KR20120080927A - 형질도입 효율이 향상된 키토산-스페르민 그라프트 공중합체 및 이를 유전자 전달체로 이용하는 유전자 치료 - Google Patents

Abstract

본 발명은 형질도입 효율이 향상된 키토산-스페르민 그라프트 공중합체 및 이를 유전자 전달체로 이용하는 유전자 치료에 관한 것이다. 본 발명의 키토산-스페르민 그라프트 공중합체는 DNA에 높은 결합능을 나타내고 핵산분해효소로부터 DNA를 효과적으로 보호하며 유전자 전달체로 사용하기에 적합한 구형의 균일한 입자 크기의 복합체를 형성할 수 있을 뿐만 아니라, 시험관 내 및 생체 내에서 매우 낮은 세포독성을 나타내고 형질도입(transfection) 효율이 기존의 비바이러스성 유전자 전달체에 비해 현저히 향상되어 유전자 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

형질도입 효율이 향상된 키토산-스페르민 그라프트 공중합체 및 이를 유전자 전달체로 이용하는 유전자 치료{Chitosan-spermine graft copolymer having improved transfection efficiency and gene therapy using the same as a gene carrier}

본 발명은 형질도입 효율이 향상된 키토산-스페르민 그라프트 공중합체(chitosan-spermine graft copolymer) 및 이를 유전자 전달체로 이용하는 유전자 치료에 관한 것이다. 본 발명의 키토산-스페르민 그라프트 공중합체는 DNA에 높은 결합능을 나타내고 핵산분해효소로부터 DNA를 효과적으로 보호하며 유전자 전달체로 사용하기에 적합한 구형의 균일한 입자 크기의 복합체를 형성할 수 있을 뿐만 아니라, 시험관 내 및 생체 내에서 매우 낮은 세포독성을 나타내고 형질도입 효율이 기존의 비바이러스성 유전자 전달체에 비해 현저히 향상되어 유전자 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

유전자 치료(gene therapy)는 치료 유전자를 체내의 원하는 장기로 전달하여 세포 내에서 새로운 단백질이 발현되도록 하여 질병을 치료하는 것으로, 질병의 증상을 치료하는 것이 아니고 질병의 원인을 치료하여 제거하는 방식이다. 유전자 치료는 일반적인 약물에 의한 치료에 비해서 우수한 선택성을 가질 수 있고 다른 치료법으로는 조절하기 힘든 질병의 치료율 및 치료 속도를 개선하여 오랜 기간 동안 적용할 수 있다. 치료 유전자로서 DNA는 생체 내 효소에 의한 가수분해에 취약하고 세포 내로 유입되는 효율이 낮기 때문에, 효과적인 유전자 치료를 위해서는 치료 유전자를 원하는 표적세포로 안전하게 전달하여 높은 발현효율의 달성을 가능케 하는 유전자 전달체(gene carrier)를 개발하는 것이 필요하다.

유전자 전달체는 독성이 낮거나 없어야 하며, 유전자를 선택적이고 효과적으로 원하는 세포에 전달할 수 있어야 한다. 이러한 유전자 전달체는 크게 바이러스성과 비바이러스성으로 나눌 수 있다. 최근까지 임상 실험에는 유전자 전달체로 형질도입 효율이 높은 바이러스성 벡터(viral vector)가 사용되었다. 그러나, 레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 아데노바이러스와의 복합체(adeno-associated virus)와 같은 바이러스성 벡터는 제조과정이 복잡할 뿐만 아니라, 면역원성, 감염 가능성, 염증 유발, 비특이적 DNA의 삽입 등의 안전성 문제와 수용할 수 있는 DNA의 크기가 한정되어 있다는 문제로 인해 인체에 적용하기엔 한계가 많다. 이에 현재는 비바이러스성 벡터(non-viral vector)가 바이러스성 벡터의 대용으로 각광을 받고 있다.

비바이러스성 벡터는 최소한의 면역반응으로 반복 투여할 수 있고, 특정 세포로의 특이적 전달이 가능하며, 저장 안정성이 우수하고, 대량 생산이 용이하다는 장점을 가지고 있다. 이러한 비바이러스성 벡터의 예로는 양이온성 리포좀(liposome) 계열로서 N-[1-(2,3-다이올레일옥시)프로필]-N,N,N-트라이메틸암모늄 클로라이드(DOTMA), 알킬암모늄(alkylammonium), 양이온성 콜레스테롤 유도체(cationic cholesterol derivatives), 그라미시딘(gramicidin) 등이 있다.

최근 비바이러스성 벡터 중 양이온성 고분자가 음전하를 띠는 DNA와 이온결합을 통한 복합체를 형성할 수 있기 때문에 많은 관심을 불러일으키고 있다. 이러한 양이온성 고분자에는 폴리-L-라이신(PLL), 폴리(4-하이드록시-L-프롤린 에스테르), 폴리에틸렌이민(PEI), 폴리[α-(4-아미노부틸)-L-글리콜산], 폴리아미도아민 덴드리머, 폴리[N,N'-(다이메틸아미노)에틸]메타크릴레이트(PDMAEMA) 등이 포함되며, 이들은 DNA를 압축하여 나노입자를 형성함으로써 효소분해로부터 DNA를 보호하고, 빠르게 세포 안으로 침투하여 엔도좀(endosome)에서 빠져나올 수 있도록 도와준다. 대부분의 비바이러스성 벡터는 바이러스성 벡터에 비해 생분해성, 낮은 독성, 비면역원성, 사용상의 간편함 등의 장점을 가지나, 큰 분자량을 갖는 DNA의 낮은 내포율, 상대적으로 낮은 형질도입 효율, 제한적인 입자 크기 등의 문제점을 가지고 있다. 따라서, 기존의 비바이러스성 벡터의 장점은 그대로 유지하면서 형질도입 효율을 증강시킨 유전자 전달체의 개발이 절실히 요구되고 있다.

한편, 키토산은 글루코사민과 N-아세틸글루코사민 잔기로 이루어지는 천연적으로 존재하는 다당류로서, 일반적으로 갑각류 껍질로부터 얻어지는 키틴의 부분적 탈아세틸화에 의해 유도될 수 있다. 키토산은 생체적합성(biocompatible) 및 생분해성(biodegradable)이 우수하고, 비독성이며, 면역 유발성이 낮고, 효소에 의해 쉽게 분해되는 것으로 알려져 있다. 또한, 키토산은 양이온성 다당류이고 다수의 약물전달 용도로, 특히 양전하를 띠는 아민이 음전하를 띠는 핵산과 정전기적 상호작용을 하도록 하여 안정한 복합체를 형성하기 때문에 유전자 전달 시스템에서 널리 사용되어 왔다.

그러나 키토산은 서로 이웃하는 분자가 강한 수소결합에 의해 견고하게 결합되어 있어 물에 녹지 않는 불용성 물질이다. 따라서 키토산은 생리적 pH에서의 용해도 및 완충능(buffering capacity)이 매우 낮아 엔도솜으로부터의 탈출이 어렵기 때문에 형질도입 효율이 매우 낮아 실질적인 응용에 많은 어려움을 가지고 있다. 이에 키토산의 형질도입 효율을 향상시키기 위해, 키토산의 자유 아미노기(free amino group)와의 반응을 이용하여 다양한 키토산 유도체 및 키토산 공중합체를 제조하는 연구가 활발히 진행되고 있다.

이러한 연구의 일환으로 이미다졸 링을 갖는 우로카닌산으로 수식된 키토산 유도체(대한민국 특허공개 제10-2005-0097189호), 만노스기로 수식된 키토산 유도체(대한민국 특허공개 제10-2007-0029982호), 폴리에틸렌이민(PEI)이 수식된 갈락토실화 키토산 공중합체(H-L Jiang 등, Gene Therapy (2007) 14: 1389-1398) 등이 개발되었다. 그러나 우로카니산 또는 만노스기로 수식된 키토산 유도체는 수용성 키토산(water-soluble chitosan)을 사용해야 하는 문제점이 있고, 폴레에틸렌이민-키토산 공중합체는 세포독성이 심하고 생분해되지 않는 폴리에틸렌이민의 사용으로 인해 실제 임상 적용에는 적합하지 않다는 문제점이 있다.

이에 본 발명자들은 유전자 전달체로서 키토산의 형질도입 효율을 향상시키기 위해 예의 연구 노력한 결과, 키토산에 친수성 폴리아민인 스페르민을 중합시킨 키토산-스페르민 그라프트 공중합체가 DNA에 높은 결합능을 나타내고 핵산분해효소로부터 DNA를 효과적으로 보호하며 유전자 전달체로 사용하기에 적합한 구형의 균일한 입자 크기를 가질 뿐만 아니라, 시험관 내 및 생체 내에서 매우 낮은 세포독성을 나타내고 형질도입 효율이 키토산보다 현저히 향상됨을 발견하고, 상기 키토산-스페르민 그라프트 공중합체가 유전자 치료를 위한 유전자 전달체로 유용하게 사용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 유전자 전달체로서 형질도입 효율이 현저히 향상된 키토산-스페르민 그라프트 공중합체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 키토산-스페르민 그라프트 공중합체를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 키토산-스페르민 그라프트 공중합체에 치료 유전자를 결합시킨 유전자 전달 복합체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 유전자 전달 복합체를 유효성분으로 함유하는 유전자 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 하나의 양태로서, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 키토산-스페르민 그라프트 공중합체를 제공한다.

본 발명에서 용어, "키토산(chitosan)"은 하기 화학식 2로 표시되는 D-글루코사민(2-아미노-2-데옥시-D-글루코오스)의 β-(1→4) 중합체로서, 생분해성, 생체적합성, 낮은 세포독성 및 높은 양이온성을 나타내어 비바이러스성 유전자 전달체로 사용되는 물질을 지칭한다.

본 발명에 사용하기에 적합한 키토산은 일반적으로 게, 바다가재, 새우 등과 같은 갑각류의 키틴으로부터 유래하며, 진균류의 키틴으로부터 유래된 키토산도 사용될 수 있다. 또한, 본 발명에 사용하기 위한 키토산은 당업계에 공지된 임의의 기술, 예를 들어 미국특허 제3,533,940호, 제3,862,122호, 제3,922,260호 및 제4,195,175호에 기재된 기술을 사용하여 키틴으로부터 직접 추출하여 사용할 수도 있고, 상업적으로 구매하여 사용할 수도 있다. 본 발명에 적합한 키토산은 생분해성, 생체적합성이 뛰어난 천연 고분자로서 평균 분자량 2 내지 500 kDa를 갖는 것이 바람직하다.

본 발명에서 용어, "스페르민(spermine)"은 하기 화학식 3으로 표시되고 2개의 일차 및 이차 아미노기를 갖는 생물기원 테트라-아민(biogenic tetra-amine)으로, 202.34 g/mol의 몰 질량을 지칭한다. 스페르민은 모든 진핵세포에 자연적으로 존재하며, 특히 단백질 및 핵산 합성이 왕성한 조직에 다량으로 포함되고, 세포대사에 관여하며, DNA 또는 RNA 구조의 안정화, 리보솜과 rRNA 결합의 안정화, 히스톤의 아세틸화 촉진, 비히스톤 단백질의 인산화촉진 등의 생리작용을 나타낸다.

본 발명에서 용어, "그라프트 공중합체(graft polymer)"는 중합체 혹은 공중합체 사슬이 중합 백본에 측쇄로서 화학적으로 결합된 경우에 형성된 거대분자를 지칭하는데, 본 발명에서는 산화에 의해 노출된 키토산의 알데히드기와 스페르민의 아민기 사이의 이민 반응(imine reaction)에 의해 형성된 키토산-스페르민 그라프트 공중합체(CHI-g-SPE)를 의미한다. 본 발명의 키토산-스페르민 그라프트 공중합체는 효과적인 유전자 전달을 위해 50 내지 200 nm의 입자 크기를 갖는 것이 바람직하다. 또한, 본 발명의 키토산-스페르민 그라프트 공중합체는 분자량이 2 내지 30 kDa 범위를 갖는 것이 효과적인 유전자 전달을 위해 바람직하다. 상기 범위의 입자 크기를 가질 때, 본 발명의 키토산-스페르민 그라프트 공중합체는 유전자 전달체로서 세포의 엔도좀(endosome) 내에 효과적으로 유입될 수 있다. 본 발명의 키토산-스페르민 그라프트 공중합체는 키토산과 스페르민이 1:2 내지 1:10의 몰비로 이루어지는 것이 바람직하다.

하나의 양태로서, 본 발명은 키토산과 스페르민 사이의 이민 반응에 의해 공중합체를 형성하는 단계를 포함하는, 키토산-스페르민 그라프트 공중합체의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 제조방법은,

1) 키토산을 과요오드산염으로 처리하여 과요오드산염-산화된 키토산을 제조하는 단계; 및

2) 상기 과요오드산염-산화된 키토산을 스페르민과 반응시켜 키토산-스페르민 그라프트 공중합체를 제조하는 단계를 포함할 수 있다(도 1 참고).

구체적으로, 단계 1)은 키토산과 스페르민 사이의 이민 반응을 위해, 키토산을 과요오드산염(periodate)으로 먼저 처리하여 키토산의 말단기를 알데히드기로 산화시키는 단계이다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는, 키토산과 과요오드산 칼륨을 각각 아세트산 완충액(pH 4.5)에 용해시킨 후 과요오드산 칼륨 용액을 키토산 용액에 서서히 첨가하고 4℃, N₂ 존재 하에서 자성 교반(magnetic stirring) 하에 1 내지 3일간 반응시킨다. 이때, 과요오드산염 산화를 위해 키토산과 과요오드산 칼륨을 1:1 내지 1:5의 몰비로 반응시키는 것이 바람직하다. 반응 종결 후, 반응물을 염화나트륨 용액(pH 4.5)에 대해 3회, 탈이온수(pH 4.5)에 대해 5회 투석(MWCO = 3500)을 수행하여 과요오드산염-산화된 키토산을 분리한다.

단계 2)는 단계 1)에서 제조된 과요오드산염-산화된 키토산을 스페르민과 반응시켜 공중합체를 제조하는 단계로, 과요오드산염 처리에 의해 노출된 키토산의 알데히드기와 스페르민의 아민기 사이에서 이민 반응이 효과적으로 수행되어 키토산-스페르민 그라프트 공중합체가 높은 수율로 합성된다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는, 과요오드산염-산화된 키토산과 스페르민을 1:2 내지 1:10의 몰로 혼합한 후 4℃, 자성 교반 하에서 2 내지 3일간 반응시킨다. 이어서 상기 반응물에 키토산 1 g당 1 내지 2 g의 수소화붕소나트륨(NaBH₄)을 처리한 후 염화나트륨 용액에 대해 투석 (MWCO = 3500)을 수행하여 키토산-스페르민 그라프트 공중합체를 분리한다. 이렇게 분리된 키토산-스페르민 그라프트 공중합체는 동결 건조될 수 있는데, 동결건조는 통상적으로 사용되는 동결건조 방법 또는 동결건조기를 사용하여 수행될 수 있고, 그 결과 부생성물이 제거된 고체 형태의 키토산-스페르민 그라프트 공중합체의 나노입자를 얻을 수 있다.

상기와 같이 제조된 본 발명의 키토산-스페르민 그라프트 공중합체는 2 내지 30 kDa의 분자량을 가지며, ¹H-NMR 분석에 의해 δ = 2.6-2.7 ppm에서 [-NH-CH₂-]의 메틸렌 양성자(methylene proton)에 대한 피크, δ = 1.6-1.7 ppm에서 [-CH₂-]의 스페르민 양성자에 대한 피크, 및 δ = 3.5-4.1 ppm에서 [-CH₂-]의 키토산 양성자에 대한 피크가 검출되어 상기 공중합체가 효과적으로 형성되었음을 확인하였다(도 2 참고). 또한, 키토산은 수 불용성 물질로 산성 조건에서만 용해되지만, 본 발명의 키토산-스페르민 그라프트 공중합체는 공중합된 스페르민의 친수성으로 인해 생리적 pH에서 수용성을 나타냄을 확인하였다. 이로 인해 본 발명의 키토산-스페르민 그라프트 공중합체는 엔도솜으로부터의 탈출이 용이하게 되어 현저히 향상된 형질도입 효율을 나타내는 것으로, 비바이러스성 유전자 전달체로서 이러한 공중합체는 본 발명자들에 의해 최초로 개발된 것이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 상기 키토산-스페르민 그라프트 공중합체에 치료 유전자가 결합된 유전자 전달 복합체를 제공한다. 본 발명의 키토산-스페르민 그라프트 공중합체에 결합될 수 있는 치료 유전자의 종류는 특별히 한정되지 않으며, 본 발명의 목적에 따라 원하는 표적에 전달되어 원하는 치료 효과를 발휘할 수 있는 어떠한 유전자도 본 발명의 범위에 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 키토산-스페르민 그라프트 공중합체와의 복합체 형태로 전달이 가능한 유전자로는 질병과 관련된 치료 유전자의 정상 유전자, 표적 단백질의 발현 억제 유전자, 안티센스 폴리뉴클레오티드를 포함하는 크고 작은 폴리뉴클레오티드, 라이보자임이나 siRNA를 포함하는 임의의 RNA 형태의 유전자도 포함될 수 있다.

본 발명에 따른 유전자 전달 복합체의 효과적인 형성을 위해 치료 유전자와 키토산-스페르민 그라프트 공중합체를 1:1 내지 1:20, 바람직하게는 1:2 내지 1:10의 중량비로 반응시키는 것이 바람직하다. 상기 범위의 중량비로 본 발명의 키토산-스페르민 그라프트 공중합체를 치료 유전자와 반응시키면, 키토산의 양전하를 띠는 아민과 음전하를 띠는 치료 유전자간의 정전기적 상호작용에 의해 안정한 유전자 전달 복합체가 형성된다.

본 발명에 따른 키토산-스페르민 그라프트 공중합체의 치료 유전자에 대한 응축능(condensation capability)을 조사하기 위해 다양한 중량비로 키토산-스페르민 그라프트 공중합체와 DNA를 반응시킨 결과, 이들의 중량비가 5:1 이상인 경우에 상기 그라프트 공중합체와 DNA의 복합체(CHI-g-SPE/DNA)가 가장 효과적으로 형성되고(도 3a 참고), 형성된 복합체가 구형 모양의 압축된 구조를 가짐을 확인하였다(도 3b 참고). 또한, 본 발명에 따른 유전자 전달 복합체는 평균 50 내지 100 nm의 상대적으로 균일한 입자 크기 분포를 나타내어(도 3c 참고) 유전자 전달체로 사용되기에 적합한 입자 크기를 가질 뿐만 아니라, 표면 전하가 양성 제타 전위(zeta potential)를 나타내어(도 3d 참고) 음이온 세포 표면에 효과적으로 결합할 수 있음을 확인하였다.

또한, 본 발명에 따른 유전자 전달 복합체는 핵산분해효소에 의한 공격으로부터 복합체 내 DNA를 효과적으로 보호하여 높은 수준의 유전자 전달을 달성할 수 있으며(도 3e 참고), 고농도(50 ㎍/㎖) 처리에서도 세포 생존율이 높게 나타나 이들이 매우 낮은 세포독성을 가짐을 확인하였다(도 4 참고).

또한, 유전자 전달 복합체의 제조 시 치료 유전자에 대한 키토산-스페르민 그라프트 공중합체의 중량비가 증가할수록 상기 복합체의 형질도입 효율이 증가하고, 키토산 단독에 비해 키토산과 스페르민의 그라프트 공중합체의 형질도입 효율이 훨씬 우수함을 확인하였다(도 5a 참고). 본 발명에 따른 키토산-스페르민 그라프트 공중합체의 이렇게 높은 형질도입 효율은 공중합체 내 높은 아민 함량에 의한 완충 능력(buffering capacity)에 기인한 것으로(도 5b 참고), 이는 본 발명의 키토산-스페르민 그라프트 공중합체가 양성자 스폰지 효과(proton sponge effect)에 의해 엔도솜으로부터 세포질 내로 효과적으로 방출될 수 있음을 나타내는 것이다.

따라서, 본 발명의 키토산-스페르민 그라프트 공중합체는 DNA에 높은 결합능을 나타내고 핵산분해효소로부터 DNA를 효과적으로 보호하며 유전자 전달체로 사용하기에 적합한 구형의 균일한 입자 크기의 유전자 전달 복합체를 형성할 수 있을 뿐만 아니라, 시험관 내 및 생체 내에서 매우 낮은 세포독성을 나타내고 형질도입 효율이 매우 높아 유전자 치료를 위한 유전자 전달체로서 유용하게 사용될 수 있다.

이에 본 발명은, 하나의 양태로서, 상기 키토산-스페르민 그라프트 공중합체에 치료 유전자가 결합된 유전자 전달 복합체를 유효성분으로 함유하는 유전자 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 투여될 수 있으며, 경구 투여 시에는 상기 유효성분 이외에 결합제, 활택제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 추가로 포함할 수 있다. 주사제의 경우에, 본 발명의 약학적 조성물은 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장화제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있다. 또한 국소 투여 시에 본 발명의 조성물은 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물의 제형은 상술한 바와 같이 약학적으로 허용가능한 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여 시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약앰플 또는 다중 투약형태로 제조할 수 있다. 기타 용액, 현탁액, 정제, 환약, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형화할 수 있다.

한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말디톨, 전분, 아카시아, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여가 가능하다. 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 장관, 설하 또는 국소 투여가 가능하다. 이와 같은 임상 투여를 위해 본 발명의 약학적 조성물은 공지의 기술을 이용하여 적합한 제형으로 제제화할 수 있다. 예를 들어, 경구 투여 시에는 불활성 희석제 또는 식용 담체와 혼합하거나, 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐에 밀봉되거나 또는 정제로 압형하여 투여할 수 있다. 경구 투여용의 경우, 유효성분은 부형제와 혼합되어 섭취형 정제, 협측 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 현탁액, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다. 또한, 주사용, 비경구 투여용 등의 각종 제형은 당해 기술 분야의 공지된 기법 또는 통용되는 기법에 따라 제조할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 유효 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하며, 당해 기술 분야의 통상의 전문가에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

하나의 양태로서, 본 발명은 키토산-스페르민 그라프트 공중합체에 치료 유전자가 결합된 유전자 전달 복합체를 에어로졸 전달을 통해 표적 부위에 전달하도록 제제화된 상기 약학적 조성물의 에어로졸 제형을 제공한다.

흡입(inhalation)을 통한 약물 전달은 비침습적(non-invasive) 방법 중 하나로, 특히 폐질환의 광범위한 치료에 에어로졸 전달을 통한 유전자 전달이 유리하게 이용될 수 있다. 이는 폐의 해부학적 구조 및 위치가 즉각적이고 비침습적인 접근을 가능케 하고, 다른 기관에는 영향을 미치지 않으면서 유전자 전달 시스템의 국소 적용을 받을 수 있기 때문이다. 따라서, 본 발명의 키토산-스페르민 그라프트 공중합체에 치료 유전자로서 폐질환, 특히 폐암과 관련된 유전자를 결합시킨 유전자 전달 복합체를 에어로졸 방식으로 폐에 전달하면, 상기 질환의 효과적인 예방 또는 치료를 기대할 수 있다. 특히, 키토산은 점막점착성(mucoadhesive property)을 가지고 있고, 본 발명의 키토산-스페르민 그라프트 공중합체는 시험관 내에서 형질도입 효율이 매우 높은 것으로 확인되었기 때문에, 이는 폐질환의 예방 또는 치료를 위한 새로운 유전자 치료제로서 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

본 발명의 키토산-스페르민 그라프트 공중합체는 DNA에 높은 결합능을 나타내고, 핵산분해효소로부터 DNA를 효과적으로 보호하며, 유전자 전달체로 사용하기에 적합한 구형의 균일한 입자 크기를 갖는 유전자 전달 복합체를 형성할 수 있을 뿐만 아니라, 시험관 내 및 생체 내에서 매우 낮은 세포독성을 나타내고, 형질도입 효율이 매우 높아 유전자 치료를 위한 유전자 전달체로서 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명에 따라 키토산-스페르민 그라프트 공중합체를 제조하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 발명에 따라 제조된 키토산-스페르민 그라프트 공중합체(CHI-g-SPE)의 조성을 ¹H-NMR로 분석한 결과로, δ = 2.6-2.7 ppm에서 [-NH-CH₂-]의 스페르민 양성자에 대한 피크, δ = 1.6-1.7 ppm에서 [-CH₂-]의 스페르민 양성자에 대한 피크, 및 δ = 3.5-4.1 ppm에서 [-CH₂-]의 키토산 양성자에 대한 피크가 검출되어 키토산-스페르민 그라프트 공중합체가 효과적으로 형성되었음을 확인하였다.
도 3a는 본 발명에 따라 키토산-스페르민 그라프트 공중합체(CHI-g-SPE)와 DNA를 다양한 중량비로 반응시켜 제조한 유전자 전달 복합체(CHI-g-SPE/DNA)의 이동성을 아가로스 겔 전기영동으로 분석한 결과이다.
도 3b는 본 발명에 따라 키토산-스페르민 그라프트 공중합체(CHI-g-SPE)와 DNA를 다양한 중량비로 반응시켜 제조한 유전자 전달 복합체(CHI-g-SPE/DNA)의 형태를 에너지 여과 투과 전자현미경(Energy Filtering Transmision Electron Microscopy, EF-TEM)으로 분석한 결과이다.
도 3c는 본 발명에 따라 키토산-스페르민 그라프트 공중합체(CHI-g-SPE)와 DNA를 다양한 중량비로 반응시켜 제조한 유전자 전달 복합체(CHI-g-SPE/DNA)의 입자 크기 분포를 분석한 결과이다.
도 3d는 본 발명에 따라 키토산-스페르민 그라프트 공중합체(CHI-g-SPE)와 DNA를 다양한 중량비로 반응시켜 제조한 유전자 전달 복합체(CHI-g-SPE/DNA)의 표면 전하(n=3, 오차 막대는 표준 편차를 나타냄)를 측정한 결과이다.
도 3e는 본 발명에 따라 키토산-스페르민 그라프트 공중합체(CHI-g-SPE)와 DNA를 5:1의 중량비로 반응시켜 제조한 유전자 전달 복합체(CHI-g-SPE/DNA)가 핵산분해효소로부터 DNA를 효과적으로 보호할 수 있음을 나타내는 결과이다.
도 4는 본 발명에 따른 키토산-스페르민 그라프트 공중합체(CHI-g-SPE)의 세포독성을 다양한 농도에서 다양한 세포(A: A549 세포주; B: WI-38 세포주; C: HepG2 세포주)를 대상으로 조사한 결과이다.
도 5a는 본 발명의 키토산-스페르민 그라프트 공중합체(CHI-g-SPE)와 DNA를 다양한 중량비로 반응시켜 제조한 유전자 전달 복합체(CHI-g-SPE/DNA)의 형질도입 효율을 A549 세포주를 대상으로 조사한 결과이다(평균±SD, n=3). 도면에서 RLU는 'relative light unit'의 약자로 발광 정도를 나타낸다.
도 5b는 본 발명의 키토산-스페르민 그라프트 공중합체(CHI-g-SPE)와 DNA를 10:1의 중량비로 반응시켜 제조한 유전자 전달 복합체(CHI-g-SPE/DNA)의 형질도입 효율에 미치는 바필로마이신(bafilomycin) A1의 효과를 조사한 그래프이다(평균±SD, n=3).
도 6은 본 발명의 키토산-스페르민 그라프트 공중합체(CHI-g-SPE)와 GFP(green fluorescent protein)를 반응시켜 제조한 유전자 전달 복합체(CHI-g-SPE/GFP)를 마우스의 폐에 에어로졸 투여한 후 생체 내 GFP 발현을 분석한 결과이다(배율: 200×, 스케일 바는 50 ㎛를 나타냄).
도 7a는 본 발명의 키토산-스페르민 그라프트 공중합체(CHI-g-SPE)와 GFP를 반응시켜 제조한 유전자 전달 복합체(CHI-g-SPE/GFP)가 에어로졸 투여된 마우스의 폐를 조직병리학적으로 검사한 결과이다(배율: 200×, 스케일 바는 50 ㎛를 나타냄).
도 7b는 본 발명의 키토산-스페르민 그라프트 공중합체(CHI-g-SPE)와 GFP를 반응시켜 제조한 유전자 전달 복합체(CHI-g-SPE/GFP)가 에어로졸 투여된 마우스의 폐를 비롯한 다양한 기관 조직을 조직병리학적으로 검사한 결과이다(배율: 200×, 스케일 바는 50 ㎛를 나타냄).

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는다.

실시예 1: 키토산-스페르민 그라프트 공중합체의 제조

키토산-스페르민 그라프트 공중합체를 제조하기 위해, 키토산(저분자량, 탈아세틸화 수준: 85%, Sigma-Aldrich)(25 mM)과 과요오드산 칼륨(50 mM, Sigma-Aldrich)을 각각 아세트산나트륨 완충액(pH 4.5)에 용해시킨 후, 과요오드산 칼륨 용액을 서서히 키토산 용액에 첨가하고 4℃에서 2일간 자성 교반 하에 반응시켰다. 반응이 종결되면, 반응용액을 투석막(Spectra/Por membrane: MWCO = 3500)을 사용하여 4℃에서 염화나트륨 용액(0.2 M, pH 4.5)에 대해 3회, 증류수(pH 4.5)에 대해 5회 투석을 수행하여 과요오드산염-산화된 키토산을 수득하였다. 수득된 과요오드산염-산화된 키토산 5 mmol에 스페르민(Sigma-Aldrich) 50 mmol을 첨가하고 4℃에서 2일간 자성 교반 하에서 반응시켜 키토산의 카르복실기와 스페르민의 아민기 사이의 이민 반응을 통해 그라프트 공중합체를 제조하였다. 이어서, 반응용액에 수소화붕소나트륨(1 g NaBH₄/g 키토산)을 처리한 후, 투석막(MWCO = 3500)을 사용하여 4℃에서 염화나트륨(0.2 M)에 대해 5회 투석을 수행하고, 증류수에 대해 5회 투석을 수행하여 반응하지 않은 스페르민을 제거하였고, 분리된 키토산-스페르민 그라프트 공중합체(CHI-g-SPE)는 동결 건조하였다.

동결 건조된 키토산-스페르민 그라프트 공중합체(CHI-g-SPE)의 조성을 ¹H-핵자기 공명(¹H-nuclear magnetic resonance, ¹H-NMR)(Avance 600, Bruker, Germany)으로 분석한 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, δ = 2.6-2.7 ppm에서 [-NH-CH₂-]의 메틸렌 양성자(methylene proton)에 대한 피크가, δ = 1.6-1.7 ppm에서 [-CH₂-]의 스페르민 양성자에 대한 피크가, δ = 3.5-4.1 ppm에서 [-CH₂-]의 키토산 양성자에 대한 피크가 검출되어 키토산과 스페르민의 그라프트 공중합체가 효과적으로 형성되었음을 확인하였다. 또한, 겔-투과 크로마토그래피 칼럼(gel-permeation chromatography column, GPC-MALS, Dawn Eos, Wyatt, USA)을 이용해 공중합체의 분자량을 측정한 결과, 본 발명의 키토산-스페르민 그라프트 공중합체(CHI-g-SPE)의 분자량은 15 kDa임을 확인하였다. 일반적으로 키토산은 수 불용성 물질로 산성 조건에서만 용해되지만, 본 발명의 키토산-스페르민 그라프트 공중합체(CHI-g-SPE)는 공중합된 스페르민의 친수성으로 인해 생리적 pH에서도 수용성을 나타내었다.

실시예 2: 키토산-스페르민 그라프트 공중합체/DNA 복합체의 특성 분석

<2-1> 키토산-스페르민 그라프트 공중합체의 DNA 응축능

유전자 전달체의 가장 중요한 특징 중 하나는 플라스미드 DNA와 상호작용하여 이를 응축시킬 수 있는 능력이다. 이에 상기 실시예 1에서 제조된 키토산-스페르민 그라프트 공중합체의 DNA 응축능을 아가로스 겔 전기영동으로 확인하였다. 먼저, 키토산-스페르민 그라프트 공중합체 용액에 플라스미드 DNA(5.3 kb, Promega, Madison, USA)를 0.005, 0.1, 0.5, 1, 5 및 10의 다양한 중량비(weight ratio)로 혼합한 후 가볍게 볼텍싱(vortexing)해주고 실온에서 30분간 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 각 반응용액을 1% 아가로스 겔에 전기영동을 수행하고 자외선 하에서 DNA 이동성을 관찰하였다. 이때, 대조군으로는 키토산-스페르민 그라프트 공중합체와 반응시키지 않은 플라스미드 DNA를 사용하였다.

그 결과, 도 3a에 나타난 바와 같이, 키토산-스페르민 그라프트 공중합체와 플라스미드 DNA가 1:1 이하의 중량비로 반응한 경우에는 DNA 응축으로 인한 지연(retardation) 현상이 야기되지 않은 반면, 이들의 중량비가 5:1 이상인 경우에는 DNA의 이동성이 완전히 지연되었는데, 이는 본 발명의 키토산-스페르민 그라프트 공중합체가 플라스미드 DNA를 효과적으로 응축시켜 유전자 전달 복합체(CHI-g-SPE/DNA)를 형성하였음을 나타내는 것이다. 대조군인 비반응 플라스미드 DNA는 아무런 지연 없이 겔을 통과하여 이동하였는데, 겔 상의 다양하고 뚜렷한 밴드는 수퍼코일드(supercoiled) 및 틈 환형(nicked circular) 형태의 플라스미드 DNA가 존재함을 의미하는 것이다. 상기 결과로부터 유전자 전달 복합체의 효과적인 형성을 위해서는 본 발명의 키토산-스페르민 그라프트 공중합체와 플라스미드 DNA를 5:1 이상의 중량비로 혼합하는 것이 바람직함을 알 수 있다.

<2-2> 키토산-스페르민 그라프트 공중합체/DNA 복합체의 형태학적 분석

상기에서 키토산-스페르민 그라프트 공중합체와 DNA를 5:1의 중량비로 반응시켜 제조한 유전자 전달 복합체(CHI-g-SPE/DNA)의 형태를 EF-TEM(LIBRA 120, Carl Zeiss, Germany)을 이용하여 관찰하였다.

그 결과, 도 3b에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 유전자 전달 복합체(CHI-g-SPE/DNA)는 키토산-스페르민 그라프트 공중합체와 플라스미드 DNA가 효과적으로 응축하여 구형의 압축된 구조를 가지고 있음을 확인하였다.

유전자 전달 복합체의 입자 크기는 복합체가 표적 부위에 접근하고 이를 통과하는 데 중요한 요소로 복합체의 세포 내 유입에 필수적이다. 대부분의 유전자 전달 복합체는 세포 내 이입(endocytosis) 또는 포액작용(pinocytosis)에 의해 세포 내로 유입되기 때문에, 최적의 세포 내 유입을 위해서는 복합체의 크기가 100 nm 이하인 것이 요구된다. 이에 동적 광 산란 분광 광도계(dynamic light scattering spectrophotometer, ELS8000, Otsuka Electronics, Osaka, Japan)를 이용하여 다양한 중량비에서 유전자 전달 복합체의 입자 크기 및 분포도를 측정하였다. 이때, 산란각도(scattering angle)는 90° 및 20°로 설정하였다.

그 결과, 도 3c에 나타난 바와 같이, 중량비 10에서 본 발명의 유전자 전달 복합체는 평균 55.7 nm(PDI: 2.272e-001) 이하의 입자 크기와 상대적으로 균일한 크기의 분포를 나타내어, 세포 내로의 빠른 유입을 위해서는 입자 크기가 100 nm 이하가 되어야 한다는 조건에 잘 부합함을 확인하였다.

<2-3> 키토산- 스페르민 그라프트 공중합체/ DNA 복합체의 표면 전하

또한, 유전자 전달 복합체의 양성 표면 전하는 음이온 세포 표면에 결합하는데 필수적이고, 이는 복합체의 세포내 유입을 용이하게 한다. 이에 키토산-스페르민 그라프트 공중합체와 플라스미드 DNA를 다양한 중량비로 반응시켜 형성된 유전자 전달 복합체의 제타 전위(zeta potential)를 동적 광 산란 분광 광도계(ELS8000, Otsuka Electronics, Osaka, Japan)를 이용하여 측정하였다.

그 결과, 도 3d에 나타난 바와 같이, 키토산-스페르민 그라프트 공중합체와 플라스미드 DNA가 0.1:1의 중량비로 반응한 경우에는 이들 사이의 복합체가 완벽하게 형성되지 않아 음성의 제타 전위를 나타낸 반면, 중량비가 1:1 이상으로 증가함에 따라 복합체는 양성의 제타 전위를 나타내었고 그 값은 급격하게 증가하였다. 이처럼 표면 전하가 양전하를 띤다는 것은 음전하를 띠는 DNA가 유전자 전달 복합체 내부에 완전히 둘러싸여 있음을 의미하고, 양성의 표면 전하는 유전자 전달 복합체의 세포 내로의 유입을 용이하게 할 뿐만 아니라, 입자들 사이에 정전기적 반발력을 일으켜 입자들끼리의 응집현상을 감소시키는 장점이 있다.

<2-4> 키토산- 스페르민 그라프트 공중합체/ DNA 복합체의 DNA 보호효과

효과적인 유전자 발현을 위해서는 핵산분해효소와 같은 효소 공격으로부터 유전자 전달 복합체 내의 DNA가 보호되어야 한다. 이러한 DNA 보호효과를 확인하기 위해, 상기에서 키토산-스페르민 그라프트 공중합체와 DNA를 5:1의 중량비로 반응시켜 제조한 유전자 전달 복합체 용액 4 ㎕ 또는 비반응 플라스미드 DNA 용액 4 ㎕에 DNase I 1 ㎕(2 유닛) 또는 PBS(phosphate-buffered saline) 함유 DNase/Mg^{2 +} 분해 완충액(50 mM TrisCl, pH 7.6 및 10 mM MgCl₂) 1 ㎕를 첨가하고 37℃에서 30분간 100 rpm으로 교반하면서 인큐베이션하였다. 효소 반응을 중지시키기 위해, 모든 반응용액에 4 ㎕의 EDTA(250 mM)를 10분간 처리한 후, 1% 소듐 도데실 설페이트(sodium dodecyl sulfate, pH 7.2)를 혼합하여 최종 부피를 15 ㎕로 맞추고 25℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 반응용액을 트리스-아세테이트-EDTA 완충액(running buffer)을 이용해 1% 아가로스 겔에서 1시간 동안 50 V로 전기영동하였다.

그 결과, 도 3e에 나타난 바와 같이, 대조군인 비반응 플라스미드 DNA는 DNase I에 의해 완전히 분해된 반면, 본 발명의 유전자 전달 복합체 내의 DNA는 DNase I의 분해로부터 효과적으로 보호되었음을 알 수 있다. 이러한 결과는 본 발명의 유전자 전달 복합체가 핵산분해효소의 공격으로부터 DNA를 보호하면서 효과적으로 세포 내로 전달할 수 있음을 나타내는 것이다.

실시예 3: 키토산- 스페르민 그라프트 공중합체의 세포독성

본 발명의 키토산-스페르민 그라프트 공중합체(CHI-g-SPE)의 세포독성을 조사하기 위해, 상기 공중합체의 농도를 달리하면서 세포 증식 분석(Cell Titer 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay)을 수행하여 세포 생존능을 조사하였다.

먼저, A549(인간의 폐 선암종 세포, human lung adenocarcinoma cell, ATCC) 및 WI-38(인간의 폐 섬유아세포, human lung fibroblast cells, ATCC) 세포는 RPMI 1640(Gibco BRL, Paris, France) 배지에, HepG2(인간의 간모세포종, human hepatoblastoma cells, 한국세포주은행) 세포는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle medium, Gibco BRL) 배지에 접종하여 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다. 이때, 모든 배지에는 10%의 우태아혈청(FBS, HyClone, Logan, UT, USA), 100 ㎍/㎖의 스트렙토마이신 및 100 U/㎖의 페니실린을 첨가하였다. 배양된 A549, WI-38 및 HepG2 세포를 1×10⁴ 개/웰의 밀도로 96-웰 플레이트에 접종하고 18시간 동안 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다. 상기 웰 플레이트의 배지를 본 발명의 키토산-스페르민 그라프트 공중합체를 각각 5, 10, 20 및 50 ㎍/㎖의 농도로 함유하는 무혈청 배지로 교체한 후 다시 24시간 동안 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다. 이때, 무처리 세포 배양액을 대조군으로 사용하고, 키토산(저분자량, 탈아세틸화 수준: 85%, Sigma-Aldrich) 및 PEI(polyethylene imine) 25K(25 kDa, Sigma-Aldrich)를 동일한 농도로 처리한 세포 배양액을 비교군으로 사용하였다. 그 후, 웰 플레이트의 배지를 20 ㎕의 세포 역가 측정 시약(Cell Titer 96 Aqueous One Solution Reagent)을 포함하는 성장 배지(growth medium)로 교체하였다. 3시간 동안 배양 후, ELISA 플레이트 판독기(GLR 1000, Genelabs Diagnostics, Singapore)를 사용하여 590 nm에서 웰 플레이트의 흡광도를 측정하여 세포의 대사 활성도(metabolic activity)를 조사하였다.

그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 대조군과 비교하여 본 발명의 키토산-스페르민 그라프트 공중합체(CHI-g-SPE) 및 키토산을 각각 처리한 세포에서는 모두 50 ㎍/㎖의 고농도에서도 세포 생존율이 높게 나타난 반면(A549 세포에서 각각 99.8 및 88.1%; WI-38 세포에서 각각 83.0 및 86.6%; 및 HepG2 세포에서 각각 90.9 및 85.1%), PEI 25K를 처리한 세포의 세포 생존율은 농도가 증가함에 따라 급격하게 감소하였다. 상기 결과로부터 본 발명의 키토산-스페르민 그라프트 공중합체가 키토산과 대등한 수준으로 세포독성이 낮아 생체적합성이 매우 우수함을 확인하였다.

실시예 4: 키토산- 스페르민 그라프트 공중합체의 형질도입 효율

본 발명의 키토산-스페르민 그라프트 공중합체(CHI-g-SPE)의 형질도입 효율을 조사하기 위하여, 시험관 내에서 루시퍼라제 활성 분석(luciferase activity assay)을 수행하였다.

먼저, 24-웰 플레이트에 10% FBS(HyClone, Logan, UT, USA), 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 및 100 U/㎖ 페니실린이 함유된 RPMI 1640(Gibco BRL, Paris, France) 배지를 첨가하고 A549 세포를 1.5×10⁵ 개/웰의 밀도로 접종하여 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 18시간 동안 배양하였다. 아울러, 본 발명의 키토산-스페르민 그라프트 공중합체 용액에 SV40 프로모터 및 인핸서에 의해 발현이 유도되는 루시퍼라제 유전자를 포함하는 플라스미드 pGL3(5.3 kb, Promega, Madison, USA)을 1, 5 및 10의 중량비로 혼합한 후 가볍게 볼텍싱 해주고 실온에서 30분간 인큐베이션하여 유전자 전달 복합체(CHI-g-SPE/GL3)를 제조하였다. 상기 웰 플레이트의 배지를 무혈청 배지 또는 제조된 유전자 전달 복합체(CHI-g-SPE/DNA) 1 ㎍를 함유하는 배지로 교체하고 4시간 동안 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다. 이때, 비교군은 키토산(저분자량, 탈아세틸화 수준: 85%, Sigma-Aldrich)과 pGL3 발현벡터의 유전자 전달 복합체(CHI/pGL3)를 함유하는 배지로 처리하였다. 그 후, 웰 플레이트의 배지를 신선한 10% FBS 함유 DMEM 배지로 교체하고 다시 48시간 동안 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다. 이어서, 배지를 제거한 후, 각 웰에 세포 용해 완충액(cell lysis buffer)을 100 ㎕씩 첨가하고 -20℃에서 24시간 동안 방치한 후 배양액을 이-튜브(e-tube)로 옮겨 담고 10,000 rpm에서 15분간 원심분리를 수행하여 상층액을 수득하였다. 수득된 상층액의 루시퍼라제 활성을 루시퍼라제 분석 키트(luciferase assay kit, Promega)를 사용하여 측정하였다.

그 결과, 도 5a에 나타난 바와 같이, 본 발명의 키토산-스페르민 그라프트 공중합체(CHI-g-SPE)의 형질도입 효율은 이의 중량비가 증가할수록 증가하였고, 가장 높은 키토산의 형질도입 효율(중량비 5)에 비해 약 4.6배 더 높았다. 유전자 전달 복합체의 아민 함량이 높을수록 이의 형질도입 효율이 증가한다고 보고되었는데(K. Wong, 등 Bioconjug . Chem . 17: 152-158, 2006), 이는 높은 아민 함량 및 아민 조성이 유전자 전달 복합체에 높은 완충능(buffering capacity)을 부여하여 상기 복합체가 엔도솜으로부터 더 용이하게 방출될 수 있도록 하기 때문이다.

이에 본 발명에 따른 키토산-스페르민 그라프트 공중합체(CHI-g-SPE)의 형질도입 기작을 규명하기 위해, 상기 공중합체의 완충능을 조사하였다. 상기와 같이 웰 플레이트에서 배양된 A549 세포에 DMSO에 희석된 바필로마이신 A1(bafilomycin A1, specific inhibitor of vacuolar type H+ ATPase, 200 nM)을 첨가하여 10분간 배양한 후, 상기와 동일한 방법으로 형질도입 효율을 측정하였다.

그 결과, 도 5b에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 키토산-스페르민 그라프트 공중합체(CHI-g-SPE)의 형질도입 효율은 바필로마이신 A1 처리 후 급격하게 감소하였는데, 이는 본 발명의 키토산-스페르민 그라프트 공중합체(CHI-g-SPE)가 높은 완충능을 가지고 있으며, 따라서 양성자 스폰지 효과(proton sponge effect)에 의해 엔도솜으로부터 신속하게 방출되어 세포질 내로 유입될 수 있음을 나타내는 것이다.

실시예 5: 키토산- 스페르민 그라프트 공중합체의 생체 내 에어로졸 전달

본 발명에 따른 키토산-스페르민 그라프트 공중합체의 에어로졸에 의한 생체 내 전달효율을 확인하기 위하여 하기 실험을 수행하였다.

먼저, 상기 실시예 2에 기재된 방법에 따라 키토산-스페르민 그라프트 공중합체와 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein)을 발현하는 플라스미드 pcDNA3.1/CT-GFP(6.1 kb, Invitrogen, CA, USA)를 10:1의 중량비로 혼합하여 유전자 전달 복합체(CHI-g-SPE/GFP)를 제조하였다. 이때, 비교군으로 키토산과 GFP의 유전자 전달 복합체(CHI/GFP)를 제조하였다.

17주령의 웅성 C57BL 마우스(중앙실험동물)를 온도 23±2℃ 및 상대습도 50±20%에서 12시간 밤/낮 주기를 유지하여 실험실 동물시설에 보관하였다. 본 연구의 모든 실험 절차는 서울대학교의 동물보호 및 사용위원회(Animal Care and Use Committee at Seoul National University, SNU-100415-1)에 의해 승인되었다. 에어로졸을 통한 유전자 전달 효율성을 확인하기 위해 마우스의 코 부위만 노출시키는 챔버(NOEC; Dusturbo, Seoul, Korea)를 사용하였고, 20마리의 마우스를 다음과 같이 무작위로 5개 군(각 군당 4마리)으로 나누었다: 비처리 대조군; GFP 처리군(키토산-스페르민 그라프트 공중합체 부재); 키토산-스페르민 그라프트 공중합체(CHI-g-SPE) 단독 처리군(GFP 부재); 키토산-스페르민 그라프트 공중합체와 GFP 복합체(CHI-g-SPE/GFP) 처리군; 및 키토산과 GFP 복합체(CHI/GFP) 처리군. 상기 각 군의 마우스에 1 mg의 DNA가 전달되도록 문헌에 사용된 방법에 근거하여 에어로졸에 노출시켰다(H.L. Jiang, 등 Biomaterials 30: 5844-5852, 2009).

에어로졸 노출 48시간 후에, 각 군의 마우스를 희생시키고 폐를 적출하였다. 적출된 폐를 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)에 담가 12시간 동안 고정시킨 후 30% 수크로스 용액에 담가 4℃에서 48시간 동안 보관하였다. 고정된 폐를 -20℃ 이하의 온도에서 OCT 화합물(Sakura, Torrance, CA, USA)로 포매(embedding)한 후 마이크로톰(microtome)으로 절단하여 10 ㎛ 두께의 폐 조직 절편을 제조하였다. 조직병리학적 분석을 위해, 준비된 폐 조직 절편을 해마톡실린과 에오신(H&E)으로 염색한 후 공초점 현미경(confocal microscope, Zeiss LSM510, Carl Zeiss)으로 GFP 신호를 관찰하였다. 아울러, 독성 검사를 위하여, 각 군의 마우스로부터 적출된 뇌, 폐, 심장, 간, 신장, 비장 및 고환 조직을 10% 중성 포르말린(neutral formalin)으로 고정시키고 3 ㎛ 두께의 파라핀 절편을 제조한 후 H&E 염색하여 공초점 현미경(Zeiss LSM510, Carl Zeiss)으로 관찰하였다.

그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 비처리 대조군과 키토산-스페르민 그라프트 공중합체(CHI-g-SPE) 단독 처리군(GFP 부재)에서는 GFP 신호가 검출되지 않았고, GFP 처리군(키토산-스페르민 그라프트 공중합체 부재)에서는 매우 미약한 GFP 신호가 검출된 반면, 본 발명의 키토산-스페르민 그라프트 공중합체와 GFP의 복합체(CHI-g-SPE/GFP) 처리군 및 키토산과 GFP의 복합체(CHI/GFP) 처리군에서는 강한 GFP 신호가 검출되었다. 특히, 본 발명의 키토산-스페르민 그라프트 공중합체와 GFP의 복합체(CHI-g-SPE/GFP) 처리군에서 검출된 GFP 신호는 키토산과 GFP의 복합체(CHI/GFP) 처리군에서 검출된 GFP 신호보다 현저하게 강하여 에어로졸 전달 효율이 매우 우수함을 알 수 있다.

폐의 조직병리학적 검사 결과, 도 7a에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 키토산-스페르민 그라프트 공중합체를 이용한 에어로졸 전달 시 폐에 어떠한 병리학적 이상도 발생하지 않음을 확인하였다. 구체적으로, 폐포 벽(alveolar wall)에서 1개 또는 2개의 폐포세포 유형 I 단층과 10% 미만의 폐포세포 유형 II 단층을 나타내었고, 어떠한 괴사, 퇴행, 화생(metaplasia), 역형성(anaplasia)도 폐포세포, 무기폐(atelectasis) 또는 폐기종(emphysema)에서 확인되지 않았다. 또한, 폐포 벽에서는 비대성(enlarged) 모세혈관, 울혈(congestion) 및 출혈(hemorrhage)이 관찰되지 않았고, 손상된 혈관내피세포가 드물게 관찰되었으나 정상 범위에 속하며, 약간의 폐포 대식세포(alveolar macrophage)가 관찰되었고, 염증세포의 침윤(infiltration) 및 삼출(exudate)은 관찰되지 않았다. 또한, 도 7b에 나타난 바와 같이, 폐를 비롯한 뇌, 심장, 폐, 간, 신장, 비장, 고환 등의 주요 기관에서도 아무런 병리학적 이상이 발견되지 않아, 본 발명에 따른 키토산-스페르민 그라프트 공중합체를 이용한 에어로졸 전달에 의해서 독성이 유발되지 않음을 확인하였다.

Claims (13)

1. 하기 화학식 1로 표시되는 키토산-스페르민 그라프트 공중합체:
   <화학식 1>
   

   
2. 제1항에 있어서, 상기 키토산이 2 내지 500 kDa의 분자량을 갖는 것인 키토산-스페르민 그라프트 공중합체.
3. 제1항에 있어서, 상기 키토산과 스페르민이 1:2 내지 1:10의 몰비로 이루어지는 것인 키토산-스페르민 그라프트 공중합체.
4. 제1항에 있어서, 상기 공중합체의 평균 입자 크기가 50 내지 200 nm 범위인 것인 키토산-스페르민 그라프트 공중합체.
5. 제1항에 있어서, 상기 공중합체의 분자량이 2 내지 30 kDa 범위인 것인 키토산-스페르민 그라프트 공중합체.
6. 1) 키토산을 과요오드산염으로 처리하여 과요오드산염-산화된 키토산을 제조하는 단계; 및
   2) 상기 과요오드산염-산화된 키토산을 스페르민과 반응시키는 단계를 포함하는, 제1항의 키토산-스페르민 그라프트 공중합체를 제조하는 방법.
7. 제6항에 있어서, 상기 단계 1)에서 키토산과 과요오드산염을 1:1 내지 1:5의 몰비로 반응시키는 것인 방법.
8. 제6항에 있어서, 상기 단계 2)에서 과요오드산염-산화된 키토산과 스페르민을 1:2 내지 1:10의 몰비로 반응시키는 것인 방법.
9. 제6항에 있어서, 상기 단계 2)에서 과요오드산염-산화된 키토산과 스페르민 사이의 이민 반응에 의해 키토산-스페르민 그라프트 공중합체가 형성되는 것인 방법.
10. 제1항의 키토산-스페르민 그라프트 공중합체에 치료 유전자가 결합된 유전자 전달 복합체.
11. 제10항에 있어서, 상기 치료 유전자와 키토산-스페르민 그라프트 공중합체가 1:1 내지 1:20의 중량비로 결합되는 것인 유전자 전달 복합체.
12. 제10항의 유전자 전달 복합체를 유효성분으로 포함하는 유전자 치료용 약학적 조성물.
13. 제12항에 있어서, 상기 유전자 전달 복합체가 에어로졸 전달에 의해 표적 부위에 전달되도록 제형화된 약학적 조성물.

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