CN1168702C - 酰基-二肽类化合物,其制备方法以及含有前述化合物的药物组合物 - Google Patents

酰基-二肽类化合物,其制备方法以及含有前述化合物的药物组合物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及化学领域，更具体地讲，本发明涉及药物化学领域。本发明涉及通式I所示的N-酰基-二肽类化合物，其中取代基A、B、X、Y、R1、R2以及下标n、m、p和q具有权利要求中给出的含义。本发明还涉及含有至少一种通式I的化合物或其与有机或无机碱的酸或盐作为活性成分的药物组合物。本发明的化合物具有有价值的药理学特性，因此可用作药物。

Description

酰基-二肽类化合物， 其制备方法以及含有前述化合物的药物组合物
本发明涉及化学领域，更具体地讲，本发明涉及药物化学领域。
更具体地讲，本发明涉及从羟基化的氨基酸衍生的二肽类化合物，其游离的胺功能基用脂肪酸形成酰胺。
1994年11月17日申请、1995年5月26日公布、公布号为WO95/14026、国际申请号为PCT/EP94/03852、发明名称为“葡萄糖胺二糖、其制备方法、药物组份及其应用”的国际专利，公开了β(1-6)葡萄糖胺二糖的制备方法、β(1-6)葡萄糖胺二糖作为活性组份的药物组合物、以及这些二糖用作免疫调节剂、抗肿瘤剂以及疫苗组份。1994年3月9日申请、1995年8月23日公布、公布号为0668289A1、发明名称为“新型二糖衍生物”的欧洲专利，公开了一种新型二糖衍生物、其立体化学异构体及其盐、以及以此二糖衍生物为活性组份的药物组合物。该药物组合具有各种生物活性如有效的促有丝分裂的活性、辅佐活性、抗肿瘤活性等。
本发明涉及至少有一个羟基被中性或带电荷形式的酸基团酯化了的N-酰基-二肽类化合物，其具有通式I所示的结构
Figure C9980776100091
其中R1和R2分别表示从含有2至24个碳原子的饱和或不饱和、直链或支链的羧酸衍生的酰基，它是未取代的或带有一个或多个选自羟基、烷基、烷氧基、酰氧基、氨基、酰氨基、酰硫基和((C1-24)烷基)硫代基团的取代基，
下标m、p和q是从1到10的整数，
下标n是从0到10的整数，
X和Y分别表示氢或是中性或带电荷形式的酸基团，
条件是，取代基X和Y中至少有一个是表示中性或带电荷形式的酸基团，
A和B彼此独立的分别表示氧原子、硫原子或亚氨基-NH-。
酸基团X和Y优选选自如下基团：
-羧基[(C1-5)烷基]
-CH-[(CH2)mCOOH][(CH2)nCOOH]，其中m＝0-5，n＝0-5
-膦酰基[(C1-5)烷基]
-二羟基磷酰氧基[(C1-5)烷基]
-二甲氧基磷酰基
-膦酰基
-羟基磺酰基
-羟基磺酰基[(C1-5)烷基]
-羟基磺酰氧基[(C1-5)烷基]。
当取代基X和/或Y表示中性形式的酸基团时，是指游离的羧酸、磺酸或磷酸形式。当酸基团是带电荷的形式时，是指羧酸、磺酸或磷酸盐的形式，即通过与有机碱或无机碱、优选适于治疗应用的碱加成所形成的盐。当碱不适于治疗应用时，这些碱可以用来进行鉴定、纯化和分离。
当X和/或Y表示羧基烷基、链烯基二羧基、羟基磺酰基、羟基磺酰基烷基、羟基磺酰氧基烷基、膦酰基烷基、磷酰氧基烷基时也是如此。
适于治疗应用的成盐用碱主要包括碱金属碱如氢氧化钠、氢氧化钾或氢氧化锂、铵盐、碱土金属碱如氢氧化钙或氢氧化锶、镁盐、铁金属盐等，有机碱例如从伯胺、仲胺、叔胺衍生的碱如甲胺、二乙胺、一乙醇胺、二乙醇胺、苄胺、N-甲基苄基胺、藜芦胺、三甲氧基苄基胺、碱性氨基酸如赖氨酸和鸟氨酸或氨基糖。
不适于治疗应用的碱的例子是布鲁辛、士的宁、胍丁胺、龙虾肌碱、氨基葡糖、N-甲基葡糖胺或N-甲基吗啉。如前所述，由这些碱衍生的盐可以用于分离和鉴定。
当m等于1并且n等于0时，所需的分子由丝氨酸衍生得到。当m等于2并且n等于0时，所需的分子由高丝氨酸衍生得到。如果m等于3并且n等于0，可以参照戊高丝氨酸化合物。如果m等于4并且n等于0，可以参照己高丝氨酸化合物。
当p等于3并且q等于1时，所需产物可以是瓜氨酸、鸟氨酸或精氨酸化合物。当p等于4并且q等于1时，可以参照高精氨酸或赖氨酸化合物。
在本文所述的二肽类化合物中，特别值得注意的是如下优选的通式I化合物：
Figure C9980776100111
其中R1和R2分别表示从含有2至24个碳原子的饱和或不饱和、直链或支链的羧酸衍生的酰基，它是未取代的或带有一个或多个选自羟基、烷基、烷氧基、酰氧基、氨基、酰氨基、酰硫基和((C1-24)烷基)硫代基团的取代基，
下标m、p和q是从1到10的整数，
下标n是从0到10的整数，
X和Y分别表示氢原子或膦酰基。
即
3-(3-十二酰氧基十四酰氨基)9-(3-羟基十四酰氨基)4-氧代-5-氮杂癸烷-1，10-二醇1和/或10-磷酸二氢酯及其与有机或无机碱形成的加成盐，
3-(3-十二酰氧基-十四酰氨基)9-(3-羟基十四酰氨基)4-氧代-5-氮杂癸烷-1，10-二醇1，10-二(磷酸二氢酯)及其与有机或无机碱形成的加成盐，
3-(3-羟基十四酰氨基)9-(3-十二酰氧基十四酰氨基)4-氧代-5-氮杂癸烷-1，10-二醇1，10-二(磷酸二氢酯)及其与有机或无机碱形成的加成盐，
3-(3-十二酰氧基十四酰氨基)9-(3-羟基十四酰氨基)4-氧代-5-氮杂癸烷-1，10-二醇1-磷酸二氢酯及其与有机或无机碱形成的加成盐，
3-(3-羟基十四酰氨基)9-(3-十二酰氧基十四酰氨基)4-氧代-5-氮杂癸烷-1，10-二醇1-磷酸二氢酯及其与有机或无机碱形成的加成盐
3-(3-羟基十四酰氨基)9-(3-十二酰氧基十四酰氨基)4-氧代-5-氮杂癸烷-1，10-二醇10-磷酸二氢酯及其与有机或无机碱形成的加成盐。
R1和R2包括带有相同或不同性质的不同大小的链的饱和或不饱和、直链或支链的酰基衍生物，它可带有一个或多个选自烷基、氨基、酰氨基、羟基、烷氧基、酰氧基、酰硫基和烷硫基的取代基。
所述酰基的例子是蓖麻油酰基、12-羟基硬脂酰基、2-羟基-3-甲基丁酰基、3-羟基-2-氨基戊酰基、棕榈酰基、反油酰基、桐酰基、二十烷酰基、花生四烯酸酰基、顺9-二十碳烯酸酰基、二十二烷酰基、芥酰基、8-甲基癸酰基、9-甲基癸酰基、二十二碳六烯酸酰基或二十碳五烯酸酰基。
通式I的化合物及其单和二磷酰基化的化合物分别用代码OM-294-MP(MP)和OM-294-DP(DP)表示，它们具有非常有价值的药理学性质，特别是在免疫调节方面。根据所用的剂量，它们可用于治疗与免疫防御系统缺陷有关的疾病或免疫应答的过表达。它们还可用于治疗癌症并在配方疫苗中用作佐剂或应答增强剂。
其它的应用包括用作治疗用分子的载体，因为它们可以形成基于亲水性或疏水性相互作用的非共价配合物。它们的两性特点可以促进治疗用分子的配制以及向膜受体及细胞膜和细胞质的转运。可以将它们通过口服、胃肠外、直肠、局部、皮下或粘膜下途径给药单独使用或与治疗用的分子联合使用。可将它们单独使用或与治疗用的分子联合使用，与血细胞一起进行现场的离体温育以促进免疫活性细胞的形成，然后再通过胃肠外给药将这些细胞注射回体内。
当在例如疫苗中用作免疫系统的佐剂、与适宜的抗原联合使用时、用于治疗病毒、寄生虫、微生物或真菌引起的疾病时，MP和DP分子具有相似的特性。与此相反，本发明的化合物则显示完全不同的特性，它们可以诱导细胞因子的生产或从造血和淋巴器官衍生的免疫活性干细胞的成熟。
MP化合物可以在存在或不存在适宜抗原的条件下促进单核细胞成熟和分化成功能性树状细胞并促进体液或细胞介导的免疫。而DP化合物则显示出抗肿瘤特性。
本发明的化合物由于毒性低而特别令人感兴趣。它们以0.025mg至100mg/单位剂量的0.05至200mg/天的剂量用于人和动物的治疗。
本发明还涉及通式I的二肽类化合物的制备方法，该方法包括如下步骤：将二氨基酸的(q+1)和ω位的胺功能基分别用易于酸解和易于氢解的封闭试剂封闭，将仍是游离的羧酸功能基与还原剂反应生成相应的醇，将(q+1)位的胺功能基游离然后用式R2OH的羧酸功能基衍生物进行酰化，其中R2如上所定义，随后通过氢解将末端胺功能基游离得到通式II的二氨基醇
Figure C9980776100131
其中R2表示从含有2至24个碳原子的饱和或不饱和、直链或支链的羧酸衍生的酰基，它是未取代的或带有一个或多个以上定义的取代基，
p和q表示从1到10的整数，
将该氨基醇在肽缩合剂的存在下在惰性溶剂中与通式III的ω-羟基、ω-氨基或ω-巯基氨基酸化合物缩合
其中R1表示从含有2至24个碳原子的饱和或不饱和、直链或支链的羧酸衍生的酰基，它是未取代的或带有一个或多个以上定义的取代基，
m是从1到10的整数，
n是从0到10的整数，
X是以上定义的酸基团，该基团可以选择性地是酯的形式，
以得到通式IV的二肽类化合物
其中的取代基R1、R2和下标n、m、p和q具有与以上所述相同的含义，
如需要，可将它末端的游离醇功能基烷基化或酰基化，或者被烷基或酰基或其它取代试剂在偶联剂的存在下取代，然后进行催化氢化或其它的脱封闭方法，以得到通式I的衍生物
Figure C9980776100151
其中的A、B，以及取代基和下标X、Y、R1 R2 n、m、p和q具有与以上所述相同的含义。
本发明还涉及通式I’的磷酸二肽类化合物的制备方法：
Figure C9980776100152
其中R1和R2分别表示从含有2至24个碳原子的饱和或不饱和、直链或支链的羧酸衍生的酰基，它是未取代的或带有一个或多个选自羟基、烷基、烷氧基、酰氧基、氨基、酰氨基、酰硫基和((C1-24)烷基)硫代基团的取代基，
下标m、p和q是从1到10的整数，
下标n是从0到10的整数，
X和Y分别表示氢原子或膦酰基，
该方法包括，将式H2N(CH2)pCHNH2(CH2)q+1COOH的二氨基酸的(q+1)和ω位的胺功能基分别用易于酸解和易于氢解的封闭试剂封闭，将仍是游离的羧酸功能基与还原剂反应生成相应的醇，将(q+1)位的胺功能基游离然后用式R2OH的羧酸功能基衍生物酰化，其中R2如上所定义，随后将末端胺功能基通过氢解游离得到通式II的氨基醇
Figure C9980776100161
其中R2表示从含有2至24个碳原子的饱和或不饱和、直链或支链的羧酸衍生的酰基，它是未取代的或带有一个或多个以上定义的取代基，
p和q表示从1到10的整数，
然后将该氨基醇在肽缩合剂的存在下在惰性溶剂中与通式III’的ω-羟基氨基酸功能基衍生物缩合
其中R1是从含有2至24个碳原子的饱和或不饱和、直链或支链的羧酸衍生的酰基，它是未取代的或带有一个或多个取代基，
m是从1到10的整数，
n是从0到10的整数，
X是下式的二烷氧基-或二芳氧基-磷酰基基团
Figure C9980776100163
以得到通式IV’的肽类化合物，
其中的取代基R1、R2以及下标m、n、p和q如上所定义，R是易于氢解的基团，如需要，可将它的另一个醇功能基在偶联剂的存在下用磷酸化试剂磷酸化，然后进行催化氢化反应，一方面将酰基R2上选择性存在的醇功能基脱保护，另一方面使磷酸酯功能基游离，然后通过氢解将第二个选择性存在的磷酸酯功能基脱保护，以得到通式V的衍生物
其中Y表示氢原子或膦酰基，然后用有机碱或无机碱选择性地进行成盐的步骤。
酰氨基的手性中心的立体化学由最初使用的氨基酸的构型决定，而酰氨基的立体化学取决于最初使用的脂肪酸的构型。可以用具有L或D构型或外消旋的二氨基酸作为原料。可以用L、D构型的羟基化的氨基酸或外消旋的混合物作为原料。所有这些立体异构体或非对映体均包括在本发明的范围内。
本发明的方法还可以由如下优选的操作步骤来定义，在反应方案1、2和3(图33、34和35)中对其进行了简要描述：
1.按照“Organic Preparations and Procedures International”，23(1992)：191-194中公开的方法封闭鸟氨酸衍生物链上ω位的胺功能基，该过程通过如下步骤来完成：首先将酸功能基与铜盐在碱性介质中反应，然后将该铜羧酸盐与氯甲酸苄酯反应进行N-苄氧羰基取代，通过将铜在酸性环境中螯合使酸功能基游离，得到N-苄氧羰基取代的衍生物。
2.用二碳酸烷基酯例如二碳酸叔丁酯在碱性介质中进行叔丁氧羰基取代来封闭鸟氨酸衍生物羧基部分α位的胺功能基。
二碳酸叔丁酯可与邻近的胺功能基反应生成ω-苄氧羰基氨基α-叔丁基羰基氨基羧酸衍生物。
3.按照《四面体通讯》(Tetrahedron Letters)，32(1991)923-926中公开的方法将羧基功能基转变成伯醇功能基，该方法包括，将羧酸衍生物与氯甲酸烷基酯例如氯甲酸异丁酯反应生成混合酸酐，将其用碱金属或碱土金属硼氢化物还原得到相应的带有伯醇功能基的羟基化衍生物。
4.用三氟乙酸除去α位的叔丁氧羰基，形成三氟乙酸盐形式的胺功能基。
5.用三氟乙酸盐作为原料，将游离的胺功能基用由R2OH酸和氯甲酸烷基酯形成的混合酸酐进行酰化。
6.通过在贵金属催化剂如铂、钯碳或铱载体材料的存在下进行氢解完成末端胺功能基的游离。
7.式II的氨基化合物和式III’的磷酰基衍生物之间的肽偶联或连接在偶联剂如1-异丁氧基-2-异丁氧羰基-1，2-二氢喹啉的存在下在惰性溶剂如含卤的溶剂中完成，或在碳二亚胺的存在下完成。
由此得到通式(IV’)的二肽类化合物，其通过由酰基R2被封闭选择性地产生的羟基功能基。
8.酰基R2的羟基功能基的游离涉及在贵金属如吸附在底物如碳上的钯的存在下氢解。
9.磷酸基团的游离通过在贵金属氧化物如氧化铂的存在下催化氢化来完成。
10.二肽类衍生物IV’的磷酸化通过两步法来完成( Helv.Chim.Acta，70(1987)，175)。在第一步中，将式IV’的化合物与二烷基或二芳基-N，N-二烷基亚磷酰胺在偶联剂例如[1H]-四唑的存在下在极性溶剂如四氢呋喃中反应；然后将形成的亚磷酸酯用芳香族过酸例如过苯二甲酸、间氯过苯甲酸或硝基过苯甲酸氧化成磷酸酯。磷酸基团Y(式V)的游离通过在贵金属例如钯碳的存在下催化氢化来完成。
11.高丝氨酸衍生物的磷酸化用二苯基磷酰基卤化物在吡啶和N，N-二烷基氨基吡啶的存在下完成( Helv.Chim，Acta, 58：(1975)，518)，用二碳酸叔丁酯在碱性介质中处理将胺功能基用叔丁氧羰基封闭，然后，在形成铯盐后，用苄基卤化物在二甲基甲酰胺或二甲基乙酰胺中处理将羧基功能基封闭。
12.高丝氨酸衍生物氮原子的酰化通过如下步骤来完成：将胺功能基用三氟乙酸脱保护得到胺的三氟乙酸盐，然后与通过将羧酸R1OH和氯甲酸烷基酯反应得到混合酸酐在活泼胺例如N-甲基吗啉的存在下反应。
本发明还涉及通式II和通式III及III’的中间体，包括其纯净的对映体形式或立体异构体混合物的形式。
本发明还涉及含有作为活性成分的至少一种中性或带电荷形式的通式I化合物以及无毒的可药用惰性赋形剂或载体的药物组合物。
本发明尤其涉及含有至少一种通式I的化合物与适于治疗应用的有机或无机碱的盐作为活性成分的药物组合物。
本发明还涉及含有纯净对映体形式或立体异构体混合物形式的通式I化合物以及药物赋形剂或载体的药物组合物。
在本文所述的药物制剂中，应当提到的是那些适于通过粘膜、经皮、局部、胃肠外、消化道或吸入给药的药物制剂，例如包衣或未包衣的片剂、胶囊、注射溶液或混悬液、喷雾剂、凝胶、硬膏剂或迅速吸收的溶液。
优选将本发明的化合物通过注射以含水溶液或混悬液的形式给药，可选择性地将其用胺或羟基烷基胺中和。
以下非限定性实施例进一步描述了本发明。在反应方案1-6(图33-38)中对其进行了简要描述。
实施例I
4-(二苯氧基磷酰氧基)-2-[(R)3-十二酰氧基十四酰氨基]丁酸
1.Nα-叔丁氧羰基-DL-高丝氨酸
将2g高丝氨酸(16.78mmol)溶于20ml水，然后向溶液中加入16.78ml 1M NaOH和3.006g碳酸铯(9.23mmol)。搅拌5分钟后，将溶液在冰/水浴中冷却。然后加入60ml二氧六环和二碳酸叔丁酯。将反应混合物在冰冷的水浴中搅拌1小时，然后室温搅拌5小时。随后真空蒸除溶剂。将干燥的残余物直接用于下一步骤。
2. Nα-叔丁氧羰基-苄基-DL-高丝氨酸酯
向步骤1的残余物中，加入20ml二甲基甲酰胺并将溶剂蒸发至干，然后向反应混合物中加入60ml二甲基甲酰胺和4.5ml苄基溴(20.13mmol)。此时有白色沉淀形成。将混合物搅拌16小时。真空蒸除溶剂。将残余物用20ml乙酸乙酯萃取两次。将有机层分别用水(20ml)和盐水(20ml)洗涤，然后用无水硫酸镁干燥。蒸除溶剂并将残余物直接用于随后的步骤。
3. 苄基Nα-叔丁氧羰基-O-(二苯氧基磷酰基)-DL-高丝氨酸酯
将上一步骤的残余物高真空干燥然后溶于二氯甲烷(60ml)。然后向溶液中加入4.11g 4-二甲基氨基吡啶(33.56mmol)，将反应混合物搅拌10分钟，然后加入12ml吡啶和6.95ml氯代磷酸酯(33.56mmol)。将溶液室温搅拌18小时，然后用1N盐酸(5×20ml)、水(30ml)和盐水(30ml)洗涤。将有机层用无水硫酸镁干燥然后真空蒸除溶剂。将残余物通过快速色谱纯化(己烷/乙酸乙酯＝4∶1)。将主要馏份浓缩以使残余物结晶。由此得到7.49g磷酸化的产物，收率82.4％。熔点：63.5-64.0℃。
4. 苄基O-(二苯氧基磷酰基)-DL-高丝氨酸酯
将上一步骤的磷酸化的产物(7.88g，15.4mmol)溶于15ml三氟乙酸然后将溶液室温搅拌2.5小时。真空蒸除溶剂，将残余物通过快速色谱纯化(MeOH/CH2Cl2＝10∶1)。将主要馏份浓缩并使残余物在室温下结晶。由此得到7.17g磷酸化的产物(收率88.9％)。该产物不经纯化直接用于随后的步骤。
5. 苄基2-[(R)-3-十二酰氧基十四酰氨基]-4-(二苯氧基磷酰氧基)丁 酸酯
将4.284g(10.07mmol)(R)3-十二酰氧基十四烷酸(按照 Bull.Chem. Soc.Jpn.， 60(1987)，2205-2214中公开的方法制备)溶于30ml四氢呋喃并将溶液在冰冷的盐水浴中冷却至-15℃。然后加入1.108ml(10.07mmol)N-甲基吗啉和1.31ml(10.07mmol)氯甲酸异丁酯。继续搅拌30分钟。向反应混合物中加入5.724g(10.07mmol)苄基O-(二苯氧基磷酰基)-DL-高丝氨酸酯在30ml四氢呋喃和5ml三乙胺的混合物中的溶液。室温搅拌过夜后，真空蒸除溶剂并向残余物中加入20ml水。然后将混合物用乙酸乙酯萃取(2×30ml)。合并有机层，依次用水(20ml)和盐水(20ml)洗涤，然后用硫酸镁干燥。蒸除溶剂并将残余物通过快速色谱纯化(己烷-乙酸乙酯2∶1，Rf＝0.29)；收率7.455g(87.1％)m.p.31.0℃-32.1℃，1H-NMR(CDCl3，250MHz)，δppm：7.4-7.1(m，15H)，6.90(2d，1H，3J＝7.6Hz，NH)，5.3-5.1(m，3H)，4.7(m，1H)，4.35(m，2H)，2.45(m，2H)，2.4-2.1(m，4H)，1.6(m，4H)，1.4-1.1(m，34H)，0.9(t，6H).13C-NMR(CDCl3，63MHz)，δppm：173.01，171.08，169.66，150.18，(d，2JP，C＝7.1Hz)，135.01，129.60，128.33，128.14，127.96，125.21，119.80(d，3JP，C＝5.0Hz)，70.69，67.05，65.19(d，2JP，C＝5.6Hz)，49.13，40.97，40.77(2种非对映体)，34.20，33.98，33.82，31.70，29.42，29.34，29.14，28.94，25.01，24.47，13.91。
6. 4-(二苯氧基磷酰氧基)-2-[(R)-3-十二酰氧基十四酰氨基]-丁酸
在三颈圆底烧瓶中制备步骤得到的苄酯(2.23g，2.6mmol)在300mlHPLC级甲醇中的溶液，然后加入1.0g碳-10％钯。真空下排空圆底烧瓶中所含的空气，然后在常压下向烧瓶中通入氢气。
将反应混合物室温搅拌1小时，然后在膜上迅速滤除催化剂，将滤液浓缩得到无色液体。经薄层色谱和NMR分析，该产物是纯净的，因此不经纯化将其直接用于偶联步骤；Rf＝0.75(二氯甲烷-甲醇-三乙胺，10∶1∶0.5).1H-RMN(CDCl3，250MHz)，δppm：7.4-7.1(m，10H)，6.85(2d，1H，NH)，5.15(m，1H)，4.6(m，1H)，4.35(m，2H)，2.45(m，2H)，2.4-2.15(m，4H)，1.6(m，4H)，1.4-1.1(m，34H)，0.9(t，6H).13C-NMR(CDCl3，63MHz)，δppm：173.35，171.30(2种非对映体)，172.75，170.37，150.0(d，2JP，C＝7.5Hz)，129.55，125.28，119.71(d，3JP，C＝4.4Hz)，70.78，65.65，(d，2JP，C＝5.9Hz)，49.00，40.77，40.63(2种非对映体)，34.13，33.86，33.76，31.59，29.31，29.25，29.03，28.82，24.88，24.68，22.36，13.76。
4-(二苯氧基磷酰氧基)-2-[(R)-3-苄氧基十四酰氨基]-丁酸可以采用相同的反应方案，通过在实施例I的步骤5中用(R)-3-苄氧基十四烷酸代替(R)-3-十二酰氧基十四烷酸制得。
实施例II
(2R)-5-氨基-2-[(R)-3-苄氧基十四酰氨基]-戊-1-醇
1. D-鸟氨酸的铜盐
向D-鸟氨酸(5.25g，30mmol)的30ml 1M氢氧化钠溶液中，加入50ml五水硫酸铜(3.814g，15.3mmol)的水溶液。继续搅拌2小时。将溶剂蒸发至干。加入60ml甲醇形成紫色固体，分离出该固体并用二氧六环和甲醇洗涤。
2. (2R)-5-氨基-5-苄氧羰基氨基)戊酸铜
将紫色的固体溶于40ml 1M氢氧化钠溶液和70ml二氧六环，将溶液在冰冷的水浴中冷却并加入5.14ml(36mmol)氯甲酸苄酯。继续在冰冷的水浴中搅拌3小时，然后室温搅拌15小时。收集紫色的沉淀并用95％乙醇(40ml)、水(50ml)和乙醇(60ml)洗涤。将沉淀在烘箱中干燥(T＜45℃，真空)；两步的收率为8.27g，预期收率的93％。
3. (2R)-5-(苄氧羰基氨基)-2-(叔丁氧羰基氨基)戊酸
将步骤2得到的铜盐溶于2M盐酸(400ml)并向其中加入EDTA(8.15g，27.8mmol)。将混合物搅拌2.5小时，然后加入氢氧化钠溶液(约160ml)中和至pH7。形成白色沉淀。将混合物在冰冷的水浴中搅拌2.5小时。滤出沉淀，用冷水洗涤直至洗涤液无色，然后在烘箱中于60℃下干燥。将该固体溶于156ml 1M NaOH，然后将该溶液用冰冷的水浴冷却。向该溶液中加入7.7g(35.2mmol)二碳酸叔丁酯的二氧六环(160ml)溶液。将混合物于0℃下搅拌45分钟，然后室温搅拌16小时。蒸除有机溶剂，向残余物中加入70ml乙酸乙酯。加入2N盐酸将水层酸化，pH降至≈3。将水层再用100ml乙酸乙酯萃取一次。合并有机层并用水(30ml)和盐水(30ml)洗涤。真空蒸除溶剂，经快速色谱纯化后得到无色油(收率：两步8.42g，预期收率的76.7％)(Rf＝0.19，二氯乙烷-MeOH 20∶1)。
4. (2R)-5-(苄氧羰基氨基)-2-(叔丁氧羰基氨基)戊-1-醇
向冷的(-15℃)步骤3得到的二氨基戊酸衍生物(5.45g，14.8mmol)的60ml THF溶液中，加入1.654ml(14.8mmol)N-甲基吗啉和9.6ml(14.8mmol)氯甲酸异丁酯(IBCF)。将溶液于-15℃搅拌1分钟，然后加入硼氢化钠(5.104g，44.6mmol)的10ml水溶液。于-15℃继续搅拌10分钟，然后加入400ml水终止反应。将溶液用乙酸乙酯萃取(100ml×2)。合并有机层并用50ml水和60ml盐水洗涤，然后用无水硫酸镁干燥。蒸除溶剂并将残余物用乙酸乙酯/己烷混合物重结晶(4.95g，94.9％收率)m.p.47.5-48℃。
5. 2，5-二氨基戊-1-醇衍生物的脱保护
将6.32g(18mmol)步骤4得到的(2R)-5-(苄氧羰基氨基)-2-(叔丁氧羰基氨基)-戊-1-醇溶于25ml三氟乙酸，然后室温搅拌2.5小时。蒸除溶剂并将残余物通过快速色谱纯化(MeOH/CH2Cl2＝10∶1)。得到无色玻璃状的大块产物，其在室温下熔化。得到5.45g三氟乙酸盐，(收率＝82.7％)。盐酸盐化合物于133.0℃-134.3℃熔化(甲醇重结晶)。
6. (2R)-5-(苄氧羰基氨基)-2-[(R)-3-苄氧基十四酰氨基]戊-1-醇
向预先冷却至-15℃的5.27g(15.8mmol)(R)-3-苄氧基十四烷酸( Bull. Chem.Soc.，Jpn.， 60(1987)，2197-2204)的30ml四氢呋喃溶液中，加入1.89ml(15.8mmol)N-甲基吗啉和2.21ml IBCF(15.8mmol)。将反应混合物于-15℃搅拌30分钟。然后，向溶液中加入5.25g前一实施例的三氟乙酸盐(14.4mmol)的30ml四氢呋喃溶液和1.44ml三乙胺。于室温下继续搅拌16小时，然后加入30ml水和60ml乙酸乙酯；分出有机层并将水层再次用乙酸乙酯(60ml)萃取。合并有机层并用水(30ml)和盐水(30ml)洗涤，然后用无水硫酸镁干燥。蒸除溶剂并将残余物用乙酸乙酯/己烷混合物重结晶(5.842g，，71.2％收率)，m.p.＝117.5-118℃。Rf＝0.32，乙酸乙酯-石油醚3∶1.1H-NMR(CDCl3，250MHz)，δppm：7.4-7.2(m，10H)，6.5(2d，1H，NH)，5.1(s，2H)，4.9(m，1H，NH)，4.5(2d，AB，2H)，3.8(m，2H)，3.5(m，2H)，3.1(m，2H)，2.4(m，2H)，2.4(m，2H)，1.6-1.4(m，6H)，1.4-1.2(m，18H)，0.9(t，3H).13C-NMR(CDCl3，63MHz)，δppm：172.24，156.49，138.06，136.53，128.46，128.04，127.87，76.76，71.39，66.60，65.44，51.54，41.43，40.65，33.76，31.87，29.61，29.30，28.01，26.47，25.05，22.65，14.09。
7. (2R)-5-氨基-2-[(R)-3-苄氧基十四酰氨基]戊-1-醇
在三颈烧瓶中，将150mg 20％钯/碳加入到(2R)-5-(苄氧羰基氨基)-2-[(R)-3-苄氧基十四酰氨基]戊-1-醇(3.0g，5.27mmol)和6ml三乙胺的300ml HPLC-级乙醇溶液中。在真空下排空空气，然后通入氢气。将反应混合物室温搅拌2小时，然后通过膜过滤滤除催化剂，将滤液浓缩得到经TLC证实为纯净的白色固体，该固体不经进一步的纯化直接用于下一步骤，Rf＝0.2，二氯己烷-甲醇-三乙胺5∶10.5，m.p.＝47-48℃。
1H-NMR(CDCl3，250MHz)，δppm：7.4-7.2(m，5H)，6.75(d，1H，NH)4.5(2d，AB，2H)，3.9(m，2H)，3.5(m，2H)，2.3-2.6(m，7H)，1.7-1.2(m，24H)，0.9(t，3H).13C-NMR(CDCl3，63MHz)，δppm：171.86，138.13，128.37，127.87，127.75，76.81，71.50，64.57，51.38，41.51，41.17，33.89，31.82，29.26，28.57，28.03，25.07，22.60，14.04。
(2R)-5-氨基-2-[(R)-3-十二酰氧基十四酰氨基]戊-1-醇可以按照相同的反应方案，通过在实施例II的步骤6中用(R)-3-十二酰氧基十四烷酸代替(R)-3-苄氧基十四烷酸制得。
实施例III
3-[(R)-3-十二酰氧基十四酰氨基]-4-氧代-5-氮杂-9-[(R)-3-羟基十四酰氨基]-癸烷-1，10-二醇1-磷酸二氢酯。
1. 肽偶联
在实施例I中得到的(2RS)-4-(二苯氧基磷酰氧基)-2-[(R)-3-十二酰氧基十四酰氨基]丁酸(1.0mmol)的20ml二氯甲烷溶液中悬浮363.6mg(1.2mmol)IDQ(1-异丁氧基-2-异丁氧羰基-1，2-二氢喹啉)。搅拌15分钟后，加入1.0mmol实施例II制得的(2R)-5-氨基-2-[(R)-苄氧基十四酰氨基]戊-1-醇的10ml二氯甲烷溶液并将反应混合物搅拌4小时。
将反应浓缩并将残余物通过快速色谱纯化(CH2Cl2/丙酮＝5∶2，Rf0.23)。蒸除溶剂得到无色粘稠液体状(0.620g，52.7％收率)磷酸化的二肽类化合物。Rf＝0.49，二氯甲烷-甲醇-三乙胺，10∶1∶0.5。1H-NMR(CDCl3，250MHz)，δppm：7.40-7.15(m，15)，7.00(m，1H)，6.90和6.80(2d，2种非对映体，1H)，6.65(d，1H)(3×NH)，5.15(m，1H)，4.50(m，3H)，4.30(m，2H)，3.85(m，2H)，3.45(m，2H)，3.15(m，2H)，2.41-2.14(m，8H)，1.6-1.4(m，8H)，1.4-1.1(m，54H)，0.9(t，9H，3CH3).13C-NMR(CDCl3，63MHz)，δppm：173.11，171.68，170.52(2种非对映体)，169.94(2种非对映体)，150.0(d，JPC＝7.2Hz)，138.0(2种非对映体)，129.58，127.99，127.49，127.26，125.24，119.73(t，JPC＝5.0Hz)，76.48，71.12，70.71，65.86(宽自旋)，64.22，50.96，49.71(宽自旋)，41.46，41.05，39.07，34.13，34.00，32.70，31.61，29.34，29.06，28.87，27.98，25.25，24.92，24.72，22.38，13.80。
2. 1-(二苯氧基磷酰氧基)-3-[(R)-3-十二酰氧基十四酰氨基]-4-氧代- 5-氮杂-9-[(R)-3-羟基十四酰氨基]癸-10-醇
将以上得到的磷酸化的二肽类化合物(488mg，0.42mmol)和乙酸(1.9ml)的65ml HPLC-级乙醇溶液加入到三颈圆底烧瓶中并加入200mg含10％Pd的钯碳。在真空下排空空气，然后向烧瓶中通入氢气。将反应混合物室温搅拌2小时，然后通过膜过滤滤除催化剂，真空蒸除溶剂得到粗产物，收率92％。将该产物的样品通过快速色谱纯化(CH2Cl2/丙酮5∶4，Rf＝0.24)。得到玻璃状的固体。Rf＝0.68，5∶2二氯甲烷-甲醇。(13C-NMR(CDCl3，63MHz)，δppm(由于存在两种非对映体，因此观察到了少量双峰形式的信号)：173.60，173.15，170.67，170.60，170.27，170.07，150.24(d)，129.92，125.66，120.05，119.90(2d)，71.11，71.05，68.83；66.21(宽自旋)，64.71，51.38；50.32，50.12，43.25，43.12，41.66，41.57，39，30，37.26，34.45，32.84，31.86，29.62，29.5，29.29，29.13，28.08，25.57，25.19，24.97，22.62，14.03。
3. 3-[(R)-3-十二酰氧基十四酰氨基-4-氧代-5-氮杂-9-[(R)-3-羟基十 四酰氨基]癸烷-1，10-二醇1-磷酸二氢酯
在三颈圆底烧瓶中，将氧化铂(137mg)用氢气在无水乙醇(5ml)中预先活化10分钟。然后加入1-(二苯氧基磷酰氧基)-3-[(R)-3-十二酰氧基十四酰氨基]-4-氧代-5-氮杂-9-[(R)-3-羟基十四酰氨基)癸-10-醇(411mg，0.38mmol)的无水乙醇(20ml)溶液。高真空下排空空气，然后向烧瓶中通入氢气。将反应混合物室温搅拌2-3小时，通过膜过滤滤除催化剂，然后真空蒸除溶剂。最后得到白色固体状的粗产物。(粗产物收率：98％)。Rf＝0.50，氯仿-甲醇-水，6∶4∶0.6。
3-[(R)-3-羟基十四酰氨基]-4-氧代-5-氮杂-9-[(R)-3-十二酰氧基十四酰氨基]-癸烷-1，10-二醇1-磷酸二氢酯可以用4-(二苯氧基磷酰氧基)-2-[(R)-3-苄氧基十四酰氨基]丁酸和(2R)-5-氨基-2-[(R)-3-十二酰氧基十四酰氨基]戊-1-醇作为原料按照同样的反应方案(反应方案3)(图35)制得。
或者，3-[(R)-3-十二酰氧基十四酰氨基]-4-氧代-5-氮杂-9-[(R)-3-羟基十四酰氨基]-癸烷-1，10-二醇1-磷酸二氢酯可以用天冬氨酸作为原料按照如下反应方案(反应方案1，5和6)(图33，37和38)制得：将(2R)-5-(苄氧羰基氨基)-2-[(R)-3-苄氧基十四酰氨基]戊-1-醇的游离OH功能基用苄氧基甲基保护，通过氢解将该化合物的5-氨基功能基游离，进行该胺与单酯化的D或L-天冬氨酸衍生物的肽偶联，所述D或L-天冬氨酸衍生物在其氨功能基上带有保护基或(R)-3-十二酰氧基十四酰基，用混合酸酐游离和还原末端羧基功能基，如果需要的话，脱保护，然后将从天冬氨酸衍生的胺功能基用(R)-3-十二酰氧基十四烷酸衍生物进行N-酰基化，将C1上的羟基功能基磷酸化，最后通过氢解将磷酸酯和和羟基功能基脱保护。
实施例IV
3-[(R)-3-十二酰氧基十四酰氨基]-4-氧代-5-氮杂-9-[(R)-3-羟基十四 酰氨基]癸烷-1，10-二醇1，10-二(磷酸二氢酯)的制备
将1-(二苯氧基磷酰氧基)-3-[(R)-3-十二酰氧基十四酰氨基]-4-氧代-5-氮杂-9-[(R)-3-苄氧基十四酰氨基]癸-10-醇(985mg，0.84mmol)与N，N′-二乙基亚磷酰胺二苄酯(0.58ml，纯度85％)在[1H]-四唑(182mg)的存在下在四氢呋喃(35ml)中室温反应30分钟。通过加入间氯过苯甲酸(535mg)的25ml二氯甲烷溶液在0℃至-20℃下将亚磷酸酯中间体氧化。20分钟后，加入Na2S2O3(20ml)以中和过量的氧化剂，然后将有机层用乙醚稀释。分出有机层，依次用Na2S2O3水溶液(5×20ml)、NaHCO3溶液(2×20ml)和盐酸(20ml)洗涤，用MgSO4干燥然后浓缩。将粗产物通过快速硅胶色谱纯化(CH2Cl2-丙酮10∶3)。将得到的保护的二磷酸化衍生物(900mg，75％收率)(Rf 0.64，5∶2二氯甲烷-丙酮)在HPLC级甲醇(1000ml)中、在10％钯碳(300mg)的存在下室温常压催化氢化4小时。通过膜过滤滤除催化剂，然后将滤液减压浓缩，由此得到10-(二羟基磷酰氧基)-1-(二苯氧基磷酰氧基)-3-[(R)-3-十二酰氧基十四酰氨基]-4-氧代-5-氮杂-[(R)-3-羟基十四酰氨基]癸烷粗品(Rf＝0.63，氯仿-甲醇-水6∶4∶0.6)，收率89％。然后将该产物用氧化铂(380mg)在HPLC级乙醇(130ml)中室温常压催化氢化24小时。通过膜过滤滤除催化剂，然后将滤液减压浓缩得到游离的二磷酸二氢酯化合物(Rf＝0.20，氯仿-MeOH-水，6∶4∶0.6)。
3-[(R)-3-羟基十四酰氨基]-4-氧代-5-氮杂-9-[(R)-3-十二酰氧基十四酰氨基]-癸-1，10-二醇1，10-二(磷酸二氢酯)可以从4-(二苯氧基磷酰氧基)-2-[(R)-苄氧基十四酰氨基]丁酸和(2R)-5-氨基-2-[(R)-3-十二酰氧基十四酰氨基]戊-1-醇按照相同的反应方案(反应方案3)(图35)制得。
或者，3-[(R)-3-十二酰氧基十四酰氨基]-4-氧代-5-氮杂-9-[(R)-3-羟基十四酰氨基]癸-1，10-二醇1，10-二(磷酸二氢酯)可以用天冬氨酸作为原料用如下反应方案制得(反应方案1、4和6)：通过氢解将(2R)-5-(苄氧羰基氨基)-2-[(R)-3-苄氧基十四酰氨基]戊-1-醇的5-氨基功能基游离，进行该胺与单酯化的D或L-天冬氨酸衍生物的肽偶联，所述D或L-天冬氨酸衍生物在其氨功能基上带有保护基或(R)-3-十二酰氧基十四酰基，用混合酸酐游离和还原末端羧基功能基，如果需要的话，脱保护，然后将从天冬氨酸衍生的胺功能基用(R)-3-十二酰氧基十四烷酸衍生物进行N-酰基化，将C1和C10上的羟基功能基磷酸化，最后通过氢解将磷酸酯和和羟基功能基脱保护。
实施例V-本发明化合物的纯化和分析
1.一磷酸化和二磷酸化化合物的纯化
将一磷酸化和二磷酸化的合成产物溶于水-异丙醇混合物(1∶1vol./vol.)，用0.1％三乙胺将pH调至8到9。随后加入所需量的2M碳酸氢铵达到25mM的浓度。
通过制备型反相HPLC在如下条件下进行纯化：
柱：Bondapack C18 Prep Pak，40×200mm，15-20μm，300，Waters
流动相：
A：异丙醇-水(1∶1，vol./vol.)，50mM碳酸氢铵
B：异丙醇-水(2∶8，vol./vol.)，50mM碳酸氢铵
流速：40ml/分钟
洗脱：恒溶剂成分吸附在柱上：40％ B(60％A).10分钟。
A∶B梯度：10分钟内40-80％B
恒溶剂成分洗脱：80％B，30分钟
洗涤步骤：100％B，10分钟
检测：UV，210nm(波长)
在上述洗脱条件下，一磷酸化化合物的保留时间从25到30分钟，而二磷酸化化合物的保留时间从18至25分钟。如果观察到有一苯基产物存在(在最后的脱苯基化过程中脱保护不完全)，则需要更好的纯化步骤。该纯化按照如下条件进行：
柱：Kromasil C18，21×250mm，5μm，100，Macherey-Nagel
流动相：
A：异丙醇-水(1∶1-v/v)，50mM碳酸氢铵
B：异丙醇-水(2∶8，v/v)，50mM碳酸氢铵
流速：10ml/分钟
洗脱：恒溶剂成分吸附在柱上：40％B(60％A)，10分钟
恒溶剂成分洗脱：
一磷酸化的化合物：80％B，30分钟
二磷酸化的化合物：74％B，30分钟
洗涤步骤：100％B，10分钟
检测：UV；210和254nm(波长)
收集含有铵盐形式的一磷酸化或二磷酸化化合物的馏份然后浓缩吸附到C18相Bondapack，15-20μm，300上，Waters。通过用10g/lNaCl的水-异丙醇(9∶1，v∶v)溶液洗涤得到一磷酸化或二磷酸化化合物的钠盐。在流过柱子5倍体积的水-异丙醇混合物(9∶1，v/v)除去过量的氯化钠后，将化合物用纯净的异丙醇洗脱。然后在Rotavapor上蒸除溶剂至干。最后用所需体积的水进行溶解(对于一磷酸化的化合物，加入0.1％的三乙醇胺)以达到2mg/ml的目标浓度。然后在0.2μm滤纸(Express Membrane，Millipore(如果体积小于50ml：建议采用Steriflip系统，如果体积大于50ml：建议采用Steritop系统))上进行无菌过滤。
在处理一磷酸化的化合物时，最好在进行无菌过滤前将溶液在室温下超声处理(3×10秒)。
2.纯化的监测和收率
在每一步骤结束后，通过反相分析HPLC色谱按照如下条件对馏份进行分析：
柱：Supelcosil C18，3μm，4.6×150mm，100，Supelco
流动相：
A：水∶乙腈(1∶1，v/v)，5mM TBAP
B：水-异丙醇(1∶9，v/v)5mM TBAP
TBAP：四丁基磷酸铵
流速：1ml/分钟
洗脱：A∶B梯度(75∶25-0∶100)，37.5分钟内
检测：UV，210和254nm(波长)
当按照上述条件机械能色谱分离时，对一-和二磷酸化的化合物观察到的保留时间分别为25.5±0.5和20.8±0.5分钟。对于一磷酸化的化合物，纯化的收率为57至94％，对于二磷酸化的化合物为71至92％。分别达到311mg和189mg一-和二磷酸化的化合物。
3. 最终产物的检测和纯度水平分析
所得产物的定量检测和纯度水平分析通过HPLC/UV按照前述的色谱操作条件进行。根据所述检测，对不同批次的一-和二磷酸化化合物测得的纯度水平为99至100％。为了证实UV范围内的无活性杂质的存在，进行LC/ES-MS分析(电子喷雾解离，正性模式)。对于后者，将(5mM)四丁基磷酸铵用(25mM)乙酸铵代替以满足解离和电子喷雾界面的需要。
采用其它测定方法来对最终的溶液进行检测。例如，对总磷酸根的定量分析(改编自Ames，B.N.，《酶学方法》( Methods in Enzymology)VII(1966)，115-117)、对氨基酸的定量分析(改编自Hughes等，《色谱杂志》( J.Chromatography)， 389：(1987)，327-333)以及对酰基链的定量分析(改编自Miller，LT.，Hewlett Packard Application Note(1984)，228-237)。
4. 光谱学分析
4.1. 质谱法
用三种类型的质谱仪绘制一-和二磷酸化化合物的ES-MS波谱(负性和正性模式)。(Finnigan LCQ，离子阱；Micromass Quattro II，三相四极；Hewlett-Packard MSD，单一四极)。还进行了互补MS/MS分析。表明所述产物的身份和纯度的波谱包括在附图中。
ES-MS波谱(正性模式)
二磷酸化的化合物：
(Micromass Quattro II：波谱1；HP-MSD：波谱3)(图39&41)
在低能量水平下，在m/z比为1014.6观察到了主要的假分子离子[M+H]+。还可以在m/z比为1036.6[M+Na]+、1058.6[M-H+2Na]+和1080.5[M-2H+3Na]+观察到钠加合物。
根据碎裂的程度，观察到了两个916.5[M-98+H]+和818.6[M-98-H]+m/z碎片，这表明在分子中存在两个磷酰基。如波谱3(图41)所示，所观察到的离子的相对强度随着所用能量的范围有很大变化。
一磷酸化的化合物：
(Micromass Quattro II：波谱2)(图40)
由于在分析溶液中存在三乙醇胺(TEoA)，因此对一磷酸化的化合物得到了略微不同的解离图谱。在m/z比为934.4[M+H]+观察到了主要的假分子离子，并且在m/z比为956.3和972.3分别观察到了钠加合物[M+H]+和钾加合物[M+K]+。还可以在m/z比为1083.4[M+TEA+H]+、m/z比为1105.3[M+TeOH+Na]和m/z比为1121.3[M+TeOH+K]+看到第二组加合物。在高能量水平下检测到的m/z比为836.4[M-98+H]+的碎片证实了在分子内存在磷酰基。
ES-MS波谱(负性模式)
在负性ES-MS波谱中观察到的一-和二磷酸化化合物的离子种类与在正性模式中得到的结果完全一致。
还进行了 FAB解离分析(正性模式)。在低分辨率水平下，一-和二磷酸化的化合物分别在956.5和1036.5m/z比显示钠加合物[M+Na]+。
在高分辨率水平下(3-硝基苄醇基质)，对一磷酸酯化合物在m/z比为956.667观察到峰，其对应于预期的分子式：C49H69O11N3PNa(预期质量：956.668amu)。
对于二磷酸酯化合物，在m/z比为1036.635观察到了峰，其对应于预期的分子式C49H97O14N3P2Na(质量的计算值：1036.634amu)。
所有MS分析均证实了所得产物的高纯度。
4.2 核磁共振
一-和二磷酸化化合物的1H-NMR和13C-NMR波谱用DPX Brucker型仪器(分别在250.13和62.89MHz下操作)和Varian Unity Inova系统(分别在500-499.87和125.7MHz下操作)测得。31P-RMN波谱在121.6mHz(DPX Brucker)下记录。证实这些产物身份和纯度的波谱包括在附图中。
1 H-NMR波谱(图谱4 & 5)(图42 & 43)
-一磷酸化的化合物：在于CDCl3+0.1％三乙醇胺(TEoA)中记录的波谱(波谱A)上，在7和9.5ppm之间观察到了与氮原子N(5)、N(2a)和N(2b)所携带的三个质子相对应的信号(参见放大的图谱窗口)。归属于H-N(2a)和H-N(2b)的信号以两个二重峰的形式出现，这表明存在立体异构体的混合物。观察到其中的一种非对映体异构体占多数(由于不同的纯化步骤所引起的)。
-二磷酸化的化合物：在于CDCl3-CD3OD(3∶1，v/v)中记录的波谱(波谱5)上，由于在CD3OD存在下的物质交换而无法看到对应于H-N(5)、H-N(2a)和H-N(2b)的信号。
关于不同信号归属的其它信息来自同核及异核相关实验(1H-1H-NMR∶COSY，1H-13C-NMR：HSQC & HMBC)。
13 C-NMR波谱(图谱6 & 7)(图44 & 45)
由于一-和二磷酸化化合物的溶解度非常低，记录13C-NMR波谱是非常困难的。
31 P-NMR波谱(图谱8 & 9)(图46 & 47)
对于一-和二磷酸化的化合物，均观察到了单峰。
实施例V-本发明化合物的药理学研究
1.通过鲎产色试验测定内毒性
通过产色的鲎变形细胞溶解物试验(Charles River Endosafe的产色LAL，批号#EK412E，Charleston，USA)。该试验是基于脂多糖(LPS)或结构类似的产物对LAL中存在的酶促级联反应的激活。该酶促激活通过在该酶促级联反应的最后阶段与肽连接的色原在蛋白酶的作用下裂解来证实，参见如下反应方案：
                          LPS或产物
                             ↓
                LAL蛋白酶激活和肽/色原分子的水解
                             ↓
Ac-Ile-Glu-Ala-Arg-p-硝基苯胺----------＞Ac-Ile-Glu-Ala-Arg+对-硝基
                                        苯胺
(无色)                                  有色(405nm)
酶促反应在37℃下进行，色原形成的时程在405nm下测定。在该时程测定试验的最后阶段，记录达到OD为0.2单位所需的时间并在LPS标准物(标准曲线)的基础上计算内毒性。
结果用关于标准化的大肠杆菌脂多糖制品的EU(内毒素单位)表示。对于这一系列的试验，1EU相当于0.08mg LPS当量。
结果表现出很大程度的变化性，这对于这种类型的的定量试验是正常的，事实上，它提供了量上的指示。进行LAL试验主要是为了证实在药物制剂中无热源存在(内毒素浓度的上限)。必需将热源含量的定量试验与给定的适宜标准化的单系列实验相比较。
结果
对本发明产物测得的结果(平均值±标准偏差)列于表(A)中：
表(a)鲎变形细胞溶解物(LAL)的激活
产物  LAL活性，EU/mg  LPS等同物的LAL活性ng eq.LPS/mg
OM-294-DP  56±48  6.2
OM-294-MP  13±2  1.4
大肠杆菌LPS(对照)  7.7±1.6×106  0.85×106
在LAL试验中，本发明化合物的活性比LPS低106倍。因此，考虑到它们介导生物学活性和作为免疫调节剂(体内及体外)的能力，OM-294-DP和OM-294-MP因其毒性低而是特别令人感兴趣的产物。
2.由LPS刺激或本发明的化合物引起的小鼠骨髓干细胞增殖的 测定
方法
将两只六周大的的雄性C57/BL6小鼠通过吸入CO2然后进行颈部脱位处死。将小鼠用乙醇洗涤，然后彻底除去背部的皮肤。通过关节分离除去髋骨、股骨和胫骨。用解剖刀粗略地除去肉。将骨清洗并将骨的末端用剪刀切开。通过注射三次1ml Dulbecco′s改良Eagle培养液(DH培养液)从用剪刀切开的末端将骨髓从骨腔中取出。将细胞悬浮在DH培养液中然后以300×g离心5分钟。弃除上清液并将干细胞悬浮在添加了20％胎牛血清(FCS)的DH培养液中。将细胞浓度调至500000细胞/ml。
将预先溶于添加有FCS、氨基酸和抗生素的DH培养液中的产物直接在96-孔微滴定板中进行系列稀释。用稀释因子3.16进行9次稀释。用6个系列测试产物，每个微滴定板包括一个含空白培养基的阴性对照。每孔中的终体积是100μl。将微滴定板在8％CO2-100％RH的保温箱中于37℃保温1小时以缓冲培养基。1小时后，将100μl细胞悬浮液加入到产物中并继续保温7天。
通过测量活细胞线粒体中产色底物(XTT)的氧化来确定增殖。
7天后，将微滴定板以400×g离心5分钟，抽出100μl上清液然后弃除。向各孔中加入50μl 1mg/ml XTT 3-[1-苯基氨基-羰基)-3，4-四唑]-二[(4-甲氧基-6-硝基)苯磺酸]钠和0.008mg/ml PMS((N-甲基二苯并吡嗪，硫酸甲酯)在RPMI培养液中的溶液。在8％CO2、100％RH下在保温箱中于37℃保温8小时后，将微滴定板用分光光度计在480nm下测定，对标准物在690nm下测定。
通过绘制剂量响应曲线将结果用平均值(±标准偏差)表示。将由DH培养基组成的阴性对照的数值(所有实验数据的平均值±标准偏差)也用图表表示。
在该实验中，本发明的化合物可以明显诱导小鼠骨髓干细胞的细胞增殖。该响应的程度几乎与大肠杆菌LPS所诱导的相同，但仅需较小的浓度就可以引起较高的响应。一磷酸化的产物可以诱导比二磷酸化的产物更为温和的响应。图1描述了来自一套三组彼此独立地在不同细胞制备物上进行的研究的代表性实验。
3.测定在巨噬细胞培养物上清液中一氧化氮的产生
方法
将两只六周大的的雄性C57/BL6小鼠通过吸入CO2然后进行颈部脱位处死。将小鼠用乙醇洗涤，然后彻底除去背部的皮肤。通过关节分离除去髋骨、股骨和胫骨。用解剖刀粗略地除去肉。将骨清洗并将骨的末端用剪刀切开。通过注射三次1ml Dulbecco′s改良Eagle培养液(DH培养液)从用剪刀切开的末端将骨髓从骨腔中取出。将细胞悬浮在DH培养液中然后以300×g离心5分钟。弃除上清液并将细胞以40000细胞/ml的密度重新悬浮在添加了20％马血清(HS)和30％L929培养物上清液的DH培养液中。L929是一种鼠成纤维细胞系，其上清液富含巨噬细胞生长因子(M-CSF)。将细胞悬浮液在陪替氏培养皿中分成12ml的等份液，然后在8％CO2和100％RH下在37℃的保温箱中保温8天。8天后，干细胞分化成为成熟的巨噬细胞。通过在4℃下在冰冷的PBS缓冲液中保温45分钟刮掉巨噬细胞。离心并除去上清液后，将细胞重新悬浮在添加有5％胎牛血清(FCS)、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸、叶酸、巯基乙醇和抗生素(青霉素和链霉素)的DH培养液中。收集干细胞并将细胞密度调至700000细胞/ml。
将预先溶于添加有FCS、氨基酸和抗生素的DH培养液中的产物直接在96-孔微滴定板中进行系列稀释。根据所处理的产物，用稀释因子3.16进行9至10次稀释。将产物一式三份地进行测试，每个微滴定板包括一个含空白培养基的阴性对照。每孔中的终体积为100μl。将微滴定板在8％CO2和100％RH下在37℃的保温箱中保温1小时以缓冲培养基。1小时后，将100μl细胞悬浮液加入到产物中并继续保温22小时。
22小时后，将微滴定板以400×g离心5分钟，抽出100μl上清液转移到微滴定板中。向各孔中加入Griess试剂[5mg/ml磺胺+0.5mg/mlN-(1-萘基乙二胺)盐酸盐在2.5％磷酸水溶液中的溶液]。将微滴定板用分光光度计在562nm波长下测定，参照物在690nm下测定。亚硝酸盐的浓度与一氧化氮的含量成比例。根据标准曲线测定亚硝酸盐的含量，该曲线在1至25μM的范围内成线性相关。
在扣除阴性对照值后将结果用平均值±标准偏差表示并以剂量响应曲线绘图。
在该实验中，本发明的化合物以与剂量响应曲线一致的方式诱导鼠巨噬细胞产生一氧化氮。二磷酸化产物诱导的增殖远远高于大肠杆菌LPS，但诱导显著响应所需的浓度较高。一磷酸化产物引起的响应比二磷酸化产物和大肠杆菌LPS弱。图2描述了来自一套三组彼此独立地在不同细胞制备物上进行的测量的代表性实验。
4.确定本发明化合物引发人肺泡巨噬细胞生产α-TNF的能力
方法
肺泡巨噬细胞的制备：通过洗涤来自肺癌患者的肺支气管肺泡(BAL)得到人肺泡巨噬细胞。在涉及肺叶健康部分的肺组织手术后，立即完成BAL。用50ml注射器用0.8％NaCl完成BAL。回收的细胞中85％以上为巨噬细胞，其他细胞中的大部分是淋巴细胞。离心后，将细胞悬浮在RPMI培养基中，然后通过(研究级)Ficoll Pack离心除去红细胞。将巨噬细胞用HBSS洗涤3次，然后以1ml/孔含1000000个细胞接种到24-孔微滴定板中。在37℃保温1小时后，所得的巨噬细胞粘附，用1ml HBSS将孔洗涤3次以除去未粘附的细胞。洗涤步骤后，将1ml RPMI加到含巨噬细胞的各孔中。
与α-TNF产物保温并检测：在存在0.1μg/ml，1μg/ml和10μg/ml下列产物的条件下，将肺泡巨噬细胞在5％CO2下于37℃保温：
-阴性对照：RPMI
-阳性对照：大肠杆菌LPS(血清型O5∶B5，Difco，Detroit，U.S.A.)
-单磷酸化的本发明化合物(OM-294-MP)
-二磷酸化的本发明化合物(OM-294-DP)
24小时后，回收培养上清液，然后分析灵敏度为1pg/ml的αTNF含量(BioSource Cytoscreen Kit，Camarillo，CA，U.S.A)。
结果
在从10μg/ml这样低的浓度，单磷酸化和二磷酸化的本发明衍生物可诱导中等程度地生产αTNF。单磷酸化的本发明衍生物比二磷酸化衍生物能诱导更高程度的αTNF生产。在所检测的3个农度，LPS阳性对照均可诱导αTNF大量生产。
结果列于表(a)中
表(a)在人肺泡巨噬细胞中通过OM-294-MP和OM-294-DP诱导αTNF生产
                   αTNF[pg/ml]平均值±3个独立实验的标准偏差
产物   0μg/ml   0.1μg/ml   1μg/ml   10μg/ml
阴性对照：RPMI   195±70
阳性对照：大肠杆菌LPS   7667±115   9858±2148   10390±3415
OM-294-MP-1   246±38   353±75   1049±295
OM-294-MP-2   205±62   291±70   1124±406
OM-294-DP-1   156±66   117±85   329±141
OM-294-DP-2   171±79   88±61
5. 在人肺泡巨噬细胞中确定本发明化合物对于抑制应答大肠杆 菌脂多糖(LPS)的αTNF生产
方法
肺泡巨噬细胞的制备：通过洗涤来自肺癌患者的肺支气管肺泡(BAL)得到人肺泡巨噬细胞。在涉及肺叶健康部分的肺组织手术后，立即完成BAL。用50ml注射器用0.8％NaCl完成BAL。回收的细胞中85％以上为巨噬细胞，其他细胞中的大部分是淋巴细胞。离心后，将细胞悬浮在RPMI培养基中，然后通过(研究级)Ficoll Pack离心除去红细胞。将巨噬细胞用HBSS洗涤3次，然后以1ml/孔含1000000个细胞接种到24-孔微滴定板中。在37℃保温1小时后，所得的巨噬细胞粘附，用1ml HBSS将孔洗涤3次以除去未粘附的细胞。洗涤步骤后，将1ml RPMI加到含巨噬细胞的各孔中。
与α-TNF产物保温并检测：在存在0.1μg/ml，1μg/ml和10μg/ml下列产物的条件下，将肺泡巨噬细胞在5％CO2下于37℃保温：
-阴性对照：RPMI
-单磷酸化的本发明化合物(OM-294-MP)
-二磷酸化的本发明化合物(OM-294-DP)
24小时后回收培养上清液并分析灵敏度为1pg/ml的αTNF含量(BioSource Cytoscreen Kit，Camarillo，CA，U.S.A)。
结果
二磷酸化衍生物在相对大的程度上抑制正常由LPS诱导的αTNF生产。单磷酸化的衍生物部分抑制由LPS诱导的αTNF生产。
结果列于表(a)中
表(a)在人肺泡巨噬细胞中OM-294-MP和OM-294-DP对LPS-诱导的 α-TNF生产的抑制作用
 产物     αTNF[pg/ml]     ％抑制作用
 RPMI(阴性对照)     73     -
 大肠杆菌LPS(10μg/ml)(阳性对照)     8470     0
 OM-294-MP-1(10μg/ml)+大肠杆菌LPS(1μg/ml)     4577     44
 OM-294-MP-2(10μg/ml)+大肠杆菌LPS(1μg/ml)     4789     41
 OM-294-DP-1(10μg/ml)+大肠杆菌LPS(1μg/ml)     1267     84
 OM-294-DP-2(10μg/ml)+大肠杆菌LPS(1μg/ml)     1280     84
6.OM-294-MP和OM-294-DP产物对树状细胞成熟的影响
评估OM-294-MP和OM-294-DP产物诱导前树状细胞成熟为树状细胞的能力。测量下列参数：CD40，CD80，CD83，CD86表面标记物的FITC-葡聚糖结合物掺入和表达。
方法
细胞：从6名健康供体的血沉棕黄层分离外周血的单核细胞。在供血前供体未经过任何治疗。
细胞的制备：将通过粘附筛选纯化的单核细胞以1×106个细胞/ml的密度重悬在含10％胎牛血清、GM-CSF(10ng/ml；IM-HGMI，Immungenex Corp.，Los Angelos，CA，U.S.A.)和IL-4(10ng/ml；No 204-IL，R&D System，Minneapolis，MN，USA)的RPMI-1640培养基(Sigma-Aldrich：St.-Louis，MO，U.S.A)中，然后分到直径为10cm平皿(P10，Falcon，Becton Dickinson，Plymouth，UK)(10×106细胞/平皿P10)中，培养6天(3天后更换成新鲜的培养基)。这些细胞称为前树状细胞(DC-6)。通过将细胞与以下文 产物节中的浓度的OM-294-MP，OM-294-DP或LPS培养3天使前树状细胞成熟为成熟的树状细胞。在第9天，收集细胞(DC-9)然后分析树状细胞成熟的不同指标：评估CD40，CD80，CD83，CD86表面标记以及其吸收FITC-葡聚糖结合物的能力。用EPICS-XL-MCL型FACS(Coulter Immunology，Hialeah，Finland)分析这些参数。
Lanzavecchia等， J.Exp.Med.， 179(1994)1109；Lanzavecchia等.，J.Exp.Med.，182(1995)389。
数据分析：将表面标记的表达表示为LPS刺激的细胞平均荧光(阳性对照)的百分比；根据在基础培养基中保持的细胞的吸收率来计算FITC-葡聚糖结合物的吸收并以％表示。t-检测包括将从不同实验得到的数据与阳性对照的数据进行比较。数据显著水平设为p＜0.05。
产物：用0.9％NaCl/水制备浓度为1mg/ml的OM-294-MP和OM-294-DP储备液，在OM-294-MP的情况下还加入0.1％三乙胺。将溶液在37°保温20分钟，剧烈振荡3分钟，然后在RPMI-1640培养基中稀释为100μg/ml，然后以10mg/ml(附图3，6，7，8)或者0.02-25μg/ml(附图4，5)的浓度使用。
参考产物：大肠杆菌脂多糖(LPS，DIFCO，Detroit，MI，USA)，作为在PBS中的5mg/ml储备液。用RPMI 1640培养基制备中间的100μg/ml溶液。检测的浓度为10μg/ml(附图3，6，7，8)或0.02-10μg/ml(附图4，5)。
结果
通过GM-CSF和IL-4的连接作用，从单核细胞分化产生的不成熟树状细胞能够掺入FITC-葡聚糖结合物。在成熟过程中，细胞丧失了掺入FITC-葡聚糖结合物的能力。在DC-9分化阶段完成分析。
将结果表示为在非刺激细胞(基础培养基图3中观察到的)掺入FITC-葡聚糖结合物的％。用LPS或OM-294-MP处理的细胞分别仅保留10％和19％噬吞细胞的能力，而用OM-294-DP刺激的细胞全部保留了其掺入FITC-葡聚糖结合物的能力(98和99％)。剂量对反应曲线表明在0.02％g-25μg/ml，OM-294-MP有显著的诱导DC-6分化成DC-9细胞的能力，参见低浓度的附图(4)和已检测较高浓度的附图(5)。
共刺激的表面标记的表达是评估DC成熟的另一指标。检测CD40，CD80，CD83，CD86的表达。将结果表示为基于以LPS-诱导的这些标记之表达的平均荧光的％。
OM-294-MP提高了所有被检测表面标记的表达：CD40(39％)，CD80(62％)，CD83(60％)，CD86(77％)参见附图(6，7，8，9)。
OM-294-DP对所研究标记的表达的影响与基本培养基的相同。所述影响不超过LPS作用的20％。
7.在DC-6阶段OM-294-MP和OM-294-DP产物对单核细胞 和前树状细胞的αTNF和IL-12p70生产的影响
在4小时、6小时和24小时的过程中，用LPS(10μg/ml)或byOM-294-MP(10μg/ml)或OM-294-DP(10μg/ml)刺激DC-6细胞(5×105/500μl培养基)。
方法
体内实验条件：从6名健康供体(在供血前供体未经任何治疗)的血沉棕黄层回收外周血的单核细胞。用Ficoll梯度分离单核细胞，然后通过粘附筛选纯化。回收粘附不紧的单核细胞，将一部分细胞作为单核细胞贮存。将纯化的单核细胞以1×106细胞/ml重悬在含10％FCS的RPMI-1640培养基中，然后以10×106细胞/P10型平皿分到直径为10cm的平皿(P10-Falcon，Becton Dickinson，Plymouth，UK)中。将细胞在含GM-CSF(10ng/ml)和IL-4(10ng/ml)的全RPMI 1640培养基培养6天。在第6天，收集细胞，用HBSS洗涤，然后以5×105细胞/孔的密度接种到500μl全RPMI培养基中，然后用LPS(10μg/ml)，OM-294-MP(10μg/ml)或OM-294-DP(10μg/ml)刺激。在4、6和24小时后回收的培养上清液中用ELISA检测αTNF及IL-12p70。
产物：将OM-294-MP和OM-294-DP产物(在无菌水中的1mg/ml储备液)在37℃培养20分钟，在3分钟内剧烈振荡，然后稀释到100mg/ml，以在RPMI 1640培养基中10μg/ml的终浓度使用。
参考产物：大肠杆菌脂多糖(LPS，DIFCO，Detroit，MI，USA)，在PBS中的5mg/ml储备液，在培养基中的中间溶液：100μg/ml，以10μg/ml的终浓度使用。
αTNF和IL-12p70的检测：按照制造商的说明手册使用来自Biosource的αTNF KHC3012试剂盒，#PP003-J061703批(BiosourceInternational，Camarillo，CA，USA)ELISA。用人IL-12kit(No.D1200，批次990 6232，R&D Systems，Minneapolis，MN，USA)通过ELISA检测培养上清液中的IL-12p70。
结果
αTNF
就时程生产率和αTNF浓度而言，OM-294-MP与LPS相似的方式刺激DC-6细胞的αTNF生产。(图10)。在6小时与24小时之间两种产物均有αTNF峰。
OM-294-DP对DC-6细胞的αTNF生产仅有很微弱的刺激作用。
IL-12p70
一般来说，存在γIFN(LPS+γINF，OM-294-MP+γIFN)的条件下，在单核细胞((图(12))和DC-6细胞((图11))中可诱导IL-12。
8.用Plasmodium berghei环子孢子表面蛋白的C末端区的合成肽(Pb CS His6-242-310)在鼠免疫模型中评估OM-294-MP和OM-294-DP佐剂特性
方法
抗原：Pb CS(HHHHHHGGMN NKNNNNDDSYIPSAEKILEFVKQIRDSIT EEWSQCNVTCG SGIRVRKRKRGSNKKAEDLTL EDIDTEI)肽，下文称作His6-242-310，对应于Plasmodium  berghei环子孢子表面蛋白的242-310氨基酸序列加N末端的6个组氨酸，2个甘氨酸和用Merrifield和Atherton合成方法(Athenon等，Bioorg Chem.，8：(1979)350-351)得到的一个甲硫氨酸残基。在具有0.4mmol/g取代率的对烷氧基苄醇树脂(Wang resin)上制备所述多肽。使用10倍摩尔过量的F-moc氨基酸衍生物，偶连时间为30分钟。依次通过大小排阻色谱(Sephadex G25，Pharmacia，Sweden)、反相色谱(W-Porex 5 C-4，250×10mm，Phenomenex，Torrance，CA，U.S.A)用10-50％乙腈-0.1％三氟乙酸混合物(v/v)的40分钟的梯度，以3ml/分钟流速纯化所述肽。按照Knecht和Chang( Anal.Chem.， 58(1986)2373-2379)的方法确定所述肽的氨基酸组成，用Voyager DE型仪器(PerspectiVe Biosystem，Framingham，MA，USA)检测分子量。用pH8.0的0.9％NaCl/水制备浓度为0.4mg/ml的抗原储备液。
佐剂：用0.9％NaCl-水制备浓度为1mg/ml的OM-294-DP和OM-294-MP的储备液，在OM-294-MP中掺入0.1％三乙胺。阳性对照由不完全弗氏佐剂(IFA from Difco，Detroit，MI，USA)组成，而阴性对照是0.9％NaCl溶液。
抗原-佐剂混合物：将1体积抗原和1体积佐剂通过旋转3分钟混合。
免疫接种方案：给6-周龄的雌性BALB/c小鼠(每组6只小鼠)免疫接种3次，在尾末端皮下注射0.1下列混合物：
  组     佐剂0.05mg/注射   抗原0.02mg/注射     小鼠数
  1     -   Pb CS His6-242-310     6
  2     IFA   Pb CS His6-242-310     6
  3     OM-294-MP   Pb CS His6-242-310     6
  4     OM-294-DP   Pb CS His6-242-310     6
  5     OM-294-MP   -     6
  6     OM-294-DP   -     6
免疫接种和取样方案：
    周     0     3     4     7     9
    免疫接种     ↑     ↑     ↑
    抗体特异性反应     ↑     ↑     ↑     ↑
    CTL反应     ↑     ↑
淋巴样器官和血液取样：
血清取样：在0，3，7和9周完成取血样。将血液在37℃放置6分钟，然后在4℃保持过夜。随后将血清冷冻直至用于抗体检测。
腹股沟淋巴结和脾的回收：分别在4或9周将每组动物中的一部分杀死。取出腹股沟淋巴结和脾。
抗-Pb CS His6242-310抗体滴度的确定 ：
用ELISA检测特异性针对Pb Cs His6 242-310抗原的抗体。在96孔微滴定板(Maxisorp F96，Nunc，DK)中，在4℃的湿润室中保温过夜，完成抗原的结合，每孔含有0.1ml含0.001mg/ml Pb CS His6 242-310抗原的PBS。用含1％ of牛血清白蛋白(BSA，Fluka，Switzerland)的PBS完成微滴定板的阻断。用含0.05％吐温20(Sigma，St.Louis，MO，USA)的PBS洗涤平板。将在0，3，7和9周收集的血清样品用稀释缓冲液(含2.5％脱脂奶粉和0.05％吐温20的PBS)系列稀释，然后转移到微滴定板中，在室温(RT)放置1小时。然后用PBS洗涤平板，然后将含有与碱性磷酸酶(Sigma，St.Louis，MO，USA)偶连的小鼠多克隆抗免疫球蛋白的稀释溶液加到各平板中，然后在RT保温1小时。将平板用PBS洗涤，加入碱性磷酸酶底物对硝基苯磷酸(Sigma，St.Louis，MO，USA)的颜色反应显示特异性抗体。用微滴定板阅读器(Dynatech 25000ELISA阅读器，Ashford，Middlesex，UK)读出在405nm的吸收值，每个血清样品测量两次。结果是与各组中的小鼠有关的所有测量值的平均值。通过给出显著阳性反应的最高稀释度得到抗体滴度，即大于本底噪音水平±3SD的OD。
ELISPOT检测：
通过在4℃湿润室中保温过夜结合鼠γ-干扰素(O1E703B2)特异性的抗体，将50μg/ml抗体溶液加到ELISPOT微滴定板中，用硝酸纤维素(Millipore，Molsheim，France)覆盖孔底。通过加入含10％ of胎牛血清(FCS，Fakola，Switzerland)的DMEM培养基(Life Technologies，GrandIsland，NY，USA)，然后在37℃放置2小时完成阻断步骤。将来自淋巴样器官(腹股沟淋巴结和脾)的细胞以200000细胞/孔的密度在微滴定板中培养，然后在37℃与用或未用短肽攻击的Pb CS 245-252100 000P815细胞培养24小时。培养后，取出细胞，洗涤步骤后，加入第二鼠抗-γIFN抗体-生物素复合物(ANI，在含1％BSA的PBS中，2μg/ml)，然后培养2小时。加入链霉抗生物素-碱性磷酸酶结合物(Boehringer Mannheim，Mannheim，GFR)然后在37℃保温1小时，此后用含0.05％吐温20的PBS洗涤3次，再用PBS洗涤3次。通过加入BCIP/NBT底物(Sigma，St.Louis，MO，USA)表明抗-γIFN免疫复合物的存在。通过用自来水洗涤终止反应。在立体显微镜下计数为γIFN阳性的点。特异性的点计数是存在用肽攻击的细胞时计数的点与不存在肽时计数的点之间的差异。结果为各组中小鼠的平均测量值。将其表示为每1百万个培养的细胞的点数。
结果
抗体反应：用图表示进行了1、2和3次免疫注射的小鼠的PbCS His6-242-310特异性抗体的生产，用ELISA确定的。对照包括仅注射一次抗原，产生很弱的抗体滴度。分别与OM-294-MP或OM-294-DP混合后注射一次抗原产生的抗体滴度几乎与用不完全弗氏佐剂(IFA)与相同抗原混合注射得到的反应一样高(图(13)。2次注射后，OM-294-MP和OM-294-DP佐剂分别均能引发比IFA强的血清反应(图(14)。3次注射后，OM-294-MP和OM-294-DP佐剂能够引发比IFA强的血清反应(图(15)。
图(13)ELISA，在第一次免疫接种后3周进行。
图(14)ELISA，在第二次免疫接种后4周进行。
图(15)ELISA，在第三次免疫接种后2周进行。
图(16)在1、2和3次免疫注射前后测量的抗体滴度。
按平均值给出1次免疫注射前和1、2和3次免疫注射后各组动物的抗体滴度(图(16)。
  CTL反应：用ELISPOT试验清楚地表明了在预先用于免疫接种的Pb CS His6-242-310肽中存在的T细胞表位Pb CS 245-252的识别。通过γ干扰素(γIFN)的阳性点计数的增加说明在免疫动物中记录的T淋巴细胞反应(腹股沟淋巴结和脾，分别在第2次注射后一周和第3次注射后2周记录的)。按用各稀释度和各组小鼠的测量平均值计算图(17，18，19和20)中的结果。将其表示为每1百万个培养细胞的点数。
在来自脾和腹股沟淋巴结的淋巴细胞的CTL反应中，OM-294-MP和OM-294-DP佐剂均有显著的提高。脾反应高于腹股沟淋巴结的反应。由OM-294-MP和OM-294-DP佐剂诱导的CTL活性明显优于IFCTL活性。
9.通过毛细管电泳说明非共价OM-294-抗原复合物
在本实施例中使用毛细管电泳说明在配制疫苗制品的过程中，OM-294-DP与Pb CS His6-242-310肽间非共价复合物的形成。
方法
方法：用1N NaOH(Fluka N°7207调到pH7.4的20mM硼酸钠缓冲液(四硼酸二钠十水合物，Merck，N°6306)
分区的毛细管(ungrafted)，长度30cm，直径50μm。
用Beckman PACE MDQ型仪器(Beckman，Brea，CA，USA)在200nm完成检测。
分离条件
  时间[分钟] 过程 压力   溶剂
  0.00 毛细管洗涤 20.0psi   H2O
  3.00 毛细管洗涤 20.0psi   1N NaOH
  6.00 样品注射 0.5psi   硼酸盐缓冲液
  6.08 分离 30.0KV   硼酸盐缓冲液
抗原： 在H2O中1mg/ml的Pb CS His6-242-310合成肽
佐剂：在H2O中1mg/ml的OM-294-DP
抗原-佐剂混合物：250μg/ml+250μg/ml
结果
在电泳图上，通过佐剂峰的消失和产生新峰的抗原峰的位移(这是新形成的复合物特异性的)说明在该疫苗制品配制过程中观察到的抗原-佐剂形成(图(21)。
10.通过在BDIX大鼠中注射来自PROb同基因肿瘤细胞系的 的细胞治疗腹膜癌
本实验的目的在于说明当给有数毫米大小肿瘤的大鼠静脉内系列注射时，OM-294-DP的抗肿瘤效果。
方法
动物：近亲交配的BDIX大鼠品系是由H.Druckrey在1937建立的。一对来自Fribourg Max Planck Institute(RFA)大鼠是该品系的最初来源，该品系自1971年已被通过单系系统保持在实验室动物收藏中心(laboratory animal house facility)。按照该系统，筛选一对姐妹-兄弟个体产生下一代。在本研究中所用的大鼠来自ffa-Credo(Arbresle，法国)的实验动物育种中心(Experimental Animal Breeding Center)，该中心可代表申请人的实验室完成育种。所用的大鼠为雄性，3月±1周。
通过注射PROb细胞诱导的肿瘤：
PROb细胞源：DHD/K12细胞系最初得自通过1，2-二甲基肼处理在近亲交配的BDIX大鼠中诱导的结肠癌片段的移植物。将该细胞系的粘附系列再根据其对胰蛋白酶处理的敏感性分成亚系，将很难脱落的细胞称为DHD/K12-TR。当注射到同基因BDIX大鼠中时，DHD/K12-TR细胞产生稳定发展的肿瘤。克隆该细胞系，仅将称为PROb的DHD/K12-TRb克隆用于本发明的研究。
培养条件：在37℃密封瓶(Falcon，Becton Dickinson，New Jersey，USA)中，在加入了10％胎牛血清(FCS，Anval，Betton，France)的由Ham’s F10培养基(Bio-Whittaker，Walkersville，USA)组成的完全培养基中培养粘附的PROb细胞。每隔3天更换培养基。细胞汇合后，用2ml EDTA/胰蛋白酶溶液，然后用2ml相同的溶液漂洗2-3分钟，从支持物上释放细胞或者刮掉细胞；将细胞重悬在全培养基中，加入FCS终止胰蛋白酶的作用。以有规律的间隔，用Hoechst荧光染料33258(Aldrich Chimie，Steinheim，GFR)T通过DNA染色检测在支原体和细胞细胞中是否有污染。
腹膜癌的诱导：按“培养条件”节所述从其支持物上是否PROb细胞，然后在台盼蓝染色溶液中计数作为评估细胞活力的方法。将细胞悬浮在Ham’s F10培养基中。通过将106个活PROb细胞注射(腹膜内)到乙醚麻醉的同基因BDIX大鼠中来诱导腹膜癌。在第10天完成肿瘤细胞注射。在这些条件下，所有大鼠都发展了腹膜癌以及血腹水，并在细胞注射后第第6天至第12天之间死亡。
腹膜癌的治疗：在肿瘤细胞注射后13天，当癌体积由直径数毫米的小结组成时，开始治疗。通过以1mg/kg体重的速率并以溶于0.9％NaCl溶液0.6mg/ml的剂量静脉内注射10次OM-294-DP进行治疗。每周向阴茎血管内注射3次。对照组仅用载体即0.9％NaCl治疗。
评估治疗效果：在肿瘤细胞注射后的第42天、第6周，杀死大鼠并解剖，通过盲实验评估癌的发展。无法测量癌体积，但是可将癌分成4种不同的类似。根据小结所数目和直径定义了5类。
0型：未看到小结
1型：容易计数到直径为0.1-0.2cm的小结
2型：观察到无数0.1-0.5的小结
3型：腹腔被小结侵染，其中一些小结直径为1cm。
4型：腹腔完全被数厘米大小的肿瘤侵染。
腹水体积和动物体重的变化：通过两次测量动物体重来测量腹水体积。可评估仅通过注射0.9％NaCl进行治疗的对照组大鼠的正常癌发展和随访治疗。
评估治疗效果：将治疗组大鼠的存活率与对照的存活率进行比较；将治疗组大鼠的癌和腹水体积与对照大鼠的测量值进行比较。
统计学分析：用Kruskal-Wallis试验确定不同类型癌的免疫治疗效果的统计学显著性。另外，对腹水体积数据进行方差分析试验，对存活数据进行对数等级试验(log rank test)。
结果
癌：在该模型中，OM-294-DP有显著的抗肿瘤活性。通过肿瘤-自由动物(class 0)更具体地说明了该活性，对于肿瘤体积来说，与NaCl对照的差异是显著的(p＜0.05)。OM-294-DP对腹水体积的治疗效果业是显著的(p＜0.05)。
表(a)癌分类和腹水体积
治疗              患某类癌的大鼠数   产物的效果(*)     腹水体积ml/大鼠   产物的效果(**)
0  1   2  3  4 范围  平均值±σ
NaCl(1) 1  0  1  0  7   -  0-84  38±29   -
OM-294-DP(2) 4  1  2  1  2   p＜0.05  0-73  8±23   p＜0.05
(*)：Kruskall-Wallis试验，(**)：方差分析.
(1)：在被处死前8-10大鼠死于癌症，在第34天1只大鼠有小结和黄疸但不能进行准确的分类(嗜食同类，在D37，1只大鼠属于(4型)，在D38，2只大鼠属于(4型)；在D39，1只大鼠属于(4型)，在D40，2只属于(4型)和D41，1只属于(4型)。1只0型大鼠在解剖后有皮下肿瘤，可能是癌细胞注射失败。
(2)：在D14，1只大鼠在治疗注射时死亡，后者未患癌。在0型中，一只被处死的大鼠有皮下肿瘤(癌细胞注射失败)。
存活：
在第42天处死动物。在注射肿瘤细胞后第42天确定存活率，90％用OM-294-DP治疗的动物存活，而未治疗组仅有20％存活。
OM-284-DP显著提高了大鼠的存活率(p＜0.001)。
体重：根据表(b)中的数据，与仅用NaCl治疗的动物相比，OM-294-DP对体重变化有没有显著影响。
表(b)大鼠的体重变化(平均值±标准偏差)
  天   NaCl  OM-294-DP
  0   314±19  277±19
  13   337±18  310±21
  20   342±20  304±23
  29   361±23  317±24
  41   314±38  327±26
11.在鼠免疫模型中通过鼻施用幽门螺杆菌脲酶B亚单位评估 OM-294-DP佐剂特性
已表明在存在霍乱毒素(CT)为基础的佐剂时，当经口或鼻施用幽门螺杆菌的脲酶B亚单位进行免疫可使小鼠不感染幽门螺杆菌。Corthésy-Teulaz I.，等，肠胃病学( Gastroenterology)， 109：(1995)：115；Michetti P.等，肠胃病学( Gastroenterology)， 116：(1999)804；Saldinger P.F.等，肠胃病学( Gastroenterology) 115：(1998)891。按照在免疫小鼠血清中测量的，这种抗-Ure B体液反应主要是IgG1(Th2反应)。用以1周的间隔通过鼻施用重组幽门螺杆菌脲酶B亚单位(UreB)和OM-294-DP将BALB/c小鼠(n＝6)免疫4次来评估OM-294-DP的佐剂作用。将BALB/c对照小鼠仅用OM-294-DP佐剂免疫。最后一次加强注射2周后，从每只小鼠取血样以通过ELISA检测血清抗-UreB免疫球蛋白(总IgG，IgG1和IgG2a)。
方法
动物：BALB/c/Ola/HsD小鼠(Harland，Horst，Netherlands)：24只小鼠.
抗原：HpUreB 1-569，按照前述方法(Michetti等，肠胃病学( Gastroenterology)， 107：(1994)1002)在大肠杆菌(M15菌株，Qiagen，Hilden，GFR)表达为重组蛋白。
佐剂：OM-294-DP(2.2mg/ml储备液)
免疫方案：
每组含6只小鼠：
A组：每周一次连续4周鼻施用25μg OM-294-DP(每剂量25μl)给6只BALB/c小鼠免疫接种4次。
B组：每周一次连续4周鼻施用50μg Ure B1-569+25μg OM-294-DP(每剂量25μl)给6只BALB/c小鼠免疫接种4次。
最后一次鼻免疫2周后，通过尾针刺从A和B组中的每只小鼠取血。
血清IgG的检测：
包被缓冲液(pH9.6)：每1升，Na2CO3(15mM，1.59g)，NaHCO3(34.8mM，2.93g)，硫汞撒(0.01％)；PBS-吐温缓冲液pH7.4：每1升，NaCl(137mM，8.0g)，KH2PO4(1.5mM，0.2g)，Na2HPO4(8.0mM，1.15g)，KCl(2.7mM，0.2g)，吐温20(0.1％1ml)； 柠檬酸/磷酸缓冲液pH5.0：每1升，柠檬酸(44.4mM，9.32g)，Na2HPO4(103mM，14.6g)； 底物溶液 10x(O-苯二胺＝OPD)(10-倍浓缩的)：(10mg/ml在柠檬酸缓冲液中)；
叠氮化钠溶液：1％， 终止溶液：在柠檬酸/磷酸缓冲液0.1M pH5.0中的0.01％叠氮化钠
方法：用包被缓冲液pH9.6(500μl UreB溶液/50ml缓冲液)制备浓度为5μg/ml的抗原溶液(在1999年5月26日制备的UreB 1-569，0.5mg/ml储备液)。将100μl移取到3个圆底96-孔平板的每个孔中(0.5μg UreB/孔)。将平板在37℃保温2小时。从平板中弃去上清液。通过加入100μl PBS-0.1％吐温溶液+5％奶粉/孔阻断孔。将平板在37℃保温30分钟。弃去阻断溶液，将孔用100μl PBS-吐温洗涤3次。弃去上清液。用PBS-0.1％吐温缓冲液(5μl血清在1ml PBS-吐温中)制备1∶200稀释的各待测小鼠的血清。将血清(100μl)一式两份分在3个平板中(1个平板检测总IgG，1个平板检测IgG1和1个平板检测IgG2a)。在4℃保温过夜。用100μl PBS-吐温将孔洗涤3次。PBS-吐温缓冲液逐个制备1∶500稀释的生物素-结合的-抗-IgG总抗体(Amersham，Cat#RPN 1177)，抗-IgG1抗体(Amersham Cat#RPN 1180)和抗-IgG2a抗体溶液(Pharmingen Cat#～02012D)。将100μl抗-IgG总抗体溶液加到N°1平板中，将100μl抗-IgG1溶液加到N°2平板中，将100μl抗-IgG2a抗体溶液加到N°3平板中。在37℃保温1小时。用PBS-吐温将孔洗涤3次。用PBS-吐温缓冲液制备的1∶1000稀释的链霉抗生物素-HRP(Dako，Cat#p0397)，然后向每个孔中加入100μl溶液。在37℃保温1小时。用PBS-吐温将孔洗涤3次。通过用0.1M柠檬酸/磷酸缓冲液稀释10倍OPD溶液(10x)制备底物溶液。向稀释的OPD溶液中加入1μl of H2O2。向每孔加入50μl底物溶液。10-20分钟出现颜色。通过加入50μl终止缓冲液终止反应。用阴性对照作为空白在492nm(用在620nm读的标准)读出吸收值。
统计学分析：数据为平均值±SD(n＝6)。P值来自t-试验。数据显著水平设在p＜0.05。
结果
用UreB-1-569+OM-294-DP通过鼻给药免疫的小鼠发展了抗-UreB体液免疫性：在血液中存在抗-UreB1-569 IgG1。
通过ELISA检测小鼠血清中特异性抗Hp UreB的抗体的存在。将UreB(0.5μg/孔)与碳酸盐缓冲液pH9.6一起分散到圆低96孔平板中。通过兔抗-IgG总抗体、抗-IgG1和IgG2a抗体检测特异性抗体。结果为在492nm的光密度(OD)。如果在首次用于试验的小鼠血清中，OD值比测量值大3倍，则认为是阳性。在仅用OM-294-DP免疫的小鼠血清中没有检测到抗UreB抗体。已用Ure+OM-294-DP免疫的小鼠也发展了总抗-UreB IgG抗体(OD＝0.274±0.130，p＜0.05)和抗-UreBIgG1(OD＝0.212±0.128，p＜0.05)，但未发展抗-UreB IgG2a抗体(OD＝0.008+0.005，不显著)。
通过鼻施用(UreB)+OM-294-DP，用幽门螺杆菌的脲酶B亚单位免疫的BALB/c小鼠发展了主要为IgG1的抗-UreB体液反应。因此，OM-294-DP可作为经鼻施用的佐剂并促进Th2型体液免疫的发展。
12.OM-294-MP和OM-294-DP与H1N1抗原结合：确定1或2 次皮下给药后在小鼠中产生的特异性抗体
方法
本研究的目的在于说明OM-294-MP和OM-294-DP对流感抗原H1N1(262195 A/B Beijing haemagglutinin，Solvay Duphar，Weesp，NL)的佐剂作用。为了达到该目的，将60只BALB/c小鼠(雌性，在治疗开始时8周龄)分成如下6组：
组   抗原终浓度：2.5μg/动物/注射   佐剂终浓度：50μg/动物/注射   NaCl(0.9％)   注射的体积
A：NaCl   -   -   150μl   150μl
B：H1N1   H1N1 (100μl)   -   50μl   150μl
C：H1N1+OM-294-MP   H1N1(100μl)   OM-294-MP(50μl)   -   150μl
D：H1N1+OM-294-DP   H1N1(100μl)   OM-294-MP(50μl)   100μl   150μl
E：OM-294-MP   -   OM-284-MP(50μl)   100μl   150μl
F：OM-294-DP   -   OM-284-DP(50μl)   100μl   150μl
抗原：用0.9％NaCl制备浓度为25μg/ml的H1N1储备液。
佐剂：用注射用水制备浓度为1mg/ml的OM-294-DP和OM-294-MP储备液，向OM-294-MP中加入0.1％三乙醇胺。阴性对照为不含抗原的0.9％NaCl溶液。
抗原-佐剂混合物：在旋转3分钟前，将佐剂在37℃保持20分钟。然后，按上表说明加入抗原和NaCl(0.9％)，将抗原-佐剂混合物旋转混合物，然后在室温下放在旋转搅拌器上15分钟，最后将全部混合物旋转3分钟。
免疫方案：在0和14天进行注射。通过皮下施用上表中的混合物(一边75μl，每只动物共150μl)。在第14和18天取血(针刺眼眶)。
抗-H1N1免疫球蛋白的检测：通过ELISA一式两份检测特异性抗H1N1的下列血清免疫球蛋白：IgG1，IgG2a，和IgM。简而言之，在4℃将微滴定板(NUNC Immunoplate，Roskilde，DK)与在碳酸氢盐缓冲液pH9.6中的100μl H1N1(0.5μg)一起保温(过夜包被)。用0.5％吐温-20(Merck Hohenbrunn，D)洗涤后，将血清稀释50-，200-和800-倍(稀释溶液：磷酸缓冲的盐(PBS)+1％牛血清白蛋白(BSA，Sigma，St.Louis，MO，USA)+0.02％吐温-20))。将100μl各稀释的血清样品加到孔中。在37℃保温45分钟。
第二次洗涤步骤后，在37℃，将特异性抗H1N1的IgG1，IgG2a和IgM与预先用PBS/BSA/吐温缓冲液(分别稀释250-，1000-，500-倍稀释的)100μl抗-IgG1抗体(抗-小鼠大鼠抗体)-过氧化物酶结合物(Serotec，Oxford，UK)、IgG2a-过氧化物酶结合物(Pharmingen，San Diego，CA，USA)和IgM-生物素结合物(Pharmingen，San Diego，CA，USA)一起保温30分钟。对于IgM，额外的洗涤步骤后，需要与1∶100稀释的链霉抗生物素-过氧化物酶结合物(Dako，Glostrup，DK)第三次保温(30分钟，37℃)。
洗涤步骤后，加入100μl亚苯基1，2-二胺溶液(OPD，Merck，Darmstadt，GFR)以检测过氧化物酶-结合的抗-IgG1和抗-IgG2二级抗体(而对于IgM，所用的试剂是3′，3′，5′，5′-四甲基联苯胺(TMB，Sigma，St.Louis，MO，USA)。在室温保温20分钟后，通过加入100μl 2N H2SO4终止反应。用Bio-Rad 3550型平板阅读器读出在490nm的吸收值。
结果
在490nm的各读数以绝对单位(A.U.)/ml给出。这是通过将各样品标准进行比较而得到的，所述标准是从在第28天从B组(仅注射H1N1的动物)收集的样品池的不同稀释物制备的。如该术语是指，稀释50倍的样品池的浓度为1000A.U./ml。然后用相应的稀释因子(50，200，或800倍)校正每个结果。本文仅报告各的平均值和标准偏差(SD)。
表a)针对H1N1的IgG1亚型特异性产生的免疫球蛋白(绝对单位/ml±SD，**p＜0.01(Anova &(两侧)Durnetts试验)。
组   第14天   第28天
A：NaCl   3±5   0±0
B：H1N1   11161±5755   53950±23403
C：H1N1+OM-294-M   34411±13719   228467**±109123
D：H1N1+OM-294-D   30101±19061   382325**±201314
E：OM-294-MP   69±34   59±31
F：OM-294-DP   59±21   38±25
表b)针对H1N1的IgG2a亚型特异性产生的免疫球蛋白(绝对单位/ml±SD，**p＜0.01(Anova &(两侧)Dunnetts试验)。
 组   第14天   第28天
 A：NaCl   0±0   0±0
 B：H1N1   26883±20779   50352±30846
 C：H1N1+OM-294-M   179344**±139781   1622722**±986195
 D：H1N1+OM-294-D   103630±96257   681441±1072710
 E：OM-294-MP   1619±743   1767±1034
 F：OM-294-DP   452±584   782±857
表c)针对H1N1的IgM亚型特异性产生的免疫球蛋白(绝对单位/ml±SD，**p＜0.01(Anova &(两侧)Dunnetts试验)。
组   第14天   第28天
A：NaCl   22102±5862   21531±3693
B：H1N1   37787±15001   57306±26886
C：H1N1+OM-294-M   67936**±21334   95108±38669
D：H1N1+OM-294-D   598100*±18324   92920±26971
E：OM-294-MP   19065±4069   18018±1016
F：OM-294-DP   20756±7160   20944±9065
这些结果表明OM-294-MP和OM-294-DP佐剂在所研究的模型中是有活性的，因为在1或2次注射后，它们都能显著提高小鼠中针对H1N1特异性产生的抗体滴度(见图22，23，24)，而与考虑的免疫球蛋白亚型(IgG1a，IgG2a和IgM)无关。
13.OM-294-OM和OM-294-DP与卵清蛋白抗原联用：确定在1 或2次皮下给药后在小鼠中产生的特异性抗体
方法
本研究的目的是和面OM-294-MP和OM-294-DP对卵清蛋白抗原(Fluka Chemie，Buchs，Switzerland)抗体的佐剂效果。为了达到该目的，将50只BALB/c小鼠(雌性，在治疗开始时8周龄)按如下分成5组：
组   抗原终浓度：50μg/动物/注射   佐剂s终浓度：50μg/动物/注射   NaCl   注射的体积
A：NaCl   -   -   150μl   150μl
B：Ova   Ova(100μl)   -   50μl   150μl
C：Ova+OM-294-MP   Ova(100μl)   OM-294-MP(50μl)   -   150μl
D：Ova+OM-294-DP   Ova(100μl)   OM-294-DP(50μl)   -   150μl
E：OM-294-MP   -   OM-294-MP(50μl)   100μl   150μl
抗原：用0.9％NaCl制备浓度为0.5mg/ml的卵清蛋白储备液。
佐剂：用注射用水制备浓度为1mg/ml的OM-294-DP和OM-294-MP储备液，对于OM-294-MP，加入0.1％三乙醇胺。阴性对照是不含抗原的0.9％NaCl溶液。
抗原-佐剂混合物：将佐剂在37℃保持20分钟，然后旋转混合3分钟。然后，按上表说明加入抗原和NaCl(0.9％)，将抗原-佐剂混合物旋转混合物，然后在室温下放在旋转搅拌器上15分钟，最后将全部混合物旋转3分钟。
免疫方案：在0和14天进行注射。通过皮下施用上表中的混合物(一边75μl，每只动物共150μl)。在第14和18天取血(针刺眼眶)。
抗-卵清蛋白免疫球蛋白的检测：通过ELISA一式两份检测特异性抗卵清蛋白的下列血清免疫球蛋白：IgG1，IgG2a，和IgM。简而言之，在4℃将微滴定板(NUNC Immunoplate，Roskilde，DK)与在碳酸氢盐缓冲液pH9.6中的100μl卵清蛋白(0.5μg)一起保温(过夜包被)。用0.5％吐温-20(Merck Hohenbrunn，D)洗涤后，将血清稀释50-，200-和800-倍(稀释溶液：磷酸缓冲的盐(PBS)+1％牛血清白蛋白(BSA，Sigma，St.Louis，MO，USA)+0.02％吐温-20))。将100μl各稀释的血清样品加到孔中。在37℃保温45分钟。
第二次洗涤步骤后，在37℃，将特异性抗卵清蛋白的IgG1，IgG2a和IgM与预先用PBS/BSA/吐温缓冲液(分别稀释250-，1000-，500-倍稀释的)100μl抗-IgG1抗体(抗-小鼠大鼠抗体)-过氧化物酶结合物(Serotec，Oxford，UK)、IgG2a-过氧化物酶结合物(Pharmingen，SanDiego，CA，USA)和IgM-生物素结合物(Pharmingen，San Diego，CA，USA)一起保温30分钟。对于IgM，额外的洗涤步骤后，需要与1∶100稀释的链霉抗生物素-过氧化物酶结合物(Dako，Glostrup，DK)第三次保温(30分钟，37℃)。
洗涤步骤后，加入100μl亚苯基1，2-二胺溶液(OPD，Merck，Darmstadt，GFR)以检测过氧化物酶-结合的抗-IgG1和抗-IgG2二级抗体(而对于IgM，所用的试剂是3′，3′，5′，5′-四甲基联苯胺(TMB，Sigma，St.Louis，MO，USA)。在室温保温20分钟后，通过加入100μl 2N H2SO4终止反应。用Bio-Rad 3550型平板阅读器读出在490nm的吸收值。
结果
在490nm的各读数以绝对单位(A.U.)/ml给出。这是通过将各样品标准进行比较而得到的，所述标准是从在第28天从B组(仅注射卵清蛋白的动物)收集的样品池的不同稀释物制备的。从该术语可清楚地理解，稀释50倍的样品池的浓度为1000A.U./ml。然后用相应的稀释因子(50，200，或800倍)校正每个结果。本文仅报告各的平均值和标准偏差(SD)。
表a)针对卵清蛋白的IgG1亚型特异性产生的免疫球蛋白(绝对单位/ml±SD，**p＜0.01(Anova &(两侧)Dunnetts试验)。
 组   第14天   第28天
 A：NaCl   6±6   16±12
 B：ova   728±589   47743±46294
 C：ova+OM-294-MP   4361**±2513   284121**±164822
 D：ova+OM-294-DP   3240**±1794   277025**±173737
 E：OM-294-MP   19±8   40±69
表b)针对卵清蛋白的IgG2a亚型特异性产生的免疫球蛋白(绝对单位/ml±SD，**p＜0.01(Anova &(两侧)Dunnetts试验)。
组   第14天   第28天
A：NaCl   2996±898   5414±1554
B：ova   5201±1880   73162±107954
C：ova+OM-294-MP   9524±6809   625663*±681232
D：ova+OM-294-DP   18108**±14958   601434*±624166
E：OM-294-MP   11253±12169   4192±2104
表c)针对卵清蛋白的IgM亚型特异性产生的免疫球蛋白(绝对单位/ml±SD，**p＜0.01(Anova &(两侧)Dunnetts试验)。
组   第14天   第28天
A：NaCl   14009±6158   12288±7136
B：ova   19423±13778   47998±34035
C：ova+OM-294-MP   21652±9524   38240±8822
D：ova+OM-294-DP   25762±10975   74399±119781
E：OM-294-MP   19742±5667   9827±2021
这些结果表明OM-294-MP和OM-294-DP佐剂在所研究的模型中是有活性的，因为在1或2次注射后，它们都能显著提高小鼠中针对卵清蛋白特异性产生的抗体滴度(见图25，26，27)。
14.OM-294-MP和OM-294-DP TT抗原(破伤风类毒素)联用： 确定在1或2次皮下给药后小鼠中产生的特异性抗体
方法
本研究的目的在于说明OM-294-MP和OM-294-DP对于TT抗原(Massachussetts Biologic Laboratoires，MA，USA)的佐剂效果。为了达到该目的，将40只BALB/c小鼠(雌性，在治疗开始时8周龄)按如下分成4组：
组   抗原终浓度：50μg/动物/注射   佐剂s终浓度50μg/动物/注射   NaCl(0.9％)   注射的体积
A：NaCl   -   -   150μl   150μl
B：TT   TT(100μl)   -   50μl   150μl
C：TT+OM-294-MP   TT(100μl)   OM-294-MP(50μl)   -   150μl
D：TT+OM-294-MP   TT(100μl)   OM-294-DP(50μl)   -   150μl
抗原：用0.9％NaCl制备浓度为0.2mg/ml的TT储备液。
佐剂：用注射用水制备浓度为1mg/ml的OM-294-DP和OM-294-MP储备液，对于OM-294-MP，加入0.1％三乙醇胺。阴性对照是不含抗原的0.9％NaCl溶液。
抗原-佐剂混合物：将佐剂在37℃保持20分钟，然后旋转混合3分钟。然后，按上表说明加入抗原和NaCl(0.9％)，将抗原-佐剂混合物旋转混合物，然后在室温下放在旋转搅拌器上15分钟，最后将全部混合物旋转3分钟。
免疫方案：在0和14天进行注射。通过皮下施用上表中的混合物(一边75μl，每只动物共150μl)。在第14和18天取血(针刺眼眶)。
抗-TT免疫球蛋白的检测：通过ELISA一式两份检测特异性抗TT的下列血清免疫球蛋白：IgG1，IgG2a，和IgM。在4℃将微滴定板(NUNC Immunoplate，Roskilde，DK)与在碳酸氢盐缓冲液pH9.6中的100μl TT(0.5μg)一起保温(过夜包被)。用0.5％吐温-20(MerckHohenbrunn，D)洗涤后，将血清稀释50、200和800倍(稀释溶液：磷酸缓冲的盐(PBS)+1％牛血清白蛋白(BSA，Sigma，St.Louis，MO，USA)+0.02％吐温-20))。将100μl各稀释的血清样品加到孔中。在37℃保温45分钟。
第二次洗涤步骤后，在37℃，将特异性抗TT的IgG1，IgG2a和IgM与预先用PBS/BSA/吐温缓冲液(分别稀释250、1000 500倍稀释)100μl抗-IgG1抗体(抗-小鼠大鼠抗体)-过氧化物酶结合物(Serotec，Oxford，UK)、IgG2a-过氧化物酶结合物(Pharmingen，San Diego，CA，USA)和IgM-生物素结合物(Pharmingen，San Diego，CA，USA)一起保温30分钟。对于IgM，额外的洗涤步骤后，需要与1∶100稀释的链霉抗生物素-过氧化物酶结合物(Dako，Glostrup，DK)第三次保温(30分钟，37℃)。
洗涤步骤后，加入100μl亚苯基1，2-二胺溶液(OPD，Merck，Darmstadt，GFR)以检测过氧化物酶-结合的抗-IgG1和抗-IgG2二级抗体(而对于IgM，所用的试剂是3′，3′，5′，5′--四甲基联苯胺(TMB，Sigma，St.Louis，MO，USA)。在室温保温20分钟后，通过加入100μl 2N H2SO4终止反应。用Bio-Rad 3550型平板阅读器读出在490nm的吸收值。
结果
在490nm的各读数以绝对单位(A.U.)/ml给出。这是通过将各样品标准进行比较而得到的，所述标准是从在第28天从B组(仅注射TT的动物)收集的样品池的不同稀释物制备的。从该术语可清楚地理解，稀释50倍的样品池的浓度为1000A.U./ml。然后用相应的稀释因子(50、200或800倍)校正每个结果。本文仅报告各的平均值和标准偏差(SD)。
就检测T特异性的IgM而言，由于该检测方法的本底噪音太高，按照用于IgG1和IgGa2的方法测量特异性IgM不能清楚划清B组(仅TT)和C组和D组(TT与佐剂)间的差异。然而用连续稀释的各样品(而不是前述A.U.)可以确定特异性IgM的滴度，并将每个样品的结果表示为产生大于A组(NaCl)的平均吸收值±3SD最高稀释度。因此，所得的滴度表明在血清样品的吸收值不再区别于本底噪音水平前，可对血清样品进行稀释的倍数。
表(a)针对TT的IgG1亚型特异性产生的免疫球蛋白(绝对单位/ml±SD，**p＜0.01(Anova &(两侧)Dunnetts试验)。
组  第14天  第28天
A：NaCl  1±2  0±1
B：TT  2871±1633  34367±15018
C：TT+OM-294-MP  8502**±2020  78506**±21660
D：TT+OM-294-DP  11620**±2348  136463**±41025
表(b)针对TT的IgG2a亚型特异性产生的免疫球蛋白(绝对单位/ml±SD，**p＜0.01(Anova &(两侧)Dunnetts试验)。
组   第14天   第28天
A：NaCl   351±506   536±1046
B：TT   2547±2539   61387±82269
C：TT+OM-294-MP   8869±6979   65881±46635
D：TT+OM-294-DP   21969**±25067   148365±134196
表(c)针对TT的IgM亚型特异性产生的免疫球蛋白的滴定(在490nm产生大于A组平均值±3SD值的各样品的稀释度)。
组   第14天   第28天
A：NaCl   标准   标准
B：TT   9动物＜251动物＜50   10动物＜25
C：TT+OM-294-MP   9动物＜251动物＞1600   7动物＜251动物＜1002动物＞1600
D：TT+OM-294-DP   7动物＜251动物＜2002动物＞1600   10动物＜25
这些结果表明OM-294-MP和OM-294-DP佐剂在所研究的模型中是有活性的，因为在1或2次注射后，它们都能显著提高小鼠中针对TT特异性产生的IgG1和IgG2抗体滴度(见图28，29)。相反，仅有几只动物产生TT特异性的IgM。
15.通过皮下给药利什曼虫属gp63抗原在CBA小鼠免疫模型中 评估OM-294-MP的佐剂特性
方法
对CBA小鼠在尾部皮下注射剂量为2μg的gp63两次，间隔8天。将OM-294-MP佐剂与两次剂量的抗原混合，而BCG仅在第一次给药时混合。每只小鼠接受2×50μg的OM-294-MP或200μg的BCG。对照组仅注射抗原(无佐剂)。第二次注射10天后，将腹股沟和主动脉周的淋巴结细胞(每组3只小鼠)进行培养并通过测定(3H-TdR)胸腺嘧啶核苷的摄取分析对纯化的gp63抗原的增殖反应。在加入3H-TdR前，通过ELISA(MIF 100 IFN和M4000 IL-4试剂盒，R&D Systems，Europe Ltd.，Abingdon，UK)确定每个淋巴结淋巴细胞培养上清液样品由用gp63抗原体外再攻击的淋巴结淋巴细胞分泌的γIFN和IL-4细胞因子的体外生产。
在表中报告的3H-TdR摄取值代表以cpm表示的算术平均±标准偏差(一式三份)和上清液中的细胞因子对应于以pg/ml表示的算术平均±标准偏差(一式三份)。
抗原：用0.9％NaCl制备的浓度为40μg/ml的gp63储备液。
佐剂：用注射用水制备浓度为1mg/ml的OM-294-MP储备液，加入0.1％三乙醇胺。阴性对照是不含抗原的PBS溶液。
抗原-佐剂混合物：将佐剂在37℃保持10分钟，然后旋转混合3分钟。然后，将抗原(1体积)和佐剂(1体积)混合，在37℃保温20分钟后旋转混合，最后将全部混合物旋转3分钟。
结果
在用gp63抗原免疫的小鼠中，OM-294-MP佐剂可以比BCG更好地诱导淋巴细胞增殖反应(表(a)和图30(a))。事实上，与不用佐剂免疫的动物的培养物相比，OM-294-MP产物使增殖速率增加了3.1至6倍，而BCG则不超过3.5倍(2.6-3.5)。
在这些淋巴细胞培养物中，在上清液中测定细胞因子的生产(表(b)和图(30(b))。我们发现，抗原gp63诱导的γIFN分泌在数量上与OM-294-MP或BCG佐剂处理的小鼠相当。然而，OM-294-MP佐剂似乎更倾向于由(抗-gp63)免疫淋巴细胞分泌大量的IL-4，而BCG处理的小鼠淋巴细胞仅分泌少量甚至检测不到的所述细胞因子。
表(a)OM-294-MP佐剂对于对gp63抗原免疫应答的影响，通过gp63抗 原在体外引起的鼠T淋巴细胞增殖反应测定
  gp63体外(μg/ml)   无佐剂(cpm×10-3/ml)   OM-294-MP(cpm×10-3/ml)   BCG(cpm×10-3/ml)
  0   1.4±0.4   2.8±0.7   5.3±1.1
  0.16   18±5   65±11   47±9
  0.31   17±5   92±11   57±17
  0.62   16±4   93±13   54±13
  1.25   13±2   39±7   44±9
表(a)中报道的数值表示算术平均摄取量±标准偏差(一式三份培养)
表(b)体内给药OM-294-MP佐剂和gp63抗原对淋巴结淋巴细胞体外生 产细胞因子的影响
                    γIFN浓度(pg/ml)
  gp63体外   无佐剂   294-MP   BCG
  0   ＜9   ＜9   27
  0.3   78   135   200
  0.6   38   120   105
                     IL-4浓度(pg/ml)
  gp63体外   无佐剂   294-MP   BCG
  0   ＜8   ＜8   ＜8
  0.3   ＜15   125   15
  0.6   ＜8   83   ＜8
通过淋巴细胞增殖和抗原诱导的γIFN和IL-4生产进行分析，OM-294-MP佐剂可以在体外在用gp63(利什曼虫属寄生虫的两染性抗原)免疫的CBA小鼠中增强特异性T应答。
16.当通过皮下给药Leishmania mexicana LmCPb抗原时OM-294-MP 佐剂在CBA小鼠免疫模型中在抗-LmCPb T-初级应答过程中的效力
方法
对CBA小鼠通过尾部注射一次与50μg OM-294-MP佐剂混合或不混合的剂量为2μg的LmCPb。对照组仅注射一次生理盐水缓冲液(未免疫的个体)。11天后，培养腹股沟和主动脉周的淋巴结(每组3只小鼠)的细胞并通过测定含氚胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)的摄取评估对纯化的LmCPb抗原的增殖反应，或者对整个Leishmania mexicana无鞭毛体制备物或刀豆球蛋白A(ConA)的增殖反应。在加入3H-TdR前，用每个淋巴结淋巴细胞培养上清液样品通过ELISA(MIF100 IFN和M4000 IL-4试剂盒，R&D Systems，Europe Ltd.，Abingdon，UK)确定由用Leishmania mexicana LmCPb抗原或无鞭毛体体外再攻击的淋巴结淋巴细胞的γIFN和IL-4细胞因子生产。
在表中报告的3H-TdR摄取值代表以cpm表示的算术平均±标准偏差(一式三份)和上清液中的细胞因子对应于以pg/ml表示的算术平均±标准偏差(一式三份)。
抗原：用PBS(2x)制备的浓度为40μg/ml的LmCPb储备液。
佐剂：用注射用水制备浓度为1mg/ml的OM-294-MP储备液，加入0.1％三乙醇胺。阴性对照是不含抗原的PBS溶液。
抗原-佐剂混合物：将佐剂在37℃保持10分钟，然后旋转混合3分钟。然后，将抗原(1体积)和佐剂(1体积)混合，在37℃保温20分钟后旋转混合，最后将全部混合物旋转3分钟。
结果
在培养基中不存在任何刺激的条件下，OM-294-MP佐剂可促进经历了自发增殖(表(a)和图31(a))并分泌痕量γIFN(表(b)和图31(b))的淋巴细胞的发育。当将纯化的LmCPb抗原或全寄生虫提取物加到培养基中时，该反应显著增强。在本试验中，观察到这种佐剂对诱导可分泌大量IL-4的敏化淋巴细胞(抗-LmCPb)有显著的影响(表(b)和图31(b))。
表(a)用LmCPb体内免疫的淋巴结细胞的体外增殖反应：OM-294-MP 佐剂的影响
              3H-TdR摄取(cpm×10-3/ml)
体外抗原     未免疫的     不含佐剂     OM-294-MP
无刺激剂     0.9±0.3     2.2±0.7     11±2
LmCPb 0.6μg/ml     0.8±0.4     1.7±0.1     19±4
LmCPb 1.7μg/ml     0.9±0.1     4.6±1.6     40±4
LmCPb 5μg/ml     1.3±0.8     7.2±0.6     80±5
LmCPb 15μg/ml     2.6±0.4     16.2±2.1     140±10
无鞭毛体1.9×10-6/ml     0.8±0.2     1.7±0.1     44±7
无鞭毛体6×10-6/ml     1.5±0.2     4.6±0.6     79±6
无鞭毛体17×10-6/ml     2.9±0.6     7.2±0.6     119±4
Con A 5μg/ml     123±33     193±17     196±10
表(b)用LmCPb体内免疫的淋巴结淋巴细胞体外分泌细胞因子：OM- 294-MP佐剂对处级反应的影响
                       γIFN生产(pg/ml)
体外刺激剂 未免疫的 不含佐剂 OM-294-MP
无刺激剂 ＜9 ＜9 25
LmCPb 15μg/ml ＜9  46 480
无鞭毛体17×10-5/ml ＜9  95 320
Con A 5μg/ml ＞1800 ＞1800 ＞1800
                        IL-4生产(pg/ml)
体外刺激剂 未免疫的 不含佐剂 OM-294-MP
无攻击 ＜8 ＜8 ＜8
LmCPb 15μg/ml ＜8 ＜8 130
无鞭毛体17×10-5/ml ＜8 ＜8 65
Con A 5μg/ml 92 190 360
在初级T反应(一次免疫注射后)中，OM-294-MP佐剂也是非常有效的。该佐剂对该反应的影响特性(淋巴细胞增殖的增强，细胞因子生产的诱导)与在对两次免疫注射过程中观察到的相似。
17.通过皮下给药Leishmania mexicana LmCPb抗原在CBA小鼠 免疫模型中评估OM-294-MP和OM-294-DP的佐剂特性：与BCG比较
方法
对CBA小鼠(每组8只小鼠)在尾部皮下注射3-5μg纯化的LmCPb两次，间隔8天。将OM-294-MP和OM-294-DP佐剂与两次剂量的抗原混合，而BCG仅在第一次混合。每只小鼠接受2×50μg的OM佐剂或200μg的BCG。第二次注射8天后，取出主动脉周和腹股沟的淋巴结(每组3只小鼠)并培养细胞以分析对纯化的LmCPb抗原的增殖反应，或者对整个Leishmania mexicana无鞭毛体制备物或刀豆球蛋白A(ConA)的增殖反应。增殖反应通过测定含氚胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)的摄取进行评估。在加入3H-TdR前，用每个淋巴结淋巴细胞培养上清液样品通过ELISA(MIF100 IFN和M4000 IL-4试剂盒，R&DSystems，Europe Ltd.，Abingdon，UK)确定由用Leishmania mexicana的LmCPb抗原或无鞭毛体或Con A抗原体外再攻击的淋巴结淋巴细胞分泌的γIFN和IL-4细胞因子的生产。
在表中报告的值表示以抗体滴度标准的百分比表示的算术平均±标准偏差，3H-TdR摄取值为以cpm表示的算术平均±标准偏差(一式三份)和细胞因子生产为以pg/ml表示的算术平均±标准偏差(一式三份)。
抗原：用0.9％NaCl制备的浓度为60μg/ml-100μg/ml的LmCPb储备液。
佐剂：用注射用水制备浓度为1mg/ml的OM-294-MP和OM-294-DP储备液，对于OM-294-MP，加入0.1％三乙醇胺。阴性对照是不含抗原的PBS溶液。
抗原-佐剂混合物：将佐剂在37℃保持10分钟，然后旋转混合3分钟。然后，将抗原(1体积)和佐剂(1体积)混合，在37℃保温20分钟后旋转混合，最后将全部混合物旋转3分钟。
结果
在用LmCPb抗原免疫的小鼠中(表s(a)和(b)，Figures 32(a)和(b))，产物OM-294-MP和OM-294-DP产生与发展了抗gp63免疫反应的小鼠中观察到的相似的作用。因此，存在LmCPb(15μg/ml)的条件下，衍生于已用抗原加OM-294-MP和OM-294-DP佐剂免疫之小鼠的培养物的增殖程度比仅用抗原(不含佐剂)免疫之小鼠的培养物分别高23和28倍。在这些条件下，BCG的影响较小，因为增殖的增加仅仅为11倍。在用纯化抗原或者利什曼虫属寄生虫全提取物攻击的培养物中，对于所检测的所有抗原浓度均观察到类似的作用。
应答LmCPb抗原加OM-294-DP比应答LmCPb抗原加BCG的γIFN生产略高(表(b)和图32(b))。应注意，在本试验中，即使不向培养基中加入抗原，淋巴细胞可能也会增殖并分泌大量的γIFN。在这种情况下，OM-294-DP佐剂似乎比BCG更有效。按照上述能够产生IL-4的淋巴细胞的发育情况，观察到OM-294-MP，OM-294-DP与BCG佐剂有显著差异。在OM-294-MP和OM-294-DP佐剂的影响下，所生产的IL-4的数量是显著的，因为它与由接触Con A(淋巴细胞的一种强的非特异性刺激剂)的淋巴细胞分泌的数量相匹配(见表(a)和(b))。
表(a)对来自用LmCPb体内免疫的小鼠的淋巴结细胞的体外增殖响应： 不同佐剂的影响
                      3H-TdR摄取(cpm×10-3/ml)
体外刺激剂     无佐剂   OM-294-DP   OM-294-MP   BCG
无刺激剂     1.7±0.6   21.8±2.2   17.1±2.5   18.6±4.8
LmCPb 0.6μg/ml     0.8±0.3   40.9±12.7   22.9±2.8   19.0±7.4
LmCPb 1.7μg/ml     2.4±0.1   57.2±10.9   34.1±4.1   39.8±5.7
LmCPb 5μg/ml     2.8±0.6   70.2±9.2   70.3±6.4   44.0±10.4
LmCPb 15μg/ml     4.3±0.1   100.0±6.5   124.2±12.0   46.2±0.3
无鞭毛体2×10-6/ml     2.4±0.6   61.0±1.7   28.4±8.3   24.4±4.3
无鞭毛体6×10-6/ml     2.3±0.7   81.5±5.5   66.1±4.5   23.6±2.5
无鞭毛体17×10-6/ml     1.7±0.4   78.2±7.8   68.7±2.3   23.4±4.0
Con A 5μg/ml     188.1±21.0   135.9±3.7   151.4±3.7   119.7±28.5
表中所报道的数值表示示踪剂摄取的算术平均值±标准偏差(一式三份培养物)
表(b)来自用LmCPb抗原体内免疫的小鼠的淋巴结淋巴细胞的体外细 胞因子生产：不同佐剂的影响
                                γIFN浓度(pg/ml)
体外刺激剂   无佐剂   OM-294-DP   OM-294-DP BCG
无刺激剂   ＜9   460   240 280
LmCPb 15μg/ml   44   520   360 460
无鞭毛体17×10-6/ml   14   ＞600   ＞600 480
Con A 5μg/ml   1200   1200   1900 ＞3000
                                 IL-4浓度(pg/ml)
体外刺激剂   无佐剂   OM-294-DP   OM-294-DP BCG
无刺激剂   ＜15   ＜8   ＜8 ＜8
LmCPb 15μg/ml   ＜15   110   88 36
无鞭毛体17×10-6/ml   ＜8   130   110 29
Con A 5μg/ml   40   230   85 105
OM-294-MP和OM-294-DP佐剂可以有效地增强对利什曼虫属的可溶性抗原LmCPb蛋白酶的免疫应答。这在体外表现在通过诱导显著量的γIFN和IL-4生产引起增殖反应的增加。
实施例VI
注射用水溶液
实施例III的化合物 1g
吐温80 0.2g
氯化钠 9g
注射用双蒸水适量至 1000ml
将溶液用0.1M HCl调至pH7.5，然后通过在0.22μm SteritopExpress 1000膜(PES膜，90mM，SCGP T10 RE，Millipore Corporation，Bedford，MA，USA)上膜过滤进行灭菌。将无菌水溶液分装到1ml的无菌安瓿中。
冷冻干燥产物
实施例IV的产物 2g
吐温80 0.2g
氯化钠 9g
甘露糖醇 10g
抗坏血酸 0.1g
注射用双蒸水适量至 1000ml
将溶液用0.1M HCl调至pH7.4，然后通过在0.22μm SteritopExpress 1000膜(PES膜，90mm，SCGP T10 RE，Millipore Corporation，Bedford，MA，USA)上膜过滤进行灭菌。将无菌溶液通过分成每瓶1ml分装到无菌多剂量瓶中，然后冷冻干燥。

Claims (21)

1.通式I’所示的磷酸二肽类化合物：
Figure C998077610002C1
其中R1和R2分别表示从含有2至24个碳原子的饱和或不饱和、直链或支链的羧酸衍生的酰基，它是未取代的或带有一个或多个选自羟基、烷基、烷氧基、酰氧基、氨基、酰氨基、酰硫基和(C1-24)烷基硫代基团的取代基，
下标m、p和q是从1到10的整数，
下标n是从0到10的整数，
X和/或Y是酸基团。
2.权利要求1所述的通式I’化合物的盐，其中X和Y分别表示氢原子或膦酰基，用无机或有机碱制成的盐。
3.权利要求1所述的化合物，即3-(3-十二烷酰氧基十四烷酰氨基)9-(3-羟基十四烷酰氨基)4-氧代-5-氮杂癸烷-1，10-二醇1和/或10-磷酸二氢酯。
4.权利要求3所述的化合物与有机或无机碱形成的加成盐。
5.权利要求1所述的化合物，即3-(3-十二烷酰氧基-十四烷酰氨基)9-(3-羟基十四烷酰氨基)4-氧代-5-氮杂癸烷-1，10-二醇1，10-二-(磷酸二氢酯)。
6.权利要求5所述的化合物与有机或无机碱形成的加成盐。
7.权利要求1所述的化合物，即3-(3-羟基十四烷酰氨基)9-(3-十二烷酰氧基十四烷酰氨基)4-氧代-5-氮杂癸烷-1，10-二醇1，10-二-(磷酸二氢酯)。
8.权利要求7所述的化合物与有机或无机碱形成的加成盐。
9.权利要求1所述的化合物，即3-(3-十二烷酰氧基十四烷酰氨基)
9-(3-羟基十四烷酰氨基)4-氧代-5-氮杂癸1，10-二醇单1-磷酸二氢酯。
10.权利要求9所述的化合物与有机或无机碱形成的加成盐。
11.权利要求1所述的化合物，即3-(3-羟基十四烷酰氨基)9-(3-十二烷酰氧基十四烷酰氨基)4-氧代-5-氮杂癸烷-1，10-二醇单1-磷酸二氢酯。
12.权利要求11所述的化合物与有机或无机碱形成的加成盐。
13.权利要求1所述的通式I’的化合物，其含有具有R或S构型的元素，或者是外消旋的。
14.制备权利要求1所述的通式I’的磷酸二肽类化合物的方法：
Figure C998077610003C1
其中R1和R2分别表示从含有2至24个碳原子的饱和或不饱和、直链或支链的羧酸衍生的酰基，它是未取代的或带有一个或多个羟基、烷基、烷氧基、酰氧基、氨基、酰氨基、酰硫基和(C1-24)烷基硫代基团取代基，
下标m、p和q是从1到10的整数，
下标n是从0到10的整数，
X和Y分别表示氢原子或是中性或带电荷形式的膦酰基，
其中，将式H2N(CH2)pCHNH2(CH2)q+1COOH的二氨基酸的(q+1)和ω位的胺功能基分别用易于酸解和易于氢解的封闭试剂封闭，将仍是游离形式的羧酸功能基与还原剂反应生成相应的醇，将(q+1)位的胺功能基游离然后用式R2OH的羧酸功能基衍生物进行酰基取代，其中R2如上所定义，随后将末端胺功能基通过氢解游离得到通式II的氨基醇
Figure C998077610004C1
其中R2表示从含有2至24个碳原子的饱和或不饱和、直链或支链的羧酸衍生的酰基，它是未取代的或带有一个或多个以上定义的取代基，
p和q表示从1到10的整数，
然后将该氨基醇在肽缩合剂的存在下在惰性溶剂中与通式III’的ω-羟基氨基酸衍生物缩合
Figure C998077610004C2
其中R1是从含有2至24个碳原子的饱和或不饱和、直链或支链的羧酸衍生的酰基，它是未取代的或带有一个或多个取代基，
m是从1到10的整数，
n是从0到10的整数，
X是下式的二烷氧基-或二芳氧基-磷酰基基团
以得到通式IV’的肽类化合物，
Figure C998077610005C1
其中R1和R2分别表示从含有2至24个碳原子的饱和或不饱和、直链或支链的羧酸衍生的酰基，它是未取代的或带有一个或多个选自羟基、烷基、烷氧基、酰氧基、氨基、酰氨基、酰硫基和(C1-24)烷基硫代基团的取代基，下标m、p和q是从1到10的整数，下标n是从0到10的整数，R是易于氢解的基团，将它的醇功能基在偶联剂的存在下用磷酸化试剂磷酸化，然后进行两步的催化氢化反应以将酰基R2上选择性存在的醇功能基和磷酸酯功能基脱封闭，然后将第二个选择性存在的磷酸酯功能基通过氢解进行脱封闭，以得到通式V的衍生物
其中Y表示氢原子或膦酰基。
15.制备权利要求2所述的通式I’的化合物的盐的方法：
其中R1和R2分别表示从含有2至24个碳原子的饱和或不饱和、直链或支链的羧酸衍生的酰基，它是未取代的或带有一个或多个羟基、烷基、烷氧基、酰氧基、氨基、酰氨基、酰硫基和(C1-24)烷基硫代基团取代基，
下标m、p和q是从1到10的整数，
下标n是从0到10的整数，
X和Y分别表示氢原子或是中性或带电荷形式的膦酰基，
其中，将式H2N(CH2)pCHNH2(CH2)q+1COOH的二氨基酸的(q+1)和ω位的胺功能基分别用易于酸解和易于氢解的封闭试剂封闭，将仍是游离形式的羧酸功能基与还原剂反应生成相应的醇，将(q+1)位的胺功能基游离然后用式R2OH的羧酸功能基衍生物进行酰基取代，其中R2如上所定义，随后将末端胺功能基通过氢解游离得到通式II的氨基醇
其中R2表示从含有2至24个碳原子的饱和或不饱和、直链或支链的羧酸衍生的酰基，它是未取代的或带有一个或多个以上定义的取代基，
p和q表示从1到10的整数，
然后将该氨基醇在肽缩合剂的存在下在惰性溶剂中与通式III’的ω-羟基氨基酸衍生物缩合
Figure C998077610006C2
其中R1是从含有2至24个碳原子的饱和或不饱和、直链或支链的羧酸衍生的酰基，它是未取代的或带有一个或多个取代基，
m是从1到10的整数，
n是从0到10的整数，
X是下式的二烷氧基-或二芳氧基-磷酰基基团
以得到通式IV’的肽类化合物，
其中R1和R2分别表示从含有2至24个碳原子的饱和或不饱和、直链或支链的羧酸衍生的酰基，它是未取代的或带有一个或多个选自羟基、烷基、烷氧基、酰氧基、氨基、酰氨基、酰硫基和(C1-24)烷基硫代基团的取代基，下标m、p和q是从1到10的整数，下标n是从0到10的整数，R是易于氢解的基团，将它的醇功能基在偶联剂的存在下用磷酸化试剂磷酸化，然后进行两步的催化氢化反应以将酰基R2上选择性存在的醇功能基和磷酸酯功能基脱封闭，然后将第二个选择性存在的磷酸酯功能基通过氢解进行脱封闭，以得到通式V的衍生物
Figure C998077610007C3
(V)
其中Y表示氢原子或膦酰基；
与无机碱或有机碱反应生成盐。
16.权利要求15所述的通式I’的化合物的盐的制备方法，其中所述有机碱或无机碱为适于治疗应用的有机碱或无机碱。
17.权利要求14所述的通式I’的磷酸二肽类化合物的制备方法，其中的羧酸R2OH是3-羟基十四烷酸。
18.权利要求15或16所述的通式I’的化合物的盐的制备方法，其中的羧酸R2OH是3-羟基十四烷酸。
19.药物组合物，所述药物组合物含有至少一种权利要求1所述的通式I’的化合物作为活性成份：
其中R1和R2分别表示从含有2至24个碳原子的饱和或不饱和、直链或支链的羧酸衍生的酰基，它是未取代的或带有一个或多个选自羟基、烷基、烷氧基、酰氧基、氨基、酰氨基、酰硫基和(C1-24)烷基硫代基团的取代基，
下标m、p和q是从1到10的整数，
下标n是从0到10的整数，
X和Y分别表示氢原子或膦酰基。
20.权利要求19所述的药物组合物，其中的活性成分是所述化合物与适于治疗应用的有机碱或无机碱形成的盐。
21.权利要求19或20所述的药物组合物，其中的活性成分是纯净的对映体形式或是立体异构体的混合物形式。
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Families Citing this family (68)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7157092B1 (en) * 1998-06-30 2007-01-02 Om Pharma Acyl pseudodipeptides, preparation method and pharmaceutical compositions containing same
WO2001046127A1 (fr) * 1999-12-22 2001-06-28 Om Pharma Pseudodipeptides acyles porteurs d'un bras auxiliaire fonctionnalise
US7064217B2 (en) * 2001-01-30 2006-06-20 University Of Virginia Patent Foundation Agonists and antagonists of sphingosine-1-phosphate receptors
CA2492826C (en) 2001-09-14 2016-12-13 Cytos Biotechnology Ag Encapsulation of unmethylated cpg-containing oligonucleotides into virus-like particles: method of preparation and use
IN2008CN05409A (zh) 2002-07-18 2015-10-02 Cytos Biotechnology Ag
WO2004084940A1 (en) 2003-03-26 2004-10-07 Cytos Biotechnology Ag Packaging of immunostimulatory oligonucleotides into virus-like particles: method of preparation and use
AU2005249212B2 (en) 2004-05-28 2010-05-20 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Vaccine compositions comprising virosomes and a saponin adjuvant
GB0503337D0 (en) 2005-02-17 2005-03-23 Glaxosmithkline Biolog Sa Compositions
CA2602456A1 (en) 2005-03-23 2006-09-28 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Composition
RU2451523C2 (ru) 2005-12-14 2012-05-27 Цитос Биотехнологи Аг Упакованные иммуностимулирующей нуклеиновой кислотой частицы, предназначенные для лечения гиперчувствительности
GB0607088D0 (en) 2006-04-07 2006-05-17 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
DK2384765T3 (en) 2005-12-22 2017-01-09 Glaxosmithkline Biologicals Sa Vaccine against Streptococcus pneumoniae.
RU2498813C2 (ru) * 2006-03-09 2013-11-20 Ом Фарма Иммуномодуляторные соединения и лечение заболеваний, связанных со сверхпродукцией воспалительных цитокинов
CN103169960A (zh) 2006-03-30 2013-06-26 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 免疫原性组合物
MX2008015529A (es) 2006-06-12 2009-01-13 Cytos Biotechnology Ag Procesos para empacar oligonucleotidos en particulas similares a virus de bacteriofagos de arn.
CN105727276A (zh) 2006-07-17 2016-07-06 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 流感疫苗
PE20080428A1 (es) 2006-07-18 2008-05-15 Glaxosmithkline Biolog Sa Vacunas para la malaria
GB2453475B (en) 2006-07-25 2011-01-19 Secr Defence Live vaccine strain
EP2433648A3 (en) 2006-10-12 2012-04-04 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Vaccine comprising an oil in water emulsion adjuvant
CN105106971A (zh) 2007-03-02 2015-12-02 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 疫苗组合物及其在刺激免疫反应中的用途
US9452209B2 (en) 2007-04-20 2016-09-27 Glaxosmithkline Biologicals Sa Influenza vaccine
JP2010531330A (ja) 2007-06-26 2010-09-24 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム 肺炎連鎖球菌莢膜多糖コンジュゲートを含むワクチン
EP2020240A1 (en) * 2007-07-30 2009-02-04 Paul-Ehrlich-Institut Bundesamt für Sera und Impfstoffe Methods and substances for the treatment of Alzheimer's
WO2009117035A1 (en) 2007-12-19 2009-09-24 The Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine, Inc. Soluble forms of hendra and nipah virus f glycoprotein and uses thereof
EP3508505A1 (en) 2007-12-24 2019-07-10 ID Biomedical Corporation of Quebec Recombinant rsv antigens
RS54306B1 (en) 2008-04-16 2016-02-29 Glaxosmithkline Biologicals S.A. THE VACCINE
MX2011005915A (es) 2008-12-03 2011-08-17 Proyecto Biomedicina Cima Sl Uso de modulinas solubles en fenol para el desarrollo de vacunas.
WO2010079081A1 (en) 2009-01-07 2010-07-15 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Methods for recovering a virus or a viral antigen produced by cell culture
GB0901423D0 (en) 2009-01-29 2009-03-11 Secr Defence Treatment
GB0901411D0 (en) 2009-01-29 2009-03-11 Secr Defence Treatment
WO2010089339A1 (en) 2009-02-06 2010-08-12 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Purification of virus or viral antigens by density gradient ultracentrifugation
AR075437A1 (es) 2009-02-17 2011-03-30 Glaxosmithkline Biolog Sa Composicion inmunogenica que comprende al menos un antigeno del virus del dengue inactivado y un adyuvante sin aluminio, metodo para producir dicha vacuna y su uso para preparar un medicamento
GB0906234D0 (en) 2009-04-14 2009-05-20 Secr Defence Vaccine
ES2583257T3 (es) 2009-06-24 2016-09-20 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Antígenos recombinantes del VSR
WO2010149743A2 (en) 2009-06-24 2010-12-29 Id Biomedical Corporation Of Quebec Vaccine
EP3988115A3 (en) 2009-07-15 2022-08-17 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Rsv f protein compositions and methods for making same
GB0913680D0 (en) 2009-08-05 2009-09-16 Glaxosmithkline Biolog Sa Immunogenic composition
US9341623B2 (en) 2009-09-25 2016-05-17 Glaxosmithkline Biologicals Sa Immunodiffusion assay for influenza virus
GB0919117D0 (en) 2009-10-30 2009-12-16 Glaxosmithkline Biolog Sa Process
WO2011101332A1 (en) 2010-02-16 2011-08-25 Proyecto De Biomedicina Cima, S.L. Compositions based on the fibronectin extracellular domain a for the treatment of melanoma
ES2562818T3 (es) 2010-05-03 2016-03-08 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Procedimiento de inactivación del virus de la gripe
GB201009273D0 (en) 2010-06-03 2010-07-21 Glaxosmithkline Biolog Sa Novel vaccine
JP6138047B2 (ja) 2010-10-15 2017-05-31 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム サイトメガロウイルスｇＢ抗原
EP2505640A1 (en) 2011-03-29 2012-10-03 Neo Virnatech, S.L. Vaccine compositions for birnavirus-borne diseases
JP2014515035A (ja) 2011-05-17 2014-06-26 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム ストレプトコッカス・ニューモニエに対するワクチン
CN104203270A (zh) 2012-03-18 2014-12-10 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 针对人乳头状瘤病毒的接种方法
WO2014024026A1 (en) 2012-08-06 2014-02-13 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Method for eliciting in infants an immune response against rsv and b. pertussis
US20140037680A1 (en) 2012-08-06 2014-02-06 Glaxosmithkline Biologicals, S.A. Novel method
US10058603B2 (en) 2013-03-15 2018-08-28 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Vaccine
EP3632458A1 (en) 2013-07-26 2020-04-08 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and pharmaceutical compositions for the treatment of bacterial infections
EP3030260A1 (en) 2013-08-05 2016-06-15 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Combination immunogenic compositions
BR112016004136B1 (pt) 2013-08-30 2023-04-11 Km Biologics Co., Ltd. Métodos para produzir um vírus em uma cultura celular e para a preparação de uma vacina
CN104436157A (zh) 2013-09-23 2015-03-25 恩金生物有限公司 流感疫苗和治疗
EP3556353A3 (en) 2014-02-25 2020-03-18 Merck Sharp & Dohme Corp. Lipid nanoparticle vaccine adjuvants and antigen delivery systems
WO2015165480A1 (en) 2014-04-30 2015-11-05 Institute For Research In Biomedicine Human cytomegalovirus vaccine compositions and method of producing the same
JP6664338B2 (ja) 2014-06-13 2020-03-13 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム 免疫原性組合せ物
WO2016180852A1 (en) 2015-05-12 2016-11-17 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for preparing antigen-specific t cells from an umbilical cord blood sample
US20180186897A1 (en) 2015-06-26 2018-07-05 Institute For Research In Biomedicine Novel vaccines in prevention and treatment of malaria
GB201614799D0 (en) 2016-09-01 2016-10-19 Glaxosmithkline Biologicals Sa Compositions
WO2018162450A1 (en) 2017-03-06 2018-09-13 Fundación Para La Investigación Médica Aplicada New inmunostimulatory compositions comprising an entity of cold inducible rna-binding protein with an antigen for the activation of dendritic cells
EP3581201A1 (en) 2018-06-15 2019-12-18 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Escherichia coli o157:h7 proteins and uses thereof
US11911553B2 (en) * 2018-07-06 2024-02-27 Fenwal, Inc. Systems and methods for concentrating cells with a syringe and a centrifuge
WO2021014385A1 (en) 2019-07-24 2021-01-28 Glaxosmithkline Biologicals Sa Modified human cytomegalovirus proteins
CN112329267B (zh) * 2020-11-26 2022-08-16 中国核动力研究设计院 一种基于特征线法的组合几何中子输运处理方法及装置
US20240115688A1 (en) 2020-12-02 2024-04-11 Glaxosmithkline Biologicals Sa Novel Antigens
WO2022162012A2 (en) 2021-01-26 2022-08-04 Eth Zurich Antibodies broadly targeting coronaviruses and uses thereof
WO2022161598A1 (en) 2021-01-26 2022-08-04 Eth Zurich Antibodies broadly targeting coronaviruses and uses thereof
WO2023144665A1 (en) 2022-01-28 2023-08-03 Glaxosmithkline Biologicals Sa Modified human cytomegalovirus proteins

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS61227586A (ja) * 1985-03-30 1986-10-09 Dai Ichi Seiyaku Co Ltd ジサツカライド誘導体およびその塩
US4746742A (en) * 1985-11-28 1988-05-24 Toho Yakuhin Kogyo Kabushiki Kaisha Analogs of nonreducing monosaccharide moiety of lipid A
DE4229877C2 (de) * 1992-09-04 1994-09-15 Max Delbrueck Centrum Phospho- bzw. Phosphono-(N-acyl)-serine und ihre Herstellung
EP0668289A4 (en) * 1993-09-07 1998-10-21 Suntory Ltd NEW DISACCHARIDE DERIVATIVE.
SI0729473T1 (en) * 1993-11-17 2001-02-28 Om Pharma Glucosamine disaccharides, method for their preparation, pharmaceutical composition comprising same, and their use
US7157092B1 (en) * 1998-06-30 2007-01-02 Om Pharma Acyl pseudodipeptides, preparation method and pharmaceutical compositions containing same

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