DE60221004T2 - Immunostimulierende oligodeoxyribonuklein moleküle - Google Patents

Immunostimulierende oligodeoxyribonuklein moleküle Download PDF

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Description

  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf immunstimulierende Oligodesoxynukleinsäuremoleküle (ODNs) und pharmazeutische Zusammensetzungen, die solche ODNs enthalten.
  • Impfstoffe können mehr Leben retten (und Mittel sparen) als jede andere medizinische Intervention (Nossal, 1998). Dank weltweiter Impfprogramme ist das Auftreten vieler tödlicher Erkrankungen drastisch zurückgegangen. Obwohl dies für eine ganze Reihe von Krankheiten gilt, z.B. Tuberkulose, Diphtherie, Keuchhusten, Masern und Tetanus, gibt es für zahlreiche Infektionserkrankungen, so auch gegen die meisten Virusinfektionen, wie AIDS, keine wirksame Impfung. Es gibt auch keine wirksame Impfung gegen andere Erkrankungen, sowohl infektiöse als auch nicht infektiöse, die jedes Jahr das Leben von Millionen Patienten fordern, wie z.B. Malaria und Krebs. Außerdem erfordert das rasche Auftreten von Antibiotika-resistenten Bakterien und Mikroorganismen alternative Behandlungen, wobei Impfstoffe eine logische Wahl sind. Schließlich wird der große Bedarf an Impfstoffen auch durch die Tatsache verdeutlicht, dass Infektionskrankheiten und nicht Herz-Kreislauf-Störungen, Krebs oder Verletzungen noch immer die häufigste Ursache für Tod und Behinderung auf der Welt darstellen (Bloom und Widdus, 1998).
  • Aus immunologischer Sicht besteht ein großes Problem auf dem Gebiet der Impfstoffe heute darin, dass traditionelle Impfstoffe (und/oder die in diesen Präparaten enthaltenen immunmodulierenden Verbindungen) darauf ausgelegt sind, große Mengen Antikörper hervorzurufen (Harrow und Lane, 1988). Antikörper alleine sind jedoch bei der Verhütung einer großen Anzahl von Krankheiten, so auch bei den meisten von Viren, intrazellulären Bakterien, bestimmten Parasiten verursachten Erkrankungen und Krebs nicht wirksam. Beispiele für solche Erkrankungen sind der oben genannte HIV-Virus oder Plasmodium spec. bei Malaria, doch sind sie nicht darauf beschränkt. In zahlreichen Versuchssystemen wurde gezeigt, dass der zelluläre Arm des Immunsystems, einschließlich T-Zellen, und nicht so sehr der humorale Arm für diese Indikationen wichtig ist. Daher sind neuartige, innovative Technologien gefordert, um die Grenzen der herkömmlichen Impfstoffe zu durchbrechen. Dabei ist das Hauptaugenmerk auf Technologien zu legen, die verlässlich das zelluläre Immunsystem anregen, einschließlich Antigen-spezifische T-Zellen, die Moleküle erkennen, die auf Pathogen-infizierten Zellen exprimiert werden. Idealer Weise werden Vakzine erzeugt, die sowohl T-Zellen, die erkrankte und/oder infizierte Zellen von normalen Zellen unterscheiden, als auch gleichzeitig Antikörper, die von B-Zellen sezerniert werden und Pathogene in extrazellulären Kompartimenten erkennen, induzieren.
  • Viele etablierte Impfstoffe bestehen aus lebenden, abgeschwächten Organismen, wo das Risiko einer Rückkehr zum virulenten Wildtyp-Stamm besteht. Insbesondere bei Wirten mit geschwächtem Immunsystem kann dies ein lebensbedrohliches Szenario darstellen. Alternativ dazu werden Vakzine als eine Kombination von Pathogen-derivierten Antigenen und Verbindungen, die Immunantworten gegen diese Antigene auslösen oder verstärken (diese Verbindungen werden üblicher Weise als Adjuvantien bezeichnet), verabreicht, da diese Untereinheits-Vakzine im Allgemeinen alleine nicht wirksam sind.
  • Während kein Zweifel darüber besteht, dass die oben genannten Impfstoffe wertvolle medizinische Behandlungen darstellen, haben sie den Nachteil, dass auf Grund ihrer Komplexität schwere Nebenwirkungen ausgelöst werden können, z.B. auf Antigene, die im Vakzin enthalten sind und eine Kreuz-Reaktivität mit Molekülen aufweisen, die von den Zellen geimpfter Lebewesen exprimiert werden. Außerdem ist es schwierig, die bestehenden Erfordernisse von Regulierungsbehörden, z.B. der Weltgesundheitsorganisation (WHO), der amerikanischen Lebensmittel- und Arzneimittelbehörde (FDA) und ihrer Pendants in Europa für die genaue Spezifikation der Vakzinzusammensetzung und die Mechanismen der Induktion der Immunität zu erfüllen.
  • Antigen präsentierende Zellen gehören zum angeborenen Immunsystem, das sich als erste Verteidigungslinie des Wirts entwickelt hat, die eine Infektion kurz nach dem Kontakt mit Mikroorganismen eingrenzt (Hoffmann et al., 1999). Zellen des angeborenen Immunsystems erkennen Muster oder relativ unspezifische Strukturen, die an ihren Targets exprimiert werden, eher als kompliziertere, spezifische Strukturen, die vom adaptiven Immunsystem erkannt werden (Hoffmann et al., 1999). Beispiele für Zellen des angeborenen Immunsystems sind Makrophagen und dendritische Zellen, aber auch Granulozyten (z.B. Neutrophile), natürliche Killerzellen und andere. Im Gegensatz dazu erkennen die Zellen des adaptiven Immunsystems spezifische, antigene Strukturen einschließlich Peptide im Fall von T-Zellen und Peptide sowie dreidimensionale Strukturen im Fall von B-Zellen. Das adaptive Immunsystem ist viel spezifischer und genauer als das angeborene Immunsystem und wird bei wiederholtem Kontakt mit einem bestimmten Pathogen/Antigen immer besser. Phylogenetisch ist das angeborene Immunsystem viel älter und ist bereits bei sehr primitiven Organismen zu finden. Trotzdem ist das angeborene Immunsystem während der Anfangsphase des Antigenkontakts von kritischer Bedeutung, da die Zellen des angeborenen Immunsystems, d.h. APCs, nicht nur Pathogene in Schach halten, sondern auch Zellen des adaptiven Immunsystems primen und so spezifische Immunantworten auslösen, die zur Entfernung der Eindringlinge führen. In Summe gesehen spielen die Zellen des angeborenen Immunsystems und insbesondere APCs eine kritische Rolle in der Phase des Auslösens der Immunantworten, indem sie a) Infektionen mit Hilfe eines primitiven Mustererkennungssystems in Schach halten, und b) Zellen des adaptiven Immunsystems primen, was zu spezifischen Immunantworten und Memory und schließlich dazu führt, dass die eingedrungenen Pathogene oder andere Targets entfernt werden (Roitt et al., 1998). Diese Mechanismen können auch wichtig dafür sein, Tumorzellen zu entfernen oder in Schach zu halten.
  • Wie oben erwähnt ist, erkennen Zellen des angeborenen Immunsystems Muster, die auf ihren jeweiligen Targets exprimiert werden. Beispiele sind Lipopolysaccharide (LPS) im Fall von gramnegativen Bakterien, mykobakterielle Glykolipide, Lipoteichonsäuren bei grampositiven Bakterien, Mannane bei Hefe und doppelsträngige RNAs bei Viren (Hoffmann et al., 1999). Außerdem können sie Muster wie veränderte Glykosylierungen von Proteinen an Tumorzellen erkennen.
  • Jüngste Befunde beschreiben DNAs von protozoischen oder niederen Eukaryonten als ein weiteres Muster, das vom angeborenen (jedoch möglicher Weise auch vom adaptiven) Immunsystem von Säugetieren (und möglicher Weise von den meisten, wenn nicht von allen Wirbeltieren) erkannt wird (Krieg, 1996; Lipford et al., 1998).
  • Das Immunsystem erkennt niedere Organismen, einschließlich Bakterien, möglicher Weise auf Grund von Unterschieden in der Struktur und Sequenzverwendung zwischen dem Pathogen und der Wirts-DNA. Insbesondere werden kurze Abschnitte von DNA, die von Nicht-Wirbeltieren oder in Form kurzer, synthetischer ODNs, die nicht methylierte Cytosin-Guanin-Dinukleotide (CpG) in einem bestimmten Basenkontext enthalten, abgeleitet sind, in Angriff genommen (Krieg et al., 1995). CpG-Motive sind in der erwarteten Häufigkeit in der DNA von Bakterien zu finden, sind jedoch in der DNA von Wirbeltieren weit weniger häufig (Lipford et al., 1998; Pisetsky, 1999). Außerdem sind CpG-Motive von Nicht-Wirbeltieren (d.h. von Bakterien) nicht methyliert, die CpG-Sequenzen von Wirbeltieren hingegen schon. Diese Unterschiede zwischen der DNA von Bakterien und Wirbeltieren ermöglichen es den Wirbeltieren, die DNA von Nicht-Wirbeltieren als ein Gefahrensignal zu erkennen.
  • Natürliche CpG enthaltende DNA, ODNs, sowie auch mit Thiophosphat substituierte (Austausch von Phosphat gegen Thiophosphat-Reste) ODNs, die CpG-Motive enthalten (CpG-ODN) sind nicht nur potente Aktivatoren der Vermehrung von Immunzellen und der humoralen Immunantwort (Krieg et al., 1995), sondern sie stimulieren auch starke zelluläre Immunantworten (Übersicht in Lipford et al., 1998). DNA/ODNs, die nicht methylierte CpG-Motive enthalten, können monozytische Zellen (dendritische Zellen, Makrophagen) und B-Zellen direkt aktivieren. Wahrscheinlich werden natürliche Killerzellen (NK) nicht direkt aktiviert, sondern reagieren auf von Monozyten deriviertes IL-12 (Interleukin 12) mit einem markanten Anstieg ihrer IFN-γ-Produktion (Chace et al., 1997). Infolge dessen fördert die Induktion von Monozyten und NK-Zellen durch CpG DNA die Induktion von Th1-Typ-Antworten und die Entwicklung zytotoxischer T-Zellen.
  • Ribonukleinsäure, basierend auf Inosin und Cytosin, wie Polyinosin-Polycytidylsäure (Poly I:C) ist dafür bekannt, Th1-spezifische Immunantworten zu fördern. Sie ist dafür bekannt, Makrophagen zu stimulieren, um Cytokine, wie IL-1α und IL-12 zu produzieren (Manetti et al., 1995), und es ist auch als ein potenter Auslöser für Interferon Typ 1 (Manetti et al., 1995) und als ein potenter Stimulator für NK-Zellen (Cavanaugh et al., 1996) bekannt.
  • Diese Wirkung ist jedoch streng auf Ribonukleinsäure beschränkt, die Inosin- und Cytidinreste enthält ( WO98/16247 ).
  • Uridin enthaltende Ribonukleinsäuren sind in diesem Zusammenhang bisher noch nicht diskutiert worden.
  • Untersuchungen durch die Erfinder der vorliegenden Erfindung zeigten, dass ODNs, die nicht methylierte CpG-Motive enthalten, zwar bei der Stimulierung des Immunsystems wirksam sind, jedoch wesentliche Nachteile haben, insbesondere im Hinblick auf die Spezifität (hoher Hintergrund) und das Auslösen von Nebenwirkungen, wie hohe systemische TNF-α-Produktion. Es ist bekannt, dass die hohe systemische Freisetzung von TNF-α das toxische Schock-Syndrom verursacht, das bei betroffenen Patienten zum Tod führen kann.
  • In Kandimalla Ekambar et al. (Bioorganic & Medicinal Chem. 9 (2001), 807-813), Seela et al. (Helv. Chim. Acta 83 (2000), 2527-2540) und Bailly et al. (PNAS 93 (1996), 13623-13628) werden Desoxyuridin enthaltende Oligodesoxynukleotide (U-ODNs) als solche sowie ihre Verwendung zur PCR und ihre Leistung bei der Bildung von DNA-Doppelhelices beschrieben.
  • Daher liegt ein Ziel der vorliegenden Erfindung darin, geeignete neuartige ODNs zur Verfügung zu stellen, die nicht solch drastische Nebenwirkungen haben wie ODNs auf Basis von CpG-Sequenzen. Ein weiteres Ziel besteht darin, die Nebenwirkungen pharmazeutischer Zusammensetzungen zu reduzieren, die bekannte ODNs enthalten, und sichere und wirksame, gut verträgliche pharmazeutische Zusammensetzungen mit wirksamen, immunstimulierenden Eigenschaften zur Verfügung zu stellen, die für die Impfung von Tieren, insbesondere von Säugetieren einschließlich von Menschen geeignet sind.
  • Dieses Ziel wird durch die Verwendung eines Oligodesoxynukleinsäuremoleküls (ODN) mit der Struktur gemäß Formel (I)
    Figure 00050001
    erreicht,
    worin jegliches X ein O oder S ist,
    jegliches NMP ein 2'-Desoyxnukleosid-Monophosphat oder -Monothiophosphat ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Desoxyadenosin-, Desoxyguanosin-, Desoxyinosin-, Desoxycytosin-, Desoxyuridin-, Desoxythymidin-, 2-Methyl-desoxyinosin-, 5-Methyl-desoxycytosin-, Desoxypseudouridin-, Desoxyribosepurin-, 2-Amino-desoxyribosepurin-, 6-S-Desoxyguanin-, 2-Dimethyl-desoxyguanosin- oder N-Isopentenyl-desoxyadenosin-monophosphat oder -Monothiophosphat,
    NUC ein 2'-Desoxynukleosid ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Desoxyadenosin-, Desoxyguanosin-, Desoxyinosin-, Desoxycytosin-, Desoxyuridin-, Desoxythymidin-, 2-Methyldesoxyinosin-, 5-Methyl-desoxycytosin-, Desoxypseudouridin-, Desoxyribosepurin-, 2-Amino-desoxyribosepurin-, 6-S-Desoxyguanin-, 2-Dimethyl-desoxy-guanosin- oder N-Isopentenyl-desoxyadenosin,
    a und b ganze Zahlen von 0 bis 100 sind, mit der Voraussetzung, dass a + b zwischen 4 und 150 beträgt,
    B und E übliche Gruppen für die 5'- oder 3'-Enden von Nukleinsäuremolekülen sind und unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus -H, -CH3, -COH, -COCH3, -OH, -CHO, -PO4, -PSO3, -PS2O2, -PS3O, -PS4, -SO3, -PO4-(CH2)1-6-NH2 oder -PO4-(CH2)1-6-NH-Label zur Herstellung einer immunstimulierenden pharmazeutischen Zusammensetzung.
  • Überraschenderweise stellte sich heraus, dass ODNs, die Desoxyuridinreste enthalten (U-ODNs), eine immunstimulierende Wirkung aufweisen, die mit jener von ODNs, die CpG-Motive enthalten, vergleichbar oder in vielen Fällen sogar besser ist. Im Vergleich zu CpG-ODNs lösen gemäß der vorliegenden Erfindung verwendete ODNs vergleichbare oder größere Mengen spezifischer T-Zellen für ein bestimmtes Antigen oder Antigenfragment aus. Außerdem induzieren gemäß der vorliegenden Erfindung verwendete ODNs nicht die systemische Produktion entzündungsfördernder Zytokine, wie TNF-α und IL-6, und reduzieren so die Induktion von potentiell schädlichen Nebenwirkungen.
  • Während bestimmte immunstimulierende Wirkungen für Inosin enthaltende RNA-Moleküle, wie Poly-IC oder die in WO98/16247 erwähnten Moleküle, beschrieben worden sind, stellte sich überra schender Weise heraus, dass Desoxynukleinsäuremoleküle, die Desoxyuridinreste enthalten, gute immunstimulierende ODNs sein können.
  • Außerdem sind gemäß der vorliegenden Erfindung verwendete U-ODNs – im Gegensatz zu ODNs auf Basis des spezifischen CpG-Motivs – nicht von einem spezifischen Motiv oder einer palindromen Sequenz abhängig, wie das für die CpG-Oligonukleotide beschrieben ist (siehe z.B. EP 0 468 520 A2 , WO96/02555 , WO98/18810 , WO98/37919 , WO98/40100 , WO98/52581 , WO99/51259 und WO99/56755 ). Daher kann eine Gruppe von gemäß der vorliegenden Erfindung verwendeten U-ODNs vorzugsweise ein CU-Motiv enthalten (und daher sind in diesen hier aufgenommenen Bezugs-Dokumenten beschriebene ODNs, worin ein oder mehrere Guanosinreste durch Desoxyuridinreste ersetzt sind, bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden ODNs). Es ist für seine prinzipielle immunstimulierende Eigenschaft nicht notwendig, da U-ODNs mit einem Uridin, das sich nicht in einem CU- oder UC-Kontext befindet, ebenfalls immunstimulierende Eigenschaften aufweisen.
  • Das gemäß der vorliegenden Erfindung verwendete U-ODN ist daher ein DNA-Molekül, das einen Desoxyuridinrest enthält, der vorzugsweise in Einzelstrangform zur Verfügung gestellt ist.
  • Die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendeten U-ODNs können durch rekombinante Verfahren isoliert oder chemisch synthetisiert werden. Im letzteren Fall kann die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendete U-ODN auch modifizierte Oligonukleotide enthalten, die unter Verwendung standardmäßiger chemischer Transformationen synthetisiert werden können, wie Methylphosphonate oder andere modifizierte Oligonukleotide auf Phosphorbasis, wie Phosphotriester, Phosphoamidate und Phosphordithioate. Andere modifizierte Oligonukleotide, nicht auf Phosphorbasis, können ebenfalls verwendet werden (Stirchak et al., MAR 17 (1989), 6129-6141), wobei jedoch Monophosphate oder Monothiophosphate die bei der vorliegenden Erfindung bevorzugt zu verwendenden 2'-Desoxynukleosid-Monophosphate sind.
  • Die NMPs der gemäß der vorliegenden Erfindung verwendeten U-ODNs sind vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Desoxyadenosin-, Desoxyguanosin-, Desoxyinosin-, Desoxycytosin-, Desoxyuridin-, Desoxythymidin-, 2-Methyl-desoxyuridin-, 5-Methyl-desoxycytosin-monophosphat oder -Monothiophosphat (wie üb lich befindet sich die Phosphat- oder Thiophosphatgruppe 5' der Desoxyribose). Während es für die auf dem CpG-Motiv basierenden ODNs von wesentlicher Bedeutung ist, dass dieses Motiv nicht methyliert ist, ist dies für die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendeten ODNs erstaunlicher Weise nicht der Fall, worin z.B. 2-Methyl-desoxyinosin- oder 5-Methyl-desoxycytosin-Reste keine allgemein negativen Auswirkungen auf die immunstimulierenden Eigenschaften der gemäß der vorliegenden Erfindung verwendeten ODNs haben. Alternativ dazu können an Stelle der 2-Desoxy-Formen der NMPs auch andere, insbesondere inerte Gruppen an der 2-Stelle der Ribosegruppe vorhanden sein, wie z.B. -F, -NH2, -CH3, insbesondere -CH3. Natürlich ist ausgeschlossen, dass sich die -OH- und SH-Gruppen bei den gemäß der vorliegenden Erfindung verwendetenU-ODNs an der 2'-Stelle der Ribose befinden, insbesondere des Riboserestes für die Uridin-NMP.
  • Die Länge der gemäß der vorliegenden Erfindung verwendeten ODNs liegt im Bereich der standardmäßigen ODNs, die gemäß dem Stand der Technik verwendet werden. Daher zeigen Moleküle mit einer Gesamtlänge von unter 4 und über 150 graduell abnehmendes immunstimulierendes Potential. Bevorzugte ODNs enthalten zwischen 10 und 60, insbesondere zwischen 15 und 40 Basen (Nukleoside), was impliziert, dass a + b in Formel (I) in diesen bevorzugten Ausführungsformen zwischen 10 und 60, vorzugsweise zwischen 15 und 40 beträgt.
  • Während es sich bei den Inosin und Cytidin enthaltenden Ribonukleinsäuremolekülen, die im Stand der Technik als immunstimulierend beschrieben sind, um große und relativ undefinierte Polynukleinsäuren mit einem Molekulargewicht von weit über 200 000 handelt (eine im Handel erhältliche Polyinosin-Polycytidylsäure von Sigma Chemicals hat ein Molekulargewicht im Bereich von 220 000 bis 460 000 (mindestens 500–1000 C+I-Reste)), sind die erfindungsgemäßen Moleküle DNA-Moleküle mit wesentlich geringerer Länge mit einer gut definierten Länge und Zusammensetzung, die in Produkten sehr gut reproduzierbar sind.
  • Weiters wird bevorzugt, dass es sich beim Desoxyuridin enthaltenden NMP der U-ODNs gemäß Formel (I) um ein Monothiophosphat mit 1-4 Schwefelatomen handelt und dass auch weitere NMPs, insbesondere alle weiteren NMPs als Nukleosid-Monothiophosphate vorhanden sind, da solche ODNs größere Nukleaseresis tenz aufweisen (für die vorliegende Erfindung ist klar, dass sich das "Mono" in "Monothiophosphaten" auf das Phosphat bezieht, d.h. dass eine Phosphatgruppe (ein Phosphoratom) in jedem NMP vorhanden ist). Vorzugsweise ist in den erfindungsgemäßen NMPs mindestens eines von X1 und X2 S und mindestens eines von X3 und X4 O. Vorzugsweise sind X3 und X4 O. (X3 kann (auf Grund der Synthese des NMP) zum Beispiel von der Phosphatgruppe oder von der 3'-Gruppe der NMP-Ribose kommen).
  • Vorzugsweise enthalten die erfindungsgemäßen ODNs die Sequenz
    Figure 00090001
    worin
    jegliches n ein 2'-Desoxynukleosid-Monophosphat oder -Mono-thiophosphat ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Desoxyadenosin-, Desoxyguanosin-, Desoxycytosin- oder Desoxythymidinmonophosphat oder -Monothiophosphat,
    jegliches h ein 2'-Desoxynukleosid-Monophosphat oder -Mono-thiophosphat ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Desoxyadenosin-, Desoxycytosin- oder Desoxythymidin-monophosphat oder -Monothiophosphat,
    u Desoxyuridin-monophosphat oder -Monothiophosphat ist,
    jegliches w ein 2'-Desoxynukleosid-monophosphat oder -Mono-thiophosphat ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Desoxyadenosin- oder Desoxythymidin-monophosphat oder -Mono-thiophosphat, und
    jegliches d ein 2'-Desoxynukleosid-monophosphat oder -Mono-thiophosphat ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Desoxyadenosin-, Desoxyguanosin- oder Desoxythymidin-monophosphat oder -Monothiophosphat.
  • Weitere gemäß der vorliegenden Erfindung bevorzugt verwendete ODNs enthalten die Sequenz
    wdu, wdud, wdudn oder
    wdudud,
    worin w, d, u und n wie oben definiert sind.
  • Wie oben ausgeführt ist, ist kein spezifisches Motiv (wie ein CpG oder ein Palindrom) für die erfindungsgemäßen U-ODNs erforderlich.
  • Ein CU-Motiv enthaltende ODNs sind jedoch bevorzugt, so dass in einer bevorzugten Ausführungsform die ODN gemäß Formel (I) mindestens ein 2'-Desoxycytosin-monophosphat oder -Mono-thiophosphat 3'-benachbart zu einem 2'-Desoxyuridin-monophosphat oder -Monothiophosphat enthält, um ein 5'-CU 3'-Motiv zu bilden.
  • Bevorzugte gemäß der vorliegenden Erfindung verwendete ODNs enthalten eine oder mehrere der Sequenz
    gacutt,
    uacutt,
    gauctt,
    uauctt,
    worin
    a Desoxyadenosin-monophosphat oder -Monothiophosphat ist,
    g Desoxyguanosin-monophosphat oder -Monothiophosphat ist,
    u Desoxyuridin-monophosphat oder -Monothiophosphat ist,
    c Desoxycytosin-monophosphat oder -Monothiophosphat ist und
    t Desoxythymidin-monophosphat oder -Monothiophosphat ist.
  • Die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendeten U-ODNs sind besonders für die Anwendung auf dem Gebiet der Pharmazie geeignet, z.B. um als ein Medikament bei einem Tier oder Menschen angewendet zu werden. Sie sind speziell daran angepasst, als ein immunstimulierendes Mittel zu wirken, insbesondere in oder zusammen mit Vakzinzusammensetzungen.
  • Daher bezieht sich die vorliegende Erfindung auch auf eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine gemäß der vorliegenden Erfindung verwendete ODN umfasst.
  • Da eine bevorzugte erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung ein Impfstoff ist, sollte diese Zusammensetzung neben der gemäß der vorliegenden Erfindung verwendeten ODN ein Antigen enthalten. Das Potential diese Antigens, einen Schutz/eine Immunantwort des geimpften Lebewesens hervorzurufen, wird stark erhöht, wenn es mit den erfindungsgemäß verwendeten ODNs kombiniert wird, insbesondere auf Grund ihrer immunstimulierenden Aktivität.
  • Ein Vakzin kann eine große Vielzahl von verschiedenen Antigenen enthalten. Beispiele für Antigene sind ganz abgetötete Organismen, wie inaktivierte Viren oder Bakterien, Pilze, Protozoen oder auch Krebszellen. Antigene können auch aus Subfraktionen dieser Organismen/Gewebe, aus Proteinen oder, in ih rer einfachsten Form, aus Peptiden bestehen. Antigene können auch vom Immunsystem in Form von glykosylierten Proteinen oder Peptiden erkannt werden und können auch Polysaccharide oder Lipide sein oder diese enthalten. Es können kurze Peptide verwendet werden, da zum Beispiel zytotoxische T-Zellen (CTL) Antigene in Form kurzer, üblicher Weise 8-11 Aminosäuren langer Peptide in Kombination mit dem Haupthistokompatibilitäts-komplex (major histocompatibility complex, MHC) erkennen (Rammensee et al., Immunogenetics 41 (1995), 178-228). B-Zellen erkennen längere Peptide, beginnend bei etwa 15 Aminosäuren (Harrow et al., Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory (1988)). Im Gegensatz zu T-Zellen-Epitopen kann die dreidimensionale Struktur von B-Zellen-Antigenen auch für das Erkennen durch Antikörper wichtig sein. Um anhaltende, Antigen-spezifische Immunantworten zu erhalten, sind Adjuvantien hilfreich, um Immunkaskaden auszulösen, die alle notwendigen Zellen des Immunsystems einbinden. In erster Linie wirken Adjuvantien auf sogenannte Antigen präsentierende Zellen (antigen presenting cells, APCs), sie sind jedoch in ihrem Wirkungsmodus nicht darauf beschränkt. Diese Zellen treffen das (die) Antigen(e) meist zu erst, gefolgt von der Präsentation des prozessierten oder unmodifizierten Antigens an den Immuneffektor. Zwischenzellentypen können ebenfalls beteiligt sein. In einer produktiven Immunantwort werden nur Effektorzellen mit der passenden Spezifität aktiviert. Das Adjuvans kann auch lokal Antigene und gemeinsam injizierte andere Faktoren zurückhalten. Zusätzlich kann das Adjuvans als chemisches anziehendes Mittel für andere Immunzellen wirken, oder es kann lokal und/oder systemisch als Stimulans für das Immunsystem wirken.
  • Die in den vorliegenden Zusammensetzungen zu verwendenden Antigene sind nicht kritisch. Vorzugsweise werden Proteine oder Peptide als solche Antigene verwendet, die von einem viralen oder bakteriellen Pathogen oder von Pilzen oder Parasiten abgeleitet sind (einschließlich derivatisierte Antigene oder glykosylierte oder lipidierte Antigene oder Polysaccharide oder Lipide). Eine weitere bevorzugte Quelle von Antigenen sind Tumor-Antigene. Bevorzugte Pathogene sind ausgewählt aus menschlichem Immundefizienzvirus (HIV), Hepatitis A- und Hepatitis B-Viren, Hepatitis C-Virus (HCV), Rous-Sarcoma-Virus (RSV), Ep stein-Barr-Virus (EBV), Influenza-Virus, Rotavirus, Staphylococcus aureus, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatis, Mycobacterium tuberculosis, Streptococcus pneumoniae, Bacillus anthracis, Vibrio cholerae, Plasmodium sp. (Pl. falciparum, Pl. vivax etc.), Aspergillus sp. oder Candida albicans. Antigene können auch Moleküle sein, die von Krebszellen exprimiert werden (Tumor-Antigene). Der Derivatisierungsprozess kann die Reinigung eines spezifischen Proteins von den Pathogen-/Krebs-Zellen, die Inaktivierung des Pathogens sowie die proteolytische oder chemische Derivatisierung oder Stabilisierung eines solchen Proteins beinhalten. Auf die gleiche Weise können auch Tumor-Antigene (Krebsvakzine) oder Autoimmun-Antigene in der pharmazeutischen, Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Mit solchen Zusammensetzungen kann eine Tumor-Impfung oder eine Behandlung von Autoimmunerkrankungen durchgeführt werden.
  • Im Fall von Peptid-Antigenen ist die Verwendung von Peptid-Mimitopen/Agonisten/Superagonisten/Antagonisten oder Peptiden, die in bestimmten Positionen verändert sind, ohne die immunologischen Eigenschaften zu beeinflussen, oder Nicht-Peptid-Mimitopen/Agonisten/Superagonisten/Antagonisten (Übersicht in Sparbier und Walden, 1999) in der derzeitigen Erfindung mit eingeschlossen. Peptid-Antigene können auch Verlängerungen entweder am Carboxy- oder am Amino-Ende des Peptid-Antigens haben, was die Interaktion mit der (den) polykationischen Verbindung(en) oder der (den) immunstimulierenden Verbindung(en) erleichtert. Für die Behandlung von Autoimmunerkrankungen können Peptid-Antagonisten angewendet werden.
  • Antigene können auch derivatisiert sein, um Moleküle einzuschließen, die die Antigen-Präsentation und das Abzielen von Antigenen auf Antigen präsentierende Zellen verstärken.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung dient die pharmazeutische Zusammensetzung dazu, Toleranz gegenüber Proteinen oder Proteinfragmenten und Peptiden zu verleihen, die an Autoimmunerkrankungen beteiligt sind. Antigene, die in diesen Ausführungsformen verwendet werden, dienen dazu, das Immunsystem toleranter zu machen oder Immunantworten gegen Epitope zu verringern, die an Autoimmun-Prozessen beteiligt sind.
  • Vorzugsweise umfasst die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung, insbesondere in Form eines Impf stoffs, weiters ein polykationisches Polymer, vorzugsweise ein polykationisches Peptid, insbesondere Polyarginin, Polylysin oder ein antimikrobielles Peptid.
  • Die gemäß der vorliegenden Erfindung zu verwendende(n) polykationische(n) Verbindung(en) kann (können) jegliche polykationische Verbindung sein, die die charakteristischen Wirkungen gemäß WO 97/30721 aufweist. Bevorzugte polykationische Verbindungen sind ausgewählt aus basischen Polypeptiden, organischen Polykationen, basischen Polyaminosäuren oder Mischungen davon. Diese Polyaminosäuren sollten eine Kettenlänge von mindestens 4 Aminosäureresten aufweisen (siehe Tuftsin, wie beschrieben in Goldman et al. (1983)). Besonders bevorzugt sind Substanzen, die peptidische Bindungen enthalten, wie Polylysin, Polyarginin und Polypeptide, die mehr als 20%, insbesondere mehr als 50% basische Aminosäuren in einem Bereich von mehr als 8, insbesondere mehr als 20 Aminosäureresten haben, oder Mischungen davon. Andere bevorzugte Polykationen und ihre pharmazeutischen Zusammensetzungen sind in WO 97/30721 (z. B. Polyethylenimin) und WO 99/38528 beschrieben. Diese Polypeptide enthalten vorzugsweise zwischen 20 und 500 Aminosäurereste, insbesondere zwischen 30 und 200 Reste.
  • Diese polykationischen Verbindungen können chemisch oder rekombinant hergestellt oder aus natürlichen Quellen abgeleitet werden.
  • Kationische (Poly)peptide können auch polykationische antibakterielle mikrobielle Peptide mit Eigenschaften sein, wie sie in Ganz und Lehrer (1999) und Hancock (1999) beschrieben sind. Diese (Poly)peptide können prokaryontischen, tierischen oder pflanzlichen Ursprungs sein oder chemisch oder rekombinant hergestellt werden (Andreu und Rivas (1998); Ganz und Lehrer (1999); Simmaco et al. (1998)). Peptide können auch zur Klasse der Defensine gehören (Ganz (1999); Ganz und Lehrer (1999)). Sequenzen solcher Peptide sind zum Beispiel in der Antimicrobial Sequences Database unter der folgenden Internet-Adresse zu finden:
    http://www.bbcm.univ.trieste.it/~tossi/pag1.html
  • Solche Wirtsverteidigungspeptide oder Defensine sind auch eine bevorzugte Form des polykationischen Polymers gemäß der vorliegenden Erfindung. Im Allgemeinen wird eine Verbindung, die als Endprodukt die Aktivierung (oder Regulierung nach unten) des adaptiven Immunsystems ermöglicht, vorzugsweise vermittelt von APCs (einschließlich dendritischer Zellen), als polykationisches Polymer verwendet.
  • Zur Verwendung als polykationische Substanz in der vorliegenden Erfindung besonders bevorzugt sind von Cathelicidin abgeleitete antimikrobielle Peptide oder Derivate davon ( WO 02/13857 ), insbesondere antimikrobielle Peptide, die von Säugetier-Cathelicidin abgeleitet sind, vorzugsweise von Menschen, Rindern oder Mäusen, oder neuroaktive Verbindungen, wie (menschliches) Wachstumshormon.
  • Polykationische Verbindungen, die aus natürlichen Quellen gewonnen werden, schließen HIV-REV oder HIV-TAT (abgeleitete kationische Peptide, Antennapedia-Peptide, Chitosan oder andere Chitin-Derivate) oder andere Peptide ein, die von diesen Peptiden oder Proteinen durch biochemische oder rekombinante Produktion abgeleitet werden. Andere bevorzugte polykationische Verbindungen sind Cathelin oder mit Cathelin verwandte oder davon abgeleitete Substanzen. Mäuse-Cathelin ist zum Beispiel ein Peptid, das die Aminosäuresequenz NH2-RLAGLLRKGGEKIGEKLKKIGOKIKNFFQKLVPQPE-COOH hat. Verwandte oder abgeleitete Cathelin-Substanzen enthalten die ganze oder Teile der Cathelin-Sequenz mit mindestens 15 bis 20 Aminosäureresten. Derivationen können die Substitution oder Modifikation der natürlichen Aminosäuren durch Aminosäuren beinhalten, die nicht zu den 20 Standard-Aminosäuren gehören. Außerdem können weitere kationische Reste in solche Cathelin-Moleküle eingeführt werden. Diese Cathelin-Moleküle werden bevorzugt mit dem Antigen und der immunogenen ODN gemäß der vorliegenden Erfindung kombiniert. Überraschender Weise hat sich jedoch gezeigt, dass diese Cathelin-Moleküle als Adjuvans für ein Antigen auch ohne Zugabe weiterer Adjuvantien wirksam sind. Daher ist es möglich, solche Cathelin-Moleküle als wirksame Adjuvantien in Vakzinformulierungen mit oder ohne weitere immunaktivierende Substanzen zu verwenden.
  • Eine weitere bevorzugte, erfindungsgemäß zu verwendende polykationische Substanz ist ein synthetisches Peptid, das mindestens 2 KLK-Motive enthält, die durch einen Linker mit 3 bis 7 hydrophoben Aminosäuren getrennt sind ( WO 02/32451 ).
  • Es war sehr erstaunlich, dass die immunstimulierende Wirkung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung signifikant höher war als von der Addition der Wirkungen jeder einzelnen Komponente oder auch von der Addition der Wirkungen der ODN oder des Polykations mit dem Antigen zu erwarten war.
  • B und E in Formel (I) sind übliche Gruppen für das 5'- und/oder 3'-Ende von Nukleinsäuremolekülen. Beispiele für solche Gruppen sind für den Fachmann leicht verfügbar (siehe z.B. "Oligonucleotides and Analogues – A Practical Approach" (1991)), Hg. Eckstein, Oxford University Press). Für die erfindungsgemäßen U-ODNs sind B und/oder E unabhängig voneinander ausgewählt aus -H, -CH3, -COCH3, -OH, -CHO, einem Phosphat, Thiophosphat, Sulfat oder einer Thiosulfatgruppe, oder einer Phosphoalkylgruppe, insbesondere mit einer Alkyllänge von C1-C6 und/oder mit einer terminalen Aminogruppe (die Aminogruppe kann z.B. zur weiteren Markierung der erfindungsgemäßen U-ODNs verwendet werden, z.B. -PO4-(CH2)-NH2 oder -PO4-(CH2)-NH-Label). Besonders bevorzugt als B sind Nukleoside, insbesondere die oben genannten 2'-Desoxynukleotide (d.h. ohne die Phosphat- oder Thiophosphatgruppe). Alternativ dazu können diese Gruppen auch Linkergruppen für andere Moleküle enthalten, insbesondere Trägermoleküle oder Labels. In solchen Formen von ODNs, wo die ODNs an feste Oberflächen, Partikel oder Labels gebunden sind, sind diese Oberflächen, Partikel, Labels etc. dann ebenfalls Teil der B- und/oder E-Gruppen.
  • Natürlich sind in dieser Formel (I) jegliche ionisierte (Salz-)Formen oder tautomere Formen der Moleküle gemäß Formel (I) eingeschlossen.
  • Die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung kann weiters weitere aktive Inhaltsstoffe (pharmazeutisch aktive Substanzen) umfassen, insbesondere Substanzen, die in Verbindung mit einem Vakzin verwendbar sind. Bevorzugte Ausführungsformen solcher weiterer aktiver Inhaltsstoffe sind Zytokine, entzündungshemmende Substanzen, antimikrobielle Substanzen oder Kombinationen davon.
  • Natürlich kann die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung weiters Hilfsstoffe, insbesondere einen pharmazeutisch annehmbaren Träger, Puffersubstanzen, Stabilisatoren oder Kombinationen davon enthalten.
  • Die relativen Mengen der Inhaltsstoffe in der vorliegenden pharmazeutischen Zusammensetzung sind stark von den Notwendig keiten des individuellen Antigens und vom Tier/Menschen abhängig, bei dem diese Zusammensetzung angewendet werden soll. Daher enthält die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung vorzugsweise ein oder mehrere erfindungsgemäße ODNs, vorzugsweise 1 pg bis 10 g, vorzugsweise 1 ng bis 1 g, mehr bevorzugt 100 ng bis 10 mg, insbesondere 10 μg bis 1 mg. Sowohl das Antigen als auch das polykationische Polymer kann in ähnlichen Dosierungen angewendet werden, wobei ein Bereich von 1 bis 10 000 μg Antigen und 0,1 bis 1000 μg Polykation pro Impfung bevorzugt wird.
  • Die vorliegenden Zusammensetzungen können einem Patienten z.B. einem Impfkandidaten, in wirksamen Mengen in Intervallen von z.B. 1 Woche, 2 Wochen oder 1 Monat verabreicht werden. Patienten, die mit den vorliegenden Zusammensetzungen behandelt werden sollen, können auch mehrmals oder nur ein Mal geimpft werden. Eine bevorzugte Verwendung der vorliegenden Erfindung ist die aktive Immunisierung, insbesondere von Menschen oder Tieren ohne Schutz gegen das spezifische Antigen.
  • Der Verabreichungsweg der vorliegenden Zusammensetzung ist nicht kritisch, z.B. ist eine subkutane, intramuskuläre, intradermale oder transdermale Injektion geeignet, sowie auch die orale Einnahme.
  • Es ist ebenfalls möglich, die vorliegende Zusammensetzung separat zu verabreichen, z.B. durch Injektion der immunstimulierenden Substanz getrennt von der Antigen/Polykation-Zusammensetzung. Die vorliegende Erfindung richtet sich daher auch an ein Kit, das eine Zusammensetzung, die das Antigen und das polykationische Polymer als eine Komponente enthält, und eine Zusammensetzung, die die immunstimulierende oder chemotaktische Substanz als zweite Komponente enthält, umfasst.
  • Die Komponenten können an die gleiche Stelle oder zur gleichen Zeit gegeben werden, es ist jedoch auch eine Verabreichung an verschiedene Stellen oder zu verschiedenen Zeiten oder für verschieden lange Zeiträume möglich. Es ist auch möglich, die systemischen oder lokalen Anwendungen der Zusammensetzung bzw. der Komponenten zu variieren.
  • Die Wirksamkeit eines immunstimulierenden Oligonukleotids gemäß der vorliegenden Erfindung per se ist durch die lokale Verfügbarkeit einer minimal wirksamen Dosis über einen bestimmten Zeitraum definiert und ist durch die Halbwertszeit des Oli gonukleotids begrenzt, welche in vivo praktisch fast ausschließlich durch den enzymatischen Abbau durch Nukleasen definiert ist. Um die Verfügbarkeit der notwendigen Dosis über den notwendigen Zeitraum sicherzustellen, kann ein (kontinuierliches) Hochdosis-Verabreichungsschema angewandt werden (wie z.B. während einer Antisense-Therapie mit Oligonukleotiden). Eine zweite bevorzugte Strategie ist eine Stabilisierung der Oligonukleotide gegen Nuklease-Abbau durch Phosphorthioat-Internukleotid-Bindungen oder durch Zugabe von Polykationen. Wie in den Beispielen beschrieben, ist bereits durch Vorsehen von nur einer der Stabilisierungsmöglichkeiten (z.B. vorzugsweise nur Phosphorthioat-Internukleotid-Bindungen oder Zugabe von polykationischen Substanzen, wie Polyarginin) eine hohe Wirksamkeit erhältlich. Die Wirksamkeit ist jedoch noch höher, wenn Oligonukleotide durch beides, z.B. Phosphorthioat-Internukleotid-Bindungen und Zugabe von polykationischen Substanzen, stabilisiert werden (was auch zu einer Fixierung an der Stelle der Impfung führt).
  • Details der vorliegenden Erfindung werden an Hand der folgenden Beispiele und Figuren beschrieben, die Erfindung ist jedoch natürlich nicht darauf beschränkt.
  • 1 zeigt, dass mit Thiophosphat substituierte, Desoxyuridin-Monophosphat-modifizierte Oligodesoxynukleotide (U-ODN 13) in Gegenwart oder Abwesenheit von Poly-L-Arginin eine starke Immunantwort gegen das vom Melanom abgeleitete Peptid TRP-2181-188 auslösen, die höher ist als die Immunantwort, die von CpG-ODN 1668 oder CpG-ODN 1668/Poly-L-Arginin ausgelöst wird. Weiters zeigt 1, dass bei Verwendung von U-ODNs, die nicht mit Thiophosphaten substituiert sind (U-ODN 13b), nur nach der Co-Injektion von Poly-L-Arginin eine starke Peptid-spezifische Immunantwort ausgelöst wird. Mäusen wurde in die Sohlen der hinteren Pfoten TRP-2181-188, TRP-2181-188 entweder mit Poly-L-Arginin (pR 60) oder dem U enthaltenden Oligodesoxynukleotid U-ODN 13/13b oder eine Kombination von beiden, pR 60 und U-ODN 13/13b injiziert. Vier Tage später wurden drainagierte Lymphknotenzellen ex vivo mit TRP-2181-188, einem irrelevanten Peptid OVA257-264 U-ODN 13/13b oder pR 60 stimuliert. Die Anzahl der IFN-γ produzierenden Zellen wurde 24 Stunden später mit Hilfe eines ELISPOT-Assays ermittelt. Die Ergebnisse sind als Anzahl der IFN-γ produzierenden Zellen/1 × 106 Lymphknotenzellen mit einer Standardabwei chung von Triplikaten ausgedrückt.
  • 2 zeigt, dass das mit Desoxyuridin-monophosphat modifizierte Oligodesoxynukleotid (U-ODN 13) die systemische Produktion von TNF-α und IL-6 nicht auslöst. Mäusen wurde in die Sohle der Hinterpfoten TRP-2181-188, TRP-2181-188 und Poly-L-Arginin oder CpG 1668 oder U-ODN 13, oder TRP-2181-188 und die Kombination von Poly-L-Arginin und U-ODN 13 injiziert. 1 Stunde nach der Injektion wurde Blut aus der Schwanzvene entnommen, und es wurde Serum hergestellt. Die Menge von TNF-α und IL-6 in den Seren wurde mit Hilfe von ELISAs ermittelt.
  • 3 zeigt, dass mit Desoxyuridin-monophosphat modifizierte Oligodesoxynukleotide (U-ODN 13) eine Immunantwort gegen das von Ovalbumin abgeleitete Peptid OVA257-264 (SIINFEKL) auslösen. Mäusen wurde in die Sohlen der Hinterpfoten OVA257-264 alleine, OVA257-264 und Poly-L-Arginin (pR 60) oder die U enthaltenden Oligodesoxynukleotide U-ODN 13, oder OVA257-264 und die Kombination von sowohl pR 60 als auch U-ODN 13 injiziert. 4 Tage später wurden die drainagierten Lymphknotenzellen ex vivo mit OVA257-264, einem irrelevanten Peptid mTRP2181-188 (mit Mäuse-Tyrosinase verwandtes Protein-2, VYDFFVWL), U-ODN 13 und pR 60 stimuliert. Die Anzahl der IFN-γ produzierenden Zellen wurde 24 Stunden später mit Hilfe eines ELISPOT-Assays bestimmt. Die Ergebnisse wurden als die Anzahl der IFN-γ produzierenden Zellen/1 × 106 Lymphknotenzellen mit einer Standardabweichung von Duplikaten ausgedrückt.
  • 4 zeigt, dass mit Desoxyuridin-monophosphat modifizierte Oligodesoxynukleotide (U-ODN 13) eine starke Immunantwort gegen das von Mäuse-Mastocytom abgeleitete Peptid P1A35-43 (LPYLGWLVF) auslösen, die durch die Co-Injektion von Poly-L-Arginin noch weiter verstärkt werden kann. Mäusen wurde in die Sohlen der Hinterpfoten P1A35-43 alleine, P1A35-43 und Poly-L-Arginin oder U-ODN 13, oder P1A35-43 und die Kombination von sowohl pR 60 als auch U-ODN 13 injiziert. 4 Tage später wurden die drainagierten Lymphknotenzellen ex vivo mit P1A35-43, einem irrelevanten Peptid CSP (SYVPSAEQI), U-ODN 13 und pR 60 stimuliert. Die Anzahl der IFN-γ produzierenden Zellen wurde 24 Stunden später mit Hilfe eines ELISPOT-Assays bestimmt. Die Ergebnisse wurden als die Anzahl der IFN-γ produzierenden Zellen/1 × 106 Lymphknotenzellen mit einer Standardabweichung von Triplikaten ausgedrückt.
  • 5 zeigt, dass ein Cocktail von mit Desoxyuridin-monophosphat modifizierten Oligodesoxynukleotiden (U-ODN 15) in Gegenwart oder Abwesenheit von Poly-L-Arginin eine starke Immunantwort gegen das vom Melanom abgeleitete Peptid TRP-2181-188 auslöst. Mäusen wurde in die Sohlen der Hinterpfoten TRP-2181-188, TRP-2181-188 entweder mit Poly-L-Arginin (pR 60) oder dem U enthaltenden Oligodesoxynukleotid-Cocktail U-ODN 15 oder eine Kombination von beiden, sowohl pR 60 als auch U-ODN 15 injiziert. 4 Tage später wurden drainagierte Lymphknotenzellen ex vivo mit TRP-2181-188, einem irrelevanten Peptid OVA257-264, U-ODN 15 oder pR 60 stimuliert. Die Anzahl der IFN-γ produzierenden Zellen wurde 24 Stunden später mit Hilfe eines ELISPOT-Assays ermittelt. Die Ergebnisse sind als Anzahl der IFN-γ produzierenden Zellen/1 × 106 Lymphknotenzellen mit einer Standardabweichung von Triplikaten ausgedrückt.
  • 6 zeigt, dass ein Cocktail von mit Desoxyuridin-monophosphat modifizierten Oligodesoxynukleotiden (U-ODN 16) eine starke Immunantwort gegen das vom Melanom abgeleitete Peptid TRP-2181-188 auslöst, die stärker ist als die Immunantwort nach der Injektion von TRP-2181-188 alleine oder in Kombination mit ODN 20, einem Oligonukleotid-Cocktail ohne Desoxyuridin-monophosphat.
  • Mäusen wurde in die Sohlen der Hinterpfoten TRP-2181-188, TRP-2181-188 entweder mit dem U enthaltenden Oligodesoxynukleotid-Cocktail U-ODN 16 oder dem Oligonukleotid-Cocktail ODN 20 injiziert. 4 Tage später wurden drainagierte Lymphknotenzellen ex vivo mit TRP-2181-188, einem irrelevanten Peptid OVA257-264, U-ODN 16 oder ODN 20 stimuliert. Die Anzahl der IFN-γ produzierenden Zellen wurde 24 Stunden später mit Hilfe eines ELISPOT-Assays ermittelt. Die Ergebnisse sind als Anzahl der IFN-γ produzierenden Zellen/1 × 106 Lymphknotenzellen mit einer Standardabweichung von Triplikaten ausgedrückt.
  • 7 zeigt das Hervorrufen spezifischer Immunantworten gegen das von Melanom abgeleitete TRP-2181-188 mit U-ODN 21 und U-ODN 22.
  • 8 zeigt das Hervorrufen spezifischer Immunantworten gegen das von Melanom abgeleitete TRP-2181-188 mit U-ODN-24.
  • 9 zeigt das Hervorrufen spezifischer Immunantworten gegen das von Melanom abgeleitete TRP-2181-188 mit verschiedenen U-ODNs.
  • BEISPIELE
  • Wenn nicht anders angegeben, wurden in allen Versuchen mit Thiophosphat substituierte ODNs (wobei Thiophosphatreste das Phosphat substituieren; im Folgenden als "mit Thiophosphat substituierte Oligodesoxynukleotide" bezeichnet) verwendet, da solche ODNs größere Nukleaseresistenz aufweisen (Ballas et al., 1996; Krieg et al., 1995; Parronchi et al., 1999).
  • Beispiel 1:
  • Hervorrufen spezifischer Immunantworten gegen ein vom Melanom abgeleitetes Peptid (TRP-2181-188) mit mit Desoxyuridin-monophosphat modifiziertem Oligonukleotid U-ODN 13.
    Mäuse C57BI/6 (Harlan/Olac)
    Peptid TRP-2-Peptid (VYDFFVWL), ein MHC Klasse I (H-
    2Kb)-beschränktes Epitop von mit Mäuse-Tyrosinase
    verwandtem Protein-2 (B16 Melanoma, Bloom, M. B.
    et al., J. Exp. Med. 1997, 185, 453-459), synthe
    tisiert durch standardmäßige Festphasen-F-moc-
    Synthese, HPLC-gereinigt und mittels Massenspek
    troskopie auf Reinheit analysiert.
    Dosis: 100 μg/Maus
    Poly-L-Arginin 60 (pR 60)
    Poly-L-Arginin mit einem durchschnittlichen Poly
    merisationsgradvon 60 Argininresten; SIGMA Che
    micals
    Dosis: 100 μg/Maus
    CpG 1668 mit Thiophosphat substituierte ODNs, die ein CpG-
    Motiv enthalten: tcc atg acg ttc ctg atg ct, wur
    den synthetisiert von NAPS GmbH, Göttingen.
    Dosis: 5 nmol/Maus
    U-ODN 13 mit Thiophosphat substituierte ODNs, die Desoxyu
    ridin-monophosphat enthalten:
    tcc atg acu ttc ctg atg ct, wurden synthetisiert
    von NAPS GmbH, Göttingen.
    Dosis: 5 nmol/Maus
    U-ODN 13b Desoxyuridin-monophosphat enthaltende ODNs (die
    nicht mit Thiophosphat substituiert sind):
    tcc atg acu ttc ctg atg ct, wurden synthetisiert
    von NAPS GmbH, Göttingen.
    Dosis: 5 nmol/Maus
  • Versuchsgruppen (4 Mäuse pro Gruppe)
    • 1. TRP-2181-188
    • 2. TRP-2181-188 + pR 60
    • 3. TRP-2181-188 + CpG-ODN
    • 4. TRP-2181-188+ U-ODN 13
    • 5. TRP-2181-188 + U-ODN 13b
    • 6. TRP-2181-188 + CpG-ODN + pR 60
    • 7. TRP-2181-188 + U-ODN 13 + pR 60
    • 8. TRP-2181-188 + U-ODN 13b + pR 60
  • Am Tag 0 wurde den Mäusen in die Sohle jeder Hinterpfote ein Gesamtvolumen von 100 μl (50 μl pro Pfote) injiziert, das die oben genannten Verbindungen enthielt. 4 Tage nach der Injektion wurden die Tiere getötet, und es wurden die Lymphknoten aus den Kniekehlen geerntet. Die Lymphknoten wurden durch ein 70 μm Zellfilter geleitet und zwei Mal mit DMEM-Medium (GIBCO BRL) gewaschen, das 5% fötales Kälberserum (FCS, SIGMA Chemicals) enthielt. Die Zellen wurden auf die geeignete Zellzahl in DMEM/5%/FCS eingestellt. Es wurde ein dreifacher IFN-γ ELISPOT-Assay durchgeführt, wie beschrieben (Miyahira et al., 1995). Dieses Verfahren ist ein verbreitet verwendetes Verfahren, das die Quantifizierung von Antigen-spezifischen T-Zellen ermöglicht. Die Lymphozyten wurden ex vivo dreifach mit Medium (Hintergrund-Kontrolle), TRP-2181-188-Peptid, einem irrelevanten Peptid OVA257-264, pR 60, U-ODN 13 und Concanavalin A (Con A) stimuliert. Spots, die einzelne IFN-γ produzierende T-Zellen darstellen, wurden gezählt, und die Anzahl der Hintergrundspots wurde von allen Proben abgezogen. Die nach der Stimulierung mit Con A (Daten nicht angegeben) entdeckte große Anzahl von Spots zeigt einen guten Zustand der verwendeten Lymphozyten an. Für jede Versuchsgruppe von Mäusen ist die Anzahl der IFN-γ produzierenden Zellen/1 × 106 Zellen in 1 dargestellt, und es ist die Standardabweichung von ex vivo stimulierten Triplikaten angegeben.
  • Dieser Versuch zeigt, dass die Injektion von TRP-2181-188 (hydrophobes Peptid) mit mit Thiophosphat substituierten U-ODNs die TRP-2181-188-spezifischen Immunantworten im Vergleich zur Injektion mit TRP-2181-188 alleine stark verstärkt. Interessanter Weise wird im Vergleich zur Injektion von TRP-2181-188/CpG-ODN durch die Injektion von TRP-2181-188/U-ODN 13 eine größere Anzahl von TRP-2181-188-spezifischen T-Zellen induziert. Die Co-Injektion von Poly-L-Arginin hat keinen Einfluss auf diese starke Antwort. Als im Gegensatz dazu U-ODN 13b verwendet wurde, das nicht mit Thiophosphaten substituiert ist, wurde nur bei der Co-Injektion von Poly-L-Arginin eine hohe Immunantwort ausgelöst.
  • Beispiel 2:
  • Die Anwendung von mit Desoxyuridin-monophosphat modifizierten Oligodesoxynukleotiden löst keine Produktion von entzündungsfördernden Zytokinen aus.
    Mäuse C57BI/6 (Harlan/Olac)
    Peptid TRP-2-Peptid (VYDFFVWL), ein MHC Klasse I (H-
    2Kb)-beschränktes Epitop von mit Mäuse-Tyrosinase
    verwandtem Protein-2 (B16 Melanoma, Bloom, M. B.
    et al., J. Exp. Med. 1997, 185, 453-459), synthe
    tisiert durch standardmäßige Festphasen-F-moc-
    Synthese, HPLC-gereinigt und mittels Massenspek
    troskopie auf Reinheit analysiert.
    Dosis: 100 μg/Maus
    Poly-L-Arginin 60 (pR 60)
    Poly-L-Arginin mit einem durchschnittlichen Poly
    merisationsgrad von 60 Argininresten; SIGMA Che
    micals
    Dosis: 100 μg/Maus
    CpG 1668 mit Thiophosphat substituierte ODNs, die ein CpG-
    Motiv enthalten: tcc atg acg ttc ctg atg ct, wur
    den synthetisiert von NAPS GmbH, Göttingen.
    Dosis: 5 nmol/Maus
    U-ODN 13 mit Thiophosphat substituierte ODNs, die Desoxyu
    ridin-monophosphat enthalten:
    tcc atg acu ttc ctg atg ct, wurden synthetisiert
    von NAPS GmbH, Göttingen.
    Dosis: 5 nmol/Maus
  • Versuchsgruppen (4 Mäuse pro Gruppe)
    • 1. TRP-2181-18
    • 2. TRP-2181-188 + pR 60
    • 3. TRP-2181-188 + CpG 1668
    • 4. TRP-2181-188 + U-ODN 13
    • 5. TRP-2181-188 + U-ODN 13 + pR 60
  • Am Tag 0 wurde den Mäusen in die Sohle jeder Hinterpfote ein Gesamtvolumen von 100 μl (50 μl pro Pfote) injiziert, das die oben genannten Verbindungen enthielt. Eine Stunde nach der Injektion wurde Blut aus der Schwanzvene entnommen, und es wurde Serum hergestellt. Die Mengen von TNF-α und IL-6 in den Seren wurden mit Hilfe spezifischer ELISAs ermittelt.
  • 2 zeigt, dass im Gegensatz zur Anwendung von CpG-ODN 1668 die Anwendung von U-ODN 13 in Kombination mit einem Peptid nicht die systemische Produktion von entzündungsfördernden Zytokinen auslöst.
  • Beispiel 3:
  • Hervorrufen spezifischer Immunantworten gegen ein von einem Allergen abgeleitetes Peptid mit mit Desoxyuridin-monophosphat modifiziertem Oligonukleotid U-ODN 13.
    Mäuse C57BI/6 (Harlan/Olac)
    Peptid OVA257-264-Peptid (SIINFEKL), ein MHC Klasse I (H-
    2Kb)-beschränktes Epitop von Hühner-Ovalbumin
    (Rotzschke et al., 1991), wurde synthetisiert
    durch standardmäßige chemische Festphasen-F-moc-
    Synthese, HPLC-gereinigt und mittels Massenspek
    troskopie auf Reinheit analysiert.
    Dosis: 300 μg/Maus
    Poly-L-Arginin 60 (pR 60)
    Poly-L-Arginin mit einem durchschnittlichen Poly
    merisationsgrad von 60 Argininresten; SIGMA Che
    micals
    Dosis: 100 μg/Maus
    U-ODN 13 mit Thiophosphat substituierte ODNs, die Desoxyu
    ridin-monophosphat enthalten:
    tcc atg acu ttc ctg atg ct, wurden synthetisiert
    von NAPS GmbH, Göttingen.
    Dosis: 5 nmol/Maus
  • Versuchsgruppen (4 Mäuse pro Gruppe)
    • 1. OVA257-264
    • 2. OVA257-264 + pR 60
    • 3. OVA257-264 + U-ODN 13
    • 4. OVA257-264 + U-ODN 13 + pR 60
  • Am Tag 0 wurde den Mäusen in die Sohle jeder Hinterpfote ein Gesamtvolumen von 100 μl (50 μl pro Pfote) injiziert, das die oben genannten Verbindungen enthielt. 4 Tage nach der Injektion wurden die Tiere getötet, und es wurden die Lymphknoten aus den Kniekehlen geerntet. Die Lymphknoten wurden durch ein 70 μm Zellfilter geleitet und zwei Mal mit DMEM-Medium (GIBCO BRL) gewaschen, das 5% fötales Kälberserum (FCS, SIGMA Chemicals) enthielt. Die Zellen wurden auf die geeignete Zellzahl in DMEM/5%/FCS eingestellt. Es wurde ein zweifacher IFN-γ ELISPOT-Assay durchgeführt, wie beschrieben (Miyahira et al., 1995). Dieses Verfahren ist ein verbreitet verwendetes Verfahren, das die Quantifizierung von Antigen-spezifischen T-Zellen ermöglicht. Die Lymphozyten wurden ex vivo zweifach mit Medium (Hintergrund-Kontrolle), OVA257-264-Peptid, einem irrelevanten Peptid TRP-2181-188, pR 60, U-ODN 13 und Concanavalin A (Con A) stimuliert. Spots, die einzelne IFN-γ produzierende T-Zellen darstellen, wurden gezählt, und die Anzahl der Hintergrundspots wurde von allen Proben abgezogen. Die nach der Stimulierung mit Con A (Daten nicht angegeben) entdeckte große Anzahl von Spots zeigt einen guten Zustand der verwendeten Lymphozyten an. Für jede Versuchsgruppe von Mäusen ist die Anzahl der IFN-γ produzierenden Zellen/1 × 106 Zellen in 3 dargestellt, und es ist die Standardabweichung von ex vivo stimulierten Duplikaten angegeben.
  • Dieser Versuch zeigt, dass mit Desoxyuridin-monophosphat modifizierte ODNs ebenfalls eine Immunantwort gegen ein hydrophiles Peptid (OVA257-264) auslösen. Die Co-Injektion von Poly-L-Arginin hat keinen Einfluss auf diese Immunantwort.
  • Beispiel 4:
  • Hervorrufen spezifischer Immunantworten gegen ein vom Mastozytom abgeleitetes Peptid mit mit Desoxyuridin-monophosphat modifiziertem Oligonukleotid U-ODN 13.
    Mäuse C57BI/6 (Harlan/Olac)
    Peptid vom Mäuse-Mastozytom P815 abgeleitetes Peptid P1A
    (LPYLGWLVF), beschränkt auf MHC Klasse I (H2-Ld)
    (Lethe et al., 1992).
    Dosis: 100 μg/Maus
    Poly-L-Arginin 60 (pR 60)
    Poly-L-Arginin mit einem durchschnittlichen Poly
    merisationsgrad von 60 Argininresten; SIGMA Che
    micals
    Dosis: 100 μg/Maus
    U-ODN 13 mit Thiophosphat substituierte ODNs, die Desoxyu
    ridin-monophosphat enthalten:
    tcc atg acu ttc ctg atg ct, wurden synthetisiert
    von NAPS GmbH, Göttingen.
    Dosis: 5 nmol/Maus
  • Versuchsgruppen (4 Mäuse pro Gruppe)
    • 1. P1A35-43
    • 2. P1A35-43 + pR 60
    • 3. P1A35-43 + U-ODN 13
    • 4. P1A35-43 + U-ODN 13 + pR 60
  • Am Tag 0 wurde den Mäusen in die Sohle jeder Hinterpfote ein Gesamtvolumen von 100 μl (50 μl pro Pfote) injiziert, das die oben genannten Verbindungen enthielt. 4 Tage nach der Injektion wurden die Tiere getötet, und es wurden die Lymphknoten aus den Kniekehlen geerntet. Die Lymphknoten wurden durch ein 70 μm Zellfilter geleitet und zwei Mal mit DMEM-Medium (GIBCO BRL) gewaschen, das 5% fötales Kälberserum (FCS, SIGMA Chemicals) enthielt. Die Zellen wurden auf die geeignete Zellzahl in DMEM/5%/FCS eingestellt. Es wurde ein dreifacher IFN-γ ELISPOT-Assay durchgeführt, wie beschrieben (Miyahira et al., 1995). Dieses Verfahren ist ein verbreitet verwendetes Verfahren, das die Quantifizierung von Antigen-spezifischen T-Zellen ermöglicht. Die Lymphozyten wurden ex vivo dreifach mit Medium (Hintergrund-Kontrolle), P1A35-43-Peptid, einem irrelevanten Peptid CSP (SYVPSAEQI), pR 60, U-ODN 13 und Concanavalin A (Con A) stimuliert. Spots, die einzelne IFN-γ produzierende T-Zellen darstellen, wurden gezählt, und die Anzahl der Hintergrundspots wurde von allen Proben abgezogen. Die nach der Stimulierung mit Con A (Daten nicht angegeben) entdeckte große Anzahl von Spots zeigt einen guten Zustand der verwendeten Lymphozyten an. Für jede Versuchsgruppe von Mäusen ist die Anzahl der Spots/1 × 106 Zellen in 4 dargestellt, und es ist die Standardabweichung von ex vivo stimulierten Triplikaten angegeben.
  • Dieser Versuch zeigt, dass mit Desoxyuridin-monophosphat modifizierte ODNs eine starke Immunantwort gegen das vom Mastozy tom abgeleitete Peptid P1A35-43 auslösen. Diese Antwort kann durch die gemeinsame Anwendung von Poly-L-Arginin noch weiter verstärkt werden.
  • Beispiel 5:
  • Hervorrufen spezifischer Immunantworten gegen ein vom Mela nom abgeleitetes Peptid (TRP-2181-188) durch einen Cocktail von mit Desoxyuridin-monophosphat modifizierten Oligonukleotiden (U-ODN 15, 20-mere).
  • Um zu zeigen, dass die Wirksamkeit eines Oligonukleotids auf Desoxy-Uridin-Basis gemäß der vorliegenden Erfindung nicht vom Rest der Sequenz abhängt (z.B. durch eine spezifische Base, ein Basenmotiv oder Basensequenz), wäre eine Möglichkeit, jedes dieser Oligonukleotide in getrennter Form zu testen; da dies jedoch praktisch unmöglich ist (z.B. würde ein 20mer 2,7 × 1011 verschiedene Sequenzen aufweisen), wurde im vorliegenden Beispiel ein anderer Weg gewählt, um eine solche Unabhängigkeit von der Sequenz zu beweisen. Das Ziel des vorliegenden Beispiels war es, so viele Sequenzen wie möglich auf einmal zu testen, da nur der in vivo-Test und nicht die Synthese einschränkend ist. Aus diesem Grund wurde das vorliegende U-ODN 15 (siehe unten) hergestellt, das mehr als neun Billionen verschiedener Sequenzen enthält. Daraus ergibt sich, dass jede einzelne immunstimulierende Sequenz 10-9-fach unter jegliche wirksame Dosis verdünnt ist. Nur die Anwesenheit von Desoxy-Uridin-Resten ist bei allen Sequenzen konstant und daher nicht verdünnt. Wenn daher Sequenz-Motive neben Desoxy-Uridin für die Wirksamkeit in immunstimulierenden Oligonukleotiden wichtig wären, wären sie in U-ODN 15 wegen der hohen Verdünnung unwirksam. Anderseits sollte, wenn Desoxy-Uridin für die Wirksamkeit wesentlich und der Rest der Sequenz nicht signifikant ist, U-ODN wirksam sein.
    Mäuse C57BI/6 (Harlan/Olac)
    Peptid TRP-2-Peptid (VYDFFVWL), ein MHC Klasse I (H-
    2Kb)-beschränktes Epitop von mit Mäuse-Tyrosinase
    verwandtem Protein-2 (1316 Melanoma, Bloom, M. B.
    et al., J. Exp. Med. 1997, 185, 453-459), synthe
    tisiert durch standardmäßige Festphasen-F-moc-
    Synthese, HPLC-gereinigt und mittels Massenspek
    troskopie auf Reinheit analysiert.
    Dosis: 100 μg/Maus
    Poly-L-Arginin 60 (pR 60)
    Poly-L-Arginin mit einem durchschnittlichen Poly
    merisationsgrad von 60 Argininresten; SIGMA Che
    micals
    Dosis: 100 μg-0,1 μg/Maus
    U-ODN 15 Cocktail von mit Thiophosphat substituierten
    ODNs, die Desoxyuridin-monophosphat enthalten:
    nhh hhh wdu dhh hhh hhh wn, wurden synthetisiert
    von NAPS GmbH, Göttingen. (n = GCAT, h = CAT, w =
    AT, d = GAT)
    Dosis: 5 nmol-0,005 nmol/Maus
  • Versuchsgruppen (4 Mäuse pro Gruppe)
    • 1. TRP-2181-188
    • 2. TRP-2181-188 + pR 60 (100 μg)
    • 3. TRP-2181-188 + U-ODN 15 (5 nmol)
    • 4. TRP-2181-188 + U-ODN 15 (0,5 nmol)
    • 5. TRP-2181-188 + U-ODN 15 (0,05 nmol)
    • 6. TRP-2181-188 + U-ODN 15 (0,005 nmol)
    • 7. TRP-2181-188 + pR 60 (100 μg) + U-ODN 15 (5 nmol)
    • 8. TRP-2181-188 + pR 60 (10 μg) + U-ODN 15 (0,5 nmol)
    • 9. TRP-2181-188 + pR 60 (1 μg) + U-ODN 15 (0,05 nmol)
    • 10. TRP-2181-188 + pR 60 (0,1 μg) + U-ODN 15 (0,005 nmol)
  • Am Tag 0 wurde den Mäusen in die Sohle jeder Hinterpfote ein Gesamtvolumen von 100 μl (50 μl pro Pfote) injiziert, das die oben genannten Verbindungen enthielt. 4 Tage nach der Injektion wurden die Tiere getötet, und es wurden die Lymphknoten aus den Kniekehlen geerntet. Die Lymphknoten wurden durch ein 70 μm Zellfilter geleitet und zwei Mal mit DMEM-Medium (GIBCO BRL) gewaschen, das 5% fötales Kälberserum (FCS, SIGMA Chemicals) enthielt. Die Zellen wurden auf die geeignete Zellzahl in DMEM/5%/FCS eingestellt. Es wurde ein dreifacher IFN-γ ELISPOT-Assay durchgeführt, wie beschrieben (Miyahira et al., 1995). Dieses Verfahren ist ein verbreitet verwendetes Verfahren, das die Quantifizierung von Antigen-spezifischen T-Zellen ermöglicht. Die Lymphozyten wurden ex vivo dreifach mit Medium (Hintergrund-Kontrolle), TRP-2181-188-Peptid, einem irrelevanten Peptid OVA257-264, pR 60, U-ODN 15 und Concanavalin A (Con A) stimuliert.
  • Spots, die einzelne IFN-γ produzierende T-Zellen darstellen, wurden gezählt, und die Anzahl der Hintergrundspots wurde von allen Proben abgezogen. Die nach der Stimulierung mit Con A (Daten nicht angegeben) entdeckte große Anzahl von Spots zeigt einen guten Zustand der verwendeten Lymphozyten an. Für jede Versuchsgruppe von Mäusen ist die Anzahl der IFN-γ produzierenden Zellen/1 × 106 Zellen in 5 dargestellt, und es ist die Standardabweichung von ex vivo stimulierten Triplikaten angegeben.
  • Dieser Versuch zeigt, dass die Injektion von TRP-2181-188 (hydrophobes Peptid) mit einem Cocktail von mit Desoxyuridin-monophosphat modifizierten ODNs (20-mere, 5 nmol) die TRP-2181-188-spezifischen Immunantworten im Vergleich zur Injektion mit TRP-2181-188alleine stark verstärkt. Selbst als 10 Mal weniger U-ODN 15 verwendet wurde (0,5 nmol), konnte eine starke Immunantwort ausgelöst werden. Die Co-Injektion von Poly-L-Arginin mit Peptid und U-ODN 15 (5 nmol) hat keinen Einfluss auf diese starke Antwort.
  • Beispiel 6:
  • Hervorrufen spezifischer Immunantworten gegen ein vom Mela nom abgeleitetes Peptid (TRP-2181-188) durch einen Cocktail von mit Desoxyuridin-monophosphat modifizierten Oligonukleotiden (U-ODN 16, 10-mere).
    Mäuse C57BI/6 (Harlan/Olac)
    Peptid TRP-2-Peptid (VYDFFVWL), ein MHC Klasse I (H-
    2Kb)-beschränktes Epitop von mit Mäuse-Tyrosinase
    verwandtem Protein-2 (B16 Melanoma, Bloom, M. B.
    et al., J. Exp. Med. 1997, 185, 453-459), synthe
    tisiert durch standardmäßige Festphasen-F-moc-
    Synthese, HPLC-gereinigt und mittels Massenspek
    troskopie auf Reinheit analysiert.
    Dosis: 100 μg/Maus
    U-ODN 16 Cocktail von mit Thiophosphat substituierten
    ODNs, die Desoxyuridin-monophosphat enthalten:
    hhh wdu dhh h, wurden synthetisiert von NAPS GmbH,
    Göttingen. (n = GCAT, h = CAT, w = AT, d = GAT)
    Dosis: 10 nmol/Maus
    ODN 20 Cocktail von mit Thiophosphat substituierten
    ODNs:
    hhh wdd dhh h, wurden synthetisiert von NAPS GmbH,
    Göttingen. (n = GCAT, h = CAT, w = AT, d = GAT).
    Dosis: 10 nmol/Maus
  • Versuchsgruppen (4 Mäuse pro Gruppe)
    • 1. TRP-2181-188
    • 2. TRP-2181-188 + U-ODN 16 (10 nmol)
    • 3. TRP-2181-188 + ODN 20 (10 nmol)
  • Am Tag 0 wurde den Mäusen in die Sohle jeder Hinterpfote ein Gesamtvolumen von 100 μl (50 μl pro Pfote) injiziert, das die oben genannten Verbindungen enthielt. 4 Tage nach der Injektion wurden die Tiere getötet, und es wurden die Lymphknoten aus den Kniekehlen geerntet. Die Lymphknoten wurden durch ein 70 μm Zellfilter geleitet und zwei Mal mit DMEM-Medium (GIBCO BRL) gewaschen, das 5% fötales Kälberserum (FCS, SIGMA Chemicals) enthielt. Die Zellen wurden auf die geeignete Zellzahl in DMEM/5%/FCS eingestellt. Es wurde ein dreifacher IFN-γ ELISPOT-Assay durchgeführt, wie beschrieben (Miyahira et al., 1995). Dieses Verfahren ist ein verbreitet verwendetes Verfahren, das die Quantifizierung von Antigen-spezifischen T-Zellen ermöglicht. Die Lymphozyten wurden ex vivo dreifach mit Medium (Hintergrund-Kontrolle), TRP-2181-188-Peptid, einem irrelevanten Peptid OVA257-264, U-ODN 16, ODN 20 und Concanavalin A (Con A) stimuliert. Spots, die einzelne IFN-γ produzierende T-Zellen darstellen, wurden gezählt, und die Anzahl der Hintergrundspots wurde von allen Proben abgezogen. Die nach der Stimulierung mit Con A (Daten nicht angegeben) entdeckte große Anzahl von Spots zeigt einen guten Zustand der verwendeten Lymphozyten an. Für jede Versuchsgruppe von Mäusen ist die Anzahl der IFN-γ produzierenden Zellen/1 × 106 Zellen in 6 dargestellt, und es ist die Standardabweichung von ex vivo stimulierten Triplikaten angegeben.
  • Dieser Versuch zeigt, dass die Injektion von TRP-2181-188 (hydrophobes Peptid) mit einem Cocktail von mit Desoxyuridin-monophosphat modifizierten ODNs (10-mere) die TRP-2181-188-spezifischen Immunantworten im Vergleich zur Injektion von TRP-2181-188 alleine oder in Kombination mit ODN 20 stark verstärkt.
  • Beispiel 7
  • Hervorrufen spezifischer Immunantworten gegen ein vom Melanom abgeleitetes Peptid (TRP-2181-188) durch mit Desoxyuridin-monophosphat modifizierte Oligonukleotide ODN 21 oder ODN 22.
    Mäuse C57BI/6 (Harlan/Olac)
    Peptid TRP-2-Peptid (VYDFFVWL), ein MHC Klasse I (H-
    2Kb)-beschränktes Epitop von mit Mäuse-Tyrosinase
    verwandtem Protein-2 (B16 Melanoma, Bloom, M. B.
    et al., J. Exp. Med. 1997, 185, 453-459), synthe
    tisiert durch standardmäßige Festphasen-F-moc-
    Synthese, HPLC-gereinigt und mittels Massenspek
    troskopie auf Reinheit analysiert.
    Dosis: 100 μg/Maus
    Poly-L-Arginin 60 (pR 60)
    Poly-L-Arginin mit einem durchschnittlichen Poly
    merisationsgrad von 60
    Dosis: 100 μg/Maus
    ODN 21 Mit Thiophosphat substituierte ODNs, die Desoxyu
    ridin-monophosphat enthalten:
    uau aua uau aua uau aua uau aua ua, wurden synthe
    tisiert von NAPS GmbH, Göttingen.
    Dosis: 5 nmol/Maus
    ODN 22 Mit Thiophosphat substituierte ODNs, die Desoxyu
    ridin-monophosphat enthalten:
    uiu iui uiu iui uiu iui uiu iui ug, wurden syn
    thetisiert von NAPS GmbH, Göttingen.
    Dosis: 5 nmol/Maus
  • Versuchsgruppen (5 Mäuse pro Gruppe)
    • 1. TRP-2181-188
    • 2. TRP-2181-188 + pR 60
    • 3. TRP-2181-188 + ODN 21
    • 4. TRP-2181-188 + pR 60 + ODN 21
    • 5. TRP-2181-188 + ODN 22
    • 6. TRP-2181-188 + pR 60 + ODN 22
  • Am Tag 0 wurde den Mäusen in die Sohle jeder Hinterpfote ein Gesamtvolumen von 100 μl (50 μl pro Pfote) injiziert, das die oben genannten Verbindungen enthielt. 4 Tage nach der Injektion wurden die Tiere getötet, und es wurden die Lymphknoten aus den Kniekehlen geerntet. Die Lymphknoten wurden durch ein 70 μm Zellfilter geleitet und zwei Mal mit DMEM-Medium (GIBCO BRL) gewaschen, das 5% fötales Kälberserum (FCS, SIGMA Chemicals) enthielt. Die Zellen wurden auf die geeignete Zellzahl in DMEM/5%/FCS eingestellt. Es wurde ein dreifacher IFN-γ ELISPOT-Assay durchgeführt, wie beschrieben (Miyahira et al., 1995).
  • Dieses Verfahren ist ein verbreitet verwendetes Verfahren, das die Quantifizierung von Antigen-spezifischen T-Zellen ermöglicht. Die Lymphozyten wurden ex vivo dreifach mit Medium (Hintergrund-Kontrolle), TRP-2181-188-Peptid, einem irrelevanten Peptid OVA257-264, pR 60, ODN 21 oder 22 und Concanavalin A (Con A) stimuliert. Spots, die einzelne IFN-γ produzierende T-Zellen darstellen, wurden gezählt, und die Anzahl der Hintergrundspots wurde von allen Proben abgezogen. Die nach. der Stimulierung mit Con A (Daten nicht angegeben) entdeckte große Anzahl von Spots zeigt einen guten Zustand der verwendeten Lymphozyten an. Für jede Versuchsgruppe von Mäusen ist die Anzahl der IFN-γ produzierenden Zellen/1 × 106 Zellen in 7 dargestellt, und es ist die Standardabweichung von ex vivo stimulierten Triplikaten angegeben.
  • Beispiel 8
  • Hervorrufen spezifischer Immunantworten gegen ein vom Melanom abgeleitetes Peptid (TRP-2181-188) durch mit Desoxyuridin-monophosphat modifiziertes Oligonukleotid ODN 24.
    Mäuse C57BI/6 (Harlan/Olac)
    Peptid TRP-2-Peptid (VYDFFVWL), ein MHC Klasse I (H-
    2Kb)-beschränktes Epitop von mit Mäuse-Tyrosinase
    verwandtem Protein-2 (B16 Melanoma, Bloom, M. B.
    et al., J. Exp. Med. 1997, 185, 453-459), synthe
    tisiert durch standardmäßige Festphasen-F-moc-
    Synthese, HPLC-gereinigt und mittels Massenspek
    troskopie auf Reinheit analysiert.
    Dosis: 100 μg/Maus
    Poly-L-Arginin 60 (pR 60)
    Poly-L-Arginin mit einem durchschnittlichen Poly
    merisationsgrad von 60
    Dosis: 100 μg/Maus
    ODN 24 Mit Thiophosphat substituierte ODNs, die Desoxyu
    ridin-monophosphat enthalten:
    uuu uuu uuu uuu uuu uuu uuu uuu
    ut, wurden synthetisiert von NAPS GmbH, Göttingen.
    Dosis: 5 nmol/Maus
  • Versuchsgruppen (5 Mäuse pro Gruppe)
    • 1. TRP-2181-188
    • 2. TRP-2181-188 + pR 60
    • 3. TRP-2181-188 + ODN 24
    • 4. TRP-2181-188 + pR 60 + ODN 24
  • Am Tag 0 wurde den Mäusen in die Sohle jeder Hinterpfote ein Gesamtvolumen von 100 μl (50 μl pro Pfote) injiziert, das die oben genannten Verbindungen enthielt. 4 Tage nach der Injektion wurden die Tiere getötet, und es wurden die Lymphknoten aus den Kniekehlen geerntet. Die Lymphknoten wurden durch ein 70 μm Zellfilter geleitet und zwei Mal mit DMEM-Medium (GIBCO BRL) gewaschen, das 5% fötales Kälberserum (FCS, SIGMA Chemicals) enthielt. Die Zellen wurden auf die geeignete Zellzahl in DMEM/5%/FCS eingestellt. Es wurde ein dreifacher IFN-γ ELISPOT-Assay durchgeführt, wie beschrieben (Miyahira et al., 1995). Dieses Verfahren ist ein verbreitet verwendetes Verfahren, das die Quantifizierung von Antigen-spezifischen T-Zellen ermöglicht. Die Lymphozyten wurden ex vivo dreifach mit Medium (Hintergrund-Kontrolle), TRP-2181-188-Peptid, einem irrelevanten Peptid OVA257-264, pR 60, ODN 24 und Concanavalin A (Con A) stimuliert. Spots, die einzelne IFN-γ produzierende T-Zellen darstellen, wurden gezählt, und die Anzahl der Hintergrundspots wurde von allen Proben abgezogen. Die nach der Stimulierung mit Con A (Daten nicht angegeben) entdeckte große Anzahl von Spots zeigt einen guten Zustand der verwendeten Lymphozyten an. Für jede Versuchsgruppe von Mäusen ist die Anzahl der IFN-γ produzierenden Zellen/1 × 106 Zellen in 8 dargestellt, und es ist die Standardabweichung von ex vivo stimulierten Triplikaten angegeben.
  • Beispiel 9
  • Hervorrufen spezifischer Immunantworten gegen ein vom Melanom abgeleitetes Peptid (TRP-2181-188) durch verschiedene, mit Desoxyuridin-monophosphat modifizierte Oligonukleotide.
  • Um die Ergebnisse von Beispiel 5 weiter zu veranschaulichen und zu verstärken, wurden weitere Beispiele auf Basis von U-ODN 16 (wie in Beispiel 6 definiert) durchgeführt. Aus Vergleichsgründen wurden Varianten verwendet, wobei eine spezifische Base nicht in der Sequenz enthalten ist. U-ODN 16-A enthält nicht Adenin, U-ODN 16-C enthält nicht Cytosin, U-ODNs 16-G enthalten kein Guanin, und U-ODN 16-T enthalten kein Thymin. Wenn neben Desoxyuridin eine spezifische andere Base für die Wirksamkeit notwendig wäre, sollte das entsprechende Oligonukleotid keine Wirksamkeit zeigen. Wenn jedoch Desoxyuridin für eine Wirksamkeit ausreicht, dann werden IFN-γ produzierende T-Zellen erzeugt.
    Mäuse C57BI/6 (Harlan/Olac)
    Peptid TRP-2-Peptid (VYDFFVWL), ein MHC Klasse I (H-
    2Kb)-beschränktes Epitop von mit Mäuse-Tyrosinase
    verwandtem Protein-2 (B16 Melanoma, Bloom, M. B.
    et al., J. Exp. Med. 1997, 185, 453-459), synthe
    tisiert durch standardmäßige Festphasen-F-moc-
    Synthese, HPLC-gereinigt und mittels Massenspek
    troskopie auf Reinheit analysiert.
    Dosis: 100 μg/Maus
    Poly-L-Arginin 60 (pR 60)
    Poly-L-Arginin mit einem durchschnittlichen Poly
    merisationsgrad von 60
    Dosis: 100 μg/Maus
    ODN 16 Cocktail aus mit Thiophosphat substituierten
    ODNs, die Desoxyuridin-monophosphat enthalten:
    hhh wdu dhh h, wurden synthetisiert von NAPS GmbH,
    Göttingen (h = CAT, w = AT, d = GAT).
    Dosis: 5 nmol/Maus
    ODN 16-A Cocktail aus mit Thiophosphat substituierten
    ODNs, die Desoxyuridin-monophosphat enthalten:
    aaa bcu caa a, wurden synthetisiert von NAPS GmbH,
    Göttingen (a = CT, b = T, c = GT).
    Dosis: 5 nmol/Maus
    ODN 16-G Cocktail aus mit Thiophosphat substituierten
    ODNs, die Desoxyuridin-monophosphat enthalten:
    hhh, wwu, whh, h, wurden synthetisiert von NAPS
    GmbH, Göttingen (h = CAT, w = AT).
    Dosis: 5 nmol/Maus
    ODN 16-C Cocktail aus mit Thiophosphat substituierten
    ODNs, die Desoxyuridin-monophosphat enthalten:
    www wdu dww w, wurden synthetisiert von NAPS GmbH,
    Göttingen (w = AT, d = GAT).
    Dosis: 5 nmol/Maus
    ODN 16-T Cocktail aus mit Thiophosphat substituierten
    ODNs, die Desoxyuridin-monophosphat enthalten:
    eee fgu gee e, wurden synthetisiert von NAPS GmbH,
    Göttingen (e = CA, f = A, g = GA).
    Dosis: 5 nmol/Maus
    ODN 28 Cocktail aus mit Thiophosphat substituierten
    ODNs, die Desoxyuridin-monophosphat enthalten:
    hhh xdU dhh y, wurden synthetisiert von NAPS GmbH,
    Göttingen (h = CAT, x = T, d = GAT, y = GT).
    Dosis: 5 nmol/Maus
  • Versuchsgruppen (5 Mäuse pro Gruppe)
    • 1. TRP-2181-188
    • 2. TRP-2181-188 + pR 60
    • 3. TRP-2181-188 + ODN 16
    • 4. TRP-2181-188 + ODN 16-A
    • 5. TRP-2181-188 + ODN 16-G
    • 6. TRP-2181-188 + ODN 16-C
    • 7. TRP-2181-188 + ODN 16-T
    • 8. TRP-2181-188 + ODN 28
    • 9. TRP-2181-188 + pR 60 + ODN 16
    • 10. TRP-2181-188 + pR 60 + ODN 16-A
    • 11. TRP-2181-188 + pR 60 + ODN 16-G
    • 12. TRP-2181-188 + pR 60 + ODN 16-C
    • 13. TRP-2181-188 + pR 60 + ODN 16-T
    • 14. TRP-2181-188 + pR 60 + ODN 28
  • Am Tag 0 wurde den Mäusen in die Sohle jeder Hinterpfote ein Gesamtvolumen von 100 μl (50 μl pro Pfote) injiziert, das die oben genannten Verbindungen enthielt. 4 Tage nach der Injektion wurden die Tiere getötet, und es wurden die Lymphknoten aus den Kniekehlen geerntet. Die Lymphknoten wurden durch ein 70 μm Zellfilter geleitet und zwei Mal mit DMEM-Medium (GIBCO BRL) gewaschen, das 5% fötales Kälberserum (FCS, SIGMA Chemicals) enthielt. Die Zellen wurden auf die geeignete Zellzahl in DMEM/5%/FCS eingestellt. Es wurde ein dreifacher IFN-γ ELISPOT-Assay durchgeführt, wie beschrieben (Miyahira et al., 1995).
  • Dieses Verfahren ist ein verbreitet verwendetes Verfahren, das die Quantifizierung von Antigen-spezifischen T-Zellen ermöglicht. Die Lymphozyten wurden ex vivo dreifach mit Medium (Hin tergrund-Kontrolle), TRP-2181-188-Peptid, einem irrelevanten Peptid OVA257-264, pR 60, den verschiedenen ODNs und Concanavalin A (Con A) stimuliert. Spots, die einzelne IFN-γ produzierende T-Zellen darstellen, wurden gezählt, und die Anzahl der Hintergrundspots wurde von allen Proben abgezogen. Die nach der Stimulierung mit Con A (Daten nicht angegeben) entdeckte große Anzahl von Spots zeigt einen guten Zustand der verwendeten Lymphozyten an. Für jede Versuchsgruppe von Mäusen ist die Anzahl der IFN-γ produzierenden Zellen/1 × 106 Zellen in 9 dargestellt, und es ist die Standardabweichung von ex vivo stimulierten Triplikaten angegeben.
  • 9 zeigt deutlich, dass alle Sequenzen wirksam sind, woraus geschlossen wird, dass Desoxyuridin enthaltende Oligonukleotide keine spezifische Sequenz-Umgebung oder definierte Basen (z.B. ein spezifisches Sequenzmotiv) zur Wirksamkeit benötigen. Diese Schlussfolgerung wurde auch durch U-ODN 21 (das nur Desoxyuridin und Desoxyadenosin enthält), U-ODN 22 und U-ODN 24 (die keine natürlich vorkommenden DNA-Basen mehr enthalten) bestätigt. Es ist daher klar, dass die Wirksamkeit der Oligonukleotide gemäß der vorliegenden Erfindung auf dem Desoxyuridin selbst beruht, jedoch keine spezifischen Basen-Motive oder spezifischen Basen nötig sind, die in natürlicher DNA vorkommen.
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  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00420001
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Claims (15)

  1. Verwendung eines Oligodesoxynukleinsäure-Moleküls (ODN) mit der Struktur gemäß Formel (I)
    Figure 00500001
    wobei jegliches X ein O oder S ist, jegliches NMP ein 2'-Desoyxnukleosid-Monophosphat oder -Monothiophosphat ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Desoxyadenosin-, Desoxyguanosin-, Desoxyinosin-, Desoxycytosin-, Desoxyuridin-, Desoxythymidin-, 2-Methyl-desoxyinosin-, 5-Methyl-desoxycytosin-, Desoxypseudouridin-, Desoxyribosepurin-, 2-Amino-desoxyribosepurin-, 6-S-Desoxyguanin-, 2-Dimethyl-desoxyguanosin- oder N-Isopentenyl-desoxyadenosin-Monophosphat oder -Monothiophosphat, NUC ein 2'-Desoxynukleosid ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Desoxyadenosin-, Desoxyguanosin-, Desoxyinosin-, Desoxycytosin-, Desoxythymidin-, 2-Methyl-desoxyuridin-, 5-Methyldesoxycytosin-, Desoxypseudouridin-, Desoxyribosepurin-, 2-Amino-desoxyribosepurin-, 6-S-Desoxyguanin-, 2-Dimethyl-desoxyguanosin- oder N-Isopentenyl-desoxyadenosin, a und b ganze Zahlen von 0 bis 100 sind, mit der Voraussetzung, dass a + b zwischen 4 und 150 beträgt, und B und E übliche Gruppen für die 5'- oder 3'-Enden von Nukleinsäuremolekülen sind, und unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus -H, -CH3, -COH, -COCH3, -OH, -CHO, -PO4, -PSO3, -PS2O2, -PS3O, -PS4, -SO3, -PO9-(CH2)1-6-NH2 oder -PO4-(CH2)1-6-NH-Label zur Herstellung einer immunstimulierenden pharmazeutischen Zusammensetzung.
  2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei jegliches NMP ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Desoxyadenosin-, Desoxyguanosin-, Desoxyinosin-, Desoxycytosin-, Desoxyuridin-, Desoxythymidin-, 2-Methyl-desoxyuridin-, 5-Methyl-desoxycytosin-Monophosphat oder -Monothiophosphat.
  3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass a + b zwischen 10 und 60, vorzugsweise zwischen 15 und 40 beträgt
  4. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eines von X1 und X2 S ist und mindestens eines von X3 und X4 O ist und vorzugsweise jegliches NMP ein Nukleosid-Monothiophosphat ist.
  5. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das ODN die Sequenz tcc atg acu ttc ctg ctg atg ct nhh hhh wdu dhh hhh hhh wn hhh wdu dhh h enthält, wobei jegliches n ein 2'-Desoxynukleosid-Monophosphat oder -Monothiophosphat ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Desoxyadenosin-, Desoxyguanosin-, Desoxycytosin- oder Desoxythymidin-Monophosphat oder -Monothiophosphat, jegliches h ein 2'-Desoxynukleosid-Monophosphat oder -Mono-thiophosphat ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Desoxyadenosin-, Desoxycytosin- oder Desoxythymidin-Monophosphat oder -Monothiophosphat, u Desoxyuridin-monophosphat oder -Monothiophosphat ist, jegliches w ein 2'-Desoxynukleosid-monophosphat oder -Monothiophosphat ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Desoxyadenosin- oder Desoxythymidin-Monophosphat oder -Monothiophosphat, und jegliches d ein 2'-Desoxynukleosid-Monophosphat oder -Mono-thiophosphat ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Desoxyadenosin-, Desoxyguanosin- oder Desoxythymidin-Monophosphat oder -Monothiophosphat.
  6. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das ODN mindestens ein 2'-Desoxycytosin-Monophosphat oder -Monothiophosphat 3'-benachbart zu einem 2'-Desoxyuridin-Monophosphat oder -Monothiophosphat enthält.
  7. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das ODN die Sequenz gacutt, uacutt, gauctt, uauctt enthält, wobei a Desoxyadenosin-Monophosphat oder -Monothiophosphat ist, g Desoxyguanosin-Monophosphat oder -Monothiophosphat ist, u Desoxyuridin-Monophosphat oder -Monothiophosphat ist, c Desoxycytosin-Monophosphat oder -Monothiophosphat ist und t Desoxythymidin-Monophosphat oder -Monothiophosphat ist.
  8. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das ODN die Sequenz wdu, wdud, wdudn oder wdudud enthält, wobei w, d, u und n wie oben definiert sind.
  9. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die immunostimulierende pharmazeutische Zusammensetzung ein Vakzin ist.
  10. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein ODN wie in einem der Ansprüche 1 bis 8 definiert.
  11. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend – ein ODN wie in einem der Ansprüche 1 bis 8 definiert und – ein Antigen.
  12. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, dass sie weiters ein polykationisches Polymer, vorzugsweise ein polykationisches Peptid, insbesondere Polyarginin, Polylysin oder ein antimikrobielles Peptid, insbesondere ein von Cathelicidin abgeleitetes antimikrobielles Peptid, ein synthetisches Peptid, welches 2 KLK-Motive enthält, die durch einen Linker mit 3 bis 7 hydrophoben Aminosäuren getrennt sind, oder ein Wachstumshormon, insbesondere ein menschliches Wachstumshormon, umfasst.
  13. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 10 bis 12, welche weiters weitere aktive Bestandteile, insbesondere Zytokine, entzündungshemmende Substanzen, antimikrobielle Substanzen oder Kombinationen davon umfasst.
  14. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 10 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass sie weiters Hilfsstoffe, insbesondere einen pharmazeutisch annehmbaren Träger, Puffersubstanzen, Stabilisatoren oder Kombinationen davon enthält.
  15. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 10 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass sie 1 ng bis 1 g, vorzugsweise 100 ng bis 10 mg, insbesondere 10 μg bis 1 mg, eines oder mehrerer ODNs gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9 enthält.
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