureresten 192 bis 330 eines HCV-1-Polyproteins; oder (b) den korrespondierenden Resten anderer HCV-Isolate besteht.
Immunogene Zusammensetzung nach Anspruch 22, wobei das immunogene HCV-Polypeptid (a) Aminosäurereste 384 bis 661 eines HCV-1-Polyproteins; oder (b) die korrespondierenden Reste anderer HCV-Isolate; oder (c) eine immunogene Sequenz, die mindestens 80% Sequenzidentität mit (a) oder (b) hat, umfasst.
Immunogene Zusammensetzung nach Anspruch 22, wobei das immunogene HCV-Polypeptid (a) Aminosäurereste 384 bis 661 eines HCV-1-Polyproteins; oder (b) die korrespondierenden Reste anderer HCV-Isolate umfasst.
Immunogene Zusammensetzung, umfassend virusähnliche Partikel, umfassend ein erstes HBsAg und erste und zweite chimäre Antigene, wobei das erste chimäre Antigen ein zweites HBsAg umfasst, das mit einem ersten immunogenen Polypeptid verbunden ist, wobei das erste immunogene Polypeptid ein HCV-E1-Glycoprotein oder ein immunogenes Fragment davon umfasst, und wobei das zweite chimäre Antigen ein drittes HBsAg umfasst, das mit einem zweiten immunogenen Polypeptid verbunden ist, wobei das zweite immunogene Polypeptid ein HCV-E2-Glycoprotein oder ein immunogenes Fragment davon umfasst und wobei das erste, zweite und dritte HBsAg jeweils eine im Wesentlichen vollständige S-Domäne umfassen.
Immunogene Zusammensetzung nach Anspruch 30, wobei das erste HBsAg im Wesentlichen aus preS2- und S-Domänen besteht.
Immunogene Zusammensetzung nach Anspruch 30, wobei das erste HBsAg im Wesentlichen aus preS1-, preS2- und S-Domänen besteht.
Immunogene Zusammensetzung nach Anspruch 30, wobei der Carboxy-Terminus des ersten immunogenen Polypeptids mit dem Amino-Terminus des zweiten HBsAg und der Carboxy-Terminus des zweiten immunogenen Polypeptids mit dem Amino-Terminus des dritten HBsAg verbunden ist.
Immunogene Zusammensetzung nach Anspruch 30, wobei das erste HBsAg im Vergleich mit der Gesamtmenge des ersten und zweiten chimären Antigens im Überschuss exprimiert wird.
Immunogene Zusammensetzung nach Anspruch 34, wobei das erste HBsAg unter Verwendung einer Menge von DNA exprimiert wird, die zwischen 1 und 100 Mal der Menge DNA liegt, die verwendet wird, um das chimäre Antigen zu exprimieren.
Immunogene Zusammensetzung nach Anspruch 30, wobei das erste immunogene Polypeptid (a) Aminosäurereste 192 bis 330 eines HCV-1-Polyproteins; oder (b) die korrespondierenden Reste anderer HCV-Isolate; oder (c) eine immunogene Sequenz, die mindestens 80% Sequenzidentität mit (a) oder (b) hat, umfasst.
Immunogene Zusammensetzung nach Anspruch 30, wobei das zweite immunogene Polypeptid (a) Aminosäurereste 384 bis 661 eines HCV-1-Polyproteins; oder (b) die korrespondierenden Reste anderer HCV-Isolate; oder (c) eine immunogene Sequenz, die mindestens 80% Sequenzidentität mit (a) oder (b) hat, umfasst.
In vitro-Verfahren zur Herstellung virusähnlicher Partikel, umfassend die folgenden Schritte: Züchten einer Zelle in einem Kulturmedium, wobei die Zelle virusähnliche Partikel exprimiert, die ein erstes HBsAg und ein chimäres Antigen umfassen, wobei das chimäre Antigen ein zweites HBsAg umfasst, das kovalent mit einem immunogenen HCV-Polypeptid verbunden ist, und wobei das erste und das zweite HBsAg jeweils eine im Wesentlichen vollständige S-Domäne umfassen; und Isolieren der virusähnlichen Partikel aus dem Kulturmedium.
Verfahren nach Anspruch 38, wobei die Zelle eine CHO-Zelle oder eine COS-Zelle ist.
In vitro-Verfahren zur Herstellung einer Zelllinie, die virusähnliche Partikel exprimiert, umfassend die folgenden Schritte: Transfizieren einer Zelle mit einem Vektor, der virusähnliche Partikel exprimiert, die ein erstes HBsAg und ein chimäres Antigen umfassen, wobei das chimäre Antigen ein zweites HBsAg umfasst, das kovalent mit einem immunogenen HCV-Polypeptid verbunden ist, und wobei das erste und das zweite HBsAg jeweils eine im Wesentlichen vollständige S-Domäne umfassen; und Züchten der Zelle, um eine Zelllinie zu erzeugen, die die virusähnlichen Partikel exprimiert.
Verfahren nach Anspruch 40, wobei der Vektor ein Plasmidvektor ist.
Verfahren nach Anspruch 40, wobei der Plasmidvektor pCMVII opti 330 E1 (SEQ ID NR: 4) oder pCMV-II-E2661-sAg (SEQ ID NR: 6) ist.
Verfahren nach Anspruch 40, wobei der Vektor ein viraler Vektor ist.
Verfahren nach Anspruch 43, wobei der virale Vektor im Wesentlichen von infektiösen Viren frei ist.
Zelllinie, die ein virusähnliches Partikel exprimiert, das ein erstes HBsAg und ein chimäres Antigen umfasst, wobei das chimäre Antigen ein zweites HBsAg umfasst, das mit einem immunogenen HCV-Polypeptid verbunden ist, und wobei das erste und das zweite HBsAg jeweils eine im Wesentlichen vollständige S-Domäne umfassen.
Zelllinie, die ein virusähnliches Partikel umfasst, das ein erstes HBsAg und erste und zweite chimäre Antigene umfasst, wobei das erste chimäre Antigen ein zweites HBsAg umfasst, das mit einem ersten immunogenen Polypeptid verbunden ist, wobei das erste immunogene Polypeptid ein HCV-E1-Glycoprotein oder ein immunogenes Fragment davon umfasst, und wobei das zweite chimäre Antigen ein drittes HBsAg umfasst, das mit einem zweiten immunogenen Polypeptid verbunden ist, wobei das zweite immunogene Polypeptid ein HCV-E2-Glycoprotein oder ein immunogenes Fragment davon umfasst, und wobei das erste, zweite und dritte HBsAg jeweils eine im Wesentlichen vollständige S-Domäne umfassen.