JP6004499B2

JP6004499B2 - クロマチン構造を制御する組成物

Info

Publication number: JP6004499B2
Application number: JP2014512738A
Authority: JP
Inventors: 浩良川上; 章一郎朝山; 健一硲; 祐太朗浅羽; 太甫野口
Original assignee: Tokyo Metropolitan University
Current assignee: Tokyo Metropolitan University
Priority date: 2012-04-24
Filing date: 2013-04-24
Publication date: 2016-10-12
Anticipated expiration: 2033-04-24
Also published as: JPWO2013162054A1; WO2013162054A1

Description

本発明は、クロマチン構造を制御するための組成物及び、当該組成物を用いたクロマチン構造の制御方法に関する。

エピジェネティクス
細胞の働きを調節するタンパク質の発現には、遺伝子の転写・翻訳が関わっており（ジェネティクス）、遺伝子の転写・翻訳の調節にはエピジェネティクスが寄与している。さらにエピジェネティクスは、タンパク質により制御されていることから、生命機能に関わるジェネティクス−エピジェネティクス−タンパク質の統合的調節機構は、生命現象の中心的役割を担っていると考えられる。

ひとつの受精卵が増殖分化することで、組織・器官そしてひとつの個体を形成する過程が発生であり、その後、個体は成長し、時間経過とともに老化し、時には癌や生活習慣病などの病気を患うこともある。しかし、細胞や組織の異常が起こっても、自然治癒又は医療を受けることで再生されることがある。また、個体は生殖細胞を通して次の世代にゲノムを伝える遺伝現象がある。これらは、基本的に、同じゲノムをもつ細胞が性質の異なる細胞に変化するというエピジェネティックな生命現象であると理解することができる。

多種多様の細胞の個性はその細胞の遺伝子発現のパターンで決められると考えられている。ゲノム上の総遺伝子数を３万個とすると、ひとつの分化細胞では、約１万個の遺伝子が発現し、残りの遺伝子は不活性化されている。つまり、ゲノム上の遺伝子を選択的に活用することによって、細胞個性がエピジェネティックに確立・維持・消去されることを意味している。

エピジェネティクスの制御システムには、ＤＮＡのメチル化、クロマチン、タンパク質の修飾・脱修飾、転写調節因子が遺伝子制御に重要な役割を果たしている。現在までに、ＤＮＡメチル化酵素、メチル化ＤＮＡ結合タンパク質、ヒストン修飾酵素、クロマチン構造因子、クロマチンリモデリング因子、クロマチンインスレーター（クロマチンの境界）等の新しい分子群や機能的な複合体が相次いで発見されている。これらのエピジェネティクス機構によって、遺伝子制御とクロマチン構造の形成がなされるのである。さらに、ゲノム上の個々の遺伝子は、組織特異的に、分化特異的に、状況特異的に発現していることは、遺伝子が独立して制御される仕組みがあることを示している。

クロマチン構造
真核生物の染色体ＤＮＡはクロマチンとよばれる高次構造をとっている。クロマチンは、ヌクレオソームの繰り返し構造がらせん状につながったものである。ヌクレオソーム同士はヒストンに巻きついていないリンカーＤＮＡを介してつながっており、さらにパックされた３０ｎｍクロマチンファイバーとなる。ヌクレオソームは、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、Ｈ４ヒストンタンパク質が２分子からなるヒストンオクタマーに１４６塩基対のＤＮＡが約２回巻きついた構造をとっている。例えば、ヒトの１個の細胞にあるＤＮＡを引き伸ばすと、約１．８ｍにもなり、このＤＮＡはヒストンタンパク質に巻き付いてクロマチン構造をつくっている。クロマチンが凝縮して、細胞の核の中に収納されている。高度に凝縮したクロマチンは、ヘテロクロマチンと呼ばれている。

遺伝子が活性化される、即ちオンになるには、このような凝縮したクロマチン構造が緩み、ヒストンが外れたり位置がずれたりしてＤＮＡの二重らせんがほどかれる必要がある。ほどかれることにより、遺伝子の塩基配列が転写されて、ＲＮＡとして読み取られる状態になる。

ヒストンタンパク質に、アセチル基やメチル基などさまざまな化学物質が付く修飾が行われていることが知られているが、その役割は分からず、あまり注目されていなかった。近年、ヒストンの特定の場所にアセチル基が付くと、クロマチン構造が緩み、遺伝子がオンになり得る状態になることが示された。ヒストンのメチル化と、メチル基を認識してヘテロクロマチンが形成される過程については、その過程で複雑な仕組みが働いていることが発見されている。分裂酵母のＨＰ１タンパク質には、少しだけ形が異なった２種類のものが知られている。一方はヘテロクロマチン化を促進させ、もう一方は逆にヘテロクロマチン化を抑制する機能を有する。機能が正反対の２種類のＨＰ１が、ある一定のバランスで集まらないと、ヘテロクロマチンが形成・維持されないことが見出されている。なぜこのような複雑な仕組みが必要なのか、明らかにされていない。

ヒトのような高等生物では、ヒストンではなくＤＮＡを直接メチル化することで遺伝子を強く抑え込む仕組みも存在する。このＤＮＡメチル化もヒストン修飾と密接に関連していることが分かってきた。

ヒストン修飾
ヒストンはリジンやアルギニンなどの塩基性アミノ酸を多数持つタンパク質で、アニオン性であるＤＮＡと堅く結合している。ヒストンのＮ末端はヒストンテールとよばれ、ヌクレオソームコアから少し離れて存在している。ヒストンは主にこのＮ末端の部分で様々な修飾を受ける。

近年、転写誘導の際に、ヒストン修飾によるクロマチン構造変化が重要な働きをすることが知られてきている。まず、ＤＮＡ結合性転写活性化因子が、標的遺伝子に結合すると、ＰＣＡＦやＣＢＰ／ｐ３００などの転写コアクチベーターがリクルートされる。転写コアクチベーターはヒストンアセチル化酵素（ＨｉｓｔｏｎｅＡｃｅｔｙｌＴｒａｎｓｆｅｒａｓｅ：ＨＡＴ）活性をもっており、周辺のヒストンをアセチル化する。これが引き金となり、クロマチンリモデリング因子がリクルートされ、クロマチンのリモデリングが誘導され、基本転写因子とＲＮＡポリメラーゼによる転写が開始する。特に、転写誘導とよく相関するアセチル化として、ヒストンＨ３Ｋ９とＫ１４のアセチル化が知られている。ヒストンのリジン残基のアミノ基がアセチル化されると、アミノ基の正電荷が中和され、ヌクレオソーム間の相互作用が緩むと考えられている。さらに、ヒストンはアセチル化以外にもメチル化やリン酸化などの修飾を受け、転写の制御・サイレンシング・クロマチン凝縮などを引き起こすことが知られている。

ヒストンを修飾する酵素としては、上述したＨＡＴ以外に脱アセチル化を触媒とするヒストン脱アセチル化酵素（ＨｉｓｔｏｎｅＤｅＡｃｅｔｙｌａｓｅ：ＨＤＡＣ）がある。細胞内ではＨＤＡＣの活性が優位であり、クロマチンは通常脱アセチル化状態に保たれており、転写因子の働きで必要な時だけアセチル化され、開くと考えられる。

ヒストンのメチル化は、ヒストンメチル化酵素（ＨｉｓｔｏｎｅＭｅｔｈｙｌＴｒａｎｓｆｅｒａｓｅ：ＨＭＴ）によって誘導される。現在、よく解析されているのはヒストンＨ３Ｋ９のメチル化である。メチル化されたＫ９をＨＰ１（ＨｅｔｅｒｏｃｈｒｏｍａｔｉｎＰｒｏｔｅｉｎ１）が認識して結合する。ＨＰ１はＤＮＡメチル化酵素やＨＤＡＣをリクルートし、また、ＨＰ１同士が集合化することにより、周辺クロマチン領域を閉じた状態に変換する。このような機構により、遺伝子座のサイレンシングが起こることが知られている。一方、ヒストンＨ３Ｋ４のメチル化は、反対に、転写の活性化と相関することが知られている。

一般に、メチル化反応とは逆の脱メチル化反応は非常に起こりにくいと考えられていたが、近年ヒストンの脱メチル化酵素も報告された。

ＤＮＡメチル化
真核生物ゲノムＤＮＡのメチル化修飾は遺伝情報の発現を制御する機構として進化を遂げてきた。ゲノムＤＮＡのメチル化はエピジェネティックな要因の一つであるが、その状態は塩基配列を新たにメチル化して模様を描く、細胞が増殖する過程で維持する、必要に応じて消去するという過程の総和として決定される。特にＤＮＡのメチル化修飾に関わるＤＮＡメチルトランスフェラーゼとその相同分子としてこれまで５つの遺伝子が報告されている（Ｄｎｍｔ１、Ｄｎｍｔ２、Ｄｎｍｔ３ａ、Ｄｎｍｔ３ｂ、Ｄｎｍｔ３Ｌ）。しかし、ゲノムのどの領域がどのように認識されてメチル化されるのかについては、これからの解決されるべき問題が多く残されている。

ＤＮＡのメチル化修飾は、遺伝子の実体である塩基配列を変えることなく、すなわち、遺伝子のコードするアミノ酸配列情報を変えることなくその発現を制御する。また、いったん付けられたゲノム上のメチル化模様は安定に次世代の細胞に受け継がれる。一方でメチル化修飾は必要に応じてはずされる可逆性ももっている。遺伝情報の発現制御機構を理解するうえで、ゲノムＤＮＡのメチル化がどのように調節されているのかを理解することは重要である。

真核生物では一部の生物の例外を除いてゲノムＤＮＡのシトシン塩基（Ｃ）の５位がメチル化修飾をうける。動物では脊椎動物に進化を遂げたときゲノムの塩基量が増加したのと時を同じくしてゲノム中のシトシンメチル化修飾の程度が増えた。脊椎動物のゲノムＤＮＡのメチル化はシトシン塩基の次にグアニン塩基が続くＣｐＧ配列中のシトシン塩基に付加される。マウスのゲノムＤＮＡではＣｐＧ配列の約８０％がメチル化修飾を受けている。このメチル基はＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニンからＤＮＡメチルトランスフェラーゼの働きで転移される。

マウスのゲノムを俯瞰してみると、Ｇ＋Ｃ含量が相対的に高い領域が島状に散在しこれをＣｐＧアイランドと呼ぶが、多くの場合、ハウスキーピング遺伝子のプロモーターとなっていて低メチル化状態にある。一般に、転写されている遺伝子のプロモーター領域は低メチル化状態にあり、不活性な遺伝子は高度にメチル化されている。プロモーター領域に存在する転写因子の結合モチーフがメチル化されると、Ｓｐ１など一部の転写因子を除いてほとんどの転写因子はＤＮＡに結合できなくなる。また、メチル化されたＤＮＡを特異的に認識して結合するタンパク質が存在し、このメチル化ＤＮＡ結合タンパク質とヒストン修飾を介して転写が阻害される。ＤＮＡメチル化は長期的に遺伝子をサイレンシングするための一種の記憶として機能している。

メチル化されたＤＮＡを特異的に認識して結合するタンパク質の多くはヒストン脱アセチル化酵素を含む転写抑制複合体の一員か、あるいはこれら複合体と結合して、最終的にはヒストンを脱アセチル化、メチル化することにより転写を抑制する。ＤＮＡメチル化とヒストン修飾には密接な関係が存在することは確かであるが、お互いの間の相互作用に関わる分子機構についてはわからないことがまだまだ多く、解決されるべき重要課題である。

以上、クロマチン構造変化の制御はヒストン又はＤＮＡの修飾が関与していると考えられているが詳細は明らかではない。クロマチン構造を人為的に制御するための手段も確立していない。

ＴｈｅＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆ＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ４１（２００９）１９９−２１３ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄＲｅｌｅａｓｅ９７（２００４）３４５−３５６

本願発明は、クロマチン構造を人為的に制御する方法及び当該方法に使用するための組成物を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記問題解決のため鋭意研究に努めた結果、特定の高分子、あるいは、ヒストンのアセチル化若しくはメチル化を制御する２種類以上の物質を含む担体の投与により、クロマチン構造が制御されることを見出し、本願発明を想到した。

本発明は、好ましい態様として以下の態様を含む。
［態様１］以下の

１）両性高分子、アニオン性高分子、及び非イオン性高分子からなる群から選択される、高分子であって、以下のいずれかの主鎖骨格を有する高分子；

あるいは、
２）
ｉ）ヒストンアセチル化酵素をコードする遺伝子を含む発現ベクター；
ｉｉ）ヒストンメチル化酵素をコードする遺伝子を含む発現ベクター；
ｉｉｉ）ヒストン脱アセチル化酵素をコードする遺伝子を含む発現ベクター；
ｉｖ）ヒストン脱メチル化酵素をコードする遺伝子を含む発現ベクター；
ｖ）ヒストンアセチル化阻害剤；
ｖｉ）ヒストン脱アセチル化阻害剤；
ｖｉｉ）ヒストンメチル化阻害剤；及び
ｖｉｉｉ）ヒストン脱メチル化阻害剤
からなるグループから選択される、２種類またはそれ以上の物質を包摂する担体を含む、クロマチン構造を制御するための組成物。
［態様２］

クロマチン構造を弛緩するための、態様１に記載の組成物。
［態様３］

高分子が、
ａ）カルボキシメチル化ポリビニルイミダゾール、
ｂ）ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリグルタミン酸、カルボキシルメチル化ポリヒスチジン、若しくはポリアスパラギン酸、又は
ｃ）ＰＥＧ又は糖鎖
あるいは、これらのブロック共重合体、グラフト共重合体、又はデンドリマー体、から選択される、態様１又は２に記載の高分子。
［態様４］

高分子の分子量が、１０，０００−２，０００，０００である、態様１−３のいずれか１項に記載の組成物。
［態様５］

担体が、ポリエステル、リン酸カルシウム、又はポリアミノ酸を含む、態様１−４のいずれか１項に記載の組成物。
［態様６］

担体が、さらに、ＤＮＡ脱メチル化酵素をコードする遺伝子を含む発現ベクター、ＤＮＡメチル化酵素をコードする遺伝子を含む発現ベクター、あるいは、ＤＮＡメチル化酵素阻害剤、を含む、態様１−５のいずれか１項に記載の組成物。
［態様７］

態様１−６のいずれか１項に記載の組成物をｉｎｖｉｔｒｏ、ｅｘｖｉｖｏ又はｉｎｖｉｖｏで投与することにより、クロマチン構造を制御する方法。

本発明により、クロマチン構造を人為的に制御することが可能になった。これにより、遺伝子の塩基配列を操作することなく、より容易にその発現の制御が可能となる。

［図１］図１は、人工クロマチンモデル（ＤＮＡ／コアヒストン複合体）の形成をアガロース電気泳動で調べた結果を示す。
［図２］図２は、高分子によるクロマチン構造の弛緩効果を、アガロース電気泳動後の蛍光強度で調べた結果を示す。
［図３］図３は、高分子ＰＡＡによるクロマチン構造の弛緩効果について、翻訳活性を調べた結果を示す。
［図４］図４は、高分子ＣＭ−ＰＶＩｍ及びＰＭＡＡによるクロマチン構造の弛緩効果について、翻訳活性を調べた結果を示す。
［図５］図５は、本発明のリン酸カルシウム複合体中のコエンザイムＡ（ＣｏＡ）の含有量を示す。
［図６］図６は、本発明のリン酸カルシウム複合体を用いた場合の、各ヒストンにおけるアセチルリジン量の変化をウエスタンブロットで調べた結果を示す。
ＣａＰ：カルシウムリン酸複合体；
ＣｏＡ：コエンザイムＡ
ＳＩＲＴ２：ＳＩＲＴ２遺伝子を含むプラスミドＤＮＡ
ＤＮＡ：プラスミドＤＮＡ
ＡＡ：アナカルジン酸
［図７Ａ］図７は、実施例１２の共焦点顕微鏡観察の結果を。図７Ａ−Ｄは各々、（Ａ）細胞核を染色したＤＡＰＩによる蛍光像、（Ｂ）ＦＩＴＣラベル化ＰＬＤ−ＥＤＡ−β−ＣＤによる蛍光像、（Ｃ）微分干渉像、そして、（Ｄ）Ａ−Ｃの画像を結合させたものである。
［図７Ｂ］図７は、実施例１２の共焦点顕微鏡観察の結果を。図７Ａ−Ｄは各々、（Ａ）細胞核を染色したＤＡＰＩによる蛍光像、（Ｂ）ＦＩＴＣラベル化ＰＬＤ−ＥＤＡ−β−ＣＤによる蛍光像、（Ｃ）微分干渉像、そして、（Ｄ）Ａ−Ｃの画像を結合させたものである。
［図７Ｃ］図７は、実施例１２の共焦点顕微鏡観察の結果を。図７Ａ−Ｄは各々、（Ａ）細胞核を染色したＤＡＰＩによる蛍光像、（Ｂ）ＦＩＴＣラベル化ＰＬＤ−ＥＤＡ−β−ＣＤによる蛍光像、（Ｃ）微分干渉像、そして、（Ｄ）Ａ−Ｃの画像を結合させたものである。
［図７Ｄ］図７は、実施例１２の共焦点顕微鏡観察の結果を。図７Ａ−Ｄは各々、（Ａ）細胞核を染色したＤＡＰＩによる蛍光像、（Ｂ）ＦＩＴＣラベル化ＰＬＤ−ＥＤＡ−β−ＣＤによる蛍光像、（Ｃ）微分干渉像、そして、（Ｄ）Ａ−Ｃの画像を結合させたものである。

本発明は、クロマチン構造を制御するための組成物、及び当該組成物を用いたクロマチンを制御する方法に関する。

本願発明の組成物は、
１）両性高分子、アニオン性高分子、及び非イオン性高分子からなる群から選択される、高分子であって、以下のいずれかの主鎖骨格を有する高分子；

あるいは、
２）
ｉ）ヒストンアセチル化酵素をコードする遺伝子を含む発現ベクター；
ｉｉ）ヒストンメチル化酵素をコードする遺伝子を含む発現ベクター；
ｉｉｉ）ヒストン脱アセチル化酵素をコードする遺伝子を含む発現ベクター；
ｉｖ）ヒストン脱メチル化酵素をコードする遺伝子を含む発現ベクター；
ｖ）ヒストンアセチル化阻害剤；
ｖｉ）ヒストン脱アセチル化阻害剤；
ｖｉｉ）ヒストンメチル化阻害剤；及び
ｖｉｉｉ）ヒストン脱メチル化阻害剤
からなるグループから選択される、２種類またはそれ以上の物質を包摂する担体を含む。

１．両性高分子、アニオン性高分子、及び非イオン性高分子からなる群から選択される、高分子
本願発明の高分子は、両性高分子、アニオン性高分子、及び非イオン性高分子からなる群から選択される。

本発明の高分子は、以下のいずれかの主鎖骨格の繰り返し構造を有する。

特に好ましい骨格構造は、−（ＣＨ_２−ＣＨ）−である。生体への適用性から、以下の骨格構造

も有用である。

主鎖骨格の繰り返し数は特に限定されない。骨格構造、側鎖構造等に応じて適宜決定される。

「両性高分子」とは、側鎖にアニオン性基とカチオン性基の双方の置換基を有し、全体では中性である高分子、あるいは、側鎖にアニオン性部分とカチオン性部分の双方を有する置換基を有し、全体では中性である高分子である。両性高分子は、一分子内にアニオン性部分とカチオン性部分の双方を有するため、双方の特徴を有する。また、アニオンとカチオンの電荷のバランスがとれることにより、非イオン性（生体適合性の付与）の特徴も有しうる。両性高分子に含まれるアニオン性部分とカチオン性部分の種類は各々１種類ずつであっても、複数種類含んでもよい。

両性高分子中の側鎖としての「アニオン性基」は、例えば、以下のような構造を有しうる。

Ａは、アニオン性部分と主鎖部分を結合するリンカー部分である。リンカー部分は、枝分かれしていてもよい、炭素数１−１０、好ましくは炭素数１−５、より好ましくは炭素数１のアルキル基；炭素環、好ましくは炭素数５−７の炭素環、より好ましくは６員環；あるいは、窒素、酸素若しくは硫黄を含む複素環、好ましくは５−７員の複素環、より好ましくは５員の複素環である。アルキル基、炭素環又は複素環は、所望により１ないし複数のアルキル基、アリール基、ハロゲン基、各種アニオン性基等により置換されていてもよい。例えば、炭素環、複素環等の環が、−ＣＯＯＨ等のアニオン性基で置換された態様も含む。

一態様として、リンカーはエチル基、イミダゾリル基、あるいは、その他の４級窒素を有する官能基から選択される。

両性高分子中の側鎖としての「カチオン性基」には、以下のような態様が含まれる。

［上記式中、Ａは、アニオン性基で定義した通りのリンカーであり；
Ｒ_１、Ｒ_２及びＲ_３は、枝分かれしていてもよい、炭素数１−１０、好ましくは炭素数１−５のアルキル基である］

「側鎖のアニオン性部分とカチオン性部分の双方を有する置換基」は、例えば、以下のような態様が含まれる。

一例として、窒素を含む複素環、例えば、イミダゾ−ル基の１つの窒素原子が主鎖結合し、もう一方の窒素原子がアニオン性基で置換されている態様を含む。アニオン性基は、上述したものから適宜選択しうる。両性高分子中の、窒素原子のアニオン性置換基の一態様は、カルボキシメチル基である。

両性高分子は、一態様として、カルボキシメチル化ポリビニルイミダゾールを含む。

「アニオン性高分子」は、側鎖にアニオン性基を有する高分子である。アニオン性高分子中の「アニオン性基」は、両性高分子に関して上述したアニオン性基から適宜選択しうる。

アニオン性基は一態様として、カルボキシル基、カルボキシ基、リン酸基、スルホン酸基、硝酸基、ボロン酸基を含む。

アニオン性高分子は一態様として、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリグルタミン酸、カルボキシルメチル化ポリヒスチジン、又はポリアスパラギン酸を含む。

なお、アニオン性高分子を用いる場合、アニオン性高分子中の主鎖骨格と側鎖の置換基の反発を防ぐためにスペーサーを含んでもよい。スペーサーとしては、アニオン性基を持たない、若しくは大きな疎水基を持たない、という性質を有するものであれば特に限定されない、例えば、ポリエチレンジアミン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などが使用されうる。

「非イオン性高分子」は、アニオン性部分、カチオン性部分のいずれも有しない高分子である。非イオン性高分子も、水素結合性、あるいは疎水結合性を有する、という条件を満たすものであれば、クロマチンに作用し、クロマチンの構造を制御しうる。非イオン性高分子は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、糖鎖など水素結合性を有する高分子等が含まれる。

本願発明の組成物に含まれる高分子は、上記特定した両性高分子、アニオン性高分子、又は非イオン性高分子の、ブロック共重合体、グラフト共重合体、又はデンドリマー体であってもよい。「ブロック共重合体」は、２種類以上の高分子が共有結合でつながり長い連鎖になった分子構造の共重合体を意味する。「グラフト共重合体」は、ある高分子に、別種の高分子が枝状に結合した分子構造の共重合体を意味する。「デンドリマー体」は、中心から規則的に分岐した構造を有する樹状の高分子を意味する。デンドリマー体は、コアと呼ばれる中心分子とデンドロンと呼ばれる側鎖部分から構成される。

本発明の高分子量は、特に限定されないが、好ましくは１０，０００−２，０００，０００、より好ましくは、２５，０００−１，０００，０００である。

限定されるわけではないが、本発明で利用する高分子にシクロデキストリン、Ｍｅβシクロデキストリン等のシクロデキストリン誘導体などを結合させるとさらに好ましい。

なお、追加成分として、カチオン性高分子を、両性高分子、アニオン性高分子、又は非イオン性高分子、あるいは、担体とともに用いてもよい。「カチオン性高分子」は、側鎖にカチオン性基を有する高分子である。カチオン性高分子中の「カチオン性基」は、両性高分子に関して上述したカチオン性基から適宜選択しうる。カチオン性高分子は一態様として、１本鎖であるステアリルアミン、二本鎖のカチオン性脂質であるＮ−［１−（２，３−ジオレイオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムメチル硫酸（ＤＯＴＡＰ）を含む。

２．担体
本発明の組成物は、
ｉ）ヒストンアセチル化酵素をコードする遺伝子を含む発現ベクター；
ｉｉ）ヒストンメチル化酵素をコードする遺伝子を含む発現ベクター；
ｉｉｉ）ヒストン脱アセチル化酵素をコードする遺伝子を含む発現ベクター；
ｉｖ）ヒストン脱メチル化酵素をコードする遺伝子を含む発現ベクター；
ｖ）ヒストンアセチル化阻害剤；
ｖｉ）ヒストン脱アセチル化阻害剤；
ｖｉｉ）ヒストンメチル化阻害剤；及び
ｖｉｉｉ）ヒストン脱メチル化阻害剤
からなるグループから選択される、２種類またはそれ以上の物質を包摂する担体を含むものでもよい。

本発明の組成物は、上記高分子及び担体の双方を含む態様も含まれる。

ｉ）−ｖｉｉｉ）の物質はいずれもクロマチンのヒストンのアセチル化、脱アセチル化、メチル化、あるいは脱メチル化に関与する物質である。ヒストンはリジン残基のアミノ基がアセチル化されるとアミノ基の正電荷が中和され、ヌクレオソーム間の相互作用が緩むと考えられている。よって、ヒストンのアセチル化によりクロマチン構造が弛緩し、転写が活性化される。脱アセチル化により反対にクロマチン構造は凝縮する。ｉ）及びｖｉ）はクロマチン構造を弛緩する作用を有する。一方、ｉｉｉ）及びｖ）は、クロマチン構造を凝縮させる構造を有する。一方ヒストンのメチル化は、Ｈ３Ｋ９がメチル化されるとクロマチンを凝縮させ、ヘテロクロマチンを形成することが知られており、位置に依存すると考えられる。一方、ヒストンＨ３Ｋ４がメチル化されると転写が活性化する。

本発明では、担体を用いて上記物質の２種類またはそれ以上を投与することを特徴とする。「２種類またはそれ以上の物質を包摂する担体」とは、１つの担体に２種類またはそれ以上の物質を含み態様も、２種以上の担体に２種類またはそれ以上の物質を含み態様も含む。クロマチンを制御する物質を２種類以上投与することにより、より強力な又は複雑な制御が可能となる。例えば、組成物には２種類以上の遺伝子を含ませてもよいし、遺伝子と化合物（阻害剤）の組み合わせでもよい。

本発明の担体は、無毒若しくは低毒で生体への適用が可能である、発現ベクター及び／又は阻害剤を配合しうる、ｉ）−ｖｉｉｉ）の物質を細胞の核まで運搬できる、という条件を満たすものであれば任意の公知の担体を使用可能である。態様において、担体は、ポリエステル、リン酸カルシウム、又はポリアミノ酸を含む。

「ポリエステル」は、多価カルボン酸とポリアルコールとの重縮合体であり、一般に、ポリアルコールと多価カルボン酸を反応（脱水縮合）させて作る。ポリエステルは一態様において、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸−ポリグリコール酸共重合体等生分解性高分子を含む。

「リン酸カルシウム」は、低毒性でかつ生分解性である。特に遺伝子を含む発現ベクターを担体に含ませるのに好ましい。同様の機能を有するものとして、リン酸ナトリウム等も本発明に使用しうる。

「ポリアミノ酸」は、複数のアミノ酸がアミド結合した高分子で、ポリペプチドともいう。アミノ酸は生体のタンパク質の構成成分であり、ポリアミノ酸は無毒又は低毒である。本明細書の実施例で記載したようなアセチル化ポリリジン（ＡｃＰＬＬ）、ハイパーブランチポリリジン（高度に枝分かれしたポリリジン）、デンドリティックポリリジン（ＤＰＫ）も、本発明の担体として使用しうる。さらに、ポリリジンは細胞の核においてポリリジンにヒストンアセチル化酵素が作用することにより、ヒストンアセチル化阻害剤としても作用しうる。また、アセチル化ポリリジンは逆に、ヒストン脱アセチル化阻害剤として作用しうる。

「ヒストンアセチル化酵素」（ＨＡＴ）は、ヒストンのリジン側鎖のアセチル化を促進する酵素である。ＨＡＴは公知であり、例えば、ヒト等においてタンパク質のアミノ酸配列、並びに当該タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列が知られている。例えば、ヒトヒストンアセチル化酵素（ＫＡＴ２Ｂ）遺伝子の塩基配列は、ＮＣＢＩデータバンクのアクセッション番号ＮＭ＿００３８８４に開示されている。ＫＡＴ２Ｂは、別名「ＣＡＦ」と呼称されることもある。

「ヒストンメチル化酵素」（ＨＭＴ）は、ヒストンにメチル基を促進する酵素である。ヒストンメチル化酵素は公知であり、例えば、ヒト等においてタンパク質のアミノ酸配列、並びに当該タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列が知られている。例えば、ヒトヒストンメチル化酵素（ＥＨＭＴ２）の変異体（Ｇ９ａ）遺伝子の塩基配列は、ＮＣＢＩデータバンクのアクセッション番号ＮＭ＿００６７０９に開示されている。

「ヒストン脱アセチル化酵素」（ＨＤＡＣ）は、ヒストンのリシン側鎖のアセチル基を加水分解し、リシンに変換する酵素である。ＨＤＡＣは公知であり、例えば、ヒト等においてタンパク質のアミノ酸配列、並びに当該タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列が知られている。例えば、ヒトヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ３）遺伝子の塩基配列は、ＮＣＢＩデータバンクのアクセッション番号ＮＭ＿０２９６７８に開示されている。ヒトヒストン脱アセチル化酵素（ＳＩＲＴ２）遺伝子の塩基配列は、ＮＣＢＩデータバンクのアクセッション番号ＮＭ＿０３４１４６に開示されている。

「ヒストン脱メチル化酵素」は、ヒストンに結合したメチル基を加水分解する酵素である。

各遺伝子によってコードされる酵素のアミノ酸配列は、好ましくは天然のタンパク質の配列である。あるいは、各酵素の機能が維持される範囲内であれば、その変異体も本発明に使用しうる。具体的には天然のアミノ酸配列又は当該アミノ酸をコードする塩基配列に対して、好ましくは少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％の配列相同性を有する。

２つの配列の同一性％は、視覚的検査および数学的計算によって決定してもよい。あるいは、２つのタンパク質配列の同一性パーセントは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．及びＷｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３−４５３，１９７０）のアルゴリズムに基づき、そしてウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループ（ＵＷＧＣＧ）より入手可能なＧＡＰコンピュータープログラムを用い配列情報を比較することにより、決定してもよい。ＧＡＰプログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（１）Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｓ．及びＨｅｎｉｋｏｆｆ，Ｊ．Ｇ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：１０９１５−１０９１９，１９９２）に記載されるような、スコアリング・マトリックス、ｂｌｏｓｕｍ６２；（２）１２のギャップ加重；（３）４のギャップ長加重；及び（４）末端ギャップに対するペナルティなし、が含まれる。

あるいは、天然のアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸残基が欠失、付加、または置換されているアミノ酸配列を有するものであってもよい。このような天然のタンパク質と相同なアミノ酸配列を有し、天然の酵素と同一の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子も本発明において使用可能である。限定されるわけではないが、変更可能なアミノ酸数は、１ないし１００アミノ酸残基、１ないし８０アミノ酸残基、１ないし５０アミノ酸残基、１ないし３０アミノ酸残基、１ないし２０アミノ酸残基、１ないし１５アミノ酸残基、１ないし１０アミノ酸残基、１ないし５アミノ酸残基である。公知の部位特異的突然変異法で修飾可能な数のアミノ酸残基、例えば、１ないし１０アミノ酸残基、１ないし８、１ないし５、１ないし３アミノ酸残基がより好ましい。

「発現ベクター」は、遺伝子を発現するための、プラスミドベクター、ウイルスベクター、コスミドベクター等、公知のベクターを使用しうる。生体に投与することを目的とするため、生体に対し無毒若しくは低毒性のベクターが好ましい。本発明の組成物により２種類以上の遺伝子を発現させることを目的とする場合、各遺伝子を含む２種類以上の発現ベクターを用いてもよく、あるいは、１つの発現ベクターに２種類以上の遺伝子を含ませたものを用いてもよい。

「ヒストンアセチル化阻害剤」は、公知のものを使用しうる。例えば、コエンザイムＡ（ＣｏＡ）、アナカルジン酸（ＡＡ）、クルクミン、ＭＢ−３を含む。

「ヒストン脱アセチル化阻害剤」は、公知のものを使用しうる。例えば、バルプロ酸（ＶＰＡ）、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）、ボリノスタット、ＭＳ−２７５を含む。ヒストン脱アセチル化阻害剤は、癌細胞に対して、細胞周期の停止、分化誘導、アポトーシスなどの活性を示し、癌細胞の増殖に影響を与えることが知られている。

「ヒストンメチル化阻害剤」は、公知のものを使用しうる。例えば、ケトシン、ＢＩＸ−０１２９４、ＤＺＮｅｐ、ＡＭＩ−１を含む。

「ヒストン脱メチル化阻害剤」は、公知のものを使用しうる。例えば、トラニルシプロミン、を含む。

阻害剤は、発現ベクターとともに担体中に含ませて組成物を構成してもよく、あるいは、担体とは別に、（例えば培地中に、あるいは生体に）直接投与してもよい。

３．クロマチン構造を制御する方法
本発明は、上述した本発明の組成物をｉｎｖｉｔｒｏ、ｅｘｖｉｖｏ又はｉｎｖｉｖｏで投与することにより、クロマチン構造を制御する方法を含む。

上記高分子と担体の双方を含む組成物を投与してもよく、あるいは、上記高分子を含む組成物と担体を含む組成物の２種類の組成物を投与する態様も含む。

クロマチン構造の制御とは、クロマチン構造を弛緩、あるいは逆に凝縮することを指す。クロマチン構造が「弛緩する」とは、クロマチンが凝縮した状態の高次構造が緩み、遺伝子の転写が進みやすくなる、即ち、転写が活性化しオンの状態になることを意味する。クロマチン構造が「凝縮する」とは、弛緩とは逆に、クロマチンが凝縮した高次構造をとり、転写が生じにくいオフの状態になることを意味する。

クロマチンの「弛緩」及び「凝縮」は、例えば、遺伝子の転写及び／又は翻訳活性を測定することにより、調べることが可能である。遺伝子の転写及び／又は翻訳活性は、公知の方法を用いて確認することが可能である。例えば、蛍光タンパク質の発現により蛍光測定することができる。あるいは、より直接的にクロマチン構造を観察することにより確認してもよい。

本願発明の高分子及び担体の投与量は特に限定されない。当業者は、高分子、担体、担体に含まれる物質等の種類、投与対象の状態等に応じて適宜量を決定することが可能である。本発明の両性高分子及びアニオン性高分子を用いる場合、アニオン数とクロマチン構造中のＤＮＡの割合は、クロマチン構造の弛緩作用の効果の大きさに影響を与える可能性がある。限定されるわけではないが、インビトロの無細胞系において、本発明の両性高分子及びアニオン性高分子を用いる場合、クロマチン構造中のＤＮＡと比較して高分子のアニオン数が２倍の場合にクロマチン構造が最も弛緩することが観察された。

４．ＤＮＡメチル化の制御
クロマチン構造のヒストンの修飾とは別に、ＤＮＡのメチル修飾も遺伝子情報の発現の制御に関与していることが知られている。具体的には、クロマチン構造のメチル化により転写が不活性化し、脱メチル化により転写が活性化する。よって、ヒストン修飾に加えて、ＤＮＡのメチル修飾の制御によりさらに遺伝子発現についてより強力、複雑又は柔軟な制御が可能である。

本発明において、担体が、さらに、ＤＮＡ脱メチル化酵素をコードする遺伝子を含む発現ベクター、ＤＮＡメチル化酵素をコードする遺伝子を含む発現ベクター、あるいは、ＤＮＡメチル化酵素阻害剤、を含ませてもよい。

ＤＮＡのメチル化修飾に関し、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼとその相同分子としてこれまで５つの遺伝子が報告されている（Ｄｎｍｔ１、Ｄｎｍｔ２、Ｄｎｍｔ３ａ、Ｄｎｍｔ３ｂ、Ｄｎｍｔ３Ｌ）。これらの遺伝子の塩基配列及びコードされるアミノ酸配列は公知であり、各々、ＮＣＢＩデータバンクのアクセッション番号ＮＭ＿００１１３０８２３、ＮＭ＿１７６０８５、ＮＭ＿０２２５５２、ＮＭ＿００１２０７０５５、ＮＭ＿０１３３６９として、開示されている。

発現ベクターは、ヒストンアセチル化酵素をコードする遺伝子等に関して上述した公知の発現ベクターを用いることができる。

「ＤＮＡメチル化酵素阻害剤」は公知のものを使用しうる。例えば、５−アザシチジン、５−アザデオキシシチジン、ゼブラリン、ヒドララジン、を含む。

以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。

実施例１人工クロマチンの作成
本実施例ではクロマチン構造を模倣した人工クロマチンモデルを作製した。

人工クロマチンはＤＮＡの代替としてｐＧＬ３と呼ばれるプラスミドＤＮＡを使用し、購入したヒストンはＨｅＬａ細胞のＣｏｒｅＨｉｓｔｏｎｅを使用した。プラスミドＤＮＡは、環状であること、分子量が小さい点で染色体のＤＮＡと相違する。しかしながら、取り扱いが容易であり発現する遺伝子が任意に組み込めることから、遺伝子発現の評価が容易である等の利点があるため、本実施例において利用した。

また、ｉｎｖｉｔｒｏのクロマチン形成反応におけるＤＮＡとコアヒストンの比が重要であり、一般に新しいＤＮＡとヒストンを調製するごとにｔｉｔｒａｔｉｏｎする必要がある。本実施例において、アガロースゲル電気泳動を用いてフリーなＤＮＡが見られず、複合体のバンドのみが確認できるヒストン／ＤＮＡ重量比を最適な重量比として決定した。

実施例３以降において、本実施例において作製した人工クロマチンを用いた。その際には、アガロースゲル電気泳動により高分子のクロマチン構造を弛緩する最適な濃度を決定した。その後、その最適濃度による翻訳活性評価をすることでそれぞれの高分子のクロマチン構造の弛緩能を間接的に評価した。

１−１）プラスミドＤＮＡの精製

ｐＧＬ３プラスミドＤＮＡを大腸菌を用いて大量培養した。プラスミドＤＮＡ複製キット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて、精製し、得られたプラスミド量を吸光度から算出した。吸光度は、ＵＶ／Ｖｉｓ分光光度計（日本分光社製）を用いて測定した。ＵＶ／Ｖｉｓ分光光度計は分子の電子エネルギー遷移を起こす紫外から可視部（２００ｎｍ〜７８０ｎｍ）の波長の光を用いて分光吸光を行う装置である。

得られたプラスミドＤＮＡ濃度は、３つのサンプルを測ったところ、以下のようになった。実施例３以降の翻訳系を用いた実験系では、濃度が高い方（０．６ｍｇ／ｍＬ）、アガロースゲル電気泳動による実験系では、濃度が低い方（０．２４ｍｇ／ｍＬ）を用いて実験を行った。

１−２）人工クロマチンの作製
１−１）で精製したプラスミドＤＮＡ（Ｔ７ＬｕｃｉｆｅｒａｓｅｃｏｎｔｒｏｌＤＮＡ（０．６ｍｇ／ｍＬ））を用いた。人工クロマチンはそれぞれの重量比（ヒストン／ＤＮＡ＝０．２１３，０．４３，０．８５，１．７，２，４）になるように調整し、１時間インキュベートすることで作製した。最適な重量比はアガロースゲル電気泳動により決定した。結果を図１に示す。

ＤＮＡ／ヒストンが複合体を形成していると、電荷が中和され、あまり流れずに注入部位付近にバンドが見られると考えて実験を行った。図１に示すように、重量比が１．７、２において複合体のバンドが見られたが、フリーなＤＮＡのバンドも観察されてしまった。一方で、重量比が４において複合体のバンドのみが観察された。

これらの３つのサンプルを用い、ｉｎｖｉｔｒｏ翻訳系により転写・翻訳を試みた。ＤＮＡ／ヒストンがきちんと生体内のクロマチンのように形成している場合、裸のＤＮＡよりも発現量が低下すると考えたが、ＤＮＡ／ヒストン重量比が１．７、２においてはポジティブコントロールであるＤＮＡのみのサンプルと同等の発現量が得られた。しかし、重量比が４の場合、発現量が１／１０^４倍となったので、このサンプルが本研究の弛緩実験に用いる転写不活性型のクロマチン構造として最適であるとして、この系を用い、実施例３以降の実験を行った。

実施例２高分子の合成
本実施例では、クロマチン制御に用いるための高分子を合成した。プロトンスポンジ効果と細胞膜融合活性により効率的なエンドソーム脱出が可能なカルボキシル基を有する点を考慮し、本実施例では以下の５つのアニオン性および両性高分子を選択した。

２−１）カルボキシメチル化ポリビニルイミダゾール（ＣＭ−ＰＶＩｍ）の合成
ポリビニルイミダゾール（ＰＶＩｍ）の合成
ラジカル重合開始剤としてＶ−６５（２，２’−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル））を用いたラジカル重合によりポリビニルイミダゾール（ＰＶＩｍ）をラジカル重合する。Ｖ６５は４５℃で温度応答的に不対電子を持つので、Ｃ＝Ｃ結合を有する１−ビニルイミダゾールを添加することでラジカル重合を行った。

１−ビニルイミダゾール３００ｍｇ（３．１９ｍｍｏｌ、密度１．０４ｇ／ｍＬ、２８８．５μＬ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）２４００μＬに溶解させた。Ｖ６５１５．８ｍｇ（０．０６４ｍｍｏｌ）をＤＭＦ３００μＬに溶解させた。二種の溶液を混合させた後、ラジカル反応中におけるラジカルの消失を防ぐために溶液中の酸素を除去する必要があるため、窒素によるバブリングを４０ｍｉｎ行った。ラジカル発生温度である４５℃に予め設定したウォーターバスで２４ｈ撹拌せずにインキュベートした。アセトン８０ｍＬ中に滴下することで再沈殿を行った。２６００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心分離し、上澄みのアセトンを除去した。少量のＤＭＦに溶解させた後、再度アセトン８０ｍＬによる再沈殿、遠心分離、上澄みの除去を行った。ドラフト内で２４時間静置することでアセトンを揮発させた。得られた生成物をＨ_２Ｏ（２０ｍＬ）に溶解させた後、ＭＷＣＯ：１０００の透析膜を用いて２日間の透析を行った。凍結乾燥を施して得られた物質を回収した。収量５７．９７ｍｇ、収率１９．３２％であった。

カルボキシメチル化ポリビニルイミダゾール（ＣＭ−ＰＶＩｍ）の合成
上記の通り合成したポリビニルイミダゾール（ＰＶＩｍ）（３０ｍｇ）をＨ_２Ｏ（８ｍＬ）に溶解させた。ヨード酢酸４０ｍｇをＨ_２Ｏ（２ｍＬ）に溶解させた。トリエチルアミン（ＴＥＡ，４４μＬ，０．３２ｍｍｏｌ）をＰＶＩｍ水溶液に添加した後、ヨード酢酸水溶液を加え、４０℃において２４時間撹拌した（Ｆｉｇ．２−２）。ＭＷＣＯ：１０００を用いた透析を２日間行った後に凍結乾燥により得られた物質を回収した。

ＰＶＩｍおよびＣＭ−ＰＶＩｍは各々^１Ｈ−ＮＭＲによる構造確認を行った。具体的には、ＰＶＩｍ３ｍｇを重水７００μＬに溶解させ測定した。

ＣＭ−ＰＶＩｍは、以下のように測定した。ＣＭ−ＰＶＩｍ３ｍｇを重ＤＭＳＯに添加、水素結合を解消するためにトリフルオロ酢酸を数滴添加した。さらにカウンターイオンを交換するためヘキサフルオロリン酸アンモニウム（ＮＨ_４ＰＦ_６）を添加し測定した。いずれも、目的とする化合物の合成が確認できた。

２−２）ポリメタクリル酸（ＰＭＡＡ）の合成
減圧蒸留したメタクリル酸（関東化学株式会社）１６．７３ｍＬをジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１３３．７ｍＬに混合した。混合物にＤＭＦ１７ｍＬに溶解したラジカル重合開始剤であるＶ−６５８８１．６ｍｇを加え、攪拌しながら一晩、窒素バブリングを行った。その後、窒素雰囲気下で５０℃、２４時間反応させた。

合成したポリマーは、アセトンに滴下することで再沈精製を行った。その後、５０℃で１２時間真空乾燥を行った。しかし、ポリマーは、非常にゲル化しやすく、再沈溶媒であるアセトンを内包してしまう。そのため、乾燥したポリマーを脱イオン水に溶解させ、分画分子量（ＭＷＣＯ）が１，０００の膜を用いて、２日間水中で透析を行い、凍結乾燥により回収した。

２−３）カルボキシメチル化ポリヒスチジン（ＣＭ−ＰＬＨ）の合成
ポリ−Ｌ−ヒスチジン（ＰＬＨ）（５０ｍｇ）とヨード酢酸（Ｉ−ＣＨ_２ＣＯＯＨ）（ＰＬＨ×０．８倍量：４０ｍｇ）をそれぞれＨ_２Ｏ８ｍＬ、２ｍＬに溶解させ、１ＮＮａＯＨで水溶液をｐＨ４．５〜５に調整し室温で２４時間攪拌した。その後、さらにＨ_２Ｏ（０．２ｍＬ）に溶解させたヨード酢酸（４０ｍｇ）を添加し、水溶液をｐＨ４．５〜５に保ち、再び２４時間、室温で攪拌した。その後、同様の操作を行い、合計３日間反応を行った。得られた水溶液をＭＷＣＯ：１０００の透析膜で、３日間透析（１ＬのＨ_２Ｏ中に５ｍＬＰＢＳ（−）（×２０）を添加）後、サンプルを回収する前にＨ_２Ｏのみで２時間透析を行った。その後、凍結乾燥によって白色粉末を回収した。

ＧＦＣは、キャリア：０．５ＭＣＨ_３ＣＯＯＨ，０．３ＭＮａ_２ＳＯ_４，流速：１．０ｍＬ／分，カラム：ＳｈｏｄｅｘＯＨｐａｋＳＢ−８０４ＨＱで測定を行った。^１ＨＮＭＲは、塩酸（５μＬ）を添加したＤ_２Ｏ（７００μＬ）で測定を行った。

ＧＦＣにより数平均分子量：約６０００、^１ＨＮＭＲによりカルボキシメチル基修飾率：約５０ｍｏｌ％と見積もった。

実施例３高分子による人工クロマチン弛緩実験
本実施例では、高分子による人工クロマチン弛緩実験を行った。

３−１）材料
高分子は、カルボキシメチル化ポリビニルイミダゾール（ＣＭ−ＰＶＩｍ）、ポリメタクリル酸（ＰＭＭＡ）及びカルボキシメチル化ポリヒスチジン（ＣＭ−ＰＬＨ）は実施例２で合成したものを使用した。ポリグルタミン酸（ＰＬＥ）はＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈより購入した。ポリアクリル酸（ＰＡＡ：分子量ＭＷ＝２５，０００又は１，０００，０００）は和光純薬工業株式会社より購入した。

３−２）アガロースゲル電気泳動による評価
実施例１で作製した人工クロマチン２．２μＬに、各高分子をそれぞれＤＮＡのアニオン数と比較してアニオン数が、２，４，８倍となるように添加し、１５分間インキュベートした。反応物を、１％アガロースゲル，ｐＨ７．４（溶媒５０ｍＭリン酸バッファー（ＰＢ））を用いて、Ｍｕｐｉｄ（登録商標）−２ｘにより電圧５０Ｖ条件下で、２０分間電気泳動を施した。その後、ＱｕａｎｔｉｔｙＯｎｅにより各高分子が弛緩するのに最適な濃度を決定した。各高分子は、ＤＮＡと比較してアニオン数が２，４，８倍となるように添加した。

結果を、図２に示す。図２に示した通り、アニオン性高分子（ＰＡＡ、ＰＭＡＡ、ＣＭ−ＰＬＨ及びＰＬＥ）を添加した場合、未添加の場合よりも複合体のバンドの蛍光強度のほうが強いことが分かった。この事実から、すべてのアニオン性高分子により人工クロマチンが弛緩されていることが示唆された。

両性高分子であるＣＭ−ＰＶＩｍにおいてはアニオン性高分子とは異なった傾向が見られた。ＣＭ−ＰＶＩｍを添加した人工クロマチンは未添加のものと比べ蛍光強度が低かった。両性高分子はアニオン性高分子と異なるメカニズムで弛緩されていることが考えられる。アニオン性高分子はヒストンのみに相互作用し、ＤＮＡ−ヒストン間の相互作用を弱めるのに対し、両性高分子はアニオン部位はヒストンと、カチオン部位はＤＮＡと相互作用することによりＤＮＡ−ヒストン間の相互作用を緩める。そのため、両性高分子はエチジウムブロマイドがインターカレートしにくく、蛍光強度が低くなってしまったのではないかということと推測される。

なお、すべての高分子においてＤＮＡと比較してアニオン数が２倍量添加した時に、蛍光強度が最大となり最も弛緩されていることが示唆された。

３−３）翻訳活性評価
翻訳活性評価は、ＴＮＴ（登録商標）ＱｕｉｃｋＣｏｕｐｌｅｄＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ／ＴｒａｎｓｌａｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍを用いて下記のように弛緩能評価を行った。

反応コンポーネント（翻訳システム）
ＴＮＴ（登録商標）ＱｕｉｃｋＭａｓｔｅｒＭｉｘ４０μＬ，メチオニン
１ｍＭ１μＬ，人工クロマチン２．２μＬ，
各高分子（ＣＭＰＶＩｍ（１ｍｇ／ｍＬ），ＰＡＡ（０．１ｍｇ／ｍＬ），ＰＭＡＡ（０．１５ｍｇ／ｍＬ）），
ヌクレアーゼを含まない水を加えて、総量で５０μＬ

投入した各高分子および、Ｎｕｃｌｅａｓｅ−ｆｒｅｅ−ｗａｔｅｒの投入量

エッペンドルフチューブに反応コンポーネントを入れ、すべてのコンポーネントをピペッティングした。その後、３０℃で９０分間インキュベートし、ルミノメーターにより発光強度を測定することで弛緩能評価を行った。

アガロースゲル電気泳動により最も弛緩されていると示唆された濃度において翻訳活性評価を行った。まず、ポジティブコントロールである裸のＤＮＡと比べて人工クロマチンにおける翻訳活性が下がっていることが確認でき、転写不活性型の人工クロマチンの作製に成功したことがわかった。転写不活性型、つまり凝集状態のヘテロクロマチンを弛緩させることが出来れば、露出するＤＮＡの領域が増加し、結果的に転写および翻訳が促進すると考え、本実験系により弛緩能評価を行った。結果を、図３及び図４に示す。

図３は、分子量ＭＷ２５，０００及び１，０００，０００の２種類の分子量のＰＡＡの結果である。両者とも高い翻訳活性を示したが、ＭＷ１，０００，０００の方が若干高かった。図４は、ＣＭ−ＰＶＩｍ及びＰＭＡＡの翻訳活性を示す。いずれも翻訳活性が示されたが、特にＣＭ−ＰＶＩｍで有意に高い効果が確認された。これらのアニオン性高分子についてはアニオン性電荷密度が高いほど効率的に弛緩するのではないかということが考えられる。

一方、電荷密度が低いＣＭ−ＰＶＩｍにおいて翻訳活性の向上が見られたのは、興味深い結果であり、この高分子が両性高分子であることから、アニオン性高分子とは異なるメカニズムでより効率的に弛緩していることが考えられる。

以上、ヒストンを用いた人工クロマチンモデルの構築に成功し、高分子の弛緩評価において有用な系を確立した。確立した系において実験したすべての高分子（ＰＬＥ，ＣＭ−ＰＬＨ，ＰＡＡ，ＰＭＡＡ，ＣＭ−ＰＶＩｍ）がクロマチン構造を弛緩させることが明らかとなった。クロマチン弛緩させた高分子のなかで、特にＰＡＡ及びＣＭ−ＰＶＩｍが無細胞系翻訳系における翻訳効率を向上させることが明らかとなった。

実施例４リン酸カルシウム複合体
本実施例は、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）をコードする遺伝子を含むプラスミド、ヒストンアセチル化酵素阻害剤であるコエンザイムＡを含む、リン酸カルシウム複合体の調製について記載する。

１ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１ｍＭＥＤＴＡをミリポアに溶解する事によりＴＥ溶液（ｐＨ７．６）を調製した。ＴＥ溶液中に０．１ｍｇ／ｍｌの濃度でプラスミドを含むプラスミド溶液を調製した。プラスミドは、ｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ６ベクターにヒストン脱アセチル化酵素ＨＤＡＣ３をコードした遺伝子が挿入されているプラスミドと、ｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ６ベクターにＤＮＡメチル化酵素（ＤＮＭＴ３ａ）をコードした遺伝子が挿入されているプラスミドを用いた。ｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ６ベクターの塩基配列を配列番号２に示す。

次いで、２．５ＭＣａＣｌ_２溶液と０．１ｍｇ／ｍｌプラスミド溶液を１：９の割合で混合した（溶液Ａ）。ポリグルタミン酸とコエンザイムＡを、溶液Ａ１００μｌに１０μｇと０、１、２、５、１０μｇとなるようにそれぞれ添加した（溶液Ｂ）。

１４０ｍＭＮａＣｌ、５０ｍＭＨＥＰＥＳ、６ｍＭＮａ_２ＨＰＯ_４をミリポアに溶解し、Ｈｅｐｅｓ／ｐｈｏｓｐｈａｔｅ溶液（ｐＨ７．１）を調製した。次いで、溶液Ｂに等量のＨｅｐｅｓ／ｐｈｏｓｐｈａｔｅ溶液を添加し、数分間撹拌した後、３７℃で２４時間静置ことにより、リン酸カルシウム複合体を頂戴した。調製した複合体は、遠心分離（１００００ｒｐｍ、１５分間）により回収した。

遠心分離により回収した全てのリン酸カルシウム複合体を過剰のＰＢＳに懸濁し、ＥＬＳＺ−２（大塚電子）を用いて粒径及びゼータ電位を測定した。結果を以下の表に示す。

さらに、リン酸カルシウム複合体中のコエンザイムＡ含有量を評価した。具体的には、先ず、調製した全ての複合体を滅菌ＰＢＳに懸濁し、遠心分離（１００００ｒｐｍ、１５分間）することにより粒子表面を洗浄した。次いで、洗浄した全ての複合体を希塩酸（ｐＨ＝３）中に分散し、十分にピペッティングして複合体を破壊した。溶液中へＣＰＭ（７−ジエチルアミノ−３−（４’−マレイミジルフェニル）−４−メチルクマリン）を添加しＤＴＸ８００（ＢＥＣＫＭＡＮＣＯＵＬＴＥＲ）により蛍光（Ｅ_Ｘ＝３６０、Ｅ_Ｍ＝４６９）を測定することにより、粒子内に含まれているコエンザイムＡを定量した。結果を、図５に示す。

実施例５リン酸カルシウム複合体を用いた遺伝子発現評価
本実施例では、実施例４で作成したリン酸カルシウム複合体を用いた場合の、遺伝子発現評価を調べた。

遺伝子発現評価のために、リン酸カルシウム複合体に、プラスミド種としてルシフェラーゼ遺伝子をコードしたｐＧＬ３を含ませた。まず、９６ｗｅｌｌプレートへＨｅｐＧ２細胞を１×１０^４Ｃｅｌｌｓ播種し、２４時間培養した。培地交換後、プラスミド量が約２００ｎｇ／ｗｅｌｌになるように、調製した複合体を培地に添加し２４時間培養した。コントロールとして市販の遺伝子導入キャリアであるリポフェクチンを用いた。培地交換後、さらに４８時間培養した。

培地を除去し、滅菌ＰＢＳで３回洗浄後、全てのｗｅｌｌへセルライシス１００μｌを添加しピペッティングすることにより、細胞ライセートを得た。ライセートへルシフェラーゼ基質１００μｌを添加し、ＡｃｃｕＦＬＥＸＬｕｍｉ４００（ＡＬＯＫＡ）を用いて、発光強度を測定した。

実施例６ＨｅｐＧ２細胞へのウエスタンブロット測定
本実施例では、本発明のリン酸カルシウム複合体とヒストン脱アセチル化阻害剤を細胞に投与した場合の、ヒストンのアセチル化をウエスタンブロットで測定した。今回使用した複合体は、「実施例４リン酸カルシウム複合体」でのヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）をコードする遺伝子を含むプラスミドの代わりに、ヒストン脱アセチル化酵素（ＳＩＲＴ２）をコードした遺伝子を含むプラスミドを使用したものである。

先ず、９６ＷｅｌｌプレートへＨｅｐＧ２細胞を５×１０^５Ｃｅｌｌｓ播種し、２４時間培養後、ヒストン脱アセチル化阻害剤であるバルプロ酸（ＶＰＡ）を３μＭ含む培地に変更し、さらに２４時間培養した。次に、調製した複合体をＷｅｌｌに添加し、２４時間培養した。コントロールにはアナカルジン酸（ＡＡ）を用いた。

全てのＷｅｌｌから培地を除去し、滅菌ＰＢＳで３回洗浄した後、ＮＰ４０バッファーを全てのＷｅｌｌへ１００μ添加しピペッティングを行った。次いで、不溶性物質を除去するため遠心分離（１５０００ｒｐｍ、５分間）にかけ、上澄みを回収する事により細胞ライセートを得た。回収した上澄み溶液へ２×ＳＢバッファーを１：１の割合で混合し、９５℃で５分間煮沸し、ウエスタンブロッティング用サンプルを作製した。

ミニプロティアンＴｅｔｒａセル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、ミニトランスブロットセル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、各種アセチル化ヒストン抗体（Ｈ３−Ｋ９，−Ｋ１８，−Ｋ２７，Ｈ４−Ｋ５，−Ｋ８，−Ｋ１２：ＣＳＴ）を用いてウエスタンブロット測定を行った。

ウエスタンブロット測定の結果を図６に示す。一番左のレーンはリン酸カルシウム（ＣａＰ）、コエンザイムＡ（ＣｏＡ）、ＳＩＲＴ２をコードする遺伝子を含むプラスミドＤＮＡ、今回の実験には全く影響を与えないプラスミドＤＮＡ、及びアナカルジン酸を添加していないサンプルである。左から２番目のレーンはＣａＰを用いてプラスミドＤＮＡを添加したサンプルである。何も添加していないサンプルと比較して、差は見られないためＣａＰがヒストンアセチル化には影響を与えていないことが確認された。真ん中のレーンはコントロールとしてＡＡのみを添加したサンプルである。左の２サンプルと比較してアセチル化ヒストンＨ３及びＨ４のバンドが薄くなっていることから、本実験におけるアセチル化量の評価が成立していることが確認された。右から２番目のサンプルはＣａＰを用いてＳＩＲＴ２をコードする遺伝子を含むプラスミドＤＮＡを導入したサンプルである。ＳＩＲＴ２が発現することにより、アセチル化ヒストンの量が減少していることが確認された。最後に一番右のレーンはＣａＰを用いてＣｏＡとＳＩＲＴ２をコードする遺伝子を含むプラスミドを導入したサンプルである。全てのサンプルと比較して最もバンドが薄くなっており、ＣｏＡとＳＩＲＴ２が作用することで強力に脱アセチル化されていることが確認された。今回の実験ではアセチル化ヒストン抗体としてＨ３−Ｋ９，−Ｋ１８，−Ｋ２７，Ｈ４−Ｋ５，−Ｋ８，−Ｋ１２を用いたため、これらのアセチル化量が減少したと考えられる。

実施例７アセチル化ポリリジン（ＡｃＰＬＬ）の合成
本実施例では、アセチル化ポリリジン（ＡｃＰＬＬ）の合成について記載する。

７−１）ＡｃＰＬＬ（５％狙い）の合成
ＰＬＬ９．５８ｍｇをＤＭＳＯ０．９５ｍＬに溶解した。この溶液にＴＥＡ２０μＬを入れ、反応前のアミノ基定量用のサンプルを５０μＬ採取した（溶液（１））。無水酢酸４．５μＬをＤＭＳＯ１．０ｍＬに溶かし、その溶液から５０μＬ採取し上記溶液（１）に加えた。この溶液をウォーターバス（４０℃）中で２時間反応させた。反応後、アミノ基定量用のサンプルを５０μＬ採取した。

蛍光分光光度計を用いて、アミノ基定量を行い反応が進んでいることを確認した。^１ＨＮＭＲを測定し、アセチル化率を算出した結果、８．５％であった。即ち、反応進行率はほぼ１００％であることが示唆された。

７−２）ＡｃＰＬＬ（７５％狙い）＋マルトース（２５％狙い）の合成
ＰＬＬ１１．２ｍｇをＤＭＳＯ１ｍＬに溶解した。この溶液にＴＥＡ１０μＬを入れ、反応前のアミノ基定量用のサンプルを５０μＬ採取した（溶液（１））。無水酢酸４μＬを上記溶液（１）に加えた。この溶液をウォーターバス（４０℃）中で２時間反応させた。反応後、アミノ基定量用のサンプルを５０μＬ採取した（溶液（２））。上記溶液（２）にマルトース６．２８ｍｇを加え、ウォーターバス（４０℃）中で２４時間反応させた。反応後の溶液をアミノ基定量用に５０μＬ採取した。

蛍光分光光度計を用いて、アミノ基定量を行い反応が進んでいることを確認した。

７−３）ＡｃＰＬＬ（３０％狙い）＋マルトース（７０％狙い）の合成
ＰＬＬ１０ｍｇをＤＭＳＯ０．９９ｍＬに溶解した。この溶液にＴＥＡ１０μＬを入れた。（溶液（１））。無水酢酸１５０μＬをＤＭＳＯ１．０ｍＬに溶かし、その溶液から１０μＬ採取し、上記溶液（１）に加えた。この溶液をウォーターバス（４０℃）中で２時間反応させた（溶液（２））。上記溶液（２）にマルトース２２６ｍｇを加え、ウォーターバス（４０℃）中で２日間反応させた。

^１ＨＮＭＲでアセチル化率及びマルトースの結合率を算出した。その結果、アセチル化率が２９．３％、アミノ基とマルトースの結合率が３９％と算出された。

実施例８ハイパーブランチポリリジンの合成
本実施例は、ハイパーブランチポリリジンの合成（ＤＭＦ溶媒）を記載する。

Ｌ−リジン（２０８ｍｇ，１ｍｍｏｌ）、ＴＥＡ（１５４μＬ，１．１ｍｍｏｌ）、ＤＭＦ１５ｍＬ混合溶液中にＨＢＴＵ（３７９ｍｇ，１．０ｍｍｏｌ）とＨＯＢｔ・Ｈ_２Ｏ（１５３ｍｇ，１．０ｍｍｏｌ）を加え、１５時間ウォーターバス４０℃条件下で攪拌した。その後、室温で１４日攪拌した。

反応前溶液も白く白濁していたが、ウォーターバスを用いて１５時間攪拌しても、反応混合溶液は白く懸濁していた。１５時間攪拌して得られた反応混合溶液にＤＭＦ，ＤＭＳＯを加え、溶けるかどうかを確認した。ＤＭＦで溶液を希釈しても溶解性は変わらなかった。一方で、ＤＭＳＯを加え希釈すると、反応後溶液を４倍希釈したところで溶かすことに成功した。

ＤＭＦ溶媒について、透析して凍結乾燥をしてなにか出来ているかを確認したところ白い粉末が得られた。ハイパーブランチＰＬＬは水溶性なので水に不溶性の不純物を取り除くために、得られた白い粉末を水に溶かし再度凍結乾燥して生成物を回収した。水系ＧＦＣで合成生成物の分子量を測定したところ、少量だが、がハイパーブランチＰＬＬが合成出来ていることが示唆された。また、^１ＨＮＭＲ解析をしたところ、Ｌ−Ｌｙｓｉｎｅとは異なったピークが見られた。

実施例９デンドリティックポリリジン（ＤＰＫ）の合成
本実施例では、デンドリテッィクポリリジン（ＤＰＫ）の合成例を記載する。

ＦＡＢ−ＭＳの測定値と文献値を比較することにより合成が出来ているかを確認したところ、ＫＧ２の合成に成功していることが示された。

実施例１０ヒストンアセチル化酵素ＤＮＡ、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、ポリ乳酸、及びカチオン性脂質の４要素を含む担体を用いた遺伝子導入
本実施例では、ヒストンアセチル化酵素ＤＮＡ、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、ポリ乳酸、及びカチオン性脂質の４要素を含む担体を用いて遺伝子導入を行い、担体の機能評価、ヒストンアセチル化量評価及び細胞分化率評価を行った。

１０−１ポリ乳酸キャリアの調製
ヒストンアセチル化酵素ＤＮＡ／ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤／ポリ乳酸複合体／カチオン性脂質は以下の手順で調製した。

まず、カチオン性脂質は、様々なアルキル鎖の鎖長を持つ化合物があるが、本研究では、細胞毒性が低く、細胞内導入効率の優れた、アルキル鎖長が１６−１８である一本鎖もしくは２本鎖のカチオン性脂質を選択した。本実施例では、１本鎖であるステアリルアミンもしくは二本鎖のカチオン性脂質であるＮ−［１−（２，３−ジオレイオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムメチル硫酸（ＤＯＴＡＰ）を使用した例を示す。ヒストンアセチル化酵素（ＣＡＦ）をコードしたＤＮＡとカチオン性脂質を、電荷比が１：１となるようにエタノールに溶解し、３７℃で１ｈインキュベートした。

次に、ＤＮＡ／カチオン性脂質複合体に５０ｎＭのヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（トリコスタンチンＡ（ＴＳＡ））を加え、さらにポリ乳酸（ＰＬＡ）をＤＮＡ／カチオン性脂質に対して５倍量加え、３７℃で１ｈインキュベートした。インキュベート終了後、サンプルはＭＷＣＯ１０００の透析膜を用いて透析を４日間行なった。最後に、透析を行なったサンプルは凍結乾燥を３日間行い、白色粉末を得た。キャリア中のＤＮＡは、ルシフェラーゼアッセイによる遺伝子発現評価により存在確認を行なった。

ルシフェラーゼアッセイは、以下の手順で行なった。ＨｅｐＧ２細胞は、９６ウェルプレートに１×１０^５ｃ細胞／ｍｌで播種し、３７℃で２４時間インキュベートした。ルシフェラーゼをコードしたプラスミドＤＮＡを含むキャリアを、ＨｅｐＧ２細胞に添加し、３７℃で４８時間インキュベートした。インキュベート終了後、ＨｅｐＧ２細胞は回収し、細胞溶解用液（プロメガ社製、ルシフェラーゼアッセイシステム付属、「ＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅｌｙｓｉｓｒｅａｇｅｎｔ」）により溶解した。遺伝子発現量は、溶解液に基質を加え、ルミノメータにより測定した。キャリア中の阻害剤は、ＨＤＡＣ活性分析キットを用いて活性評価を行なった。

１０−２細胞系
（１）キャリア導入
ヒト骨髄性白血病細胞（ＨＬ６０）を、細胞濃度１×１０^５細胞／ｍｌで１２ウェルプレートに播種し、３７℃で２４時間インキュベートした。調製したキャリアを、ＨＬ６０細胞に添加し、３７℃で４８、９６、１９２時間インキュベートした。インキュベート終了後の細胞は、一方は、顆粒球を特異的に染色する手法であるＮＢＴ染色により細胞分化率評価を行なった。他方では、細胞を細胞溶解用液により溶解し、タンパク質溶液を得た。
（２）ヒストンアセチル化量評価（ウエスタンブロット解析）
ヒストンアセチル化量の変化を、上記得られたタンパク質溶液を用いて、ウエスタンブロット法により評価した。回収したタンパク質溶液は、タンパク質のジスルフィド結合を切断するために、還元剤を用いて９５℃で５分間インキュベートした。調製したサンプルを１５％ポリアクリルアミドゲルを用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なった。次に、メタノールにより親水化処理を行なったＰＶＤＦ膜と泳動したゲルとを重ね合わせ、ゲルからＰＶＤＧ膜へタンパク質を転写した。転写したＰＶＤＦ膜を、５％スキムミルクに浸けて、一時間放置した。その後、ＰＶＤＦ膜を洗浄液を用いて洗浄した。洗浄したＰＶＤＦ膜は、一次抗体反応を行なった。一次抗体は、Ａｃ−Ｈ３Ｋ９，Ｋ１８，Ｋ２７（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＪａｐａｎ社製）およびコントロールであるβ−アクチンを用いた。一次抗体は、洗浄液で１０００倍に希釈して使用した。希釈した抗体溶液にＰＶＤＦ膜を浸し、６時間放置した。その後、ＰＶＤＦ膜を洗浄液を用いて洗浄した。次に、二次抗体反応を行なった。二次抗体は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を用いた。ＨＲＰ抗体は、洗浄液で５０００倍に希釈して使用した。希釈した抗体溶液にＰＶＤＦ膜を浸し、６時間放置した。その後、ＰＶＤＦ膜を洗浄液を用いて洗浄した。最後に、検出試薬としてＥＣＬＰｒｉｍｅＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔｔｉｎｇＤｅｔｅｃｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ（ＧＥヘルスケアジャパン社製）を使用し、発光検出を行なった。検出試薬をＰＶＤＦ膜に滴下し、５分間静置した。その後、ＰＶＤＦ膜は、ＡＴＴＯ製の撮影装置ＡＥ−９３００Ｅｚ−ＣａｐｔｕｒｅＭＧを用いて化学発光検出を行なった。
（３）細胞分化率評価（ＮＢＴ染色）
ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）溶液は、０．２％ＮＢＴ、２０％ＦＢＳとなるように調製した。インキュベート終了後のＨＬ６０細胞を、１×１０^６細胞／ｍｌとなるようにＲＰＭＩ培地に懸濁した。次にＲＰＭＩ培地と等量のＮＢＴ溶液を加え、さらにホルボールミリスチルアセテート（ＰＭＡ）を２×１０^−６Ｍとなるように添加し、３７℃で３０分インキュベートした。インキュベート終了後、１２００ｒｐｍで５分遠心分離し、上清を除去した。最後に、ＰＢＳに再懸濁させ、血球計数盤を用いて細胞のカウントを行なった。分化率（％）は、１００×染色された細胞数／全細胞数として求めた。

１０−３結果
（１）カチオン性脂質としてＤＯＴＡＰを用いたポリ乳酸キャリアの機能評価
ルシフェラーゼアッセイによる遺伝子発現評価では、ポリ乳酸キャリアを導入した細胞で遺伝子発現が確認された。ＨＤＡＣ活性分析キットを用いて活性評価を行なったところ、薬剤を添加していないコントロールに対して、６５％の阻害活性を示した。以上の結果から、ＤＮＡおよび阻害剤がキャリア内に封入されていることが確認された。
（２）ヒストンアセチル化量評価
２日後における細胞のヒストンアセチル化量は、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤のみを添加した場合は、何も添加していない場合と比較して１．４倍、ヒストンアセチル化酵素ＤＮＡのみを添加した場合は１．２５倍上昇していた。一方、カチオン性脂質としてＤＯＴＡＰを用いたキャリアを導入した場合は、１．６５倍上昇した。４，８日後においても同様の傾向がみられ、カチオン性脂質としてＤＯＴＡＰを用いたキャリアを添加した細胞は８日後において、コントロールに対してアセチル化量が２倍上昇していた。
（３）細胞分化率評価
２，４，８日後における顆粒球への分化率は、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤のみを添加した場合、それぞれ２９，３３，３５％であった。一方でカチオン性脂質としてＤＯＴＡＰを用いたキャリアを導入した細胞の分化率は、それぞれ４５，５１，５９％であった。

小括
本実施例では、遺伝子導入によるエピジェネティクス修飾の促進および阻害剤による逆反応の抑制を同時に行なうことでエピジェネティクス修飾制御を行なった。エピジェネティクス修飾のうちヒストンアセチル化を促進することで、抗がん治療が可能であることが見いだされた。

実施例１１ヒストンアセチル化酵素ＤＮＡ、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、リン酸カルシウム、及びポリグルタミン酸の４要素を含む担体を用いた遺伝子導入
本実施例では、ヒストンアセチル化酵素ＤＮＡ、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、ポリ乳酸、及びカチオン性脂質の４要素を含む担体を用いて遺伝子導入を行い、担体の機能評価、ヒストンアセチル化量評価及び細胞分化率評価を行った。

１１−１ＨｅｐＧ２細胞系
ＣＡＦプラスミドとＴＳＡの導入実験
（１）複合体の調製
２．５ＭＣａＣｌ_２溶液、１０ｍｇ／ｍｌポリグルタミン酸（ＰＬＥ）溶液をヒストンアセチル化酵素であるＣＡＦをコードしたプラスミドＤＮＡ溶液と混合した。Ｃａ^２＋の最終濃度は２５０ｍＭ、ＰＬＥの最終量は５μｇとなるように調製した。次に前述の混合溶液と等量のＨｅｐｅｓ／Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ溶液を混合し、数分間撹拌した後、３７℃で２４時間インキュベートした。インキュベート終了後、１００００ｒｐｍで５分間遠心分離し、複合体を回収した。
（２）複合体導入
ＨｅｐＧ２細胞は１×１０^５細胞／ｍｌで９６ウェルプレートに播種し、３７℃で２４時間インキュベートした。調製した複合体とヒストン脱アセチル化酵素阻害剤であるＴＳＡ（最終量が１μｇとなるように）をＨｅｐＧ２細胞に添加し、３７℃で２４時間インキュベートした。インキュベート終了後、細胞に取り込まれなかった複合体を除くために培地交換を行なった。その後２４時間毎に培地交換を２回行った。インキュベート終了後の細胞を細胞溶解用液により細胞溶解し、タンパク質溶液を得た。
（３）ヒストンアセチル化量評価（ウエスタンブロット解析）
ヒストンアセチル化量の変化を、ウエスタンブロット法により評価した。アセチル化ヒストンの評価は、Ａｃ−Ｈ３Ｋ９，Ｋ１８，Ｋ２７の抗体（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＪａｐａｎ社製）を用いて行なった。

具体的には、回収したタンパク質溶液を、タンパク質のジスルフィド結合を切断するために、還元剤を用いて９５℃で５分間インキュベートした。調製したサンプルを１５％ポリアクリルアミドゲルを用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なった。次に、メタノールにより親水化処理を行なったＰＶＤＦ膜と泳動したゲルとを重ね合わせ、ゲルからＰＶＤＧ膜へタンパク質を転写した。転写したＰＶＤＦ膜を、５％スキムミルクに浸けて、一時間放置した。その後、ＰＶＤＦ膜を、洗浄液を用いて洗浄した。洗浄したＰＶＤＦ膜は、一次抗体反応を行なった。一次抗体は、Ａｃ−Ｈ３Ｋ９，Ｋ１８，Ｋ２７の抗体（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＪａｐａｎ社製）およびコントロールである抗β−アクチン抗体を用いた。

一次抗体は、洗浄液で１０００倍に希釈して使用した。希釈した抗体溶液にＰＶＤＦ膜を浸し、６時間放置した。その後、ＰＶＤＦ膜を洗浄液を用いて洗浄した。次に、二次抗体反応を行なった。二次抗体は、抗ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）抗体を用いた。ＨＲＰ抗体は洗浄液で５０００倍に希釈して使用した。希釈した抗体溶液にＰＶＤＦ膜を浸し、６時間放置した。その後、ＰＶＤＦ膜を洗浄液を用いて洗浄した。最後に、検出試薬としてＥＣＬＰｒｉｍｅＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔｔｉｎｇＤｅｔｅｃｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ（ＧＥヘルスケアジャパン社製）を使用し、発光検出を行なった。検出試薬をＰＶＤＦ膜に滴下し、５分間静置した。その後、ＰＶＤＦ膜は、ＡＴＴＯ製の撮影装置ＡＥ−９３００Ｅｚ−ＣａｐｔｕｒｅＭＧを用いて化学発光検出を行なった。

１１−２ＨＬ６０細胞系
（１）キャリア導入
ヒト骨髄性白血病細胞（ＨＬ６０）は、細胞濃度１×１０^５細胞／ｍｌで１２ウェルプレートに播種し、３７℃で２４時間インキュベートした。ＣａＰ／ＣＡＦプラスミドＤＮＡ／ＴＳＡ／ＰＬＥ複合体は、ＨＬ６０細胞に添加し、３７℃で４８時間インキュベートした。インキュベート終了後の細胞は、一方は、顆粒球を特異的に染色する手法であるＮＢＴ染色により細胞分化率評価を行なった。他方では、細胞を細胞溶解用液により細胞溶解し、タンパク質溶液を得た。ヒストンアセチル化量の変化は、このタンパク質溶液を用いて、ウエスタンブロット法により評価した。
（２）ヒストンアセチル化量評価
ヒストンアセチル化量の変化は、ウエスタンブロット法により評価した。アセチル化ヒストンの評価は、Ａｃ−Ｈ３Ｋ９、Ａｃ−Ｈ３Ｋ１８、Ａｃ−Ｈ４Ｋ１２の抗体（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＪａｐａｎ社製）を用いて行なった。
（３）細胞分化率評価（ＮＢＴ染色）
ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）溶液は、０．２％ＮＢＴ、２０％ＦＢＳとなるように調製した。インキュベート終了後のＨＬ６０細胞を、１×１０^６細胞／ｍｌとなるようにＲＰＭＩ培地に懸濁した。次にＲＰＭＩ培地と等量のＮＢＴ溶液を加え、さらにホルボールミリスチルアセテート（ＰＭＡ）を２×１０^−６Ｍとなるように添加し、３７℃で３０分インキュベートした。インキュベート終了後、１２００ｒｐｍで５分遠心分離し、上清を除去した。最後に、ＰＢＳに再懸濁させ、血球計数盤を用いて細胞のカウントを行なった。分化率（％）は、１００×染色された細胞数／全細胞数として求めた。

１１−３結果
（１）ＨｅｐＧ２細胞系−ＣＡＦプラスミドＤＮＡとトリコスタチンＡを用いた実験
何も添加していない細胞と比較して、ＣＡＦプラスミドＤＮＡのみを添加した細胞は、ヒストンアセチル化量が１．１０倍であり、トリコスタチンＡのみを添加した細胞では１．２１倍上昇していた。さらに、リン酸カルシウムキャリアを導入した細胞では、２．５１倍アセチル化量が上昇していた。
（２）ＨＬ６０細胞系
（ａ）ヒストンアセチル化量評価
何も添加していない細胞と比較して、ＣＡＦプラスミドＤＮＡのみを添加した細胞は、ヒストンアセチル化量が１．７４倍であり、トリコスタチンＡのみを添加した細胞では１．７５倍であった。さらに、リン酸カルシウムキャリアを導入した細胞では、１．８９倍アセチル化量が変化していた。
（ｂ）細胞分化率評価
トリコスタチンＡのみを添加した細胞では、２７％の細胞が顆粒球へ分化していた。一方で、リン酸カルシウムキャリアを添加した細胞は、３６％が顆粒球へ分化していた。

実施例１２アニオン性高分子を用いたクロマチン構造の制御
本実施例では、細胞内における、アニオン性高分子によりクロマチン構造を工学的に制御について記載する。アニオン性高分子であるポリアスパラギン酸−エチレンジアミン−β−シクロデキストリン（ＰＬＤ−ＥＤＡ−β−ＣＤ）を核内導入し、クロマチン構造の弛緩およびクロマチン構造の弛緩に伴うヒストンアセチル化量の上昇が見出された。

１２−１
（１）６−Ｏ−Ｔｓ−β−ＣＤの合成（Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２０１１，９，７７９９）
β−シクロデキストリン（ＣＤ）５ｇ（１２．３ｍｍｏｌ）を４１ｍＬの水に添加し、０．６ｇ（４１ｍｍｏｌ）の水酸化ナトリウムを溶解させた水酸化ナトリウム水溶液１．７ｍＬを１５分間かけて添加した。その後反応液を氷中に移し、２．５ｍＬのアセトニトリルに溶解した１．０２ｇ（１４．８ｍｍｏｌ）のＴｓＣｌ（ｐ−トルエンスルホニルクロリド）を２５分かけて添加した。その後氷中で４時間撹拌し、桐山ろ紙（Ｎｏ．５）によって沈殿をろ過し、ろ液を４℃で一晩静置した。生じた結晶を桐山ろ紙（Ｎｏ．４）で回収し、水とエタノールによって洗浄した。エタノールをデシケーター内で乾燥させ、１．０５ｇの６−Ｏ−Ｔｓ−β−ＣＤを得た。
（２）ＰＬＤ−ＥＤＡおよびＰＬＤ−ＥＤＡ−β−ＣＤの合成
ＰＬＤ（ポリアスパラギン酸）２０ｍｇ（０．２ｍｍｏｌ／ＣＯＯＨ）、ＨＯＢｔ（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール）２７．７ｍｇ（０．２ｍｍｏｌ）、ＰｙＢＯＰ（（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスファート）１０５．１ｍｇ（０．２ｍｍｏｌ）に脱水ＤＭＦ１０ｍＬ中に溶解し、超音波を照射しながら１０分間インキュベートした。次いで、２ｍＬの脱水ＤＭＦ中に溶解したＮ−Ｂｏｃ−ＥＤＡ（Ｎ−ブトキシカルボニルエチレンジアミン）３２０ｍｇ（２．０ｍｍｏｌ）を加え、閉鎖系で、６０℃オイルバス中で４８時間撹拌した。反応液を室温まで放冷した後に２０倍量のエタノール中に沈殿させ、３０分間３５００ｒｐｍで遠心した。上澄みを捨て、新たにエタノールを４０ｍＬ加えて３０分間３５００ｒｐｍで遠心し、この操作を２回繰り返した。

残った沈殿をエタノールを用いてバイアル瓶へ流し込み、７０℃常圧で一晩エタノールを乾燥させた。生成した粉末に１ｍＬのＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）を加えて１時間撹拌し、反応液は２０ｍＬのジエチルエーテル中に沈殿した。上澄みは４割以上を捨てた後に再び２０ｍＬになるまでジエチルエーテルを加え、この操作を５回繰り返した。室温で一晩ジエチルエーテルを乾燥させた後、残った固体を２０ｍＬの超純水に溶解し、５日間凍結乾燥し、３．９ｍｇのＰＬＤ−ＥＤＡを得た。

得られたＰＬＤ−ＥＤＡ３．９ｍｇ（０．０４ｍｍｏｌ／ＥＤＡ）と６−Ｏ−Ｔｓ−β−ＣＤ５０ｍｇ（０．４ｍｍｏｌ）を脱水ＤＭＳＯ４ｍＬに溶解し、７０℃オイルバス中で４８時間撹拌し、反応液を室温まで放冷した後、水中で分画分子量３５００の再生セルロース膜を用いて透析を行った。その後、凍結乾燥を４８時間行い、５．０ｍｇのＰＬＤ−ＥＤＡ−β−ＣＤを得た。
（３）ＰＬＤ−ＥＤＡ−β−ＣＤの同定
ＰＬＤ−ＥＤＡ−β−ＣＤはＧＦＣによってフリーなＣＤの除去と分子量損失がないことを確認し、^１Ｈ−ＮＭＲよりＣＤ由来のピークおよびＰＬＤ由来のピークを確認した。
（４）ＰＬＤ−ＥＤＡ−β−ＣＤのＦＩＴＣラベル化
先の項で合成したＰＬＤ−ＥＤＡ−β−ＣＤ２．５ｍｇ（３μｍｏｌ／ＮＨ_２）を１．１７ｍｇ（３μｍｏｌ）のＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）とともに１０ｍＭＫ_２ＣＯ_３中で遮光しながら室温で２時間撹拌し、ＦＩＴＣラベル化を行った。その後分画分子量３５００の膜を用いて水中で遮光しながら６日間透析し、残った不溶性の物質を３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することで取り除き、上清を２日間凍結乾燥することでＦＩＴＣラベル化ＰＬＤ−ＥＤＡ−β−ＣＤを得た。

１２−２共焦点顕微鏡によるＰＬＤ−ＥＤＡ−β−ＣＤの細胞内導入の観察
スライドガラス上にＨｅＬａ細胞を３×１０^４ｃｅｌｌｓ／ウェルの濃度で播種して３７℃、５％ＣＯ_２下でインキュベートした。８時間後に培地を交換し、ＰＬＤ−ＥＤＡ−β−ＣＤ３０μｇ／ウェルを添加した。さらに１６時間３７℃、５％ＣＯ_２下でインキュベートし、培地を全て吸引した後にＰＢＳ（−）で洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで細胞を固定した後にＤＡＰＩ溶液（１万分の１希釈）により細胞核を染色した。ＰＢＳ（−）で２回洗浄した後、５０％グリセロールで試料をマウントし、遮光して保管した。

共焦点顕微鏡観察はオリンパス社のＦＶ１０００−Ｄを用いて行った。波長それぞれＦＩＴＣ／ＤＡＰＩに最適化された波長により励起・観察した。

１２−３遺伝子導入およびウエスタンブロット法によるクロマチン構造弛緩評価
アニオン性高分子の核内導入によってクロマチン構造が弛緩し、ヒストンが露出すると、ヒストンテイルへのヒストンアセチル化酵素（ＨＡＴ）のアクセシビリティーが向上し、アセチル化ヒストン量が増加すると考えられる。従って、そのアセチルヒストン量をウエスタンブロット法により定量する。

ＨｅＬａ細胞を１２ウェルプレートに５×１０^４細胞／ウェルで播種し、３７℃、５％ＣＯ_２下でインキュベートした。８時間後に培地を交換し、ＰＬＤ−ＥＤＡ−β−ＣＤ１００μｇ／ウェルを添加した。さらに１６時間同条件下でインキュベートし、培地を全て吸引した後に、ヒストンアセチル化酵素（ＨＡＴ）をコードしたプラスミドＤＮＡをリポフェクチンと電荷比（＋／−）１で混合し、１時間リン酸バッファー中でインキュベートすることで調製した複合体を添加した（ＤＮＡ量１μｇ／ウェル）。その後、細胞を同条件下で４８時間インキュベートし、培地を吸引した後ＰＢＳ（−）で洗浄し、５×細胞溶解用液７５μＬ／ウェルを添加することで細胞溶解物を回収した。回収したライセートにＰＢＳ（−）２００μＬを添加し、不溶性のタンパク質を取り除くために５０００×ｇで１０分間遠心分離を行った。上清２００μＬは、タンパク質のジスルフィド結合を切断するために還元剤を用いて、９５℃で５分間インキュベートした。

サンプルの３０μＬをロードし、３０ｍＡ一定の条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。３０分間の泳動後、ＰＶＤＦ膜へのブロッティングを１００Ｖ一定の条件で９０分間行い、ＰＶＤＦ膜を１時間ブロッキングした。ブロッキング後のＰＶＤＦ膜を１×ＴＢＳ−Ｔにより５分間４００ｒｐｍで震盪することによって洗浄し、この操作を３回繰り返した。その後ウサギ由来のアセチル−Ｈ３抗体、アセチル−Ｈ４抗体・β−アクチン抗体それぞれ３μＬを含む３ｍＬの１×ＴＢＳ−Ｔ中で、ＰＶＤＦ膜を１２時間４℃でインキュベートした。さらにＰＶＤＦ膜を１×ＴＢＳ−Ｔで前述の通り洗浄し、ウサギ由来のＨＲＰ結合２次抗体３μＬを含む３ｍＬの１×ＴＢＳ−Ｔ中で６時間インキュベートした。１×ＴＢＳ−Ｔで前述の洗浄を行った後、アルカリホスファターゼによる発色処理を行い、ＣＳアナライザーによって露光時間４分でバンドを検出した。

１２−４結果
（１）共焦点顕微鏡観察の結果
共焦点顕微鏡観察の結果を図７Ａ−図７Ｄに示す。図７Ａ−Ｄは各々、（Ａ）細胞核を染色したＤＡＰＩによる蛍光像、（Ｂ）ＦＩＴＣラベル化ＰＬＤ−ＥＤＡ−β−ＣＤによる蛍光像、（Ｃ）微分干渉像、そして、（Ｄ）Ａ−Ｃの画像を結合させたものである。図７より、細胞核の領域に、ＰＬＤ−ＥＤＡ−β−ＣＤが局在していることが示された。なお、ＣＤ修飾を行っていないＰＬＤ−ＥＤＡは核への局在が観察されなかった。限定されるわけではないが、「ＥＤＡ」部分は、アニオン性高分子（ＰＬＤ）と細胞間膜の反発を防ぐためのスペーサーとして、「ＣＤ」部分は細胞膜コレステロールとの相互作用により、脂質に富む領域にポリマーが留まるために機能していると考えられる。
（２）ウエスタンブロットによるアセチルヒストン量の変化（ＫＳＢ１０２）
ＨｅＬａ細胞におけるヒストンＨ３およびＨ４のアセチル化量はアニオン性ポリマー／ＨＡＴ／リポフェクチン複合体のいずれも添加していないコントロールの場合と比較して、ＨＡＴ／リポフェクチンを加えたものでは３．９倍アセチル化量が増加し、アニオン性ポリマー添加後にＨＡＴ／リポフェクチンを加えたものではコントロールに対して４．７倍アセチル化量の増加を示した。
［配列表］

Claims

以下の
ｉ）ヒストンアセチル化酵素をコードする遺伝子を含む発現ベクター；
ｉｉ）ヒストンメチル化酵素をコードする遺伝子を含む発現ベクター；
ｉｉｉ）ヒストン脱アセチル化酵素をコードする遺伝子を含む発現ベクター；
ｉｖ）ヒストン脱メチル化酵素をコードする遺伝子を含む発現ベクター；
ｖ）ヒストンアセチル化阻害剤；
ｖｉ）ヒストン脱アセチル化阻害剤；及び
ｖｉｉ）ヒストン脱メチル化阻害剤
からなるグループから選択される、２種類またはそれ以上の物質を包摂する担体、
並びに、
カルボキシメチル化ポリビニルイミダゾール
を含む、クロマチン構造を制御するための組成物。
２種類またはそれ以上の物質が、以下の
ｉ）ヒストンアセチル化酵素をコードする遺伝子を含む発現ベクター；
ｉｉｉ）ヒストン脱アセチル化酵素をコードする遺伝子を含む発現ベクター；
ｖ）ヒストンアセチル化阻害剤；及び
ｖｉ）ヒストン脱アセチル化阻害剤；
からなるグループから選択される、請求項１に記載の組成物。
２種類またはそれ以上の物質が、以下の
ｉｉ）ヒストンメチル化酵素をコードする遺伝子を含む発現ベクター；
ｉｖ）ヒストン脱メチル化酵素をコードする遺伝子を含む発現ベクター；及び
ｖｉｉ）ヒストン脱メチル化阻害剤
からなるグループから選択される、請求項１に記載の組成物。
担体が、ポリエステル、リン酸カルシウム、又はポリアミノ酸を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
担体が、さらに、ＤＮＡ脱メチル化酵素をコードする遺伝子を含む発現ベクター、ＤＮＡメチル化酵素をコードする遺伝子を含む発現ベクター、あるいは、ＤＮＡメチル化酵素阻害剤、を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
担体がリン酸カルシウムである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
クロマチン構造を弛緩するための、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物をｉｎｖｉｔｒｏ又はｅｘｖｉｖｏで投与することにより、クロマチン構造を制御する方法。