CN1526016A - 稳定核酸的方法 - Google Patents

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Abstract

描述了一种通过使核酸与聚阳离子聚合物接触稳定核酸的方法。

Description

稳定核酸的方法
本发明涉及一种稳定核酸的方法。
核酸在特殊医学领域已经证明是有前途的药物。核酸作为药物使用的特别令人感兴趣的领域是利用特异性多核苷酸的一般性免疫刺激作用接种裸DNA或RNA，特别是接种特异性(重组)抗原、反义处理及基因治疗处理。
在新一代疫苗的研发中，接种裸核酸正在成为最有前途的进展之一。已经为这种接种提出了许多进展和特殊策略，以使其成为接种技术中的有效手段。
核酸作为普通免疫刺激剂的使用也正在从理论研究向医学实践发展。免疫系统识别低等生物(包括细菌)可能是由于病原体与宿主DNA之间结构与序列应用的差异。特别是针对来源于非脊椎动物的短DNA片段，或在某些碱基中含有非甲基化胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸(CpG)的合成短寡脱氧核苷酸(ODN)的形式。CpG基序在细菌DNA中以预期的频率出现，但在脊椎动物DNA中频率较低。另外，非脊椎动物CpG基序未甲基化，而脊椎动物CpG序列甲基化。细菌DNA与脊椎动物DNA之间的差异使得脊椎动物将非脊椎动物DNA识别为危险信号。而且，先天免疫系统的细胞将病毒的双链RNA识别为危险信号。
反义和/或基因治疗处理也是其主题，其中核酸的医学应用起主要作用。
然而，为了在所有这些应用领域中获得足够的药物效能，用于预防或治疗的核酸应当具有一定的稳定性，特别是体内稳定性。
当用于个体时，为了提高核酸的有效性，特别是延长体内半衰期，以现有技术进行了几种尝试。例如，对于核酸接种，提出了用于核酸的复杂包装系统，例如微球体、脂质体、病毒体、乳液、微团等。这些包装系统主要在向细胞内输送核酸方面有其优点，而不是有效并直接地稳定核酸，特别是DNA。另一方面，核酸的修饰，特别是磷酸骨架中的修饰，已经报告能够有效延长这些分子的半衰期(参见，例如US 5,663,153和US 5,723,335)。然而，至少含有一个硫代磷酸键的这些分子是非天然物质，尤其是当用于人时，如果长时间使用，在可能的降解产物以及这些物质的积累两方面产生危险。另外，这些修饰核酸在人体中的效果与安全性仍有待于确定。
因此本发明的目的在于提供一种稳定、特别是在体内稳定在药物中使用的核酸(特别是DNA)的方法。
该目的通过一种稳定核酸的方法达到，该方法的特征在于使核酸接触一种聚阳离子聚合物。根据本发明优选的聚阳离子聚合物是聚阳离子肽，特别是聚精氨酸、聚赖氨酸和类似的化合物。
通过本发明能够惊奇地看到，聚阳离子聚合物，优选地聚阳离子肽，特别是聚氨基酸(如聚精氨酸)，对核酸、尤其是含有天然磷酸二酯键的核酸具有保护及稳定作用。因此本发明特别适用于在磷酸骨架中缺乏人工修饰的核酸。因此，本发明的一个优选实施方案目的在于一种稳定在核苷残基之间含有二磷酸基(即缺乏硫代磷酸键)的脱氧核糖核酸的方法。
尽管根据本发明也可以使用修饰的核酸，但是在核酸的医学用途上，使用含未修饰骨架、特别是未修饰DNA和RNA的核酸，本发明的效果特别明显。
根据另一方面，本发明也涉及聚阳离子聚合物，优选地聚阳离子肽，特别是聚精氨酸等，在稳定核酸中的用途。如上所述，根据本发明的用途特别适于稳定在核苷残基之间含有磷酸二酯键的核酸，特别是脱氧核糖核酸。
惊奇地发现，核酸(例如ODNs)的化学重要性显著高于序列(例如CpG基序)。因此，通过本发明，天然形式核酸获得的比活性结果优于硫代磷酸修饰的分子，尽管在现有技术中后者更加有效。
如果稳定发生在水溶液或悬液中，优选地发生在待应用(“现配现用”)于个体的溶液或悬液中，特别是在例如作为基因治疗或反义药物的疫苗中，本发明特别适用。
水溶液或悬液另外还可能含有缓冲物、药物赋形剂和载体、其它稳定剂、其它药物等，特别是本领域周知的可与核酸和聚阳离子聚合物的混合物一起使用的辅助物质。
根据本发明表明，使用根据本发明的聚阳离子聚合物，优选地聚阳离子肽，可延长用于个体的核酸的体内半衰期，而无论其特定用途如何，即无论核酸是用作如特异性“裸”DNA疫苗，用作普通免疫刺激剂，用作反义药物，还是用作基因治疗药物。它能够使基于核酸如DNA、RNA或PNA的这些药物具有长期的有效性。
根据本发明使用的聚阳离子化合物例如可以是任何一种聚阳离子化合物，其显示根据WO97/30721的特有作用。优选的聚阳离子化合物选自碱性多肽、有机聚阳离子、碱性聚氨基酸或其混合物。这些聚氨基酸应当具有至少4个氨基酸残基的链长。特别优选的是含有肽键的物质，如聚赖氨酸、聚精氨酸和在8个以上、特别是20个以上氨基酸残基中含有20％以上、特别是50％以上碱性氨基酸的多肽，或其混合物。其它优选的聚阳离子及其药物组合物在WO97/30721(例如聚乙烯亚胺)和WO99/38528中描述。优选地，这些多肽含有20-500个氨基酸残基，特别是30-200个残基。
这些聚阳离子化合物可以通过化学或重组方法产生，或者可以来自于天然来源。
阳离子(多)肽也可以是聚阳离子抗细菌微生物肽。这些(多)肽可以是原核或动物或植物来源的，或者可以通过化学或重组方法产生，或者来自于天然来源。肽也可能属于防卫素一类。
这些宿主防御肽或防卫素也是根据本发明的聚阳离子聚合物的优选形式。通常用一种可作为终产物激活(或下调)获得性免疫系统(优选地由APC(包括树突细胞)介导)的化合物作为聚阳离子聚合物。
在本发明中特别优选的用作聚阳离子物质的是cathelicidin衍生的抗微生物肽或其衍生物(A 1416/2000，在此引用作为参考)，特别是由哺乳动物cathelicidin衍生的抗微生物肽，优选地来源于人、牛或小鼠，或神经活性化合物，如(人)生长激素(如WO01/24822所述)。
来自于天然来源的聚阳离子化合物包括HIV-REV或HIV-TAT(衍生的阳离子肽、触角肽、壳聚糖或几丁质的其它衍生物)或通过生物化学或重组生产由这些肽或蛋白质衍生的其它肽。其它优选的聚阳离子化合物是cathelin或与cathelin(特别是小鼠、牛或者(尤其是)人cathelin和/或cathelicidin)相关或由其衍生的物质。相关或衍生的cathelin物质包含cathelin序列的全部或部分，其含有至少15-20个氨基酸残基。衍生包括不属于20种标准氨基酸之内的氨基酸对天然氨基酸的置换或修饰。另外，也可将其它阳离子残基导入这些cathelin分子中。这些cathelin分子优选地与根据本发明的抗原/疫苗组合物组合。然而，令人惊奇的是，这些cathelin分子也可有效地作为抗原的佐剂，而不需要添加其它佐剂。因此，在疫苗制品中能够用这些cathelin分子作为有效的佐剂，其中含有或不含其它免疫激活物质。
根据本发明使用的另一种优选聚阳离子物质是至少含有2个KLK-基序的合成肽，这两个基序被3-7个疏水氨基酸(特别是亮氨酸)的接头隔开(A 1789/2000，在此引用作为参考)。
无论如何，根据本发明使用的聚阳离子化合物，特别是肽，其自身不应是免疫原性的(即不引发免疫应答)，而只参与免疫应答。
本发明通过下列实施例和附图进一步描述，然而，并非仅限于此。
图1显示利用pR和含CpG的ODN产生特异性免疫应答。
图2显示利用pR和含脱氧I或脱氧U的ODN产生特异性免疫应答。
图3显示利用pR和含脱氧-U的ODN的混合物产生特异性免疫应答。
图4显示利用pR和ODN产生特异性免疫应答。
图5显示利用pR诱导持续的免疫应答。
图6显示利用KLK和含脱氧I的ODN产生特异性免疫应答。
图7显示利用KLK和含脱氧I的ODN产生特异性免疫应答。
图8显示在存在或不存在pR的条件下，用DNAse处理的DNA的1％琼脂糖凝胶。
实施例
实施例1
使用pR和含CpG的寡脱氧核苷酸CpG 1668(未用硫代磷酸取代)，针对卵白蛋白衍生的肽(OVA257-264)的特异性免疫应答的产生
小鼠             C57Bl/6(Harlan/Olac)
肽               OVA257-264-肽(SIINFEKL)，鸡卵白蛋白
                 的一种MHC I类(H-2Kb)-限制的表位
                 (Rotzschke等人，1991)，通过标准固相
                 F-moc合成法合成，HPLC纯化，通过质
                 谱法分析其纯度
                 剂量：300μg/小鼠
聚-L-精氨酸(pR)  平均聚合度为43个精氨酸残基的聚-L-精
                 氨酸；SIGMA Chemicals
                 剂量：100μg/小鼠
CpG-ODN 1668     含有CpG-基序的硫代磷酸取代的ODN：
                 tcc atg acg ttc ctg atg ct，由Purimex
                 GmbH，Gttingen合成
                 剂量：5nmol/小鼠
CpG-ODN 1668b    含有CpG-基序tcc atg acg ttc ctg atg ct(未
                 用硫代磷酸取代)的ODN，由Purimex
                 GmbH，Gttingen合成
                 剂量：5nmol/小鼠
实验组(每组4只小鼠)
1.OVA257-264+pR
2.OVA257-264+CpG-ODN 1668
3.OVA257-264+CpG-ODN 1668b
4.OVA257-264+CpG-ODN 1668+pR
5.OVA257-264+CpG-ODN 1668b+pR
在第0天，向小鼠的每只后足垫内注射总体积100μl(每只足垫50μl)，其中含有上述化合物。动物在注射4天后处死，收获腘淋巴结。淋巴结通过70μm细胞滤器，用含有5％胎牛血清(FCS，SIGMAchemicals)的DMEM培养基(GIBCO BRL)洗涤两次。细胞用DMEM/5％/FCS调节至适当的细胞数。如述(Miyahira等人，1995)一式三份进行IFN-γELISPOT测定。该方法是一种广泛使用的方法，可定量抗原特异性T细胞。用培养基(背景对照)、OVA257-264-肽、一种无关肽TRP-2181-188和伴刀豆球蛋白A(ConA)一式三份离体(exvivo)刺激淋巴细胞。计数代表产IFN-γ的单个T细胞的斑点，所有样品均减去背景斑点的数量。在ConA刺激后检测到大量斑点(数据未显示)，表明使用的淋巴细胞状态良好。对于每个实验组的小鼠，产IFN-γ细胞/1×106淋巴结细胞的数量在图1中显示，给出离体刺激的三份样品的标准差。
该实验表明，注射含硫代磷酸取代的CpG-ODN1668的OVA257-264与组合注射OVA257-264与聚-L-精氨酸相比，可增强OVA257-264-特异性免疫应答。同时注射聚-L-精氨酸强烈增强CpG-ODN 1668诱导的免疫应答。相反，当使用未用硫代磷酸取代的CpG-ODN 1668b时，只在同时注射聚-L-精氨酸后才诱发强免疫应答。
实施例2
使用pR和脱氧肌苷修饰的寡核苷酸I-ODN 2b(磷酸二酯键，未用硫代磷酸取代)或脱氧尿苷一磷酸修饰的寡核苷酸U-ODN 13b(磷酸二酯键，未用硫代磷酸取代)，针对黑素瘤衍生肽(TRP-2181-188)的特异性免疫应答的产生
小鼠            C57Bl/6(Harlan/Olac)
肽              TRP-2-肽181-188(VYDFFVWL)，小鼠酪
                 氨酸酶相关蛋白-2的一种MHC I类
                 (H-2Kb)-限制的表位(B16黑素瘤，Bloom，
                 M.B.等人，J Exp.Med 1997，185，
                 453-459)，通过标准固相F-moc合成法合
                 成，HPLC纯化，通过质谱法分析其纯度
                 剂量：100μg/小鼠
聚-L-精氨酸(pR)  平均聚合度为43个精氨酸残基的聚-L-精
                 氨酸；SIGMA Chemicals
                 剂量：100μg/小鼠
I-ODN 2          含有脱氧肌苷的硫代磷酸取代的ODNs：
                 tcc atg aci ttc ctg atg ct，由Purimex
                 GmbH，Gttingen合成
                 剂量：5nmol/小鼠
I-ODN 2b         含有脱氧肌苷的ODNs(未用硫代磷酸取
                 代)：tcc atg aci ttc ctg atg ct，由Purimex
                 GmbH，Gttingen合成
                 剂量：5nmol/小鼠
U-ODN 13         含有脱氧尿苷一磷酸的硫代磷酸取代的
                 ODNs：tcc atg acu ttc ctgatg ct，由
                 Purimex GmbH，Gttingen合成
                 剂量：5nmol/小鼠
U-ODN 13b        含有脱氧尿苷一磷酸的ODNs(未用硫代
                 磷酸取代)：tcc atg acu ttc ctg atg ct，由
                 Purimex GmbH，Gttingen合成
                 剂量：5nmol/小鼠
实验组(每组4只小鼠)
1.TRP-2181-188
2.TRP-2181-188+pR
3.TRP-2181-188+I-ODN 2
4.TRP-2181-188+I-ODN 2b
5.TRP-2181-188+U-ODN 13
6.TRP-2181-188+U-ODN 13b
7.TRP-2181-188+I-ODN 2+pR
8.TRP-2181-188+I-ODN 2b+pR
9.TRP-2181-188+U-ODN 13+pR
10.TRP-2181-188+U-ODN 13b+pR
小鼠的注射和免疫应答的分析如实施例1所述进行。结果显示于图2中。对于淋巴结细胞的离体再刺激，用TRP-2181-188作为特异肽，OVA257-264作为无关肽。
该实验显示，注射TRP-2181-188与硫代磷酸取代的I-ODNs或U-ODNs，与单独注射TRP-2181-188相比，强烈增强TRP-2181-188特异的免疫应答。同时注射聚-L-精氨酸与各自的ODN进一步增强这些应答。相反，当使用未用硫代磷酸取代的I-ODN 2b或U-ODN 13b时，只在同时注射聚-L-精氨酸后才诱发强免疫应答。
实施例3
使用pR和脱氧尿苷一磷酸修饰的寡核苷酸(U-ODN 15b，未用硫代磷酸取代)的混合物，针对黑素瘤衍生肽(TRP-2181-188)的特异性免疫应答的产生
小鼠                 C57Bl/6(Harlan/Olac)
肽                   TRP-2-肽181-188(VYDFFVWL)，小鼠酪
                     氨酸酶相关蛋白-2的一种MHC I类
                     (H-2Kb)-限制的表位(B16黑素瘤，Bloom，
                     M.B.等人，J Exp.Med 1997，185，
                     453-459)，通过标准固相F-moc合成法合
                     成，HPLC纯化，通过质谱法分析其纯度
                     剂量：100μg/小鼠
聚-L-精氨酸(pR)  平均聚合度为43个精氨酸残基的聚-L-精
                 氨酸；SIGMA Chemicals
                 剂量：100μg/小鼠
U-ODN 15b        含有脱氧尿苷的ODNs(未用硫代磷酸取
                 代)的混合物：nhh hhh wdu dhh hhh hhh
                 wn，由Purimex GmbH，Gttingen合成。
                 (n＝GCAT，h＝CAT，w＝AT，d＝GAT)
                 剂量：5nmol/小鼠
实验组(每组4只小鼠)
1.TRP-2181-188
2.TRP-2181-188+pR
3.TRP-2181-188+U-ODN 15b
4.TRP-2181-188+U-ODN 15b+pR
小鼠的注射和免疫应答的分析如实施例1所述进行。结果显示于图3中。对于淋巴结细胞的离体再刺激，用TRP-2181-188作为特异肽，OVA257-264作为无关肽。
在同时注射TRP-2181-188、pR以及未用硫代磷酸取代的U-ODN(U-ODN 15b)的混合物之后，与单独注射TRP-2181-188或分别注射TRP-2181-188与pR或U-ODN 15b相比，TRP-2181-188特异的免疫应答强烈增强。
实施例4
由pR和不同寡脱氧核苷酸(磷酸二酯键，未用硫代磷酸取代)诱导的黑素瘤衍生肽(TRP-2181-188)特异性免疫应答是持续的。
小鼠               C57Bl/6(Harlan/Olac)
肽                 TRP-2-肽181-188(VYDFFVWL)，小鼠酪
                   氨酸酶相关蛋白-2的一种MHC I类
                   (H-2Kb)-限制的表位(B16黑素瘤，Bloom，
                 M.B.等人，J Exp.Med 1997，185，
                 453-459)，通过标准固相F-moc合成法合
                 成，HPLC纯化，通过质谱法分析其纯度
                 剂量：100μg/小鼠
聚-L-精氨酸(pR)  平均聚合度为43个精氨酸残基的聚-L-精
                 氨酸；SIGMA Chemicals
                 剂量：100μg/小鼠
CpG-ODN 1668     含有CpG-基序的硫代磷酸取代的ODNs：
                 tcc atg acg ttc ctg atg ct，由Purimex
                 GmbH，Gttingen合成
                 剂量：5nmol/小鼠
U-ODN 13         含有脱氧尿苷一磷酸的硫代磷酸取代的
                 ODNs：tcc atg acu ttc ctg atg ct，由
                 Purimex GmbH，Gttingen合成
                 剂量：5nmol/小鼠
U-ODN 13b        含有脱氧尿苷一磷酸的ODNs(未用硫代
                 磷酸取代)：tcc atg acu ttc ctg atg ct，由
                 Purimex GmbH，Gttingen合成
                 剂量：5nmol/小鼠
U-ODN 15         含有脱氧尿苷的硫代磷酸取代的ODNs的
                 混合物：nhh hhh wdu dhh hhh hhh wn，
                 由Purimex GmbH，Gttingen合成。(n＝
                 GCAT，h＝CAT，w＝AT，d＝GAT)
                 剂量：5nmol/小鼠
U-ODN 15b        含有脱氧尿苷的ODNs(未用硫代磷酸取
                 代)的混合物：nhh hhh wdu dhh hhh hhh
                 wn，由Purimex GmbH，Gttingen合成。
                 (n＝GCAT，h＝CAT，w＝AT，d＝GAT)
                 剂量：5nmol/小鼠
实验组(每组5只小鼠)
1.TRP-2181-188
2.TRP-2181-188+pR
3.TRP-2181-188+CpG 1668
4.TRP-2181-188+U-ODN 13
5.TRP-2181-188+U-ODN 13b
6.TRP-2181-188+U-ODN 15
7.TRP-2181-188+U-ODN 15b
8.TRP-2181-188+pR+CpG 1668
9.TRP-2181-188+pR+U-ODN 13
10.TRP-2181-188+pR+U-ODN 13b
11.TRP-2181-188+pR+U-ODN 15
12.TRP-2181-188+pR+U-ODN 15b
小鼠的注射如实施例1所述进行。结果显示于图4中。为了在注射后第40天分析免疫应答，制备脾细胞的单细胞悬液。用TRP-2181-188作为特异肽，OVA257-264作为无关肽和ConA，离体再刺激脾细胞。
注射TRP-2181-188与pR、CpG 1668、U-ODN 13或硫代磷酸取代的U-ODNs(U-ODN 15)的混合物，与单独注射TRP-2181-188相比，强烈增强TRP-2181-188特异的免疫应答。同时注射聚-L-精氨酸与CpG1668或U-ODN 13显著增强该应答(只在U-ODN 15中轻微)。相反，当使用未用硫代磷酸取代的U-ODN 13或U-ODN 15b时，只在同时注射聚-L-精氨酸后才诱发强免疫应答。注射pR/U-ODN 15b(未用硫代磷酸取代)后的应答显著超过了pR/U-ODN15(用硫代磷酸取代)所诱发的应答。
实施例5
在TRP-2181-188与pR和含CpG的寡脱氧核苷酸CpG 1668b(磷酸二酯键，未用硫代磷酸取代)同时注射后，针对黑素瘤衍生肽(TRP-2181-188)的长期特异性免疫应答的诱发。
小鼠             C57Bl/6(Harlan/Olac)
肽               TRP-2-肽181-188(VYDFFVWL)，小鼠
                 酪氨酸酶相关蛋白-2的一种MHC I类
                 (H-2Kb)-限制的表位(B16黑素瘤，
                 Bloom，M.B.等人，J Exp.Med 1997，
                 185，453-459)，通过标准固相F-moc合
                 成法合成，HPLC纯化，通过质谱法分
                 析其纯度
                 剂量：100μg/小鼠
聚-L-精氨酸(pR)  平均聚合度为43个精氨酸残基的聚-L-
                 精氨酸；SIGMA Chemicals
                 剂量：100μg/小鼠
CpG-ODN 1668b    含有CpG-基序的ODNs(未用硫代磷酸
                 取代)：tcc atg acg ttc ctg atg ct，由
                 Purimex GmbH，Gttingen合成
                 剂量：5nmol/小鼠
实验组(每组5只小鼠)
1.TRP-2181-188
2.TRP-2181-188+pR
3.TRP-2181-188+CpG 1668b
4.TRP-2181-188+pR+CpG 1668b
小鼠的注射如实施例1所述进行。结果显示于图5中。为了在注射后第6、49和98天分析免疫应答，制备脾细胞的单细胞悬液。用TRP-2181-188作为特异肽，OVA257-264作为无关肽(数据未显示)和ConA，离体再刺激脾细胞。
同时注射TRP-2181-188、pR和CpG 1668b与分别注射TRP-2181-188与pR或CpG 1668b相比，产生数量显著增加的肽特异性产IFN-γ细胞。这不仅在第6天可观察到，在单次注射以后的时间点(第49、98天)也可观察到，表明组合pR/CpG 1668b具有强烈且持久的免疫刺激作用。
实施例6
使用KLK和脱氧肌苷修饰的寡核苷酸I-ODN 2b(磷酸二酯键，未用硫代磷酸取代)，针对OVA257-264-肽的特异性免疫应答的产生。小鼠            C57Bl/6(Harlan/Olac)
肽             OVA257-264-肽(SIINFEKL)，鸡卵白蛋白的一
               种MHC I类(H-2Kb)-限制的表位(Rotzschke
               等人，1991)，通过标准固相F-moc合成法合
               成，HPLC纯化，通过质谱法分析其纯度
               剂量：300μg/小鼠
KLK            KLKLLLLLKLK-COOH
               剂量：168μg/小鼠
I-ODN 2b       含有脱氧肌苷的ODNs(未用硫代磷酸取代)：
               tcc atg aci ttc ctg atg ct，由Purimex GmbH，
               Gttingen合成
               剂量：5nmol/小鼠
实验组(每组5只小鼠)
1.OVA257-264+KLK
2.OVA257-264+I-ODN 2b
3.OVA257-264+KLK+I-ODN 2b
小鼠的注射如实施例1所述进行。结果显示于图6中。为了在注射后第7天分析免疫应答，采血，并通过Ficoll梯度分离外周血单核细胞。用OVA257-264作为特异肽，TRP-2181-188作为无关肽和ConA，离体再刺激PBMC。
注射OVA257-264与KLK或I-ODN 2b不诱发肽特异的IFN-γ产生。然而，在同时注射OVA257-264、KLK和I-ODN 2b之后，可检测到大量的OVA257-264特异性产IFN-γT细胞。
实施例7
使用KLK和脱氧肌苷修饰的寡核苷酸I-ODN 2b(磷酸二酯键，未用硫代磷酸取代)，针对黑素瘤衍生肽(TRP-2181-188)的特异性免疫应答的产生。
小鼠           C57Bl/6(Harlan/Olac)
肽             TRP-2-肽181-188(VYDFFVWL)，小鼠酪氨酸酶
               相关蛋白-2的一种MHC I类(H-2Kb)-限制的表
               位(B16黑素瘤，Bloom，M.B.等人，J Exp.Med
               1997，185，453-459)，通过标准固相F-moc合成
               法合成，HPLC纯化，通过质谱法分析其纯度
               剂量：100μg/小鼠
KLK            KLKLLLLLKLK-COOH
               剂量：168μg/小鼠
I-ODN 2b       含有脱氧肌苷的ODNs(未用硫代磷酸取代)：
               tcc atg aci ttc ctg atg ct，由Purimex GmbH，
               Gttingen合成
               剂量：5nmol/小鼠
实验组(每组5只小鼠)
1.TRP-2181-188
2.TRP-2181-188+KLK
3.TRP-2181-188+I-ODN 2b
4.TRP-2181-188+KLK+I-ODN 2b
小鼠的注射如实施例1所述进行。结果显示于图7中。为了在注射后第7天分析免疫应答，采血，并通过Ficoll梯度分离外周血单核细胞。用TRP-2181-188作为特异肽，OVA257-264作为无关肽和ConA，离体再刺激PBMC。
单独注射或与KLK或I-ODN 2b一起注射TRP-2181-188不诱发肽特异的IFN-γ产生。相反，在同时注射TRP-2181-188、KLK和I-ODN 2b之后，可检测到极大量的肽特异性产IFN-γT细胞。
实施例8
聚-L-精氨酸阻止血清DNAse对DNA的降解
为了研究pR在阻止DNAse降解DNA中的保护作用，进行下列体外实验。为了显示可能的体内相关性，用血清作为DNase的来源。
在含或不含聚-L-精氨酸(2.4μg/2.4μl)的条件下，DNA-质粒pSP65(1.58μg/2μl)与来源于幼稚小鼠的血清(8μl)一起在37℃下温育1小时。在室温下添加肝素(1.6U/1.6μl)20分钟，用来分解DNA/pR复合物，以使DNA迁移至凝胶中。图8显示1％琼脂糖凝胶(30分钟/100伏)。用100bp DNA标记物(GIBCO BRL)作为对照。
对于未处理的pSP65 DNA，可观察到典型的环状质粒超螺旋/螺旋/松弛带模式。DNA与血清温育导致降解，检测为不同的随机DNase切割产物的成片条带(smear)。在添加聚-L-精氨酸后阻止了血清DNase的这种降解。
因此，聚-L-精氨酸稳定DNA免遭酶降解，并且延长DNA的半衰期和生物有效性。

Claims (7)

1.稳定核酸的方法，其特征在于核酸与一种聚阳离子聚合物接触。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于该核酸是一种在核苷残基之间含有二磷酸基的脱氧核糖核酸。
3.聚阳离子聚合物在稳定核酸中的用途。
4.根据权利要求3的用途，用于稳定在核苷残基之间含有磷酸二酯基的脱氧核糖核酸。
5.根据权利要求3或4的用途，其特征在于该核酸在水溶液或悬液中稳定。
6.根据权利要求5的用途，其特征在于该聚阳离子聚合物是一种聚阳离子肽，优选的是在8个以上氨基酸残基中含有20％以上、特别是50％以上碱性氨基酸的多肽。
7.根据权利要求3-6中任何一项的用途，其特征在于对个体施用的核酸的体内半衰期延长。
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