CN111214461B - 糖靶向修饰siRNA纳米粒子的制备及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了糖靶向修饰siRNA纳米粒子的制备及应用，涉及纳米颗粒载药技术领域。一种糖靶向纳米粒子，其包括靶向纳米载体，靶向纳米载体由靶向分子、第一连接化合物、第一亲水性生物材料、第二连接化合物和阳离子化合物通过化学键依次连接；第一连接化合物和第二连接化合物均具有羧基；第一连接化合物同时具有马来酰亚胺基，靶向分子为环己醛糖。设置靶向分子为环己醛糖，有利于纳米粒子靶向血脑屏障上的毛细血管内皮细胞膜上的GLUT‑1蛋白，通过GLUT‑1蛋白转运环己醛糖的作用将纳米粒子高效率的转运至大脑中，从而有效的通过血脑屏障，有利于提升糖靶向纳米粒子穿透BBB的效率。

Description

糖靶向修饰siRNA纳米粒子的制备及应用
技术领域
本发明涉及纳米颗粒载药技术领域，具体而言，涉及糖靶向修饰siRNA纳米粒子的制备及应用。
背景技术
阿尔茨海默(AD)是一种进行性神经退行性疾病，全球有4000多万人患有阿尔茨海默氏症，这是一种最常见的与年龄相关的神经退行性疾病，以学习、记忆和其他认知功能逐渐丧失为特征。已有批准的治疗方法是使用一些神经递质调节剂，比如由胆碱酯酶抑制剂和NMDAR拮抗剂组成的美金刚。虽然这些治疗针对AD的症状可以为患者提供一些缓解和安慰，但他们并没有阻止疾病本身的进展。该疾病严重影响人类身心健康及生活质量，是世界性重大医学难题之一。
RNA干扰(RNA interference,RNAi)是由双链RNA(double-strand RNA,dsRNA)引发的序列特异性的转录后基因沉默机制。长度约为21-23个碱基对的小干扰核糖核酸(small interfering RNA,RNA)RNAi的效应分子，在胞内通过RNA诱导基因沉默复合物的生成，序列特异性降解mRNA，而使目的蛋白表达量下调。siRNA作为一种药物治疗疾病已经显示了巨大的应用前景，然而，siRNA作为生物活性的核酸类物质，存在稳定性差和吸收率低的缺陷，裸露的siRNA进入血清易被核酸酶降解，且siRNA带负电荷，亲水性强，导致其不易透过细胞膜进入细胞质发挥高效的RNAi作用。siRNA的输运是其能否应用于临床的关键瓶颈，设计和合成安全有效的siRNA输运载体成为目前siRNA药物研发的重要方向。
目前已有很多载体用于改善siRNA的核酸酶抗性而又不干扰其沉默效率。其中，细胞穿膜肽(cell-penetrating peptides，CPPs)作为基因递送载体被广泛研究且表现出很大的优势。但是，由于siRNA和小分子药物具有不同的物理、化学和生物学特性(例如不同的分子量、疏水性、亲水性和系统稳定性等)以及siRNA的聚阴离子性质、相对较大的分子量，裸siRNA可以被血清核糖核酸酶快速降解，并且几乎不能穿过细胞膜，由于以上多种限制因素，故而设计高效的siRNA/药物共递送体系具有一定挑战性。研究人员已经开发了各种病毒和非病毒递送载体以改善体内RNAi治疗的功效。病毒载体与非病毒载体相比具有较高的转染效率，但其与插入诱变以及免疫原性相关限制了其在治疗中的使用。
此外，阿尔茨海默难以达到有效的治疗原因之一在于受到血脑屏障(BBB)的阻碍，药物很难有效地到达病灶部位，从而治疗效果不尽人意。为了解决药物递送困难及药物作用效率低等问题，需要选择一种能够穿过血脑屏障，靶向脑部的纳米级递送载体。
纳米颗粒在生物医学上的巨大潜力诸如生物相容性、低毒性、伸展性等特性已吸引了研究人员的广泛专注。通常，siRNA/药物纳米载体应当是无毒的并且对于全身给药是非免疫原性的，有很好的生物相容性。siRNA纳米载体通过静电相互作用或化学共轭有效地缩合siRNA，而药物纳米载体通过物理包封，包合物的形成或直接化学共轭有效地包封药物。除了这些特征之外，siRNA/药物共递送纳米载体应在血流中提供更好的半衰期，能够同时递送siRNA和小分子药物至目标细胞/组织，并促进其细胞内摄取和随后的基因沉默，对其个体释放动力学和药理作用没有不利影响。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供糖靶向修饰siRNA纳米粒子的制备及应用以解决上述技术问题。
本发明是这样实现的：
一种糖靶向纳米粒子，其包括靶向纳米载体，靶向纳米载体由靶向分子、第一连接化合物、第一亲水性生物材料、第二连接化合物和阳离子化合物通过化学键依次连接；第一连接化合物和第二连接化合物均具有羧基；第一连接化合物同时具有马来酰亚胺基，靶向分子为环己醛糖。
靶向纳米载体由靶向分子、第一连接化合物、亲水性生物材料、第二连接化合物和阳离子化合物通过化学键依次连接，设置靶向分子为环己醛糖，有利于糖靶向纳米粒子靶向血脑屏障上的毛细血管内皮细胞膜上的GLUT-1蛋白。小鼠饥饿24小时后，再通过腹腔注射glucose溶液(20％wt)，刺激血脑屏障上的GLUT-1受体由血管外侧转向血管内侧，从而将大量的糖靶向纳米粒子转运到大脑中，从而有效的通过血脑屏障，有利于提升糖靶向纳米粒子穿透BBB的效率。第一连接化合物和第二连接化合物均通过羧基分别与靶向分子和第一亲水化合物共价连接。
当糖靶向纳米粒子载有siRNA时，保证了siRNA高效的到达目标部位，进而发挥药效。靶向纳米载体含有亲水性生物材料以提升糖靶向纳米粒子的生物相容性。设置第一连接化合物从而将靶向分子与亲水性生物材料枝接。阳离子化合物作为亲水段，不仅可以用于后续与FPMA共同构成一个稳定的纳米结构，同时也可通过盐桥作用负载siRNA，起到装载核酸药物的作用。在本发明应用较佳的实施方式中，阳离子化合物为GUA。
GUA为一种阳离子单体，为N-(3-甲基丙烯酰胺基丙基)胍盐氯化物，靶向纳米载体通过连接GUA可以进一步提升靶向纳米载体的亲水性，促进靶向纳米载体的相容性。第二连接化合物用于将亲水性生物材料和GUA枝接。上述提供的靶向纳米载体可以用于包覆siRNA以制备治疗剂。
在本发明应用较佳的实施例中，上述环己醛糖为葡萄糖或半乳糖。设置靶向分子为葡萄糖或半乳糖，有利于糖靶向纳米粒子靶向血脑屏障上的毛细血管内皮细胞膜上的GLUT-1蛋白，通过GLUT-1蛋白转运葡萄糖或半乳糖的作用将糖靶向纳米粒子高效率的转运至大脑中，从而有效的通过血脑屏障。
在本发明应用较佳的实施例中，上述第一亲水性生物材料含有巯基和氨基。靶向分子与第一连接化合物通过酯化反应进行接枝连接，第一连接化合物接枝于第一亲水性生物材料含巯基的一端，第一亲水性生物材料的氨基端与第二连接化合物的羧基端脱水缩合连接，阳离子化合物与第二连接化合物聚合连接。
在本发明应用较佳的实施例中，上述第一连接化合物为马来酰亚胺基丙酸，第二连接化合物为CPADB。
通过上述各个基团的化学连接实现了靶向分子、亲水性生物材料和GUA的共价枝接。
在本发明应用较佳的实施例中，上述第一连接化合物为马来酰亚胺基丙酸，第二连接化合物为CPADB。马来酰亚胺的羧基与靶向分子的羟基发生酯化反应，从而将马来酰亚胺接枝在靶向分子上。
在本发明应用较佳的实施例中，上述亲水性生物材料为PEI、聚赖氨酸或HS-PEG-NH2。
在本发明应用较佳的实施例中，上述亲水性生物材料为HS-PEG-NH2。
在本发明应用较佳的实施例中，上述HS-PEG-NH2的分子量为2000。接枝后的产物与亲水性生物材料的巯基进行迈克尔加成反应，从而将靶向分子接枝到聚乙二醇上。CPADB(C13H13NO2S2)购买自Sigma-Aldrich，CPADB通过羧基与HS-PEG-NH2的氨基发生脱水缩合反应。进一步的，将脱水缩合后的产物与GUA聚合得到靶向纳米载体。
在本发明应用较佳的实施例中，上述糖靶向纳米粒子还包括非靶向含氟纳米载体，非靶向含氟纳米载体与靶向纳米载体自组装连接，非靶向纳米载体由第二亲水性生物材料、第二连接化合物、阳离子化合物和疏水嵌段通过化学键依次连接。
通过无规共聚的方法将第二亲水性生物材料、第二连接化合物、阳离子化合物与疏水嵌段聚合得到非靶向含氟纳米载体
在本发明应用较佳的实施方式中，非靶向含氟纳米载体以含氟的FPMA作为疏水嵌段，再辅以GUA作为亲水单体，具有两性的非靶向含氟纳米载体在血液中具有更好的稳定性，将非靶向含氟纳米载体与靶向纳米载体以一定的摩尔比在水相中自组装，有效提高了糖靶向纳米粒子的稳定性，延长了糖靶向纳米粒子在血液循环的时间，使得糖靶向纳米粒子在血流中具有更好的半衰期，增加了糖靶向纳米粒子在目标部位的有效积累。为后续同时递送siRNA和小分子药物至目标细胞/组织提供了方便，这样将非靶向含氟纳米载体与靶向纳米载体组装既促进了血液循环时间的延长，又增加了脑中的积累量。
在本发明应用较佳的实施例中，上述第二亲水性生物材料为PEG-NH2，第二连接化合物CPADB。
在本发明应用较佳的实施例中，上述第二亲水性生物材料远离第二连接化合物的一端修饰有封闭基团。
在本发明应用较佳的实施例中，上述封闭基团为烷氧基。
在本发明应用较佳的实施例中，上述封闭基团为甲氧基。
在本发明应用较佳的实施例中，上述制备非靶向含氟纳米载体的方法包括先将非靶向含氟纳米载体中的亲水性生物材料与第二连接化合物脱水缩合反应，再将脱水缩合反应产物、阳离子化合物和疏水嵌段共聚反应。疏水嵌段为FPMA；阳离子化合物为GUA。
在本发明应用较佳的实施例中，上述脱水缩合反应产物、GUA和FPMA共聚反应添加摩尔比为100-110：1800-2000：1。
在本发明应用较佳的实施例中，上述共聚反应的温度为60-70℃。
在本发明应用较佳的实施例中，上述共聚反应的时间为24-48h。
在上述共聚反应条件下，合成的目标聚合物接枝效率最高。
通过修饰封闭基团以杜绝非靶向纳米载体接枝靶向分子。
在本发明应用较佳的实施例中，上述靶向纳米载体与非靶向含氟纳米载体的摩尔比为2-5:10。
在本发明应用较佳的实施例中，上述靶向纳米载体与非靶向含氟纳米载体的摩尔比为2.5:7.5。
当靶向纳米载体与非靶向含氟纳米载体的摩尔比为2.5:7.5时，制得的糖靶向纳米粒子进脑效率最高。
在本发明应用较佳的实施例中，上述非靶向含氟纳米载体中GUA的聚合度为16-20，FPMA的聚合度为2-6。当非靶向含氟纳米载体中GUA的聚合度为16-20，FPMA的聚合度为2-6时，接枝效率最好。
一种糖靶向修饰siRNA的纳米粒子，其包括糖靶向纳米粒子，且糖靶向纳米粒子中的靶向纳米载体包覆于siRNA的周围，siRNA为BACE1 siRNA或抑制Aβ聚集的siRNA；
BACE1 siRNA的正义链的核酸序列如SEQ NO.1所示，BACE1 siRNA的反义链的核酸序列如SEQ NO.2所示。
靶向纳米载体通过静电相互作用有效地连接siRNA，将siRNA包覆于糖靶向纳米粒子内，避免了裸露的siRNA进入血清易被核酸酶降解或被巨噬细胞所吞噬，且靶向纳米载体带正电荷，使其容易透过细胞膜进入细胞质发挥高效的RNAi作用。BACE1 siRNA可以特异性的针对BACE1基因进行基因沉默，从而抑制β-淀粉样蛋白的生成和积累，从而实现阿尔茨海默病(AD)的治疗。
在本发明应用较佳的实施例中，上述糖靶向纳米粒子还包括非靶向含氟纳米载体，非靶向含氟纳米载体与靶向纳米载体自组装连接。
在本发明应用较佳的实施例中，上述非靶向含氟纳米载体与siRNA的摩尔比为1.5-5:1。
在本发明应用较佳的实施例中，上述非靶向含氟纳米载体与siRNA的质量比为2.5:1。
当非靶向含氟纳米载体与靶向纳米载体以3:1的摩尔比混合均匀后，再与siRNA的质量比为2.5:1孵育时，制得的糖靶向纳米粒子可以更好的装载siRNA，且制得的糖靶向纳米粒子粒径保持在120-160nm之间，PDI(聚合物分散性指数)低于0.2。
一种载siRNA的糖靶向纳米粒子的制备方法，其包括：将糖靶向纳米粒子与siRNA混合孵育；
或将第一试剂、第二试剂与siRNA混合共孵育；
在本发明应用较佳的实施例中，上述孵育时间为0.5-1.5h。
在本发明应用较佳的实施例中，上述孵育是在缓冲液中进行。
在本发明应用较佳的实施例中，上述缓冲液为Hepes缓冲液。
Hepes缓冲液是一种氢离子缓冲剂，能较长时间控制恒定的pH范围。本实施例中控制pH为7.2-7.4。
在本发明应用较佳的实施例中，上述制备方法还包括将非靶向含氟纳米载体与靶向纳米载体和siRNA混合自组装。
通过混合自组装从而将siRNA包覆在非靶向含氟纳米载体与靶向纳米载体形成的无规共聚物中。
一种载siRNA的糖靶向纳米粒子在制备阿尔茨海默治疗剂中的应用。
上述载BACE1 siRNA的糖靶向纳米粒子可以制备为治疗剂，特异性的针对BACE1基因进行基因沉默，从而抑制β-淀粉样蛋白的生成和积累，从而实现阿尔茨海默病(AD)的治疗。
采用纳米颗粒的用于制备阿尔茨海默治疗剂的潜在优势包括：不需要改变药物分子的结构的前提下具有改善药物的药理性质的能力，通过以组织或细胞特异性方式靶向递送药物来增强治疗功效，纳米颗粒可跨越上皮和内皮等一系列生物屏障进行药物递送，纳米颗粒可将药物递送至细胞内作用部位，纳米颗粒具有递送具有不同物理化学性质的治疗剂以及核酸类药物的能力。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了糖靶向修饰siRNA纳米粒子的制备及应用，靶向纳米载体由靶向分子、第一连接化合物、亲水性生物材料、第二连接化合物和阳离子化合物通过化学键连接，设置靶向分子为环己醛糖，有利于糖靶向纳米粒子靶向血脑屏障上的毛细血管内皮细胞膜上的GLUT-1蛋白，通过GLUT-1蛋白转运环己醛糖的作用将糖靶向纳米粒子高效率的转运至大脑中，从而有效的通过血脑屏障，有利于提升糖靶向纳米粒子穿透BBB的效率。
当糖靶向纳米粒子载有siRNA时，靶向纳米载体通过静电相互作用有效地连接siRNA，将siRNA包覆于糖靶向纳米粒子内，避免了裸露的siRNA进入血清易被核酸酶降解，且靶向纳米载体带正电荷，使其容易透过细胞膜进入细胞质发挥高效的RNAi作用。此外，通过包覆靶向纳米载体，为siRNA在血液中提供了更好的半衰期。设置BACE1 siRNA或抑制Aβ聚集的siRNA可以特异性的针对BACE1基因或Aβ聚集相关的基因进行基因沉默，从而抑制β-淀粉样蛋白的生成和积累，从而实现阿尔茨海默病(AD)的治疗。因此，上述提供的糖靶向纳米粒子可以用于包覆siRNA以制备AD治疗剂。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为实施例1和实施例2制得的聚合中间产物和终产物进行核磁共振分析图；
图2为实验例1的聚合中间产物和终产物核磁共振分析图；
图3为实施例4制备得到的载siRNA的糖靶向纳米粒子进行糖靶向纳米粒子物性检测图；
图4为载siRNA的糖靶向纳米粒子进行流式细胞检测、Confocal成像观察、细胞毒性实验和体外基因沉默实验结果图；
图5为药代动力学和生物分布结果图；
图6为小鼠的行为学实验结果图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供了一种靶向纳米载体的制备方法，具体包括如下有机合成步骤。本实施例中的靶向分子为半乳糖(Gal)，第一连接化合物为马来酰亚胺基丙酸，第二连接化合物为CPADB，第一亲水性生物材料为HS-PEG-NH2。
dGal和dGal-Mal的结构式如下所示：
Figure GDA0002940676530000101
通过羧基与羟基的酯化反应将马来酰亚胺接枝到半乳糖上，具体反应步骤如下：将3-马来酰亚胺基丙酸(0.50g，2.96mmol)和1,2,3,4-二-O-异亚丙基-D-α-吡喃半乳糖(0.82g，3.15mmol)溶在12mL吡啶/二氯甲烷中的溶液(1/1＝v/v)中，加入N-乙基-N'-(3-(二甲基氨基)丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)(0.695g，3.62mmol)，N，N-二甲基吡啶-4-胺(DMAP)(19mg，0.15mmol)，将反应混合物在室温下搅拌24小时。将有机相用二氯甲烷(12mL)稀释，并用2M HCl(4×15mL)，盐水洗三次，经无水硫酸钠干燥后用旋转蒸发仪浓缩至干。通过硅胶色谱法(丙酮/己烷＝1/1v/v；DCM:甲醇＝1:3)纯化获得的黄色油状物，即为产物Gal-Mal。合成反应的方程如下：
Figure GDA0002940676530000111
(2)合成阳离子单体(GUA)。
N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺盐酸盐(APM)的结构式如下：
Figure GDA0002940676530000112
通过氨基开环反应得到目标单体GUA，具体反应步骤如下：将N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺盐酸盐(APM)(0.50g，2.80mmol)，1H-吡唑-1-甲脒单盐酸盐(0.41g，2.80mmol)和TEA(0.80g，6.7mmol)溶解于DMF(8mL)中。加入对苯二酚(5mg)作为阻聚剂。将混合物在室温下在氮气环境中搅拌24小时，过膜后倒入乙醚(50mL)中。沉淀得到的油状物，离心(8000rpm，5min，4℃)除去上清液。用乙腈(10mL)和三乙胺(0.5mL)的溶液洗涤沉淀两次。用二氯甲烷(15mL)洗涤得到的固体后，将GUA的浅黄色粘性固体放入真空干燥箱中真空干燥制得GUA。合成反应的方程如下：
Figure GDA0002940676530000113
(3)合成dGal-HS-PEG
HS-PEG-NH2的结构式如下：
Figure GDA0002940676530000114
通过步骤(1)中的Gal-Mal与HS-PEG-NH2的巯基的迈克尔加成反应使得Gal接枝到聚乙二醇上，具体反应步骤如下：将dGal-MAL(12.4mg，30μmol)，HS-PEG-NH2(Mn＝2.0kg/mol，50mg，25μmol)溶于2.0mL DMSO/PB＝1:3的溶液中，室温条件下搅拌24h。将产物在超纯水中透析(MWCO＝500-1000)一天，后用冷冻干燥机冻干。
合成反应的方程如下：
Figure GDA0002940676530000121
(4)合成dGal-PEG-CPADB。
在冰浴条件下，将CPADB(38.4mg，0.14mmol)和NHS(16.8mg，0.15mmol)溶于7mLDCM中，向反应液中缓慢滴加EDC的DCM溶液(68.1mg，0.35mmol溶于1.5mLDCM)滴加结束一小时后撤掉冰浴。将反应混合物在室温下搅拌20h，加入步骤(3)合成的dGal-HS-PEG(50mg，0.025mmol)，使反应在室温下搅拌8小时。通过在冷乙醚中沉淀，离心(8000rpm,5min,4℃),收集沉淀,并真空干燥，制得dGal-PEG-CPADB。合成反应的方程如下：
Figure GDA0002940676530000122
(5)合成dGal-PEG-PGUA。
将反应所用双颈瓶提前通氮气30min，然后取步骤(2)合成的GUA(128mg，0.58mmol)，步骤(4)合成的Gal-PEG-CPADB(Mn＝2.0kg/mol，40mg，18μmol)和AIBN(0.52mg，6μmol)溶于4mL DMF中。将反应容器密封并浸入恒温65℃的油浴中。聚合进行48小时。用纯水将产物Gal-PEG-PGUA透析(MWCO＝500-1000)一天，用冷冻干燥机干燥。合成反应的方程如下：
Figure GDA0002940676530000131
(6)去保护
将聚合物dGal-PEG-PGUA(45mg)在80％甲酸(2mL)中室温搅拌6h，加入去离子水(1.5mL)，持续搅拌3h，减压除去溶剂。
Figure GDA0002940676530000141
实施例2
本实施例提供了一种非靶向纳米载体(MeO-PEG-PGUA和MeO-PEG-PGUAF)的制备方法，具体包括如下有机合成步骤。本实施例中的第二连接化合物为CPADB，第二亲水性生物材料为MeO-PEG-NH2。
(1)合成MeO-PEG-CPADB。
在冰浴条件下，将CPADB(230.4mg，0.696mmol)和NHS(100.8mg，0.852mmol)溶于43.8mL DCM中，向反应液中缓慢滴加EDC的DCM溶液(408.6mg，1.986mmol溶于8.766mL DCM)滴加结束一小时后撤掉冰浴。将反应混合物在室温下搅拌20个小时，加入MeO-PEG-NH2(464mg,0.232mmol)，使反应在室温下搅拌8小时。通过在冷乙醚中沉淀，离心(8000rpm，5min，4℃),收集沉淀,并真空干燥，得到MeO-PEG-CPADB。合成反应的方程如下：
Figure GDA0002940676530000151
(2)合成MeO-PEG-PGUA
将反应所用双颈瓶提前通氮气30min，然后取实施例1中步骤(2)制得的GUA(128mg，0.58mmol)，本实施例步骤(1)制得的MeO-PEG-CPADB(Mn＝2.0kg/mol，40mg，18μmol)和AIBN(0.52mg，3.2μmol)溶于4mL DMF中。将反应容器密封并浸入恒温在65℃的油浴中。使聚合进行48小时。用纯水将产物MeO-PEG-PGUA透析(MWCO＝500-1000Da)一天，用冷冻干燥机干燥。合成反应的方程如下：
Figure GDA0002940676530000152
(3)合成MeO-PEG-PGUAF。
FPMA的结构式如下：
Figure GDA0002940676530000153
将反应所用双颈瓶提前通氮气30min，然后取实施例1中步骤(2)制得的GUA(44mg，0.2mmol)，本实施例步骤(1)制得的MeO-PEG-CPADB(Mn＝2.0kg/mol，20mg，10μmol)，FPMA(2,2,3,3-四氟丙基甲基丙烯酸酯，购买自阿拉丁，CAS号:45102-52-1，20μg，0.1μmol)和AIBN(0.26mg，1.6μmol)溶于2mL DMF中。将反应容器密封并浸入恒温在65℃的油浴中。使聚合进行48小时。将产物MeO-PEG-PGUAF在纯水中透析(MWCO＝500-1000)一天。合成反应的方程如下：
Figure GDA0002940676530000161
实施例3
本实施例提供了一种糖靶向修饰siRNA的纳米粒子的制备方法。
首先，将siRNA干粉离心(7000rpm，4min)使siRNA沉淀后，加入500μL DEPC水，制成1mg/mL的siRNA溶液。
然后，取聚合物(1mg，包括实施例1制备的靶向纳米载体和实施例2制备的非靶向含氟纳米载体MeO-PEG-PGUAF溶于10mM Hepes缓冲溶液(pH＝7.4，10mg/mL)中，其中靶向纳米载体和非靶向载体的摩尔比为1:3，加入siRNA(15μM于10mM HEPES缓冲液)并在室温下孵育1小时。糖靶向纳米粒子按质量比聚合物:siRNA＝2.5:1进行制备。
实施例4
本实施例提供了一种糖靶向修饰siRNA的纳米粒子的制备方法。
首先，将siRNA干粉离心(7000rpm，4min)使siRNA沉淀后，加入500μL DEPC水，制成1mg/mL的siRNA溶液。
然后，取聚合物(1mg，实施例2制备的非靶向含氟载体MeO-PEG-GUAF以及靶向纳米载体Gal-PEG-PGUA溶于10mM Hepes缓冲溶液(pH＝7.4，10mg/mL)中备用，分别制备Fluorine-free Gal-NP和Fluorinated Gal-NP，加入siRNA(15μM于10mM HEPES缓冲液)并在室温下孵育1小时。糖靶向纳米粒子按质量比聚合物:siRNA＝1:1,2.5:1，5:1,10:1,20:1进行制备。
实施例5
本实施例提供了一种糖靶向修饰siRNA的纳米粒子的制备方法。与实施例3的制备方法区别在于，本实施例中靶向纳米载体不带有靶向分子，其余制备步骤相同。
实施例6
本实施例提供了一种糖靶向修饰siRNA的纳米粒子的制备方法。与实施例5的制备方法区别在于，本实施例中siRNA为siScramble序列，其余制备步骤相同。siScramble序列为对照siRNA，为沉默无效的siRNA。
siScramble序列的正义链核酸序列(如SEQ ID NO.3所示)为5’-UUC UCCGAA CGUGUC ACG UdTdT-3’，反义链核酸序列(如SEQ ID NO.4所示)为5’-ACG UGA CAC GUU CGGAGA AdTdT-3’。
实施例7
本实施例提供了一种糖靶向修饰siRNA的纳米粒子的制备方法。与实施例3的制备方法区别在于，本实施例中siRNA为siScramble序列，siScramble序列同实施例6中的siScramble序列相同，其余制备步骤相同。
实验例1
本实验例对实施例1和实施例2制得的聚合中间产物和终产物进行核磁共振分析，400MHz，氢谱16次，分析结果参照图1和图2所示，图1中的a图示出了Gal-Mal的接枝结果，b图为阳离子单体GUA的接枝结果，c图为MeO-PEG-CPADB的接枝结果图，d图为Gal-HS-PEG的接枝结果图，e图为Gal-PEG-CPADB的接枝结果图，f图为Gal-PEG-PGUA的接枝结果图。图2中的a图示出了MeO-PEG-PGUA的接枝结果，b图为MeO-PEG-PGUAF的接枝结果。
通过核磁结果分析，实施例1和实施例2成功合成了目标聚合物，其中，Gal-Mal接枝效率为100％，PEG接枝CPADB效率为97％，GUA聚合度为16-20，FPMA聚合度为2-6。
实验例2
本实验例对实施例4制备得到的糖靶向修饰siRNA的纳米粒子进行糖靶向纳米粒子物性表征。
(1)使用动态光散射测量糖靶向纳米粒子的粒径，将孵育好的纳米粒子吸取100μL加入测量皿中，25℃检测，检测结果参照图3所示，a图的左图为不含氟的非靶向载体MeO-PEG-PGUA载siRNA的粒径测量结果(GUA/siRNA)，a图的右图为含氟的非靶向载体MeO-PEG-PGUAF载siRNA的粒径测量结果(GUAF/siRNA)。
由图3中的a图可知，GUA/siRNA与GUAF/siRNA的粒径大小分别为133nm和124nm。PDI小于0.2。
(2)不同质量比的聚合物与siRNA结合，对不含氟的非靶向载体MeO-PEG-PGUA和含氟的非靶向载体MeO-PEG-PGUAF粒径(左图)和PDI(右图)影响结果参照图3中的b图所示。由图3中的b图可知，形成的纳米粒子粒径为120-160nm，PDI均小于0.2。
(3)通过琼脂糖凝胶电泳研究无规共聚糖靶向纳米粒子的siRNA结合能力。制备2％的琼脂糖凝胶，将实施例4中制备的糖靶向纳米粒子以及不含氟的靶向载体Gal-PEG-PGUA按质量比聚合物:siRNA＝1:1,2.5:1，5:1,10:1,20:1孵育30min，将孵育的混合物上样于2％的琼脂糖凝胶，在TAE溶液(40mM Tris/HCl，1v/v％乙酸和1mM EDTA)中(40V)电泳45分钟。使用蓝光切胶仪(G500312，生工生物工程股份有限公司)进行检测。
实验结果参照图3中的c图所示，通过凝胶阻滞实验可以看出在聚合物与siRNA质量比为2.5:1时可以很好的装载siRNA。
(4)通过TEM观察实施例4中糖靶向纳米粒子按质量比聚合物:siRNA＝2.5:1进行制备的糖靶向纳米粒子形貌。结果参照图3中的d图所示，糖靶向纳米粒子在TEM下形貌均一，粒径大小为70nm左右。
实验例3
本实验例对实施例3、实施例5制备的糖靶向修饰siRNA的纳米粒子进行流式细胞检测和Confocal成像观察。
流式细胞检测包括如下步骤：将Neuro-2a细胞接种于6孔板(1×106个细胞/孔)中，加入2mL培养基培养24h，随后将培养基吸走，分别加入含PBS、siRNA、NPs/Cy5 siRNA(即实施例5)、Gal-NPs/Cy5 siRNA(即实施例3)的培养基(200nm Cy5-siRNA)中37℃孵育4h，用0.25％(w/v)胰蛋白酶和0.03％(w/v)EDTA消化细胞。悬浮液1000G离心3min,PBS洗涤2次，重悬于500μLPBS中。1小时内进行流式细胞仪(BD FACS Calibur，Becton Dickinson,USA)测试，用Cell Quest软件圈取10000个细胞获得。
Confocal成像观察包括如下步骤：将Neuro-2a细胞接种于24孔板中(1×105个/孔)中，培养过夜，分别加入含PBS、siRNA、NPs/Cy5 siRNA(即实施例5)、Gal-NPs/Cy5 siRNA(即实施例3)的培养基37℃孵育4h,培养基被除去,PBS洗涤三次。PBS洗3次，4％多聚甲醛固定15min，0.1％TRITON X-100渗透15min，PBS洗3次，10μg/ml fluorescent phalloidin染色20-40min，PBS洗涤三次，DAPI(10μg/mL)染色10min，PBS洗三次。荧光图像采用共聚焦显微镜(TCS SP5,Leica Microsystems CMS GmbH,Germany)获得。
实验结果参照图4中的a图和b图所示，由图4中的a图和b图可以清晰看到糖靶向纳米粒子进入细胞情况。
实验例4
本实验例对实施例3、实施例5、实施例6和实施例7制备的糖靶向修饰siRNA的纳米粒子进行细胞毒性实验和体外基因沉默实验。
细胞毒性实验包括如下步骤：Neuro-2a细胞被接种在96孔板(6000个/孔)中，加入MEM培养基(含10％胎牛血清)培养24h。之后,将培养基更换为包含不同纳米粒子的培养基(400nM)和细胞进一步培养48h。然后,加入20μL的MTT溶液(5mg/mL)，继续培养4h后，移去培养基，加入150μLDMSO以溶解甲瓒。用酶标仪测定每孔在570nM处的吸光度,使用多功能酶标仪测量。所有数据均相对于未处理的对照细胞表达(n＝3)。
体外基因沉默实验包括如下步骤：采用qRT-PCR技术对Bace 1基因在细胞水平上的基因沉默活性进行了研究。将Neuro-2a细胞接种于6孔板(1×106个细胞/孔)中，加入MEM培养基(含10％胎牛血清)2mL，培养24h，用移液枪吸走培养基，分别加入含PBS、GUAF/siScramble(实施例6)、GUAF/siBACE1(实施例5)、Gal-GUAF/siScramble(实施例7)和Gal-GUAF/siBACE1(实施例3)(400nM siRNA)的新鲜培养基(2mL)。3天后用PBS冲洗细胞三次，用总RNA提取试剂盒(Tiangen)提取总RNA。反转录使用反转录试剂盒(takara)，qPCR采用TBGreenTM Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)基因表达检测方案，采用LightCycler480系统测得。mRNA表达量的计算采用ΔΔCt法(2-ΔΔCt)，结果以均值标准差(n＝3)表示。
实验结果参照图4中的c图和d图所示，由图4中的c图细胞毒性实验可以看出，在siRNA浓度为400nmol时，该聚合物纳米粒子没有毒副作用，通过d图体外基因沉默实验可以看出，该siBACE1序列对于BACE1具有显著性沉默效果。
实验例5
本实验例进行动物实验以探究带靶向的纳米粒子对比不带靶向的纳米粒子进脑的效率、半衰期及血糖变化。
(1)在体内药代动力学研究中，6-8周BALB/c小鼠随机分组(每组平行3只)，由尾静脉注射200μL的Free siRNA,Gal-GUA/Cy5siRNA(靶向纳米载体不含氟)、Gal-GUAF/Cy5siRNA(实施例3)(siRNA剂量为1mg/kg)，在预定时间点眼眶取血。取血样后，立即溶解于0.6mL裂解液(1％Triton X-100)中，37℃快速溶解，离心(14.8k rpm,30min)。采用荧光法测定上清液中Cy5的含量。血液循环遵循典型的两室模型:分布期快速下降和消除期较长。我们计算了两个阶段的半衰期(t1/2α和t1/2β)通过拟合实验数据使用模型:y＝A1exp(-x/t1)+A2exp(-x/t2)+y0,然后采t1/2,t1，t1/2α＝0.693*t1,β＝0.693*t2。
实验结果参照图5中的a图所示，药代动力学结果表明含FPMA的纳米粒子可以大大增加纳米粒子的血液循环时间。
(2)生物分布。
C57小鼠禁食24小时后，腹腔注射20％wt的葡萄糖溶液，半小时后尾静脉注射纳米药物到C57小鼠体内，1h后处死小鼠。取心、肝、脾、肺、肾、脑等主要脏器，清洗、干燥、称重。溶解于0.6mL裂解液(1％Triton X-100)中，室温匀浆4min，离心(14.8k rpm,30min)，取上清。上清液中Cy5用荧光法根据校准曲线测定，以每克组织注射剂量(％ID/g)表示。
实验结果参照图5中的b图所示，带靶向的纳米粒子对比不带靶向的纳米粒子进脑的效率具有显著性差异。
实验例6
本实验例经小鼠的行为学实验。
a.水迷宫实验。
Training：将小鼠头朝池壁放入水中，放入位置随机取东、西、南、北四个起始位置之一。记录动物找到水下平台的时间(s)。在前几次训练中，如果这个时间超过60s，则引导动物到平台。让动物在平台上停留10s。每只鼠每天训练4次，两次训练之间间隔15-20min，连续训练5天。
Probe test:训练结束的第二天，将平台撤掉，开始60s的探查训练。将动物由原先平台象限的对侧放入水中。记录动物在目标象限(原先放置平台的象限)所花的时间和进入该象限的次数，以此作为空间记忆的检测指标。
Reversal training：测定动物的工作记忆(workingmemory)。探查训练结束后的第二天，开始维持4天的对位训练。将平台放在原先平台所在象限的对侧象限，方法与1相同。每天训练4次。每次记录找到平台的时间和游泳距离以及游泳速度。
Reversal probe test:最后一次对位训练的第二天进行。方法与2类似。记录动物60s内动物在目标象限(平台第二次所在区)所花时间和进入该区的次数。
实验结果参照图6所示，通过水迷宫实验结果a图和b图可以看出撤掉平台后目标组AD小鼠在目标象限中停留时间相比于其他组具有显著性差异，具有明显记忆力改善情况，其他对照组与AD鼠的PBS组对比，则没有什么改善。每组n＝6。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 河南大学
<120> 糖靶向修饰siRNA纳米粒子的制备及应用
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 1
gaaccuaugc gaugcgaau 19
<210> 2
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 2
auucgcaucg cauagguuc 19
<210> 3
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 3
uucuccgaac gugucacgu 19
<210> 4
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 4
acgugacacg uucggagaa 19

Claims (13)

1.一种糖靶向纳米粒子，其特征在于，其包括靶向纳米载体，所述靶向纳米载体由靶向分子、第一连接化合物、第一亲水性生物材料、第二连接化合物和阳离子化合物通过化学键依次连接；所述第一连接化合物和所述第二连接化合物均具有羧基；所述第一连接化合物同时具有马来酰亚胺基；
所述第一亲水性生物材料含有巯基和氨基，所述第一亲水性生物材料为PEI、聚赖氨酸或HS-PEG-NH2；所述靶向分子与所述第一连接化合物通过酯化反应进行接枝连接，所述第一连接化合物接枝于所述第一亲水性生物材料含巯基的一端，所述第一亲水性生物材料的氨基端与所述第二连接化合物的羧基端脱水缩合连接，所述阳离子化合物与所述第二连接化合物聚合连接；所述第一连接化合物为马来酰亚胺基丙酸，所述第二连接化合物为CPADB，所述阳离子化合物为GUA；
GUA的结构式为：
Figure 327160DEST_PATH_IMAGE002
，
CPADB的结构式为：
Figure 244300DEST_PATH_IMAGE003
；
所述靶向分子为环己醛糖。
2.根据权利要求1所述的糖靶向纳米粒子，其特征在于，所述环己醛糖为葡萄糖或半乳糖。
3.根据权利要求1所述的糖靶向纳米粒子，其特征在于，所述第一亲水性生物材料为HS-PEG-NH2；
所述HS-PEG-NH2的分子量为2000。
4.根据权利要求1所述的糖靶向纳米粒子，其特征在于，所述糖靶向纳米粒子还包括非靶向含氟纳米载体，所述非靶向含氟纳米载体与所述靶向纳米载体自组装连接，所述非靶向含氟纳米载体由第二亲水性生物材料、第二连接化合物、阳离子化合物和疏水嵌段通过化学键依次连接；
所述第二亲水性生物材料为PEG-NH2，所述第二连接化合物CPADB；
所述第二亲水性生物材料远离所述第二连接化合物的一端修饰有封闭基团；
所述封闭基团为烷氧基；
制备非靶向含氟纳米载体的方法包括先将非靶向含氟纳米载体中的第二亲水性生物材料与第二连接化合物脱水缩合反应，再将脱水缩合反应产物、阳离子化合物和疏水嵌段共聚反应；所述疏水嵌段为FPMA；所述阳离子化合物为GUA；
FPMA的结构式如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE005
；
所述脱水缩合反应产物、所述GUA和FPMA共聚反应添加摩尔比为100-110：1800-2000：1；
所述共聚反应的温度为60-70℃；
所述共聚反应的时间为24-48h。
5.根据权利要求4所述的糖靶向纳米粒子，其特征在于，所述封闭基团为甲氧基。
6.根据权利要求4所述的糖靶向纳米粒子，其特征在于，所述靶向纳米载体与所述非靶向含氟纳米载体的摩尔比为2-5:10；
所述非靶向含氟纳米载体中GUA的聚合度为16-20，FPMA的聚合度为2-6。
7.根据权利要求6所述的糖靶向纳米粒子，其特征在于，所述靶向纳米载体与所述非靶向含氟纳米载体的摩尔比为2.5:7.5。
8.一种糖靶向修饰siRNA的纳米粒子，其特征在于，其包括权利要求1-7任一项所述的糖靶向纳米粒子，且所述糖靶向纳米粒子中的靶向纳米载体包覆于siRNA的周围。
9.根据权利要求8所述的糖靶向修饰siRNA的纳米粒子，其特征在于，所述siRNA为BACE1 siRNA或抑制Aβ聚集的siRNA；
所述BACE1 siRNA的正义链的核酸序列如SEQ NO.1所示，所述BACE1 siRNA的反义链的核酸序列如SEQ NO.2所示。
10.根据权利要求8所述的糖靶向修饰siRNA的纳米粒子，其特征在于，所述糖靶向纳米粒子还包括非靶向含氟纳米载体，所述靶向纳米载体与所述非靶向含氟纳米载体的摩尔比为2-5:10；
所述非靶向含氟纳米载体与所述siRNA的质量比为1.5-5:1。
11.根据权利要求10所述的糖靶向修饰siRNA的纳米粒子，其特征在于，所述非靶向含氟纳米载体与所述siRNA的质量比为2.5:1。
12.一种权利要求8-11任一项所述的糖靶向修饰siRNA的纳米粒子的制备方法，其特征在于，其包括：
将所述糖靶向纳米粒子与siRNA混合孵育；
所述孵育时间为0.5-1.5h；
所述孵育是在缓冲液中进行；
所述缓冲液为Hepes缓冲液。
13.一种如权利要求8-11任一项所述的糖靶向修饰siRNA的纳米粒子在制备阿尔茨海默治疗剂中的应用。
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