JP2000157270A - 遺伝子導入用キャリアー、該キャリアーと遺伝子との複合体及び細胞への遺伝子導入方法 - Google Patents
遺伝子導入用キャリアー、該キャリアーと遺伝子との複合体及び細胞への遺伝子導入方法Info
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- JP2000157270A JP2000157270A JP33689398A JP33689398A JP2000157270A JP 2000157270 A JP2000157270 A JP 2000157270A JP 33689398 A JP33689398 A JP 33689398A JP 33689398 A JP33689398 A JP 33689398A JP 2000157270 A JP2000157270 A JP 2000157270A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 遺伝子の導入効率がよく、導入した遺伝子の
発現率が高く、しかも安全性に優れた遺伝子導入用キャ
リアー、遺伝子とキャリアーとの複合体、及び遺伝子導
入方法を提供する。 【解決手段】 遺伝子導入用キャリアーとして、固有粘
度１．０ｄｌ／ｇのキトサンを用い、これを遺伝子と混
合して遺伝子−キトサン複合体を形成し、この複合体と
細胞を血清存在下に接触させて遺伝子を細胞内に導入す
る。
発現率が高く、しかも安全性に優れた遺伝子導入用キャ
リアー、遺伝子とキャリアーとの複合体、及び遺伝子導
入方法を提供する。 【解決手段】 遺伝子導入用キャリアーとして、固有粘
度１．０ｄｌ／ｇのキトサンを用い、これを遺伝子と混
合して遺伝子−キトサン複合体を形成し、この複合体と
細胞を血清存在下に接触させて遺伝子を細胞内に導入す
る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、アンチセンス療法や遺
伝子治療に応用可能な、安全性が高く効率的な遺伝子導
入用キャリアー、該キャリアーと遺伝子との複合体及び
細胞への遺伝子導入方法に関する。
伝子治療に応用可能な、安全性が高く効率的な遺伝子導
入用キャリアー、該キャリアーと遺伝子との複合体及び
細胞への遺伝子導入方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】近年の目覚ましい遺伝子工学の進歩によ
って、多くの遺伝病やガンなどの原因遺伝子が同定、単
離されてきている。そしてそれら病気の原因となる遺伝
子の異常がＤＮＡレベルで明らかにされたことで、その
異常な遺伝子を正常に戻すことによりその病気を治療す
るという遺伝子治療が考えられるようになってきた。
って、多くの遺伝病やガンなどの原因遺伝子が同定、単
離されてきている。そしてそれら病気の原因となる遺伝
子の異常がＤＮＡレベルで明らかにされたことで、その
異常な遺伝子を正常に戻すことによりその病気を治療す
るという遺伝子治療が考えられるようになってきた。
【０００３】現在、実用化されている遺伝子治療法は大
きくわけて２つある。１つは、先天性免疫不全症や先天
性代謝異常症等の先天的な遺伝病において、その欠損し
た遺伝子を外部から導入して補うという治療法であり、
もう１つはガン細胞やＡＩＤＳなどのような細胞やウイ
ルスをターゲットにして、それらの増殖を抑制したり、
死滅させるための遺伝子を導入する治療法である。上記
どちらの治療法においても、目的とする遺伝子を細胞内
に導入し、発現させることが重要であることが知られて
いる。
きくわけて２つある。１つは、先天性免疫不全症や先天
性代謝異常症等の先天的な遺伝病において、その欠損し
た遺伝子を外部から導入して補うという治療法であり、
もう１つはガン細胞やＡＩＤＳなどのような細胞やウイ
ルスをターゲットにして、それらの増殖を抑制したり、
死滅させるための遺伝子を導入する治療法である。上記
どちらの治療法においても、目的とする遺伝子を細胞内
に導入し、発現させることが重要であることが知られて
いる。
【０００４】しかしながら、ＤＮＡと細胞膜は共にアニ
オン性を示し、電気的に反発してしまうため、遺伝子
（ＤＮＡ）を単独で直接細胞内に導入することは非常に
困難である。
オン性を示し、電気的に反発してしまうため、遺伝子
（ＤＮＡ）を単独で直接細胞内に導入することは非常に
困難である。
【０００５】そこで、これまでにもＤＮＡキャリアーと
して様々な物質が検討されてきたが、安全性や導入効率
等の面で問題があり、実用化の妨げとなっている。例え
ば、代表的なウイルスベクターであるレトロウイルスベ
クターは、導入効率が高いという利点がある一方で、
大きなサイズのＤＮＡを使えない、非分裂細胞に導入
できない、発現レベルが低いなどの欠点がある。ま
た、アデノウイルスベクターは、非分裂細胞にも導入可
能だが、免疫原性が強く、抗体ができてしまうという欠
点があり、ヘルペスウイルスベクターは、神経細胞への
導入に優れているが、細胞毒性が強いという欠点があ
る。その他ウイルスベクター以外のキャリアーとしてカ
チオン性リポソーム、脂質、ポリマーなどが研究されて
いるが、導入効率や細胞特異性が低くなるという問題が
あった。
して様々な物質が検討されてきたが、安全性や導入効率
等の面で問題があり、実用化の妨げとなっている。例え
ば、代表的なウイルスベクターであるレトロウイルスベ
クターは、導入効率が高いという利点がある一方で、
大きなサイズのＤＮＡを使えない、非分裂細胞に導入
できない、発現レベルが低いなどの欠点がある。ま
た、アデノウイルスベクターは、非分裂細胞にも導入可
能だが、免疫原性が強く、抗体ができてしまうという欠
点があり、ヘルペスウイルスベクターは、神経細胞への
導入に優れているが、細胞毒性が強いという欠点があ
る。その他ウイルスベクター以外のキャリアーとしてカ
チオン性リポソーム、脂質、ポリマーなどが研究されて
いるが、導入効率や細胞特異性が低くなるという問題が
あった。
【０００６】また、特開平３−１９８７８２号公報にお
いて、低分子キトサンをキャリアーとした遺伝子導入の
方法が開示されているが、この方法は、遺伝子を細胞に
導入する際に、細胞膜の透過性を増強する薬剤を使用す
るため、細胞にダメージを与えてしまうという問題があ
った。
いて、低分子キトサンをキャリアーとした遺伝子導入の
方法が開示されているが、この方法は、遺伝子を細胞に
導入する際に、細胞膜の透過性を増強する薬剤を使用す
るため、細胞にダメージを与えてしまうという問題があ
った。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記問題を
解決し、導入した遺伝子の発現レベルが高く、しかも安
全性に優れた遺伝子導入用キャリアー、該キャリアーと
遺伝子との複合体及び細胞への遺伝子導入方法を提供す
るものである。
解決し、導入した遺伝子の発現レベルが高く、しかも安
全性に優れた遺伝子導入用キャリアー、該キャリアーと
遺伝子との複合体及び細胞への遺伝子導入方法を提供す
るものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、生体に対
して安全性が高いことを主眼として、鋭意研究した結
果、遺伝子導入用キャリアーとして、天然の塩基性高分
子多糖類であるキトサンのうち、比較的高分子量のもの
を使用して、遺伝子−キトサン複合体を調製し、この複
合体と細胞とを血清存在下に接触させることにより、遺
伝子を効率良く細胞に導入、発現できることを見い出
し、本発明を完成した。
して安全性が高いことを主眼として、鋭意研究した結
果、遺伝子導入用キャリアーとして、天然の塩基性高分
子多糖類であるキトサンのうち、比較的高分子量のもの
を使用して、遺伝子−キトサン複合体を調製し、この複
合体と細胞とを血清存在下に接触させることにより、遺
伝子を効率良く細胞に導入、発現できることを見い出
し、本発明を完成した。
【０００９】すなわち、本発明の１つは、固有粘度１．
０ｄｌ／ｇ以上のキトサンからなることを特徴とする遺
伝子導入用キャリアーを提供するものである。
０ｄｌ／ｇ以上のキトサンからなることを特徴とする遺
伝子導入用キャリアーを提供するものである。
【００１０】本発明のもう一つは、固有粘度１．０ｄｌ
／ｇ以上のキトサンと導入すべき遺伝子とからなること
を特徴とするキャリアーと遺伝子との複合体を提供する
ものである。
／ｇ以上のキトサンと導入すべき遺伝子とからなること
を特徴とするキャリアーと遺伝子との複合体を提供する
ものである。
【００１１】本発明の更にもう一つは、固有粘度１．０
ｄｌ／ｇ以上のキトサンと導入すべき遺伝子とを混合し
てそれらの複合体を形成し、この複合体を細胞と接触さ
せることを特徴とする遺伝子導入方法を提供するもので
ある。
ｄｌ／ｇ以上のキトサンと導入すべき遺伝子とを混合し
てそれらの複合体を形成し、この複合体を細胞と接触さ
せることを特徴とする遺伝子導入方法を提供するもので
ある。
【００１２】本発明の遺伝子導入方法においては、導入
すべき遺伝子の塩基とキトサンの糖単位の比率が１：２
〜１：２０となるように両者を混合することが好まし
い。
すべき遺伝子の塩基とキトサンの糖単位の比率が１：２
〜１：２０となるように両者を混合することが好まし
い。
【００１３】また、前記複合体を前記細胞と接触させる
際に、前記細胞の培養培地に血清成分を添加することが
好ましい。
際に、前記細胞の培養培地に血清成分を添加することが
好ましい。
【００１４】本発明によれば、後述する実施例に示され
るように、天然物から得られた安全性の高いキトサンを
遺伝子のキャリアーとして、遺伝子との複合体を形成す
ることにより、遺伝子を効率的に細胞内に導入できると
共に、現在最も優れたキャリアーとされているリポフェ
クチンよりも高い発現率を得ることができる。
るように、天然物から得られた安全性の高いキトサンを
遺伝子のキャリアーとして、遺伝子との複合体を形成す
ることにより、遺伝子を効率的に細胞内に導入できると
共に、現在最も優れたキャリアーとされているリポフェ
クチンよりも高い発現率を得ることができる。
【００１５】
【発明の実施形態】キトサンは、主にエビやカニなどの
甲殻類の甲羅に含まれるキチン（Ｎ−アセチル−Ｄ−グ
ルコサミンがβ−１，４結合した多糖）のアセトアミド
基を脱アセチル化して得られる多糖類である。
甲殻類の甲羅に含まれるキチン（Ｎ−アセチル−Ｄ−グ
ルコサミンがβ−１，４結合した多糖）のアセトアミド
基を脱アセチル化して得られる多糖類である。
【００１６】本発明で使用するキトサンは、希酸に可溶
な通常のキトサンで、１．０ｄｌ／ｇ以上の固有粘度を
有するものであればよく、起源、脱アセチル化度等は特
に限定されるものではない。固有粘度が上記よりも低い
低分子量キトサンでは、導入率が著しく低くなるという
問題がある。
な通常のキトサンで、１．０ｄｌ／ｇ以上の固有粘度を
有するものであればよく、起源、脱アセチル化度等は特
に限定されるものではない。固有粘度が上記よりも低い
低分子量キトサンでは、導入率が著しく低くなるという
問題がある。
【００１７】なお、本発明において固有粘度とは、例え
ば特開平１−１８５３０１号に記載された方法に従い、
ウベローデ粘度計を用いて、試料は、キトサンをこれと
同量の酢酸を用いて水に溶解し、この溶液と同量の０．
４Ｎ酢酸＋０．２Ｎ酢酸ナトリウムとを混合して測定に
用いる溶液を調製し、希釈には０．２Ｎ酢酸＋０．１Ｎ
酢酸ナトリウムを用い、３０℃の条件で測定された固有
粘度を意味する。
ば特開平１−１８５３０１号に記載された方法に従い、
ウベローデ粘度計を用いて、試料は、キトサンをこれと
同量の酢酸を用いて水に溶解し、この溶液と同量の０．
４Ｎ酢酸＋０．２Ｎ酢酸ナトリウムとを混合して測定に
用いる溶液を調製し、希釈には０．２Ｎ酢酸＋０．１Ｎ
酢酸ナトリウムを用い、３０℃の条件で測定された固有
粘度を意味する。
【００１８】本発明において、遺伝子は、導入するＤＮ
Ａが発現ベクターのプロモーター下流に連結されている
プラスミド（組み換えベクター）が好ましく用いられ
る。
Ａが発現ベクターのプロモーター下流に連結されている
プラスミド（組み換えベクター）が好ましく用いられ
る。
【００１９】本発明の遺伝子−キトサン複合体の形成
は、両者の溶液を０〜５０℃で１０分〜２４時間、好ま
しくは２０〜３０℃で１〜４時間混合することにより得
ることができる。この時の両者の混合の比率は、プラス
ミド１塩基：キトサン中のグルコサミン単位＝１：２〜
１：２０とすることが好ましく、１：５〜１：１０とす
ることがより好ましい。なお、両者の溶媒としては、滅
菌された超純水、緩衝液等が好ましく用いられる。
は、両者の溶液を０〜５０℃で１０分〜２４時間、好ま
しくは２０〜３０℃で１〜４時間混合することにより得
ることができる。この時の両者の混合の比率は、プラス
ミド１塩基：キトサン中のグルコサミン単位＝１：２〜
１：２０とすることが好ましく、１：５〜１：１０とす
ることがより好ましい。なお、両者の溶媒としては、滅
菌された超純水、緩衝液等が好ましく用いられる。
【００２０】本発明の好ましい態様においては、上記条
件で調製した遺伝子−キトサン複合体を培養中の目的の
細胞にそのまま添加して、細胞の培養温度で４〜１２時
間静置して上記複合体と細胞を十分接触させた後、血清
を添加した培地に交換して更に４〜２４時間培養するこ
とにより導入する。培地中に血清を加えることにより、
遺伝子発現率を高めることができる。
件で調製した遺伝子−キトサン複合体を培養中の目的の
細胞にそのまま添加して、細胞の培養温度で４〜１２時
間静置して上記複合体と細胞を十分接触させた後、血清
を添加した培地に交換して更に４〜２４時間培養するこ
とにより導入する。培地中に血清を加えることにより、
遺伝子発現率を高めることができる。
【００２１】本発明で使用する血清成分は、細胞培養に
適したものであればよく、例えば牛胎児血清（ＦＢＳ）
などが好ましく用いられる。血清成分の培地中への添加
量は、０．１〜５０重量％が好ましく、２〜２０重量％
が更に好ましい。
適したものであればよく、例えば牛胎児血清（ＦＢＳ）
などが好ましく用いられる。血清成分の培地中への添加
量は、０．１〜５０重量％が好ましく、２〜２０重量％
が更に好ましい。
【００２２】
【実施例】以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細かつ
具体的に説明するが、これにより本発明が何ら制約され
るものではない。
具体的に説明するが、これにより本発明が何ら制約され
るものではない。
【００２３】実施例１ 実験材料としては、下記のものを用いた。 細胞：ヒト肺がん細胞 Ａ５４９（細胞開発銀行製） 培地：ＤＭＥＭ培地（日水製薬製）＋１０％ウシ胎児
血清（以下、ＦＢＳとする） キトサン： (i) 固有粘度２．０ｄｌ／ｇ、脱アセチル化度９３．６
％ (ii)固有粘度０．６ｄｌ／ｇ、脱アセチル化度７９．０
％ 遺伝子：ホタルのルシフェラーゼ遺伝子を導入したプ
ラスミド なお、プラスミドとキトサンとの混合比は、プラスミド
１塩基：キトサンのグルコサミン単位＝１：５の割合と
なるようにした。
血清（以下、ＦＢＳとする） キトサン： (i) 固有粘度２．０ｄｌ／ｇ、脱アセチル化度９３．６
％ (ii)固有粘度０．６ｄｌ／ｇ、脱アセチル化度７９．０
％ 遺伝子：ホタルのルシフェラーゼ遺伝子を導入したプ
ラスミド なお、プラスミドとキトサンとの混合比は、プラスミド
１塩基：キトサンのグルコサミン単位＝１：５の割合と
なるようにした。
【００２４】実験方法について説明すると、まず、ホタ
ルのルシフェラーゼ遺伝子を導入したプラスミド水溶液
５ｍｌ（１ｍｇ／ｍｌ）とキトサン水溶液５ｍｌ（２．
９５ｍｇ／ｍｌ）を混合し、室温で２時間撹拌してプラ
スミド−キトサン複合体を形成させた。
ルのルシフェラーゼ遺伝子を導入したプラスミド水溶液
５ｍｌ（１ｍｇ／ｍｌ）とキトサン水溶液５ｍｌ（２．
９５ｍｇ／ｍｌ）を混合し、室温で２時間撹拌してプラ
スミド−キトサン複合体を形成させた。
【００２５】次に、Ａ５４９細胞を３７℃で２４時間培
養後、上記プラスミド−キトサン複合体溶液を１ｍｌ加
え、更に８時間インキュベーションした後、上記複合体
の入った培地を上記血清培地に替えて１２時間培養して
プラスミドを細胞内に導入させた。
養後、上記プラスミド−キトサン複合体溶液を１ｍｌ加
え、更に８時間インキュベーションした後、上記複合体
の入った培地を上記血清培地に替えて１２時間培養して
プラスミドを細胞内に導入させた。
【００２６】対照として、プラスミドのみと、プラスミ
ド−リポフェクチン複合体とを用いて、同様な方法で細
胞内への遺伝子導入を行った。なお、リポフェクチン
は、現在最も優れたキャリアーと言われているものであ
る。
ド−リポフェクチン複合体とを用いて、同様な方法で細
胞内への遺伝子導入を行った。なお、リポフェクチン
は、現在最も優れたキャリアーと言われているものであ
る。
【００２７】それぞれの培養後、上清を取り除いてから
ＰＢＳで３回洗浄し、細胞溶解液１００ｍｌを加えてか
ら細胞を回収した。これを遠心分離して、上清を細胞抽
出液とし、そのルシフェラーゼ活性を測定した。
ＰＢＳで３回洗浄し、細胞溶解液１００ｍｌを加えてか
ら細胞を回収した。これを遠心分離して、上清を細胞抽
出液とし、そのルシフェラーゼ活性を測定した。
【００２８】ルシフェラーゼ活性の測定は、Ｐｒｏｍｅ
ｇａ社のルシフェラーゼアッセイシステムを用いて行
い、プラスミドのみの場合のルシフェラーゼ活性を１０
０としてその相対値を求めた。その結果を表１（実施例
４の後に記載）に示す。
ｇａ社のルシフェラーゼアッセイシステムを用いて行
い、プラスミドのみの場合のルシフェラーゼ活性を１０
０としてその相対値を求めた。その結果を表１（実施例
４の後に記載）に示す。
【００２９】表１の結果から、(i) のプラスミド−キト
サン複合体（固有粘度２．０ｄｌ／ｇ）は、プラスミド
のみに比べて２４０倍、プラスミド−リポフェクチン複
合体に比べて約２．７倍の発現率であった。
サン複合体（固有粘度２．０ｄｌ／ｇ）は、プラスミド
のみに比べて２４０倍、プラスミド−リポフェクチン複
合体に比べて約２．７倍の発現率であった。
【００３０】一方、(ii)のプラスミド−キトサン複合体
（固有粘度０．６ｄｌ／ｇ）は、プラスミドのみ、プラ
スミド−リポフェクチン複合体に比べると発現率は高い
ものの、(i) のプラスミド−キトサン複合体（固有粘度
２．０ｄｌ／ｇ）に比べると明らかに発現率が低下す
る。
（固有粘度０．６ｄｌ／ｇ）は、プラスミドのみ、プラ
スミド−リポフェクチン複合体に比べると発現率は高い
ものの、(i) のプラスミド−キトサン複合体（固有粘度
２．０ｄｌ／ｇ）に比べると明らかに発現率が低下す
る。
【００３１】実施例２ 実験材料として下記のものを用いた。 細胞：ヒト肺がん細胞 Ａ５４９（細胞開発銀行製） 培地：ＤＭＥＭ培地（日水製薬）のみ及びＤＭＥＭ培
地＋１０％ＦＢＳ キトサン：固有粘度２．０ｄｌ／ｇ、脱アセチル化度
９３．６％ 遺伝子：ホタルのルシフェラーゼ遺伝子を導入したプ
ラスミド なお、プラスミドとキトサンとの混合比は、プラスミド
１塩基：キトサンのグルコサミン単位＝１：５の割合と
なるようにした。
地＋１０％ＦＢＳ キトサン：固有粘度２．０ｄｌ／ｇ、脱アセチル化度
９３．６％ 遺伝子：ホタルのルシフェラーゼ遺伝子を導入したプ
ラスミド なお、プラスミドとキトサンとの混合比は、プラスミド
１塩基：キトサンのグルコサミン単位＝１：５の割合と
なるようにした。
【００３２】実施例１と同様な方法で調製したプラスミ
ド−キトサン複合体を細胞に接触させた後に、血清添加
又は無添加の培地で培養した以外は、実施例１と同様に
して遺伝子導入を行い、その発現率を見た。その結果を
表１に示す。
ド−キトサン複合体を細胞に接触させた後に、血清添加
又は無添加の培地で培養した以外は、実施例１と同様に
して遺伝子導入を行い、その発現率を見た。その結果を
表１に示す。
【００３３】表１の結果から、培地に血清（ＦＢＳ）を
加えることにより発現率が約６．９倍上昇した。
加えることにより発現率が約６．９倍上昇した。
【００３４】実施例３ 実験材料として下記のものを用いた。 細胞：ヒト肺がん細胞 Ａ５４９（細胞開発銀行製） 培地：ＤＭＥＭ培地（日水製薬）＋１０％ＦＢＳとす
る キトサン：固有粘度３．０ｄｌ／ｇ、脱アセチル化度
８４．０％ 遺伝子：ホタルのルシフェラーゼ遺伝子を導入したプ
ラスミド 上記実験材料を用い、プラスミドとキトサンとの混合比
をプラスミド１塩基：キトサンのグルコサミン単位＝
１：２〜１：２０の範囲で変えた他は、実施例１と同様
な方法で、プラスミド−キトサン複合体を形成し、この
複合体を用いて細胞への遺伝子導入を行い、その発現率
を見た。その結果を表１に示す。
る キトサン：固有粘度３．０ｄｌ／ｇ、脱アセチル化度
８４．０％ 遺伝子：ホタルのルシフェラーゼ遺伝子を導入したプ
ラスミド 上記実験材料を用い、プラスミドとキトサンとの混合比
をプラスミド１塩基：キトサンのグルコサミン単位＝
１：２〜１：２０の範囲で変えた他は、実施例１と同様
な方法で、プラスミド−キトサン複合体を形成し、この
複合体を用いて細胞への遺伝子導入を行い、その発現率
を見た。その結果を表１に示す。
【００３５】表１の結果から、プラスミド−キトサン複
合体を調製する際の混合比は、プラスミド１塩基：キト
サンのグルコサミン単位＝１：５である場合が最も発現
率が高く、プラスミドのみの場合に比べて３８０倍の発
現率であった。
合体を調製する際の混合比は、プラスミド１塩基：キト
サンのグルコサミン単位＝１：５である場合が最も発現
率が高く、プラスミドのみの場合に比べて３８０倍の発
現率であった。
【００３６】
【表１】
【００３７】試験例１ 上記実施例４におけるプラスミドとキトサンを１：０．
５〜１：２０の比率で混合して得られたプラスミド−キ
トサン複合体を電気泳動して、複合体形成の様子を見
た。この結果を図１に示す。図１中、１はプラスミドの
み、２はプラスミド：キトサン＝１：０．５、３はプラ
スミド：キトサン＝１：２、４はプラスミド：キトサン
＝１：５、５はプラスミド：キトサン＝１：１０、６は
プラスミド：キトサン＝１：２０のそれぞれの電気泳動
パターンを示す。また、図１中の７はプラスミドを示す
パターン、８はプラスミド−キトサン複合体を示すパタ
ーンである。
５〜１：２０の比率で混合して得られたプラスミド−キ
トサン複合体を電気泳動して、複合体形成の様子を見
た。この結果を図１に示す。図１中、１はプラスミドの
み、２はプラスミド：キトサン＝１：０．５、３はプラ
スミド：キトサン＝１：２、４はプラスミド：キトサン
＝１：５、５はプラスミド：キトサン＝１：１０、６は
プラスミド：キトサン＝１：２０のそれぞれの電気泳動
パターンを示す。また、図１中の７はプラスミドを示す
パターン、８はプラスミド−キトサン複合体を示すパタ
ーンである。
【００３８】図１に示されるように、プラスミド：キト
サン＝１：２〜１：２０の比率で混合した場合、殆ど全
てのプラスミドがキトサンと複合体を形成していること
が分かる。
サン＝１：２〜１：２０の比率で混合した場合、殆ど全
てのプラスミドがキトサンと複合体を形成していること
が分かる。
【００３９】
【発明の作用】以上説明したように、本発明によれば、
遺伝子導入用キャリアーとして固有粘度１．０ｄｌ／ｇ
以上の比較的高分子のキトサンを用いたことにより、遺
伝子を効率的に細胞内に導入できると共に、現在最も優
れたキャリアーとされているリポフェクチンよりも高い
発現率を得ることができる。また、キトサンは、天然物
であって、安全性が非常に高いので、例えばアンチセン
ス療法や遺伝子治療に好適である。
遺伝子導入用キャリアーとして固有粘度１．０ｄｌ／ｇ
以上の比較的高分子のキトサンを用いたことにより、遺
伝子を効率的に細胞内に導入できると共に、現在最も優
れたキャリアーとされているリポフェクチンよりも高い
発現率を得ることができる。また、キトサンは、天然物
であって、安全性が非常に高いので、例えばアンチセン
ス療法や遺伝子治療に好適である。
【図１】 プラスミドとキトサンを様々な比率で混合し
て得られたプラスミド−キトサン複合体を電気泳動した
結果を示す図表である。
て得られたプラスミド−キトサン複合体を電気泳動した
結果を示す図表である。
１…プラスミドのみ ２…プラスミド：キトサン＝１：０．５ ３…プラスミド：キトサン＝１：２ ４…プラスミド：キトサン＝１：５ ５…プラスミド：キトサン＝１：１０ ６…プラスミド：キトサン＝１：２０ ７…プラスミド ８…プラスミド−キトサン複合体
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 4B024 AA20 BA08 DA03 FA20 GA16 HA17 4B029 AA21 BB16 CC04 4C090 AA07 BA47 BD08 DA10 DA23
Claims (5)
- 【請求項１】 固有粘度１．０ｄｌ／ｇ以上のキトサン
からなることを特徴とする遺伝子導入用キャリアー。 - 【請求項２】 固有粘度１．０ｄｌ／ｇ以上のキトサン
と導入すべき遺伝子とからなることを特徴とするキャリ
アーと遺伝子との複合体。 - 【請求項３】 固有粘度１．０ｄｌ／ｇ以上のキトサン
と導入すべき遺伝子とを混合してそれらの複合体を形成
し、この複合体を細胞と接触させることを特徴とする遺
伝子導入方法。 - 【請求項４】 導入すべき遺伝子の塩基とキトサンの糖
単位の比率が１：２〜１：２０となるように両者を混合
する請求項３記載の遺伝子導入方法。 - 【請求項５】 前記複合体を前記細胞と接触させる際
に、前記細胞の培養培地に血清成分を添加する請求項３
又は４記載の遺伝子導入方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP33689398A JP2000157270A (ja) | 1998-11-27 | 1998-11-27 | 遺伝子導入用キャリアー、該キャリアーと遺伝子との複合体及び細胞への遺伝子導入方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP33689398A JP2000157270A (ja) | 1998-11-27 | 1998-11-27 | 遺伝子導入用キャリアー、該キャリアーと遺伝子との複合体及び細胞への遺伝子導入方法 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000157270A true JP2000157270A (ja) | 2000-06-13 |
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ID=18303629
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP33689398A Pending JP2000157270A (ja) | 1998-11-27 | 1998-11-27 | 遺伝子導入用キャリアー、該キャリアーと遺伝子との複合体及び細胞への遺伝子導入方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2000157270A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005200531A (ja) * | 2004-01-15 | 2005-07-28 | Japan Science & Technology Agency | ６−アミノ−６−デオキシキトサン、その製造方法およびそれより成る核酸導入剤 |
| US7550512B2 (en) | 2001-11-28 | 2009-06-23 | Keio University | Medical polymers and uses thereof |
| US8796027B2 (en) | 2005-04-27 | 2014-08-05 | Jnc Corporation | Nucleic acid complex and method of introducing nucleic acid into cell using the same |
-
1998
- 1998-11-27 JP JP33689398A patent/JP2000157270A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7550512B2 (en) | 2001-11-28 | 2009-06-23 | Keio University | Medical polymers and uses thereof |
| JP2005200531A (ja) * | 2004-01-15 | 2005-07-28 | Japan Science & Technology Agency | ６−アミノ−６−デオキシキトサン、その製造方法およびそれより成る核酸導入剤 |
| JP4518804B2 (ja) * | 2004-01-15 | 2010-08-04 | 独立行政法人科学技術振興機構 | ６−アミノ−６−デオキシキトサン、その製造方法およびそれより成る核酸導入剤 |
| US8796027B2 (en) | 2005-04-27 | 2014-08-05 | Jnc Corporation | Nucleic acid complex and method of introducing nucleic acid into cell using the same |
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