JP5484732B2 - 過敏症の治療のための免疫賦活性核酸パッケージ粒子 - Google Patents

過敏症の治療のための免疫賦活性核酸パッケージ粒子 Download PDF

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Description

（発明の分野）
本発明は、免疫学の分野及び免疫学的に活性な組成物による過敏症の治療に関する。本発明の組成物は、免疫賦活性核酸がパッケージされた粒子、好ましくはウイルス様粒子、ナノ粒子、微小粒子（マイクロ粒子）又はリポソームを含有する。本発明の組成物は過敏症、好ましくはアレルギーで、アトピー性湿疹、喘息及びＩｇＥ依存性アレルギー（Ｉ型アレルギー）、特に花粉アレルギー（花粉症）のような疾患を含むものの治療において有用である。
（発明の概要）
最初の側面では、本発明は医薬として使用される組成物であって、粒子と免疫賦活性核酸（ＩＳＳ-ＮＡ）を含むか、本質的にこれらからなるか、又はこれらからなり、該粒子が前記免疫賦活性核酸と共にパッケージされている組成物を提供する。
本発明の組成物が過敏症、好ましくはアレルギーの予防的及び治療的処置において有用であることが意外にも見出された。更なる側面では、よって本発明は動物の過敏症、好ましくはアレルギーを治療する方法に使用される組成物を提供し、該組成物は粒子と免疫賦活性核酸（ＩＳＳ-ＮＡ）を含み、該粒子は前記ＩＳＳ-ＮＡと共にパッケージされている。特定の側面では、本発明は動物の過敏症、好ましくはアレルギーを治療する方法に使用される組成物を提供し、該組成物はウイルス様粒子と非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを含み、該ウイルス様粒子は前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドと共にパッケージされている。好ましい実施態様では、前記過敏症はアレルギー、好ましくはＩｇＥ依存性喘息、アトピー性湿疹又はＩｇＥ依存性アレルギー（Ｉ型アレルギー）である。更に好ましい実施態様では、前記粒子はナノ粒子、微小粒子及びリポソームから選択される。更に好ましい実施態様では、前記粒子はＶＬＰ、好ましくはＲＮＡ-バクテリオファージのＶＬＰ、また好ましくはバクテリオファージＱβのＶＬＰである。更に好ましい実施態様では、前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドはホスホジエステル結合ヌクレオチド、最も好ましくはＧ１０（配列番号２７）のものから専らなる。
更なる側面では、本発明は、動物の過敏症を治療する方法に使用される組成物の製造方法を提供し、該組成物は（ａ）ウイルス様粒子と；（ｂ）非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを含み；ここで、該ウイルス様粒子（ａ）は前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド（ｂ）と共にパッケージされ、該方法は、（ｉ）前記ＶＬＰ（ａ）を前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド（ｂ）と共にインキュベートする工程と；（ｉｉ）リボヌクレアーゼを加える工程と；（ｉｉｉ）前記組成物を精製する工程を含む。
更なる側面では、本発明は、動物の過敏症を治療する方法に使用される組成物の製造方法を提供し、該組成物は（ａ）ウイルス様粒子と；（ｂ）非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを含み；ここで、該ウイルス様粒子（ａ）は前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド（ｂ）と共にパッケージされ、該方法は、（ｉ）前記ＶＬＰをリボヌクレアーゼと共にインキュベートする工程と；（ｉｉ）前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを加える工程と；（ｉｉｉ）前記組成物を精製する工程を含む。
更なる側面では、本発明は、動物の過敏症を治療する方法に使用される組成物の製造方法を提供し、該組成物は（ａ）ウイルス様粒子と；（ｂ）非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを含み；ここで、該ウイルス様粒子（ａ）は前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド（ｂ）と共にパッケージされ、該方法は、（ｉ）前記ＶＬＰ（ａ）を分解する工程と；（ｉｉ）前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを加える工程と；（ｉｉｉ）前記ＶＬＰを再構築する工程を含む。
更なる側面では、本発明は、動物の過敏症を治療する方法に使用される組成物の製造方法を提供し、該組成物は（ａ）ウイルス様粒子と；（ｂ）非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを含み；ここで、該ウイルス様粒子（ａ）は前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド（ｂ）と共にパッケージされ、該方法は、（ｉ）前記ＶＬＰを前記ＶＬＰの核酸を加水分解可能な金属イオンを含む溶液と共にインキュベートする工程と；（ｉｉ）前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを加える工程と；（ｉｉｉ）前記組成物を精製する工程を含み、ここで好ましくは工程（ｉ）の前記金属イオンは、（ａ）亜鉛（Ｚｎ）イオン；（ｂ）銅（Ｃｕ）イオン；（ｃ）鉄（Ｆｅ）イオン；（ｄ）（ａ）、（ｂ）及び／又は（ｃ）の少なくとも一つのイオンの任意の混合物からなる群から選択される。
更なる側面では、本発明は、動物の過敏症を治療する方法に使用される組成物の製造方法を提供し、該組成物は（ａ）ウイルス様粒子と；（ｂ）非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを含み；ここで、該ウイルス様粒子（ａ）は前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド（ｂ）と共にパッケージされ、該方法は、（ｉ）前記ＶＬＰをアルカリ性条件、好ましくはＮａＯＨの存在下、最も好ましくは約２５ｍＭのＮａＯＨの存在下でインキュベートする工程と；（ｉｉ）前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを加える工程と；（ｉｉｉ）前記組成物を精製する工程を含む。
更なる側面では、本発明は、動物の過敏症を治療する方法に使用される組成物の製造方法を提供し、該組成物は（ａ）ウイルス様粒子と；（ｂ）非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを含み；ここで、該ウイルス様粒子（ａ）は前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド（ｂ）と共にパッケージされ、該方法は、（ｉ）前記ＶＬＰを前記ＶＬＰを不安定化可能な溶液と共にインキュベートし、ここで前記ＶＬＰがバクテリオファージＱβのＶＬＰである工程と；（ｉｉ）前記溶液からコートタンパク質を精製する工程と；（ｉｉｉ）非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド及び酸化剤の存在下で前記コートタンパク質をＶＬＰと再構築する工程を含む。
更なる側面では、本発明は医薬として使用される組成物を提供し、ここで該組成物は、（ｉ）ＶＬＰを前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドと共にインキュベートする工程と；（ｉｉ）リボヌクレアーゼを加える工程と；（ｉｉｉ）前記組成物を精製する工程を含む方法によって得ることができる。
更なる側面では、本発明は医薬として使用される組成物を提供し、ここで該組成物は、（ｉ）ＶＬＰをリボヌクレアーゼと共にインキュベートする工程と；（ｉｉ）非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを加える工程と；（ｉｉｉ）組成物を精製する工程を含む方法によって得ることができる。
更なる側面では、本発明は医薬として使用される組成物を提供し、ここで該組成物は、（ｉ）ＶＬＰを分解する工程と；（ｉｉ）非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを加える工程と；（ｉｉｉ）前記ＶＬＰを再構築する工程を含む方法によって得ることができる。
更なる側面では、本発明は医薬として使用される組成物を提供し、ここで該組成物は、ＶＬＰを前記ＶＬＰの核酸を加水分解可能な金属イオンを含む溶液と共にインキュベートする工程と；（ｉｉ）非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを加える工程と；（ｉｉｉ）前記組成物を精製する工程を含む方法によって得ることができる。
更なる側面では、本発明は動物のアレルギーの治療方法に使用される組成物を提供し、ここで該組成物は、（ｉ）ＶＬＰを非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドと共にインキュベートする工程と；（ｉｉ）リボヌクレアーゼを加える工程と；（ｉｉｉ）前記組成物を精製する工程を含む方法によって得ることができる。
更なる側面では、本発明は動物のアレルギーの治療方法に使用される組成物を提供し、ここで該組成物は、（ｉ）ＶＬＰをリボヌクレアーゼと共にインキュベートする工程と；（ｉｉ）非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドリボヌクレアーゼを加える工程と；（ｉｉｉ）前記組成物を精製する工程を含む方法によって得ることができる。
更なる側面では、本発明は動物のアレルギーの治療方法に使用される組成物を提供し、ここで該組成物は、（ｉ）ＶＬＰを分解する工程と；（ｉｉ）非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを加える工程と；（ｉｉｉ）前記ＶＬＰを再構築する工程を含む方法によって得ることができる。
更なる側面では、本発明は、動物のアレルギーを治療する方法に使用される組成物を提供し、該組成物は、（ｉ）ＶＬＰを該ＶＬＰの核酸を加水分解可能な金属イオンを含む溶液と共にインキュベートする工程と；（ｉｉ）非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを加える工程と；（ｉｉｉ）前記組成物を精製する工程を含む方法によって得ることができる。
更なる側面では、本発明は本発明の組成物を含有する薬学的組成物を提供する。
更なる側面では、本発明は動物の過敏症、好ましくはアレルギーを治療する方法を提供し、該方法は本発明の組成物を前記動物に導入することを含む。
本発明の更なる側面は、動物の過敏症の治療のための医薬の製造における本発明の組成物又は本発明の薬学的組成物の使用であって、ここで、好ましくは前記過敏症はアレルギーであり、更に好ましくは前記アレルギーは、（ａ）ＩｇＥ依存性喘息；（ｂ）アトピー性湿疹；及び（ｃ）ＩｇＥ依存性アレルギー（Ｉ型アレルギー）、好ましくは花粉アレルギー又はハウスダストアレルギーからなる群から選択される。
（発明の詳細な記載）
別段の定義をしない限り、ここで使用される全ての技術及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。
「過敏症」：本発明の文脈において、「過敏症」なる用語は、Johanssonら, 2001, Allergy 56:813-824に示唆されているように、正常な被験者が耐容性を示す用量の定まった刺激に暴露されることによって開始される任意の客観的に再現性がある症状又は徴候として理解されるものである。過敏症反応は、病歴、検査、又は症状と患者のその症状が起因する環境因子との間の関連の調査から合理的な証拠が存在するという意味で再現性がある。過敏症という用語は非アレルギー性過敏症とアレルギー性過敏症（アレルギー）を包含する。非アレルギー性過敏症は免疫系の関与を含まないか又は少なくとも免疫系の関与が検出できない任意の過敏症であり、アレルギー性過敏症は細胞性又は体液性免疫系の関与を常に含む。過敏症は好ましくは（ａ）喘息、（ｂ）鼻炎、（ｃ）結膜炎、（ｄ）鼻結膜炎、（ｅ）皮膚炎、（ｅ）蕁麻疹、（ｅ）食物過敏症、（ｅ）薬物過敏症、（ｅ）昆虫刺傷又は虫刺され過敏症、及び（ｅ）アナフィラキシーからなる群から選択される疾患のアレルギー性及び非アレルギー性形態を意味する。
更に好ましくは、過敏症は、（ａ）喘息、（ｂ）鼻炎、（ｃ）結膜炎、（ｄ）鼻結膜炎、（ｅ）皮膚炎、（ｅ）蕁麻疹、（ｅ）食物過敏症、（ｅ）薬物過敏症、（ｅ）昆虫刺傷又は虫刺され過敏症、及び（ｅ）アナフィラキシーからなる群から選択される疾患のアレルギー性形態を意味する。特に、過敏症はまた任意のタイプのアレルギーを含む。
「アレルギー」：本発明の文脈において、「アレルギー」なる用語は「アレルギー性過敏症」の略であり、Johanssonら, 2001, Allergy 56:813-824及びJohanssonら, 2004, J. Allergy Clin. Immunol. 113(5) 832-835に示唆されているように理解される。別段示さない限り、本願はそこに記載されたアレルギーの命名法に従う。アレルギー又はアレルギー性過敏症は、しばしば遺伝的素因がある個体（アトピー）において、物質（アレルゲン）に反応して免疫学的機構によって開始される過敏症反応である。アレルギーは抗体又は細胞媒介性でありうる。殆どの患者では、典型的にアレルギー反応の原因となる抗体はＩｇＥアイソタイプに属し（「抗体」を参照）、これらの患者はＩｇＥ依存性アレルギー（Ｉ型アレルギー）を被っていると言うことができる。ＩｇＥ依存性アレルギー反応は必ずしもアトピー性患者において生じるものではないことに注意しなければならない。非ＩｇＥ依存性アレルギーでは、抗体はＩｇＧアイソタイプに属しうる。よって、本発明の意味において、「アレルギー」はＩｇＥ依存性アレルギー（Ｉ型アレルギー）と非ＩｇＥ依存性アレルギーの双方を意味する。ＩｇＥ依存性アレルギーが好ましくは本発明によって対処される。従って、本発明の文脈において、アレルギーは好ましくはＩｇＥ依存性アレルギーを指す。アレルギーは過敏性反応を誘発する抗原の供給源に従って分類される。一実施態様では、アレルギーは、（ａ）食物アレルギー、（ｂ）薬物アレルギー、（ｃ）ハウスダストアレルギー、（ｄ）昆虫毒又は虫刺されアレルギー、及び（ｅ）花粉アレルギーから選択される。あるいは、アレルギーは過敏症反応の主要な症状に基づいて分類される。よって、他の実施態様では、アレルギーは、（ａ）喘息、（ｂ）鼻炎、（ｃ）結膜炎、（ｄ）鼻結膜炎、（ｅ）皮膚炎、（ｆ）蕁麻疹及び（ｇ）アナフィラキシーの群から選択される疾患の任意のアレルギー性形態を指す。
「Ｉ型アレルギー」：「Ｉ型アレルギー」及び「ＩｇＥ依存性アレルギー」なる用語は交換可能に使用され、アレルゲンに対するＩｇＥ依存性過敏症に関する。本発明の好ましい実施態様は、（ａ）花粉アレルギー（花粉症）；（ｂ）ハウスダストアレルギー；（ｃ）食物アレルギー；（ｄ）薬物アレルギー；（ｅ）昆虫毒又は虫刺されアレルギー、好ましくは蜂毒アレルギー；及び（ｆ）動物アレルギー、好ましくはネコアレルギーからなる群から選択されるＩｇＥ依存性アレルギーに関する。
「花粉症」：鼻炎、結膜炎及び／又は喘息を含みうる花粉に対するＩｇＥ依存性アレルギー（Ｉ型アレルギー）の典型的な形態で、好ましくは喘息が花粉症の慢性形態で生じる。
「アトピー」、「アトピー性疾患」：アトピーは、低用量のアレルゲン、通常はタンパク質に応答してＩｇＥ抗体を作り出し、喘息、鼻結膜炎、又は湿疹／皮膚炎のような典型的な症状を発症する個人的な又は家族性傾向である。小児におけるアトピーの最初の症状はしばしばアレルギー性症状、例えば下痢、喘鳴、及び発疹であり、原因のＩｇＥ抗体は後になって検出できるのみである。典型的なアトピー性個体におけるアレルギー性症状はアトピー性と称されうる。本発明の一実施態様では、過敏症はアトピー性疾患、好ましくは（ａ）アトピー性喘息、（ｂ）アトピー性ＩｇＥ依存性アレルギー、好ましくは花粉アレルギー（花粉症）、ハウスダストアレルギー又はチリダニアレルギーからなる群から選択されるアトピー性疾患である。一実施態様では、本願は、前記ＩｇＥ依存性アレルギーがアトピー性とみなされようと、非アトピー性アレルギーとみなされようと、一般にＩｇＥ依存性アレルギーに関する。しかしながら、本発明の特に好ましい実施態様はアトピー性アレルギー、好ましくはＩｇＥ依存性アトピー性アレルギーに関する。
「鼻炎」：「鼻炎」なる用語は、鼻からの過敏性症状、例えば痒み、くしゃみ、増加した鼻水分泌、及び鼻詰まりに関する。鼻炎は非アレルギー性並びにアレルギー性、つまり免疫学的に媒介される鼻炎に関する。本発明の好ましい実施態様は、アレルギー性鼻炎、好ましくはアレルギー性鼻炎のＩｇＥ依存性及び非ＩｇＥ依存性形態に関する。特に好ましい実施態様は、ＩｇＥ依存性アレルギー性鼻炎に関する。
「結膜炎」：結膜炎なる用語は、アレルギー性であり得、また非アレルギー性でありうる目の痒みに関し、アレルギー性結膜炎はＩｇＥ依存性及び非ＩｇＥ依存性アレルギー性結膜炎を包含する。アレルギー性結膜炎、特にＩｇＥ依存性アレルギー性結膜炎は通常はアレルギー性鼻炎に付随し、よってこの疾患はアレルギー性鼻結膜炎と適切には呼ばれる。ＩｇＥ依存性結膜炎の他に、ＴＨ１機構を含む接触性アレルギー性結膜炎が生じる。非アレルギー性結膜炎はまたしばしば非アレルギー性鼻炎を伴う。本発明の好ましい実施態様は、アレルギー性結膜炎のＩｇＥ依存性及び非ＩｇＥ依存性形態を含むアレルギー性結膜炎に関する。特に好ましい実施態様は、ＩｇＥ依存性アレルギー性結膜炎に関する。更に好ましい実施態様はＩｇＥ依存性アレルギー性鼻結膜炎に関する。
「喘息」：喘息又は気管支喘息は、肺の気道の炎症による慢性呼吸器疾患であり、気道の神経末端の感受性に影響を及ぼし、容易に刺激されるようになる。発作では、気道の内面が膨潤し気道を狭くし、肺に入り肺から出る空気の流れを減少させる。喘息は間欠形態（日中の間、一週間に２回以下の発作、夜に一ヶ月に２回以下の発作）、慢性形態（日中に持続的な発作、夜に頻繁な発作）及び任意の中間形態で起こりうる。本願の意味において、喘息なる用語は非アレルギー性並びにアレルギー性喘息に関する。本発明の好ましい実施態様は、喘息のＩｇＥ依存性及び非ＩｇＥ依存性形態を含むアレルギー性喘息に関する。特に好ましい実施態様はＩｇＥ依存性アレルギー性喘息、最も好ましくはアトピー性喘息に関する。
「アトピー性喘息」：アトピー性湿疹及びＩｇＥ依存性アレルギー、例えば花粉アレルギー（花粉症）、ハウスダスト又はチリダニに関連してしばしば起こる遺伝的素因を持つ患者における喘息のＩｇＥ依存形態。
「皮膚炎」：「皮膚炎」なる用語は皮膚の局所的炎症に関し、とりわけ、「湿疹」及び「接触性皮膚炎」（以下の定義を参照）を包含する。本発明の好ましい実施態様は皮膚炎、好ましくは湿疹及び接触性皮膚炎に関する。
「湿疹」：「湿疹」なる用語は、遺伝的に決定された皮膚障壁欠陥を含むある種の臨床的特徴を共通に有する幾つかの皮膚疾患の集合を記述するアトピー性湿疹／皮膚炎症候群（ＡＥＤＳ）に関する。この遺伝的に決定された標的器官感受性が湿疹の基礎を構成する。アトピー性体質の小児及び若い成人において、根底にある炎症はＩｇＥ抗体関連反応によって支配されている（アトピー性湿疹）。慢性の症例では、炎症はＩｇＥ抗体によってあまり影響されないと思われ、組織診における支配細胞はリンパ球である。湿疹は非アレルギー性湿疹及びアレルギー性湿疹に関する。本発明の好ましい実施態様は湿疹、好ましくはアトピー性（ＩｇＥ依存性）湿疹及び湿疹の非アトピー性形態を含むアレルギー性湿疹に関する。最も好ましくは、本発明はアトピー性（ＩｇＥ依存性）湿疹に関する。
「接触性皮膚炎」：「接触性皮膚炎」なる用語は、低分子量化学薬品又は刺激物に密接な接触をすることにより引き起こされる皮膚における局所的炎症反応に関する。接触性皮膚炎はアレルギー性であり得、また非アレルギー性でありうる。アレルギー性接触性皮膚炎は免疫学的機構、主にＴＨ１リンパ球によって媒介される。ハプテンとして作用し、アレルギー性接触性皮膚炎を引き起こす典型的なアレルゲンはニッケル、クロムイオン、香料、保存料、及び毒ツタウルシ植物からのウルシオールである。暴露は口からの取り込みから生じ得、いわゆる全身性アレルギー性接触性皮膚炎である。接触性皮膚炎のサブグループのタンパク接触性皮膚炎は、損傷を受けた皮膚からのタンパク質の吸収によって引き起こされるＩｇＥ関連反応である。本発明の好ましい実施態様は接触性皮膚炎、好ましくはアレルギー性接触性皮膚炎に関する。更に好ましい実施態様はタンパク接触性皮膚炎に関する。
「蕁麻疹」：「蕁麻疹」なる用語は刺激物又はアレルゲンによって引き起こされる皮膚の非炎症反応に関し、非アレルギー性蕁麻疹並びにアレルギー性蕁麻疹を含む。アレルギー性蕁麻疹は免疫学的機構によって媒介され、これは一般にはＩｇＥ依存性であるが、免疫複合体関連でもありうる。ラテックス手袋を着用したラテックスアレルギーのヒトの手や、イヌになめられたイヌアレルギーのヒトに起こるように、蕁麻疹はまたアレルゲンに局所的に接触した後に局所的に発症しうる。本発明の好ましい実施態様は、蕁麻疹、好ましくはアレルギー性蕁麻疹、最も好ましくはＩｇＥ依存性アレルギー性蕁麻疹に関する。
「食物過敏症」：「食物過敏症」なる用語は食物に対する有害反応に関し、これは非アレルギー性であり得、またアレルギー性であり得る。アレルギー性食物過敏症はＩｇＥ依存性であり得、食物アレルギーと称される。食物に対する深刻な全身性のアレルギー性反応はアナフィラキシー（以下を参照）として分類できる。本発明の好ましい実施態様は食物アレルギー、好ましくはＩｇＥ依存性食物アレルギーに関する。
「薬物過敏症」：「薬物過敏症」なる用語は、非アレルギー性であり得、またアレルギー性であり得る薬物に対する体の過敏反応に関する。抗体か媒介されようと細胞が媒介されようと、免疫学的機構が示された場合、反応は薬物アレルギーと呼ばれる。薬物アレルギーはＩｇＥによって媒介されうる。本発明の好ましい実施態様は薬物過敏症、好ましくは薬物アレルギー、最も好ましくはＩｇＥ依存性薬物アレルギーに関する。
「昆虫刺傷過敏症」又は「虫刺され過敏症」：これらの用語は、非アレルギー性であり得、またアレルギー性であり得る昆虫毒及び唾液に対する過敏反応に関する。免疫学的機構によって媒介される昆虫刺傷過敏症又は虫刺され過敏症は、蜂毒アレルギーにおけるように毒又は唾液アレルギーと称される。刺傷における多量の毒アレグゲンは吸入花粉アレルゲンの年と匹敵する。この高用量の感作は、おそらく、そのようなアレルギーを発症するための遺伝的素因がなぜ必要ではないかを説明する。本発明の好ましい実施態様は、毒アレルギー、好ましくはＩｇＥ依存性毒アレルギー、最も好ましくはＩｇＥ依存性蜂毒アレルギーに関する。
「アナフィラキシー」：「アナフィラキシー」なる用語は深刻な生命を脅かす汎発性又は全身性過敏反応を意味する。反応は通常は徐々に発症し、最も頻繁には歯茎／喉、手掌、又は足底の痒み、及び局所的蕁麻疹で始まり；低血圧及びショックに達する。低血圧及び深刻な気管支痙攣は、アナフィラキシーとして分類される反応に対して存在する必要はない。アナフィラキシーは、非アレルギー性であり得、またアレルギー性であり得る。アレルギー性アナフィラキシーはＩｇＧ免疫複合体のような免疫学的機構、補体関連、又は免疫細胞媒介機構を含む。アナフィラキシーは好ましくはＩｇＥ抗体によって媒介されるアナフィラキシー反応（ＩｇＥ依存性アナフィラキシー）、最も好ましくはピーナッツ誘発食物アナフィラキシー又は蜂毒誘発アナフィラキシーに関する。
「アレルゲン」：「アレルゲン」なる用語はアレルギーを引き起こす物質を意味する。好ましいアレルゲンは、全体の内容を出典明示によりここに援用するShough, Hら, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 19版, (82章), Mack Publishing Company, Mack Publishing Group, Easton, Pennsylvania (1995))に開示されているアレルゲンである。アレルゲンは脊椎動物において抗原となる。ここで使用される「アレルゲン」なる用語は、「アレルゲン抽出物」及び「アレルゲンエピトープ」も意味する。非常に好ましいアレルゲンは、花粉（例えば、牧草、ブタクサ、カバノキ及びビャクシン）；ハウスダスト及びチリダニ；哺乳動物表皮のアレルゲン及び動物の鱗屑；カビ及び真菌；昆虫体及び昆虫毒液；羽毛；食物；及び薬物（例えばペニシリン）からなる群から選択される。
「アレルゲン抽出物」／「誘発試験溶液」：アレルゲン抽出物は、結膜、鼻及び気管支誘発に使用される誘発試験溶液の成分である。かかるアレルゲン抽出物は市販されており、かかる抽出物を製造する方法はよく知られている。好ましいものは、（ｉ）樹木種又は草種で、最も好ましくはハンの木、セイヨウトネリコ、カバノキ、ハシバミ、カモガヤ、ハッショウ草、ホソムギ、オオアワガエリ、ケンタッキーブルーグラス、ヒロハノウシノケグサ、ギョウギシバ、ブタクサ、ライムギ及びコムギからなる群から選択されるもの；（ｉｉ）異なった動物種の上皮、好ましくはネコ、イヌ及びウマからなる群から選択される動物種からの上皮；（ｉｉｉ）カビ、好ましくはコウジカビ、カンジダ、アルテルナリア、及びサッカロミセスからなる群から選択されるカビ；及び（ｉｖ）ダニ種、好ましくはコナヒョウヒダニ、ヤケヒョウヒダニ及びアシブトコナダニからなる群から選択されるダニ種からなる群から選択される供給源から調製される単一のアレルゲン抽出物を含有する単一アレルゲン誘発溶液である。アレルゲン混合物を含むアレルゲン抽出物もまた誘発試験溶液に使用することができる。好ましいものは、カモガヤ、ハッショウ草、ホソムギ、オオアワガエリ、ケンタッキーブルーグラス及び／又はヒロハノウシノケグサの、異なった草のアレルゲン混合物である。更に好ましいものは、草、穀類、異なった樹木及び／又は獣毛のアレルゲン混合物である。誘発溶液は通常は生理食塩水中で調製され、０．４％のフェノールの添加により保存することができる。
「抗体」：ここで使用される場合、「抗体」なる用語はエピトープ又は抗原決定基に結合可能な免疫グロブリンのクラスに属する分子を意味する。
「抗原」：ここで使用される場合、「抗原」なる用語は、抗体又はＭＨＣ分子によって提示される場合はＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）が結合可能な分子を指す。ここで使用される「抗原」なる用語はまたＴ細胞エピトープも包含する。抗原は、免疫系が認識することができ、及び／又はＢ及び／又はＴリンパ球の活性化がもたらされる体液性免疫応答及び／又は細胞性免疫応答を誘導することができる。ここで使用される抗原はまた数種の個々の抗原の混合物であってもよい。しかしながら、「抗原」は本発明の組成物の成分の何れも包含しない。特に、「抗原」なる用語は本発明の粒子もＩＳＳ-ＮＡも意味するものではない。「抗原」なる用語はまた本発明の粒子を形成する任意の成分、例えばカプシドタンパク質を意味するものでもない。
エピトープ：ここで使用される場合、「エピトープ」なる用語は、動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトにおいて抗原性又は免疫原性活性を有するポリペプチドの連続的又は非連続的部分を指す。エピトープはＭＨＣ分子においてそのＴ細胞レセプターを介して抗体又はＴ細胞により認識される。
「免疫応答」：ここで使用される場合、「免疫応答」なる用語は、Ｂリンパ球及び／又はＴリンパ球及び／又は抗原提示細胞及び／又は自然免疫系他の細胞、例えばｐＤＣの活性化又は増殖をもたらす体液性免疫応答及び／又は細胞性免疫応答を指す。あるいは、免疫応答は肥満細胞のようなエフェクター細胞の機能改変をまた生じうる。
「免疫応答を誘導する」：物質、好ましくはＩＳＳ-ＮＡは、細胞又は生物が該物質、好ましくは有効量の該物質に暴露されたときに、未処理のコントロールにおいては生じない免疫応答が該細胞又は動物において検出可能であるときに、免疫応答を誘導可能である。
「ＩＦＮ-αの産生を刺激する」：特定の物質への暴露後に、細胞、好ましくは樹状細胞によってＩＦＮ-αが産生されることは、該物質の免疫賦活効果の強い指標である。従って、ＩＦＮ-αの産生を誘導可能であるＩＳＳ-ＮＡが本発明においては好ましい。細胞によるＩＦＮ-αの産生は、当該分野で一般的に知られている方法、好ましくは（ａ）ＥＬＩＳＡ、最も好ましくは本質的には実施例１４に記載されたようなＥＬＩＳＡ；（ｂ）蛍光色素コンジュゲート抗体を使用し、好ましくは実施例１４に記載されているようなフローサイトメトリー；及び（ｃ）細胞壊死阻害バイオアッセイから選択される方法によって、決定することができる。典型的な細胞壊死阻害バイオアッセイは、過去にPestka, S. (1986)"Interferon Standards and General Abbreviations", Method in Enzymology, Academic Press, New York 119, 14-23に記載されているように、水疱性口内炎ウイルスで感染されたウシＭＤＢＫ細胞に基づいている。本発明の文脈において、物質、好ましくは免疫賦活性核酸は、上述の方法の何れか一つ、好ましくはＥＬＩＳＡにより、最も好ましくは実施例１４に記載されているようにして検出して、細胞によるＩＦＮ-αの産生が、コントロール細胞と比較して前記細胞を前記物質へ暴露したときに有意に増大し、典型的には、また好ましくは、前記ＩＦＮ-αの産生は少なくとも約２の因数、より好ましくは約３以上の因数だけ増加する場合、「ＩＦＮ-αの産生を刺激する」とみなされる。
「免疫応答を亢進する」：免疫応答を亢進する物質とは、物質、好ましくはＩＳＳ-ＮＡであって、細胞又は動物の該物質への暴露時に該細胞又は該動物の免疫応答を強化し又は調節することができるものを指す。この観察は、免疫応答の指標であるとして当該分野で知られている任意のパラメータ、好ましくはサイトカインの形成及び細胞傷害性に関する。例えば、細胞傷害性Ｔ細胞の溶解活性を、物質、好ましくはＩＳＳ-ＮＡと共に、及び物質を伴わないで、例えば５１Ｃｒ放出アッセイを使用して、測定することができる。ＣＴＬ溶解活性が物質を伴わない場合のＣＴＬ溶解活性と比較して高いときの物質の量は免疫応答を亢進するのに十分な量と言われる。好ましい実施態様では、免疫応答は、少なくとも約２の因数、より好ましくは約３以上の因数だけ亢進される。分泌されるサイトカインの量とタイプはまた変わりうる。あるいは、誘導される抗体又はそのサブクラスの量は変わりうる。
「免疫賦活性核酸（ＩＳＳ-ＮＡ）」：ここで使用される場合、免疫賦活性核酸なる用語は、免疫応答を誘導し、及び／又は亢進することができる核酸を指す。ここで使用されるＩＳＳ-ＮＡは、リボ核酸、特にデオキシリボ核酸を含み、ここで、リボ核酸と、デオキシリボ核酸は双方とも二本鎖か一本鎖の何れかでありうる。好ましいＩＳＳ-ＮＡはデオキシリボ核酸であり、更に好ましくは該デオキシリボ核酸は一本鎖である。好ましくは、ＩＳＳ-ＮＡは、非メチル化Ｃを含む少なくとも一つのＣｐＧモチーフを含む。非常に好ましいＩＳＳ-ＮＡは、少なくとも一つのＣｐＧモチーフを含み、前記少なくとも一つのＣｐＧモチーフが少なくとも一つ、好ましくは一つの、ＣＧジヌクレオチドを含むか又は好ましくはそれからなり、該Ｃは非メチル化のものである。好ましくは、必ずしも必要ではないが、前記ＣＧジヌクレオチドはパリンドローム配列の一部である。上述のＣｐＧモチーフを含まないＩＳＳ-ＮＡは、例を挙げると、ＣＧジヌクレオチドを欠いた核酸、並びにメチル化ＣのＣＧジヌクレオチドを含む核酸を包含する。ここで使用される「免疫賦活性核酸」なる用語は、修飾塩基、好ましくは４-ブロモ-シトシンを含む核酸をまた指す。本発明の文脈で特に好ましいものは、樹状細胞におけるＩＦＮ-αの産生を刺激可能なＩＳＳ-ＮＡである。
「オリゴヌクレオチド」：ここで使用される場合、「オリゴヌクレオチド」なる用語は、２個以上のヌクレオチド、好ましくは少なくとも約６のヌクレオチドから約１０００００のヌクレオチド、より好ましくは約６から約２０００のヌクレオチド、より好ましくは約６から約３００のヌクレオチド、更により好ましくは約２０から約３００のヌクレオチド、更により好ましくは約２０から約１００のヌクレオチド、最も好ましくはから４０のヌクレオチドを含む核酸配列を指す。非常に好ましくは、オリゴヌクレオチドは、約３０のヌクレオチドを含み、より好ましくは正確に３０のヌクレオチドからなる。オリゴヌクレオチドなる用語はまた１００を越え約２０００までのヌクレオチド、好ましくは１００を越え約１０００までのヌクレオチド、より好ましくは１００を越え約５００までのヌクレオチドを含む核酸配列も指す。
オリゴヌクレオチドはポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドであり、好ましくは（ａ）非修飾ＲＮＡ又はＤＮＡ、及び（ｂ）修飾ＲＮＡ又はＤＮＡから選択される。該修飾は骨格又はヌクレオチド類似体を含みうる。オリゴヌクレオチドは、好ましくは（ａ）一本鎖及び二本鎖ＤＮＡ、（ｂ）一本鎖及び二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、（ｃ）一本鎖及び二本鎖ＲＮＡ、（ｄ）一本鎖及び二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、及び（ｅ）一本鎖、又はより好ましくは二本鎖又は一本鎖及び二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ及びＲＮＡを含むハイブリッド分子からなる群から選択される。更なる実施態様では、オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ又はＤＮＡ、あるいはＲＮＡ及びＤＮＡを含む三本鎖領域及びより高次の構造である。更なる実施態様では、オリゴヌクレオチドは、合成、ゲノム又は組換えである。好ましいオリゴヌクレオチドはλ-ＤＮＡ、コスミドＤＮＡ、人工細菌染色体、酵母菌人工染色体及び糸状ファージ、好ましくはＭ１３からなる群から選択される。一実施態様では、オリゴヌクレオチドは、（ａ）少なくとも一の修飾ヌクレオチド又は少なくとも一のヌクレオチド類似体を含むＤＮＡ又はＲＮＡ、又は（ｂ）安定性又は他の理由で修飾された骨格を有するＤＮＡ又はＲＮＡを意味する。好ましいヌクレオチド修飾体／類似体は、（ａ）ペプチド核酸、（ｂ）イノシン、（ｃ）トリチル化塩基、（ｄ）ホスホロチオエート、（ｅ）アルキルホスホロチオエート、（ｆ）５-ニトロインドールデオキシリボフラノシル、（ｇ）５-メチルデオキシシトシン、及び（ｈ）５,６-ジヒドロ-５,６-ジヒドロキシデオキシチミジンからなる群から選択される。ホスホチオエート化ヌクレオチドは細胞又は生物中において分解から保護されており、よって好ましいヌクレオチド修飾である。更に好ましいものは、典型的には自然に見出されるようなポリペプチドの化学的、酵素的、又は代謝的に修飾された形態、並びにウイルス及び細胞に特有のＤＮＡ及びＲＮＡの化学形態である。他のヌクレオチド類似体／修飾体は、当業者に明らかであろう。しかしながら、専らホスホジエステル結合ヌクレオチドからなる未修飾オリゴヌクレオチドは、典型的には、修飾ヌクレオチドよりもＩＳＳ-ＮＡとして活性があり、よって本発明においては一般的に好ましい。最も好ましいものは、専らホスホジエステル結合デオキシヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドである。更に好ましいものは細胞、好ましくは樹状細胞においてＩＦＮ-αの産生を刺激可能なオリゴヌクレオチドである。細胞においてＩＦＮ-αの産生を刺激可能な非常に好ましいオリゴヌクレオチドはＡ型ＣｐＧ及びＣ型ＣｐＧから選択される。
「ＣｐＧモチーフ」：ここで使用される場合、「ＣｐＧモチーフ」なる用語は、Ｃが、非メチル化で、中心ＣｐＧ（の３’及び５’側）に隣接する少なくとも一つの塩基、好ましくは一又は二のヌクレオチドによって囲まれた非メチル化中心ＣｐＧを含むヌクレオチドのパターン、つまり非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを意味する。典型的には、また好ましくは、ここで使用されるＣｐＧモチーフは非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドとその５’及び３’端の二つのヌクレオチドを含むか、あるいはこれらからなる。理論によって束縛されるものではないが、ＣｐＧに隣り合う塩基はＣｐＧオリゴヌクレオチドに対する活性の有意な部分をもたらす。
「ＣｐＧ」／「非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド」：ここで用いる場合、「非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド」又は「ＣｐＧ」なる用語は、少なくとも一のＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチド、好ましくはオリゴデスオキシヌクレオチドを意味する。よって、ＣｐＧは少なくとも一つの非メチル化シトシン、グアニンジヌクレオチドを含む。好ましいＣｐＧは、脊椎動物骨髄由来細胞の分裂促進効果を刺激／活性化し、例えば有し、あるいは該細胞によるサイトカインの発現を誘導又は増大させる 例えば、ＣｐＧはＢ細胞、ＮＫ細胞及び抗原提示細胞、例えば樹状細胞、単球及びマクロファージの活性化に有用でありうる。好ましくは、ＣｐＧは、３’にグアノシンが続く非メチル化シトシンを含むオリゴデスオキシヌクレオチド、好ましくは一本鎖オリゴデスオキシヌクレオチドを意味し、上記非メチル化シトシン及び上記グアノシンはホスフェート結合によって結合され、好ましくは該ホスフェート結合はホスホジエステル結合又はホスホチオエート結合であり、更に好ましくは上記ホスフェート結合はホスホジエステル結合である。ＣｐＧは、ヌクレオチド類似体、例えばホスホロチオエステル結合を含む類似体などを含むことができ、二本鎖又は一本鎖であってよい。一般に、二本鎖分子はインビボにおいてより安定性がある一方、一本鎖分子は高い免疫活性を有する。好ましくは、ここで使用される場合、ＣｐＧは、少なくとも約１０のヌクレオチド長で、少なくとも一つのＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドであり、更に好ましくは、上記ＣｐＧは１０から６０、より好ましくは１５から６０、更により好ましくは２０から４０，更により好ましくは約３０、最も好ましくは正確に３０のヌクレオチド長である。ＣｐＧは、メチル化及び／又は非メチル化ヌクレオチドからなり得、上記少なくとも一つのＣｐＧモチーフは、Ｃが非メチル化の少なくとも一つのＣＧジヌクレオチドを含む。ＣｐＧはまたメチル化及び非メチル化配列ストレッチを含み得、上記少なくとも一つのＣｐＧモチーフは、Ｃが非メチル化の少なくとも一つのＣＧジヌクレオチドを含む。非常に好ましいＣｐＧは専ら非メチル化ヌクレオチドからなる。非常に好ましくは、ＣｐＧは、３’端にグアノシンが続く非メチル化シトシンを含む一本鎖オリゴデスオキシヌクレオチドに関し、上記非メチル化シトシンと上記グアノシンはホスホジエステル結合によって結合している。更により好ましくは、ＣｐＧは、３’端にグアノシンが続く非メチル化シトシンを含む一本鎖オリゴデスオキシヌクレオチドに関し、上記非メチル化シトシンと上記グアノシンがホスホジエステル結合によって結合し、上記ＣｐＧが専ら非メチル化ヌクレオチドからなる。最も好ましくは、ＣｐＧは、３’端にグアノシンが続く非メチル化シトシンを含む約３０のヌクレオチド長の一本鎖オリゴデスオキシヌクレオチドに関し、上記非メチル化シトシンと上記グアノシンがホスホジエステル結合によって結合し、上記ＣｐＧが専ら非メチル化ヌクレオチドからなる。ＣｐＧはホスホロチオエステル結合を含む類似体のようなヌクレオチド類似体を含み得、二本鎖又は一本鎖でありうる。一般に、ホスホジエステルＣｐＧは以下に示すようにＡ型ＣｐＧであり、ホスホチオエステル安定化ＣｐＧはＢ型ＣｐＧ又はＣ型ＣｐＧである。本発明において好ましいＣｐＧオリゴヌクレオチドは、Ａ型ＣｐＧ及びＣ型ＣｐＧであり、最も好ましくはＡ型ＣｐＧである。
「Ａ型ＣｐＧ」：ここで使用される場合、「Ａ型ＣｐＧ」又は「Ｄ型ＣｐＧ」は、少なくとも一つのＣｐＧモチーフを有するオリゴデスオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）を意味する。Ａ型ＣｐＧは優先的にＴ細胞の活性化及び樹状細胞の成熟を刺激し、ＩＦＮ-α産生を刺激可能である。Ａ型ＣｐＧでは、少なくとも一つのＣｐＧモチーフのヌクレオチドが少なくとも一つのホスホジエステル結合によって結合している。Ａ型ＣｐＧは、その５’端及び／又は好ましくはその３’端にホスホロチオエート結合ヌクレオチドが隣接しうる少なくとも一つのホスホジエステル結合ＣｐＧモチーフを含む。好ましくは、ＣｐＧモチーフ、よって好ましくはＣＧジヌクレオチドと少なくとも一つ、好ましくは二つのヌクレオチドを有するその直ぐ隣接する領域はホスホジエステルヌクレオチドからなる。好ましいＡ型ＣｐＧは専らホスホジエステル（ＰＯ）結合ヌクレオチドからなる。更に好ましいＡ型ＣｐＧはホスホチオエート結合を含んでいない。典型的には、また好ましくは、本明細書で使用される「Ａ型ＣｐＧ」又は「Ｄ型ＣｐＧ」なる用語は、少なくとも一つのＣｐＧモチーフと、５’及び／又は３’端にポリＧモチーフを含むオリゴデスオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）を意味する。典型的には、また好ましくは、ポリＧモチーフは、少なくとも一つ、好ましくは少なくとも３、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５のＧ（グアノシン）、最も好ましくは少なくとも１０のＧを含むか、あるいはこれらからなる。ある実施態様では、５’及び／又は３’端、典型的には、また好ましくは、５’及び／又は３’端のポリＧモチーフの少なくとも一つのＧ、好ましくはポリＧモチーフの少なくとも二つ、三つ又は四つ、更により好ましくは全てのＧが、ホスホロチオエート修飾されている。しかしながら、非常に好ましい実施態様では、ポリＧモチーフの全てのＧはホスホジエステル結合によって結合している。好ましくは、本発明のＡ型ＣｐＧはパリンドローム配列を含むかあるいはそれからなる。典型的には、また好ましくは、ＣｐＧモチーフは上記パリンドローム配列の一部である。典型的には、また好ましくは、全てのヌクレオチド、しかしパリンドローム配列の少なくともＣｐＧモチーフは、ホスホジエステルヌクレオチドからなる。典型的には、また好ましくは、パリンドローム配列は配列番号２８である。非常に好ましいＡ型ＣｐＧは１６から３０ヌクレオチド長で、専らホスホジエステル結合ヌクレオチドからなり、パリンドローム配列、好ましくは配列番号２８のパリンドローム配列を含み、その５’端及びその３’端に３から１０ＧからなるポリＧモチーフが隣接している。
「Ｂ型ＣｐＧ」：ここで使用される場合、「Ｂ型ＣｐＧ」（Ｋ型）なる用語は、優先的に又は好ましくは専ら修飾ヌクレオチド、好ましくはホスホロチオエート修飾ヌクレオチドからなるＣｐＧオリゴヌクレオチドに関する。Ｂ型ＣｐＧは優先的にＢ細胞を刺激し、ある程度はＮＫ細胞活性化とサイトカイン産生を刺激する。
「Ｃ型ＣｐＧ」：ここで使用される場合、「Ｃ型ＣｐＧ」なる用語は、Ｂ型オリゴヌクレオチドのように、優先的に又は好ましくは専ら修飾ヌクレオチド、好ましくはホスホロチオエート修飾ヌクレオチドからなるＣｐＧオリゴヌクレオチドに関する。Ｃ型ＣｐＧの例は国際公開第２００５／０４２０１８Ａ２号及びVollmer等 2004, Eur. J. Immunol. 43:351-262（これらは出典明示によりここに援用する）に記載されている。特に国際公開第２００５／０４２０１８Ａ２号の配列番号１から６９が参照される。CpGs Ｃ型ＣｐＧはＡ型及びＢ型ＣｐＧの効果を併せ持ち、Ｂ細胞又はＮＫ細胞の活性化とＩＦＮ-α産生、好ましくは樹状細胞におけるＩＦＮ-α産生を刺激する。ＩＦＮ-α産生を好ましくは樹状細胞において刺激することができるＣ型ＣｐＧが本発明において一般に好ましい。Ａ型ＣｐＧとは異なり、Ｃ型ＣｐＧは、典型的にはポリ-Ｇストレッチを含まない。Ｃ型ＣｐＧは好ましくはＣｐＧモチーフを含むパリンドローム配列、好ましくは配列番号５３から６０に記載したようなパリンドローム配列を含むか、あるいはそれらからなる。更に好ましいＣ型ＣｐＧは、（ａ）ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＡ（配列番号６１）、（ｂ）ＣＧＧＣＧＣＣＧＴＧＣＣＧ（配列番号６２）及び（ｃ）ＣＧＧＣＧＴＣＧＴＧＣＣＧ（配列番号６３）からなる群から選択される配列を含み、ここで、上記Ｃ型ＣｐＧの５’端は好ましくは配列番号６１からなり、及び／又は上記Ｃ型ＣｐＧの３’端は好ましくは配列番号６２及び配列番号６３から選択されるヌクレオチド配列からなり、最も好ましくは上記Ｃ型ＣｐＧの３’端は配列番号６３からなる。更に好ましいＣ型ＣｐＧは、（ａ）ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＡＣＧＧＣＧＣＣＧＴＧＣＣＧ（配列番号６４）及び（ｂ）ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＡＣＧＧＣＧＴＣＧＴＧＣＣＧ（配列番号６２５）からなる群から選択され、好ましくは上記Ｃ型ＣｐＧの全核酸はホスホロチオエート結合している。更に好ましいＣ型ＣｐＧは、（ａ）ＴＣｐＧＴＣＧＴＴＴＴＡＣＧＧＣＧＣＣＧＴＧＣＣＧ（配列番号６４）；（ｂ）ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＡＣｐＧＧＣｐＧＣＣｐＧＴＧＣＣＧ（配列番号６４）；（ｃ）ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＡＣｐＧＧＣＧＣＣｐＧＴＧＣＣＧ（配列番号６４）；（ｄ）ＴＣＧＴＣｐＧＴＴＴＴＡＣｐＧＧＣＧＣＣｐＧＴＧＣＣＧ（配列番号６４）からなる群から選択され、ここで、ｐはホスホジエステル結合を示し、他の全てのヌクレオチドはホスホロチオエート結合である。（ａ）ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＣＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＧ（配列番号６６）；（ｂ）ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＣＧＡＣＧＧＣＣＧＴＣＧ（配列番号６７）；（ｃ）ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＣＣＧＧＣＧＣＧＣＣＧＧ（配列番号６８）；（ｄ）ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＣＧＧＣＧＣＧＣＧＴＣＧ（配列番号６９）；（ｅ）ＴＣＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＧＴＣＧＴＣＧＴＴＴ（配列番号７０）；（ｆ）ＴＴＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＧＴＣＧＴＣＧＴＴＴ（配列番号７１）；（ｇ）ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＣＧＴＣＧＧＣＣＧＣＣＧ（配列番号７２）；（ｈ）ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＣＧＧＣＴＴＴＴＧＣＣＧ（配列番号７３）；（ｉ）ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＣＧＧＣＧＴＴＴＴＴＴＴ（配列番号７４）；及び（ｊ）ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＣＧＧＣＧＧＣＣＧＣＣＧ（配列番号７５）からなる群から選択されるＣ型ＣｐＧは、ＩＦＮ-α産生の強力なインデューサーであり(Vollmer等 2004, Eur. J. Immunol. 43:351-262, p. 253, その表１を参照）、よって本発明における特に好ましい免疫賦活性核酸である。
「パリンドローム配列」：パリンドローム配列は、規則的な塩基対（Ａ／Ｔ；Ｃ／Ｇ）を有する二本鎖核酸の形態で存在する場合、５’−３’方向に同一の二つの一本鎖からなるヌクレオチド配列である。本発明の免疫賦活性核酸は好ましくは少なくとも６、好ましくは少なくとも７、８、９又は１０、最も好ましくは正確に１０のヌクレオチドからなるパリンドローム配列を含み、最も好ましくは上記パリンドローム配列は好ましくはＣｐＧモチーフを含む。本発明において有用な免疫賦活性核酸のパリンドローム配列は、例えばYamamoto等 1992, J. Immunol. 148(12):4072-4076及びKuramoto等1992, Jpn. J. Cancer Res. 83:1128-1131に記載されている。好ましいパリンドローム配列は、ＣｐＧモチーフを含み、（ａ）ＧＡＣＧＴＣ（配列番号３５）、（ｂ）ＡＧＣＧＣＴ（配列番号３６）、（ｃ）ＡＡＣＧＴＴ（配列番号３７）、（ｄ）ＡＴＣＧＡＴ（配列番号３８）；（ｅ）ＣＧＡＴＣＧ（配列番号３９）；（ｆ）ＣＧＴＡＣＧ（配列番号４０）；（ｇ）ＣＧＣＧＣＧ（配列番号４１）；（ｈ）ＧＣＧＣＧＣ（配列番号４２）；（ｉ）ＴＣＧＣＧＡ（配列番号４３）；（ｊ）ＡＣＧＡＴＣＧＴ（配列番号４４）；（ｋ）ＣＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧ（配列番号４５）；（ｌ）ＣＧＡＣＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＴＣＧ（配列番号４６）；（ｍ）ＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ（配列番号２８）、（ｎ）ＣＧＡＣＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＴＣＧ（配列番号４７）；（ｏ）ＡＡＣＧＴＴ（配列番号４８）；（ｐ）ＣＡＡＣＧＴＴＧ（配列番号４９）；（ｑ）ＡＣＡＡＣＧＴＴＧＴ（配列番号５０）；（ｒ）ＡＡＣＡＡＣＧＴＴＧＴＴ（配列番号５１）；（ｓ）ＣＡＡＣＡＡＣＧＴＴＧＴＴＧ（配列番号５２）；（ｔ）ＣＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＧ（配列番号５３）；（ｕ）ＣＧＡＣＧＧＣＣＧＴＣＧ（配列番号５４）；（ｖ）ＣＣＧＧＣＧＣＧＣＣＧＧ（配列番号５５）；（ｗ）ＣＧＣＧＣＧ（配列番号５６），（ｘ）ＣＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＧ（配列番号５７）；（ｙ）ＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣ（配列番号５８）；（ｚ）ＣＧＧＣＣＧ（配列番号５９）；及び（ａａ）ＣＧＧＣＧＧＣＣＧＣＣＧ（配列番号６０）からなる群から選択される。Ａ型ＣｐＧは好ましくはパリンドローム配列（ａ）から（ｓ）から選択されるパリンドローム配列を含む一方、Ｃ型ＣｐＧは好ましくはパリンドローム配列（ｔ）から（ａａ）から選択されるパリンドローム配列を含む。
パッケージ化(packaged)：ここで使用される「パッケージ化」なる用語は、粒子、特にＶＬＰとの関係したＩＳＳ-ＮＡ、特に非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの状態を意味する。ここで使用される「パッケージ化」なる用語は、共有結合、好ましくは化学カップリングによるものを意味する。より好ましくは、「パッケージ化」なる用語は、非共有結合、好ましくはイオン性相互作用、疎水性相互作用、又は水素結合を意味する。共有結合は好ましくはエステル、エーテル、ホスホエステル、アミド、ペプチド、イミド、炭素-硫黄結合、及び炭素-リン結合からなる群から選択される。非常に好ましくは、ここで使用される「パッケージ化」なる用語は粒子内への上記ＩＳＳ-ＮＡの封入(enclosement）又は部分的な封入を意味する。例えば、非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、共有結合も非共有結合もなく実際の結合がない状態で、あるいは非共有結合によって、ＶＬＰに封入されうる。
典型的には、また好ましくは、ＩＳＳ-ＮＡがパッケージ化された粒子は分解から、好ましくはＤＮエース又はＲＮエース加水分解から上記ＩＳＳ-ＮＡを保護する。従って、好ましい意味では、「パッケージ化」なる用語は、パッケージされた状態のＩＳＳ-ＮＡ、好ましくは非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドがＤＮエース又はＲＮエース加水分解から隔絶されている。より好ましくは、「パッケージ化」なる用語は、ＩＳＳ-ＮＡ、好ましくは非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドがＤＮエース又はＲＮエース加水分解から隔絶され、更に好ましくはＤＮエースはＤＮエースＩ又はベンゾナーゼである。皿により好ましくは、「パッケージ化」なる用語は、非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドがベンゾナーゼ加水分解から隔絶されている。
ＩＳＳ-ＮＡ、特に非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドのＤＮエース（例えばＤＮエースＩ又はベンゾナーゼ）への接近性は好ましくは国際公開第２００３／０２４４８１Ａ２号の実施例１１−１７（その１１１頁を参照）に記載されているようにしてアッセイされる。好ましい意味では、ＶＬＰは、ベンゾナーゼ（２ｍＭのＭｇＣｌ２，ｐＨ７．２を含むバッファー中の１９０Ｕベンゾナーゼ／ｍｇカプシドタンパク質、２０−２５℃，１８時間）での処理後に少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の上記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが上記ＶＬＰ（例えば臭化エチジウム染色ゲル中において）から回収され得る場合、非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドがパッケージされていると見なされる。そのようなアッセイには、適切なコントロールが必要であり、ＶＬＰと非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの特定の組合せに対して適合かする必要があるかも知れないことは当業者には明らかである。より好ましい意味では、ＲＮＡバクテリオファージのＶＬＰは、ベンゾナーゼ（２ｍＭのＭｇＣｌ２，ｐＨ７．２を含むバッファー中の１９０Ｕベンゾナーゼ／ｍｇカプシドタンパク質、２０−２５℃，１８時間）での処理後に少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の上記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドがＲＮＡバクテリオファージの上記ＶＬＰから回収され得る場合、非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドがパッケージされていると見なされる。非常に好ましい意味では、ＲＮＡバクテリオファージのＶＬＰは、ベンゾナーゼ（２ｍＭのＭｇＣｌ２，ｐＨ７．２を含むバッファー中の１９０Ｕベンゾナーゼ／ｍｇカプシドタンパク質、２０−２５℃，１８時間）での処理後に少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の上記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドがＲＮＡバクテリオファージの上記ＶＬＰから回収され得る場合、Ｇ１０（配列番号２７）オリゴヌクレオチドがパッケージされていると見なされる。より特定の意味では、ＲＮＡバクテリオファージＱβ、ＡＰ２０５、ＧＡ又はｆｒのＶＬＰは、ベンゾナーゼ（２ｍＭのＭｇＣｌ２，ｐＨ７．２を含むバッファー中の１９０Ｕベンゾナーゼ／ｍｇカプシドタンパク質、２０−２５℃，１８時間）での処理後に少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の上記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドがＲＮＡバクテリオファージの上記ＶＬＰから回収され得る場合、Ｇ１０（配列番号２７）オリゴヌクレオチドがパッケージされていると見なされる。非常に特定の意味では、ＲＮＡバクテリオファージＱβのＶＬＰは、ベンゾナーゼ（２ｍＭのＭｇＣｌ２，ｐＨ７．２を含むバッファー中の１９０Ｕベンゾナーゼ／ｍｇカプシドタンパク質、２０−２５℃，１８時間）での処理後に少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％の上記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドがＲＮＡバクテリオファージＱβの上記ＶＬＰから回収され得る場合、Ｇ１０（配列番号２７）オリゴヌクレオチドがパッケージされていると見なされる。
あるいは、ＩＳＳ-ＮＡ、特にＤＮエース又はＲＮエース加水分解の基質を構成しないＩＳＳ-ＮＡの粒子中へのパッケージ状態は、実施例４に記載したように、サイズ排除クロマトグラフィー又はＳＤＳ-ＰＡＧＥ及び続く分光学的分析によって評価することができる。ＩＳＳ-ＮＡがパッケージされた粒子のパッケージ状態を証明する更なる可能性は、例えば実施例１に記載した条件下での、粒子の透析又はタンジェンシャルフロー濾過であり、パッケージされた核酸が上記粒子に付随して残る一方、非パッケージ化核酸は除去される。
非常に好ましい意味では、粒子は、バクテリオファージ、好ましくはＲＮＡバクテリオファージ、更に好ましくはＲＮＡバクテリオファージＱβのウイルス粒子又はウイルス様粒子、最も好ましくはＲＮＡバクテリオファージＱβのウイルス粒子であり、上記ＩＳＳ-ＮＡが非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、好ましくはＡ型ＣｐＧ、更に好ましくは配列番号７２である場合、「パッケージ化」なる用語は、上記ＩＳＳ-ＮＡがパッケージされた粒子が、上記バクテリオファージ、好ましくは上記ＲＮＡバクテリオファージ、更に好ましくは大腸菌中でのコートタンパク質の組換え発現により得られた上記ＲＮＡバクテリオファージＱβのウイルス粒子と同じ保持時間で溶出することを示しており、好ましくは上記保持時間は、好ましくは本願の実施例４に記載されているようなサイズ排除クロマトグラフィーによって決定され、好ましくは本願の実施例４に記載されているようにして決定される上記ＩＳＳ-ＮＡを含む。
好ましい実施態様では、ＩＳＳ-ＮＡ、好ましくは非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、粒子、好ましくはＶＬＰカプシド内に、最も好ましくは非共有的にパッケージされる。非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドがパッケージされたＶＬＰの調製方法は先行技術、例えば国際公開第２００３／０２４４８１Ａ２号（その実施例２、３、７、８、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、及び１７、特にその実施例１４−１７を参照）及び国際公開第２００４／０００３５１Ａ１号に与えられている。両出願の開示を出典明示により本願に援用する。非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドがパッケージされたＶＬＰの調製のための更なるプロトコルは本願の実施例１、３、５及び６に提供される。
上で特定したアッセイ条件下、特に国際公開第２００３／０２４４８１Ａ２号の実施例１１−１７のものでは、上記ＩＳＳ-ＮＡがパッケージされる幾つかの合成粒子は、ある限られた量のＩＳＳ-ＮＡを放出し得、該放出は典型的には二相又はより多相の動態に従い、該動態は速やかな初期のバースト放出相と少なくとも一つの遅い放出相を含みうる。例えば、合成粒子にパッケージされたＩＳＳ-ＮＡの合成粒子は、生理バッファー中でインビトロで３７℃又は３０℃にてインキュベートされた場合に、バースト放出相で放出されうる。この場合、バースト放出相には少なくとも一つの遅い放出相が続く。ある場合には、I第二の放出相がフラットであり、これは、その相では合成粒子からＩＳＳ-ＮＡが放出されないか非常に限られた量しか放出されないことを意味する。二以上の相が、合成粒子からのＩＳＳ-ＮＡの放出動態の試験によって特定される。典型的には、初期のバースト放出相は２４時間まで続く場合があり、遅い放出相は２−３日から６日又はそれ以上続く場合がある。ある場合には、遅い放出相はほぼフラットであり、バースト放出相後にＩＳＳ-ＮＡは放出されないか殆ど放出されない。あるいは、初期バースト相が存在せず、むしろ一又は複数の遅い放出相が存在しうる。 バースト放出相はパッケージ化を評価するアッセイにおいてヌクレアーゼ又は血清曝露に付随しうるので、このあっせいで評価されるヌクレアーゼ又は血清による分解からの保護は完全でない場合がある。保護を試験するためのアッセイで使用される条件下におけるオリゴヌクレオチドの初期バースト放出相の場合では、遅い放出相に対応するアッセイの時間スパンの間、保護が評価される。よって、ウイルス粒子又はウイルス様粒子ではなく合成粒子である粒子に関して「パッケージ化」なる用語は、合成粒子とＩＳＳ-ＮＡを含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる組成物をまた包含し、上記合成粒子による ＩＳＳ-ＮＡの放出が起こるが、但し、上記合成粒子にパッケージされたＩＳＳ-ＮＡの少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、更により好ましくは少なくとも６０％、更により好ましくは少なくとも７０％、最も好ましくは少なくとも８０％がアッセイの終わりに上記合成粒子に付随して残る。
「粒子」：本発明の粒子は、１０から１００００ｎｍ、好ましくは２０から１０００ｎｍ、より好ましくは２０から５００ｎｍ、更により好ましくは２０から３００ｎｍ、更により好ましくは２０から２００ｎｍ、最も好ましくは２０から１００ｎｍの直径を有し、これらの粒子には好ましくはＩＳＳ-ＮＡがパッケージされる。本発明の粒子は、好ましくは、合成粒子及びＶＬＰからなる群から選択される。本発明の非常に好ましい粒子はＶＬＰ、より好ましくはＲＮＡファージのＶＬＰである。
「粒子のサイズ」：球状又はほぼ球状の粒子のサイズは、粒子集団の平均直径として決定される；楕円状、細長い又は不規則に形成された粒子は粒子集団の最も長い軸の算術平均値を意味する。典型的には、また好ましくは、粒子、好ましくはナノ粒子又は微小粒子(マイクロ粒子)、最も好ましくはナノ粒子のサイズは動的光散乱（ＤＬＳ）法（実施例１３）によって決定される。
「合成粒子」：ここで使用される場合、「合成粒子」は、化学的又は物理的プロセス、好ましくはモノマーの重合、ポリマーの沈殿、巨大分子の結合組立、例えば凝集又は熱変性、該組み立てられた巨大分子の化学的架橋によって、形成される粒子を意味する。好ましい合成粒子は、リポソーム、微小粒子(マイクロ粒子)及びナノ粒子から選択される。更に好ましい粒子は、リポソーム、微小粒子、ナノ粒子、及びビロソームから選択される。非常に好ましい合成粒子はナノ粒子である。「合成粒子」なる用語はウイルスタンパク質の集合によって形成された粒子は意味しない。ウイルスコートタンパク質から形成される粒子は特にウイルス粒子又はウイルス様粒子と呼ばれる。ウイロイド、レトロトランスポゾン及び遺伝子的にコードされたウイルスタンパク質から形成される全ての粒子がまたウイルス粒子又はウイルス様粒子として理解される。
「リポソーム」：ここで使用される場合、「リポソーム」なる用語は、一又は複数、好ましくは一、二、又は三のリン脂質二重層膜を含むリン脂質小胞体を意味する。リポソームは、調製方法及び使用される脂質に応じて電荷とサイズが変化する。本発明のリポソームは中性、カチオン性、アニオン性、ステルス、又はカチオン性ステルスでありうる。好ましくは、本発明のリポソームはカチオン性リポソームである。リポソームは、１００から８００ｎｍ、好ましくは１００から４００ｎｍ、より好ましくは１００から３００ｎｍ、更により好ましくは１００から２００ｎｍ、最も好ましくは２００ｎｍ未満の直径を有しうる。「リポソーム」なる用語は、ここで使用される場合、修飾リポソーム、好ましくはリポソームの表面が、ＤＣへの結合を、例えば特定の糖部分（Fukasawa等, (1998), FEBS, 441, 353-356）又は抗体（Serre等 (1998), J. Immunol., 161, 6059-6067）を介して最適化するために特に修飾されている修飾リポソームをまた包含する。
「リポポリプレックス(lipopolyplex)」：リポポリプレックス粒子は、カチオン性脂質、ポリカチオン及びＩＳＳ-ＮＡ又はＤＮＡを含むか、又は好ましくは本質的にそれらからなるか、最も好ましくはそれらからなるリポソームであり、カチオン性脂質が、ポリカチオンとのＩＳＳ-ＮＡ又はＤＮＡの複合体を囲む更なる保護層を形成していると考えられる（Pelisek J.等 J Gene Med 2006; 8:186-197）。
「微小粒子(マイクロ粒子)」：ここで使用される場合、「微小粒子」はミクロンオーダー（つまり、＞１μｍで、＜１０００μｍ）に制御された寸法の合成粒子を意味する。好ましい微小粒子は１から１０μｍ、好ましくは１から５μｍ、より好ましくは１から２μｍのサイズを有している。
「ナノ粒子」：ここで使用される場合、「ナノ粒子」はナノメーターオーダーに制御された寸法の合成粒子を意味し、好ましくはＩＳＳ-ＮＡが該ナノ粒子に捕捉され、カプセル化され、非共有結合され、共有結合され、又は溶解される。ナノ粒子のサイズは、好ましくは１０００、９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、１００又は５０ｍ未満であり、更に好ましくは、上記ナノ粒子は約１０、１５、２０、３０、４０、又は５０ｎｍ以上である。好ましくは、ナノ粒子は５０ｎｍ以上である。よっって、本発明のナノ粒子は、好ましくは１０から５００ｎｍ、より好ましくは２０から４００ｎｍ、更により好ましくは４０から３００ｎｍ、更により好ましくは５０から２００ｎｍ、最も好ましくは５０から１００ｎｍのサイズである。本発明において好ましいものは、１００から３００ｎｍのサイズのナノ粒子であり、より好ましいものは１００から２００ｎｍのサイズのナノ粒子である。非常に好ましいものは５０から２００ｎｍのサイズのナノ粒子である。ナノ粒子という用語は、 球状、楕円状、細長い形状又は不規則な構造の粒子を包含し、好ましくは少なくとも一つのポリマーを含むか又はそれからなる。ナノ粒子はまたナノカプセル及びポリプレックス粒子を包含する。ナノカプセルは貯蔵所(リザーバ)、例えば油貯蔵所を含むナノ粒子であり、上記貯蔵所はポリマー壁によって囲まれている（Maria J. Alonso, Microparticulate systems for the delivery of proteins and vaccines, S. Cohen及びHoward Bernstein編, Marcel Dekker, New York 1996, p206）。ある種の材料のナノ粒子、例えばポリエステルナノ粒子は、該材料を含むか、又は好ましくは本質的にそれからなるか、最も好ましくはそれからなるナノ粒子を意味する。本発明において、この処方例はナノ粒子中のＩＳＳ-ＮＡの存在を排除しない。
ナノカプセルを含むナノ粒子の製造に適したポリマーは、生物分解性ポリエステル（例えばポリ乳酸、ポリ乳酸グリコール酸供重合体（ＰＬＡ及びＰＬＧＡと称される）、ポリ-e-カプロタクトン（ＰＥＣＬと称される）、ポリ-(アルキルシアノアクリレート) （ＰＡＣＡと称される)、キトサン、アルギネート、架橋ヒト血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、ゼラチン、シゾフィラン(Schizofyllan)、デキストランのことである。ナノ粒子は生物非分解性材料、例えばポリスチレン、コロイド状金、シリカ、又は金属クラスターから調製することもできる。また、親水性成分ｍ例えばＰＥＧ、多糖類（Lemarchand C.等(Eur J Pharm Biopharm. 2004 Sep;58:327-41)、デキストラン、キトサン、ポリリジン、レシチン等をコポリマーとして又はナノ粒子の表面に被覆試薬として導入することもまたできる。錯化剤、例えばポリリジン（ＰＬＬ）、ポリ(エチレンイミン)（ＰＥＩ）、プロタミン、スペルミン又は正に荷電した構造化オリゴペプチドを、核酸と共にナノ粒子に導入し、核酸の導入のためにナノ粒子表面に結合させ、ナノ粒子上の反応性基に共有的に結合させ、又はナノ粒子中に重合プロセスの間に導入することができる。他の錯化剤には酢酸亜鉛のような金属塩が含まれる。
「ポリプレックス」：ポリプレックス粒子は、核酸、好ましくはＩＳＳ-ＮＡとの、ポリカチオンとも呼ばれるカチオン性ポリマー、例えばポリリジン（ＰＬＬ）、ポリ(エチレンイミン)（ＰＥＩ）等の直接的相互作用によって形成されるナノ粒子である。ポリプレックスはまた上記核酸、好ましくは上記ＩＳＳ-ＮＡと、ＰＥＧ-ＰＬＬ又は例えば分岐状ＰＥＩの直接的相互作用によって形成されうる。
「錯化剤」：錯化剤は、ＩＳＳ-ＮＡに非共有的に結合し、得られた錯体の有効電荷を中和又は少なくとも部分的に減少させる薬剤である。錯化剤の例は、ポリリジン（ＰＬＬ）、スペルミン、プロタミン、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、分岐状ＰＥＩ、リジンリッチな構造化オリゴペプチド、カチオン性脂質、例えばＤＯＴＡＰ等、及び酢酸亜鉛、塩化マグネシウム、カルシウム等のような塩によって提供される金属カチオンである。更なる錯体ポリマー、例えばポリ(エチレン)グリコール-ポリリジン（ＰＥＧ-ＰＬＬ）コポリマーもまた錯化剤として使用することもできる。
「生物分解性」：材料、好ましくは粒子、より好ましくは微小粒子又はナノ粒子は、それが通常の哺乳動物の生理学的条件下で分解性又は腐食性である場合、生物分解性と称される。粒子の分解は、例えば、粒子の溶解、酵素分解、好ましくは加水分解又は酸化によって、あるいは任意の他の化学的又は物理的プロセスによる粒子の脱安定化によって、生じうる。通常の哺乳動物の生理学的条件は、血清中の試料を３７℃でインキュベートすることにより試験管内で再現できる。健常な志願者からのヒト血清中で３７℃にて７２時間インキュベーションしたときに、分解すれば、その微小粒子又はナノ粒子は生物分解性であると考えられる。この定義において、「分解」とは、その質量及び／又は平均ポリマー長の少なくとも５％、好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、更により好ましくは少なくとも５０％を失うことを意味する。最も好ましくは、粒子はこれらの条件下で完全に分解する。逆に、微小粒子又はナノ粒子は、ヒト血清中で３７℃にて７２時間インキュベーションしたときに、その質量及び／又は平均ポリマー長の少なくとも５％も失わない場合には、生物非分解性と称される。非常に好ましいものは、低ｐＨ、好ましくは免疫細胞のエンドソーム中で見出されるｐＨ、より好ましくは４．５から６のｐＨ、最も好ましくは約５のｐＨで生物分解性である粒子である。
「コートタンパク質」：ここで使用される場合、「コートタンパク質」なる用語は、バクテリオファージ又はＲＮＡファージのカプシド集合体内に取り込むことができるバクテリオファージ又はＲＮＡファージのタンパク質を意味する。しかしながら、ＲＮＡファージのコートタンパク質遺伝子の特異的遺伝子産物を指すときは、「ＣＰ」なる用語を使用する。例えば、ＲＮＡファージＱβのコートタンパク質遺伝子の特異的遺伝子産物は「ＱβＣＰ」と呼ぶ一方、バクテリオファージＱｂの「コートタンパク質」は、「ＱβＣＰ」並びにＡ１タンパク質を含む。バクテリオファージＱβのカプシドは、主にＱβＣＰと、少ない含量のＡ１タンパク質で構成される。同様に、ＶＬＰＱβのコートタンパク質は、主にＱβＣＰと、少ない含量のＡ１タンパク質を含む。
「組換えＶＬＰ」：「組換えＶＬＰ」なる用語は、ここで使用される場合、組換えＤＮＡ技術の少なくとも一工程を含む方法によって得られるＶＬＰを指す。ここで用いる「組換え生産されるＶＬＰ」なる用語は、組換えＤＮＡ技術の少なくとも一工程を含む方法によって得られるＶＬＰを指す。よって、「組換えＶＬＰ」及び「組換え生産されるＶＬＰ」なる用語はここでは交換可能に用いられ、同一の意味を有する。
「ウイルス粒子」：ここで使用される「ウイルス粒子」なる用語は、ウイルスの形態学的形態を指す。あるウイルスタイプでは、それはタンパク質カプシドによって囲まれるゲノムを含み；他のものは更なる構造（外被、テイル等）を有している。
「ウイルス様粒子(ＶＬＰ)」は、ここで使用される場合、非複製性又は非感染性、好ましくは非複製性かつ非感染性のウイルス粒子を指すか、又は非複製性又は非感染性、好ましくは非複製性かつ非感染性の構造類似ウイルス粒子、好ましくはウイルスのカプシドを指す。ここで用いられる「非複製性」なる用語は、ＶＬＰに包含されるゲノムを複製することができないことを意味する。ここで用いられる「非感染性」なる用語は、宿主細胞に侵入することができないことを意味する。好ましくは、本発明に係るウイルス様粒子は、ウイルスゲノム又はゲノム機能の全て又は一部を欠いているため、非複製性及び／又は非感染性である。一実施態様では、ウイルス様粒子はウイルスゲノムが物理的又は化学的に不活化され、分解及び組立により、又はＶＬＰへの精製タンパク質の組立により除かれているウイルス粒子である。てんけいてきには、またより好ましくは、ウイルス粒子はウイルスゲノムの複製性及び感染性の構成成分の全て又は一部を欠いている。本発明に係るウイルス様粒子は、それらのゲノムと異なる核酸を含みうる。本発明に係るウイルス様粒子の典型的かつ好ましい実施態様は、対応するウイルス、バクテリオファージ、好ましくはＲＮＡバクテリオファージのウイルスカプシド等のウイルスカプシドである。「ウイルスカプシド」又は「カプシド」なる用語は、ウイルスタンパク質のサブユニットから構成される巨大分子集合体を指す。典型的には、６０、１２０、１８０、２４０、３００、３６０及び３６０以上のウイルスタンパク質サブユニットがある。典型的かつ好ましくは、これらのサブユニットの相互作用により、固有の反復組織を持つウイルスカプシド又はウイルスカプシド様構造が形成され、上記構造は典型的には球状又は管状である。例えば、ＲＮＡバクテリオファージのカプシド又はＨＢｃＡｇは、正二十面体対称の球状形態を有している。ここで使用される「カプシド様構造」なる用語は、上記の定義の意味でカプシド形態に類似するが、十分な次数と繰り返しを維持しながら典型的な対称組立体からは逸脱するウイルスタンパク質サブユニットからなる巨大分子組立体を意味する。本発明はＶＬＰ、好ましくは正二十面体対称を含む非天然ＶＬＰを包含する。ウイルス粒子とウイルス様粒子の一つの共通な特徴はそのサブユニットのより高次の繰り返し配置である。
「ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子」：ここで使用される場合、「ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子」なる用語は、ＲＮＡバクテリオファージのコートタンパク質、その変異体又は断片を含むか、又は好ましくは本質的にそれらからなるか、又はそれらからなるウイルス様粒子を指す。また、ＲＮＡバクテリオファージの構造に類似するＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子は非複製性及び／又は非感染性であり、ＲＮＡバクテリオファージの複製機構をコードする少なくとも一の遺伝子、好ましくは複数の遺伝子を欠損しており、典型的には、宿主にウイルスが接着するか侵入するためのタンパク質又はそれに関与するタンパク質をコードする一又は複数の遺伝子も欠損する。しかしながら、この定義は、上述の遺伝子又は遺伝子群がなお存在しているが不活性であり、よってまたＲＮＡバクテリオファージの非複製性及び／又は非感染性ウイルス粒子を生じるＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子をまた包含する。ＲＮＡバクテリオファージ由来の好ましいＶＬＰは正二十面体対称を示し、１８０のサブユニットからなる。本明細書において、「サブユニット」及び「モノマー」なる用語は本テキスト中で交換可能で等価的に使用される。ＲＮＡバクテリオファージのウイルス粒子を非複製性及び／又は非感染性にするために好適な方法は物理的、化学的不活化、例えば紫外線照射、ホルムアルデヒド処理により、典型的かつ好ましくは遺伝子操作による。あるいは、個々のタンパク質は全ビリオンから単離され、インビトロでＶＬＰに組み立てられうる。
「合成ＶＬＰ」：自然に細胞内的に又はインビトロで組み立てられ得る非天然発生タンパク質又はペプチドから形成される粒子は合成ＶＬＰと呼ばれる。合成ＶＬＰの例は、出典明示によりここに援用される国際公開第０４０７１４９３Ａ１号に提供される。合成ＶＬＰはまた組立に対して核酸又は金属イオンを必要とする粒子を包含する。好ましい合成粒子は、１０から１０００ｎｍ、好ましくは１０から３００ｎｍ、より好ましくは１０から１５０ｎｍ、最も好ましくは１５から１００ｎｍの決まったサイズを有する。他の好ましい合成ＶＬＰは、二以上の決まったコンホメーション、例えば１５ｎｍと２５ｎｍで存在しうる。
「ビロソーム」：ここで使用される場合、ビロソームなる用語は、再構成されたウイルス外被、好ましくは再構成されたインフルエンザウイルス外被、より好ましくは再構成されたインフルエンザＡ型ウイルス外被、最も好ましくはインフルエンザＡ型／シンガポールウイルスの再構成された外被に関する。ビロソームは薬剤担体系として当該分野で知られている。ビロソームは脂質膜を含み、該脂質膜は典型的かつ好ましくは単層脂質二重層を含む。好ましい意味では、ビロソームなる用語は、再構成されたインフルエンザウイルス外被、好ましくは再構成されたインフルエンザＡ型ウイルス外被、最も好ましくは再構成されたインフルエンザＡ型／シンガポールウイルス外被に関し、上記再構成されたインフルエンザウイルス外被、好ましくは再構成されたインフルエンザＡ型ウイルス外被、最も好ましくは再構成されたインフルエンザＡ型／シンガポールウイルス外被は脂質膜を含み、上記脂質膜はインフルエンザ糖タンパク質を含み、好ましくは上記インフルエンザ糖タンパク質は赤血球凝集素ＨＡとノイラミニダーゼＮＡから選択される。典型的かつ好ましくは、ビロソームはＨＡを介して標的細胞に付着する。非常に好ましいビロソームは脂質膜、好ましくは脂質二重層を含み、上記脂質膜又は上記脂質二重層は主にカチオン性脂質を含むか又は好ましくはそれらから主としてなる。その脂質膜中にカチオン性脂質を含むビロソームは、ＩＳＳ-ＮＡ、特にオリゴヌクレオチドの送達のために特に適している。更に好ましいものは特異的ビロソームであり、これは脂質膜に含まれる抗体又はその断片によって標的細胞に付着する。よって、更に好ましい意味では、ビロソームなる用語は、脂質膜を含む特異的ビロソームに関し、上記脂質膜は特異的抗体又はその断片、好ましくはＦａｂ断片又はＦａｂ’断片を含み、好ましくは上記抗体又はその断片の特異性が、ビロソームを特異的標的細胞に向ける。典型的かつ好ましくは、ビロソームは、レセプター依存性エンドサイトーシスによって標的細胞に取り上げられる。
「有効量」：ここで使用される場合、「有効量」なる用語は、所望の生物学的効果を実現するのに必要な又は十分な量を指す。組成物、好ましくは薬学的組成物の有効量は、この選択された結果を得る量であり、かかる量は当業者により常套的に決定されうる。例えば、免疫系不全を治療するための有効量は、免疫系の活性化を引き起こし、抗原への暴露時に抗原特異的な免疫応答の進行をもたらすのに必要な量であろう。該用語は、「十分な量」とも同義である。任意の特定の適用例に対する有効量は、治療される疾患又は状態、投与される特定の組成物、患者の大きさ、及び／又は疾患又は状態の重篤度などの要因に応じて変わる可能性がある。当業者であれば、過度の実験を必要とせずに、本発明の特定の組成物の有効量を経験的に決定することができる。
「治療」：ここで使用される場合、「治療」、「治療する」、「治療した」又は「治療している」なる用語は、予防及び／又は治療を指す。例えばアトピー性疾患に対して使用される場合、該用語は、患者が罹っている疾患の症状の深刻度を評価するために一般的に使用される標準的方法によって評価して、治療される患者の症状スコアを減少させる治療的処置を意味する。該用語はまた例えば未処置の患者と比較して誘発剤への曝露時に患者が典型的に発症する症状を予防し又は寛解させるアトピー性疾患の予防的治療をも意味しうる。
「薬学的に許容可能な担体」：本発明の組成物は、場合によっては薬学的に許容可能な担体と組み合わせられうる。ここで使用される「薬学的に許容可能な担体」なる用語は、ヒト又は他の動物への投与に適している一又は複数の適合性のある固形又は液状フィラー、希釈剤又はカプセル化物質を意味する。「担体」なる用語は、投与を容易にするために活性成分と組み合わされる天然又は合成の有機又は無機成分を示す。
「薬学的組成物」：ここで使用される場合、「薬学的組成物」なる用語は、本発明の組成物を含み、動物に投与可能である形態にある製剤を意味する。典型的かつ好ましくは、薬学的組成物は、本発明の組成物が懸濁させられ又は溶解される一般的な生理食塩水又は緩衝水溶液媒体を含む。この形態では、本発明の組成物は症状を予防し、寛解し、又はその他治療するために簡便に使用され得る。宿主への導入時には、薬学的組成物は、限定するものではないが、抗体及び／又はサイトカインの産生及び／又は細胞傷害性Ｔ細胞、抗原提示細胞、ヘルパーＴ細胞、樹状細胞及び／又は他の細胞性応答の活性化を含む免疫応答を誘発することができる。好ましい薬学的組成物はサイトカイン環境、典型的かつ好ましくはＩＦＮ-αの形成を誘導し、それがアレルギー及び／又は喘息の症状を減じる。場合によっては、薬学的組成物は本発明の組成物に対して少ない又は主要な割合で存在し得るアジュバントを更に含む。
「アジュバント」：ここで用いられる「アジュバント」なる用語は、本発明の組成物と組み合わせると、より亢進した及び／又は長い免疫応答、好ましくはサイトカイン産生をもたらす貯蔵所の生成を宿主内において可能にする物質又は免疫応答の非特異的刺激因子を意味する。様々なアジュバントが当該分野で知られており、本発明において有用である。好ましいアジュバントは、不完全フロイントアジュバント、アルミニウム含有アジュバント、修飾ムラミルジペプチド、界面活性物質、例えばリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルション、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、ＢＣＧ (ウシ型弱毒結核菌ワクチン)、コリネバクテリウムパルバム、Ｔｏｌｌ様レセプター（ＴＬＲ）のリガンドであって、限定しないがペプチドグリカン、リポ多糖類とその誘導体、ポリＩ：Ｃ、免疫賦活性オリゴヌクレオチド、イミダゾキノリン、例えばレシキモド及びイミキモド、フラゲリン、モノホスホリル脂質免疫修飾物質、ＡｄｊｕＶａｘ１００ａ、ＱＳ-２１、ＱＳ-１８、ＧＰＩ-０１００、ＣＲＬ１００５、ＭＦ-５９、ＯＭ-１７４、ＯＭ-１９７、ＯＭ-２９４、ビロソームアジュバント技術及びこれら物質の任意の混合物からなる群から選択される。本発明の目的のための非常に好ましいアジュバントはアルミニウム含有アジュバント、好ましくはアルミニウム含有鉱物性ゲル、最も好ましくはアルハイドロゲルである。非常に好ましい実施態様では、前記アジュバントはアルハイドロゲルである。アジュバントなる用語はまた上に列挙した物質の任意のものの混合物を包含する。本発明の粒子、好ましくはＶＬＰは、一般にはアジュバントとして記載されている。しかしながら、本願の文脈内で使用される「アジュバント」なる用語は本発明の粒子ではなく、特に本発明の組成物に使用されるＶＬＰではないアジュバントを意味する。それぞれの場合、アジュバントなる用語は前記粒子に加えて使用されるアジュバントを意味する。
「ポリペプチド」：ここで用いられる「ポリペプチド」なる用語は、ペプチド結合によって互いに結合したアミノ酸残基、一般には天然のアミノ酸残基からなるポリマーを意味する。ポリペプチドは必ずしも大きさが限定されないが、ポリペプチドなる用語はおよそ１０からおよそ５０のアミノ酸の大きさのペプチドと関連してしばしば使用される。
「タンパク質」：ここで使用される場合、タンパク質なる用語は、２０より多く、より好ましくは５０より多いアミノ酸残基の大きさのポリペプチドを指す。必ずしも必要ではないが、タンパク質は、一般に、定まった三次元構造を有しており、定まった三次元構造を有しておらず、むしろ多数の異なる高次構造を採ることができ、折りたたまれていない(unfolded)と称されるペプチド及びポリペプチドに対して、しばしば折りたたまれた(folded)と称される。
「配列同一性」：ポリペプチドのアミノ酸配列同一性は、既知のコンピュータープログラム、例えばＢｅｓｔｆｉｔプログラムを使用して常套的に決定することができる。特定の配列が例えば参照アミノ酸配列に対して９５％の同一性があるかどうかを決定するためにＢｅｓｔｆｉｔ又は他の配列アライメントプログラム、好ましくはＢｅｓｔｆｉｔを用いる場合、同一性の割合が参照アミノ酸配列の完全長に対して算出され、ホモロジー内のギャップが参照配列のアミノ酸残基の総数の５％以下になるように、パラメーターを設定する。ポリペプチド間の同一性の割合を決定する際の上述の方法は、この発明で開示される全てのタンパク質、ポリペプチド又はその断片に適用される。
「配列相同性」：ヌクレオチド配列の相同性は、好ましくは、ＢＬＡＳＴアルゴリズムの実行であるプログラムｂｌａｓｔｎによって、最も好ましくは該ソフトウェアのデフォルト設定を用いて、決定することができる。
ここで用いられる「タンパク質の断片」、特に組換えタンパク質又は組換えコートタンパク質の断片は、野生型組換えタンパク質又はコートタンパク質それぞれの少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは少なくとも９５％の長さであり、好ましくはＶＬＰ形成能を保持するポリペプチドとして定義される。好ましくは、該断片は、少なくとも一つの内部欠損、少なくとも一つの切断又は少なくとも一つのその組合せによって得られる。「組換えタンパク質の断片」又は「コートタンパク質の断片」は、上で定義された「組換えタンパク質の断片」又は「コートタンパク質の断片」それぞれの少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有し、好ましくはウイルス様粒子に組立て可能なポリペプチドを更に包含する。
「変異体コートタンパク質」なる用語は、野生型組換えタンパク質又はコートタンパク質それぞれから誘導されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを指し、ここでアミノ酸配列は、野生型配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、又は９９％同一であり、好ましくはＶＬＰへの組立て能を保持している。
「動物」：ここで使用される「動物」なる用語は、任意の動物、好ましくは非脊椎動物、好ましくはクモ類及び昆虫、及び脊椎動物を含む、免疫系を有する任意の動物を指す。典型的には、また好ましくは、動物は脊椎動物、より好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトに関する。よって、動物には例えばヒト、ヒツジ、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ラット、マウス、トリ、爬虫類、魚類、昆虫及びクモ類が含まれる。
「Ｏｎｅ」、「ａ／ａｎ」：「ｏｎｅ」、「ａ」、又は「ａｎ」なる用語が本明細書中で使用される場合、それらは、特に示さない限りは、「少なくとも一つ」又は「一又は複数」を意味する。
「約」：本願の意味では、約なる表現は＋／−１０％の意味を有している。例えば約１００は９０から１１０を意味する。
これまでに開示したように、非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドがパッケージされたＶＬＰは、Ｂ及びＴ細胞応答を亢進し得る。アレルゲンと共にＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを適用することによりアレルギー反応が寛解されることがまたこれまでに観察された。本発明の粒子、好ましくはＶＬＰとのアレルゲンの共有結合、カップリング又は混合が過敏症、好ましくはアレルギーの治療において効果を達成するために必要とはされないことが驚いたことに今見出された。更に驚いたことには、本発明の組成物を使用する過敏症、好ましくはアレルギーの治療において、特定の抗原又はアレルゲンの投与又は同時投与が必要とはされないことが見出された。更に、上記効果は非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドがパッケージされたＶＬＰには限定されず、免疫賦活性核酸（ＩＳＳ-ＮＡ）がパッケージされた本発明の粒子に一般化することができる。
本出願人は、ＩＳＳ-ＮＡがパッケージされた粒子での治療によって過敏症を治癒できることを発見した。本出願人は適切なサイズの粒子が皮内又は皮下注射後に流入領域リンパ節まで直ぐに拡散し、そこでそれらが主として樹状細胞（ＤＣ）及びマクロファージによって取り上げられることをまた示した。形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）、単球由来及び好白球樹状細胞又はマクロファージを含む様々なＤＣが、Ｔｏｌｌ-９レセプターを経由して非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドがパッケージされた粒子、好ましくはＶＬＰの取り込み時に活性化される。本出願人は、５０から２００ｎｍのサイズのポリスチレンナノ粒子がまた流入領域リンパ節まで直ぐに拡散する一方、より大きな粒子（＞５００ｎｍ）が皮下注射後の同じ時間スパンの間に注射部位に残ることをまた発見した。ＰＬＧＡナノ粒子は樹状細胞（ＤＣ）によって貪食されることが示された（Diwan等 J Drug Target. 2003;11:495-507）。更に、非メチル化ＣｐＧ含有オリゴデオキシヌクレオチドと抗原を同時に取り込んだＰＬＧＡナノ粒子をパルス添加したマウスＤＣが、抗原のみを含めたＰＬＧＡナノ粒子をパルス添加したＤＣと比較して、Ｔ細胞刺激アッセイにおいて抗原特異的Ｔ細胞活性化を亢進することが示された。従って、非メチル化ＣｐＧ含有オリゴデオキシヌクレオチドのようなＩＳＳ-ＮＡを導入したナノ粒子は取り込み時に樹状細胞を刺激することができ、これらの樹状細胞がその後Ｔ細胞を活性化する。ヒト樹状細胞において、Ｔｏｌｌ様レセプター９の発現は小サブセット、つまりいわゆる形質細胞様樹状細胞に限られている。我々は、約３０ｎｍのサイズを有するＱβウイルス様粒子がヒト形質細胞様樹状細胞によって取り上げられ、よってＩＳＳ-ＮＡをこれら細胞に送達できることをここに示す。興味深いことには、マスト細胞もＴＬＲ-９を発現する。最近の報告は、アレルゲン誘発時にＴｈ２細胞活性化を防止する際のＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの役割を示している(Hessel等 (2005) J. exp. Med. 11: 1563-73.）。従って、ＩＳＳ-ＮＡがパッケージされたナノ粒子又はＶＬＰのような粒子の、形質細胞様樹状細胞又は抗原提示細胞、例えば伝統的な樹状細胞による取り込みはＴｈ２細胞の活性化の阻害を生じ、よってアレルゲン誘発反応を阻害しうる。同じ報告はアレルギー応答に対する非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの抑制作用におけるマスト細胞に関連している。マスト細胞は食作用に活性であり、本発明の粒子、好ましくはナノ粒子又はＶＬＰであって、該ナノ粒子又はＶＬＰ、好ましくは上記ＶＬＰにＩＳＳ-ＮＡ、好ましくは非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドがパッケージされたものがマスト細胞の阻害を介してその効果を部分的に媒介し、非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドがパッケージされたＶＬＰ又はナノ粒子の他の代替的又は相補的に可能な作用機序をもたらすことができる。しかしながら、本発明の組成物の作用態様はこの機序に限定されるものではない。
上述した知見に基づいて、本発明は、動物における過敏症、好ましくはアレルギーの治療又は予防のための組成物、薬学的組成物及び方法を提供する。特に、本発明は動物における過敏症を治療するための方法に使用される組成物を提供し、該組成物は粒子とＩＳＳ-ＮＡを含有し、該粒子に上記ＩＳＳ-ＮＡがパッケージされている。本発明は、過敏症、好ましくはアレルギー、より好ましくはアトピー性湿疹、アトピー性喘息及びＩ型アレルギー、例えば花粉アレルギー（花粉症）を治療し、及び／又は予防するために特に有用である方法及び組成物を提供する。
この文脈において、粒子なる用語は、その化学的及び物理的特徴に対して、ＩＳＳ-ＮＡがパッケージされうる任意の構造を意味し、好ましくは該粒子は上記動物の体内において上記ＩＳＳ-ＮＡを分解から保護することができ、及び／又は該粒子は上記ＩＳＳ-ＮＡを免疫細胞に特異的に送達させ放出させることができる。よって、有効であるためには、本発明の粒子は、好ましくは（ｉ）ＩＳＳ-ＮＡを収容し、（ｉｉ）上記ＩＳＳ-ＮＡを体内の免疫細胞に送達させ得る。従って、本発明の粒子は非常に広い意味で理解されなければならない。
好ましい実施態様では、上記分子は、合成分子、ウイルス粒子及びＶＬＰからなる群から選択される。
本発明の分子は生物分解性又は生物非分解性でありうる。生物分解性粒子は上記動物の体内における上記粒子の蓄積を予防し、このような蓄積と関係しているかも知れない毒性効果を回避するために一般に好ましい。従って、好ましい実施態様では、上記粒子、好ましくは上記合成粒子、最も好ましくは上記ナノ粒子は、生物分解性物質を含み、又は好ましくはそれから本質的になり、最も好ましくはそれからなる。更に好ましい実施態様では、上記粒子、好ましくは上記合成粒子、最も好ましくは上記ナノ粒子は、生物分解性である。非常に好ましい実施態様では、上記ＩＳＳ-ＮＡがパッケージされた上記合成粒子は生物分解性である。更なる実施態様では、上記粒子、好ましくは上記合成粒子は、好ましくは標的細胞内、最も好ましくは標的細胞のエンドソーム中に、上記ＩＳＳ-ＮＡを放出する。更に好ましい実施態様では、上記粒子、好ましくは上記合成粒子は、プロテアーゼを含み、低ｐＨ、好ましくは約ｐＨ５を示す標的細胞のエンドソーム区画中で分解される。
本発明の一実施態様では、上記粒子は合成粒子、好ましくはリポソーム、微小粒子及びナノ粒子からなる群から選択される合成粒子であり、より好ましくは上記合成粒子はリポソーム又はナノ粒子であり、更により好ましくはナノ粒子である。本発明の更なる実施態様では、上記粒子は合成粒子、好ましくはリポソーム、微小粒子、ナノ粒子及びビロソームからなる群から選択される合成粒子である。本発明の合成粒子は、生物非分解性物質、生物分解性物質又はそれらの混合物を含むか、好ましくはそれらから本質的になるか、最も好ましくはそれらからなり、上記生物分解性物質は有機又は無機又は双方の組合せでありうる。
好ましい実施態様では、上記合成粒子は微小粒子又はナノ粒子、好ましくはナノ粒子であり、該合成粒子は、（ａ）ポリエステル類、好ましくはＰＬＡ、ポリ(グリコール酸)及びＰＥＣＬから選択されるもの、（ｂ）ポリエステル類のコポリマー、好ましくはＰＬＧＡ、（ｃ）ポリエステルとＰＥＧのブロックコポリマー、（ｄ）ポリオルトエステル、（ｅ）ポリ(無水物)、（ｆ）ポリ(セバシン酸)、（ｇ）アミノ酸を導入したセバシン酸モノマーに基づくポリ無水物、（ｈ）ポリ無水物エステル、（ｉ）ポリホスファゼン、好ましくは加水分解に敏感なエステル基を含むポリホスファゼン(Andrianov AK及びPayne LG, Microparticulate systems for the delivery of proteins and vaccines, S. Cohen及びHoward Bernstein編, Marcel Dekker, New York 1996, p127-147)、（ｊ）ポリアミド、（ｋ）好ましくはタンパク質から選択される巨大分子及び生物由来の変性巨大分子（例えばゼラチン、ヒト血清アルブミン）及び（ｌ）多糖類（例えばデキストラン、キトサン、アルギネート、シゾフィラン(Schyzofyllan)）、（ｍ）好ましくはポリ(メチルメタクリレート)及びコポリマー、好ましくはＰＥＧ-メタクリレート又はＰＥＧ-ジメタクリレートから選択されるメタクリレート系物質、（ｎ）好ましくはＰＥＧベースコモノマー及びイオン性コモノマーから選択されるメチルメタクリレート系物質、（ｏ）Bousquet Y等 Biomaterials. 1998 Jan-Feb；19:271-8及びBreton P等 Pharm Res. 1999;16:141-7に記載されているようなポリ(メチリデンマロネート２.１.２)、（ｐ）コロイド状金、（ｑ）ポリスチレン、（ｒ）ポリエチレン、（ｓ）ポリプロピレン、（ｔ）ラテックス、（ｕ）強磁性又は常磁性材料、（ｖ）デキストラン、（ｗ）ハイドロキシアパタイト、及び（ｘ）上に挙げた材料の任意のものの混合物からなる群から選択される材料を含むか、好ましくはそれらから本質的になるか、最も好ましくはそれらからなる。
好ましい実施態様では、上記合成粒子は、微小粒子又はナノ粒子、好ましくはナノ粒子であり、ここで、上記合成粒子は、（ａ）コロイド状金、（ｂ）ポリスチレン、（ｃ）ポリエチレン、（ｄ）ポリプロピレン、（ｅ）ラテックス、（ｆ）強磁性又は常磁性材料、（ｇ）デキストラン及び（ｈ）ハイドロキシアパタイトからなる群から選択される生物非分解性材料を含むか、好ましくはそれらから本質的になるか、最も好ましくはそれらからなる。
より好ましい実施態様では、上記合成粒子、好ましくは上記ナノ粒子は、（ａ）ポリエステル類、好ましくはＰＬＡ、ポリ(グリコール酸)及びＰＥＣＬから選択されるもの、（ｂ）ポリエステル類のコポリマー、好ましくはＰＬＧＡ、（ｃ）ポリエステルとＰＥＧのブロックコポリマー、（ｄ）ポリオルトエステル、（ｅ）ポリ(無水物)、（ｆ）ポリ(セバシン酸)、（ｇ）アミノ酸を導入したセバシン酸モノマーに基づくポリ無水物、（ｈ）ポリ無水物エステル、（ｉ）ポリホスファゼン、好ましくは加水分解に敏感なエステル基を含むポリホスファゼン(Andrianov A.K.及びPayne LG, Microparticulate systems for the delivery of proteins and vaccines, S. Cohen及びHoward Bernstein編, Marcel Dekker, New York 1996, p127-147)、（ｊ）ポリアミド、（ｋ）好ましくはタンパク質から選択される巨大分子及び生物由来の変性巨大分子（例えばゼラチン、ヒト血清アルブミン）及び多糖類（例えばデキストラン、キトサン、アルギン酸塩、シゾフィラン(Schyzofyllan)）からなる群から選択される生物分解性材料を含むか、好ましくはそれらから本質的になるか、最も好ましくはそれらからなる。
更により好ましい実施態様では、上記生物分解性材料は、（ａ）ポリエステル類、好ましくはＰＬＡ、ポリ(グリコール酸)及びＰＥＣＬから選択されるもの、（ｂ）ポリエステル類のコポリマー、好ましくはＰＬＧＡ、（ｃ）ポリエステルとＰＥＧのブロックコポリマー、（ｄ）ポリオルトエステル、（ｅ）ポリ(無水物)、（ｆ）ポリ(セバシン酸)、（ｇ）アミノ酸を導入したセバシン酸モノマーに基づくポリ無水物、（ｈ）ポリ無水物エステル、（ｉ）ポリホスファゼン、好ましくは加水分解に敏感なエステル基を含むポリホスファゼン(Andrianov AK及びPayne LG, Microparticulate systems for the delivery of proteins and vaccines, S. Cohen及びHoward Bernstein編, Marcel Dekker, New York 1996, p127-147)、及び（ｊ）ポリアミドから選択される。
更により好ましい実施態様では、上記生物分解性材料は、（ａ）ポリエステル類、好ましくはＰＬＡ、ポリ(グリコール酸)及びＰＥＣＬから選択されるもの、及び（ｂ）ポリエステル類のコポリマー、好ましくはＰＬＧＡから選択される。
更に好ましい実施態様では、上記粒子、好ましくは上記合成粒子、最も好ましくは上記ナノ粒子は、少なくとも一、好ましくは正確に三、より好ましくは正確に二、最も好ましくは正確に一の生物分解性ポリマーを含むか、好ましくはそれらから本質的になり、好ましくは、上記ポリマーは生物分解性の非毒性ポリマーに分解し、更により好ましくは、上記生物分解性ポリマーはポリエステルである（Maria J. Alonso等, Microparticulate systems for the delivery of proteins and vaccines, S. Cohen及びHoward Bernstein編, Marcel Dekker, New York 1996, p 203-242）。
ナノ粒子は、化学的又は物理的方法、例えば、エマルジョンのナノ滴としてのモノマーの重合又は縮合、ポリマーの沈殿、巨大分子のコアセルベーション、例えば乳化方法によって、イオン相互作用によって、一緒にされた巨大分子の組立て、該組立てられた巨大分子の凝集、熱変性又は化学的架橋によって形成されうる。ナノ粒子は、ポリマーの疎水性コア層と他のポリマー、例えばポリ(エチレン)グリコール(ＰＥＧ)の親水性外部シェル層を有するコア-シェル粒子のように、異なった性質の２以上の層を含む複合構造をまた有しうる。コア-シェルナノ粒子の他の例には、荷電ポリマー、例えばポリリジンがナノ粒子の表面に吸着されたナノ粒子が含まれる。あるいは、カチオン性部分を担持するコモノマーとＰＥＧ部分を担持するコモノマーが重合プロセスに含まれるより複合のナノ粒子が製造されてもよい。よって、好ましい実施態様では、上記ナノ粒子は外部シェル層を含み、ここで好ましくは上記外部シェル層はＰＥＧを含むか、あるいは本質的にそれからなる。非常に好ましい実施態様では、上記ナノ粒子はコア及びシェル層を含み、該コアはＰＥＧを含むか、あるいは本質的にそれからなる。更に好ましい実施態様では、上記ナノ粒子はコア及びシェル層を含み、該コアはポリアルキルシアノアクリレートを含むか、あるいは本質的にそれからなり、好ましくは上記シェル層はＰＥＧを含むか、あるいは本質的にそれからなる。
更に好ましい実施態様では、上記ナノ粒子は、コア-シェルナノ粒子であり、好ましくは、該コア-シェルナノ粒子のシェル層には上記ＩＳＳ-ＮＡがパッケージされる。好ましくは、上記コア-シェルナノ粒子の上記シェル層は正に荷電している。更に好ましくは、上記コア-シェルナノ粒子の上記シェル層はポリマーを含むか、あるいは本質的にそれからなり、好ましくは該ポリマーは、ポリリジン、臭化セチルトリメチルアンモニウム(ＣＴＡＢ)及びポリエチレンイミンから選択される。あるいは、上記ＩＳＳ-ＮＡは、例えばＣａＰ-ＰＥＧ-ＰＡＡナノ粒子の、コア層に優先して随伴していてもよい。
更に好ましい実施態様では、上記ナノ粒子はポリプレックス（ｐｏｌｙｐｌｅｘ）である。ポリプレックスナノ粒子は、ＰＥＩ、ＰＬＬ又はＰＥＧ-ＰＬＬのような錯化剤とＩＳＳ-ＮＡの直接の会合が、いわゆるポリプレックスを形成することによって、形成される（Boeckle S.等 J Gene Med 2004; 6:1102-1111；Wagner E.等 Adv Genet. 2005;53:333-54；Walker G.等 Mol Ther. 2005;11:418-25）。
ナノ粒子のサイズは、Alonso M.J.（Microparticulate systems for the delivery of proteins and vaccines, S. Cohen及びHoward Bernstein編, Marcel Dekker, New York 1996, p203-242）において概説されているように、走査型及び透過型電子顕微鏡法、又は光子相関分光法又は動的光散乱法のような既知の方法を用いて決定することができる。表面電荷、特にゼータ電位のような表面特性は、電気泳動移動度測定のような方法を使用して電場におけるナノ粒子の速度を決定することで測定することができる。レーザードップラー測風法又は電気泳動光散乱法が使用されてもよい。あるいは、交流電場に対する音波応答（電子音波振幅効果)も用いることもできる。測定は市販の装置で実施できる。ゼータ電位はナノ粒子の凝集挙動、又はその表面上の荷電成分を吸着するその能力を予想するために有益であり、よってナノ粒子の性質を最適にするのに役立つ。
好ましい実施態様では、上記ナノ粒子は、ポリエステル類、好ましくは脂肪族ポリエステル類を含むか、あるいは本質的にそれからなる。脂肪族ポリエステル類は、生理学的に生じる代謝物への無作為の加水分解によって分解する。これらの材料は再吸収性縫合糸に使用されており、リュープロリド酢酸塩（ゴナドトロピン放出ホルモン類似体）の非経口注射用のポリエステルミクロスフィア製剤は市販品である。幾つかのポリマーを、本発明のナノ粒子の調製に用いることができ、開示されている：ポリ(乳酸)(ＰＬＡ)、ポリ(グリコール酸)(ＰＧＡ)、又はＰＬＡＡ及びＰＧＡのコポリマー、ＰＬＧＡと呼ばれる乳酸グリコール酸共重合体が特に適している。ラセミの非晶質形態が好ましい。これらのポリマーは市販されており、それらの合成は当該分野でよく知られている。それらの合成法は、例えばＡｖｇｏｕｓｔａｋｉｓＫ(Curr Drug Deliv. 2004;1:321-33)によって記載されている。ポリエステルミクロスフィア、特にＰＬＧＡの性質、並びにそれらを生産する方法は、Kissel T及びKoneberg R（Microparticulate systems for the delivery of proteins and vaccines, S. Cohen and Howard Bernstein編, Marcel Dekker, New York 1996, p. 51-87)に概説され、記載されている。これらの方法には、スプレードライ法、水中油中水エマルジョン溶媒蒸発法及び相分離法が含まれる。好ましい実施態様では、上記ナノ粒子は、PLGAを含むか、あるいは本質的にそれからなり、好ましくは、PLGAを構成するモノマーのモル比は５０モル％ＬＡ及び５０モル％ＧＡである。モノマーの何れかの割合を増加させると、ポリマーの分解が遅くなる。例えば、８５:１５のＬＡ：ＧＡの比率を有するポリマーは、５０：５０の比率のものよりおよそ２．５倍遅い分解速度を有する。よって、ＰＬＧＡポリマーの性質はモノマーの割合を変えることによって操作することができる。
ナノ粒子、特にポリエステル材料から作製されるナノ粒子の調製は、例えばAlonso MJ（ Microparticulate systems for the delivery of proteins and vaccines, S. Cohen及びHoward Bernstein編, Marcel Dekker, New York 1996, p203-242）又はAvgoustakis K（Curr Drug Deliv. 2004;1:321-33）によって概説されている。ポリエステルナノ粒子を生産する方法は、またそこに記載されており、ポリマー沈殿法と集合的に呼ばれる方法を含む。これらの方法では、有機溶媒に溶解されたポリマーが安定化剤を含む水中で乳化される。有機溶媒は有機相から水性相中に拡散する。有機相からの溶媒の枯渇の結果はポリマーの沈殿であり、ナノ粒子の形成に至る。
これらの一つは溶媒抽出-蒸発法である。この方法では、塩化メチレン、酢酸エチル又はクロロホルムのような水溶解性が乏しい有機溶媒が使用される。しかしながら、溶媒は非常に過剰の水のために有機相から水相中に抽出され、これは溶媒の続く蒸発によって更に容易にされる方法である。溶媒抽出-蒸発法は、本質的には、含められる分子の疎水性に応じて、分子をナノ粒子に導入するために二つの一般的な方法で実施され得る。疎水性分子、又は水不溶性の複合体はポリマーと同じ有機溶媒に溶解させ又は懸濁させ、ついで、安定剤、典型的には界面活性剤、例えばポリ(ビニルアルコール)(ＰＶＡ)、、ポロキサマー又は例えばデキストランを含む外部水相において乳化させることができ、乳化過程の間に形成されるナノ液滴が溶媒抽出及び蒸発の際にナノ粒子を形成する。好ましくは、エマルジョンは、高速又は高圧ホモジナイザー、微細流動化(ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚａｔｉｏｎ)又は超音波処理を使用して調製される。集中的な撹拌又はボルテックス化もまた適している。この方法はまた水中油溶媒抽出及び蒸発法と呼ばれる。
より親水性又は両親媒性化合物が、ポリマーを含む多量の有機溶媒中に水溶液として導入される。好ましくは、水溶液は、例えば高速又は高圧ホモジナイザー、微細流動化、超音波処理、ボルテックス又は集中撹拌を使用して、有機溶媒と乳化される。得られた油中水エマルジョン又は懸濁液は多量の水に更に乳化され、水中油中水エマルジョンを生じ、溶媒抽出及び蒸発の際にそこからナノ粒子が形成される。この方法はまた水中油中水溶媒蒸発法と呼ばれる。
溶媒抽出及び蒸発法は、例えば温度を増大させ、真空を形成し、又はイソプロパノール（例えば２％）のようなアルコールを外部水相に加えてその外部水相中における有機溶媒の溶解度を増加させることによって、更に加速させることができる。例えば、ロータリーエバポレーター（rotavapor）を用いて溶媒抽出及び蒸発を加速させることができる。
製造プロセスにおいて使用されるある種の界面活性剤のような、動物又はヒトへの非経口注入と適合性がない幾つかの成分は、例えば水での洗浄工程によって、除去されなければならない場合がある。使用される精製方法は例えばタンジェンシャルフロー濾過、又は遠心分離である。ついで、ナノ粒子は典型的には凍結乾燥によって分離され、その場合、トレハロース又はグルコース等の糖のような凍結保護物質がナノ粒子の凝集を予防するために加えられる。
他のポリマー沈殿法は、溶媒置換又はナノ沈殿法である。それは、外部水相に完全に可溶性である有機溶媒の使用を伴う。ポリマーは、アセトン、エタノール又はメタノールに溶解させ、例えばポロキサマー１８８のような界面活性剤の水溶液中に撹拌しながら導入する際に沈殿する。
更なる高分子沈殿法は、塩析技術である。この方法では、ポリマーは例えばアセトンに溶解させられ、ＰＶＡの飽和水溶液を撹拌下で加えて、水中油エマルジョンを形成する。水を更に加え、アセトンが外部水相に拡散すると、ポリマーが沈殿してナノ粒子を形成する。
本発明の更なる実施態様では、上記ナノ粒子は、ＰＥＧ-ポリエステルナノ粒子、例えばＰＥＧ-ＰＬＡ又はＰＥＧ-ＰＬＧＡナノ粒子である。ＰＬＡ及びＰＬＧＡ粒子はオプソニンのような血漿タンパク質を吸収し、補体系を活性化する。血漿タンパク質結合を最小にするために、コア-シェル粒子が製造されており、そこでは、親水性ＰＥＧの相のシェルが粒子のポリマーコアを囲み、血漿タンパク質又はオプソニンの疎水性ポリマー表面への付着を防止し又は低減させる。ポリ(エチレングリコール)でのナノ粒子、特にＰＬＧＡナノ粒子の被覆は、補体活性化を強く減少させ、血液循環時間を増大させることが示されている（Gref R等 Microparticulate systems for the delivery of proteins and vaccines, S. Cohen及びHoward Bernstein編, Marcel Dekker, New York 1996, p279-305；Hawley AE等 Pharm Res. 1997;14:657-61）。皮下注射時のリンパ節の富化は裸のPLGA粒子と比較してまた富化された（Hawley AE等 Pharm Res. 1997;14:657-61）。ポリスチレン又はＰＬＧＡナノ粒子をＰＬＡ-ＰＥＧコポリマーで被覆すると、より短いPEG鎖の最大のリンパ節富化が得られた（750 Da PEG、PLA：PEG １．５：０．７５；Hawley AE等 Pharm Res. 1997;14:657-61）。より長いＰＥＧ鎖は注射部位からのドレナージを増加させ、リンパ節レベルを減少させ、リンパ節マクロファージの効率の低い捕捉が示唆され、よって、長いＰＥＧ鎖の立体障害の増加の結果、全身性分布が増加する。ＰＬＡ-ＰＥＧ（ＰＬＡ：ＰＥＧ１．５：０．７５）が沈殿プロセス中にＰＬＧＡナノ粒子に導入されると、中間の割合のＰＬＡ-ＰＥＧ（３５％）を有するナノ粒子で最も高いリンパ節富化が得られ、４５％のＰＬＡ-ＰＥＧの粒子が、高血液及び肝臓レベルに反映されるように、全身性分布を増加させた。よって、ＰＥＧ鎖長とナノ粒子に導入されるＰＥＧコポリマーの割合の変動によりナノ粒子の薬物動態学的性質の操作が可能になる。
ＰＥＧ-ＰＬＡ及びＰＥＧ-ＰＬＧＡナノ粒子の調製方法は、ＰＬＡ及びＰＬＧＡナノ粒子の調製のために使用する方法と同様であり、Avgoustakis K (Curr Drug Deliv. 2004;1:321-33)及びGref R.等.（Microparticulate systems for the delivery of proteins and vaccines, S. Cohen及びHoward Bernstein編, Marcel Dekker, New York 1996, p279-305)に概説されている。これらの方法は、エマルジョン-溶媒蒸発法、溶媒置換法及び塩析法を含む。ナノカプセルの調製のための塩析法の使用もまたそこに記載されている。ブロックコポリマーを合成する方法は当該分野で知られている。オクタン酸第一スズにより触媒されるモノメトキシ-ＰＥＧへのモノマー（ラクチド、グリコリド、カプロラクトン又はそれらの混合物）の環開重合によりジブロックコポリマー（例えばＰＥＧ-ＰＬＡ）を調製するための一方法、並びにナノ粒子の調製のための多ブロックコポリマーの調製と使用は、Avgoustakis K（Curr Drug Deliv. 2004;1:321-33）とそこの文献に記載され概説されている。
ＰＬＡ／ＰＥＧ及びＰＬＧＡ／ＰＥＧの変動は、製造されるナノ粒子の構造を操作することを可能にする。 例えば、低比率はより動的なタイプの粒子を生成するが、より高い比率はより固体状の構造を生成する。より短いＰＬＡ又はＰＬＧＡ鎖長（ｘ≦３０）はミセル形成過程を経てナノ粒子形成をもたらしうる一方、より長い鎖長では、集塊-沈殿過程が起こる、Avgoustakis K（Curr Drug Deliv. 2004;1:321-33）。
本発明の更なる実施態様では、ナノ粒子は、ポリアルキルシアノアクリレートナノ粒子である。ポリアルキルシアノアクリレートナノ粒子は、Fattal E.等（J. Contr. Release 1998; 53:137-143）によって記載されているように、乳化重合法を用いて調製することができる。ついで、ナノ粒子は、カチオン性疎水性試薬、例えば臭化セチルトリメチルアンモニウム(ＣＴＡＢ)で被覆され、ＩＳＳ-ＮＡがナノ粒子に吸着される。代替法では、Zobel等（Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 1997;7:483-493)に記載されているように、ナノ粒子が水性分散液重合法で製造される。使用される界面活性剤はＤＥＡＥ-デキストランであり、これは静電的相互作用を介してナノ粒子の表面上にＩＳＳ-ＮＡを続いて吸着させる。約１７０−１０００ｎｍの範囲のサイズの粒子はZobel等によって得られている。
更なる実施態様では、ナノ粒子は、Li Y.等（Int J Pharm. 2003;259:93-101）に記載されているように、ＰＥＧコートポリシアノアクリレートナノ粒子であり、そこでは、ナノ粒子へのトランスフェリンの更なる共有結合が省略される。ナノ粒子は、ポリ(アミノポリ(エチレングリコール)-シアノアクリレート・ヘキサデシルシアノアクリレート共重合体)（ポリ（Ｈ２ＮＰＥＧＣＡ・ＨＤＣＡ共重合体）をポリマーとして使用して、水中油中水エマルジョン溶媒蒸発法によって調製される。簡単に述べると、バッファー(例えばＮａＨＣＯ３、ｐＨ８)に希釈したＩＳＳ-ＮＡを、超音波処理によってポリ（Ｈ２ＮＰＥＧＣＡ・ＨＤＣＡ共重合体を含むジクロロメタン／酢酸エチル(１:１)中で乳化させる。得られたエマルジョンを、１％ｗ／ｖのＰＶＡ水溶液中に注ぎ、更に乳化する。ＰＶＡの割合は変動し得、特により高い割合（０．１ＭのＮａＨＣＯ３中３％、ｐＨ８)はｄｓＤＮＡに対する損傷を制限することが示されている（Li Y.等 (Int J Pharm. 2003;259:93-101）。ついで、得られた二重エマルジョンを、磁気撹拌下で０．３％のｗ／ｖＰＶＡ水溶液に希釈する。ついで、有機溶媒を３７℃にてロータリーエバポレーターで減圧下で蒸発によって除去し、ナノ粒子を３９０００ｇでの遠心分離によって収集する。Li等によって得られた粒子サイズは約１３０から１５０ｎｍの範囲であった。一実施態様では、ＩＳＳ-ＮＡは非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドである。
エマルジョン-溶媒蒸発法又はスプレードライ法によって製造されるＩＳＳ-ＮＡ、特に非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドのパッケージ化は、ポリエステルナノ粒子の対して次に例示される。しかしながら、同様の手順がＰＡＣＡ及びＰＥＧ-ＰＡＣＡナノ粒子のために応用されうることは当業者には明らかである。ＰＬＡ、ＰＬＧＡ、ＰＥＣＬ、ＰＥＧ-ＰＬＡ、ＰＥＧ-ＰＬＧＡ又はＰＥＧ-ＰＥＣＬナノ粒子のようなポリエステルナノ粒子内へのＩＳＳ-ＮＡ、例えば非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドのパッケージ化は幾つかの方法で実施することができる。一方法では、Aukunuru J.V.等（J. Pharm. Pharmacol. 2003; 55:1199-206）によって報告されているように、ＩＳＳ-ＮＡが水中油中水エマルジョン溶媒蒸発法の初期の水相に加えられる。別の方法では、ＩＳＳ-ＮＡは超音波処理によって有機溶媒、例えばジクロロメタンに懸濁させられ、ついで噴霧乾燥されて、ＩＳＳ-ＮＡをパッケージ化したナノ粒子を生じる。ある実施態様では、ＩＳＳ-ＮＡをパッケージするナノ粒子の容量、特にＯＤＮは、錯化剤、例えばリジンリッチなオリゴペプチド（Emile C.等 Drug Deliv 1996; 3:187-195）、ＰＬＬ、ＰＥＩ、スペルミン又は酢酸亜鉛のような塩（Putney SD等 Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 1999;9:451-8）を添加することによって増加させられる。ナノ粒子に導入することができる水溶液中において錯化剤及びＩＳＳ-ＮＡを混合することにより不溶性の複合体が得られる。理解されるように、ＩＳＳ-ＮＡに対する錯化剤の最適比、及び錯化剤がＰＥＩ又はＰＬＬである場合のＩＳＳ-ＮＡに対するＰＬＬの最適長、及び錯化剤がＰＥＩである場合の分岐又は直鎖ＰＥＩの何れが選択されるかは、経験的に決定されなければならない。例えば、Emile C.等（Drug Deliv 1996; 3:187-195）に報告されているように、アセトン中のポリマー、錯化剤、例えばリジンリッチなペプチド、及びＯＤＮのようなＩＳＳ-ＮＡの溶液が水溶液に滴下して注がれる。ＩＳＳ-ＮＡと錯化剤の錯体がポリマーと共に沈殿して、ＩＳＳ-ＮＡがパッケージされたナノ粒子を形成する。一実施態様では、ＩＳＳ-ＮＡと錯化剤の錯体が有機溶媒、例えば塩化メチレンに懸濁され、スプレードライ法を使用してＰＬＧＡナノ粒子に導入されパッケージされる（Putney SD等 Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 1999;9:451-8；Pamujula S等 J Pharm Phamracol 2004; 56:1119-25）。
更なる実施態様では、上記ナノ粒子はブロックコポリマー被覆リン酸カルシウムナノ粒子である(ＣａＰ-ＰＥＧ-ＰＡＡ；Kakizawa等(2004) J. Contr. Release 97:345-56）。これらはＩＳＳ-ＮＡ、好ましくは非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドをパッケージするのに適したコア-シェル粒子である。それらは、ＰＥＧの親水性係留層によって囲まれたＣａＰのナノ結晶のコアを含んでなる。ＩＳＳ-ＮＡ及びＰＥＧ-ブロック-ポリ(アスパラギン酸)(ＰＥＧ-ＰＡＡ)の存在下でカルシウム及びリン酸塩含有溶液を混合すると、ＩＳＳ-ＮＡを組み込んでいるナノ粒子が自然に形成される。一実施態様では、ＩＳＳ-ＮＡは、非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドである。ＰＥＧ-ＰＡＡのＰＡＡセグメントはＣａＰに対して高い結合親和性を有しており、非イオン性及び疎水性ＰＥＧは立体的安定化機能を有している。Kakizawa等 (2004) J. Contr. Release 97:345-56の図１に見られるように、粒子サイズは、ＰＥＧ-ＰＡＡ及びリン酸塩濃度を変化させることによって調節できる。得られる典型的なサイズは約１００から約３００ｎｍの間である。臨界的に最小量のＰＥＧ-ＰＡＡがナノ粒子の凝集を防止するために必要とされる一方、より高いレベルになれば、ＣａＰ結合についてＩＳＳ-ＮＡと競合し始め、Kakizawa等によって教示されているようにして経験的に決定されなければならない。例えば１．５ｍＭから３ｍＭへのリン酸塩濃度の増加は、より高いＯＤＮ結合能を生じる（Kakizawa等(2004) J. Contr. Release 97:345-56）。
ＰＥＧ-ＰＡＡとナノ粒子の調製は詳細に記載されている（Kakizawa等 (2004) J. Contr. Release 97:345-56）。本質的には、ＣａＣｌ２、トリス、低ＥＤＴＡ量及びＩＳＳ-ＮＡを含む溶液が、Ｈｅｐｅｓ、リン酸水素二ナトリウム及びＰＥＧ-ＰＡＡを含む等容量の溶液に速やかに添加される。得られた混合物をボルテックスミキサーによって激しく撹拌し、３７℃で２４時間インキュベートする。Kakizawa等は、細胞質にｓｉＲＮＡを送達させるためにＣａ-Ｐ-ＰＥＧ-ＰＡＡナノ粒子を使用することを考察しており、そこでは、それらは、低Ｃａ２＋濃度と高いリン酸塩濃度のために細胞質においてＣａＰコアが速やかに溶解することが予想される。ナノ粒子にパッケージされる本発明のＩＳＳ-ＮＡは細胞質への送達を必要としていない。例えば、他のＯＤＮカチオン相互作用については、ＯＤＮ放出はエンドソームのような低ｐＨコンパートメントで起こり得る。
他の実施態様では、上記ナノ粒子は、アルギネート-ＰＬＬナノ粒子である。アルギン酸ナトリウムはその構成成分としてマンヌロン酸及びグルロン酸を有する天然の多糖類である。Aynie等（Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 1999;9:301-12）は、ＯＤＮが結合したＰＬＬが架橋したアルギネートナノ粒子を記載している。該粒子の調製は二工程プロセスであり、最初のアルギネートプレゲルが磁気撹拌下で塩化カルシウムを添加することによって製造され、第二のＰＬＬが添加されて、プレゲルの残りの自由電荷を持つ高分子電解質を形成する。ＩＳＳ-ＮＡはＰＬＬと同時にプレゲルに添加されるか、ナノ粒子形成後に添加される。好ましい実施態様では、上記ナノ粒子は分子量３９００及び７９００のポリリジンポリマーを含むかあるいは本質的にそれらからなり、好ましくは上記ＩＳＳ-ＮＡは非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドである。Aynie等は２００−６００ｎｍの粒子サイズとおよそ１０％のＯＤＮ充填を報告している。しかしながら、アルギネートナノ粒子の充填容量はAynie等によって記載されている条件下では飽和に達しない一方、カプセル化効率は１００％である。よって、アルギネート-ＰＬＬナノ粒子は高いＯＤＮ充填容量を有しており、ＯＤＮ又はＩＳＳ-ＮＡをパッケージするために本発明の実施態様において使用される。
更に好ましい実施態様では、ナノ粒子はキトサンナノ粒子である。キトサンは、キチンから脱アセチル化によって調製される正荷電多糖類ポリマーである。キトサンナノ粒子の調製は例えばRoy K.等（Nat Med. 1999;5:387-91）又はMao HQ等（J Control Release. 2001;70:399-421）によって記載されており、１５０−３００ｎｍサイズのナノ粒子が得られている。これらの著者はコアセルベーション法を使用しており、酢酸ナトリウム中のキトサン溶液を、５５℃でボルテックスしながら硫酸ナトリウム中のＩＳＳ-ＮＡ溶液に混合している。温度、ｐＨ、キトサン、硫酸ナトリウムの濃度、キトサン及びＤＮＡの分子量を変えて最適なナノ粒子を得ることができる。ある実施態様では、キトサンナノ粒子はＰＥＧのＮ-ヒドロキシ-スクシンイミド誘導体と更に反応させられる（Leong KW.等 J Control Release. 1998;53:183-193）。他の実施態様では、キトサンナノ粒子は、更にホモ二官能性架橋剤ＤＳＳ（ビス-Ｎ-ヒドロキシ-スクシンイミド化合物）と同時に反応させられる（Leong KW.等 J Control Release. 1998;53:183-193）。一実施態様では、ＩＳＳ-ＮＡは非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドである。
更に好ましい実施態様では、上記ナノ粒子はカチオン化ゼラチンナノ粒子であり、好ましくは、上記ＩＳＳ-ＮＡは非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、好ましくはＧ１０（配列番号２７）である。カチオン化ゼラチンナノ粒子の調製は、Zwiorek K.等(J Pharm Pharmaceut Sci 2004; 7:22-28)又はZillies J及びCoester C (J Pharm Pharmaceut Sci 2004; 7:17-21)によって記載されており、１８０−２８０ｎｍのサイズのナノ粒子が報告されている。二工程の脱溶媒和法が使用されてナノ粒子が生成され、ｐＨ４．５でのバッファーへの再懸濁後にＥＤＣの存在下でコールアミンで更に誘導体化される。ついで、ＩＳＳ-ＮＡは、ナノ粒子をＩＳＳ-ＮＡの溶液に再懸濁させ、得られた混合物を更にインキュベートすることによってナノ粒子にパッケージされる。Zwiorek等は１８０−２９０ｎｍの範囲のサイズの粒子を得た。ゼラチンナノ粒子を調製する際の更なるガイドはAzarmi S.等（J. Pharm. Pharmaceut. Sci. 2006; 9:124-132）によって与えられ、ナノ粒子の架橋に対してEDCの代わりにグルタールアルデヒドが使用されている。
更に好ましい実施態様では、上記ナノ粒子はゼラチンナノ粒子であり、好ましくは上記ＩＳＳ-ＮＡは非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドである。ゼラチンナノ粒子は、低ｐＨでＮａ２ＳＯ４でのコアセルベーション法によって、Truong-Le VL等 Hum Gene Ther.1998; 9:1709-1717によって記載されているようにして調製され、その粒子はＥＤＣで架橋されるが反応混合物中のトランスフェリンを省く。サイズ３００−６００ｎｍの粒子がTruong-Le等によって得られた。好ましい実施態様では、上記ナノ粒子はゼラチン-コールアミンナノ粒子である。
更に好ましい実施態様では、上記ナノ粒子はアルブミンナノ粒子であり、好ましくは上記ＩＳＳ-ＮＡは非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドである。アルブミンナノ粒子の調製は、例えばIrache JM等（Mini Rev Med Chem. 2005; 5:293-305）によって記載されており、２５０−３００ｎｍのサイズのナノ粒子が報告されている。非常に好ましい実施態様では、アルブミンナノ粒子はヒト血清アルブミンから作製される。アルブミンナノ粒子は、コアセルベーション法又は脱溶媒和法によって調製され、続いてグルタルアルデヒドでの架橋によって安定化される。一方法では、ＩＳＳ-ＮＡはアルブミン水溶液（２％ｗ／ｖ）と共にインキュベートされ、混合物はエタノールで脱溶媒和され、これがナノ粒子の形成を誘導する。ついで、これらはグルタルアルデヒドで架橋される。Wartlick等（J Control Release. 2004;96:483-495）によって記載されているように、ナノ粒子の安定性は、架橋工程中にグルタルアルデヒドの濃度を調節することによって最適化できる。更なる一実施態様では、アルブミンナノ粒子はプロタミン-アルブミン-ＩＳＳ-ＮＡナノ粒子である（Vogel V.等 J control release. 2005; 103: 99-11）。
更なる一実施態様では、アルブミンナノ粒子はプロタミン-アルブミン-ＩＳＳ-ＮＡナノ粒子である（Weyermann等 J control release. 2004; 100: 411-423；Vogel V.等 J control release. 2005; 103: 99-11；Mayer G.等 J control release 2005; 106:181-187）。本発明の実施に有用なナノ粒子はまたKumar MNVR (J. Pharm. Pharmaceut. Sci. 2000; 3:234-258)によって記載されたナノ粒子を含む。
更に好ましい実施態様では、上記ナノ粒子はメタクリレート系ハイドロゲルナノ粒子である。このようなナノ粒子の調製並びにＩＳＳ-ＮＡの吸着は、Jain S.等（Biomacromolecules. 2005;6:2590-600）によって記載され、約５００ｎｍのサイズの粒子が得られている。これらのナノ粒子は、Jain S.等によって記載されたようにして、二相微小エマルジョン(miniemulsion)重合プロセスによって調製され、但し卵白アルブミンはプロセスに含まれていない。ＰＥＧ-メタクリレート、メタクリル酸及びＰＥＧ-ジメタクリレートが撹拌下でプルロニック塩溶液に添加される。得られた溶液を４０℃に加熱し、相分離及び乳化を生じさせ、重合が過硫酸アンモニウム及びメタ重亜硫酸ナトリウムの添加により開始される。ナノ粒子は遠心分離により単離され、ポリ(Ｌ-アルギニン)と続いてＩＳＳ-ＮＡが疎水性ナノ粒子上に吸着される。
更に好ましい実施態様では、上記ナノ粒子はメチルメタクリレート系カチオン性ナノ粒子である。かかるナノ粒子の調製は、Tondelli L.等（J Biomater Sci Polymer Edn 2003; 14:1209-1227）によって記載されており、５００−１０００ｎｍのナノ粒子が得られている。メチルメタクリレートは、ＰＥＧ誘導体化メチルメタクリレート及び第四級アンモニウムイオンを含むメタクリルメタクリレート誘導体と、過硫酸カリウムで開始される乳化重合反応において混合される。ついで、ＩＳＳ-ＮＡがカチオン性ナノ粒子と共にインキュベートされる。
更に好ましい実施態様では、上記ナノ粒子はＰＬＬ変性シリカナノ粒子である。ナノ粒子の調製は、Zhu SG.等（Biotechnol Appl Biochem 2004; 39:179-187）によって記載され、２０ｎｍのサイズのナノ粒子が得られている。ナノ粒子は、油中水マイクロエマルジョンを使用して調製され、テトラエトキシシランの加水分解及び縮合反応が水酸化アンモニウムで開始される。シリカナノ粒子が、ＰＬＬの添加前に炭酸塩バッファー中で活性化され、ＩＳＳ-ＮＡは洗浄されたＰＬＬ-シリカナノ粒子と共に更にインキュベートされる。
本発明の実施に適したナノ粒子は、実施例１１に記載されるように、骨髄由来樹状細胞(ＢＭＤＣ)の活性化について試験することができる。あるいは、インターロイキン１２(ＩＬ-１２)の分泌に加えて、このアッセイ中のナノ粒子の活性を、上清中のインターロイキン６(ＩＬ-６)又はＩＦＮ-αを検出するか、又は蛍光標示式細胞分取によってナノ粒子のインキュベーション時のＢＭＤＣ上のＣＤ-８６のアップレギュレーションを定量することによって、同定されうる。重要なことは、これらのアッセイが、凍結させることができる同一バッチのＢＭＤＣを使用する場合、再現可能であることである。従って、活性剤の比較は、同じバッチのＢＭＤＣで実施されるべきである。
好ましい実施態様では、非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを有するナノ粒子は、Ｇ１０オリゴヌクレオチドがパッケージされたＱβと同様な形で実施例１１に記載された細胞アッセイにおいてＢＭＤＣの活性化を誘導し、Ｑβ-ＶＬＰ又は２０−５００ｎｍサイズのポリスチレンビードと同様の動態でマウス足蹠中への皮下注射時にリンパ節に達する（実施例７及び９参照）。Ｇ１０オリゴヌクレオチドがパッケージされたＱβと同様な形でのＢＭＤＣの活性化とは、ナノ粒子中のＧ１０オリゴヌクレオチドパッケージの同一用量が、ＱβにパッケージされたＧ１０オリゴヌクレオチドの同じ用量によって誘導される量の８０％、好ましくは６０％、より好ましくは５０％、４０％、３０％内でＩＬ-１２分泌の最大半量をもたらすことを表すことを意味する。更に好ましい実施態様では、ナノ粒子は実施例に記載されたアレルギーの動物モデルにおいて保護性である。
好ましい実施態様では、本発明のナノ粒子には、該粒子の０．５から８０％（ｗ／ｗ）、好ましくは０．５から４０％（ｗ／ｗ）、より好ましくは２から４０％（ｗ／ｗ）、更により好ましくは６から４０％（ｗ／ｗ）、尚更により好ましくは１０から４０％（ｗ／ｗ）、更により好ましくは１５から４０％（ｗ／ｗ）、最も好ましくは１８から３０％（ｗ／ｗ）の量に達するＩＳＳ−ＮＡ、好ましくは非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、最も好ましくはＱβＧ１０が、パッケージされる。
ナノ粒子の調製方法は、Microparticulate systems for the delivery of proteins and vaccines, S. Cohen及びH. Bernstein編, Marcel Dekker, New York 1996に概説されている。そこに記載されている微小粒子には、ポリエステル微小粒子、ペグ化ポリエステル微小粒子、ポリホスファゼン微小粒子、リポスフィア及びゼラチン微小粒子が含まれる。更なる微小粒子には、アルギネート微小粒子(Aggarwal N.等 Can J Vet Res. 1999;63:148-52)、（キトサン微小粒子(Aral C及びAkbuga J. J Pharm Pharm Sci. 2003;6:321-6；Xu W.等 Vaccine. 2004; 22:3603-12）が含まれる。当該分野でよく知られているように、得られた粒子サイズがナノ粒子の調製に使用されるエマルジョン内の液滴のサイズによって決まるナノ粒子の調製に使用される方法は、微小粒子の調製に容易に適合化させることができ、そこでは、混合、ボルテックス化、高速ホモジナイゼーション工程が、微小粒子が生産されるように変更される。またスプレードライ法が、微小粒子が作製されるように適合化されうる。本発明の実施に有用な微小粒子は、Kumar ＭＮＶＲ (J Pharm Pharmaceut Sci 2000; 3:234-258)に記載された微小粒子をまた含む。
上述のナノ粒子へのＩＳＳ-ＮＡのパッケージ化の方法は、微小粒子にＩＳＳ-ＮＡをパッケージするために適合化され得、製造されたエマルジョンが微小粒子の生成を生じるように、ホモジナイゼーション又は混合工程が、当業者に知られているように変更される。スプレードライ法もまた、微小粒子が作製されるように適合化されうる。
ポリエステルミクロスフィア、特にＰＬＧＡミクロスフィアの性質、並びにそれらを製造する方法は、例えばＫｉｓｓｅｌＴ及びＫｏｎｅｂｅｒｇＲ（Microparticulate systems for the delivery of proteins and vaccines, S. Cohen及びH. Bernstein編, Marcel Dekker, New York 1996, p.51-87）によって概説され記載されている。これらの方法には、スプレードライ法、水中油中水エマルジョン溶媒蒸発法及び相分離法が含まれる。ＰＬＧＡを構成するモノマーの好ましいモル比は５０モル％ＬＡ及び５０モル％ＧＡである。モノマーの何れかの割合を増加させると、ポリマーの分解が遅くなる。例えば、８５:１５のＬＡ：ＧＡの比率を有するポリマーは、５０：５０の比率のものよりおよそ２．５倍遅い分解速度を有する。よって、ＰＬＧＡポリマーの性質はモノマーの割合を変えることによって操作することができる。
一実施態様では、上記合成粒子はリポソームであり、上記リポソームは脂質二重層からなる脂質小胞体である。リポソームには、当該分野で知られている方法を使用してＩＳＳ-ＮＡがパッケージされ得る。本発明のリポソームは、中性リポソーム、アニオン性リポソーム、カチオン性リポソーム、ステルス(stealth)、又はカチオン性ステルスからなる群から選択されうる。好ましい実施態様では、リポソームはカチオン性リポソームである。リポソームは、１００から８００ｎｍ、好ましくは１００から４００ｎｍ、より好ましくは１００から３００ｎｍ、更により好ましくは１００から２００ｎｍ、最も好ましくは２００ｎｍの直径を有しうる。
好ましい実施態様では、リポソームは、標的細胞とのリポソームの相互作用を容易にするために正電荷を示す。ある実施態様では、リポソームは、カチオン性脂質、コリピド(colipid)、及び安定化添加剤を含む。他の実施態様では、リポソームは、ジメチルアミノエタン-カルバモール-コリステロール、及び／又はジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、及び／又はポリエチレングリコール誘導体化ホスファチジルエタノールアミンを含む。好ましい実施態様では、リポソームはホスファチジルコリン、及び／又はコレステロール、及び／又はＤＬ-α-トコフェロール、好ましくはホスファチジルコリン、コレステロール、及びＤＬ-α-トコフェロールを含む。このようなリポソームの作製は、例えばBangham等, (1965), J.Mol.Biol., 13, 238-252；Gursel等 (2001), J Immunol 167: 3324；又はLudewig等, (2000), Vaccine, 19, 23-32によく確立されており、その開示は出典明示によりその全体をここに援用する。
好ましいリポソーム及びリポソーム中へのＩＳＳ-ＮＡのパッケージ化は、出典明示によりここに援用する国際公開第２００５／０１４１１０号に記載されている。ＩＳＳ-ＮＡは、カチオン性脂質を含むか、又は好ましくはそれから本質的になるか、又は最も好ましくはそれからなる前もって形成された小胞体と混合され、カチオン性脂質と直接混合されて、リポプレックスを生じ、あるいは好ましい実施態様では、脂質二重層に封入された水性空間内にカプセル化される。更なる実施態様では、上記リポソームはリポポリプレックスである（Pelisek J.等 J Gene Med 2006; 8:186-197）。一実施態様では、リポソームは、Cohen S.等 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1991; 88:10440-10444によって記載されているように、アルギネート-ＰＬＬコート中の、マイクロカプセル化リポソームである。好ましい実施態様では、ＩＳＳ-ＮＡ、好ましくは非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが、Semple S.C.等 Methods Enzymol. 2000;313:322-41によって記載されているように、好ましくはＰＥＧ-セラミド-Ｃ１４を含む「安定化されたアンチセンス脂質粒子」内にパッケージされる。本発明の実施のための該方法の遂行において、アンチセンスオリゴヌクレオチドはＩＳＳ-ＮＡに置き換えられ、特に非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドに置き換えられる。これらのリポソームは、生理学的ｐＨ以下でのみ荷電しているカチオン性脂質で調製される。よって、低ｐＨでのリポソームの調製中にリポソームの外表面に結合したＩＳＳ-ＮＡ又は非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、調製物が中性ｐＨに戻された場合に、続いて解離され、アニオン交換クロマトグラフィーによって除去され得る。適切な更なるリポソーム、調製方法、並びにＩＳＳ-ＮＡ、特にオリゴヌクレオチドのための方法は、Semple S.C.等 Methods Enzymol. 2000;313:322-41及びそこの文献に見出すことができる。リポソームの調製方法には、乾燥脂質水和法、逆相水和法、洗浄剤透析法、最小体積封入法が含まれる。ある実施態様では、ＩＳＳ-ＮＡ、特に非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドのパッケージ化は、Ｃ６−Ｃ３０アルキル鎖、胆汁酸、コール酸、タウロコール酸、デスオキシコール酸塩、コレステロール、オレイルリトコール酸、オレオイルコレン酸、糖脂質、リン脂質、スフィンゴ脂質、イソプレノイド、ステロイド、ビタミン、ビタミンＥ、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、脂肪酸エステル、トリグリセリドからなる群から選択される残基によって置換されたＩＳＳ-ＮＡ又は非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを使用することによって、容易になる。
本発明の一側面では、リポソーム中のＩＳＳ-ＮＡはＩＦＮ-αの増大したレベルを前進的に誘導するために使用される。ＩＦＮ-αのそのような増加したレベルは過敏症、好ましくはアレルギーにおいて治療的に活性があることが知られている。
更なる実施態様では、上記合成粒子はビロソームであり、好ましくは上記ビロソームはインフルエンザウイルスの再構成されたウイルス外被であり、更に好ましくは上記インフルエンザウイルスはインフルエンザＡウイルスであり、また更に好ましくは上記インフルエンザＡウイルスはインフルエンザＡ型／シンガポールウイルスである。カチオン性（正に荷電）脂質を含むビロソームが特に核酸を標的細胞に送達するのに適している。更なる実施態様では、上記合成粒子はビロソームであり、該ビロソームは脂質膜を含み、上記脂質膜はカチオン性脂質を含むか、好ましくはそれから本質的になる。非常に好ましい実施態様では、上記合成粒子はビロソームであり、上記ＩＳＳ-ＮＡは非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドであり、好ましくは上記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドはＧ１０（配列番号２７）であり、更に好ましくは、上記ビロソームは脂質膜を含み、該脂質膜はカチオン性脂質を含むか、好ましくはそれから本質的になる。更に好ましい実施態様では、上記ビロソームは脂質膜を含み、該脂質膜は抗体又はその断片を含み、好ましくは該抗体は標的細胞のレセプターと特異的に相互作用する。
本発明の合成粒子、好ましくは微小粒子及びナノ粒子、最も好ましくはナノ粒子は、皮下的、静脈内、皮内、腹腔内に注射され、鼻腔内、経口、経皮的、又は吸入投与されうる。
非常に好ましい実施態様では、上記粒子はウイルス粒子又はウイルス様粒子（ＶＬＰ）、好ましくはＶＬＰである。当該分野で知られている任意のウイルスが本発明のＶＬＰ又はウイルス粒子として選択されうる。殆どの通常知られているウイルスの配列が決定されており、公的に直ぐに利用できる。ウイルスの分類学は当業者によく知られており、例えばH.V. Van Regenmortel等編, Virus Taxonomy: 7th Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses (2000) (Academic Press/elsevier, Burlington Mass, USA)、レスター大学(英国)のウイルス分類学のウェブページ (http://www-micro.msb.le.ac.uk/3035/Virusgroups.html)及びＴａｘｏｎｏｍｙＢｒｏｗｓｅｒ of the National Center for BｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ (NCBI, Washington D.C., USA) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ICTVdb/)によってまとめられている。ウイルスコートタンパク質をコードしている遺伝子は当業者によって同定され得、そのヌクレオチド及びアミノ酸配列は、例えばGenbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)から取得することができる。本発明において特に有用なウイルスは、"Artificial DNA - Methods and Applications", Yury Khudyakov及びHoward Fields編, CCR Press, 2003に一般に開示されている。
ウイルス粒子又はＶＬＰはウイルス感染細胞培養物から産生され精製されうる。本発明の目的に対して、上記ウイルス粒子又はＶＬＰは好ましくは非複製的又は非感染性、より好ましくは非複製的かつ非感染性である。紫外線照射、化学的処理、例えばホルムアルデヒド、β-プロピオン又はクロロホルムでの処理がウイルスを非活性化するために当業者に知られている一般的な方法である。あるいは、上記非複製的及び非感染性ウイルス粒子又は上記非複製的及び非感染性ＶＬＰは上記ウイルスのコアタンパク質の精製及び再構築によって産生することができる。
一実施態様では、上記ウイルス粒子又はＶＬＰ、好ましくはＶＬＰは、ウイルスのウイルス粒子又はＶＬＰ、好ましくはＶＬＰであり、上記ウイルスは、ＤＮＡ逆転写ウイルスを含むＤＮＡウイルス又はＲＮＡウイルスでありうる。好ましい実施態様では、上記ウイルスはＤＮＡウイルスであり、該ＤＮＡウイルスは一本鎖ＤＮＡウイルスであり、該一本鎖ＤＮＡウイルスは、好ましくは、（ａ）パルボウイルス、好ましくはパルボウイルスＢ１９、ブタパルボウイルス（ＰＰＶ）又はイヌパルボウイルス（ＣＰＶ）、（ｂ）エリスロウイルス、（ｃ）ディペンドウイルス、（ｄ）ネコ汎血球減少症ウイルス（ＦＰＶ）とＣＰＶの組換え体（Saliki. T.J.等 (1992) J. Gen. Virol 73:369ff）、（ｅ）アデノ随伴ウイルス２型（ＡＡＶ-２）、（ｆ）ミンク腸炎パルボウイルス（ＭＥＶ）、（ｇ）タイワンアヒルパルボウイルス（ＤＰＶ）、（ｈ）マウス微小ウイルス（ＭＶＭ）、（ｉ） アリューシャンミンク病パルボウイルス（ＡＤＶ）、及び（ｊ）ハチノスツヅリガデンソウイルス（ＧＭＤＮＶ）からなる群から選択される。
更に好ましい実施態様では、上記ＤＮＡウイルスは、二本鎖ＤＮＡ逆転写ウイルスを含む二本鎖ＤＮＡウイルスであり、該二本鎖ＤＮＡウイルスは、好ましくは、（ａ）核多核体病ウイルス、好ましくはAutograpa californica核多核体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）又はＡｃＭＮＰＶポリへドリンとイラクサギンウワバ顆粒病ウイルス（ＴｎＧＶ）のキメラ（Eason J.E.等 (1998), J Virol 72:6237ff）、（ｂ）パピローマウイルス、好ましくは（ｉ）ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ、最も好ましくはＨＰＶ６、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、又はＨＰＶ３３）、（ｉｉ）ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ、好ましくはＢＰＶ１）、及び（ｉｉｉ）ワタウサギパピローマウイルス（ＣＲＰＶ）から選択されるもの、（ｃ）ポリオーマウイルス、好ましくは（ｉ）マウスポリオーマウイルス（好ましくはＰｙ又はＳＶ４０）、（ｉｉ）セキセイインコヒナウイルス、（ｉｉｉ）ヒトポリオーマウイルスＪＣ、（ｉｖ）ハムスターポリオーマウイルス（ＨａＰＶ）、（ｖ）サルＢ-リンパ球向性パポウイルス(pａｐｏｖｉｒｕｓ)（ＬＰＶ）、（ｖｉ）トリポリオーマウイルス（ＡＰＶ）及び（ｖｉｉ）組換えヒト及び非ヒトポリオーマウイルス（Sasnauskas K.等 (1999) Biol. Chem. 380, 381）から選択されるもの、（ｄ）脾臓壊死性ウイルス（SNV, Jiang A. (1999) Hum. Gene Therapy 10(16): 2627-2636）、非常に好ましくは、（ｅ）Ｂ型肝炎ウイルスからなる群から選択される。
更に好ましい実施態様では、上記ウイルスはＲＮＡウイルスであり、該ＲＮＡウイルスは一本鎖ＲＮＡウイルス又は二本鎖ＲＮＡウイルスでありうる。更なる実施態様では、上記ＲＮＡウイルスは一本鎖ＲＮＡウイルスであり、好ましくは該一本鎖ＲＮＡウイルスは一本鎖ポジティブセンスＲＮＡウイルスであり、ここで好ましくは上記一本鎖ポジティブセンスＲＮＡウイルスは、（ａ）ブロモウイルス科、好ましくは（ｉ）アルファモウイルス（例えばアルファルファ・モザイクウィルス(ＡｌＭＶ))、及び（ｉｉ）イラルウイルス（例えばプルヌス壊死性輪斑イラルウイルス（ＰＮＲＳＶ、Pallas V. (1998) Arch. Virol. 144:797-803）)；プルン・ドワーフウィルス(ＰＤＶ（Abou-Jawdah Y.等 (2004) J. Virological Methods 121:31-38)）)、(ｉｉｉ)ブロモウイルス(例えばササゲクロロティックモットルウィルス(ＣＣＭＶ)又はブロム・モザイクウィルス(ＢＭＶ))、(iv)ククモウイルス(例えばキュウリモザイクウイルス（Natilla A.等 Arch Virol 2004 149(1): 137-154）)から選択されるもの、(ｂ) トンブスウイルス科、好ましくは(ｉ)トンブスウイルス、好ましくはトマトブッシースタントウィルス(ＴＢＳＶ（Joelson T.等 (1997) J. Gen. Virol. 78:1213-1217）)、(ｉｉ)カーモウイルス、ｔｕｒｎｉｃ crinkleウイルス(ＴＣＶ（Qu F.及びMorris T.J. (1997) J. Virol. 71(2): 1428-1435）)、(ｃ) ポティウイルス、好ましくはジョンソングラスモザイク病ウイルス(ＪＧＭＶ)、及び、プラム痘瘡ポティウイルス(ＰＰＶ（Fernandez-Fernandes M.R.等 (2002) J. Virol. 76(24): 12646-12653）、(ｄ)タバコモザイクウィルス(タバコモザイクウィルス)、(ｅ)コモウイルス、好ましくはササゲモザイクウイルス(ＣＰＭＶ)、(ｆ)ジャガイモウイルスＸ(ＰＶＸ（Marusic C.等 2001) J. Virol. 75(18): 8434-8439, (g) カルシウイルス、好ましくは(i)ノーウォークウイルス(NV), (ii)ノーウォーク様カルシウイルス、(iii)ヒトカルシウイルス、(iv) Lorsdaleカルシウイルス、(v) ウサギ出血病ウイルス(RHDV)、(vi) European brown hare syndromウイルス(EBHSV), (vii)トロントウイルス、(viii)ハワイウイルス、(ix)サッポロ様ウイルス、及び(x) Grimsbyネコカルシウイルスから選択されるもの、(h) RNAバクテリオファージ、(i) ルテオウイルス、好ましくはpotato leaf rollウイルス(PLRV), (j) flock houseウイルス、(k) retroidウイルス、好ましくは（ｉ）腫瘍レトロウイルス、(ii) レンチウイルス、及び(iii) 酵母レトロトランスポゾンTy1、(l) ダニ媒介脳炎ウイルス(TBEV, Leibl H. (1998) Vaccine 16(4): 340-345)及び(m) トガウイルス、好ましくはアルファウイルス、最も好ましくはシンドビスウイルスから選択される。
更なる実施態様では、上記ＲＮＡウイルスは、（ａ）ブロモウイルス科、好ましくは（ｉ）アルファモウイルス（例えばアルファルファ・モザイクウィルス(ＡｌＭＶ))、及び（ｉｉ）イラルウイルス（例えばプルヌス壊死性輪斑イラルウイルス（ＰＮＲＳＶ、Pallas V. (1998) Arch. Virol. 144:797-803）)；プルン・ドワーフウィルス(ＰＤＶ（Abou-Jawdah Y.等 (2004) J. Virological Methods 121:31-38)）)、(ｉｉｉ)ブロモウイルス(例えばササゲクロロティックモットルウィルス(ＣＣＭＶ)又はブロム・モザイクウィルス(ＢＭＶ))、(iv)ククモウイルス(例えばキュウリモザイクウイルス（Natilla A.等 Arch Virol 2004 149(1): 137-154）)から選択されるもの、(ｂ) トンブスウイルス科、好ましくは(ｉ)トンブスウイルス、好ましくはトマトブッシースタントウィルス(ＴＢＳＶ（Joelson T.等 (1997) J. Gen. Virol. 78:1213-1217）)、(ｉｉ)カーモウイルス、ｔｕｒｎｉｃ crinkleウイルス(ＴＣＶ（Qu F.及びMorris T.J. (1997) J. Virol. 71(2): 1428-1435）)、(ｃ) ポティウイルス、好ましくはジョンソングラスモザイク病ウイルス(ＪＧＭＶ)、及び、プラム痘瘡ポティウイルス(ＰＰＶ（Fernandez-Fernandes M.R.等 (2002) J. Virol. 76(24): 12646-12653）、(ｄ)タバコモザイクウィルス(タバコモザイクウィルス)、(ｅ)コモウイルス、好ましくはササゲモザイクウイルス(ＣＰＭＶ)、(ｆ)ジャガイモウイルスＸ(ＰＶＸ（Marusic C.等 2001) J. Virol. 75(18): 8434-8439, (g) カルシウイルス、好ましくは(i)ノーウォークウイルス(NV), (ii)ノーウォーク様カルシウイルス、(iii)ヒトカルシウイルス、(iv) Lorsdaleカルシウイルス、(v) ウサギ出血病ウイルス(RHDV)、(vi) European brown hare syndromウイルス(EBHSV), (vii)トロントウイルス、(viii)ハワイウイルス、(ix)サッポロ様ウイルス、及び(x) Grimsbyネコカルシウイルスから選択されるもの、(h) RNAバクテリオファージ、(i) ルテオウイルス、好ましくはpotato leaf rollウイルス(PLRV), (j) flock houseウイルス、(k) retroidウイルス、好ましくは（ｉ）腫瘍レトロウイルス、(ii) レンチウイルス、及び(iii) 酵母レトロトランスポゾンTy1、(l) ダニ媒介脳炎ウイルス(TBEV, Leibl H. (1998) Vaccine 16(4): 340-345)及び(m) トガウイルス、好ましくはアルファウイルス、最も好ましくはシンドビスウイルス、及び（ｎ）ノダウイルス科、好ましくはアルファノダウイルス、最も好ましくはPariacotoウイルス（Johnson K.N.等 (2004) Journal of Virology 78:11371-11378）から選択される。
更に好ましい実施態様では、上記ＲＮＡウイルスは二本鎖ＲＮＡウイルスであり、好ましくは上記二本鎖ＲＮＡウイルスは、（ａ）ビルナウイルス、（ｂ）サイポウイルス、好ましくはカイコ細胞質多角体病ウイルス（ＢｍＣＰＶ）、（ｃ）オルビウイルス、好ましくはブルータングウイルス（ＢＴＶ）又はアフリカ馬疫ウイルス（ＡＨＳＶ）、（ｄ）ロタウイルス、非常に好ましくは（ｅ）二本鎖ＲＮＡバクテリオファージ、好ましくは（ｉ）バクテリオファージ８、（ｉｉ）バクテリオファージｐｈｉ６、（ｉｉｉ）バクテリオファージｐｈｉ１２、及び（ｉｖ）バクテリオファージｐｈｉ１２から選択されるものから選択される。
更に好ましい実施態様では、上記ウイルス粒子又はＶＬＰはウイルス粒子又はウイルスのＶＬＰであり、上記ウイルスはバクテリオファージであり、上記バクテリオファージはＤＮＡバクテリオファージ又はＲＮＡバクテリオファージでありうる。
好ましい実施態様では、上記バクテリオファージはＤＮＡバクテリオファージであり、該バクテリオファージは一本鎖ＤＮＡバクテリオファージ又は二本鎖バクテリオファージでありうる。好ましい実施態様では、上記ＤＮＡバクテリオファージは好ましくは、（ａ）ミクロウイルス科、好ましくはＰｈｉ Ｘ１７４、及び（ｂ）イノウイルス科、好ましくはｆｄ及びＭ１３から選択される。更に好ましい実施態様では、上記ＤＮＡバクテリオファージは二本鎖ＤＮＡバクテリオファージであり、上記二本鎖ＤＮＡバクテリオファージは好ましくは、（ａ）ミオウイルス科、好ましくはＴ２、Ｔ４又はＴ６、（ｂ）シホウイルス科、好ましくはバクテリオファージλ、Ｔ１、Ｔ５又はＨＫ９７、（ｃ）ポドウイルス科、好ましくはＴ２、Ｔ７又はＰ２２、（ｄ）テクティウイルス科、好ましくはＰＲＤ１、（ｅ）コルチコウイルス科、好ましくはＰＭ２、（ｆ）プラズマウイルス科、好ましくはマイコプラズマファージ、（ｇ）リポスリクスウイルス科、好ましくはサーモプロテウスバクテリオファージＴＴＶ１及び（ｈ）フセロウイルス科、好ましくはスルホロブスバクテリオファージ１からなる群から選択される。
より好ましい実施態様では、上記バクテリオファージはＲＮＡバクテリオファージであり、上記ＲＮＡバクテリオファージは一本鎖ＲＮＡバクテリオファージ又は二本鎖ＲＮＡバクテリオファージでありうる。一実施態様では、上記ＲＮＡバクテリオファージはエンテロバクテリオファージであり、好ましくは上記エンテロバクテリオファージはレビウイルス科の代表例であり、好ましくは上記レビウイルス科の代表例は、（ａ）分類学的に割り当てられていないファミリーメンバーのアシネトバクター・ファージ２０５（ＡＰ２０５）、（ｂ）レビウイルス、及び好ましくは（ｃ）アロレビウイルスからなる群から選択される。
好ましい実施態様では、上記レビウイルス科の代表例は、レビウイルスであり、好ましくは上記レビウイルスは、（ａ）バクテリオファージＢＺ１３、（ｂ）バクテリオファージＧＡ、（ｃ）バクテリオファージＪＰ３４、（ｄ）バクテリオファージＫＵ１、（ｄ）バクテリオファージＴＨ１、（ｅ）バクテリオファージＭＳ２、（ｆ）バクテリオファージｆ２、（ｇ）バクテリオファージｆｒ、（ｈ）バクテリオファージＪＰ５０１、（ｉ）バクテリオファージＭ１２、（ｊ）バクテリオファージＲ１７、及び（ｋ）バクテリオファージＰＰ７からなる群から選択される。
より好ましい実施態様では、上記レビウイルス科の代表例は、アロレビウイルスであり、好ましくは上記アロレビウイルスは、（ａ）バクテリオファージＦＩ、（ｂ）バクテリオファージＩＤ２、（ｃ）バクテリオファージＮＬ９５、（ｄ）バクテリオファージＳＰ、（ｄ）バクテリオファージＴＷ２８、（ｅ）バクテリオファージＱβ、（ｆ）バクテリオファージＭ１１、（ｇ）バクテリオファージＭＸ１、（ｈ）バクテリオファージＳＴ、（ｉ）バクテリオファージＴＷ１８、及び（ｊ）バクテリオファージＶＫからなる群から選択される。
更に好ましい実施態様では、上記ＲＮＡバクテリオファージは、（ａ）バクテリオファージＢＺ１３、（ｂ）バクテリオファージＧＡ、（ｃ）バクテリオファージＪＰ３４、（ｄ）バクテリオファージＫＵ１、（ｄ）バクテリオファージＴＨ１、（ｅ）バクテリオファージＭＳ２、（ｆ）バクテリオファージｆ２、（ｇ）バクテリオファージｆｒ、（ｈ）バクテリオファージＪＰ５０１、（ｉ）バクテリオファージＭ１２、（ｊ）バクテリオファージＲ１７、（ｋ）バクテリオファージＰＰ７、（ｌ）バクテリオファージＦＩ、（ｍ）バクテリオファージＩＤ２、（ｎ）バクテリオファージＮＬ９５、（ｏ）バクテリオファージＳＰ、（ｐ）バクテリオファージＴＷ２８、（ｑ）バクテリオファージＱβ、（ｒ）バクテリオファージＭ１１、（ｓ）バクテリオファージＭＸ１、（ｔ）バクテリオファージＳＴ、（ｕ）バクテリオファージＴＷ１８、及び（ｖ）バクテリオファージＶＫからなる群から選択される。更に好ましい実施態様では、上記ＲＮＡバクテリオファージは、（ａ）バクテリオファージＱβ、（ｂ）バクテリオファージＲ１７、（ｃ）バクテリオファージｆｒ、（ｄ）バクテリオファージＧＡ、（ｅ）バクテリオファージＳＰ、（ｆ）バクテリオファージＭＳ２、（ｇ）バクテリオファージＭ１１、（ｈ）バクテリオファージＭＸ１、（ｉ）バクテリオファージＮＬ９５、（ｋ）バクテリオファージｆ２、（ｌ）バクテリオファージＰＰ７、及び（ｍ）バクテリオファージＡＰ２０５からなる群から選択される。
更に好ましい実施態様では、上記ＲＮＡバクテリオファージは二本鎖ＲＮＡバクテリオファージであり、好ましくは上記二本鎖ＲＮＡバクテリオファージはシストウイルス科の代表例であり、より好ましくは上記シストウイルス科の代表例はシストウイルスであり、最も好ましくは上記シストウイルスはシュードモナスバクテリオファージＰｈｉ６である。
好ましい実施態様では、上記粒子はバクテリオファージのウイルス粒子であり、好ましくは上記バクテリオファージはＲＮＡバクテリオファージであり、更に好ましくは上記ＲＮＡバクテリオファージは一本鎖ポジティブセンスＲＮＡバクテリオファージであり、更により好ましくは上記一本鎖ポジティブセンスＲＮＡバクテリオファージは、（ａ）バクテリオファージＱβ、（ｂ）バクテリオファージｆｒ、（ｃ）バクテリオファージＧＡ、及び（ｄ）バクテリオファージＡＰ２０５から選択される一本鎖ポジティブセンスＲＮＡウイルスであり、最も好ましくは上記一本鎖ポジティブセンスＲＮＡバクテリオファージはＱβである。
非常に好ましい実施態様では、上記粒子はＶＬＰ、好ましくはＲＮＡウイルスのＶＬＰ、より好ましくは一本鎖ポジティブセンスＲＮＡウイルスのＶＬＰ、最も好ましくはＲＮＡバクテリオファージのＶＬＰである。
更に好ましい実施態様では、上記粒子はバクテリオファージのＶＬＰ、より好ましくはエンテロバクテリオファージのＶＬＰ、更により好ましくはレビウイルス科の代表例のＶＬＰ，最も好ましくはレビウイルス又はアロレビウイルスのＶＬＰである。非常に好ましい実施態様では、上記ＶＬＰはアロレビウイルスのＶＬＰである。
更なる実施態様では、上記粒子はウイルス粒子又はＶＬＰ、正二十面体ウイルスのＶＬＰであり、上記正二十面体ウイルスは好ましくは植物感染性正二十面体ウイルスである。植物感染性正二十面体ウイルスのＶＬＰは例えば出典明示によりここに援用される国際公開第２００５／０６７４７８Ａ２号に開示されている。好ましい実施態様では、上記正二十面体ウイルスは、（ａ）パピローマウイルス科、（ｂ）トティウイルス科、（ｃ）ディシストロウイルス科(Dcistroviridae)、（ｄ）ヘパドナウイルス科、（ｅ）トガウイルス科、（ｆ）ポリオーマウイルス科、（ｇ）ノダウイルス科、（ｈ）テクティウイルス科、（ｉ）レビウイルス科、（ｊ）ミクロウイルス科、（ｋ）サイフォウイルス科、（ｌ）ピコルノウイルス科(Picornoviridae)、（ｍ）パルボウイルス科、（ｎ）カルシウイルス科、（ｏ）テトラウイルス科、及び（ｐ）サテライトウイルスからなる群から選択される何れか一の分類群の代表例から選択される。好ましい実施態様では、上記正二十面体ウイルスは、植物感染性正二十面体であり、 上記植物感染性正二十面体ウイルスは、（ａ）ブニヤウイルス科、（ｂ）レオウイルス科、（ｃ）ラブドウイルス科、（ｄ）ルテオウイルス科、（ｅ）ナノウイルス科、（ｆ）パルティティウイルス科、（ｇ）セキウイルス科、（ｈ）ティモウイルス科、（ｉ）ウルミアウイルス科、（ｊ）タバコネクロシスウイルスサテライト、（ｋ）カリモウイルス科、（ｌ）ジェミニウイルス科、（ｍ）コモウイルス科、（ｎ）ソベモウイルス、（ｏ）トンブスウイルス科、及び（ｐ）ブロモウイルス科からなる群から選択される何れか一の分類群の代表例から選択される。更に好ましい実施態様では、上記植物感染性正二十面体ウイルスは、（ａ）ルテオウイルス科、（ｂ）ナノウイルス科、（ｃ）パルティティウイルス科、（ｄ）セキウイルス科、（ｅ）ティモウイルス科、（ｆ）ウルミアウイルス科、（ｇ）タバコネクロシスウイルスサテライト、（ｈ）カリモウイルス科、（ｉ）ジェミニウイルス科、（ｊ）コモウイルス科、（ｋ）ソベモウイルス、（ｌ）トンブスウイルス科、及び（ｍ）ブロモウイルス科からなる群から選択される何れか一の分類群の代表例から選択される。更に好ましい実施態様では、 上記植物感染性正二十面体ウイルスは、（ａ）カリモウイルス科、（ｂ）ジェミニウイルス科、（ｃ）コモウイルス科、（ｄ）ソベモウイルス、（ｅ）トンブスウイルス科、及び（ｆ）ブロモウイルス科からなる群から選択される何れか一の分類群の代表例から選択される。更に好ましい実施態様では、上記植物感染性正二十面体ウイルスは、（ａ）コモウイルス科、（ｂ）ソベモウイルス、（ｃ）トンブスウイルス科、及び（ｄ）ブロモウイルス科からなる群から選択される何れか一の分類群の代表例から選択される。更に好ましい実施態様では、上記植物感染性正二十面体ウイルスは、コモウイルス科及びブロモウイルス科から選択される何れか一の分類群の代表例から選択される。非常に好ましい実施態様では、上記植物感染性正二十面体ウイルスは、ササゲモザイクウイルス又はササゲクロロティックモトルウイルスである。更に好ましい実施態様では、上記植物感染性正二十面体ウイルスは、ブロモウイルス科の代表例、好ましくは、ブロモウイルス、ククモウイルス、イラルウイルス、又はアルファモ(Alfamo)ウイルスである。非常に好ましい実施態様では、上記植物感染性正二十面体ウイルスは、ブロモモザイクウイルス、ササゲクロロティックモトルウイルス、キュウリモザイクウイルス、タバコ条斑病ウイルス及びアルファルファモザイクウイルス（ＡＭＶ１及びＡＭＶ２を含むＡＭＶ）から選択される。
更に好ましい実施態様では、上記ＶＬＰは合成ＶＬＰである。
更に好ましい実施態様では、ＶＬＰは組換えＶＬＰである。宿主中においてコートタンパク質を組換え的に発現することによるＶＬＰの調製は当業者の技術常識の範囲内である。そのコート又はカプシドタンパク質をＶＬＰの調製に使用することができる例示的なＤＮＡ又はＲＮＡウイルスは国際公開第２００４／００９１２４号の２５頁１０−２１行、２６頁１１−２８行、２８頁４行から３１頁４行に開示されている。これらの開示は出典明示によりここに援用する。
好適な一実施態様では、上記ＶＬＰは、ウイルスの組換えタンパク質、その変異体又は断片を含むか、あるいはそれからなり、好ましくは上記ウイルスは上に列挙した任意のウイルスから選択される。非常に好ましい実施態様では、上記ＶＬＰは、ウイルスの組換えタンパク質、その変異体又は断片を含むか、あるいはそれからなり、上記ウイルスは、（ａ）ＲＮＡバクテリオファージ；（ｂ）バクテリオファージ、（ｃ）Ｂ型肝炎ウイルス、好ましくはそのカプシドタンパク質(Ulrich, 等, Virus Res. 50: 141-182 (1998))又はその表面タンパク質(国際公開第92/11291号)、（ｄ）はしかウイルス(Warnes等, Gene 160:173-178 (1995))、（ｅ）シンドビスウイルス；（ｆ）ロタウイルス(米国特許第5071651号及び米国特許第5374426号)、（ｇ）口蹄疫ウイルス(Twomey 等, Vaccine 13:1603 1610, (1995))、（ｈ）ノーウォークウイルス(Jiang, X.等, Science 250:1580 1583 (1990)；Matsui, S.M.等, J. Clin. Invest. 87:1456 1461 (1991))、（ｉ）アルファウイルス属、（ｊ）レトロウイルス、好ましくはそのＧＡＧタンパク質(国際公開第96/30523号)、（ｋ）レトロトランスポゾンＴｙ、好ましくはタンパク質ｐ１；（ｌ）ヒトパピローマウイルス(国際公開第98/15631号)、（ｍ）ポリオーマウイルス、（ｎ）タバコモザイク病ウイルス、及び（ｏ）Ｆｌｏｃｋハウスウイルスからなる群から選択される。非常に好ましい実施態様では、上記ＶＬＰは、ウイルスの組換えタンパク質、その変異体又は断片を含むか、あるいはそれからなり、上記ウイルスは、（ａ）Ｂ型肝炎ウイルス、及び（ｂ）ポリオーマウイルスからなる群から選択される。
更に好ましい実施態様では、上記ＶＬＰはウイルスの組換えタンパク質、その変異体又は断片を含むか、あるいはそれからなり、上記ウイルスは、植物感染正二十面体ウイルスであり、好ましくは上記植物感染正二十面体ウイルスは、（ａ）コモウイルス科、（ｂ）ソベモウイルス属、（ｃ）トンブスウイルス科、及び（ｄ）ブロモウイルス科からなる群から選択される。
好ましい一実施態様では、ＶＬＰは、組換えタンパク質、その変異体又は断片の一より多いアミノ酸配列、好ましくは二つのアミノ酸配列を含むか、あるいはそれからなる。一を越えるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなるＶＬＰは、本出願では、モザイクＶＬＰと呼ばれる。
ここで使用される「組換えタンパク質の断片」なる用語又は「コートタンパク質の断片」なる用語は、野生型組換えタンパク質又はコートタンパク質それぞれの長さの少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは少なくとも９５％であり、好ましくはＶＬＰを形成する能力を保持するポリペプチドとして定義される。好ましくは、該断片は、（ｉ）少なくとも一、好ましくは正確に一の、内部欠失、（ｉｉ）少なくとも一、好ましくは正確に一の、切断、又は（ｉｉｉ）それらの少なくとも一、好ましくは正確に一の、組合せから得られる。更に好ましくは、断片は、最大５、４、３又は２の内部欠失、最大２の切断又はそれらの正確に一つの組合せにより得られる。更に好ましくは、断片は、最大５、４、３又は２の内部欠失によって得られ、更により好ましくは、上記欠失のそれぞれは１から５、好ましくは１から４、より好ましくは１から３、更により好ましくは１から２、最も好ましくは正確に１のアミノ酸を含む。
「組換えタンパク質の断片」又は「コートタンパク質の断片」なる用語は、上で定義された「組換えタンパク質の断片」又は「コートタンパク質の断片」のそれぞれと、少なくとも８０％、好ましくは９０％、更により好ましくは９５％のアミノ酸配列同一性を有し、好ましくはウイルス様粒子内に集合化することができるポリペプチドを更に包含する。
「変異体コートタンパク質」なる用語は、野生型組換えタンパク質又はコートタンパク質それぞれに由来するアミノ酸配列を有するポリペプチドを指し、該アミノ酸配列は野生型配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％又は９９％の同一性であり、好ましくは集合してＶＬＰを形成する能力を保持している。
好適な一実施態様では、本発明のＶＬＰはＢ型肝炎ウイルスのＶＬＰである。Ｂ型肝炎ウイルス様粒子の調製は、特に国際公開第００／３２２２７号、同第０１／８５２０８号、同第０１／０５６９０５号及び同第２００４／０００３５１号に開示されている。これら４つすべての文献は出典明示により明示的にここに援用される。本発明の実施に使用するのに適したＨＢｃＡｇの他の変異体は、国際公開第０１／０５６９０５号の３４−３９頁に開示されている。特に好ましいＢ型肝炎ウイルスＶＬＰは国際公開第２００４／０００３５１号の４３頁、１２行から４９頁、８行と、国際公開第２００４／０００３５１号の配列番号１９−６８、７１及び９７に記載されている。本発明の更に好ましい一実施態様では、リジン残基がＨＢｃＡｇポリペプチドに導入される。好ましい実施態様では、本発明のＶＬＰ及び組成物は、配列番号１のアミノ酸１−１４４又は１−１４９、１−１８５を含むか、あるいはこれからなるＨＢｃＡｇを用いて調製され、このアミノ酸は、７９番目と８０番目のアミノ酸がGly-Gly-Lys-Gly-Gly(配列番号２４)のアミノ酸配列を有するペプチドに置き換えられるように修飾されている。この修飾により配列番号１から配列番号２に変化する。更なる好ましい実施態様では、配列番号２の４８番目と１１０番目のシステイン残基、又はその対応する断片、好ましくは１−１４４又は１−１４９がセリンに変異される。本発明は、上記の対応するアミノ酸変異を有するＢ型肝炎コアタンパク質変異を含有する組成物を更に含む。本発明は、配列番号２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％又は９９％の同一性であるアミノ酸配列を含むか、あるいはこれからなるＨＢｃＡｇポリペプチドを含む組成物及び薬学的組成物をそれぞれ含む。
本発明の好ましい一実施態様では、ウイルス様粒子は、ＲＮＡバクテリオファージの組換えコートタンパク質、その変異体又は断片を含むか、又はそれらから本質的になるか、又はそれらからなる。好ましくは、ＲＮＡバクテリオファージは、（ａ）バクテリオファージＢＺ１３、（ｂ）バクテリオファージＧＡ、（ｃ）バクテリオファージＪＰ３４、（ｄ）バクテリオファージＫＵ１、（ｄ）バクテリオファージＴＨ１、（ｅ）バクテリオファージＭＳ２、（ｆ）バクテリオファージｆ２、（ｇ）バクテリオファージｆｒ、（ｈ）バクテリオファージＪＰ５０１、（ｉ）バクテリオファージＭ１２、（ｊ）バクテリオファージＲ１７、（ｋ）バクテリオファージＰＰ７、（ｌ）バクテリオファージＦＩ、（ｍ）バクテリオファージＩＤ２、（ｎ）バクテリオファージＮＬ９５、（ｏ）バクテリオファージＳＰ、（ｐ）バクテリオファージＴＷ２８、（ｑ）バクテリオファージＱβ、（ｒ）バクテリオファージＭ１１、（ｓ）バクテリオファージＭＸ１、（ｔ）バクテリオファージＳＴ、（ｕ）バクテリオファージＴＷ１８、及び（ｖ）バクテリオファージＶＫからなる群から選択される。更に好ましくは、ＲＮＡバクテリオファージは、（ａ）バクテリオファージＱβ、（ｂ）バクテリオファージＲ１７、（ｃ）バクテリオファージｆｒ、（ｄ）バクテリオファージＧＡ、（ｅ）バクテリオファージＳＰ、（ｆ）バクテリオファージＭＳ２、（ｇ）バクテリオファージＭ１１、（ｈ）バクテリオファージＭＸ１、（ｉ）バクテリオファージＮＬ９５、（ｋ）バクテリオファージｆ２、（ｌ）バクテリオファージＰＰ７、及び（ｍ）バクテリオファージＡＰ２０５からなる群から選択される。
本発明の好適な一実施態様では、ウイルス様粒子は、ＲＮＡバクテリオファージの少なくとも一のコートタンパク質、その変異体又は断片を含み、該コートタンパク質は（ａ）ＱβＣＰと称する配列番号３；（ｂ）配列番号３及び配列番号４の混合物（ＱβＡ１タンパク質）；（ｃ）配列番号５（Ｒ１７カプシドタンパク質）；（ｄ）配列番号６（ｆｒカプシドタンパク質）；（ｅ）配列番号７（ＧＡカプシドタンパク質）；（ｆ）配列番号８（ＳＰカプシドタンパク質）；（ｇ）配列番号８及び配列番号９の混合物；（ｈ）配列番号１０（ＭＳ２カプシドタンパク質）；（ｉ）配列番号１１（Ｍ１１カプシドタンパク質）；（ｊ）配列番号１２（ＭＸ１カプシドタンパク質）；（ｋ）配列番号１３（ＮＬ９５カプシドタンパク質）；（ｌ）配列番号１４（ｆ２カプシドタンパク質）；（ｍ）配列番号１５（ＰＰ７カプシドタンパク質）；及び（ｎ）配列番号２１（ＡＰ２０５カプシドタンパク質）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。本発明の更に好ましい実施態様では、ウイルス様粒子は、（ａ）配列番号３；（ｂ）配列番号３及び配列番号４の混合物；（ｃ）配列番号６；（ｄ）配列番号７；（ｅ）配列番号２１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するコートタンパク質を含む。本発明の更に非常に好ましい実施態様では、ウイルス様粒子は、（ａ）配列番号３；及び（ｂ）配列番号３及び配列番号４の混合物からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するコートタンパク質を含む。
本発明の更に非常に好ましい実施態様では、ウイルス様粒子は、配列番号３のアミノ酸配列を有するコートタンパク質から本質的になるか、又は配列番号４のアミノ酸配列を有するコートタンパク質又はその変異体と配列番号３の混合物から本質的になる。
本発明の好適な一実施態様では、ＶＬＰは、ＲＮＡバクテリオファージのコートタンパク質、その変異体又は断片の一を越えるアミノ酸配列、好ましくは２つのアミノ酸配列を含むか、あるいはそれらからなるモザイクＶＬＰである。
一実施態様では、ウイルス粒子又はＶＬＰはバクテリオファージｆｒ又はＧＡのＶＬＰである。組換えＶＬＰの形態のｆｒコートタンパク質はPushko P等（(1993) Prot Engin 6:883-891）によって記載されているようにして得ることができ、ＧＡ ＶＬＰは、例えば国際公開第２００４／００７５３８号に記載されているＧＡファージからｐＱｂ１８５への逆転写によって単離されたＧＡコートタンパク質ｃＤＮＡをクローニングすることによって得ることができる。Ｆｒ及びＧＡ ＶＬＰの分解は、０．１Ｍの濃度で酢酸が補填されていてもよい７Ｍの尿素中でＶＬＰをインキュベートすることによって直ぐになすことができる。核酸は、核酸が保持されながらコートタンパク質の有意な量が流れるｐＨか、又はコートタンパク質がまたカラムに吸着され続いて塩勾配で溶離されるｐＨで、イオン交換クロマトグラフィーによってコートタンパク質から更に精製される。ＩＳＳ-ＮＡとのｆｒ及びＧＡコートタンパク質の組立は、本質的には国際公開第２００３／０２４４８１号に記載されているようにして、ゆっくりした透析によって実施され、ここで、上記ＩＳＳ-ＮＡは好ましくは非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、より好ましくはＧ１０（配列番号２７）、更により好ましくは実施例２に記載したＨＰＬＣ条件下でＱβカプシド標準に対して８０から１２０％、最も好ましくは８０から９５％の保持時間を有する凝集Ｇ１０（配列番号２７）である。再構築反応の終わりに、再構築混合物は、例えばＮＥＴバッファー中の５０％（ｖ／ｖ）グリセロール溶液に対する透析（国際公開第２００３／０２４４８１号）によって濃縮され、例えばセファロースＣＬ-４Ｂカラムでのゲル濾過法によって更に精製される。更なる精製法には、ＣｓＣｌ勾配又はスクロースクッションでの超遠心が含まれる。Ｆｒ及びＧＡ ＶＬＰの分解及び組立のための更なるプロトコルは本願の実施例５及び６に開示されている。
非常に好適な一実施態様では、ＶＬＰはＲＮＡバクテリオファージの２つの異なるコートタンパク質を含むか、あるいはそれらからなるものであり、該２つのコートタンパク質はＣＰ Ｑβ(配列番号３)とＣＰ Ｑβ Ａ１(配列番号４)、又はＣＰ ＳＰ(配列番号８)とＣＰ ＳＰ Ａ１(配列番号９)のアミノ酸配列を有する。
本発明の好適な実施態様では、本発明のウイルス様粒子は、ＲＮＡ-バクテリオファージＱβ、ｆｒ、ＡＰ２０５又はＧＡの組換えコートタンパク質、その変異体又は断片を含むか、又はそれらから本質的になるか、又はそれらからなる。
好適な一実施態様では、本発明のＶＬＰはＲＮＡバクテリオファージＱβのＶＬＰである。Ｑβのカプシド又はウイルス様粒子は、直径２５ｎｍで、Ｔ＝３の疑似対称体の、正二十面体ファージ様カプシド構造を示す。カプシドは、ジスルフィド架橋により共有結合性の五量体及び六量体で結合して(Golmohammadi, R等, Structure 4：543-5554(1996))、際だって安定したＱβカプシドとなるコートタンパク質の１８０のコピーを含む。しかしながら、組換えＱβコートタンパク質から作製されるカプシド又はＶＬＰは、カプシド内の他のサブユニットへ、ジスルフィド結合を介して結合していないか、又は不完全に結合するサブユニットを含んでいてもよい。
本発明に係る更に好ましいＲＮＡバクテリオファージ、特にＱβ及びｆｒのＶＬＰは、国際公開第０２／０５６９０５号に開示されており、この開示内容は出典明示によりここにその全体を援用する。特に、国際公開第０２／０５６９０５号の実施例１８にＱβのＶＬＰ粒子の調製について詳しく記載されている。
他の好適な実施態様では、本発明のＶＬＰは、ＲＮＡバクテリオファージＡＰ２０５のＶＬＰである。アミノ酸５のプロリンがスレオニンに置換しているＡＰ２０５コートタンパク質を含む、ＡＰ２０５ＶＬＰの集合体コンピテント変異体型をまた本発明の実施に使用してもよく、本発明の他の好ましい実施態様となる。国際公開第２００４／００７５３８号の特に実施例１及び実施例２には、ＡＰ２０５コートタンパク質を含むＶＬＰの取得方法、とりわけその発現と精製について記載されている。国際公開第２００４／００７５３８号は出典明示によってここに援用される。更に好ましい実施態様では、上記ウイルス粒子又はＶＬＰはＲＮＡバクテリオファージＡＰ２０５のウイルス粒子又はＶＬＰであり、上記ＩＳＳ-ＮＡは好ましくは非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、より好ましくはＧ１０（配列番号２７）、更により好ましくは実施例２に記載したＨＰＬＣ条件下でＱβカプシド標準に対して８０から１２０％、最も好ましくは８０から９５％の保持時間を有する凝集Ｇ１０（配列番号２７）である。
露出したリジン残基がアルギニンに置き換えられているＱβ変異体を本発明に用いることができる。よって、本発明の他の好ましい実施態様では、ウイルス様粒子は、変異体Ｑβコートタンパク質を含むか、本質的にこれからなるか、あるいはこれからなる。好ましくは、これらの変異体コートタンパク質は、ａ）Ｑβ-２４０(配列番号１６、配列番号３のＬｙｓ１３-Ａｒｇ)、ｂ）Ｑβ-２４３(配列番号１７、配列番号３のＡｓｎ１０-Ｌｙｓ)；ｃ）Ｑβ-２５０(配列番号１８、配列番号３のＬｙｓ２-Ａｒｇ)、ｄ）Ｑβ-２５１(配列番号１９、配列番号３のＬｙｓ１６-Ａｒｇ)；及びｅ）Ｑβ-２５９(配列番号２０、配列番号３のＬｙｓ２-Ａｒｇ、Ｌｙｓ１６-Ａｒｇ)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、あるいはこれからなる。上に示したＱβ変異体コートタンパク質、変異体Ｑβコートタンパク質ＶＬＰ及びカプシドの構築、発現及び精製はそれぞれ、国際公報第０２／０５６９０５号に記載されている。特に上述の出願の実施例１８がここで言及される。
更に好ましい実施態様では、上記ウイルス粒子又はＶＬＰはＲＮＡバクテリオファージＱβのウイルス粒子又はＶＬＰであり、上記ＩＳＳ-ＮＡは好ましくは非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、より好ましくはＧ１０（配列番号２７）、更により好ましくは実施例２に記載したＨＰＬＣ条件下でＱβカプシド標準に対して８０から１２０％、最も好ましくは８０から９５％の保持時間を有する凝集Ｇ１０（配列番号２７）である。ＱβＶＬＰの分解及び組立は実施例１及び３に実証されている。
本発明の他の好適な実施態様では、ウイルス様粒子は、Ｑβの変異体コートタンパク質、又はその変異体又は断片、及び対応するＡ１タンパク質を含むか、又はそれらから本質的になるか、又はそれらからなる。更なる好適な実施態様では、ウイルス様粒子は、アミノ酸配列１６、１７、１８、１９又は２０の配列番号を有する変異体コートタンパク質及び対応するＡ１タンパク質を含むか、又はそれらから本質的になるか、又はそれらからなる。
更にＲＮＡバクテリオファージコートタンパク質はまた細菌宿主内で発現すると自己集合体化することが示されている(Kastelein, RA.等, Gene 23:245-254 (1983)、Kozlovskaya, TM.等, Dokl. Akad. Nauk SSSR 287:452-455 (1986)、Adhin, MR.等, Virology 170:238-242 (1989)、Priano, C.等, J. Mol. Biol. 249:283-297 (1995))。特に、ＧＡ (Ni, CZ.,等, Protein Sci. 5: 2485-2493 (1996)、Tars, K等, J. Mol.Biol. 271:759-773(1997))及びｆｒ (Pushko P. 等, Prot. Eng. 6: 883-891 (1993)、Liljas, L等 J Mol. Biol. 244:279-290, (1994))の生物学的及び生化学的性質は開示されている。幾つかのＲＮＡバクテリオファージの結晶構造が決定されている(Golmohammadi, R.等, Structure 4:543-554 (1996))。
好ましい一実施態様では、ウイルス粒子又はＶＬＰはササゲクロロティックモトルウイルス（ＣＣＭＶ）のＶＬＰ又はウイルス粒子である。大腸菌において発現されたコートタンパク質からのＣＣＭＶウイルスと核酸の組立は記載されている（Zhao X等(1995) Virology 207:486-494）。特に、ＲＮＡとのＣＣＭＶの再構築はＲＮＡ配列とは独立であることが示されている（Johnson JM等 (2004) J Mol Biol 335:455-464）。更に、ウイルスは、高ＮａＣｌ濃度（１M；Johnson JE及びSpeir JA (1997) J Mol Biol 269:665-675）を加えることによって分解させることができる、ニクレアーゼ消化を受けやすい膨潤形態で存在している場合がある。核酸の存在下でのＣＣＭＶの再構築の方法もまたそこに記載されている。一実施態様では、よってＣＣＭＶ粒子はＩＳＳ-ＮＡ、好ましくは非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドと再構築される。非常に好ましい実施態様では、非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドはＧ１０（配列番号２７）、より好ましくは凝集Ｇ１０、更により好ましくは実施例２に記載したＨＰＬＣ条件下でＱβカプシド標準に対して８０から１２０％、最も好ましくは８０から９５％の保持時間を有する凝集Ｇ１０である。更なる一実施態様では、天然ＣＣＭＶウイルス粒子は、膨潤しており、ヌクレアーゼで処理され、ＩＳＳ-ＮＡ、好ましくは非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、更により好ましくはＧ１０（配列番号２７）が、ヌクレアーゼ除去後にヌクレアーゼ処理粒子に加えられる。更なる一実施態様では、ＣＣＭＶカプシドは、例えばZlotnick等(2000) Virology 277:450-456に記載されているようにして、核酸なしで再構築され、場合によってはZlotnick等 ((2000) Virology 277:450-456)又はJohnson JE及びSpeir JA ((1997) J Mol Biol 269:665-675)に記載されているように、適切なｐＨ及びイオン強度に溶液をもっていくことによって膨潤され、ＩＳＳ-ＮＡ、好ましくは非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、より好ましくはＧ１０（配列番号２７）が膨潤された空の粒子に加えられる。
更なる一実施態様では、ウイルス粒子又はＶＬＰは、ブロモモザイクウイルス（ＢＭＶ）のＶＬＰ又はウイルス粒子である。ＢＭＶの再構築は過去に記載されている（Choi YG及びRao LN (2000) Virology 275: 249-257、並びにそこの文献）。各ウイルスＲＮＡの３’端のｔＲＮＡ様構造（ｔｌｓ）がパッケージ化に必要であることが示され、約２００ヌクレオチド長のヌクレオチド配列としてトランスで加えることができる（Choi YG等(2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:655-660)。タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）又はＣＭＶ、又は小麦胚芽ｔＲＮＡのようなｔＲＮＡのような他のウイルスからのｔｌｓ をまたトランスで加えて、再構築を容易にすることができるが、Choi等はＢＭＶカプシド中へのｔＲＮＡのパッケージ化は検出しなかった(Choi YG等 (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:655-660）。よって、更なる一実施態様では、ＢＭＶがＩＳＳ-ＮＡ、好ましくは非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、より好ましくはＧ１０、更により好ましくは実施例２に記載したＨＰＬＣ条件下でＱβカプシド標準に対して８０から１２０％、最も好ましくは８０から９５％の保持時間を有する凝集Ｇ１０であると再構築される。
本発明の組成物は免疫賦活性核酸（ＩＳＳ-ＮＡ）を含有し、好ましくは上記ＩＳＳ-ＮＡは、細胞、好ましくは樹状細胞において、サイトカイン、好ましくはＩＦＮ-αの生産を誘導することができる。一実施態様では、上記ＩＳＳ-ＮＡは、（ａ）リボ核酸；（ｂ）デスオキシリボ核酸、（ｃ）キメラ核酸；及び（ｄ）（ａ）、（ｂ）及び／又は（ｃ）の少なくとも一つの核酸の任意の混合物からなる群から選択される。好ましい実施態様では、上記ＩＳＳ-ＮＡはリボ核酸であり、好ましくは上記リボ核酸は二本鎖リボ核酸、好ましくは（ａ）二本鎖ウイルスＲＮＡ、及び（ｂ）合成二本鎖ＲＮＡ、好ましくはポリ（Ａ：Ｕ）又はポリ（Ｉ：Ｃ）、最も好ましくはポリ（Ｉ：Ｃ）からなる群から選択される二本鎖リボ核酸である。
自然免疫系は病原性微生物によって共有される不変の分子パターンを認識する能力を有している。最近の研究は、この認識が効果的な免疫応答を誘導する際の重要な工程であることを明らかにした。微生物産物が免疫応答を増強する主要な機構はＡＰＣ、特に樹状細胞を刺激して、炎症誘発性サイトカインをつくり出し、Ｔ細胞のための同時刺激分子を高レベルで発現することである。これらの活性化された樹状細胞は続いて一次Ｔ細胞応答を開始させ、Ｔ細胞媒介エフェクター機能のタイプを指示する。核酸の３つのクラス、つまり、（ｉ）免疫賦活性配列を含む細菌ＤＮＡ、特に特異的フランキング塩基内の非メチル化ＣｐＧジヌクレオチド（ＣｐＧモチーフと呼ぶ）、（ｉｉ）免疫応答を亢進する微生物成分の重要なメンバーを表す様々なタイプのウイルスによって合成される二本鎖ＲＮＡ、及び（ｉｉｉ）一本鎖ＲＮＡ。合成二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡ、例えばポリイノシン酸-ポリシチジル酸（ポリＩ：Ｃ）は樹状細胞を誘導して炎症誘発性サイトカインをつくり出し、高レベルの同時刺激分子を発現することができる。Tokunaga及びYamamoto等による一連の研究は、細菌ＤＮＡ又は合成オリゴデスオキシヌクレオチドがヒトＰＢＭＣ及びマウス脾臓細胞を誘導してＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）を産生することを示した（Yamamoto等, Springer Semin Immunopathol. 22:11-19に概説）。ポリ（Ｉ：Ｃ）はＩ型ＩＦＮの強力なインデューサーとして元々は合成されたが、ＩＬ-１２のような他のサイトカインをまた誘導する。好ましいリボ核酸にはポリイノシン酸-ポリシチジル酸二本鎖ＲＮＡ（ポリＩ：Ｃ）が包含される。リボ核酸とその修飾並びにその生産方法はLevy, H.B (Methods Enzymol. 1981, 78:242-251)、DeClercq, E (Methods Enzymol. 1981, 78: 227-236)及びTorrence, P.F. (Methods Enzymol 1981;78:326-331)及びその中の文献に記載されている。更に好ましいリボ核酸は、二つのストランドが二本鎖ＲＮＡを形成するポリ（Ｉ：Ｃ）のようなイノシン酸及びシチジル酸のポリヌクレオチドを含む。リボ核酸は生物から単離することができる。リボ核酸はまた合成リボ核酸、ホスホジエステル骨格の修飾、特にホスホロチオエート修飾によってヌクレアーゼ耐性にされた合成ポリ（Ｉ：Ｃ）オリゴヌクレオチドを更に包含する。更なる実施態様では、ポリ（Ｉ：Ｃ）のリボース骨格はデスオキシリボースによって置き換えられる。当業者ならば合成オリゴヌクレオチドを如何にして合成するかの手順を知っているであろう。
更なる実施態様では、上記ＩＳＳ-ＮＡは一本鎖リボ核酸、好ましくはポリウリジル酸（ポリ-Ｕ、Westwood A. (2006), Vaccine 24:1736-1743）である。好ましい実施態様では、上記ＩＳＳ-ＮＡはデスオキシリボ核酸であり、好ましくは上記デスオキシリボ核酸は二本鎖デスオキシリボ核酸である。非常に好ましい実施態様では、上記ＩＳＳ-ＮＡはデスオキシリボ核酸であり、好ましくは上記デスオキシリボ核酸は一本鎖デスオキシリボ核酸、最も好ましくはオリゴデスオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）である。
他の実施態様では、上記ＩＳＳ-ＮＡはオリゴヌクレオチドであり、上記オリゴヌクレオチドは好ましくは、（ａ）非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド；及び（ｂ）非メチル化ＣｐＧモチーフを含まないオリゴヌクレオチドからなる群から選択される。好ましくは、上記ＩＳＳ-ＮＡは非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドである。特異的フランキング塩基内の非メチル化ＣｐＧ-ジヌクレオチド（ＣｐＧモチーフと呼ぶ）は免疫応答を亢進する微生物成分の重要なメンバーを表す。Ｔｏｌｌ様レセプター９（ＴＬＲ９）は、細菌ＤＮＡによって、特に非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドによって活性化される。一般に、非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、配列：５’Ｘ１Ｘ２ＣＧＸ３Ｘ４ ３’を含み、ここでＸ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４は任意のヌクレオチドである。好ましい非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、更に、約６から約１０００００ヌクレオチド、より好ましくは、約６から約２０００ヌクレオチド、更により好ましくは約２０から約２０００ヌクレオチド、更により好ましくは約２０から約３００のヌクレオチドを含む。更に好ましい非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、１００から約２０００ヌクレオチド、好ましくは１００から約１０００ヌクレオチド、より好ましくは１００から約５００ヌクレオチドを含む。本発明において、特に好ましいオリゴヌクレオチド、非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは２０から４０、好ましくは２６、２７、２８、２９、３０、３１又は３２ヌクレオチド、最も好ましくは３０ヌクレオチドを含む。
ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドはオリゴヌクレオチドの安定性を亢進するためにホスフェート骨格の一又は複数のホスホチオエステル修飾を含みうる。例えば、一又は複数のホスフェート骨格の修飾を有するか、又は修飾されたホスフェート骨格の全てを有するＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド及びヌクレオチドホスフェート骨格修飾の一つ、幾つか又は全てがホスホロチオエート修飾であるＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが本発明の範囲に含められる。好ましい実施態様では、上記ＩＳＳ-ＮＡはＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドであり、好ましくは上記ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは専らホスホジエステル結合からなり、好ましくは非メチル化ヌクレオチドが本発明において好適である。
ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドはまた組換え、ゲノム、合成、ｃＤＮＡ、プラスミド由来、及び一本鎖又は二本鎖でありうる。本発明での使用に対して、核酸は当該分野でよく知られている多くの手順の何れかを使用して新規合成することができる。例えば、b-シアノエチルホスホラミダイト法（Beaucage, S. L.,及びCaruthers, M. H., Tet. Let. 22:1859 (1981)；ヌクレオシドＨ-ホスホネート法（Garegg等, Tet. Let. 27:4051-4054 (1986)；Froehler等., Nucl. Acid. Res. 14:5399-5407 (1986)；Garegg等, Tet. Let. 27:4055-4058 (1986), Gaffney等, Tet. Let. 29:2619-2622 (1988))である。これらの化学は市場で入手できる様々な自動オリゴヌクレオチド合成機によって実施することができる。あるいは、ＣｐＧは、患者への投与後にオリゴヌクレオチドに分解するプラスミド中で大規模に製造することができる(Sambrook, T.等 “Molecular Cloning: A Laboratory Manual,” Cold Spring Harbor laboratory Press, New York, 1989参照)。オリゴヌクレオチドは、制限酵素、エキソヌクレアーゼ又はエンドヌクレアーゼを用いるもののような既知の技術を使用して既存の核酸配列（例えばゲノム又はｃＤＮＡ）から調製することができる。
ＩＳＳ-ＮＡ、好ましくは非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、組成物が動物の免疫応答を亢進する限り、当該分野で知られている任意の方法によって粒子に結合させることができる。例えば、ＩＳＳ-ＮＡは共有的に又は非共有的に結合させることができる。好ましくは、粒子、好ましくはＶＬＰは、ＩＳＳ-ＮＡ、好ましくは非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを完全に又は部分的に封入する。非常に好ましい実施態様では、上記粒子、好ましくは上記ＶＬＰには、上記ＩＳＳ-ＮＡがパッケージされ、更に好ましくは、上記ＩＳＳ-ＮＡは非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、最も好ましくはＧ１０（配列番号２７）である。
一実施態様では、ＩＳＳ-ＮＡ、好ましくは非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、粒子、好ましくは上記ＶＬＰに、結合部位、好ましくは（ａ）オリゴヌクレオチド結合部位（天然に生じるか又は非天然のもの）、（ｂ）ＤＮＡ結合部位、及び（ｃ）ＲＮＡ結合部位から選択される結合部位にて結合される。他の実施態様では、ＶＬＰ結合部位はアルギニンリッチリピート又はリジンリッチリピートを含む。
本発明の他の好ましい実施態様では、ＩＳＳ-ＮＡは非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドであり、該非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドのＣｐＧモチーフはパリンドローム配列の一部であり、好ましくは上記パリンドローム配列は、配列番号２８及び配列番号３５から６０の何れか一から選択される。好ましくは、上記パリンドローム配列はＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ（配列番号２８）である。
好ましい実施態様では、上記ＩＳＳ-ＮＡはＡ型ＣｐＧ又はＣ型ＣｐＧである。好ましくは、上記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドはＡ型ＣｐＧであり、好ましくはヌクレオチドは専らホスホジエステル結合によって結合している。更に好ましい実施態様では、上記ＩＳＳ-ＮＡはパリンドローム配列を含むＡ型ＣｐＧであり、好ましくは上記パリンドローム配列は、（ａ）ＧＡＣＧＴＣ（配列番号３５）、（ｂ）ＡＧＣＧＣＴ（配列番号３６）、（ｃ）ＡＡＣＧＴＴ（配列番号３７）、（ｄ）ＡＴＣＧＡＴ（配列番号３８）；（ｅ）ＣＧＡＴＣＧ（配列番号３９）；（ｆ）ＣＧＴＡＣＧ（配列番号４０）；（ｇ）ＣＧＣＧＣＧ（配列番号４１）；（ｈ）ＧＣＧＣＧＣ（配列番号４２）；（ｉ）ＴＣＧＣＧＡ（配列番号４３）；（ｊ）ＡＣＧＡＴＣＧＴ（配列番号４４）；（ｋ）ＣＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧ（配列番号４５）；（ｌ）ＣＧＡＣＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＴＣＧ（配列番号４６）；（ｍ）ＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ（配列番号２８），（ｎ）ＣＧＡＣＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＴＣＧ（配列番号４７）；（ｏ）ＡＡＣＧＴＴ（配列番号４８）；（ｐ）ＣＡＡＣＧＴＴＧ（配列番号４９）；（ｑ）ＡＣＡＡＣＧＴＴＧＴ（配列番号５０）；（ｒ）ＡＡＣＡＡＣＧＴＴＧＴＴ（配列番号５１）；及び（ｓ）ＣＡＡＣＡＡＣＧＴＴＧＴＴＧ（配列番号５２）からなる群から選択される。更に好ましい実施態様では、上記ＩＳＳ-ＮＡははパリンドローム配列を含むＡ型ＣｐＧであり、該パリンドローム配列は、ＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ（配列番号２８）である。
好ましい実施態様では、上記パリンドローム配列には、その３’末端と５’末端にグアノシン体が隣接する。更に好ましい実施態様では、上記パリンドローム配列には、その５’末端に少なくとも３で多くとも２５のグアノシン体が隣接し、上記パリンドローム配列には、その３’末端に少なくとも３で多くとも２５のグアノシン体が隣接している。更に好ましい実施態様では、上記パリンドローム配列には、その５’末端に少なくとも３で多くとも１５、好ましくは多くとも１０のグアノシン体が隣接し、上記パリンドローム配列には、その３’末端に少なくとも３で多くとも１５、好ましくは多くとも１０のグアノシン体が隣接している。他の好ましい実施態様では、上記パリンドローム配列には、その５’末端と３’末端に少なくとも３で多くとも１５、好ましくは多くとも１０のグアノシン体が隣接している。更に好ましい実施態様では、パリンドローム配列には、その５’末端に少なくとも３で多くとも１５、好ましくは多くとも１０のグアノシン体が隣接し、上記パリンドローム配列には、その３’末端に少なくとも６で多くとも１５、好ましくは多くとも１０のグアノシン体が隣接している。更に好ましい実施態様では、パリンドローム配列は、その５’末端に少なくとも５で多くとも１０のグアノシン体が隣接し、上記パリンドローム配列には、その３’末端に少なくとも５で多くとも１０のグアノシン体が隣接している。更に好ましい実施態様では、パリンドローム配列、好ましくは配列番号２８は、その３’末端に少なくとも１０、好ましくは正確に１０のグアノシン体が隣接し、その５’末端に少なくとも１０、好ましくは正確に１０のグアノシン体が隣接している。非常に好ましい実施態様では、上記ＩＳＳ-ＮＡはパリンドローム配列を含むＡ型ＣｐＧであり、該パリンドローム配列は、その５’末端に３から１０のグアノシン体が隣接し、その３’末端に３から１０のグアノシン体が隣接している。更により好ましい実施態様では、上記ＩＳＳ-ＮＡはパリンドローム配列を含むＡ型ＣｐＧであり、該パリンドローム配列は配列番号２８であり、該パリンドローム配列はその５’末端に３から１０のグアノシン体が隣接し、該パリンドローム配列はその３’末端に３から１０のグアノシン体が隣接している。これらの免疫賦活性物質は効率的にＶＬＰにパッケージ化することができ、パッケージ化効率は、典型的には、５’及び／又は３’末端の隣接グアノシン体の数が増加するにつれて減少する。
本発明の非常に好ましい実施態様では、非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、（ａ）「Ｇ８−８」ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号２５）；（ｂ）「Ｇ９−９」ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号：２６）；又は（ｃ）「Ｇ１０」ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号２７）からなる群から選択される配列を含むか、あるいはそれらから本質的になるか、あるいはそれらからなる。後者はインビトロにおいて血球細胞を刺激することができることが過去に見出されている（Kuramoto E.等, Japanese Journal Cancer Research 83, 1128-1131 (1992)）。
特に好ましい実施態様では、非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、「Ｇ１０」（配列番号２７）を含むか、あるいはそれらから本質的になるか、あるいはそれらからなり、好ましくは上記Ｇ１０は専らホスホジエステル結合ヌクレオチドからなり、更に好ましくは、上記Ｇ１０は、実施例２に記載したＨＰＬＣ条件下でＱβカプシド標準に対して８０から１２０％、最も好ましくは８０から９５％の保持時間を有する凝集Ｇ１０である。
更に特に好ましい実施態様では、非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、「Ｇ９-９」（配列番号２６）を含むか、あるいはそれらから本質的になるか、あるいはそれらからなる。更に特に好ましい実施態様では、非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、「Ｇ８-８」（配列番号２５）を含むか、あるいはそれらから本質的になるか、あるいはそれらからなる。
更に好ましい実施態様では、上記ＩＳＳ-ＮＡは非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドであり、該非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドのＣｐＧモチーフはパリンドローム配列の一部であり、該非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、（ａ）“Ｇ３−６”ＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（配列番号２９）；（ｂ）“Ｇ４−６”ＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（配列番号３０）；（ｃ）“Ｇ５−６”ＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（配列番号３１）；（ｄ）「Ｇ６−６」ＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（配列番号３２）；ａｎｄ（ｅ）「Ｇ７−７」ＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号３３）；（ｆ）「Ｇ８−８」ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号２５）；（ｇ）「Ｇ９−９」ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号２６）；及び（ｈ）“Ｇ６”ＧＧＧＧＧＧＣＧＡＣＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号３４）から選択される核酸配列を含む。
本発明の更に好ましい実施態様では、ＩＳＳ-ＮＡは非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドであり、該非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドのＣｐＧモチーフはパリンドローム配列の一部であり、該パリンドローム配列はＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ（配列番号２８）であり、該パリンドローム配列には、その５’末端に少なくとも４で多くとも９のグアノシン体が隣接し、また 該パリンドローム配列には、その３’末端に少なくとも６で多くとも９のグアノシン体が隣接する。
本発明の他の好ましい実施態様では、免疫賦活性物質は非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドであり、該非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドのＣｐＧモチーフはパリンドローム配列の一部であり、該非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、（ａ）“Ｇ４−６”ＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（配列番号３０）；（ｂ）“Ｇ５−６”ＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（配列番号３１）；（ｃ）「Ｇ６−６」ＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（配列番号３２）；（ｄ）「Ｇ７−７」ＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号３３）；（ｅ）「Ｇ８−８」ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号２５）；及び（ｆ）「Ｇ９−９」ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号２６）から選択される核酸配列を有する。
本発明の他の好ましい実施態様では、ＩＳＳ-ＮＡは非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドであり、該非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドのＣｐＧモチーフはパリンドローム配列の一部であり、該非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、（ａ）“Ｇ４−６”ＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（配列番号３０）；（ｂ）“Ｇ５−６”ＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（配列番号３１）；（ｃ）「Ｇ６−６」ＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（配列番号３２）；（ｄ）「Ｇ７−７」ＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号３３）；（ｅ）「Ｇ８−８」ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号２５）；及び（ｆ）「Ｇ９−９」ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号２６）から選択される核酸配列を有する。
本発明の更に好ましい実施態様では、ＩＳＳ-ＮＡは非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドであり、該非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドのＣｐＧモチーフはパリンドローム配列の一部であり、該パリンドローム配列はＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ（配列番号２８）であり、該パリンドローム配列には、その５’末端に少なくとも５で多くとも８のグアノシン体が隣接し、また 該パリンドローム配列には、その３’末端に少なくとも６で多くとも８のグアノシン体が隣接する。
実験データは、上記ＩＳＳ-ＮＡ、好ましくはグアノシンが隣接したパリンドローム性の非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドであって、パリンドローム配列がＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ（配列番号２８）で、該パリンドローム配列には、その３’末端と５’末端に１０未満のグアノシン体が隣接したものを、粒子、好ましくはＶＬＰ中にパッケージする容易さが、パリンドローム配列に更に少ないグアノシン体が隣接する場合に増加することを示している。しかしながら、パリンドローム配列に隣接するグアノシン体の数を減少させると、インビトロでの血球細胞の刺激を減少させる。従って、パッケージ性は、示された発明の免疫賦活性物質の生物学的活性の減少によって賄われる。よって、好ましい実施態様はパッケージ性と生物学的活性の折衷である。
本発明の他の好ましい実施態様では、ＩＳＳ-ＮＡは非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドであり、上記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドのＣｐＧモチーフはパリンドローム配列の一部であり、上記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが（ａ）“Ｇ５−６” ＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（配列番号３１）；（ｂ）「Ｇ６−６」 ＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（配列番号３２）；（ｃ）「Ｇ７−７」 ＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号３３）；及び（ｄ）「Ｇ８−８」 ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号２５）から選択される核酸配列を有している。
本発明の非常に好ましい実施態様では、ＩＳＳ-ＮＡは非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドであり、上記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドのＣｐＧモチーフはパリンドローム配列の一部であり、上記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは配列番号２５（Ｇ８-８）の核酸配列を有している。
上で述べたように、ＶＬＰ中へのパッケージ化に使用される最適な配列はパッケージ性と生物学的活性の折衷である。このことを考慮に入れると、Ｇ８-８免疫賦活性物質は、なお合理的に良好にパッケージ化されていながら生物学的に高い活性を有するので、本発明の更なる非常に好ましい実施態様である。
更に好ましい実施態様では、上記ＩＳＳ-ＮＡは非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドであり、上記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、細胞、好ましくはＰＢＭＣ、脾臓細胞又はヒトｐＤＣにおけるＩＦＮ-αの産生を誘導可能であり、更に好ましくは、上記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、（ａ）Ｔ*Ｃ*Ｇ*Ｔ*Ｃ*Ｇ*Ｔ*Ｔ*Ｔ*Ｔ*Ｇ*Ｔ*Ｃ*Ｇ*Ｔ*Ｔ*Ｔ*Ｔ*Ｇ*Ｔ*Ｃ*Ｇ*Ｔ（２００６−ＰＳ，配列番号７６）；（ｂ）ＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（２２１６−ＰＯ，配列番号７７）；（ｃ）Ｇ*Ｇ*ＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ*Ｇ*Ｇ*Ｇ*Ｇ*Ｇ*Ｇ（２２１６−ＰＯコア，配列番号７７）；（ｄ）ＧＧＴＧＣＡＴＣＧＡＴＧＣＡＧＧＧＧＧＧ（Ｄ１９−ＰＯ，配列番号７８）；（ｅ）Ｇ*Ｇ*ＴＧＣＡＴＣＧＡＴＧＣＡＧ*Ｇ*Ｇ*Ｇ*Ｇ*Ｇ（Ｄ１９−ＰＯコア，配列番号７８）；（ｆ）ＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（Ｇ３−６，配列番号２９）；（ｇ）ＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（Ｇ４−６，配列番号３０）；（ｈ）ＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（Ｇ５−６，配列番号３１）；（ｉ）ＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（Ｇ６−６，配列番号３２）；（ｊ）ＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧ（Ｇ７−７，配列番号３３）；（ｋ）ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧ（Ｇ８−８，配列番号２５）；（ｌ）ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（Ｇ９−９，配列番号２６）；（ｍ）ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（Ｇ１０，配列番号２７）；及び（ｎ）ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（Ｇ１０２ｘ，配列番号７９）から選択され、ここで、*はホスホロチオエート修飾を示し、他の全てのヌクレオチドはホスホジエステル結合である。より好ましい実施態様では、上記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドはヒトｐＤＣにおいてＩＦＮ-αの産生を誘導可能であり、好ましくは上記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドはＴ*Ｃ*Ｇ*Ｔ*Ｃ*Ｇ*Ｔ*Ｔ*Ｔ*Ｔ*Ｇ*Ｔ*Ｃ*Ｇ*Ｔ*Ｔ*Ｔ*Ｔ*Ｇ*Ｔ*Ｃ*Ｇ*Ｔ（２００６−ＰＳ，配列番号７６）であり、ここで、*はホスホロチオエート修飾を示し、他の全てのヌクレオチドはホスホジエステル結合である。更により好ましい実施態様では、上記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドはＰＢＭＣ又は脾臓細胞においてＩＦＮ-αの産生を誘導可能であり、好ましくは上記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、（ａ）ＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（２２１６−ＰＯ，配列番号７７）；（ｂ）Ｇ*Ｇ*ＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣ*Ｇ*Ｇ*Ｇ*Ｇ*Ｇ*Ｇ（２２１６−ＰＯコア，配列番号７７）；（ｃ）ＧＧＴＧＣＡＴＣＧＡＴＧＣＡＧＧＧＧＧＧ（Ｄ１９−ＰＯ，配列番号７８）；（ｄ）Ｇ*Ｇ*ＴＧＣＡＴＣＧＡＴＧＣＡＧ*Ｇ*Ｇ*Ｇ*Ｇ*Ｇ（Ｄ１９−ＰＯコア，配列番号７８）；（ｅ）ＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（Ｇ３−６，配列番号２９）；（ｆ）ＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（Ｇ４−６，配列番号３０）；（ｇ）ＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（Ｇ５−６，配列番号３１）；（ｈ）ＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（Ｇ６−６，配列番号３２）；（ｉ）ＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧ（Ｇ７−７，配列番号３３）；（ｊ）ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧ（Ｇ８−８，配列番号２５）；（ｋ）ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（Ｇ９−９，配列番号２６）；（ｌ）ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（Ｇ１０，配列番号２７）；ａｎｄ（ｍ）ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（Ｇ１０２ｘ，配列番号７９）からなる群から選択され、ここで、*はホスホロチオエート修飾を示し、他の全てのヌクレオチドはホスホジエステル結合である。非常に好ましい実施態様では、上記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドはＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（Ｇ１０２ｘ，配列番号７９）であり、ここで好ましくは全てのヌクレオチドはホスホジエステル結合である。
更に好ましい実施態様では、上記ＩＳＳ-ＮＡはＣ型ＣｐＧであり、好ましくは上記Ｃ型ＣｐＧはパリンドローム配列を含み、更に好ましくは上記パリンドローム配列は配列番号５３から６０に示された配列の何れか一つから選択される。更に好ましい実施態様では、上記Ｃ型ＣｐＧは配列番号６４又は配列番号６５であり、好ましくは上記Ｃ型ＣｐＧの全核酸はホスホロチオエート結合性である。更に好ましいＣ型ＣｐＧは、（ａ）ＴＣｐＧＴＣＧＴＴＴＴＡＣＧＧＣＧＣＣＧＴＧＣＣＧ（配列番号６４）；（ｂ）ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＡＣｐＧＧＣｐＧＣＣｐＧＴＧＣＣＧ（配列番号６４）；（ｃ）ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＡＣｐＧＧＣＧＣＣｐＧＴＧＣＣＧ（配列番号６４）；及び（ｄ）ＴＣＧＴＣｐＧＴＴＴＴＡＣｐＧＧＣＧＣＣｐＧＴＧＣＣＧ（配列番号６４）からなる群から選択され、ここでｐはホスホジエステル結合を示し、全ての他のヌクレオチドはホスホロチオエート結合である。（ａ）ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＣＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＧ（配列番号６６）；（ｂ）ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＣＧＡＣＧＧＣＣＧＴＣＧ（配列番号６７）；（ｃ）ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＣＣＧＧＣＧＣＧＣＣＧＧ（配列番号６８）；（ｄ）ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＣＧＧＣＧＣＧＣＧＴＣＧ（配列番号６９）；（ｅ）ＴＣＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＧＴＣＧＴＣＧＴＴＴ（配列番号７０）；（ｆ）ＴＴＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＧＴＣＧＴＣＧＴＴＴ（配列番号７１）；（ｇ）ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＣＧＴＣＧＧＣＣＧＣＣＧ（配列番号７２）；（ｈ）ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＣＧＧＣＴＴＴＴＧＣＣＧ（配列番号７３）；（ｉ）ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＣＧＧＣＧＴＴＴＴＴＴＴ（配列番号７４）；及び（ｊ）ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＣＧＧＣＧＧＣＣＧＣＣＧ（配列番号７５）からなる群から選択されるＣ型ＣｐＧは、ＩＦＮ−αの産生の強力なインデューサーであり（Vollmer等 2004, Eur. J. Immunol. 43:351-262, p.253, その表１を参照のこと)、よって本発明において特に好ましいＩＳＳ-ＮＡである。
本発明の一実施態様は動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトにおける過敏症を治療し又は予防する方法に使用される組成物であり、該組成物は粒子と免疫賦活性核酸を含み、上記粒子に上記免疫賦活性核酸がパッケージされ、好ましくは上記過敏症はアレルギー性又は非アレルギー性過敏症である。本発明の組成物及び薬学的組成物は治療的並びに予防的処置において使用することができる。
好ましい実施態様では、上記過敏症は、（ａ）喘息、（ｂ）鼻炎、（ｃ）結膜炎、（ｄ）骨結膜炎、（ｅ）皮膚炎、（ｆ）蕁麻疹、及び（ｇ）アナフィラキシーからなる群から選択される。
更に好ましい実施態様では、上記過敏症はアレルギーであり、上記アレルギーは好ましくはＩｇＥ依存性アレルギー及び非ＩｇＥ依存性アレルギーから選択される。好ましい実施態様では、上記過敏症は喘息、好ましくはＩｇＥ依存性喘息であり、ここで、上記喘息は間欠又は慢性喘息でありうる。非常に好ましい実施態様では、上記過敏症はアトピー性喘息である。
更に好ましい実施態様では、上記過敏症は皮膚炎、好ましくは湿疹、最も好ましくはアトピー性湿疹である。
非常に好ましい実施態様では、上記過敏症はＩｇＥ依存性アレルギー（Ｉ型アレルギー）であり、好ましくは上記ＩｇＥ依存性アレルギーは天然に生じるアレルゲン、つまり花粉、獣皮、ハウスダスト、チリダニ等のような天然源に生じるアレルゲンに対するＩｇＥ依存性アレルギーである。
好ましい実施態様では、上記アレルギー、好ましくはＩｇＥ依存性アレルギーは、（ａ）花粉アレルギー（花粉症）、（ｂ）ハウスダストアレルギー、（ｃ）食物アレルギー、（ｄ）薬物アレルギー、（ｅ）昆虫毒アレルギー、好ましくは蜂毒アレルギー、及び（ｆ）動物アレルギー、好ましくはネコアレルギーからなる群から選択される。
更に好ましい実施態様では、上記アレルギー、好ましくは上記ＩｇＥ依存性アレルギーは、（ａ）花粉；（ｂ）ダスト、好ましくはハウスダスト；（ｃ）チリダニ；（ｄ）真菌類、好ましくはコウジカビ；（ｅ）哺乳動物の表皮、（ｆ）鳥の羽毛；（ｇ）昆虫、好ましくは蜂毒；（ｈ）食物、好ましくはイチゴ、キーウィ、ピーナッツ、又は小麦タンパク質；（ｉ）哺乳動物のフケ、好ましくはネコのフケ；（ｊ）唾液；（ｋ）血清；及び（ｌ）尿からなる群から選択される供給源に生じるアレルゲンに対するアレルギーである。更に好ましい実施態様では、上記アレルギー、好ましくは上記ＩｇＥ依存性アレルギーは、（ａ）樹木、（ｂ）草、（ｃ）動物産物、及び（ｄ）植物産物からなる群から選択される供給源に生じるアレルゲンに対するアレルギーである。更に好ましい実施態様では、上記アレルギー、好ましくは上記ＩｇＥ依存性アレルギーは、（ａ）蜂毒ホスホリパーゼＡ２；（ｂ）ブタクサ花粉Ａｍｂ ａ １；（ｃ）カバノキ花粉Ｂｅｔ ｖ Ｉ；（ｄ）白頭スズメバチ毒(white faced hornet venom)５Ｄｏｌ ｍ Ｖ；（ｅ）チリダニＤｅｒ ｐ １；（ｆ）チリダニＤｅｒ ｆ ２；（ｇ）チリダニＤｅｒＰ ２；（ｈ）チリダニＬｅｐ ｄ；（ｉ）真菌アレルゲンＡｌｔ ａ １；（ｊ）真菌アレルゲンＡｓｐ ｆ １；（ｋ）真菌アレルゲンＡｓｐ ｆ １６；及び（ｌ）ピーナッツアレルゲンからなる群から選択される抗原に対するアレルギーである。
更に好ましい実施態様では、上記アレルギー、好ましくは上記ＩｇＥ依存性アレルギーは、ネコアレルゲンに対するアレルギー、好ましくはＦｅｌＤ１抗原に対するアレルギーである。更に好ましい実施態様では、上記アレルギー、好ましくは上記ＩｇＥ依存性アレルギーは、チリダニに対するアレルギーであり、好ましくは上記チリダニは、（ａ）ヤケヒョウヒダニ、（ｂ）コナヒョウヒダニ、（ｃ）デルマトフィルス・ミクロセラス（D. microceras）、（ｄ）ユーログリファス・マイネイ（Euroglyphus maynei）、（ｅ）Ｇｌｙｃｙｐｈａｇｕｓ ｓｐ．、（ｆ）キナコダニ、（ｇ）ネッタイタマニクダニから選択される。
更に好ましい実施態様では、上記アレルギー、好ましくは上記ＩｇＥ依存性アレルギーは、花粉アレルギー（花粉症）である。更に好ましい実施態様では、上記アレルギー、好ましくは上記ＩｇＥ依存性アレルギーはハウスダストアレルギー、好ましくはハウスダストに含まれるチリダニアレルゲンに対するＩｇＥ依存性アレルギーであり、上記チリダニアレルゲンは好ましくは（ａ）Ｄｅｒ ｐ １；（ｂ）Ｄｅｒ ｆ ２；及び（ｃ）ＤｅｒＰ ２からなる群から選択される。
本発明は、とりわけ、粒子、好ましくはＶＬＰに、ＩＳＳ-ＮＡ、好ましくは非メチル化Ｃ及びＧに富む一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド（ＣｐＧ）をパッケージできるという知見に関する。
従って、本発明の好ましい実施態様は、動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトにおける過敏症を治療し又は予防する方法に使用される組成物であり、該組成物はＶＬＰと非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを含有し、上記ＶＬＰに上記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドがパッケージされている。
本発明の更に好ましい実施態様は、ヒトにおけるアレルギーを治療し又は予防する方法に使用される組成物であり、該組成物はＲＮＡバクテリオファージのＶＬＰと非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを含み、上記ＲＮＡバクテリオファージのＶＬＰに上記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドがパッケージされ、好ましくは上記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドがＧ１０（配列番号２７）である。
本発明の非常に好ましい実施態様は、ヒトにおけるアレルギーを治療し又は予防する方法に使用される組成物であり、該組成物はＲＮＡバクテリオファージＱβのＶＬＰと非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドＧ１０（配列番号２７）を含有し、上記ＲＮＡバクテリオファージＱβのＶＬＰに上記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドＧ１０がパッケージされている。
本発明の更なる実施態様は、本発明の組成物の製造方法及び上記組成物を使用して過敏症を治療する方法であり、好ましくは上記過敏症はアトピー性喘息、Ｉ型アレルギー又はアトピー性湿疹である。
本発明は、動物における過敏症の治療方法に使用される組成物を製造する方法を提供し、該組成物はＶＬＰと非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを含有し、上記ＶＬＰには上記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドがパッケージされ、上記方法は（ｉ）上記ＶＬＰ（ａ）を上記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド（ｂ）と共にインキュベートし、（ｉｉ）ＲＮエースを添加し；及び（ｉｉｉ）上記組成物を精製する工程を含む。好ましい実施態様では、上記ＶＬＰは細菌発現系において産生される。他の好ましい実施態様では、上記ＲＮエースはＲＮエースＡである。
更に好ましい実施態様では、上記方法は、（ｉ）上記ＶＬＰをＲＮエースと共にインキュベートし、（ｉｉ）上記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチを添加し；及び（ｉｉｉ）上記組成物を精製する工程を含む。好ましい実施態様では、上記ＶＬＰは細菌発現系において産生される。他の好ましい実施態様では、上記ＲＮエースはＲＮエースＡである。
更に好ましい実施態様では、上記方法は、（ｉ）上記ＶＬＰを分解し；（ｉｉ）上記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを加え；及び（ｉｉｉ）上記ＶＬＰを再構築する工程を含む。更なる実施態様では、上記方法は分解したＶＬＰから核酸を除去する工程を更に含む。あるいは、上記方法は少なくとも部分的に分解されたＶＬＰの核酸を除去し、及び／又は再構築後に組成物を精製する工程を更に含む。好ましい実施態様では、上記ＶＬＰは、細菌発現系において産生される。更に好ましい実施態様では、上記方法の工程（ｉ）で言及された上記ＶＬＰは、ＲＮＡバクテリオファージのＶＬＰ、より好ましくは、（ａ）バクテリオファージＱβ、（ｂ）バクテリオファージＡＰ２０５、（ｃ）バクテリオファージＧＡ、及び（ｄ）バクテリオファージｆｒからなる群から選択されるＲＮＡバクテリオファージのＶＬＰである。非常に好ましい実施態様では、上記方法の工程（ｉ）で言及された上記ＶＬＰは、ＲＮＡバクテリオファージのＶＬＰ、より好ましくはＲＮＡバクテリオファージＡＰ２０５又はＱβ、最も好ましくはＱβのＶＬＰである。
更に好ましい実施態様では、上記方法の工程（ｉｉ）で言及された上記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、５から６０のヌクレオチド、好ましくは２０から４０のヌクレオチド、最も好ましくは約３０のヌクレオチドからなる。非常に好ましい実施態様では、上記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドはＡ型ＣｐＧ、好ましくは５’及び／又は３’端にポリＧモチーフを含むＡ型ＣｐＧである。更により好ましい実施態様では、上記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、（ａ）「Ｇ８−８」ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号２５）；（ｂ）「Ｇ９−９」ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号２６）；又は（ｃ）「Ｇ１０」ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号２７）、最も好ましくは配列番号２７からなる群から選択される。
更に好ましい実施態様では、上記方法は、（ｉ）上記ＶＬＰの核酸を加水分解可能な金属イオンを含む溶液中で上記ＶＬＰをインキュベートし；（ｉｉ）上記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを加え；及び（ｉｉｉ）上記組成物を精製する工程を含み、好ましくは工程（ｉ）の上記金属イオンは、（ａ）亜鉛（Ｚｎ）イオン；（ｂ）銅（Ｃｕ）イオン；（ｃ）鉄（Ｆｅ）イオン；（ｄ）（ａ）、（ｂ）及び／又は（ｃ）の少なくとも一つのイオンの任意の混合物からなる群から選択される。好ましい実施態様では、上記ＶＬＰは細菌発現系において産生される。
更に好ましい実施態様では、上記方法は、（ｉ）上記ＶＬＰの核酸を加水分解可能な金属イオンを含む溶液と共に上記ＶＬＰをインキュベートし；（ｉｉ）上記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを加え；及び（ｉｉｉ）上記組成物を精製する工程を含み、好ましくは工程（ｉ）の上記金属イオンは、（ａ）亜鉛（Ｚｎ）イオン；（ｂ）銅（Ｃｕ）イオン；（ｃ）鉄（Ｆｅ）イオン；（ｄ）（ａ）、（ｂ）及び／又は（ｃ）の少なくとも一つのイオンの任意の混合物からなる群から選択される。好ましい実施態様では、上記ＶＬＰは細菌発現系において産生される。
更に好ましい実施態様では、上記方法は、（ｉ）上記ＶＬＰを脱安定化可能な溶液と共に上記ＶＬＰをインキュベートし、（ｉｉ）上記溶液からコートタンパク質を精製し；及び（ｉｉｉ）非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの存在下で上記ＶＬＰを再構築する工程を含み、好ましくは上記ＶＬＰを脱安定化可能な上記溶液が塩化マグネシウムを含み、更に好ましくは上記塩化マグネシウムの濃度が０．２から１．５Ｍ、より好ましくは０．４から１Ｍ、最も好ましくは約０．７Ｍであり；更により好ましくは上記ＶＬＰがバクテリオファージＱβのＶＬＰである。非常に好ましい実施態様では、上記方法は、（ｉ）上記ＶＬＰを脱安定化可能な溶液と共に上記ＶＬＰをインキュベートし、（ｉｉ）上記溶液からコートタンパク質を精製し；及び（ｉｉｉ）非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの存在下で上記ＶＬＰを再構築する工程を含み、好ましくは上記ＶＬＰを脱安定化可能な上記溶液が塩化マグネシウムを含み、更に好ましくは上記塩化マグネシウムの濃度が０．２から１．５Ｍ、より好ましくは０．４から１Ｍ、最も好ましくは約０．７Ｍであり；更により好ましくは上記ＶＬＰがバクテリオファージＱβのＶＬＰであり、更により好ましくは上記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドがＧ１０（配列番号２７）であり、最も好ましくは上記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが、実施例２に記載したＨＰＬＣ条件下でＱβカプシド標準に対して８０から１２０％、最も好ましくは８０から９５％の保持時間を有する凝集Ｇ１０である。
更に好ましい実施態様では、上記方法は、（ｉ）上記ＶＬＰをアルカリ性条件下、好ましくはＮａＯＨの存在下、最も好ましくは約２５ｍＭのＮａＯＨの存在下でインキュベートし；（ｉｉ）上記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを加え；及び（ｉｉｉ）上記組成物を精製する工程を含む。
非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを、分解されたＶＬＰに該オリゴヌクレオチドを加える前に、オリゴヌクレオチド凝集体の形成を支える条件下にすることによって、上記ＶＬＰの上記再構築の効率を改善することができ、また再構築したＶＬＰの安定性を改善することができることが見出された。オリゴヌクレオチドの凝集状態を制御する条件は、Guschlbauer W., Journal of Biomolecular Structure & Dynamics, ISSN 0739-1102, Volume 8, Issue Number 3 (1990). Title: Four-Stranded Nucleic Acid Structures 25 Yearsに記載されている。オリゴヌクレオチドの凝集は、例えばイオン条件、オリゴヌクレオチドの濃度、ｐＨ、温度条件及びインキュベーション時間によって影響される。更に、オリゴヌクレオチドの凝集が、その５’及び／又は３’端にポリＧモチーフを含むＡ型オリゴヌクレオチド、最も好ましくはＧ１０（配列番号２７）に対して特に有利であることが見出された。非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの凝集に対する好ましい条件は実施例２において例示している。最適な凝集条件は異なる非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの間で変動し、同じ非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの異なったバッチ間でさえも変動しうる。非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの実際の凝集状態は、ＨＰＬＣによって、好ましくは実施例２に記載の条件下で評価することができる。
よって、本発明の更なる実施態様では、本発明は、（ｉ）上記ＶＬＰを分解し；（ｉｉ）上記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを加え；及び（ｉｉｉ）上記ＶＬＰを再構築する工程を含む方法を提供し、ここで、上記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの上記添加の前に、該方法は、オリゴヌクレオチド凝集体の形成を支える条件下で上記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドをインキュベートする更なる工程を含む。好ましい実施態様では、上記インキュベーションは、７０から１００℃の温度、好ましくは約８５℃にて、好ましくはナトリウムイオンの存在下で実施される。更により好ましい実施態様では、上記インキュベーションは、１００〜２５０μｍ、好ましくは約１７５μｍの上記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの濃度で、２００から５００ｍＭのナトリウムイオンの存在下、好ましくは約２５０ｍＭのナトリウムイオンの存在下で、好ましくは８５℃で約１０分間、実施され、更に好ましくは、上記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドはその５’及び／又は３’端にポリＧモチーフを含む。更により好ましい実施態様では、上記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、（ａ）「Ｇ８−８」ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号２５）；（ｂ）「Ｇ９−９」ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号２６）；又は（ｃ）「Ｇ１０」ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号２７）からなる群から選択され、最も好ましくは上記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドはＧ１０（配列番号２７）であるい。更に好ましい実施態様では、オリゴヌクレオチド凝集体の形成を支える上記条件は、凝集した非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、好ましくは凝集したＧ１０（配列番号２７）が得られるように選択され、上記凝集した非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、好ましくは上記凝集したＧ１０（配列番号２７）は、実施例２に記載したＨＰＬＣ条件下でＱβカプシド標準に対して８０から１２０％、最も好ましくは８０から９５％の保持時間を示す。
本発明は更に動物における過敏症を治療する方法に使用される組成物の製造方法を提供し、該組成物は、（ａ）バクテリオファージＱβのウイルス様粒子ＶＬＰ、及び（ｂ）非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを含み；上記ウイルス様粒子（ａ）には上記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド（ｂ）がパッケージされ、上記方法は、（ｉ）上記ＶＬＰを脱安定化可能な溶液と共に上記ＶＬＰをインキュベートし、（ｉｉ）上記溶液からコートタンパク質を精製し；及び（ｉｉｉ）非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドと酸化剤の存在下でＶＬＰに上記コートタンパク質を再構築する工程を含む。好ましい実施態様では、上記ＶＬＰを脱安定化可能な上記溶液は塩化マグネシウムと還元剤を含み、好ましくは上記塩化マグネシウムの濃度は０．２から１．５Ｍ、より好ましくは０．４から１Ｍ、最も好ましくは約０．７Ｍであり；更に好ましくは上記還元剤はＤＴＴであり、更により好ましくは上記ＤＴＴの濃度は１から１００ｍＭ、好ましくは２から１５ｍＭ、より好ましくは約１０ｍＭ、最も好ましくは約１０ｍＭである。更に好ましい実施態様では、上記酸化剤はＨ２Ｏ２であり、更に好ましくは該Ｈ２Ｏ２の濃度は、１から５０ｍＭ、好ましくは１から１０ｍＭ、最も好ましくは約７ｍＭである。更に好ましい実施態様では、上記コートタンパク質の上記再構築は、塩の存在下で実施され、ここで好ましくは上記塩はＮａＣｌであり、更に好ましくは該塩、好ましくは上記ＮａＣｌの濃度が１００ｍＭから１Ｍ、より好ましくは１００ｍＭから５００ｍＭ、最も好ましくは約２５０ｍＭである。更に好ましい実施態様では、上記コートタンパク質のＶＬＰへの上記再構築の前に、上記精製したコートタンパク質を、塩、還元剤及び非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを含有する溶液中でインキュベートし、ここで好ましくは（ｉ）上記塩はＮａＣｌであり、更に好ましくは上記塩、好ましくは上記ＮａＣｌの濃度は１００ｍＭから１Ｍ、より好ましくは１００ｍＭから５００ｍＭ、最も好ましくは約２５０ｍＭであり；（ｉｉ）上記尿素の濃度は１００ｍＭから７Ｍ、より好ましくは５００ｍＭから２Ｍ、最も好ましくは約１Ｍであり；（ｉｉｉ）上記還元剤はＤＴＴであり、好ましくは上記ＤＴＴの濃度は１から１０ｍＭ、好ましくは１から５ｍＭ、最も好ましくは２．５ｍＭである。更に好ましい実施態様では、上記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドはＧ１０（配列番号２７）であり、最も好ましくは上記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、実施例２に記載したＨＰＬＣ条件下でＱβカプシド標準に対して８０から１２０％、最も好ましくは８０から９５％の保持時間を有する凝集したＧ１０である。
本発明は動物における過敏症を治療する方法に使用される組成物を更に提供し、該組成物はここに開示された方法の何れか一つによって得ることができる。
上述の本発明の組成物の製造方法は上記ＶＬＰの代わりにウイルス粒子を使用して実施することもまたでき、該ウイルス粒子は、好ましくは、バクテリオファージ、好ましくはＲＮＡバクテリオファージのウイルス粒子である。
特に、本発明は動物における過敏症を治療する方法に使用される組成物を提供し、該組成物は、（ｉ）ＶＬＰを非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドと共にインキュベートし；（ｉｉ）ＲＮエースを添加し；及び（ｉｉｉ）上記組成物を精製する工程を含む方法によって得ることができる。好ましい実施態様では、上記ＶＬＰは細菌発現系において産生される。他の好ましい実施態様では、上記ＲＮエースはＴＮエースＡである。
本発明は更に動物における過敏症を治療する方法に使用される組成物を提供し、該組成物は、（ｉ）ＶＬＰをＲＮエースと共にインキュベートし；（ｉｉ）非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを添加し；及び（ｉｉｉ）上記組成物を精製する工程を含む方法によって得ることができる。好ましい実施態様では、上記ＶＬＰは細菌発現系において産生される。他の好ましい実施態様では、上記ＲＮエースはＴＮエースＡである。
本発明は更に動物における過敏症を治療する方法に使用される組成物を提供し、該組成物は、（ｉ）ＶＬＰを分解し；（ｉｉ）非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを添加し；及び（ｉｉｉ）上記ＶＬＰを再構築する工程を含む方法によって得ることができる。更なる実施態様では、上記方法は分解されたＶＬＰから核酸を除去する工程を更に含む。あるいは、上記方法は、少なくとも部分的に分解されたＶＬＰの核酸を除去し、及び／又は再構築の後に組成物を精製する工程を更に含む。好ましい実施態様では、上記ＶＬＰは細菌発現系において産生される。
本発明は更に動物における過敏症を治療する方法に使用される組成物を提供し、該組成物は、（ｉ）ＶＬＰを、該ＶＬＰの核酸を加水分解可能な金属イオンを含む溶液と共にインキュベートし；（ｉｉ）非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを添加し；及び（ｉｉｉ）上記組成物を精製する工程を含む方法によって得ることができ、好ましくは工程（ｉ）の上記金属イオンは、（ａ）亜鉛（Ｚｎ）イオン；（ｂ）銅（Ｃｕ）イオン；（ｃ）鉄（Ｆｅ）イオン；（ｄ）（ａ）、（ｂ）及び／又は（ｃ）の少なくとも一つのイオンの任意の混合物からなる群から選択される。好ましい実施態様では、上記ＶＬＰは細菌発現系において産生される。
本発明は更に動物における過敏症を治療する方法に使用される組成物を提供し、該組成物は、（ｉ）ＶＬＰを、該ＶＬＰの核酸を加水分解可能な金属イオンを含む溶液と共にインキュベートし；（ｉｉ）非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを添加し；及び（ｉｉｉ）上記組成物を精製する工程を含む方法によって得ることができ、好ましくは工程（ｉ）の上記金属イオンは、（ａ）亜鉛（Ｚｎ）イオン；（ｂ）銅（Ｃｕ）イオン；（ｃ）鉄（Ｆｅ）イオン；（ｄ）マグネシウム（Ｍｇ）イオン；及び（ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び／又は（ｄ）の少なくとも一つのイオンの任意の混合物からなる群から選択される。好ましい実施態様では、上記ＶＬＰは細菌発現系において産生される。
本発明は更に動物における過敏症を治療する方法に使用される組成物を提供し、該組成物は、（ｉ）上記ＶＬＰを、該ＶＬＰを脱安定化可能な溶液と共にインキュベートし、ここで好ましくは該ＶＬＰはバクテリオファージＱβのＶＬＰであり；（ｉｉ）上記溶液からコートタンパク質を精製し；及び（ｉｉｉ）非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド及び酸化剤の存在下で上記コートタンパク質をＶＬＰに再構築する工程を含む方法によって得ることができる。好ましい実施態様では、上記ＶＬＰを脱安定化可能な上記溶液は塩化マグネシウムと還元剤を含有し、好ましくは上記塩化マグネシウムの濃度が０．２から１．５Ｍ、より好ましくは０．４から１Ｍ、最も好ましくは約０．７Ｍであり；更に好ましくは上記還元剤はＤＴＴであり、更により好ましくは上記ＤＴＴの濃度は１から１００ｍＭ、好ましくは２から１５ｍＭ、より好ましくは約１０ｍＭ、最も好ましくは約１０ｍＭである。更に好ましい実施態様では、上記酸化剤はＨ２Ｏ２であり、更に好ましくは該Ｈ２Ｏ２の濃度は、１から５０ｍＭ、好ましくは１から１０ｍＭ、最も好ましくは約７ｍＭである。更に好ましい実施態様では、上記コートタンパク質のＶＬＰへの上記再構築は、塩の存在下で実施され、ここで好ましくは上記塩はＮａＣｌであり、更に好ましくは該塩、好ましくは上記ＮａＣｌの濃度が１００ｍＭから１Ｍ、より好ましくは１００ｍＭから５００ｍＭ、最も好ましくは約２５０ｍＭである。更に好ましい実施態様では、上記コートタンパク質のＶＬＰへの上記再構築の前に、上記精製したコートタンパク質を、塩、還元剤及び非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを含有する溶液中でインキュベートし、ここで好ましくは（ｉ）上記塩はＮａＣｌであり、更に好ましくは上記塩、好ましくは上記ＮａＣｌの濃度は１００ｍＭから１Ｍ、より好ましくは１００ｍＭから５００ｍＭ、最も好ましくは約２５０ｍＭであり；（ｉｉ）上記尿素の濃度は１００ｍＭから７Ｍ、より好ましくは５００ｍＭから２Ｍ、最も好ましくは約１Ｍであり；及び（ｉｉｉ）上記還元剤はＤＴＴであり、好ましくは上記ＤＴＴの濃度は１から１０ｍＭ、好ましくは１から５ｍＭ、最も好ましくは２．５ｍＭである。更に好ましい実施態様では、上記記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドはＧ１０（配列番号２７）であり、最も好ましくは上記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、実施例２に記載したＨＰＬＣ条件下でＱβカプシド標準に対して８０から１２０％、最も好ましくは８０から９５％の保持時間を有する凝集Ｇ１０である。
本発明は更に動物における過敏症を治療する方法に使用される組成物を提供し、該組成物は、（ｉ）上記ＶＬＰをアルカリ性条件下、好ましくはＮａＯＨの存在下、最も好ましくは約２５ｍＭのＮａＯＨの存在下でインキュベートし；（ｉｉ）上記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを加え；及び（ｉｉｉ）上記組成物を精製する工程を含む方法によって得ることができる。
本発明は更に医薬として使用される組成物を提供し、該組成物は本発明の方法の何れか一つによって得ることができ、上記組成物は粒子とＩＳＳ-ＮＡを含み、上記粒子には上記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドがパッケージされ、上記粒子は好ましくはＲＮＡバクテリオファージ、最も好ましくはＲＮＡバクテリオファージＱβのＶＬＰであり、好ましくは上記ＩＳＳ-ＮＡは非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドであり、上記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは好ましくは専らホスホジエステル結合ヌクレオチドからなり、更に好ましくは上記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは配列番号２８のパリンドローム配列を含み、最も好ましくは上記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドはＧ１０（配列番号２７）である。
本発明は更に動物における過敏症、好ましくはアレルギー、最も好ましくはアトピー性喘息、アトピー性湿疹、花粉アレルギー、ハウスダスト又はチリダニアレルギーを治療する方法に使用される組成物を提供し、該組成物は本発明の方法の何れか一つによって得ることができ、上記組成物は（ａ）ＶＬＰと（ｂ）非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを含み、上記ウイルス様粒子（ａ）には上記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド（ｂ）がパッケージされ、上記ＶＬＰは好ましくはＲＮＡバクテリオファージ、最も好ましくはＲＮＡバクテリオファージＱβのＶＬＰであり、上記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは好ましくは専らホスホジエステル結合ヌクレオチドからなり、更に好ましくは上記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは配列番号２８のパリンドローム配列を含み、最も好ましくは上記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドはＧ１０（配列番号２７）である。
本発明は更に動物における過敏症、好ましくはアレルギー、最も好ましくはアトピー性喘息、アトピー性湿疹、花粉アレルギー、ハウスダスト又はチリダニアレルギーを治療する方法に使用される組成物を提供し、該組成物は本発明の方法の何れか一つによって得ることができ、上記組成物はＶＬＰと非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを含み、上記ウイルス様粒子には上記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドがパッケージされ、上記ＶＬＰは好ましくはＲＮＡバクテリオファージ、最も好ましくはＲＮＡバクテリオファージＱβのＶＬＰであり、上記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは好ましくは専らホスホジエステル結合ヌクレオチドからなり、更に好ましくは上記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは配列番号２８のパリンドローム配列を含み、最も好ましくは上記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドはＧ１０（配列番号２７）である。
本発明はまた動物における過敏症を治療し、予防し及び／又は減弱する方法に使用される薬学的組成物を提供する。本発明の薬学的組成物は、免疫学的に有効な量の本発明組成物を薬学的に許容可能な希釈剤、担体又は賦形剤と共に含有し、あるいはそれらからなる。薬学的組成物はまたアジュバントを含有していてもよい。
更なる実施態様では、上記薬学的組成物は本発明の組成物の徐放製剤を含む。徐放製剤は当該分野でよく知られている。典型的で好ましい徐放製剤は、微小粒子、エマルジョン、及びゲルとして製剤された本発明の組成物である。
一実施態様では、本発明はアトピー性湿疹を治療し又は予防するための薬学的組成物を提供する。他の実施態様では、本発明は喘息を治療し又は予防するための薬学的組成物を提供する。他の実施態様では、本発明はＩｇＥ依存性アレルギー（Ｉ型アレルギー）、好ましくは花粉アレルギー、ハウスダスト又はチリダストアレルギーを治療し又は予防するための薬学的組成物を提供する。
当業者には理解されるように、本発明の組成物が動物に投与される場合、それらは、塩、バッファー、アジュバント又は組成物の効能を改善するために望ましい他の物質を含む組成物の形態であってよい。薬学的組成物の調製に使用するのに適した物質の例は、REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES(Osol,A編, Mack Publishing Co., (1990))を含む多数の情報源に与えられている。
様々なアジュバントが宿主の種に応じて免疫学的応答を増加させるために使用され得、限定するものではないが、フロイント（完全及び不完全）、ミネラルゲル、例えば水酸化アルミニウム、界面活性剤、例えばリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、及び潜在的に有用なヒトアジュバント、例えばＢＣＣ（カルメット・ゲラン桿菌）及びコリネバクテリウム・パルバムが含まれる。このようなアジュバントはまた当該分野でよく知られている。 本発明の組成物と共に投与することができる更なるアジュバントには、限定されるものではないが、モノホスホリル脂質免疫調節物質、ＡｄｊｕＶａｘ１００ａ、ＱＳ−２１、ＱＳ−１８、ＣＲＬ１００５、アルミニウム塩（Ａｌｕｍ）、ＭＦ−５９、ＯＭ−１７４、ＯＭ−１９７、ＯＭ−２９４、イソマトリックス(isomatrix）、及びビロソームアジュバント技術が含まれる。アジュバントはまたこれらの物質の混合物を含みうる。
南アフリカの木Quillaja(キラヤ)Saponaria Molinaの樹皮から得られたアジュバント活性を有する免疫学的に活性なサポニン画分は当該分野で知られている。例えばＱＡ２１としても知られているＱＳ２１はQuillaja Saponaria Molinaの木からのＨｐｌｃ精製画分であり、その製造方法は（ＱＡ２１として）米国特許第５０５７５４０号に開示されている。キラヤサポニンはまたScott等, Int. Archs. Allergy Appl. Immun., 1985, 77, 409によってアジュバントとして開示されている。モノホスホリル脂質Ａとその誘導体は当該分野で知られている。好ましい誘導体は３デ-Ｏ-アシル化モノホスホリル脂質Ａであり、英国特許第２２２０２１１号から知られている。更に好ましいアジュバントは、その開示を出典明示によりここに援用する国際公開第００／００４６２号に記載されている。
本発明の組成物は、その投与がレシピエント個体によって許容可能である場合、「薬理学的に許容可能である」と言える。更に、本発明の組成物は、「治療的に有効な量」（すなわち、所望の生理学的効果を生じる量）で投与される。
本発明の組成物は、当該分野で知られている様々な方法によって投与することができる。選択される特定の形式は、選択される特定の組成物、治療される症状の重篤度、及び治療効果に必要とされる用量に当然ながら依存する。本発明の方法は、一般的に述べると、臨床上許容されない副作用を引き起こさずに有効レベルの活性化合物を生じる任意の形態を意味する、医学的に許容される投与形式の任意のものを使用して実施することができる。このような投与形式には、経口、直腸、非経口、大槽内、膣内、腹膜内、局所（粉末、軟膏、滴下剤又は経皮パッチによって）、頬投与、あるいは経口又は点鼻薬としての投与がある。ここで使用される「非経口的」なる用語は、静脈内、筋肉内、腹膜内、胸骨内、皮下及び関節内注射及び注入を含む投与形式を指す。本発明の組成物は、リンパ節に直接注射することもできる。微小粒子を含む組成物は好ましくは皮下、静脈内、皮内、腹腔内に注射され、鼻腔内、経口、経皮又は吸入投与される。
投与用の組成物の成分には、滅菌水溶液（例えば、生理食塩水）又は非水溶液及び懸濁液がある。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、及びオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルである。担体又は密封包帯を使用して、皮膚の浸透性を高め、抗原吸着を増大させることができる。
用量レベルは、投与形式、患者の性質、及び担体／アジュバント製剤の質に依存する。典型的な量は、患者当たり約０．００１μｇから約２０ｍｇの範囲内である。好ましい量は、一回の投与当たり５０μｇから１０００μｇ、より好ましくは１００μｇから６００μｇ、最も好ましくは３００μｇの本発明の組成物である。少なくとも約１０μｇ〜約５００μｇである。被験者を免疫化するために多重投与が好ましく、プロトコルは、問題の被験者に適合させた当分野の標準的なものである。更に好ましい量は、一患者当たり少なくとも約５０μｇから約５００μｇ、最も好ましくは一患者当たり３００μｇである。患者を治療するためには複数回の投与が好ましく、プロトコルは当該患者に適合させた当該分野で標準的なものである。上記組成物又は上記薬学的組成物の投与は、数回、好ましくは少なくとも３回から１０回、最も好ましくは３回から５回、毎週、毎月又は毎年の間隔で、好ましくは約１週間から約１ヶ月、より好ましくは２週間に一回、最も好ましくは毎週の間隔で繰り返される。非常に好ましい実施態様では、上記組成物又は上記薬学的組成物の投与は毎週間隔で６回繰り返され、好ましくはそれぞれの場合に５０μｇから約５００μｇ、最も好ましくは約３００μｇが投与される。
本発明の組成物は簡便には単位用量形態で提供することができ、製薬の分野でよく知られている任意の方法によって調製することができる。該方法は、本発明の組成物を、一又は複数の補助成分を構成する担体と組み合わせる工程を含む。一般に、該組成物は、本発明の組成物を均一かつ十分に液状担体、微細固形担体、又は両方と組合せ、ついで必要に応じて、生成物の形状を整えることによって調製される。
経口投与に適した組成物は、カプセル、錠剤又はトローチ剤などの、分離した単位として提供でき、それぞれが予め定まった量の本発明の組成物を含む。他の組成物には、水性液体又は非水性液体に懸濁させた懸濁液、例えばシロップ、エリキシル剤又はエマルジョンなどがある。
他の送達系は、時間放出、遅延放出又は徐放送達系を含みうる。このような系によって、上述の本発明の組成物の繰返し投与を避けることができ、患者及び医師に対する利便性が高まる。多くのタイプの放出送達系が利用可能であり、当業者に知られている。
本発明の更なる側面は、動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトにおける、過敏症、好ましくはアトピー性湿疹、アトピー性喘息又はＩｇＥ依存性アレルギー（Ｉ型アレルギー）を著領する方法であり、該方法は上記動物に（ｉ）粒子とＩＳＳ-ＮＡを含む組成物であって、上記粒子に上記ＩＳＳ-ＮＡがパッケージされたもの又は（ｉｉ）組成物（ｉ）の免疫学的に有効な量を薬学的に許容可能な希釈剤と共に含有する薬学的組成物を導入することを含み、好ましくは上記薬学的組成物（ｉｉ）は更にアジュバントを含む。好ましい実施態様では、上記組成物（ｉ）又は上記薬学的組成物（ｉｉ）は上記動物に皮下的、筋肉内、静脈内、鼻腔内、又はリンパ節に直接、導入される。更に好ましい実施態様では、組成物（ｉ）又は薬学的組成物（ｉｉ）の上記動物への上記導入は、１週間から３ヶ月、好ましくは１週間の間隔で、少なくとも２回、好ましくは少なくとも３回、最も好ましくは少なくとも４回、繰り返される。更により好ましい実施態様では、組成物（ｉ）又は薬学的組成物（ｉｉ）の上記動物への上記導入は、約１週間の間隔で６回繰り返され、好ましくは各回に約３００μｇの上記組成物（ｉ）が導入される。
本発明の好ましい実施態様は、動物におけるアレルギーの治療方法であり、上記方法は、（ａ）ＶＬＰ；及び（ｂ）非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを含有する組成物を上記動物に導入することを含み、上記ウイルス様粒子（ａ）には上記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド（ｂ）がパッケージされ、上記アレルギーが好ましくはアトピー性湿疹、喘息又はＩ型アレルギー、好ましくは花粉アレルギー（花粉症）であり、更に上記ＶＬＰはＲＮＡバクテリオファージ、好ましくはＲＮＡバクテリオファージＱβのＶＬＰであり、好ましくは上記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド（ｂ）は専らホスホジエステル結合ヌクレオチド、最も好ましくは配列番号２７からなる。
特定の疾患に対する本発明の治療の効果は、当該分野で知られている標準的な方法を使用して、上記疾患に関連する症状の重篤度を評価することによって評価することができる。一般的に、症状は、治療の開始前、つまり最初のワクチン接種の前、治療中の間隔において、及び最後の治療の１から３ヶ月後に直接スコア付けされる。アトピー性皮膚炎の症状は例えば、N. Engl. J. Med 1997, 337:816-21に記載されているようにしてスコア付けできる。喘息の症状は、Juniper等, Health Qual. Life Outcomes, 2005 Sep 16, 3:58に記載された質問状及びN. Engl. J. Med 2000, 343:1054-63に記載された質問状と肺機能のスパイトメトリー測定の組合せを含む様々な方法によってスコア付けされうる。これらの文献は出典明示によりここに援用される。花粉アレルギーは、とりわけ、鼻粘膜誘発試験を使用して評価することができ、他のアレルギー、例えばハウスダスト又はチリダニアレルギーは結膜誘発手順又は皮膚プリックテストを使用して評価することができる。これらの試験方法は実施例のセクションに詳細に記載する。
本発明の更なる側面は、動物における過敏症の治療のための医薬の製造における、本発明の組成物又は本発明の薬学的組成物の使用であり、上記過敏症はアレルギーであり、更に好ましくは上記アレルギーは、（ａ）アトピー性湿疹；（ｂ）アトピー性喘息；及び（ｃ）ＩｇＥ依存性アレルギー（Ｉ型アレルギー）、好ましくは花粉アレルギー（花粉症）又はハウスダストアレルギーからなる群から選択される。
本発明の好ましい実施態様は、動物における過敏症の治療のための医薬の製造における、粒子とＩＳＳ-ＮＡを含有し、該粒子に上記ＩＳＳ-ＮＡがパッケージされた組成物の使用であり、過敏症は、（ａ）アトピー性湿疹；（ｂ）アトピー性喘息；及び（ｃ）ＩｇＥ依存性アレルギー（Ｉ型アレルギー）、好ましくは花粉アレルギー（花粉症）からなる群から好ましくは選択され、更に好ましくは、上記粒子は、ＲＮＡバクテリオファージ、好ましくはＲＮＡバクテリオファージＱβのＶＬＰであり、好ましくは上記ＩＳＳ-ＮＡは非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドであり、好ましくは上記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは専らホスホジエステル結合ヌクレオチドからなり、より好ましくは上記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは配列番号２８のパリンドローム配列を含み、最も好ましくは上記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドはＧ１０（配列番号２７）である。
上記粒子がバクテリオファージＱβのＶＬＰである全ての側面と実施態様において、特に本発明の全ての組成物、方法、プロセス及び使用において、上記ＶＬＰは好ましくは本質的に配列番号３のアミノ酸配列を有するコートタンパク質からなる。上記ＩＳＳ-ＮＡが非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドＧ１０（配列番号２７）である全ての側面と実施態様において、特に本発明の全ての組成物、方法、プロセス及び使用において、上記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは好ましくは専らホスホジエステル結合ヌクレオチドからなる。
上記粒子がバクテリオファージＱβのＶＬＰであり、上記ＩＳＳ-ＮＡが非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドＧ１０（配列番号２７）である全ての側面と実施態様において、特に本発明の全ての組成物、方法、プロセス及び使用において、バクテリオファージＱβの上記ＶＬＰは好ましくは本質的に配列番号３のアミノ酸配列を有するコートタンパク質からなり、更に好ましくは、上記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは専らホスホジエステル結合ヌクレオチドからなる。
次の実施例は例示のためだけのものであり、特許請求の範囲によって定まる発明の範囲を限定することを意図するものではない。本発明の精神及び範囲を逸脱することなく、様々な変形と変更を本発明の方法においてなすことができることは当業者には明らかであろう。よって、本発明は、添付の特許請求の範囲に入る限り、本発明の変形例と変更例及びその均等物をカバーすることが意図される。
特段の記載がない限り、実施例において使用したバクテリオファージＱβのＶＬＰは、配列番号３のアミノ酸配列を有するコートタンパク質から本質的になるＶＬＰである。更に、特段の記載がない限り、実施例において使用した非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドＧ１０（配列番号２７）は専らホスホジエステル結合ヌクレオチドからなる非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドＧ１０（配列番号２７）である。
ここで言及される全ての特許、特許出願及び文献は明示的に出典明示によりその全体を援用する。
（実施例１）
ＡＰ２０５ＶＬＰ及びＱｂＶＬＰ中へのＣｐＧ-ＤＮＡ１６６８のパッケージ化の実施例
細菌で産生させたＶＬＰは、自己組織化に無作為にＶＬＰ中にパッケージ化された高レベルの一本鎖ＲＮＡを含んでおり、これは、ＲＮＡ／ＤＮＡ又はタンパク質の検出のために臭化エチジウム又はクーマシーブルーで染色された１％アガロースゲルで可視化できる。ＲＮＡは、ＲＮエースＡを用いた消化によって、ＣｐＧ ＤＮＡのパッケージ化の前にＶＬＰから除去されなければならない。従って、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４中の１ｍｇ／ｍｌのＶＬＰを３００μｇのＲＮエースＡと共に３７℃で３時間、インキュベートした。ＲＮエースＡ（及び加水分解したＲＮＡ）の除去のために、ＶＬＰを、１００'０００又は３００'０００ＭＷカットオフ膜を使用して２０ｍＭのＨＥＰＥＳに対して２−３日透析した。ついで、空になったＶＬＰにＣｐＧ-オリゴヌクレオチド１６６８-ＣｐＧ（ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＡＴＡＡＴ，配列番号８０）を補填し、これを１００ｎｍｏｌのＣｐＧを用いてホスホロチオエート骨格によって保護し（１ｍｌのＶＬＰ（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４中に１ｍｇ／ｍｌ，２ｍＭのＭｇＣｌ２）、３７℃で３時間のインキュベーション中に粒子内に自由拡散させた。ＣｐＧオリゴヌクレオチド含有ＶＬＰをＶＬＰを、３００'０００ＭＷカットオフ膜を使用してタンジェンシャルフロー濾過を介して未結合ＣｐＧ-オリゴヌクレオチドから精製した。臭化エチジウム又はクーマシーブルーで染色された１％のアガロースゲルはＲＮＡの除去に続くＣｐＧのＶＬＰ中へのパッケージ化を可視化させ、未結合のＣｐＧの除去を証明した。
実施例２
オリゴヌクレオチドＧ１０(配列番号２７)の脱凝集及び凝集と凝集状態の分析
脱凝集（１０．０ｍｌスケール，２６０μＭのＧ１０，２５ｍＭのＮａＯＨ，５０℃，７０分）：
４５．９１ｍｇのＧ１０を１５ｍｌの試験管中に計量した。粉末を１１．０ｍｌの精製水（ｃ＝３２５．３μＭ；光度計で検出）に溶解させた。８．０ｍｌのオリゴヌクレオチド溶液を、２５０μｌの１ＭのＮａＯＨ及び１．７５ｍｌの精製水と１５ｍｌの試験管中において（２６０μＭのＧ１０，２５ｍＭのＮａＯＨ）混合した。水浴中にて混合物を５０℃で７０分間、脱凝縮させた。氷で溶液を冷却した後、０．５ＭのＨＣｌを用いてｐＨをｐＨ５．３１まで調節し；５４０μｌの０．５ＭのＨＣｌと５μｌの１ＭのＮａＯＨを加えた。
凝集（１０．０ｍｌスケール，１７５μＭのＧ１０，２５０ｍＭのＮａＯＨ，８５℃，９−２４分）：
７．１ｍｌの脱凝縮Ｇ１０溶液、２．１３ｍｌの精製水及び７７０μｌの３ＭのＮａＣｌを１５ｍｌの試験管中で混合した（１７５μＭオリゴ，２５０ｍＭのＮａ＋）。混合物を水浴中にて８５℃で９分間、インキュベートした。溶液を氷／水浴で冷却し、使用するまで氷上に保存した。凝集オリゴヌクレオチド溶液は調製から３時間以内に使用されなければならない。
Ｇ１０の定量：
３４０ｎｍでの吸収によって補正した２６０ｎｍでの紫外線吸収によってＧ１０を定量した。１Ａ２６０−３４０＝２７．８μｇ／ｍｌ。
凝集状態の分析：
Ｇ１０の凝集状態を、標準としてＱβカプシドを使用し、次の条件を使用するＨＰＬＣによって分析した。
カラム： ＴＳＫｇｅ ｌ５０００ＰＷＸＬ ７．８ｍｍ×３０．０ｃｍ
（ロット：5PWX06GNMH3304,Art:08023, Tosoh Bioscience）
溶出剤： ＰＢＳ ｐＨ７．２
注入体積： ４０．０μｌ
流量： ０．８ｍｌ／分
勾配： 均一濃度
遂行時間： ２０分
波長： ２１５，２６０及び２８０ｎｍ，
２６０ｎｍでデータ評価
カラムオーブン温度： ２５℃
オートサンプラー温度： ８℃
Ｇ１０の相対保持時間Ｘ％は次のようにして計算した： Ｘ％＝ピーク開始時間［分］／保持時間（Qβカプシド）［分］×１００％。
脱凝集G１０は１３８％の相対保持時間を示した（１３６．９−１４０．３％；ｎ＝５）。上に記載した脱凝集／凝集処理を受けていないＧ１０調製物は同じ範囲での相対保持時間を示す。脱凝縮及び凝縮後、G１０の相対保持時間は１１８％であることが分かった。
実施例３
ＱβＶＬＰの分解：
ＰＢＳ（２０ｍＭのホスフェート，１５０ｍＭのＮａＣｌ，ｐＨ７．５）中の４５ｍｇのＱβＶＬＰ（２．５ｍｇ／ｍｌ，Ｂｒａｄｆｏｒｄ分析で定量）を、撹拌条件下で室温にて１５分間、１０ｍＭのＤＴＴで還元させた。ついで、塩化マグネシウムを０．７Ｍの最終濃度になるまで加え、インキュベーションを撹拌しながら室温で１５分間継続させると、カプセル化宿主細胞ＲＮＡが沈殿し、同時にＶＬＰの崩壊が生じた。その溶液を４℃にて４０００ｒｐｍで１０分間、遠心分離し（エッペンドルフ５８１０Ｒ，固定角度ロータＡ−４−６２を次の全工程で使用）、溶液から沈殿したＲＮＡを除去した。放出された二量体Ｑβコートタンパク質を含む上清をクロマトグラフィー精製工程に使用した。
カチオン交換クロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーによるＱβコートタンパク質の精製：
二量体コートタンパク質、宿主細胞タンパク質及び残留宿主細胞ＲＮＡを含む分解反応の上清をＳＰ-セファロースＦＦカラム(xk16/20, 6 ml, Amersham Bioscience)に充填した。カラムを２０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７）で平衡にし、試料を水に１：１５で希釈し、カラムへのコートタンパク質の適切な結合を達成するために１０ｍＳ／ｃｍ以下に伝導率を調節した。結合コートタンパク質の溶出は、２０ｍＭリン酸ナトリウム／５００ｍＭ塩化ナトリウムの一ステップ勾配によって達成し、タンパク質をおよそ２５ｍｌの画分体積で収集した。全工程中においてクロマトグラフィーを５ｍｌ／分の流量で室温にて実施し、２６０ｎｍ及び２８０ｎｍの吸光度をモニターした。第二の工程では、単離されたＱβコートタンパク質（カチオン交換カラムからの溶出画分）を、２０ｍＭのリン酸ナトリウム／２５０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．２で平衡にしたセファクリルＳ-１００ＨＲカラム（xk26/60, 320 ml, Amersham Bioscience）に充填した。クロマトグラフィーを２．５ｍｌ／分の流量で室温にて実施し、２６０ｎｍ及び２８０ｎｍの吸光度をモニターした。５ｍｌの画分を集めた。
分析的サイズ排除クロマトグラフィーによる精製Ｑβコートタンパク質の特徴付け：
精製したＱβコートタンパク質の試料を分析的サイズ排除クロマトグラフィーにより分析し(図１Ｃ)、ｉ）インタクトなＱβＶＬＰ (図１Ａ）（これは、大腸菌可溶化液から精製し、精製手順に対するソース材料として使用した）、及びｉｉ）分解反応の上清（図１Ｂ）と比較した。コートタンパク質からのＲＮＡ分子の効果的な分離は、図１ＣにおいてＲＮＡ様ピーク（典型比Ａ２８０／Ａ２６０＝０．５）がなく、独特のタンパク質様ピーク(典型比Ａ２８０／Ａ２６０＝１．７)が存在することによって示されている。
ダイアフィルトレーションによるＱβＧ１０の構築：
精製されたコートタンパク質（２０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２、２５０ｍＭのＮａＣｌ中）を水、尿素、ＮａＣｌ、ＤＴＴの原液及び凝集Ｇ１０オリゴヌクレオチド（本質的に実施例２に記載されたようにして調製したもの）と混合した。混合物の容積は５０ｍｌで、成分の最終濃度は、コートタンパク質１ｍｇ／ｍｌ、尿素１．０Ｍ、ＮａＣｌ ２５０ｍＭ、ＤＴＴ ２．５ｍＭ及びＧ１０ ０．２４ｍｇ／ｍｌであった。ついで、溶液を、３０ｋＤａのカットオフカートリッジ（Pellicon XL, Millipore）及び１０ｍｌ／分のクロスフロー流量及び２．５ｍｌ／分の透過流量を使用して、３００ｍｌの２０ｍＭリン酸ナトリウム、２５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２に対して室温で透析濾過した。Ｈ２Ｏ２を７ｍＭの最終濃度になるまで加え、その溶液を室温で１時間インキュベートしてジスルフィド結合を生じさせた。ついで、その溶液を、３００ｋＤａのカットオフカートリッジ（Pellicon XL, Millipore）及び１０ｍｌ／分のクロスフロー流量及び２．５ｍｌ／分の透過流量を使用して、５００ｍｌの２０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２に対して透析濾過し、構築されたＱβＧ１０産物から過剰のＨ２Ｏ２と非パッケージ化Ｇ１０オリゴヌクレオチドを除去した。
実施例４
ＱβＧ１０パッケージ化産物の分析とパッケージ化法の収率の決定
分析的サイズ排除クロマトグラフィーによるパッケージ化ＱβＶＬＰの特徴付け：
パッケージ化ＱβＶＬＰの試料を分析的サイズ排除クロマトグラフィーにより分析し（図２）、大腸菌溶解化液から精製したインタクトなＱβＶＬＰと比較した。生成物中の正しく組み立てられたＶＬＰの存在を、天然ＱβＶＬＰを表すピークと同じ保持時間で移動するピークによって確認した。ＱβＧ１０ＶＬＰ（図２Ｄ）に対して観察されたピークは、２６０ｎｍでの核酸の吸収係数がコートタンパク質の吸収係数より１００倍以上高いため、ＶＬＰの核酸量によって占められている。精製されたＱβＧ１０ＶＬＰの比Ａ２６０／Ａ２８０は１．７０（１．６５−１．７６；ｎ＝５）であることが見出され、これはＧ１０（Ａ２６０／Ａ２８０＝１．７４）に特徴的であり、ＱβＶＬＰの比Ａ２６０／Ａ２８０は１．８７（１．８５−１．９０；ｎ＝１０）であることが見出され、これはＲＮＡに特徴的である。
ＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析によるパッケージ化ＱβＧ１０ＶＬＰの特徴付け：
パッケージされたＱβＧ１０の試料を非還元的ＳＤＳ-ＰＡＧＥにより分析し（図３）、大腸菌可溶化液から精製したインタクトなＱβＶＬＰと比較した。生成物中における正しく組み立てられたＶＬＰの存在は、インビトロで組み立てられたＱβＧ１０ＶＬＰ中のコートタンパク質の正確な構造的配置を示すインタクトなＱβＶＬＰと同様に、コートタンパク質のジスルフィド結合五量体及び六量体形態のバンドの生成によって確認された。
パッケージ化オリゴヌクレオチドＧ１０の定量：
ＱβＧ１０ＶＬＰ（ＰＢＳ中０．２５ｍｇ／ｍｌ）の試料を０．１ｍＭのＴＣＥＰで処理し（室温で１５分）、ジスルフィド結合を還元した。ＮａＣｌを還元された試料（１Ｍの最終濃度）に加え、混合物を６０℃で１５分間インキュベートしてタンパク質成分を沈殿させた。遠心分離後、得られた上清を９５℃で５分間インキュベートし、氷で１分冷却して、Ａ２６０値を測定した。上清中のオリゴヌクレオチドＧ１０の濃度を次の式に従って計算した：
ｃ(Ｇ１０)(ｍｇ／ｍｌ)＝Ａ２６０×１．１２×９６００／３４４５８０
ここで、
１．１２＝試料中の塩含量に対する修正因子
９６００＝オリゴヌクレオチドＧ１０の分子量
３４４５８０＝オリゴヌクレオチドＧ１０の比モル吸収係数
典型的には、パッケージ化オリゴヌクレオチドＧ１０の量はＱβコートタンパク質１ｍｇ当たり０．２ｍｇであった。
ＱβＧ１０ＶＬＰのＧ１０含有量とパッケージ化反応の収率計算：
凝集したＧ１０を、実施例３に記載されているようにしてＶＬＰの組立／再構築によってＱβＶＬＰ中にパッケージ化した。９５３ｍｇのＧ１０オリゴヌクレオチドを４００ｍｇの精製Ｑβ二量体との再構築のために導入した。反応は、１００μｇのタンパク質当たり２０μｇのＧ１０オリゴヌクレオチドを含むＱβＧ１０を生じた（タンパク質量はBradford分析又はＨＰＬＣで定量した）。パッケージ化反応のＧ１０収率は７５％のタンパク質収率で６３％であった。
実施例５
分解／再構築によるＡＰ２０５及びＧＡ３５５ＶＬＰのパッケージ化
分解：
バッファーＡ（５ｍＭのＮａＰＯ４、ｐＨ６．８、１００ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＭｇＣｌ２）中の５０−１００ｍｇのＡＰ２０５又はＧＡ３５５ＶＬＰ（Bradford分析によって定量）を、それぞれ１ｍｇ／ｍｌ及び５Ｕ／ｍｌのＲＮエースＡ（Sigma）及びベンゾナーゼ（Novagen）と共に３０℃で１６時間インキュベートした。ＡＰ２０５ＶＬＰの場合は、内部ジスルフィド結合の脱酸素を、ＲＮエースＡとベンゾナーゼの添加に先立って実施した後、２０ｍＭのＤＴＴを添加し、３７℃で３０分インキュベートした。１ＭのＮａＣｌの添加後、７０℃で１５分のインキュベーションによってウイルスコートタンパク質の沈殿が誘導された。沈殿したコートタンパク質を、４℃、２７０００ｇで１０分間遠心分離して沈降させた。ＲＮエースＡ、ベンゾナーゼ及び分解した核酸を含む上清を捨てた。ペレットをバッファーＢ（２０ｍＭのＮａＰＯ４、ｐＨ７．２，６Ｍの尿素）中に再懸濁させ、室温で１０分間、インキュベートした。
カチオン交換クロマトグラフィーによるコートタンパク質の精製：
溶液を４℃、２７０００ｇで１０分間遠心分離して透明にした。 無視できるペレットは捨てた。そして、再構築されたコートタンパク質を含む上清を、バッファーＢで平衡にしたＳＰセファロースＴＭ ＦＦカラム(16/20, Amersham Biosciences)にかけた。通過物を捨てた。バッファーＢ（１５ＣＶ）での十分な洗浄後に、カラムを、３７．５ＣＶの勾配長で、バッファーＢからバッファーＣ（２０ｍＭのＮａＰＯ４ ｐＨ７．２，１Ｍの尿素）の線形勾配で調節した。２５４ｎｍ及び２８０ｎｍでの充填、洗浄及び溶出の間の吸光度をモニターした。コートタンパク質は、バッファーＤ（２０ｍＭのＮａＰＯ４ ｐＨ６．５，１Ｍの尿素，３００ｍＭのＮａＣｌ）での一画分として溶出させ、ＬＤＳ-ＰＡＧＥと続くクーマーシー染色によって分析した。溶出タンパク質画分を「分解コートタンパク質」として４℃で保存した。タンパク質濃度はBradford分析によって定量した。
再構築：
精製したＡＰ２０５又はＧＡ３５５コートタンパク質をＧ１０オリゴヌクレオチドに対して５倍の過剰量（ｗ／ｗ）で使用した。コートタンパク質を、１Ｍの尿素と２．５ｍＭのＤＴＴを含む再構築バッファー中のＧ１０オリゴヌクレオチドと混合し、室温で１時間インキュベートした。インキュベーション後、再構築混合物を、５リットルのＰＢＳに対して２４時間透析した。得られた懸濁液を２７０００ｇ、４℃で１０分間遠心分離した。無視できる沈降物を捨てた。上清は再構築されパッケージ化されたＶＬＰを含んでいた。タンパク質濃度はBradford分析によって定量し、組み立てられパッケージされたＶＬＰを遠心濾過装置(Amicon Ultra 15, 10K MWCO)で濃縮した。
再構築されパッケージ化されたＶＬＰの精製：
ＰＢＳで平衡にされたセファロースＴＭ ＣＬ-４Ｂ(26/60, Amersham Biosciences)上に２５ｍｇまでの全タンパク質を充填した。１．２５ｍｌ／分の流量で室温にて平衡バッファーを用いてサイズ排除クロマトグラフィーを実施した。溶出の間、２５４ｎｍと２６０ｎｍの吸光度をモニターした。二つのピークが分離された。主要な高分子量のピークが低見かけ分子量の小さなピークの前にあった。主要なピークはＳＥ-ＨＰＬＣによって示された精製ＶＬＰと一致した見かけ分子量を明らかにしていた。Ｇ１０オリゴヌクレオチドがパッケージされたＡＰ２０５又はＧＡ３５５ＶＬＰの分析は、国際公開第０３／０２４４８１号の実施例１６（p.131ff）に本質的に示されているようにして実施される。
実施例６
分解／再構築によるＧ１０でのＦＲＶＬＰのパッケージ化
分解：
バッファーＡ（５ｍＭのＮａＰＯ４、ｐＨ６．８、１００ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＭｇＣｌ２）中の５０−１００ｍｇのＦＲＶＬＰ（Bradford分析によって定量）を、それぞれ１ｍｇ／ｍｌ及び５Ｕ／ｍｌのＲＮエースＡ（Sigma）及びベンゾナーゼ（Novagen）と共に３０℃で１６時間インキュベートした。１ＭのＮａＣｌの添加後、７０℃で１５分のインキュベーションによってＦＲコートタンパク質の沈殿が誘導された。沈殿したコートタンパク質を、４℃、２７０００ｇで１０分間遠心分離して沈降させた。ＲＮエースＡ、ベンゾナーゼ及び分解した核酸を含む上清を捨てた。ペレットをバッファーＢ（２０ｍＭのＮａＰＯ４、ｐＨ７．２，６Ｍの尿素）中に再懸濁させ、室温で１０分間、インキュベートした。
カチオン交換クロマトグラフィーによるＦＲコートタンパク質の精製：
溶液を４℃、２７０００ｇで１０分間遠心分離して透明にした。 無視できるペレットは捨て、再構築されたコートタンパク質を含む上清を、バッファーＢで平衡にしたＳＰセファロースＴＭ ＦＦカラム(16/20, Amersham Biosciences)にかけた。通過物を捨てた。バッファーＢ（１５ＣＶ）での十分な洗浄後に、カラムを、３７．５ＣＶの勾配長で、バッファーＢからバッファーＣ（２０ｍＭのＮａＰＯ４ ｐＨ７．２，１Ｍの尿素）の線形勾配で調節した。２５４ｎｍ及び２８０ｎｍでの充填、洗浄及び溶出の間での吸光度をモニターした。ＦＲコートタンパク質は、バッファーＤ（２０ｍＭのＮａＰＯ４ ｐＨ６．５，１Ｍの尿素，３００ｍＭのＮａＣｌ）での一画分として溶出させ、ＬＤＳ-ＰＡＧＥと続くクーマーシー染色によって分析した。溶出タンパク質画分を「分解コートタンパク質」として４℃で保存した。タンパク質濃度はBradford分析によって定量した。
再構築：
精製したＦＲコートタンパク質をＧ１０オリゴヌクレオチドに対して５倍の過剰量（ｗ／ｗ）で使用した。ＦＲコートタンパク質を、１Ｍの尿素と２．５ｍＭのＤＴＴを含む再構築バッファー中のＧ１０オリゴヌクレオチドと混合し、室温で１時間インキュベートした。インキュベーション後、再構築混合物を、５リットルのＰＢＳに対して２４時間透析した。得られた懸濁液を２７０００ｇ、４℃で１０分間遠心分離した。無視できる沈降物を捨てた。上清は再構築されパッケージ化されたＦＲＶＬＰを含んでいた。タンパク質濃度はBradford分析によって定量し、組み立てられパッケージされたＦＲＶＬＰを遠心濾過装置(Amicon Ultra 15, 10K MWCO)で濃縮した。
再構築されパッケージ化されたＦＲＶＬＰの精製：
ＰＢＳで平衡にされたセファロースＴＭ ＣＬ-４Ｂ(26/60, Amersham Biosciences)上に２５ｍｇまでの全タンパク質を充填した。１．２５ｍｌ／分の流量で室温にて平衡バッファーを用いてサイズ排除クロマトグラフィーを実施した。溶出の間、２５４ｎｍと２６０ｎｍの吸光度をモニターした。二つのピークが分離された。主要な高分子量のピークが低見かけ分子量の小さなピークの前にあった。主要なピークはＳＥ-ＨＰＬＣによって示された精製ＦＲＶＬＰと一致した見かけ分子量を明らかにしていた。Ｇ１０オリゴヌクレオチドがパッケージされたＦＲＶＬＰの分析は、国際公開第０３／０２４４８１号の実施例１６（p.131ff）に本質的に示されているようにして実施される。
実施例７
リンパ節へのナノ粒子のサイズ依存性輸送
リンパ節への粒子状抗原の輸送メカニズムを研究するために、２０ｎｍから２０００ｎｍの範囲のサイズの黄緑色の蛍光ポリスチレンナノ粒子(Molecular probes)を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの足蹠に注射し（２５μｇ／足蹠）、追跡した。バクテリオファージＱβのＶＬＰをタンパク質標識キット(Molecular probes)を使用してＡｌｅｘａ４８８にカップリングさせ、３０ｎｍの蛍光粒子として実験に含めた。４８時間後に、ナノ粒子とＶＬＰを膝窩流入領域リンパ節（ＬＮ）においてフローサイトメトリーによって追跡した。膝窩ＬＮを単離し、１ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＤ(Boehringer)及び０．０４ｍｇ／ｍｌのＤＮエースＩ(Roche) で３７℃にて３０分間、消化させた。ナノ粒子を取り込む細胞集団を同定するために、ＬＮ細胞を抗ＣＤ１１ｃ-ＰＥ(BD)で染色した。フローサイトメトリー分析によって、注射から４８時間後に、ナノ粒子とＶＬＰは膝窩ＬＮに到達し、樹状細胞（ＤＣ、表１）を含むＬＮ細胞に異なったレベルで結合することが示された。ＬＮ細胞は大きな粒子（１０００−２０００ｎｍ）よりも小さな粒子（２０−５００）をより効率的に獲得した。ＶＬＰ-Ａｌｅｘａ４８８（３０ｎｍ）は２０ｎｍと１００ｎｍの間のポリスチレンナノ粒子のＬＮ取込み効果を示した。これらのデータは、ナノ粒子とＶＬＰがサイズに依存した形で注射部位からＬＮまで輸送され、顕著な輸送が２０から５００ｎｍの間のサイズの粒子で起こることを示唆している。
Figure 0005484732
実施例８
ＬＮへのＶＬＰの輸送の動態
ＬＮ細胞中へのナノ粒子の取り込みの動態を研究するために、ＶＬＰ-Ａｌｅｘａ４８８(実施例７に記載したようにして調製した)をＣ５７ＢＬ／６マウス(実施例７に記載したもの) に注射し、２時間後から９６時間後まで追跡した。ＬＮ細胞は次の抗体の組合せで染色した：抗ＣＤ１１ｃ-ＰＥ、抗ＣＤ１１ｂ-ＡＰＣ、抗ＣＤ１１ｃ-ビオチン、抗ＣＤ１９-ＡＰＣ、抗Ｂ２２０-ＰＥ、抗ＣＤ８-ＣｙＣｈｒ、抗ＣＤ４０-ＡＰＣ及びストレプトアビジン-ＣｙＣｈｒ（全てＢＤ由来）。フローサイトメトリー分析は、足蹠への注射の２時間後に、ＶＬＰ-Ａｌｅｘａ４８８が膝窩ＬＮからの抗原提示細胞（ＡＰＣ）に結合したことを示している（表２）。皮膚由来の樹状細胞がＶＬＰ-Ａｌｅｘａ４８８を取り込み２時間という短い間に流入領域ＬＮに輸送することは全く起こりそうになかった。これらの結果は、ＶＬＰ-Ａｌｅｘａ４８８が無細胞の形でリンパ系を通って流入領域リンパ節に流入したことをむしろ示唆している。マクロファージ及びＤＣは ＶＬＰ-Ａｌｅｘａ４８８を取り込む最も顕著な集団であった。最も重要なことは、注射から２時間後に、１．９％のＬＮ常在形質細胞様ＤＣがまたＶＬＰ-Ａｌｅｘａ４８８を獲得したことである。ヒトにおけるｐＤＣは大体は二次リンパ系組織に見出され、ＴＬＲ９を発現する唯一のＤＣ集団である。従って、ＶＬＰ-Ａｌｅｘａ４８８のＬＮへ自由に流入する能力は、それらを、ＶＬＰにパッケージされたＩＳＳ（例えばＣｐＧ）を同時に移送する可能性を持ち、ｐＤＣを標的とする非常に適切なベヒクルとする。
ＶＬＰ-Ａｌｅｘａ４８８の取り込みは、注射から２４時間後にピークに達し（表２）、４８時間までかなり安定したままで、９６時間後に低下した。その後の時点でまた、皮膚由来ＤＣが流入領域ＬＮへのＶＬＰ-Ａｌｅｘａ４８８の輸送に寄与する蓋然性が高い。確かに、ＶＬＰ-Ａｌｅｘａ４８８の取り込みの２時間（流入）と２４時間（ＤＣ媒介輸送）の間の比は、ＬＮにおいてもＶＬＰを獲得する（図４）リンパ球(CD11c+CD40loCD8+) ＤＣと比較して、骨髄（皮膚由来CD11c+CD40hiCD8-を含む）について低い。
Figure 0005484732
実施例９
インビボ画像処理によるナノ粒子の輸送の動態
２０及び５００ｎｍの蛍光ポリスチレンナノ粒子並びにＶＬＰ-Ａｌｅｘａ４８８の輸送を、４７０／４０ｎｍ励起フィルターと高解像度カメラ (KM_Dynax_5D)を装備したＵＶ光ツール(LT-99D2-220, Lightools Research, CA)を使用して、インビボで調査した。実施例７に記載のようにマウスの足蹠に蛍光ナノ粒子を注射し、注射後２、２４及び１９２時間に写真を撮った。フローサイトメトリーのデータ（表２）と一致して、注射２時間後に、ＶＬＰ-Ａｌｅｘａ４８８は、蛍光顕微鏡によって検出されているように、膝窩ＬＮに達した。ＶＬＰ（３０ｎｍ）と同様、２０ｎｍのナノ粒子（表３）もまた検出されており、これは、小さいナノ粒子が無細胞の形でＬＮに流れることができることを示唆している。これとは対照的に、この初期の時点では５００ｎｍのナノ粒子は膝窩ＬＮには検出されておらず（表３）、これは大きな粒子のＬＮへの遅い輸送動態を証明している。２０又は５００ｎｍのナノ粒子の注射から２時間後にフローサイトメトリー分析を実施した。これらの結果は、光ツール画像処理での知見を確認している（表３）。５００ｎｍの粒子の遅い輸送動態に対する一つの可能性は、それが注射部位でのＤＣ取り込みとＬＮへの輸送を介して部分的に起こることである。
注射の２４時間後に、５００ｎｍの粒子は蛍光顕微鏡で検出したところ流入領域ＬＮに達したが、付随した蛍光は、２０ｎｍ及びＶＬＰ-Ａｌｅｘａ４８８ナノ粒子を注射したマウスのＬＮにおいてよりも定量的に少なかった。後の時点（１９２時間）では、ＶＬＰ-Ａｌｅｘａ４８８、２０及び５００ｎｍ粒子は注射部位と膝窩ＬＮになおも存在しており、抗原の貯蔵所形成と連続的送達を示唆している。
併せると、これらのデータは、ナノ粒子のＬＮへの輸送のサイズ依存性メカニズムを示唆している。小粒子、例えば２０ｎｍ及びＶＬＰ-Ａｌｅｘａ４８８は無細胞の形で早い時点でＬＮまで流入する一方、大きな粒子（５００ｎｍ）はＤＣ媒介輸送の必要性のために遅い動態を示すことを示唆している。
Figure 0005484732
実施例１０
ＬＮへのナノ粒子の送達のＤＣ依存性
マクロファージは非遊走性細胞であると考えられ、よってマクロファージを担持する粒子はＬＮにおいて粒子を獲得したＬＮ常在細胞であると思われる。これに対して、ＤＣは注射部位で粒子を貪食し、流入領域ＬＮまで遊走する能力を有している。ナノ粒子のサイズとＬＮへの輸送のメカニズムの間の関係を調査するために、２０から２０００ｎｍの範囲の蛍光ナノ粒子を実施例７に記載したようにマウスの足蹠に注射し、ナノ粒子含有ＤＣとマクロファージの間の比を計算した（図５）。注射した粒子が大きくなればなるほど（５００−２０００ｎｍ）、より多くのＤＣがＬＮにおけるその取り込みに関与する。より小さい粒子（２０−２００ｎｍ）は匹敵する割合のＤＣ及びマクロファージで検出されており、細胞フリーの流入とＬＮ常在ＡＰＣとの結合が示唆される。
野生型マウス及びＤＣを条件枯渇させたマウス(CD11c-DTR-GFP mice, Jung S.等, 2002)におけるインビボ画像処理動態研究では、大きな粒子（５００ｎｍ）はＤＣの存在下でのみ流入領域ＬＮに達する一方、小さい（２０ｎｍ）ナノ粒子はＤＣ枯渇動物でもまた効果的に輸送されたことが示された。これらのデータは、小さいナノ粒子がリンパ節常在ＤＣ集団を標的とすることができることを示唆している。確かに、表４に示されるように、２０ｎｍの粒子とＶＬＰ（３０ｎｍ）はリンパ節常在形質細胞様ＤＣ（ＰＤＣＡ-１＋Ｂ２２０＋）、Ｂ細胞（ＰＤＣＡ-１−Ｂ２２０＋）及びリンパ様ＤＣ（ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８＋）に結合した。従って、小粒子はＬＮ錠剤ＡＰＣを標的とするのに有用である一方、大きな粒子は専ら注射部位でＤＣを標的とする。
Figure 0005484732
実施例１１
骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）の産生とＱβＧ１０バッチでの処理
ＬＰＳ耐性（Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ）及びＬＰＳ応答性（Ｃ３Ｈ／ＨｅＮ）株由来の１１週齢のマウスを屠殺し、大腿及び脛骨を単離し、ＰＢＳ中に保った。肉を除去後、骨を両側から切断し、１０％のＦＣＳ ＲＰＭＩを満たしたシリンジを使用して骨髄を流し出した。放出された細胞を集め、７０μｍの細胞ストレーナーを通過させた。細胞を洗浄し、１０ｎｇ／ｍｌのマウスＧＭ-ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ）を含む１０％のＦＣＳ ＲＰＭＩ中に２０×１０４細胞／ｍｌで再懸濁させた。２０×１０６細胞を６日間、１０ｍｌの培地中の細菌グレードのペトリ皿に蒔いた。ＣＤ１１ｃ及びＣＤ１１ｂの発現についてフローサイトメトリーによって細胞を分析することによって、ＢＭＤＣの分化状態を６日目に確認した。分化の６日目に、ＢＭＤＣをペトリ皿から回収し、一回洗浄し、５×１０４／ウェルで９６ウェルのＵ底プレート（ＢＤ）に蒔いた。ＱβＧ１０の６の希釈物（４倍）を別のプレートに調製し、２０時間の間、ＢＭＤＣに加えた。
ＩＬ-１２の定量のためのＥＬＩＳＡ：
コーティングバッファー（０．１ＭのＮａＨＣＯ３，ｐＨ９．６）中の２μｇ／ｍｌのラット抗マウスＩＬ-１２（ｐ４０／ｐ７０モノクローナル抗体（mAb, Pharmingen）をマイクロタイタープレート（Maxisorp, Nunc）に一晩被覆した。洗浄（０．０５％のＴｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ）及びブロッキング（２％のＢＳＡ／０．０５％のＴｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ）後、ＢＭＤＣの７０μｌの上清又は組み換えＩＬ−１２の２倍希釈物（２０μｇ／ｍｌから出発）を加え、室温（ＲＴ）で２時間インキュベートした。プレートを洗浄後、ビオチン標識ラット抗マウスＩＬ−１２ｍＡｂ（ｐ４０／ｐ７０，Pharmingen）を １μｇ／ｍｌで室温にて１時間加えた。プレートを洗浄し、室温で１時間、１μｇ／ｍｌのストレプトアビジン−ＨＲＰＯ（Jackson laboratories）と共にインキュベートした。洗浄後、クエン酸バッファー（ｐＨ５）中のｏ−フェニレンジアミン（OPD, Fluka）を５分間加え、反応を５％のＨ２ＳＯ４で停止させた。４９０ｎｍでの光学密度をＥＬＩＳＡリーダー（Molecular Devices）で測定し、ソフトウェアSoft max Proを使用してデータを解析した。
結果：
Ｇ１０オリゴがパッケージされたＱβによるＢＭＤＣの活性化は図６に示す。ＢＭＤＣはＱβＧ１０によって活性化され、よって用量依存的な形でＩＬ-１２を分泌した（用量はＱβＶＬＰ中にパッケージ化されたＧ１０オリゴヌクレオチドの当量として与える）が、未処理のコントロール細胞はＩＬ-１２を分泌しなかった。従って、ＱβＶＬＰ中にパッケージ化されたＧ１０オリゴヌクレオチドはＢＭＤＣを活性化させることができ、該粒子が細胞によって取り込まれ、続いてオリゴヌクレオチドがＢＭＤＣの刺激のために利用可能になることが実証された。
実施例１２
ＢＭＤＣはＡＰ２０５Ｇ１０での処理時にＩＬ-１２を放出する
Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウス由来のＢＭＤＣを実施例１１に記載されているようにしてインビトロで産生した。細胞を９６ウェルプレートに蒔き、モック又は標記した濃度のＧ１０を組み込んだＡＰ２０５（ＡＰ２０５Ｇ１０）で刺激した。１８時間後、上清を回収し、実施例１１に記載されているようにサンドウィッチＥＬＩＳＡによってＩＬ-１２を測定した。ＡＰ２０５Ｇ１０はＩＬ-１２の用量依存的な分泌を誘導したが、未処理細胞は基底レベルでのみＩＬ-１２を放出した（表５）。これらの結果は、ＡＰ２０５Ｇ１０がＢＭＤＣによって取り込まれ、それらを活性化してＩＬ-１２を放出させることを実証している。
Figure 0005484732
実施例１３
Ｇ１０オリゴデスオキシヌクレオチド（Ｇ１０-ＯＤＮ）のためのデリバリー系としてのゼラチンナノ粒子の調製と特徴付け
二工程脱溶媒和によるプレーンなゼラチンナノ粒子（ＧＮＰ）の調製：
使用した手順は、次のように(Coester等 2000)によって記載されたオリジナルなものである。１．２５ｇのゼラチンA型 (Bloom175) を２５ｍｌの高度に精製した水（ＨＰＷ）に、５０℃まで穏やかに加熱しながら５％（ｗ／ｗ）になるまで溶解させた。最初の脱溶媒和工程は２５ｍｌのアセトンの添加によって開始した。沈殿したゼラチン画分を６０秒間沈降させた後、分散したゼラチン並びに溶解したゼラチンからなる上清を捨てた。５０℃への加熱下で２５ｍｌの水を加えて沈降物を再び溶解させ、ｐＨを２．５に調整した。一定速度での撹拌（５００ｒｐｍ）下で５０ｍｌのアセトンを滴下して添加することによる第二の脱溶媒和の間にその場でゼラチンナノ粒子が形成された。１０分後、１７５μｌのグルタルアルデヒド（２５％）を反応容器に加え、ナノ粒子を架橋させた。最後に、抽出器フード中で１２時間撹拌した後、粒子を、３倍遠心分離（２００００ｇで２０分）とアセトン／水（３０／７０）中での再分散、ＨＰＷ単独での最後の工程によって精製した。精製したナノ粒子は４−８℃でＨＰＷ（伝導率＜０．０４μｓ／ｃｍ）中の分散液として保存した。次の標準的プロセスパラメータはナノ粒子の調製に対して重要である：（ａ）第一及び第二脱溶媒和工程の前の温度：５０℃；（ｂ）撹拌速度：５００−７００ｒｐｍ；（ｃ）第一脱溶媒和工程後の沈殿時間：６０秒；（ｄ）アセトン添加の速度（第二脱溶媒和工程）：３−５ｍｌ／分。
ナノ粒子サイズの決定：
粒子サイズは動的光散乱（ＤＬＳ）法を用いて決定した。ＤＬＳ実験は、１７３°の静的検出角でＮＩＢＳ?技術(Non Invasive Back Scattering)を使用してZetasizer ZS (Malvern Instruments, Worcestershire, England)で実施した。ナノ粒子を滅菌濾過し高度に精製した水に希釈し、３０から１００μｇ／ｍｌの範囲の濃度で測定した。かかる低濃度のため、ナノ粒子は分散液の粘度には影響を与えず、よって、２５℃で０．８８７２ｃＰである純水の粘度を使用した。実験は２５℃で実施した。
プレーンなゼラチンナノ粒子のカチオン化：
塩化コールアミン塩酸塩を使用してCoester(2003)によって記載されたオリジナルな方法の新たな修正版を使用した。プレーンなナノ粒子の水性分散液をｐH４．５に調節し、モル過剰量のカチオン化剤塩化コールアミン塩酸塩（例えば５００ｍｇのナノ粒子に対して５０ｍｇ）を一定撹拌下で加えた。５分のインキュベーション後、５０ｍｇの１-エチル-３-(３-ジメチル-アミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を加えて、粒子上のフリーのカルボキシル基を活性化させ、塩化コールアミン塩酸塩と反応させた。カチオン化反応の間、塩化コールアミン塩酸塩の第１級アミノ基がナノ粒子表面上の二つの可能な官能基と反応することができる。最初の相互作用部位は、一官能だけの結合架橋試薬グルタルアルデヒドから誘導された残留アルデヒド基である。更に、第１級アミノ基はナノ粒子表面上の活性化されたカルボキシル基と反応可能である。反応は１時間後に停止され、ナノ粒子は、プレーンなナノ粒子の精製と同様に、３倍遠心分離と再分散によって精製した。最終の粒子を、動的光散乱を使用したサイズ決定とゼータ電位の測定によって、特徴付けした。各割り当てサイズと対応する多分散指数は１０回の試行の平均とした。ゼータ電位は同じ機器を使用して決定し、ＰＢＳ中での１０回の個々の測定の平均として計算した。ＰＢＳ中で５ｍＶ又はそれ以上の正電荷を示す粒子を充填に使用した。
カチオン化ゼラチンナノ粒子へのＧ１０-ＯＤＮの充填：
Ｇ１０-ＯＤＮを、精製水及びＰＢＳ中の凝集又は非凝集形態（実施例２のＯＤＮ Ｇ１０の調製プロトコルにおける凝集工程を省略）で用いた。以下に記載した細胞性アッセイに対して、含有量はＧＮＰが１％、Ｇ１０-ＯＤＮが０．１％であり、ＰＢＳ中１０％（ｗ／ｗ）の標的の充填が得られる。以下に記載するマウスモデルでの研究に対しては、０．２５％のＧ１０-ＯＤＮ含量と２．５％のＧＮＰをまた調製し、ＰＢＳ中１０％（ｗ／ｗ）とする。充填実験はＰＢＳ中のＧＮＰに対して標的とする（所望される）１０％（ｗ／ｗ）のＧ１０-ＯＤＮの充填について例示して記載するが、同じ手順を、凝集又は非凝集Ｇ１０-ＯＤＮを使用する他の標的充填割合に対して適合化させた。１．２ｍｇのＧＮＰを含む水性ＧＮＰ分散液４３．３μｌを無菌条件下でエッペンドルフ(EppendorfTM)１．５ｍｌキャップに移した。ついで、１０８６μｌのＰＢＳを加え、ピペットで同時に混合した。次の工程で、１２０μｇの凝集Ｇ１０を含む７１．４μｌのＧ１０原液を、少なくとも２０秒間、ピペットを素早くしかし穏やかに上下させることにより分散液に添加した。次に、調製された試料を２２℃で１時間１５分の間、インキュベートし、７５０ｒｐｍでThermomixerTM装置にかけた。
Ｇ１０-ＯＤＮ充填効率の決定：
インキュベーション後、充填の成功が試験されるＧ１０-ＯＤＮ充填ＧＮＰ試料を１５０００ｇで１時間遠心分離した。遠心分離後、上清を残りのペレットから注意深く分離させ、２６０ｎｍの波長で分光測定によって分析した。同じ濃度（１ｍｇ／ｍｌ）の無充填ＧＮＰ参照体と同じ濃度（１００μｇ／ｍｌ）のＧ１０-ＯＤＮの参照体を調製し、遠心分離した。Ｇ１０-ＯＤＮの充填割合は、試料の結果から粒子参照体の測定吸収値を減じた後、Ｇ１０-ＯＤＮ参照体の測定吸収値でこの結果を除し、それに１００を乗じることにより得られる、Ｇ１０-ＯＤＮがない割合から計算した。最後に、充填効率は、１００％からフリーＧ１０-ＯＤＮパーセントを減じることによって計算した。
Ｇ１０-ＯＤＮ充填決定の結果：
充填効率の結果は様々なＧＮＰバッチによって得られた。しかしながら、調製方法、特にカチオン化はそれぞれの場合で同じであった。よって、充填はまた異なった粒子サイズのバッチの間で比較することができる。割合で与えられる全ての結果は、Ｇ１０-ＯＤＮ及びＧＮＰの用いられた質量で計算された質量パーセント（ｗ／ｗ）である。非凝集Ｇ１０-ＯＤＮに対する表Ｉ−ＩＩＩと凝集Ｇ１０-ＯＤＮに対する表ＩＶ−Ｖに示されるように、３−１５％（非凝集Ｇ１０-ＯＤＮ）又は５−１０％（凝集Ｇ１０-ＯＤＮ）の充填割合のＧ１０-ＧＮＰが首尾良く得られた。最適な充填媒体はＰＢＳであり、そこでは調製物に凝塊（フロキュレーション）が検出されなかった。非凝集Ｇ１０-ＯＤＮの結果は、全体として十分な結合を示し、水中では５から１０％、充填効率が減少する傾向があり、ＰＢＳではこの傾向はなかった。ＧＮＰへの１５％のＧ１０-ＯＤＮの充填は僅かだけ低い効率を示している。
Figure 0005484732
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Ｇ１０充填ゼラチンナノ粒子（ＧＮＰ-Ｇ１０）はＢＭＤＣからＩＬ-１２の分泌を誘導する：
ＧＮＰ-Ｇ１０を上記のようにして調製した。未結合Ｇ１０の効果を評価するために、一定量のＧＮＰ-Ｇ１０調製物を４℃で１時間１６０００ｇで遠心分離し、上清を回収した（ｓｕｐＧＮＰ-Ｇ１０）。実施例１１に記載されているようにして、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウス由来のＢＭＤＣをインビトロで産生した。細胞を９６ウェルプレートに蒔き、モックか標記した濃度のＧＮＰ-Ｇ１０又はｓｕｐＧＮＰ-Ｇ１０（そのＧ１０の濃度として与える）の何れかで刺激した。１８時間後、細胞上清を回収し、ＩＬ-１２を、実施例１１に記載したように、サンドウィッチＥＬＩＳＡによって測定した。ＧＮＰ-Ｇ１０は試験された全ての濃度でＢＭＤＣからのＩＬ-１２の分泌を誘導した（表ＶＩ）。これに対して、ＢＭＤＣはｓｕｐＧＮＰ-Ｇ１０での処理時には、有意な量のＩＬ-１２を放出しなかった。これらの結果は、ＧＮＰ-Ｇ１０はＢＭＤＣによって取り込まれ、ＩＬ-１２の放出を惹起する。また、これらのデータは、Ｇ１０は効率的にＧＮＰに充填されたが、ｓｕｐＧＮＰ-Ｇ１０はＢＭＤＣからのＩＬ-１２の分泌を誘導しなかったことを示している。ＧＮＰはＧ１０がないとマウス樹状細胞においてＩＬ-１２の分泌を誘導しなかった。
Figure 0005484732
Ｇ１０充填ゼラチンナノ粒子（ＧＮＰ-Ｇ１０）は喘息のマウスモデルにおいて保護性がある：
アレルギー性気道の実験的喘息モデル(Hessel EM等, J.Exp.Med. 2005, 202, 1563) を使用して、全ＩｇＥレベルに対するＧＮＰ-Ｇ１０の効果を評価した。感作のために、４グループのマウス（グループＢ−Ｅ、１グループ当たりマウス５匹）に４５０μｇのミョウバン(アルハイドロゲル２．０％Brenntag Biosector, Denmark)と混合した１５０μｇのブタクサ(Ambrosia artemisiifolia)花粉抽出物(RW, Greer)を０日目と３日目に腹腔内(i.p.) 注射した。一グループ（グループＡ）からのマウスはＰＢＳだけでi.p.処理した。１０日目に、グループＣのマウスに３００μｇのＱβＧ１０（６０μｇのＧ１０に等価）を、グループＤのマウスに６００μｇのＧＮＰ-Ｇ１０（６０μｇのＧ１０に等価）を、グループＥのマウスに６００μｇのＧＮＰ-Ｇ１０凝集体（６０μｇのＧ１０に等価）を、グループＡ及びＢのマウスにＰＢＳを皮下注射した。注射前に全ての動物から血液を採取する。１７日目に、全ての動物を出血させ、全ＩｇＥ力価を決定する。血中の全ＩｇＥレベルはＥＬＩＳＡによって測定する。簡単に述べると、ＥＬＩＳＡプレート(９６ウェルMAXIsorp, NUNCイムノプレート#442404)に抗ＩｇＥ(BD Pharmingen, # 553413)を、コーティングバッファー（０．１ＭのＮａＨＣＯ３，ｐＨ９．６）中５μｇ／ｍｌの濃度で４℃にて一晩被覆する。ついで、プレートを洗浄バッファー（ＰＢＳ／０．０５％のＴｗｅｅｎ）で洗浄し、洗浄バッファー中２％のＢＳＡを用いて３７℃にて２時間ブロックする。ついで、プレートを十分に洗浄下後、１：２０の希釈マウス血清又は連続希釈マウスＩｇＥ標準(BD Pharmingen, # 557079)と共にインキュベートする。そのプレートを室温で２時間インキュベートし、ついで洗浄バッファーで十分に洗浄する。ついで、結合した特異的マウス抗体を、ＨＲＰＯ標識のε鎖特異的ラット抗マウスＩｇＥ抗体(Southern Biotech #H021-NBB4C)との一時間のインキュベーションによって検出する。洗浄バッファーでの十分な洗浄後に、プレートを６分間ＯＰＤ溶液（１OPD錠剤、２５ｍｌのＯＰＤバッファー及び８μｌのＨ２Ｏ２)で展開し、反応を５％のＨ２ＳＯ４溶液で停止させる。ついで、プレートをＥＬＩＳＡリーダー(Biorad Benchmark)でＯＤ４５０ｎｍにて読み取る。血清中のＩｇＥ濃度は参照としてマウスＩｇＥ標準を使用してGraphPad Prism4で計算する。
実施例１３の文献：
Ahlers, Michael等 Biodegradable gelatin nanoparticles and procedure for their production. (Deutsche Gelatine-Fabriken Stoess A.-G., Germany, assignee. Patent 102004041340. 20060223. (2005)。
Coester, C. J.等 "Gelatin nanoparticles by two step desolvation-a new preparation method, surface modifications and cell uptake." Journal of Microencapsulation 17.2 (2000): 187-93。
Coester, Conrad. Development of a new carrier system for oligonucleotides and plasmids based on gelatin nanoparticles. New Drugs [1], 14-17. 2003。
Zillies, Jan及びCoester, Conrad. Evaluating gelatin based nanoparticles as a carrier system for double stranded oligonucleotides. Journal of Pharmacy & Pharmaceutical Sciences 7[4], 17-21. 2004。
Zwiorek, Klaus, Kloeckner, Julia, Wagner, Ernst, and Coester, Conrad. Gelatin nanoparticles as a new and simple gene delivery system. Journal of Pharmacy & Pharmaceutical Sciences 7 [4], 22-28. 2004。
実施例１４
ＥＬＩＳＡによる細胞中におけるＩＦＮ-α産生の検出
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をバフィーコートから単離し、１０％の仔ウシ血清（ＦＣＳ）を含むＲＰＭＩ培地中の免疫賦活性核酸で１８時間処理した。上清中のＩＦＮ-αを、PBL Biomedical Laboratoriesによって提供された抗体セットを使用して、サンドウィッチＥＬＩＳＡによって測定した。簡単に述べると、ＥＬＩＳＡプレートに５μｇ／ｍｌの捕獲抗ＩＦＮ-α抗体を被覆した。洗浄後、プレートを室温（ＲＴ）で１時間、０．５％ＢＳＡでブロックした。処理したＰＢＭＣ及びコントロールＰＢＭＣからの上清並びに組換えＩＦＮ-αをプレートに加え、３７℃で２時間インキュベートした。ウサギポリクローナル抗ＩＦＮ-α血清を検出抗体として使用し、室温で１時間インキュベートした。室温で１時間、ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギ血清を続いてプレートに加えた。各インキュベーション後に洗浄工程を実施した。発色反応を酵素基質ｏ-フェニレンジアミンを使用して起こさせ、ＥＬＩＳＡリーダー装置において４９０ｎｍで読み取った。データは、組換えＩＦＮ-αの標準曲線に従って分泌されたＩＦＮ-α（ｐｇ／ｍｌ）として表されている。
実施例１５
蛍光色素コンジュゲート抗体を使用するフローサイトメトリー分析
ＰＢＭＣを免疫賦活性核酸を用いて３−６時間刺激し、ついでブレフェルジンＡと共に更に４時間インキュベートした。ついで、細胞をＤＣ特異的表面マーカーで染色し、透過処理し、ＩＦＮ-αに対して細胞内染色する。
実施例１６
ブタクサ花粉での感作後及び１１日目の一回の誘発後の好酸球増加症に対するＱβＧ１０の効果
アレルギー性気道の実験的喘息モデル(Hessel EM等, J.Exp.Med. 2005, 202, 1563) を使用して、喘息の病理的原因である好酸球増加症に対するＱβＧ１０の効果を評価した。感作のために、３グループのマウス（１グループ当たりマウス５匹）に４５０μｇのミョウバン(アルハイドロゲル２．０％Brenntag Biosector, Denmark)と混合した１５０μｇのブタクサ(Ambrosia artemisiifolia)花粉抽出物(RW, Greer)を０日目と３日目に腹腔内(i.p.) 注射した。９日目に、グループＢのマウスに３７５μｇのＱβＧ１０を皮下（s.c.）投与した。１０日目に、グループCのマウスに３７５μｇのＱβＧ１０を皮下投与した。グループＡのマウスにはコントロールとしてＰＢＳを投与した。１１日目に、全マウスにＰＢＳ中２００μｇのＲＷを鼻腔内(i.n.)負荷投与した。負荷投与から４８時間後に、マウスを屠殺し、肺をPBSで洗浄した（表６）。気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）に含まれている細胞をＦＡＣＳによって分析した。好酸球は高ＣＣＲ３(マウスCＣＲ３フィコエリトリンＭＡｂ，R&D)発現によって同定した。表７に示されるように、ＢＡＬ中の細胞の全量はＰＢＳコントロールマウスと比較して処理されたＱβＧ１０において強く減少した。減少は、負荷投与の２４時間前（５２％）よりも負荷投与の４８時間前（６１％、ｐ＜０．０５）にＱβＧ１０を与えた場合に、より顕著であった。表８に示されるように、好酸球の量は、ＰＢＳコントロールマウスと比較して処理されたＱβＧ１０において強く減少した。再び、減少は、負荷投与の２４時間前（６０％、ｐ＜０．０５）よりも負荷投与の４８時間前（７０％、ｐ＜０．０５）にＱβＧ１０を与えた場合に、より顕著であった。よって、ＱβＧ１０処理は喘息のマウスモデルにおいて喘息の発症を予防する。
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実施例１７
ブタクサ花粉での感作後及び二回の誘発（１１日目及び１５日目）後の好酸球増加症に対するＱβＧ１０の効果
アレルギー性気道のより強い実験的喘息モデル（Hessel EM等., J. Exp. Med. 2005, 202, 1563の修正) をまた使用して好酸球増加症と血液中のＩｇＥ濃度に対するＱβＧ１０の効果を評価した。感作のために、２グループのマウス（１グループ当たりマウス５匹）に, ４５０μｇのミョウバン中の１５０μｇのＲＷ花粉抽出物を０日目と３日目に腹腔内投与した。９日目と１３日目に、グループＢのマウスに３７５μｇのＱβＧ１０を皮下注射した。ＡグループのマウスにはコントロールとしてＰＢＳを投与した。１１日目と１５日目に、マウスにＰＢＳ中の２００μｇのＲＷを鼻腔内誘発投与した。誘発後４８時間で、マウスを屠殺し、肺をＰＢＳで洗浄した（表９）。ＢＡＬに含まれている細胞を、実施例１６に記載されているようにしてＦＡＣＳによって分析した。表１０及び１１に示されるように、細胞の全量（５１％、ｐ＜０．０１）及び好酸球の量（６２％，ｐ＜０．００１）は、ＰＢＳコントロールマウスと比較して処理されたＱβＧ１０において強く減少した。よって、ＱβＧ１０は喘息の強いマウスモデルにおいて喘息の発症を防止する。
血液中の全ＩｇＥレベルはＥＬＩＳＡによって測定した。簡単に述べると、ＥＬＩＳＡプレート(９６ウェルMAXIsorp, NUNCイムノプレート#442404)に抗ＩｇＥ(BD Pharmingen, #553413)を、コーティングバッファー（０．１ＭのＮａＨＣＯ３，ｐＨ９．６）中５μｇ／ｍｌの濃度で４℃にて一晩被覆した。ついで、プレートを洗浄バッファー（ＰＢＳ／０．０５％のＴｗｅｅｎ）で洗浄し、洗浄バッファー中２％のＢＳＡを用いて３７℃にて２時間ブロックした。ついで、プレートを十分に洗浄下後、１：２０の希釈マウス血清又は連続希釈マウスＩｇＥ標準(BD Pharmingen, # 557079)と共にインキュベートした。そのプレートを室温で２時間インキュベートし、ついで洗浄バッファーで十分に洗浄した。ついで、結合した特異的マウス抗体を、ＨＲＰＯ標識のε鎖特異的ラット抗マウスＩｇＥ抗体(Southern Biotech #H021-NBB4C)との一時間のインキュベーションによって検出した。洗浄バッファーでの十分な洗浄後に、プレートを６分間ＯＰＤ溶液（１ＯＰＤ錠剤、２５ｍｌのＯＰＤバッファー及び８μｌのＨ２Ｏ２)で展開し、反応を５％のＨ２ＳＯ４溶液で停止させた。ついで、プレートをＥＬＩＳＡリーダー(Biorad Benchmark)でＯＤ４５０ｎｍにて読み取った。血清中のＩｇＥ濃度は標準に従ってGraphPad Prism4で計算した。表１２に示すように、ＱβＧ１０で処理されたマウス中の全ＩｇＥレベルは、未処理のマウスと比較して有意に（Ｐ＜０．０５）減少している。
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実施例１８
ＱβＧ１０の効果の持続時間とＲＷ抗原とのＱβＧ１０の相互作用
実施例１６におけるようにミョウバンと混合したＲＷで０日目と３日目にマウスを感作した。１０日目と１２日目に、マウスにＱβＧ１０、ＲＷ（２０μｇ）と混合したＱβＧ１０又はＰＢＳを皮下投与した。処置の６日及び１４日後に、マウスをＲＷで誘発した。誘発後４８時間で、血清中のＩｇＥレベルを分析した（表１３）。データは、ＱβＧ１０、又はＲＷと混合したＱβＧ１０におけるＩｇＥレベルが、ＰＢＳ処理コントロールと比較して有意に減少し（表１４）、ＱβＧ１０と、ＲＷと混合したＱβＧ１０との間に明確な差が見られなかった。
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実施例１９
ＱβＧ１０の特異性
マウスを０日目と３日目にＲＷとＦｅｌ ｄ１(Cytos, Switzerland) で感作させた。１０日目にマウスをＰＢＳ（グループＡ及びＢ）、又はＱβＧ１０（グループＣ及びＤ）、又はＲＷと混合したＱβＧ１０（グループＥ及びＦ）又はＦｅｌ ｄ１と混合したＱβＧ１０の何れかで処理した。１２日目に、グループＡ、Ｃ、Ｅ及びＧからのマウスにミョウバン混合ブタクサを負荷投与した。一方、グループＢ、Ｄ、Ｆ及びＨからのマウスにはＦｅｌ ｄ１を負荷投与した。１４日目に、全マウスが１０日目と同じ処置を受けた。１６日目に全マウスが１２日目のように負荷投与を受けた。最後の負荷投与の４８時間後に、ＢＡＬ及び血液中のＲＷ及びＦｅｌ ｄ１特異的ＩｇＥを測定し、ＢＡＬ中の浸潤細胞を分析した（表１５）。
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実施例２０
Ｇ１０及びＱβＧ１０の比較
Ｇ１０及びＱβＧ１０の効果をブタクサアレルギーモデルにおいて比較した。３グループのマウスを、ミョウバンを混合したブタクサの i.p.注射によって０日目と３日目に感作させた。１０日目と１２日目に、グループＢ及びＣのマウスをそれぞれＧ１０又はＱβＧ１０で処置した。グループＡのマウスにはコントロールとしてＰＢＳが投与された。全マウスに２００μｇのＲＷがi.n.投与によって誘発投与され、誘発の２日後に、マウスを屠殺した。浸潤細胞及びＢＡＬ中のＩＬ-４濃度及び血液中のＩｇＥレベルを分析した（表１６）。
表１７に示すように、ＢＡＬ中の細胞の全量はＧ１０処理マウスにおいて有意には変化しなかったが、ＰＢＳコントロールマウスと比較してＱβＧ１０処理マウスにおいて強く減少していた（３２％、ｐ＜０．０５）。同様に、好酸球の量はＰＢＳコントロールマウスと比較してＱβＧ１０処理マウスにおいて強く減少しており（６４．１％、ｐ＜０．０１）、Ｇ１０処理マウスにおける変化は有意ではなかった（表１８）。よって、非パッケージ化Ｇ１０はＢＡＬ中の浸潤細胞に有意な効果を示さないが、Ｑβにパッケージ化したＧ１０は細胞が肺に浸潤するのを防止した。表１９に示されているように、Ｇ１０で処理されたマウス中のＩｇＥレベルの変化は有意ではなかったが、ＱβＧ１０処理マウスは、ＰＢＳ処理マウスと比較して有意に（ｐ＜０．００１）減少した血中ＩｇＥレベルを有していた。表２０に示されているように、Ｇ１０で処理されたマウスのＢＡＬ中のＩＬ４レベルの変化は有意ではなかったが、ＱβＧ１０処理マウスは、ＰＢＳ処理マウスと比較して有意に（ｐ＜０．００１）減少したＢＡＬ ＩＬ-４レベルを有していた。従って、Ｇ１０をＱβにパッケージ化した場合、それは喘息とアレルギーの病理マーカーを減少させた。
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実施例２１
ＱβＧ１０でのネコアレルギーの治療
マウスを１日目と１４日目に５μｇのＦｅｌ ｄ１を腹腔内注射して感作させた後、２８、２９、３０及び３３日目に１μｇのＦｅｌ ｄ１を鼻腔内に追加投与した。３７日、３９日及び４１日目に、マウスに３７５μｇのＱβＧ１０又はＰＢＳを皮下注射した。４３日目に、１μｇのＦｅｌ ｄ１を鼻腔内に負荷投与し、マウスのコア温度を直腸プローブデジタル体温計を使用して直腸的に測定する。マスト細胞の脱顆粒をネコアレルギーモデルでモニターする。マウスに０日目と３日目に３７５μｇのＱβＧ１０を皮下注射する。５日目に、マウスに、５０μｌの１：５の希釈ネコアレルギー血清又はその血清又はコントロール血清からの精製ＩｇＥを皮内注射した。４又は２４時間後に、マウスに、１０μｇのＦｅｌ ｄ１プラスエバンスブルー線量を静脈内注射した。静脈内注射の３０分後にマウスを屠殺し、ブルー染色反応を分析した。ＱβＧ１０処理マウスは未処理マウスと比較してブルー染色が低減していた。
実施例２２
ＱβＧ１０での蜂毒アレルギーの治療
雌の６から８週齢のＣＢＡ／ＪマウスをHarlan(Zeist, The Netherlands)から得た。１ｍｇのミョウバンに吸着させた０．１μｇのＰＬＡ２を腹側領域及び尾の基部にs.c.注射することにより、動物を隔週毎に感作した。二通りのプロトコルがＱβＧ１０療法に適用される。最初は、前もって感作させたマウスに６連続日にわたって３７５μgのＱβＧ１０のs.c.注射を行う。ＩｇＥレベルはＱβＧ１０の最後の注射の４８時間後に測定する。第二は、未処置マウスに０日目と３日目に３７５μgのＱβＧ１０のs.c.注射を行う。最後のＱβＧ１０注射の２週間後に、マウスをミョウバン中のＰＬＡ２で感作させる。ＰＬＡ２感作から７日後にＩｇＥレベルを測定する。コントロールグループにはＰＢＳか３０μｇの天然ＰＬＡ２を投与する。アナフィラキシー応答の誘導には、動物にＰＢＳ中３０μｇの天然ＰＬＡ２をi.p.注射し、直腸温度を較正デジタル体温計を用いてモニターする。未処理マウスと比較して、ＱβＧ１０処理マウスにおける体温低下は顕著ではない。
実施例２３
ＱβＧ１０でのチリダニアレルギーの治療
雄CBA/CaHマウスを ５μｇの Der P1 + 1 mgのアルハイドロゲルの腹腔内注射で感作する。鼻腔内注入の場合は、５μgのDer P1又は滅菌生理食塩水を含む２５μｌの一定量を麻酔をかけたマウスの鼻に適用する。二通りのプロトコルがＱβＧ１０療法に適用される。 最初は、前もって感作させたマウスに６連続日にわたって３７５μgのＱβＧ１０のs.c.注射を行う。ＩｇＥレベルはＱβＧ１０の最後の注射の４８時間後に測定する。第二は、未処置マウスに０日目と３日目に３７５μgのＱβＧ１０のs.c.注射を行う。最後のＱβＧ１０注射の２週間後に、マウスをミョウバン中のDer P1 で感作させる。Der P1 感作から７日後にＩｇＥレベルを測定する。ＱβＧ１０処理マウスは、未処理マウスより低いＩｇＥ濃度を示す。
実施例２４
ＱβＧ１０でのアトピー性皮膚炎を被っている患者の治療と効果の評価
２４．１ アトピー性皮膚炎の症状の評価：
全身体関与を１００から１０００ｃｍ２の形状の使用で、又は身体部分のサイズをベースとして身体部分に標準的な測定値をあてがった９のルールによって推定する。全身体スコアは、紅斑、そう痒、滲痂皮(oozing crusting)、剥脱、及び、全ての関連した皮膚の苔癬化、非関連皮膚の乾燥、及び不眠に対する０から３のスケールの個々のスコアの合計である。研究者は、紅斑、そう痒、滲痂皮(oozing crusting)、剥脱、及び全ての関連した皮膚の苔癬化及び非関連皮膚の乾燥の深刻度に対して０から３のスケールで被験者の冒された皮膚領域にグレードを付ける。被験者は１０ｃｍの可視類似スケールで選択領域のそう痒にグレードを付け、下限を深刻とし、上限を無しとする；このグレードは解析のために０から３のスコアに転換される。効果の評価を一定にするために、全ての審査者がマニュアルを受け取り、当日参加し、集中訓練過程とオンサイト訓練を受ける。
２４．２ ＱβＧ１０での治療：
アトピー性皮膚炎を患っている被験者のグループを、３００μｇのＱβＧ１０（Ｇ１０（配列番号２７）をパッケージしたＱβＶＬＰ）で１週間の間隔で少なくとも３回、処置し、匹敵する症状のコントロールグループはプラシーボで処置する。試験グループの平均症状スコアに応じて、試験グループの治療を、それぞれ３００μｇのＱβＧ１０の全６から１０のワクチン接種まで繰り返すことができる；コントロールグループは常に平行してプラシーボで処置される。
２４．３ 効果の評価：
最初の処置の前と研究の終わりに全身体関与を評価する。各患者に対して個々に選択された選択された皮膚領域の症状を、各処置前と最後の処置の３ヶ月後までの間隔で直接評価する。研究の最初と最後の試験グループの症状スコアの変化をコントロールグループのものと比較する。
実施例２５
アトピー性皮膚炎の効果パラメータ
アトピー性皮膚炎（ＡＤ）の医師の総括的評価（ＰＧＡ）：
研究者は、表２１に記載されたスケールを使用して全体の疾患重症度に評点を付ける。評点は、過去の評価を参照しないで、患者の現在の症状を考慮してあてがわれることになる。
湿疹面積及び重症度インデックス（ＥＡＳＩ）：
４つの身体表面領域に対する皮膚炎の程度と重症度を、湿疹面積及び重症度インデックス（ＥＡＳＩ）を使用して計算する。４つの身体領域には比例した身体表面積（ＢＳＥ）を、頭部と首部が合わさって１０％ＢＳＡを構成し、胴体の前部と背部がそれぞれ１５％ＢＳＡを構成し、各腕が１０％ＢＳＡを構成し、各脚が２０％ＢＳＡを構成するように、割り当てる。身体領域の各々に関連する面積の割合に０から６のスコアが与えられ、ここで、０＝発疹なし、１＝＜１０％、２＝１０％から２９％、３＝３０％から４９％、４＝５０％から６９％、５＝７０％から８９％、及び６＝９０％から１００％である。評価されるアトピー性皮膚炎の４つの重要な症状は、紅斑、結節／浮腫、剥脱（引っ掻きによる皮膚の線状の擦過）、及び苔癬化である。これらの症状のそれぞれが０から３のスケールを使用して４つの身体領域のそれぞれで評点化され、半分の段階が許容され、ここで０＝なし、１＝穏やか、２＝中程度、及び３＝重症である。表２２に概要を述べた定義が使用される。
各身体領域に対するスコアは４つの重要な症状の重症度スコアの合計に、身体領域に関連した面積の割合を乗じ、ついでその結果に特定の身体領域にあてがわれた一定の加重値を乗じることによって得られる（表２３を参照）。ＥＡＳＩスコアは４つの身体領域スコアの合計である。
患者の痒みスコア評価：
研究のための来診の都度に、患者は表２４に示した評点を使用して最後の来診以来の痒みの重症度を評価することを求められる。
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実施例２６
アトピー性皮膚炎に罹っている被験者のＱβＧ１０での治療と効果の評価
ＱβＧ１０での治療：
二重盲検平行グループ臨床試験をアトピー性皮膚炎の３６名の患者で実施する。患者はそれぞれ１８名の患者の二つのグループに無作為に割り当てられる。最初のグループは１週間の間隔で６回、３００μｇのＱβＧ１０（Ｇ１０（配列番号２７）が満たされたＱβＶＬＰ）で処置する。第二のグループはプラシーボで処置する。
効果の評価：
医師総括評価（ＰＧＡ）、ＥＡＳＩスコア、及び患者の痒みの評価（実施例２５を参照）を最初の処置の前と、治療期間中は隔週で、また治療後は最初の治療後２４週目の研究の終了時点まで数回、実施する。
実施例２７
喘息に罹っている被験者のＱβＧ１０又はＡＰ２０５Ｇ１０での治療と標準化された喘息生活の質の質問状を使用する効果の評価
２７．１ 喘息症状の評価：
喘息の症状を、標準化された喘息生活の質の質問状を使用して評価する(AQLQ(S)又はAQLQ12+, Juniper等, Health Qual. Life Outcomes Sept. 2005 3:58)。
２７．１ ＱβＧ１０又はＡＰ２０５Ｇ１０での治療：
喘息を患っており、ＡＱＬＱ(Ｓ)又はＡＱＬＱ１２＋の匹敵する症状スコアを示す二つの試験グループと一つのコントロールグループを、それぞれＧ１０（配列番号２７）がパッケージされたバクテリオファージＱβのＶＬＰ、Ｇ１０（配列番号２７）がパッケージされたバクテリオファージＡＰ２０５のＶＬＰ又はプラシーボで治療する。ＱβＧ１０及びＡＰ２０５Ｇ１０は国際公開第０３／０２４４８１号の実施例１６及び１７に従って又は好ましくはここの実施例に従って産生される。被験者は１週間の間隔で少なくとも３回、３００μｇのＱβＧ１０又は３００μｇのＡＰ２０５Ｇ１０で治療される。試験グループの平均症状スコアに応じて、試験グループの治療を、それぞれ３００μｇのＶＬＰ-Ｇ１０の全６から１０のワクチン接種まで繰り返すことができる；コントロールグループは常に平行してプラシーボで処置される。
２７．３ 効果の評価：
各治療の前直接と最後の治療後１ヶ月と３ヶ月目にＡＱＬＱ(Ｓ)又はＡＱＬＱ１２＋を使用して全被験者を評点付けする。ＣｐＧパッケージ化ＶＬＰで治療した二グループとコントロールグループにおける平均スコアの発生を比較する。
実施例２８
喘息の症状の評価
喘息の症状の重症度は、次のプロトコルに従ってメタコリンの投与の前後でのスパイロメトリー測定によって評価することができる。
工程１：試験溶液の調製
− 試験の２０分前に冷蔵庫から試験溶液（メタコリン）を取り除き、室温までもっていく；
− 試験溶液の有効期限をチェックする；
工程２：試験患者の準備
− 患者を部屋の気温に１０分間、適応させる；
− 呼吸器スパイロメーター試験を実施する（アペンディクス１１．４呼吸器スパイロメトリーを参照）；
− メタコリン試験の禁忌者を除外する（関連の気道閉塞、急性感染、妊婦、β-ブロッカー又は抗コリン薬）（コリン作用薬又は抗コリン作用薬）；
工程３：「線量計Ｍｅｆａｒ ＭＢ３」の準備
− 右側の二つの黄色のボタン（「ユニット」、「コンプレッサー」）を押してマシンのスイッチを入れ、圧が２５ｋｇ／ｃｍ２に達するまで待つ；
− 灰色の０５番のボタンを押して吸入時間を定め、ついでポーズの時間０５０と吸入時間（Ｎ．吸入）０２を決め、「リセット」を押す
− １．５ｍｌのＮａＣｌ０．９％を吸入セットの下方プラスチック片中に満たすことによって吸入セットを準備し、同じ数で上方部分をねじ込み、ついで吸入機器をマシンに連結する連結及びマウスピース及びホースをつける
− 「エアータンク放出」のボタンを押す
工程４：ネガティブ制御及び患者の指示
− 患者に唇にマウスピースをつけさせ、深く息をするように指示することによって、ＮａＣｌ０．９％でネガティブ制御を実施する；
− 深く息を吸い込みながら、ボタン「緊急マニュアルサーミスタ」を押す；
− 一回繰り返し（以下の投薬プロトコルを参照）、ついで「終了」及び「リセット０２」を押す；
− ２分間待ち、ついで呼吸器スパイロメータ試験を繰り返す；
工程５：メタコリンでの吸入誘発
− １．５ｍｌのメタコリン濃度１０ｍｇ／ｍｌを吸入セットの下方プラスチック片中に満たし、セットをねじ込み、「エアータンク放出」を押す；
− 患者に唇にマウスピースをつけさせ、深く息をするように指示する。深く息を吸い込みながら、ボタン「緊急マニュアルサーミスタ」を押す；
− 一回繰り返し（以下の投薬プロトコルを参照、表２５）、ついで「終了」及び「リセット０２」を押す；
− ２分間待ち、ついで呼吸器スパイロメータ試験を繰り返す；
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呼吸器スパイロメトリー（ＲＳ）のフローチャート
工程１：準備
− 使用前に毎日スパイロメータを調整する
工程２：試験
− 被験者に直立位置で座って、普通に呼吸をするように依頼する；
− 被験者に息を大きく吸って、ついで全ての空気が吐き出されるまで、スパイロメータ中にできるだけ速やかにかつ完全に吐くよう指示する；
− 更に二回（全部で三回）繰り返す；
工程３：結果
− 最善の試みを定める（最大のＦＥＶ１／ＦＶＣ比として定義）。最大のＦＥＶ１／ＦＶＣ比が一回を越える試みにおいて見られる場合、最善の試みは最も高いＦＥＶ１のものである；
− 最大のＦＥＶ１／ＦＶＣ比が正常の７０％未満である場合、「関連気道閉塞」として分類し、除外基準を証明する。その他の場合は続ける；
− 測定されたＦＥＶ１から２０％を差し引き、それをＦＥＶ１−２０％として定義する；
− 測定されたＦＥＶ１、「ＦＥＶ１−正常」及び計算されたＦＥＶ１−２０％を準備されたシートに書き写す（「メタコリン-(気管支)誘発試験」）。
実施例２９
喘息を被っている被験者のＱβＧ１０又はＡＰ２０５Ｇ１０での治療とメタコリン誘発投与後にスパイロメトリーを使用した効果の評価
２９．１ 喘息症状の評価：
喘息の症状を、実施例２８に従ってメタコリン投与の前後で得られた測定値を用いたスパイロメトリーによって評価する。定量したものは、パラメータＦＥＶ１及び予想値の割合として表された努力肺活量に対するＦＥＶ１の比である。加えて、被験者（又はその両親又は保護者）が日誌カードを治験を通して毎日つけ、喘息による夜の目覚め、最大流量メータによって測定した朝と夜の最大流量、医薬の使用、症状のためで運動誘発性気管支痙攣防止のための救出医薬（アルブテロール）の使用、プレゾニドンの使用、喘息による学校の欠席／仕事の欠勤、喘息及び症状の重症度のための診療所又は病院への通院を記録する。被験者は治験を通して自身の通常の医薬を使用する。
２９．２ ＱβＧ１０又はＡＰ２０５Ｇ１０での治療：
実施例２７．２を参照のこと。
２９．３ 効果の評価：
全被験者のスパイロメトリーのデータを各治療前で直接取得し、毎日のデータを、最初の治療前１ヶ月から最後の治療から３ヶ月後まで毎日のペースで得る。分析するのは例えば毎月の夜の目覚めに関連した喘息の回数、エピソードのない日の数及び朝の最大流量である。ＣｐＧパッケージ化ＶＬＰで治療した二グループの平均データをプラシーボグループと比較する。
実施例３０
皮膚プリックテスト
皮膚プリックテスト（ＳＰＴ）は、被験者がある種のアレルゲンに対して過敏化を示すことを証明するために実施される。該テストは、花粉アレルゲン及びアトピーのスクリーニングに常套的に使用されるアレルゲンミックスを含む広範囲のアレルゲンに対する患者の反応を試験するのに有用である。該テストはチリダニアレルゲン(Der p及びDer f)に対する反応を試験するのに有用である。スクリーニングでは、このテストはＣＰＴの前に実施されなければならない（実施例３１）。皮膚プリックテスト及び皮内皮膚テストは過敏化の可視化を可能にする。皮膚テストの基本原理は、真皮中への少量のアレルゲンの導入である。放出されたメディエータが血管拡張を引き起こして血管透過性を増大させ、これがついで組織浮腫に至り、みみず腫れを生じさせる。ヒスタミンが軸索反射によってニューロメディエータのサブスタンスＰの放出を惹起し、これが周りの皮膚の発赤を生じさせる。
アレルゲンの約３０ｍｌの連続希釈物の小液滴を前腕の手掌表面に配する。テスト部位は擬陽性反応を避けるために少なくとも２ｃｍ離さなければならない。いわゆるプリック針、つまり皮膚中に直角に穿刺され得る針を使用して、アレルゲン溶液を真皮中に「穿刺」し、高度に再現性のある結果を得る。ネガティブコントロールについては、アレルゲン溶液の希釈剤を使用する。ヒスタミンがポジティブコントロールとして使用され、医薬（主として抗ヒスタミン薬）による皮膚反応性の抑制を検出する。１ｍｇ／ｍｌのヒスタミン溶液が直径２−７ｍｍの範囲の腫れを誘発する。
腫れ及び発赤反応の面積を１５分後に記録する。永久的な記録を得るために、腫れ並びに発赤のサイズをペンで皮膚の上に描き、セロハンテープ上にブロットし、ペーパー上に保存する。腫れと発赤の両面積を面積測定によって評価する。従って、反応がコンピュータによってスキャンされ、表面積が市販のソフトウェアを使用して測定される。７ｍｍ２以上の腫れサイズが陽性とみなされる。
ヒスタミンに対する皮膚の反応における個人間の変動がかなりあることを知った上で、反応をポジティブコントロールに対する割合でスコア付けする。限界希釈法の評価は平行線生物検定及び中央値傾きに基づく。
皮膚プリックテスト（ＳＰＴ）のフローチャート
工程１：準備
− 最近受けた投薬療法（コルチコステロイド、抗アレルギー療法、鎮静剤及び抗うつ薬療法）について質問し、ＳＰＴに対する禁忌者を除く；
− 試験溶液をチェックする（有効期間、管理温度、必要とされる体温）；
− アルコールで試験部位（腕の掌側）を清浄化する。ペンを使用して、アレルゲンを穿刺する領域をマークする。これらの穿刺部位は少なくとも２ｃｍ離しておかなければならない；
− チリダニに使用される濃度は１：１０００、１：１００、１：１０及び１：１である。
工程２：テスト
− アレルゲン溶液の一滴を皮膚の各マーク領域に配する。１ｍｍポイントの殺菌プリックランセットを用いて皮膚に液滴を穿刺する。これは血が出ないようにしてする。アレルゲンのキャリーオーバーを防ぐために、ランセットは穿刺間がアルコールスワブで拭い取られる；
− ハウスダストのチリダニアレルゲンテストは、１：１０００、１：１００、１：１０及び１：１のアレルゲン濃度で実施する；
− ポジティブ（ヒスタミン）及びネガティブコントロール（希釈剤）が含められなければならない；
− １分後に、溶液をテスト部位にブロットし、拭い取ってはいけない；
− ３０分待つ；
工程３：結果
− テスト部位をアルコールと、ついで創傷ベンジンで拭い、マーカーペンで紅斑及び浮腫の周りにラインを引く；
− テスト部位の透明なスコッチテープを貼り、ついで引き剥がし、ペーパーシートに貼り付ける；
− 紅斑及び浮腫の直径及び／又は面積を決定する。ソースドキュメントに測定値を記録し、症例報告用紙に書き写す；
− 痒いテスト部位は抗ヒスタミンゲルで局所的に処理することができる；
アレルギー反応は常にコントロール反応（希釈剤のみ）に対して評価される。典型的には、被験者は、少なくとも６ｍｍ直径の少なくとも一つの浮腫又は紅斑あるいは少なくとも７ｍｍ２の面積の少なくとも一つの浮腫又は紅斑を示す場合、アレルギーであると考えられる。
実施例３１
結膜誘発試験
アレルゲンに対する患者の応答は、次の手順に従って実施されるいわゆる結膜誘発試験を使用して評価することができる。該試験は、花粉アレルゲンを含む広範囲のアレルゲンに対する患者の反応を試験するのに有用である。該試験はチリダニアレルゲン（Der p及びDer f）に対する反応を試験するのに有用である。
結膜誘発試験（ＣＰＴ）のフローチャート：
工程１：準備
− 患者を１０分間部屋の気候に適合させる；
− 試験溶液をチェックする（有効期間、管理温度、必要とされる体温）；
− 誘発の最初の時点では眼に痒みがないことを確認する；
− ＣＰＴに対する禁忌者を除外する（あらゆる眼の疾患、但し屈折異常又はアレルギー性結膜炎を除く、コンタクトレンズ、抗アレルギー治療）；
工程２：コントロール
− 左眼（コントロール眼）の下部結膜嚢中にアレルゲン内容物を除いたアレルゲン溶液と同一のコントロール溶液を５０μｌ投与する；
工程３：アレルゲン濃度１での誘発
− コントロール溶液の適用直後に、右／反対眼（誘発眼）の下部結膜嚢中にアレルゲン溶液濃度１を５０μｌ投与する；
− 患者に眼をこすらないように知らせる；
− １０分待った後、ＣＰＴに対する二つの症状スコアを記入する；
工程４：アレルゲンでの誘発に対する応答
− 陽性の場合は、抗ヒスタミンを局所投与しＣＰＴを止める；
− 陰性の場合には、誘発眼に次に高いアレルゲン濃度で濃度４まで誘発を繰り返す（工程５を参照）；
− 濃度４での誘発後に陰性の場合、陰性として分類して停止する；
工程５：次の高いアレルゲン濃度での誘発
− 反対眼（誘発眼）の下部結膜嚢中に次に高い濃度のアレルゲン溶液を５０μｌ投与する；
− 患者に眼をこすらないように知らせる；
− １０分待った後、ＣＰＴに対する二つの症状スコアを記入する（工程４参照）；
ＣＰＴでのアレルゲンに対する応答の分類（段階基準）
０：主観的な又は可視可能な反応なし；
Ｉ：痒み、発赤、異物感；
ＩＩ：段階Ｉに加えて、涙、結膜肉芽の血管拡張；
ＩＩＩ：段階ＩＩに加えて、結膜足根の血管拡張及び紅斑、眼瞼痙攣；
ＩＶ：段階ＩＩＩに加えて、結膜浮腫、眼瞼膨張；
段階は次の溶液（標準的なアレルゲン溶液の希釈係数）で決定される：ネガティブ溶液；濃度Ｉ：１：１０００、濃度ＩＩ：１：１００；濃度ＩＩＩ；１：１０；及び濃度ＩＶ：１：１；ＣＰＴは応答が段階ＩＩ以上の場合に陽性である。
症状は、５つの異なったパラメータに対して０から３のスコアを付与するＣＰＴのスコアシート（表２６）を使用してスコア付けがなされる。よって、最大のスコアは一回の誘発当たり１５である。ＣＰＴは全応答が＞１０であれば陽性である。
Figure 0005484732
実施例３２
鼻粘膜誘発試験
鼻粘膜誘発試験は、広範囲のアレルゲン、特に花粉アレルゲンに対する患者の反応を試験するのに有用である。鼻はアレルゲンの誘発のためには理想的な部位を提供する。アレルゲンは高度の精確さをもって粘膜に適用できる。誘発手順は自然の暴露を反映するものでなければならない。高い再現性を有する定量測定は重要である(Andersson M, L. Greiff, C. Svensson及びC. Persson. Acta Otolaryngol. 115 (1995), pp.705-713）。最近、Bousquet (Bousquet J, P. van Cauwenberge及びN. Khaltaev. Aria Workshop Group; WHO, J. Allergy Clin. Immunol. 108 (2001), pp. S147-334.)及びＡＲＩＡワークショップグループは、アレルギー性鼻炎とその喘息に対する影響に関する文献を提示し(Bousquet等, 2001)、適応、技術及び試験の評価に関して（Malm L, R. Gerth van Wijk及びC. Bachert. Rhinology 38 (2000), pp.1-6）鼻粘膜誘発試験のための「鼻気道の客観的評価についての国際委員会(International Committee on Objective Assessment of the Nasal Airways)」の小委員会からのガイドラインを提供している。また、アレルギー学及び臨床免疫学のための独国学会(German Society for Allergology and Clinical Immunology)は、独国耳鼻咽喉学会の臨床免疫学、アレルギー学及び環境医薬のワーキンググループ(Working Group for Clinical Immunology, Allergology and Environemental Medicine of the German Society for Ear, Nose and Throat)と共に方針説明書を作成した(Reichelmann等 Position statement. Allergo J (2002) 11:29-36.)。
アレルゲンの沈着及びアレルゲン投薬：鼻ポンプスプレーが鼻粘膜の広い領域に溶液を送達させるので、アレルゲンの溶液は定量ポンプスプレーから送達される。アレルゲン溶液は、中性ｐＨの等張緩衝水溶液である。生理食塩水での１：３連続希釈物が試験の前に新たに調製される。正確なアレルゲン濃度は過去の研究で決定される。アレルゲン溶液は１００μｌの体積で適用される。
ＮＰＴの禁忌者：最近の４週間での鼻炎のエピソード；アレルギー疾患増悪；アナフィラキシー反応を引き起こしたことが知られているアレルゲンの使用；妊娠；最近の８週間での鼻の手術；併発している重症の全身病、特に心肺疾患；全身性アレルギー反応の治療を妨害しうる医薬での治療（例えばβブロッカー又はＡＣＥ阻害剤）；試験１週間前のワクチン接種。
鼻粘膜誘発試験を妨害することが知られている医薬の退薬期間：全身性抗ヒスタミン薬：その半減期に応じて４８時間から１週間；経鼻抗ヒスタミン薬：１週間；ケトチフェン：２週間；ＤＮＣＧ、ネドクロミル：３日間；経鼻コルチコステロイド：１週間；全身性コルチコステロイド：１週間；局所用βアドレナリン作動薬：１日；非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）：１週間；降圧薬（例えばレセルピン、クロニジン）：３週間；抗うつ薬（例えばイミプラミン、三環系）：３日。
鼻粘膜誘発試験の技術と実施プロトコル
ベースライン条件を評価するためにＮＰＴに先だって、前側又は後側鼻鏡検査、好ましくは前側鼻鏡検査を含む鼻鏡検査を実施する。鼻鏡検査によるベースライン評価及び臨床症状スコア、並びに鼻腔通気度検査の前の少なくとも１５分、患者を室温に十分に適合させる。鼻の広い側が誘発に使用される。実際のアレルゲン溶液の投与前に、鼻の広い側の鼻粘膜に、非特定の応答性亢進のために１００μｌのアレルゲン希釈剤を誘発投与する。スコア及び鼻腔通気度検査の評価を１０分後に繰り返して、臨床的症状又は鼻疎通性の客観的測定値の有意な変化をチェックする。有意な変化が生じていないならば、鼻の広い側について実際のアレルゲン誘発を実施する。送達装置のアプリケータを鼻前庭に挿入し、眼の内眼角に向けて上方かつ側方に向け、１００μＬのアレルゲン試験溶液を鼻内に噴霧するときに下及び中鼻甲粘膜にアレルゲンを付着させる。アレルゲン投与中、患者は下気道へのアレルゲンの吸入を避けるために息を止めなければならない。患者には投与前に吸い込み投与直後に吐くように指示する。
応答の測定
鼻の症状の記録を３つの一般的な方法に従って平行して実施する（Bachert C: Nasal provocation test: critical evaluation. Ring J, Behrendt HD編: New trends in allergy, IV, Berlin, 1997, Vieluf Springer-Verlag, p 277)。
スコア１：各鼻の症状の重症度を１０ｃｍの線形の可視アナログスケールに記録する。ついで、重症度を、希釈剤（ネガティブコントロール）及び各誘発用量で得られたスコア（軽度１−３ｃｍ；中程度４−７ｃｍ；重症８−１０ｃｍ）に基づいて評価する。
スコア２：これらのパラメータの標準化された定量のための実際のスコアリング系で、独国アレルギー学及び臨床免疫学学会のＥＮＴ部によって提案されたものを表２７にまとめる（Reichelmann等 Position statement. Allergo J (2002) 11:29-36.）。
Figure 0005484732
スコア３：このスコアはしばしば臨床研究と科学的研究の双方において使用される（Linder, 1988）。エンドポイントは１３ポイントの最大スコアから５の全症状スコアをもたらす刺激薬の量と考える（表２８）。
Figure 0005484732
鼻漏：０＝軽度、１＝中程度、３＝重症；くしゃみ：０＝０−２回のくしゃみ；１ポイント＝３−５回のくしゃみ；２ポイント＝＞５回のくしゃみ。他の症状は痒み又は涙（１ポイント）及び結膜炎、咳、蕁麻疹、又は呼吸困難（２ポイント）を含む。
エンドポイント：アレルゲン誘発後、患者がスコア２において３ポイントより多く取得するか、又は鼻流量の減少が１５０Ｐａで＞４０％ならば、エンドポイントに達する。エンドポイントにはまた、スコア２の＞２ポイントと関連して鼻流量の減少が１５０Ｐａで＞２０％の場合に達する。
鼻疎通性の客観的測定：鼻の気道空間体積及び疎通性を前側鼻腔通気度検査によって評価する。経鼻圧に応じた時間に一鼻孔中における経鼻的気流を分析するように設計され、これは周期的呼吸中に反対側が評価される。鼻疎通性の完全な従来の評価では、この方法は、鼻孔内の断面積として鼻の形状を記録する音響鼻腔計測法と併用される。
前側鼻腔通気度検査及び音響鼻腔検査法の双方の結果が図解的に可視化され分析と文書化が容易にされる。ＮＰＴ前後の測定は、各分析器によって計算される鼻流量（ｃｍ３／ｓ）及び断面積（ｃｍ２）の正確な数と組み合わせてこれらのグラフを使用して容易に比較され正確に評価される。
実施例３３
花粉アレルギー及びアトピー性湿疹を煩っている被験者のＱβＧ１０での治療と鼻粘膜誘発試験を使用する効果の評価
花粉アレルギー及びアトピー性湿疹を煩っている個人を１週間の間隔で３００μｇのＱβＧ１０の皮下注射により４回治療した。実施例３０に従う皮膚プリックテスト及び実施例３２に従う鼻粘膜誘発試験をベースラインを決定するための最初の治療の前の日に実施した。鼻粘膜誘発試験は、１：１０００、１：１００、１：１０及び１：１の希釈の花粉アレルゲンを含む市販の誘発剤を用いて実施し、第二の治療の１週間後（第三の治療の前直接）と第四の治療の１週間後に繰り返した。被験者の反応を実施例３２に記載しているようにスコア２及びスコア３を使用して評点を付けた。加えて、くしゃみの回数を記録した（表３１）。表２９−３１に示されるように、三つ全てのパラメータはアレルゲン誘発に対する被験者の反応の有意な減少を示している。加えて、初冬に症状が出る、典型的にアトピー性湿疹を被っている被験者は、晩秋に実施された試験後にアトピー性湿疹の症状が全くなくなったことが報告された。後者の知見はアトピー性湿疹に対する処置の予防効果を示すものである。
Figure 0005484732
Figure 0005484732
Figure 0005484732
実施例３４
花粉アレルギーを煩っている被験者のＱβＧ１０及びＱβＧ８−８での治療と鼻粘膜誘発試験を使用する効果の評価
３４．１ ＱβＧ１０ ＱβＧ８−８での治療：
皮膚プリック及び鼻粘膜誘発試験（実施例３０及び３２を参照）でのベースラインの決定後、花粉アレルギーを煩っている被験者の三グループを形成する。ここで、全てのグループは同様の平均試験スコアを示している。最初のグループは１週間の間隔で少なくとも３回、３００μｇのＱβＧ１０（Ｇ１０（配列番号２７）がパッケージされたＱβＶＬＰ）で治療する。第二のグループはＧ８−８（配列番号２５）がパッケージされた３００μｇのＱβで平行して処置する。第三のグループはプラシーボで処置する。試験中における平均症状スコアに応じて、試験グループの治療は、それぞれ３００μｇのＱβＧ１０又はＱβＧ８−８の全６から１０のワクチン接種まで繰り返すことができる；コントロールグループは常に平行してプラシーボで処置される。
３４．２ 効果の評価：
各治療前と最後の治療後の３ヶ月までの間隔中に結膜誘発試験を実施する。研究の最初と最後の試験グループの症状スコアの変化をコントロールグループのものと比較する。
実施例３５
ハウスダストアレルギーを煩っている被験者のＱβＧ１０及びＱβＧ８−８での治療と結膜誘発試験を使用する効果の評価
３５．１ ＱβＧ１０ ＱβＧ８−８での治療：
皮膚プリック及び結膜誘発試験（実施例３０及び３１を参照）でのベースラインの決定後、ハウスダストアレルギーを煩っている被験者の三グループを形成する。ここで、全てのグループは同様の平均試験スコアを示している。最初のグループは１週間の間隔で少なくとも３回、３００μｇのＱβＧ１０（Ｇ１０（配列番号２７）がパッケージされたＱβＶＬＰ）で治療する。第二のグループはＧ８−８（配列番号２５）がパッケージされた３００μｇのＱβで平行して処置する。第三のグループはプラシーボで処置する。試験中における平均症状スコアに応じて、試験グループの治療は、それぞれ３００μｇのＱβＧ１０又はＱβＧ８−８の全６から１０のワクチン接種まで繰り返すことができる；コントロールグループは常に平行してプラシーボで処置される。
３５．２ 効果の評価：
各治療前と最後の治療後の３ヶ月までの間隔中に結膜誘発試験を実施する。研究の最初と最後の試験グループの症状スコアの変化をコントロールグループのものと比較する。
実施例３６
ハウスダストアレルギーを煩っている被験者のＨＢｃ及びＨＢｃＧ８−８での治療と結膜誘発試験を使用する効果の評価
３６．１ ＨＢｃＧ１０ ＨＢｃＧ８−８での治療：
皮膚プリック及び結膜誘発試験（実施例３０及び３１を参照）でのベースラインの決定後、ハウスダストアレルギーを煩っている被験者の三グループを形成する。ここで、全てのグループは同様の平均試験スコアを示している。最初のグループは１週間の間隔で少なくとも３回、３００μｇのＨＢｃＧ１０（Ｇ１０（配列番号２７）がパッケージされたＨＢｃＶＬＰ）で治療する。第二のグループはＧ８−８（配列番号２５）がパッケージされた３００μｇのＨＢｃで平行して処置する。第三のグループはプラシーボで処置する。試験中における平均症状スコアに応じて、試験グループの治療は、それぞれ３００μｇのＨＢｃＧ１０又はＨＢｃＧ８−８の全６から１０のワクチン接種まで繰り返すことができる；コントロールグループは常に平行してプラシーボで処置される。
３６．２ 効果の評価：
各治療前と最後の治療後の３ヶ月までの間隔中に結膜誘発試験を実施する。研究の最初と最後の試験グループの症状スコアの変化をコントロールグループのものと比較する。
実施例３７
花粉アレルギーを被っている被験者のＱβＧ１０での治療と鼻粘膜誘発試験、皮膚プリックテスト、及び患者の日誌を使用する効果の評価
ＱβＧ１０での治療：
非盲検臨床試験を花粉にアレルギーのある患者で実施した。患者は、１週間の間隔で６回、３００μｇのＱβＧ１０（Ｇ１０（配列番号２７）が満たされたＱβＶＬＰ）で治療した。
効果の評価：
標準化された花粉抽出物での鼻粘膜誘発試験（実施例３２を参照）を、最初の処置の前と、最後の治療の２週間後に実施した。鼻粘膜誘発試験はまた最初の治療後６ヶ月目と１２ヶ月目にも実施する。治療前からの症状スコアの変化を、治療後の様々な評価時点において評価する。また様々な量の花粉アレルゲンを含む溶液を使用して皮膚プリックテスト（実施例３０を参照）で効果を測定する。毎日の生活における治療の効果を、治療の後に最初の花粉シーズン中における症状及び使用医薬を記録する有効な患者の日誌を使用して測定する。有効な患者の日誌はまた治療後の第二の花粉シーズンの間の症状と使用医薬を記録するためにも使用される。
鼻粘膜誘発試験：
３００μｇのＱβＧ１０の６回の毎週の注射によって治療した花粉アレルギーの５名の患者について治療前と治療後２週間目に鼻粘膜誘発試験（実施例３２）を実施した。表３２に示されるように、これらの患者は、治療前のその反応と比較して低下した症状スコアを示した。
Figure 0005484732
実施例３８
花粉アレルギーを被っている被験者のＱβＧ１０での治療と結膜誘発試験、皮膚プリックテスト、及び患者の日誌を使用する効果の評価
ＱβＧ１０での治療：
二重盲検平行グループ臨床試験を花粉にアレルギーのある３０名の患者で実施する。患者はそれぞれ１０名の患者の三グループに無作為に割り当てられる。最初のグループは１週間の間隔で６回、３００μｇのＱβＧ１０（Ｇ１０（配列番号２７）が満たされたＱβＶＬＰ）で処置する。第二のグループは１週間の間隔で６回、水酸化アルミニウムアジュバントと組み合わせた３００μｇのＱβＧ１０で処置する。第三のグループはプラシーボで処置する。
効果の評価：
標準化された花粉抽出物での結膜誘発試験（実施例３１を参照）を、最初の処置の前と、最後の治療の２週間後と、最初の治療後６ヶ月と１２ヶ月で実施する。治療前からの症状スコアの変化を、治療後の様々な評価時点においてグループ間で比較する。また様々な量の花粉アレルゲンを含む溶液を使用して皮膚プリックテスト（実施例３０を参照）用いて効果を測定する。毎日の生活における治療の効果を、治療の後に最初の花粉シーズン中における症状及び使用医薬を記録する有効な患者の日誌を使用して測定する。有効な患者の日誌はまた治療後の第二の花粉シーズンの間の症状と使用医薬を記録するためにも使用される。
実施例３９
チリダニアレルギーを被っている被験者のＱβＧ１０での治療と結膜誘発試験、皮膚プリックテスト、及び患者の日誌を使用する効果の評価
ＱβＧ１０での治療：
二重盲検平行グループ臨床試験をチリダニにアレルギーのある２０名の患者で実施する。患者はそれぞれ１０名の患者の二つのグループに無作為に割り当てられる。最初のグループは１週間の間隔で６回、３００μｇのＱβＧ１０（Ｇ１０（配列番号２７）が満たされたＱβＶＬＰ）で処置する。第二のグループはプラシーボで処置する。
効果の評価：
標準化されたチリダニ抽出物での結膜誘発試験（実施例３１を参照）を、最初の処置の前と、最後の治療の２週間後と、最初の治療後６ヶ月と１２ヶ月で実施する。治療前からの症状スコアの変化を、治療後の様々な評価時点においてグループ間で比較する。また様々な量のチリダニアレルゲンを含む溶液を使用して皮膚プリックテスト（実施例３０を参照）用いて効果を測定する。毎日の生活における治療の効果を、治療前の連続１４日間、治療後の２週間、及び最初の治療後の６ヶ月目及び１２ヶ月目に症状及び使用医薬を記録する有効な患者の日誌を使用して測定する。
分析的サイズ排除クロマトグラフィーによる精製Ｑβコートタンパク質の特徴づけ。（Ａ）精製したＱβ ＶＬＰの試料。観察されたピーク（比Ａ２６０／Ａ２８０＝２）は、２６０ｎｍでのＲＮＡ吸収係数がコートタンパク質の吸収係数よりおよそ１００倍高いので、ＶＬＰのＲＮＡコアによって支配されている。（Ｂ）分解反応の上清の試料。放出されたコートタンパク質はおよそ１２分のタンパク質様ピークの存在によって示されている。更に幾つかの種の非沈降ＲＮＡ分子が６．８から１１分の範囲に存在する。（Ｃ）精製したＱβコートタンパク質の試料。分析はカラムＴＳＫ Ｇ５０００ＰＷｘｌ（Tosoh Bioscience）にてＰＢＳ中で実施した。 （Ａ）天然Ｑβ ＶＬＰ、（Ｄ）ＱβＧ１０ＶＬＰ及びパッケージ成分（Ｂ）オリゴヌクレオチドＧ１０及び（Ｃ）Ｑβコートタンパク質の分析的サイズ排除クロマトグラフィー。ＱβＧ１０ ＶＬＰ（Ｄ）（比Ａ２６０／Ａ２８０＝１．７４）に対して観察されたピークは、２６０ｎｍでのＧ１０の吸収係数がコートタンパク質の吸収係数よりおよそ１３０倍高いので、ＶＬＰのＧ１０コアによって支配されている。分析はカラムＴＳＫ Ｇ５０００ＰＷｘｌ（Tosoh Bioscience）にてＰＢＳ中で実施した。 天然Ｑβ ＶＬＰとインビトロで構築したＱβＧ１０の非還元ＳＤＳ-ＰＡＧＥ解析。コートタンパク質の五量体と六量体の位置が示されている（（ａ）分子量マーカー、（ｂ）Ｑβ ＶＬＰ、（ｃ）Ｑβ Ｇ１０）。 リンパ節へのＶＬＰのＤＣ媒介又はフリーの排出の尺度としての、足蹠への皮下注射後の骨髄-ＤＣ、リンパ系-ＤＣ、マクロファージ、ｐＤＣ及びＢ細胞集団中における２４ｈでのＶＬＰ＋細胞の数に対する２ｈでのＶＬＰ＋細胞の数の比。抗ＣＤ１１ｃ、抗ＣＤ１１ｂ、抗Ｂ２２０及び抗ＣＤ１９抗体を用いて、ＦＡＣＳによって骨髄-ＤＣ、リンパ系-ＤＣ、マクロファージ、ｐＤＣ及びＢ細胞を同定した。 粒子陽性ＤＣとマクロファージのパーセント間の比。マウスに異なったサイズのナノ粒子を注射した。４８時間後に、ＦＡＣＳで細胞を分析した。 ＱβＧ１０によるＢＭＤＣの活性化。ＢＭＤＣはＱβＧ１０により活性化され、よって用量依存的（用量はＱβ ＶＬＰにパッケージされたＧ１０オリゴヌクレオチドの当量として与えられる）にＩＬ-１２を分泌したが、未処理のコントロール細胞はＩＬ-１２を分泌しなかった。

Claims (26)

  1. 動物の過敏症を治療するための組成物において、前記組成物が、
    （Ａ）ＲＮＡバクテリオファージＱβのコートタンパク質のウイルス様粒子と、
    （Ｂ）免疫賦活性核酸であって、前記免疫賦活性核酸が(a)「Ｇ６−６」 ＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧ（配列番号３２）；(b)「Ｇ７−７」 ＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号３３）；(c)「Ｇ８−８」 ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号２５）；(d)「Ｇ９−９」 ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号２６）；及び(e)「Ｇ１０」 ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号２７）からなる群から選択される配列を含む非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドであるもの
    を含んでなり、
    前記ウイルス様粒子が前記免疫賦活性核酸と共にパッケージされており、前記組成物がアレルゲン又はアレルゲン抽出物を含んでおらず、及び前記組成物が過敏症を治療する方法に使用され、アレルゲン又はアレルゲン抽出物の同時投与なしに前記動物に導入される、組成物。
  2. 前記コートタンパク質が配列番号３のアミノ酸配列を有する請求項１に記載の組成物。
  3. 前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが、配列ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号２７）からなる請求項１又は２に記載の組成物。
  4. 前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが、専らホスホジエステル結合ヌクレオチドからなる請求項１から３の何れか一項に記載の組成物。
  5. 前記非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが、デオキシリボヌクレアーゼ加水分解又はベンゾネース加水分解を受けない請求項１から４の何れか一項に記載の組成物。
  6. 前記免疫賦活性核酸が配列ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号２７）からなる非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドであり、該非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドが、専らホスホジエステル結合ヌクレオチドからなる請求項１から５の何れか一項に記載の組成物。
  7. 前記過敏症が、（ａ）アレルギー、（ｂ）喘息、及び（ｃ）皮膚炎から選択される請求項１から６の何れか一項に記載の組成物。
  8. 前記過敏症が、（ａ）ＩｇＥ依存性アレルギー（Ｉ型アレルギー）、（ｂ）ＩｇＥ依存性喘息、及び（ｃ）アトピー性湿疹から選択される請求項１から７の何れか一項に記載の組成物。
  9. 前記過敏症が天然に存在するアレルゲンに対するＩｇＥ依存性アレルギーである請求項１から８の何れか一項に記載の組成物。
  10. 前記ＩｇＥ依存性アレルギーが、
    （ａ）花粉アレルギー（花粉症）；
    （ｂ）ハウスダストアレルギー；
    （ｃ）食物アレルギー；
    （ｄ）薬物アレルギー；
    （ｅ）昆虫毒アレルギー；
    （ｆ）蜂毒アレルギー；
    （ｇ）動物アレルギー；及び
    （ｈ）ネコアレルギー
    からなる群から選択される請求項９に記載の組成物。
  11. 前記過敏症が喘息である請求項１から１０の何れか一項に記載の組成物。
  12. 前記組成物が前記動物に、皮下、筋肉内、静脈内、鼻腔内、又はリンパ節に直接に導入される、請求項１から１１の何れか一項に記載の組成物。
  13. 前記動物への前記導入が、１週間から３ヶ月の間隔で、少なくとも２回繰り返される請求項１２に記載の組成物。
  14. 前記動物への前記導入が、２週間の間隔で少なくとも３回繰り返される請求項１３に記載の組成物。
  15. 前記動物への前記導入が、毎週の間隔で少なくとも６回繰り返され、それぞれの都度、５０μｇから５００μｇの組成物が導入される請求項１から１４の何れか一項に記載の組成物。
  16. 前記動物への前記導入が、毎週の間隔で少なくとも６回繰り返され、それぞれの都度、３００μｇの組成物が導入される請求項１から１５の何れか一項に記載の組成物。
  17. 前記組成物が、アレルゲン又はアレルゲン抽出物の投与をしないで前記動物に導入される請求項１から１６の何れか一項に記載の組成物。
  18. 前記組成物が前記動物に導入され、前記動物への前記組成物の前記導入が、前記動物への前記組成物の前記導入の（ａ）少なくとも１週間前と少なくとも１週間後の間はアレルゲン又はアレルゲン抽出物が前記動物に導入されないように、実施される請求項１から１７の何れか一項に記載の組成物。
  19. 前記組成物が前記動物に導入され、前記動物への前記組成物の前記導入が、前記動物への前記組成物の前記導入の（ｂ）少なくとも４週間前と少なくとも４週間後の間はアレルゲン又はアレルゲン抽出物が前記動物に導入されないように実施される請求項１から１７の何れか一項に記載の組成物。
  20. 前記組成物が前記動物に導入され、前記動物への前記組成物の前記導入が、前記動物への前記組成物の前記導入の（ｃ）少なくとも８週間前と少なくとも８週間後の間はアレルゲン又はアレルゲン抽出物が前記動物に導入されないように実施される請求項１から１７の何れか一項に記載の組成物。
  21. 前記組成物が前記動物に導入され、前記動物への前記組成物の前記導入はアレルゲン又はアレルゲン抽出物が前記動物に全く導入されないように実施される請求項１から１７の何れか一項に記載の組成物。
  22. 前記動物がヒトである請求項１から２１の何れか一項に記載の組成物。
  23. ヒトの過敏症を治療するための組成物において、前記組成物が、
    （ａ）配列番号３のアミノ酸配列を有するコートタンパク質から成るＲＮＡバクテリオファージＱβのウイルス様粒子と、
    （ｂ）配列番号２７に記載の配列を有する非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドであって、専らホスホジエステル結合ヌクレオチドからなる非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドから成り、
    前記ウイルス様粒子が非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドと共にパッケージされており、前記組成物がアレルゲン又はアレルゲン抽出物を含んでおらず、及び前記組成物が過敏症を治療する方法に使用され、アレルゲン又はアレルゲン抽出物の同時投与なしに前記ヒトに導入される、組成物。
  24. （ａ）請求項１から２３の何れか一項に記載の組成物及び
    （ｂ）アジュバントを含有する薬学的組成物。
  25. アルミニウム含有アジュバントを含有する請求項２４に記載の薬学的組成物。
  26. アルハイドロゲルを含有する請求項２４に記載の薬学的組成物。
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Families Citing this family (77)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030109469A1 (en) * 1993-08-26 2003-06-12 Carson Dennis A. Recombinant gene expression vectors and methods for use of same to enhance the immune response of a host to an antigen
EP1450856B1 (en) * 2001-09-14 2009-11-11 Cytos Biotechnology AG Packaging of immunostimulatory cpg into virus-like particles: method of preparation and use
AU2002366710A1 (en) * 2001-12-20 2003-07-09 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of USE OF CpG OLIGODEOXYNUCLEOTIDES TO INDUCE ANGIOGENESIS
WO2003089642A1 (en) * 2002-04-22 2003-10-30 Bioniche Life Sciences Inc. Oligonucleotide compositions and their use for the modulation of immune responses
JP2006515277A (ja) 2002-10-29 2006-05-25 コーリー ファーマシューティカル グループ， リミテッド Ｃ型肝炎ウィルス感染の処置および予防に関する方法および製品
BRPI0408623A (pt) * 2003-03-26 2006-03-07 Cytos Biotechnology Ag conjugados de partìcula semelhante ao vìrus análogo de peptìdeo de melan-a
CA2588274A1 (en) * 2004-10-05 2006-04-13 Cytos Biotechnology Ag Vlp-antigen conjugates and their uses as vaccines
US9492400B2 (en) 2004-11-04 2016-11-15 Massachusetts Institute Of Technology Coated controlled release polymer particles as efficient oral delivery vehicles for biopharmaceuticals
US8354094B1 (en) * 2005-01-04 2013-01-15 Gp Medical, Inc. Pharmaceutical composition of nanoparticles
WO2006125821A2 (en) * 2005-05-26 2006-11-30 Cytos Biotechnology Ag Scalable fermentation process
EP1973608A1 (en) 2005-12-14 2008-10-01 Cytos Biotechnology AG Immunostimulatory nucleic acid packaged particles for the treatment of hypersensitivity
US9267937B2 (en) 2005-12-15 2016-02-23 Massachusetts Institute Of Technology System for screening particles
CA2648099C (en) 2006-03-31 2012-05-29 The Brigham And Women's Hospital, Inc System for targeted delivery of therapeutic agents
CA2652280C (en) 2006-05-15 2014-01-28 Massachusetts Institute Of Technology Polymers for functional particles
AU2007260236B2 (en) 2006-06-12 2013-05-16 Kuros Us Llc Processes for packaging oligonucleotides into virus-like particles of RNA bacteriophages
WO2007150030A2 (en) 2006-06-23 2007-12-27 Massachusetts Institute Of Technology Microfluidic synthesis of organic nanoparticles
CA2671873C (en) 2006-12-12 2018-10-09 Brian Stephen Sproat Oligonucleotides containing high concentrations of guanine monomers
EP2134830A2 (en) 2007-02-09 2009-12-23 Massachusetts Institute of Technology Oscillating cell culture bioreactor
US20090074828A1 (en) 2007-04-04 2009-03-19 Massachusetts Institute Of Technology Poly(amino acid) targeting moieties
EP2630967A1 (en) 2007-10-12 2013-08-28 Massachusetts Institute of Technology Vaccine nanotechnology
US8277812B2 (en) 2008-10-12 2012-10-02 Massachusetts Institute Of Technology Immunonanotherapeutics that provide IgG humoral response without T-cell antigen
US8343497B2 (en) 2008-10-12 2013-01-01 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Targeting of antigen presenting cells with immunonanotherapeutics
US8343498B2 (en) 2008-10-12 2013-01-01 Massachusetts Institute Of Technology Adjuvant incorporation in immunonanotherapeutics
US8591905B2 (en) 2008-10-12 2013-11-26 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Nicotine immunonanotherapeutics
WO2010114768A1 (en) * 2009-03-30 2010-10-07 Cerulean Pharma Inc. Polymer-epothilone conjugates, particles, compositions, and related methods of use
WO2010114770A1 (en) * 2009-03-30 2010-10-07 Cerulean Pharma Inc. Polymer-agent conjugates, particles, compositions, and related methods of use
WO2010122164A1 (en) 2009-04-23 2010-10-28 Cytos Biotechnology Ag VIRUS-LIKE PARTICLES OF BACTERIOPHAGE φCB5
AU2010243490A1 (en) * 2009-04-30 2011-11-24 Cytos Biotechnology Ag Influenza hemagglutinin compositions and uses thereof
KR20180026572A (ko) 2009-05-27 2018-03-12 셀렉타 바이오사이언시즈, 인크. 방출 속도가 상이한 성분을 갖는 나노운반체
EP2399608B1 (en) * 2010-03-05 2020-07-08 Sebastian Fuchs Immunomodulating nanoparticulate composition for use in inhalation therapy
WO2011119881A1 (en) * 2010-03-24 2011-09-29 Northeastern University Multi-compartmental macrophage delivery
JP6371058B2 (ja) 2010-05-26 2018-08-15 セレクタ バイオサイエンシーズ インコーポレーテッドＳｅｌｅｃｔａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ． 結合していないアジュバントを有するナノキャリア組成物
BR112013003825A2 (pt) * 2010-08-20 2019-09-24 Cerulean Pharma Inc conjugados, partículas, composições e métodos relacionados
US9994443B2 (en) 2010-11-05 2018-06-12 Selecta Biosciences, Inc. Modified nicotinic compounds and related methods
CN103517716A (zh) 2011-04-29 2014-01-15 西莱克塔生物科技公司 用于诱导调节性b细胞的致耐受性合成纳米载体
US9665956B2 (en) * 2011-05-27 2017-05-30 Abbott Informatics Corporation Graphically based method for displaying information generated by an instrument
JP2014521687A (ja) 2011-07-29 2014-08-28 セレクタ バイオサイエンシーズ インコーポレーテッド 体液性および細胞傷害性ｔリンパ球（ｃｔｌ）免疫応答を生成する合成ナノキャリア
US20130039973A1 (en) * 2011-08-03 2013-02-14 Henry J. Smith Viral Immunogenic Compositions
US9149426B2 (en) * 2012-02-15 2015-10-06 University Of Tennessee Research Foundation Nanoparticle composition and methods to make and use the same
EP2841098A4 (en) 2012-04-23 2016-03-02 Allertein Therapeutics Llc NANOPARTICLES FOR THE TREATMENT OF ALLERGIES
JP2016516754A (ja) 2013-04-03 2016-06-09 アラーテイン・セラピューティクス・リミテッド・ライアビリティ・カンパニーＡｌｌｅｒｔｅｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， ＬＬＣ 新規のナノ粒子組成物
US10894963B2 (en) 2013-07-25 2021-01-19 Exicure, Inc. Spherical nucleic acid-based constructs as immunostimulatory agents for prophylactic and therapeutic use
WO2015024992A2 (en) * 2013-08-22 2015-02-26 Cytos Biotechnology Ag Treatment of asthma
AU2014320015B2 (en) 2013-09-10 2020-10-29 Mockv Solutions Llc Methods and kits for quantifying the removal of Mock Virus Particles from a purified solution
US9932563B2 (en) 2013-09-11 2018-04-03 Georgia Tech Research Corporation Compositions and methods for inhibiting gene expressions
WO2015073831A1 (en) * 2013-11-15 2015-05-21 Liquidia Technologies, Inc. Virtual conjugate particles
US10293044B2 (en) 2014-04-18 2019-05-21 Auburn University Particulate formulations for improving feed conversion rate in a subject
EP3508198A1 (en) 2014-06-04 2019-07-10 Exicure, Inc. Multivalent delivery of immune modulators by liposomal spherical nucleic acids for prophylactic or therapeutic applications
CN106604891B (zh) * 2014-07-31 2020-07-28 艾玛菲克有限公司 非晶碳酸钙的非水液体和半固体制剂
MA40824A (fr) 2014-10-22 2017-08-29 Saiba Gmbh Particules de cmv de type virus modifié
KR20170078843A (ko) 2014-11-21 2017-07-07 노오쓰웨스턴 유니버시티 구형 핵산 나노입자 접합체의 서열 특이적 세포 흡수
WO2016103703A1 (ja) * 2014-12-25 2016-06-30 国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所 非凝集性免疫賦活化オリゴヌクレオチド
AU2015374385B2 (en) 2014-12-31 2020-08-06 Checkmate Pharmaceuticals, Inc. Combination tumor immunotherapy
WO2016149378A1 (en) 2015-03-16 2016-09-22 Pdx Pharmaceuticals, Llc Cross-linked polymer modified nanoparticles
CN107405313B (zh) 2015-04-06 2021-04-13 株式会社Lg生活健康 难溶性药物传递用的可溶性微针
WO2017041083A1 (en) * 2015-09-04 2017-03-09 Inventprise, Llc Vlp stabilized vaccine compositions
US10835600B2 (en) * 2015-09-08 2020-11-17 Universität Zürich Compositions against cat allergy
KR20200038339A (ko) 2015-09-10 2020-04-10 인벤트프라이즈 엘엘씨 다가 vlp 접합체
EP3368609A4 (en) * 2015-10-28 2019-07-24 University of Maryland, College Park MULTIFUNCTIONAL BIODEGRADABLE CARRIER FOR ACTIVE INJECTION
EP3436066A1 (en) 2016-04-01 2019-02-06 Checkmate Pharmaceuticals, Inc. Fc receptor-mediated drug delivery
WO2017179025A1 (en) 2016-04-15 2017-10-19 Alk-Abelló A/S Epitope polypeptides of ragweed pollen allergens
EP3448418A1 (en) 2016-04-27 2019-03-06 Allergy Therapeutics (UK) Limited Treatment of peanut allergy
EA201892003A1 (ru) 2016-04-27 2019-05-31 Бенчмарк Энимал Хэлс Лтд. Лечение атопического дерматита собак
US11364304B2 (en) 2016-08-25 2022-06-21 Northwestern University Crosslinked micellar spherical nucleic acids
KR101886286B1 (ko) * 2016-11-21 2018-08-10 주식회사 옵티팜 돼지파보바이러스 및 돼지열병바이러스에 대한 동시 항원성 복합 항원 단백질의 제조 방법
US11696954B2 (en) 2017-04-28 2023-07-11 Exicure Operating Company Synthesis of spherical nucleic acids using lipophilic moieties
CN107389847B (zh) * 2017-06-05 2020-01-07 中国农业科学院蜜蜂研究所 一种快速分析蜂花粉中脂类成分的方法
AU2019251421A1 (en) * 2018-04-09 2020-10-29 Checkmate Pharmaceuticals Packaging oligonucleotides into virus-like particles
CN112423766A (zh) * 2018-07-19 2021-02-26 一般财团法人阪大微生物病研究会 含有A型CpG寡脱氧核糖核苷酸的脂质颗粒
CN113301918A (zh) 2018-12-20 2021-08-24 塞坝股份公司 Cmv的通过融合修饰的病毒样颗粒
CN110042103B (zh) * 2019-03-25 2023-01-17 华南农业大学 一种对猪具有特异性免疫刺激作用的CpG-ODN及其应用
US20220249389A1 (en) 2019-07-12 2022-08-11 Oregon Health & Science University Immunotherapeutic constructs and methods of their use
CN114096280A (zh) 2019-07-12 2022-02-25 俄勒冈健康与科学大学 用于共同递送有丝分裂激酶抑制剂和免疫检查点抑制剂的治疗构建体
US20230038487A1 (en) * 2019-11-25 2023-02-09 The Regents Of The University Of California Modified viral therapeutics and uses thereof
WO2021260131A1 (en) 2020-06-25 2021-12-30 Saiba AG Virus-like particles of cmv modified by fusion
EP4228708A2 (en) * 2020-10-13 2023-08-23 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Polymer-conjugated microbubbles for high drug/gene loading
WO2024047091A2 (en) 2022-08-30 2024-03-07 Saiba Animal Health Ag Veterinary compositions of modified virus-like particles of cmv and ngf antigens

Family Cites Families (100)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2034118A1 (en) 1970-07-09 1972-01-13 Seinfeld, Hugo, Brendel, Walter, Prof Dr . 8000 München Xenogenic nucleic acids for enhancing antigenicity - of peptides and proteins
US5374426A (en) * 1986-09-03 1994-12-20 University Of Saskatchewan Rotavirus nucleocapsid protein VP6 in vaccine compositions
US5057540A (en) * 1987-05-29 1991-10-15 Cambridge Biotech Corporation Saponin adjuvant
US4912094B1 (en) 1988-06-29 1994-02-15 Ribi Immunochem Research Inc. Modified lipopolysaccharides and process of preparation
EP0468520A3 (en) 1990-07-27 1992-07-01 Mitsui Toatsu Chemicals, Inc. Immunostimulatory remedies containing palindromic dna sequences
AU9052091A (en) 1990-12-20 1992-07-22 Smithkline Beecham Biologicals (Sa) Vaccines based on hepatitis b surface antigen
GB9101550D0 (en) 1991-01-24 1991-03-06 Mastico Robert A Antigen-presenting chimaeric protein
GB9114003D0 (en) 1991-06-28 1991-08-14 Mastico Robert A Chimaeric protein
GB9213601D0 (en) 1992-06-26 1992-08-12 Mastico Robert A Protein based delivery system
AU678769B2 (en) 1992-07-27 1997-06-12 Hybridon, Inc. Oligonucleotide alkylphosphonothioates
FR2695563B1 (fr) 1992-09-11 1994-12-02 Pasteur Institut Microparticules portant des antigènes et leur utilisation pour l'induction de réponses humorales ou cellulaires.
NO176837C (no) 1992-12-30 1995-06-07 Norsk Hydro As Fremgangsmåte for å fjerne hydrogensulfid fra oljeholdig vann
US6727230B1 (en) 1994-03-25 2004-04-27 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Immune stimulation by phosphorothioate oligonucleotide analogs
WO1995026204A1 (en) 1994-03-25 1995-10-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Immune stimulation by phosphorothioate oligonucleotide analogs
US6239116B1 (en) 1994-07-15 2001-05-29 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US7935675B1 (en) * 1994-07-15 2011-05-03 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US6207646B1 (en) 1994-07-15 2001-03-27 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
DE69535905D1 (de) 1994-07-15 2009-02-26 Coley Pharm Group Inc Immunomodulatorische Oligonukleotide
US6429199B1 (en) 1994-07-15 2002-08-06 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules for activating dendritic cells
US5935821A (en) 1995-01-17 1999-08-10 Board Of Trustees Of The University Of Kentucky Polynucleotides related to monoclonal antibody 1A7 and use for the treatment of melanoma and small cell carcinoma
EP0817854A2 (en) 1995-03-31 1998-01-14 Wolf, Hans, Prof. Dr. Antigen presentation system based on retrovirus-like particles
US5994315A (en) 1995-06-07 1999-11-30 East Carolina University Low adenosine agent, composition, kit and method for treatment of airway disease
WO1997026883A1 (en) 1996-01-23 1997-07-31 Icn Pharmaceuticals, Inc. Modulation of th1/th2 cytokine expression by ribavirin® and ribavirin® analogs in activated t-lymphocytes
WO1997028259A1 (en) 1996-01-30 1997-08-07 The Regents Of The University Of California Gene expression vectors which generate an antigen specific immune response and methods of using the same
GB9621091D0 (en) 1996-10-09 1996-11-27 Fondation Pour Le Perfectionem Attenuated microorganisms strains and their uses
ATE292980T1 (de) 1996-10-11 2005-04-15 Univ California Immunostimulierende oligonucleotidekonjugate
EP0855184A1 (en) 1997-01-23 1998-07-29 Grayson B. Dr. Lipford Pharmaceutical composition comprising a polynucleotide and an antigen especially for vaccination
GB9702021D0 (en) 1997-01-31 1997-03-19 Imperial College Medicaments
EP1039935A4 (en) 1997-02-28 2005-04-27 Univ Iowa Res Found USE OF NUCLEIC ACIDS CONTAINING NON-METHYLATED CpG DINUCLEOTIDES IN THE TREATMENT OF LIPOPOLYSACCHARIDE-ASSOCIATED ILLNESSES
US6406705B1 (en) 1997-03-10 2002-06-18 University Of Iowa Research Foundation Use of nucleic acids containing unmethylated CpG dinucleotide as an adjuvant
WO1998049195A1 (en) 1997-04-29 1998-11-05 Universiteit Utrecht Corona virus-like particles as tools for vaccination and therapy
CA2288129A1 (en) 1997-05-01 1998-11-12 Chiron Corporation Use of virus-like particles as adjuvants
AU7690898A (en) 1997-05-20 1998-12-11 Ottawa Civic Hospital Loeb Research Institute Vectors and methods for immunization or therapeutic protocols
ES2326848T3 (es) 1997-06-06 2009-10-20 The Regents Of The University Of California Inhibidores de la actividad de secuencias inmunoestimulatorias de adn.
EP1012173B1 (en) * 1997-06-23 2007-10-31 Ludwig Institute For Cancer Research Isolated decapeptides which bind to hla molecules, and the use thereof
US6169175B1 (en) 1997-08-06 2001-01-02 Centers For Disease Control And Prevention Preparation and use of recombinant influenza A virus M2 construct vaccines
ES2283070T3 (es) 1997-09-05 2007-10-16 The Regents Of The University Of California Utilizacion de oligonucleotidos inmunoestimulantes para la prevencion o tratamiento del asma.
US6171591B1 (en) 1997-12-08 2001-01-09 Pentamer Pharmaceuticals, Inc. Recombinant nodavirus compositions and methods
DE69935507T2 (de) 1998-04-03 2007-12-06 University Of Iowa Research Foundation Verfahren und produkte zur stimulierung des immunsystems mittels immunotherapeutischer oligonukleotide und zytokine
US5990085A (en) 1998-05-04 1999-11-23 Michigan State University Inhibin-HBc fusion protein
JP2002514397A (ja) 1998-05-14 2002-05-21 コーリー ファーマシューティカル ゲーエムベーハー ＣｐＧオリゴヌクレオチドを用いる造血調節の方法
CN1168702C (zh) 1998-06-30 2004-09-29 Om药业 酰基-二肽类化合物,其制备方法以及含有前述化合物的药物组合物
WO2000006588A1 (en) 1998-07-27 2000-02-10 University Of Iowa Research Foundation STEREOISOMERS OF CpG OLIGONUCLEOTIDES AND RELATED METHODS
US5962636A (en) * 1998-08-12 1999-10-05 Amgen Canada Inc. Peptides capable of modulating inflammatory heart disease
AU777225B2 (en) 1998-09-03 2004-10-07 Coley Pharmaceutical Gmbh G-motif oligonucleotides and uses thereof
JP4486257B2 (ja) 1998-10-21 2010-06-23 アメリカ合衆国 自己抗体の誘導のためのウイルス様粒子
ATE412434T1 (de) 1998-11-30 2008-11-15 Cytos Biotechnology Ag Molekulare anordnung von allergenen, verfahren zur deren herstellung und deren verwendung
EP1230257A4 (en) 1998-12-23 2003-08-13 Thompson Boyce Plant Res EXPRESSION OF IMMUNOGENOUS HEPATITIS B SURFACE ANTIGEN IN TRANSGENIC PLANTS
EP1141314A2 (en) 1998-12-31 2001-10-10 Chiron Corporation Polynucleotides encoding antigenic hiv type c polypeptides, polypeptides and uses thereof
WO2000046365A1 (en) 1999-02-02 2000-08-10 Biocache Pharmaceuticals, Inc. Advanced antigen presentation platform
CZ20013081A3 (cs) 1999-02-25 2002-02-13 Smithkline Beecham Biologicals S. A. Epitopy a mimotopy získané z oblastí C-epsilon-2 nebo C-epsilon-4 IgE, jejich antagonisté a jejich terapeutické pouľití
ATE297190T1 (de) 1999-02-26 2005-06-15 Chiron Corp Mikroemulsionen mit adsorbierten makromolekülen und mikropartikeln
WO2000054803A2 (en) 1999-03-16 2000-09-21 Panacea Pharmaceuticals, Llc Immunostimulatory nucleic acids and antigens
US6977245B2 (en) * 1999-04-12 2005-12-20 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Oligodeoxynucleotide and its use to induce an immune response
PL203951B1 (pl) 1999-04-19 2009-11-30 Smithkline Beecham Biolog Kompozycja adiuwantowa, kompozycja szczepionki oraz sposób jej wytwarzania, szczepionka oraz zastosowanie
ES2250151T3 (es) 1999-06-29 2006-04-16 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Uso de cpg como adyuvante de vacuna contra vih.
WO2001012223A2 (en) 1999-08-19 2001-02-22 Dynavax Technologies Corporation Methods of modulating an immune response using immunostimulatory sequences and compositions for use therein
AU6801800A (en) 1999-08-30 2001-03-26 Ludwig Institute For Cancer Research Isolated nona and decapeptides which bind to hla molecules, and the use thereof
JP2001151698A (ja) 1999-09-10 2001-06-05 Nichiko Pharmaceutical Co Ltd インフルエンザワクチン
UA77152C2 (en) 1999-09-25 2006-11-15 Method for stimulation of immune response using nucleic acid-containing immunostimulating compositions, method for treatment of cancer and method for treatment or prophylaxis of allergy or asthma
ES2265980T5 (es) 1999-09-27 2010-12-28 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Metodos relacionados con interferón inducido por ácidos nucleicos inmunoestimuladores.
US6949520B1 (en) * 1999-09-27 2005-09-27 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Methods related to immunostimulatory nucleic acid-induced interferon
JP2003511420A (ja) 1999-10-13 2003-03-25 カイロン コーポレイション タンパク質から細胞性免疫応答を得る方法
US7223398B1 (en) 1999-11-15 2007-05-29 Dynavax Technologies Corporation Immunomodulatory compositions containing an immunostimulatory sequence linked to antigen and methods of use thereof
CA2392527C (en) 1999-11-24 2013-09-10 Chiron Corporation Hbv/hcv virus-like particle
AU3108001A (en) * 2000-01-20 2001-12-24 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Immunostimulatory nucleic acids for inducing a th2 immune response
AT409085B (de) 2000-01-28 2002-05-27 Cistem Biotechnologies Gmbh Pharmazeutische zusammensetzung zur immunmodulation und herstellung von vakzinen
EP1975182A1 (en) 2000-02-01 2008-10-01 PanGenetics B.V. CD40-binding APC-activating molecules
US7585847B2 (en) * 2000-02-03 2009-09-08 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Immunostimulatory nucleic acids for the treatment of asthma and allergy
US6756044B1 (en) 2000-02-09 2004-06-29 Genvec, Inc. Antigenic complexes and methods
US6423539B2 (en) 2000-02-24 2002-07-23 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Adjuvant treatment by in vivo activation of dendritic cells
WO2001085208A2 (en) 2000-05-05 2001-11-15 Cytos Biotechnology Ag Molecular antigen arrays and vaccines
AUPQ912000A0 (en) 2000-07-31 2000-08-24 Crown In The Right Of The Queensland Department Of Health, The Improved virus like particles
WO2002053141A2 (en) 2000-12-14 2002-07-11 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Inhibition of angiogenesis by nucleic acids
US7094409B2 (en) 2001-01-19 2006-08-22 Cytos Biotechnology Ag Antigen arrays for treatment of allergic eosinophilic diseases
US7128911B2 (en) 2001-01-19 2006-10-31 Cytos Biotechnology Ag Antigen arrays for treatment of bone disease
US7264810B2 (en) 2001-01-19 2007-09-04 Cytos Biotechnology Ag Molecular antigen array
US20030050268A1 (en) * 2001-03-29 2003-03-13 Krieg Arthur M. Immunostimulatory nucleic acid for treatment of non-allergic inflammatory diseases
WO2003040308A2 (en) 2001-07-27 2003-05-15 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Use of sterically stabilized cationic liposomes to efficiently deliver cpg oligonucleotides in vivo
JP4360906B2 (ja) * 2001-09-14 2009-11-11 サイトス バイオテクノロジー アーゲー ウィルス様粒子によって誘導される免疫応答を高めるための、抗原提示細胞のインビボでの活性化
EP1450856B1 (en) 2001-09-14 2009-11-11 Cytos Biotechnology AG Packaging of immunostimulatory cpg into virus-like particles: method of preparation and use
AU2002362696B2 (en) 2001-10-05 2008-05-29 Cytos Biotechnology Ag Angiotensin peptide-carrier conjugates and uses thereof
US7115266B2 (en) 2001-10-05 2006-10-03 Cytos Biotechnology Ag Angiotensin peptide-carrier conjugates and uses thereof
EP1455593B1 (en) 2001-10-06 2013-07-24 Merial Limited Methods and compositions for promoting growth and innate immunity in young animals
DK1441764T3 (da) 2001-11-07 2009-01-26 Cytos Biotechnology Ag Antigen-Arrays der omfatter RANKL til behandling af knoglesygdom
ES2320638T3 (es) 2001-11-07 2009-05-27 Cytos Biotechnology Ag Disposicion ordenada de antigenos il-5, il-13 o eotasina, para el tratamiento de enfermedades alergicas con un componente eosinofilico.
TW200303759A (en) 2001-11-27 2003-09-16 Schering Corp Methods for treating cancer
AU2003205623A1 (en) 2002-01-18 2003-07-30 Cytos Biotechnology Ag Prion protein carrier-conjugates
US20030219459A1 (en) 2002-01-18 2003-11-27 Cytos Biotechnology Ag Prion protein carrier-conjugates
PL375306A1 (en) * 2002-06-20 2005-11-28 Cytos Biotechnology Ag Packaged virus-like particles for use as adjuvants: method of preparation and use
NZ538083A (en) 2002-07-17 2006-08-31 Cytos Biotechnology Ag Molecular antigen arrays using a virus like particle derived from the AP205 coat protein
WO2004009124A2 (en) 2002-07-19 2004-01-29 Cytos Biotechnology Ag Ghrelin-carrier conjugates
WO2004071493A1 (en) 2003-02-17 2004-08-26 Peter Burkhard Peptidic nanoparticles as drug delivery and antigen display systems
CN100404070C (zh) * 2003-07-10 2008-07-23 赛托斯生物技术公司 包装的病毒样颗粒
WO2005014110A1 (en) * 2003-07-22 2005-02-17 Cytos Biotechnology Ag Cpg-packaged liposomes
CN101454451A (zh) 2003-10-30 2009-06-10 科勒制药有限公司 具有增强免疫刺激能力的c类寡核苷酸类似物
DE102004041340A1 (de) 2004-08-20 2006-02-23 Deutsche Gelatine-Fabriken Stoess Ag Nanopartikel und Verfahren zu deren Herstellung
BRPI0516953A (pt) * 2004-09-21 2008-09-30 Cytos Biotechnology Ag partìculas do tipo vìrus compreendendo uma proteìna de fusão da proteìna de revestimento de ap205 e um polipeptìdeo antigênico
WO2006097530A2 (en) * 2005-03-18 2006-09-21 Cytos Biotechnology Ag Cat allergen fusion proteins and uses thereof
EP1973608A1 (en) 2005-12-14 2008-10-01 Cytos Biotechnology AG Immunostimulatory nucleic acid packaged particles for the treatment of hypersensitivity

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