JP5808082B2 - 細胞への水溶性高分子量物質の導入方法及び導入剤 - Google Patents
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Description
本明細書において、膜透過性ペプチドとは、それ自体が細胞に取り込まれるペプチドをいい、膜透過性ペプチド基とは、膜透過性ペプチドと同様のアミノ酸配列を有する基をいう。本発明のグラフト型高分子の側鎖の膜透過性ペプチド基は、細胞および導入しようとする水溶性高分子量物質に応じて適宜選択されてよいが、膜透過性ペプチド基を構成するアミノ酸の少なくとも1つは塩基性アミノ酸であることが好ましい。また、塩基性アミノ酸は、L体又はD体のいずれであってもよく、細胞および導入しようとする水溶性高分子量物質に応じて適宜選択されてよい。
本発明のグラフト型高分子の幹高分子は、特に限定されないが、細胞やタンパク質等の水溶性高分子量物質との親和性に優れることから親水性高分子であることが好ましい。ここで、親水性高分子とは、水溶性高分子、または水中で膨潤する高分子を意味する。本発明において、水溶性高分子とは、常圧下で25℃の水に0.1質量%以上の量で均一に溶解する高分子をいう。
本発明のグラフト型高分子において、幹高分子への膜透過性ペプチド基の導入は、常法に従って反応させればよく、用いる脱離基や具体的な合成手順は、用いる高分子及び膜透過性ペプチドに応じて適宜選択すればよい。例えば、幹高分子のカルボキシル基を有するモノマー単位に膜透過性ペプチド基を導入する場合には、膜透過性ペプチドのカルボン酸末端をアミド化等により不活性化させて、幹高分子のカルボキシル基と膜透過性ペプチドの末端アミノ基とを反応させればよく、副反応が低下することから膜透過性ペプチドのアミノ末端は保護基で保護されていることが好ましい。
本発明の導入方法により、種々の水溶性高分子量物質が細胞に導入できるが、あまりに高分子量の化合物の場合には導入効率が低下することから、本発明の導入方法により細胞に導入することが好ましい水溶性高分子量物質の質量平均分子量は、100万以下であることが好ましく、50万以下であることが更に好ましく、30万であることが最も好ましい。
本発明のグラフト型高分子を使用することにより、種々の細胞に水溶性高分子量物質を導入することが可能であり、培養液(液体培地ともいう)等に分散された細胞、固定培地等に接着した細胞、生体組織の細胞等のいずれの細胞にも水溶性高分子量物質を導入することが可能である。細胞は、組織細胞や神経細胞等を形成する接着系の細胞と、血球細胞等の浮遊系の細胞に大別できる。浮遊系の細胞に対しては、マイクロインジェクション法やエレクトロポレーション法は適用できず、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、ウイルスベクター法等が適用できたが、導入率は満足できるものではなかった。本発明の導入方法は、接着系の細胞だけでなく、浮遊系の細胞に対しても、水溶性高分子量物質を高い導入率で導入することが可能である。
本発明の導入方法では、細胞に水溶性高分子量物質を導入するのに、本発明のグラフト型高分子と水溶性高分子量物質とを含有する水性溶液または水性分散液を、細胞と接触させるだけでよく、ウイルスベクター法や膜透過性ペプチドを用いた従来の導入方法のような煩雑な前処理を必要とせずに、細胞に水溶性高分子量物質を導入できる。
本発明の一例に係る高分子の合成手順の概要は以下の反応式に示す通りである。詳細な手順を以下に説明する。なお、本発明では、膜透過性ペプチド基を構成するアミノ酸を1文字略号で表わす場合には、Lアルギニンの場合には「R」、Dアルギニンの場合には「r」で表すものとする。
(プロトン化)
N−ビニルアセトアミド−アクリル酸ナトリウム共重合体である「GE160」(昭和電工社製)10gを、イオン交換水1Lに溶解し、その溶液にイオン交換樹脂「アンバーリスト15DRY」(オルガノ社製)を10g加えて撹拌した。2時間撹拌した後に、イオン交換樹脂を濾別し、濾液を凍結乾燥することで、プロトン化されたN−ビニルアセトアミド−アクリル酸共重合体(GE160−H)を8.6g得た。このGE160−Hについて、常法に従って中和滴定を行った結果、上記反応式においてa:b=70:30であることが確認された。また、GPC分析の結果、GE160の質量平均分子量は160万であった。
1.0gのGE160−Hを、20mLのN,N−ジメチルホルムアミド(DMF)に溶解し、更に4.00gのジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)を添加した。この溶液を氷冷下10分間撹拌し、N−ヒドロキシコハク酸イミド2.22gを加えた。60℃で19時間に亘り撹拌を続け、反応を行った。反応の後、エタノール20mLを加えた後、アセトニトリル1Lに再沈殿を行って、減圧乾燥することで、スクシイミドエステル化されたGE160−OSuを0.90g得た。
30mgのGE160−OSuを、0.6mLのDMFに溶解した。これに、オクタLアルギニン(NH2−RRRRRRRR、林化成社製)のDMF溶液(1mg/10μL)1.28mLを混合し、60℃で24時間振盪し、反応を行った。反応の後、特級エタノール1mLを添加し、500mLのアセトニトリルへ再沈殿を行い、濾過により濾物を回収した。この濾物を、セルロース透析チューブ(シームレスセルロースチューブ,和光純薬社製)に入れ、チューブの両口を縛った後、イオン交換水を用いて2日間透析を行った。その後、チューブの内容物を凍結乾燥して、オリゴアルギニンが導入された高分子GE160−R8を127mg得た。
膜透過性ペプチドを導入する際、オクタDアルギニン(NH2−rrrrrrrr、林化成社製)を用いた点を除き、製造例1と同様の手順で高分子GE160−R8を合成した。
Caco−2細胞:ヒト結腸ガン由来上皮細胞株Caco−2の単層培養細胞
<水溶性高分子量物質>
FD−4:フルオレセイン(FITC)標識デキストリン(分子量4000、シグマ−アルドリッチ社製)
FD−40:FITC標識デキストリン(分子量40000、シグマ−アルドリッチ社製)
FITC−Ins:FITC標識インスリン(フナコシ社製)
◎:可視光で確認できた細胞のうち90%以上の細胞に蛍光がみられ、水溶性高分子量物質の導入率が高い。
○:可視光で確認できた細胞のうち40%以上90%未満の細胞に蛍光がみられ、水溶性高分子量物質の導入率がやや高い。
△:可視光で確認できた細胞のうち40%未満の細胞にしか蛍光がみられず、水溶性高分子量物質の導入率が低い。
×:可視光で確認できた細胞のいずれにも蛍光がみられず、水溶性高分子量物質が導入できていない。
Claims (4)
- 細胞膜透過性ペプチド基を側鎖に有し、下記一般式(1)で表されるモノマー単位を有するグラフト型高分子と、水溶性高分子量物質(但し、前記グラフト型高分子を除く)とを含有する水性溶液または水性分散液を、細胞と接触させる工程を有する細胞への水溶性高分子量物質の導入方法であって、
前記細胞膜透過性ペプチド基を構成する細胞膜透過性ペプチドが、7以上12以下のアルギニンがペプチド結合したアルギニンオリゴマー、GRKKRRQRRRPPQなるアミノ酸配列を有するペプチド、TRQARRNRRRRWRERQR、RRRRNRTRRNRRRVR、TRRQRTRRARRNR、RQIKIWFQNRRMKWKKなるアミノ酸配列を有するペプチド、KMTRAQRRAAARRNRWTAR、RQIKIWFQNRRMKWKK、GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKILなるアミノ酸配列を有するペプチドからなる群から選択される少なくとも1種の細胞膜透過性ペプチドであり、
前記グラフト型高分子の幹高分子の質量平均分子量が10万〜5000万である、
水溶性高分子量物質の導入方法。
- 請求項1に記載の細胞膜透過性ペプチド基を側鎖に有するグラフト型高分子と、ペプチド、タンパク質、または多糖類から選ばれる水溶性高分子量物質(但し、前記グラフト型高分子を除く)とを含有する水性溶液または水性分散液を、細胞と接触させる工程を有する細胞への水溶性高分子量物質の導入方法。
- 前記水溶性高分子量物質が、核酸、ペプチド、または多糖類である請求項1または2に記載の導入方法。
- 細胞膜透過性ペプチド基を側鎖に有し、下記一般式(1)で表されるモノマー単位を有するグラフト型高分子からなる、細胞への水溶性高分子量物質の導入剤であって、
前記細胞膜透過性ペプチド基を構成する細胞膜透過性ペプチドが、7以上12以下のアルギニンがペプチド結合したアルギニンオリゴマー、GRKKRRQRRRPPQなるアミノ酸配列を有するペプチド、TRQARRNRRRRWRERQR、RRRRNRTRRNRRRVR、TRRQRTRRARRNR、RQIKIWFQNRRMKWKKなるアミノ酸配列を有するペプチド、KMTRAQRRAAARRNRWTAR、RQIKIWFQNRRMKWKK、GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKILなるアミノ酸配列を有するペプチドからなる群から選択される少なくとも1種の細胞膜透過性ペプチドであり、
前記グラフト型高分子の幹高分子の質量平均分子量が10万〜5000万である、
細胞への水溶性高分子量物質の導入剤。
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