JP2015515530A - インビボ核酸送達のためのポリ(アクリラート)ポリマー - Google Patents
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Abstract
Description
ポリヌクレオチドおよび他の実質的に細胞膜不透過性化合物の生細胞への送達は、細胞の複雑な膜系によって高度に制限されている。アンチセンス、RNAi、および遺伝子療法において用いられる薬物は比較的大きい親水性ポリマーであり、高度に負に荷電していることが多い。これらの物理的特徴はいずれも、細胞膜を通過してのそれらの直接拡散を妨げる。このため、ポリヌクレオチド送達の主な障壁は細胞膜を通過しての細胞の細胞質または核へのポリヌクレオチドの送達である。
本発明は、核酸、ペプチド、およびタンパク質などの、生物活性物質の送達のために有用な、両親媒性ポリ(アクリラート)ランダムコポリマーおよびその結合体系に関する。核酸および他の実質的に細胞膜不透過性化合物の生細胞への送達は、細胞の複雑な膜系によって高度に制限されている。インビボ送達のために、両親媒性ポリ(アクリラート)ランダムコポリマーを、生理的に不安定な連結を介してのマスキング剤の共有結合により可逆的に修飾する。
式中:
Nは-NH2の形を有する一級アミンであり、
N'は-NR5H、-NR5R6、もしくは-NR5R6R7の形を有する二級、三級、もしくは四級アミンであり、ここでR5、R6、およびR7は独立に-CH3および-CH2-CH3から選択されるか、またはN'は窒素複素環、アルジミン、ヒドラジド、ヒドラゾン、もしくはイミダゾールであり得、
YおよびY'はリンカー基であり、
RおよびR'は、独立に2〜20個の炭素原子を有する、本明細書において規定する疎水性基、またはアルコキシルエチル基、-(CH2)l-O-CH2-CH3であり、ここでlは2、3、または4であり(好ましいアルコキシアルキル基は2-エトキシエチル基、-(CH2)2-O-CH2-CH3であり)、
R1、R2、R3、およびR4は独立に水素(-H)およびメチル(-CH3)から選択され、
mおよびpはゼロ(0)よりも大きい整数であり、
nおよびqはゼロ(0)以上の整数であり、かつ
比(m+n)/(p+q)は0.67〜5.7(40〜85%アミン)、より好ましくは1.2〜4(55〜80%アミン)である。
式中:
Nは-NH2の形を有する一級アミンであり、
Yは前述のリンカー基であり、
Rは、2〜6個の炭素原子を有する、本明細書において規定する疎水性基、またはアルコキシルアルキル基、-(CH2)l-O-CH2-CH3であり、ここでlは2、3、または4(好ましくは2-エトキシエチル)であり、
R1およびR3は独立に水素(-H)およびメチル(-CH3)から選択され、
mはゼロ(0)よりも大きい整数であり、
pはゼロ(0)よりも大きい整数であり、
比m/pは0.67〜5.7(40〜85%アミン)、より好ましくは1.2〜4(55〜80%アミン)である。
式中、R1はメチル基(-CH3)、エチル基(-CH2CH3)、またはプロピル基(-CH2CH2CH3)などのアルキル基であり、かつR2は中性標的指向基または中性立体安定化部分を含む。より好ましくは、標的指向剤および立体安定化部分は非荷電である。R1またはR2が水素である、一置換無水マレイン酸は、記載する発明に適していない連結を生じる。無水マレイン酸のアミドとの反応はβカルボキシル基を生じるが、このβカルボキシルは完全な見かけの負電荷を示さない(Rozema et al. Bioconjugate Chem. 2003, 14, 51-57)。したがって、R1およびR2が電荷中性である無水マレイン酸系マスキング剤を用いて、高い負電荷を与えることなく、ポリアミンを中和することができる。
式中、N、N'、Y、Y'、R、R'、R1、R2、R3、R4、m、n、p、qは前記式(I)および(Ia)に与えた意味を有し、
m1はゼロ以上かつ式(I)または(Ia)のm以下の整数であり、
m3はゼロ以上かつ式(I)または(Ia)のm以下の整数であり、
m1+m2+m3=式(I)または(Ia)のmであり、
m1+m3は≧m2[すなわち、式(I)または(Ia)のm×0.5以上かつ式(I)または(Ia)のm以下]の整数であり、
R7はアルキル基であり、かつR8は中性標的指向基を含むか、またはR8はアルキル基であり、かつR7は中性標的指向基を含み、かつ
R9はアルキル基であり、かつR10は中性立体安定化部分を含むか、またはR10はアルキル基であり、かつR9は中性立体安定化部分を含む。
式中、R4は中性、好ましくは非荷電の標的指向リガンドまたは立体安定化部分を含み、R3はアミン反応性カルボナート基を含み、かつR1およびR2はアミノ酸側鎖である。好ましいジペプチドにおいて、R1は疎水性アミノ酸側鎖であり、R2は非荷電親水性アミノ酸側鎖である。好ましい疎水性アミノ酸はフェニルアラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、アラニン、またはトリプトファンである。好ましい非荷電親水性アミノ酸はアスパラギン、グルタミン、またはシトルリンである。より好ましい疎水性アミノ酸はフェニルアラニンまたはバリンである。より好ましい非荷電親水性アミノ酸はシトルリンである。好ましい活性化カルボナートはパラニトロフェノールである。しかし、当技術分野において公知の他のアミン反応性カルボナートも容易にパラニトロフェノールの代わりに用いられる。活性化カルボナートのアミンとの反応により、標的指向リガンドまたは立体安定化部分が膜活性ポリアミンに、ペプチダーゼで切断可能なジペプチド-アミドベンジル-カルバマート連結を介して接続される。アミノ酸とアミドベンジル基との間のジペプチドの酵素切断により、ポリマーからR4が除去されて脱離反応が誘発され、これによりポリマーアミンが再生される。
式中:
Xは-NH-、-O-、または-CH2-であり
Yは-NH-または-O-であり
R1は好ましくは
-(CH2)k-フェニル(kは1、2、3、4、5、6であり;k=1 フェニルアラニン)、
-CH-(CH3)2(バリン)、
-CH2-CH-(CH3)2(ロイシン)、
-CH(CH3)-CH2-CH3(イソロイシン)、
-CH3(アラニン)、
-(CH2)2-COOH(グルタミン酸)、
または
R2は好ましくは
水素(グリシン)
-(CH2)3-NH-C(O)-NH2(シトルリン)、
-(CH2)4-N-(CH3)2(リジン(CH3)2)、
-(CH2)k-C(O)-NH2;(kは1、2、3、4、5、6であり)、
-CH2-C(O)-NH2(アスパラギン)、
-(CH2)2-C(O)-NH2(グルタミン)、
-CH2-C(O)-NR1R2(アスパラギン酸アミド)、
-(CH2)2-C(O)-NR1R2(グルタミン酸アミド)、
-CH2-C(O)-OR1(アスパラギン酸エステル)、または
-(CH2)2-C(O)-OR1(グルタミン酸エステル)であり、
R1およびR2はアルキル基であり
R4は中性ポリエチレングリコールまたは標的指向リガンドを含み;かつ
ポリアミンは両親媒性膜活性ポリ(アクリラート)である。
式中、N、N'、Y、Y'、R、R'、R1、R2、R3、R4、m、n、p、qは前記式(I)および(Ia)に与えた意味を有し、
m1は1、2、3、または4であり、
m1+m2=式(I)または(Ia)のmであり;かつ
リンカーは生理的に不安定なリンカーを含む。
式中、N、N'、Y、Y'、R、R'、R1、R2、R3、R4、m、n、p、qは前記式(I)および(Ia)に与えた意味を有し、かつリンカーは生理的に不安定なリンカーを含む。
本発明のポリ(アクリラート)ランダムコポリマーは両親媒性である。両親媒性(amphipathic)、または両親媒性(amphiphilic)ポリマーは、親水性(極性、水溶性)および疎水性(非極性、親油性、水不溶性)基または部分の両方を有する。
本明細書において用いられる膜活性ポリマーは、生体膜に対して以下の効果の1つまたは複数を誘導することができる、表面活性、両親媒性ポリマーである:膜不透過性分子が細胞に侵入する、もしくは膜を通過することを可能にする、膜の変化もしくは破壊、膜における孔形成、膜の分裂、または膜の破壊もしくは溶解。本明細書において用いられる膜、または細胞膜は、脂質二重層を含む。膜の変化または破壊は、以下の検定の少なくとも1つにおいてポリマーの活性により機能的に規定することができる:赤血球溶解(溶血)、リポソーム漏出、リポソーム融合、細胞融合、細胞溶解、およびエンドソーム放出。細胞膜の溶解を引き起こしうる膜活性ポリマーは、膜溶解性ポリマーとも呼ぶ。形質膜よりもエンドソームまたはリソソームの破壊を優先的に引き起こすポリマーはエンドソーム溶解性と考えられる。膜活性ポリマーの細胞膜に対する効果は一時的でありうる。膜活性ポリマーは、膜に対する親和性を有し、二重層構造の変性または変形を引き起こす。膜活性ポリマーは合成または非天然両親媒性ポリマーであってもよい。
エンドソーム溶解性ポリマーは、pHの変化に反応して、エンドソームの破壊もしくは溶解を引き起こす、またはポリヌクレオチドもしくはタンパク質などの通常は細胞膜不透過性の化合物の、エンドソームもしくはリソソームなどの細胞内部の膜封入小胞からの放出を提供することができるポリマーである。エンドソーム溶解性ポリマーは、生理的に適切なpH範囲(通常はpH5.5〜8)にわたって、それらの物理化学的性質のシフトを起こす。このシフトは、電荷、疎水性、または親水性におけるシフトの結果としての、ポリマーの溶解性または他の化合物もしくは膜と相互作用する能力における変化でありうる。例示的エンドソーム溶解性ポリマーは、pHに不安定な基または結合を有する。したがって、マスキング剤がpHに不安定な結合を介してポリマーに結合している、可逆的にマスクした膜活性ポリ(アクリラート)は、エンドソーム溶解性ポリマーであると考えることができる。
親水性基は、質的な用語で、化学基が水を好むことを示す。典型的には、そのような化学基は水溶性であり、水との水素結合供与体または受容体である。親水性基は荷電または非荷電でありうる。荷電基は正に荷電(アニオン)もしくは負に荷電(カチオン)または両方(両性イオン)でありうる。親水性基の例には、以下の化学部分が含まれる:炭水化物、ポリオキシエチレン、特定のペプチド、オリゴヌクレオチド、アミン、アミド、アルコキシアミド、カルボン酸、硫黄、およびヒドロキシル。
疎水性基は、質的な用語で、化学基が水を避けることを示す。典型的には、そのような化学基は水溶性ではなく、水素結合を形成しない傾向にある。疎水性基は脂肪、油、脂質、および非極性溶媒に溶解し、水素結合を形成する能力はほとんど、またはまったくない。2個またはそれ以上の炭素原子を含む炭化水素、特定の置換炭化水素、コレステロール、およびコレステロール誘導体は、疎水性基および化合物の例である。
標的指向基または部分は、それらが結合している結合体の薬物動態または生体分布特性を増強して、結合体の細胞特異的分布および細胞特異的取り込みを改善する。標的指向基は分子の標的細胞との結合を増強する。したがって、標的指向基は、それらが結合している結合体の薬物動態または生体分布特性を増強して、結合体の細胞分布および細胞取り込みを改善しうる。リガンドなどの標的指向基の細胞または細胞受容体への結合は、エンドサイトーシスを開始しうる。標的指向基は一価、二価、三価、四価であってもよく、またはより高い原子価を有していてもよい。標的指向基は、細胞表面分子に親和性を有する化合物、細胞受容体リガンド、ならびに細胞表面分子に親和性を有する抗体、抗体断片、および抗体様物質を含む群から選択してもよい。好ましい標的指向基は細胞受容体リガンドを含む。様々なリガンドが、薬物および遺伝子を細胞および特定の細胞受容体へと標的指向させるために用いられてきた。細胞受容体リガンドは、炭水化物、グリカン、糖類(ガラクトース、ガラクトース誘導体、マンノース、およびマンノース誘導体を含むが、それらに限定されるわけではない)、ビタミン、葉酸塩、ビオチン、アプタマー、およびペプチド(RGD含有ペプチド、インスリン、EGF、およびトランスフェリンを含むが、それらに限定されるわけではない)を含む群から選択してもよい。
ガラクトースおよびガラクトース誘導体は、肝細胞表面上で発現されるアシアロ糖タンパク質受容体(ASGPr)へのそれらの結合を通じて、インビボで分子を肝細胞へと標的指向させるために用いられてきた。本明細書において用いられるASGPr標的指向基は、ガラクトースおよびガラクトースと等しいか、またはそれよりも大きいASGPrへの親和性を有するガラクトース誘導体(構造類縁体)を含む。ガラクトース標的指向部分のASGPrへの結合は、送達ポリマーの肝細胞への細胞特異的標的指向および送達ポリマーの肝細胞へのエンドサイトーシスを促進する。
本明細書において用いられる立体安定化部分は、立体安定化部分を含まないポリマーに比べて、それが結合しているポリマーの分子内または分子間相互作用を防止または阻害する、非イオン性親水性ポリマー(天然、合成、または非天然のいずれか)である。立体安定化部分は、それが結合しているポリマーが静電相互作用を起こすことを妨害する。静電相互作用は、正電荷と負電荷との間の引力による、2つまたはそれ以上の物質の非共有結合である。立体安定化部分は血液成分との相互作用を阻害し、したがって細網内皮系によるオプソニン作用、食作用、および取り込みを阻害することができる。したがって、立体安定化部分は、それらが結合している分子の循環時間を延長することができる。立体安定化部分はポリマーの凝集も阻害しうる。好ましい立体安定化部分はポリエチレングリコール(PEG)またはPEG誘導体である。本明細書において用いられる好ましいPEGは、約1〜500のエチレングリコールモノマー、2〜20のエチレングリコールモノマー、5〜15のエチレングリコールモノマー、または約10のエチレングリコールモノマーを有しうる。本明細書において用いられる好ましいPEGは、約85〜20,000ダルトン(Da)、約200〜1000Da、約200〜750Da、または約550Daの分子量平均も有しうる。本明細書において用いられる立体安定化部分は水溶液中で、立体安定化部分を含まないポリマーに比べて、それが結合しているポリマーの分子内または分子間相互作用を防止または阻害する。
ゼータ電位は、懸濁液中の粒子が示す物理的性質であり、表面電荷に密接に関連している。水性媒質中で、試料のpHはゼータ電位に影響をおよぼす最も重要な因子の1つである。電荷が塩基/酸のプロトン化/脱プロトン化に基づいている場合、電荷はpHに依存する。したがって、ゼータ電位の値が意味を持つためには、溶液の状態、特にpHを含まなければならない。典型的な粒子について、ゼータ電位の大きさはコロイド系の潜在的安定性の指標となる。懸濁液中のすべての粒子が大きい負または正のゼータ電位を有する場合、これらは互いに反発する傾向があり、粒子が一緒になる傾向はないであろう。しかし、粒子が低いゼータ電位値を有する場合、粒子が一緒になって凝集するのを防ぐ力はないであろう。典型的な粒子の安定懸濁液と不安定懸濁液との間の一般的境界線は、一般には+30または-30mVのいずれかとされる。+30mVよりも正または-30mVよりも負のゼータ電位を有する粒子は通常は安定と考えられる。記載の発明の送達ポリマーは、生理的塩およびpHで20mVから-20mVのゼータ電位を示すが、水溶液中でコロイドとして安定であり、凝集しない。
連結またはリンカーは、関心対象の1つの化学基または区分を関心対象のもう1つの化学基または区分に、1つまたは複数の共有結合を介して連結する、2つの原子間の接続である。例えば、連結は修飾またはマスキング剤をポリマーに接続することができる。連結の形成は2つの別々の分子を1つの分子に接続することもあり、または同じ分子内の2つの原子を接続することもある。連結は中性電荷でもよく、または正もしくは負の電荷を有していてもよい。可逆的または不安定な連結は可逆的または不安定な結合を含む。連結は任意に2つのつなぎ合わせた原子間の距離を延ばすスペーサーを含んでいてもよい。スペーサーは連結に柔軟性および/または長さをさらに加えうる。スペーサーには、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アラルキル基、アラルケニル基、アラルキニル基が含まれるが、それらに限定されるわけではなく;これらはそれぞれ1つまたは複数のヘテロ原子、複素環、アミノ酸、ヌクレオチド、および糖類を含みうる。スペーサー基は当技術分野において周知で、前述のリストは本発明の範囲を制限する意図はない。
RNAiポリヌクレオチド-ポリヌクレオチド標的指向基結合体を、RNAiポリヌクレオチドをポリヌクレオチド標的指向基に共有結合することにより生成する。ポリヌクレオチドを、それが反応性基Aを含むように合成または修飾する。標的指向基も、それが反応性基Bを含むように合成または修飾する。反応性基AおよびBは、それらが当技術分野において公知の方法を用いて共有結合を介して連結されうるように選択する。
ポリヌクレオチド、または核酸もしくはポリ核酸なる用語は、少なくとも2つのヌクレオチドを含むポリマーを意味する当技術分野の用語である。ヌクレオチドはポリヌクレオチドポリマーのモノマー単位である。120未満のモノマー単位を有するポリヌクレオチドはオリゴヌクレオチドと呼ぶことが多い。天然核酸はデオキシリボース-またはリボース-リン酸骨格を有する。非天然または合成ポリヌクレオチドは、インビトロまたは無細胞系で重合されるポリヌクレオチドで、天然リボースまたはデオキシリボース-リン酸骨格と同じまたは類似の塩基を含むが、天然のもの以外の型の骨格を含みうる。ポリヌクレオチドは任意の当技術分野において公知の技術を用いて合成することができる。当技術分野において公知のポリヌクレオチド骨格には、PNA(ペプチド核酸)、ホスホロチオアート、ホスホロジアミダート、モルホリノ、および天然核酸のリン酸骨格の他の変種が含まれる。塩基にはプリンおよびピリミジンが含まれ、これらにはさらに天然化合物アデニン、チミン、グアニン、シトシン、ウラシル、イノシン、および天然類縁体が含まれる。プリンおよびピリミジンの合成誘導体には、アミン、アルコール、チオール、カルボキシラート、およびハロゲン化アルキルなどであるが、それらに限定されるわけではない、ヌクレオチド上に新しい反応性基を配置する修飾が含まれるが、それらに限定されるわけではない。塩基なる用語は、DNAおよびRNAの任意の公知の塩基類縁体を含む。ポリヌクレオチドはリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、合成ヌクレオチド、または任意の適切な組み合わせを含んでいてもよい。ポリヌクレオチドはインビトロで重合してもよく、組換えでもよく、キメラ配列、またはこれらの基の誘導体を含む。ポリヌクレオチドは5'末端、3'末端、または5'および3'両末端に末端キャップ基を含んでいてもよい。キャップ基は、逆方向デオキシ脱塩基基、逆方向デオキシチミジン基、チミジン基、または3'グリセリル修飾でありうるが、それらに限定されるわけではない。
薬理学および毒性学において、投与経路とは薬物、液体、毒、または他の物質を体に接触させる路である。一般に、哺乳動物を処置するための薬物および核酸の投与法は当技術分野において周知で、本発明の組成物の投与に適用することができる。本発明の化合物は、任意の適切な経路を介して、最も好ましくは非経口により、その経路に適切に合わせて作られた製剤で投与することができる。したがって、本発明の化合物は、注射により、例えば、静脈内、筋肉内、皮内、皮下、または腹腔内投与することができる。したがって、本発明は、薬学的に許容される担体または賦形剤を含む薬学的組成物も提供する。
RNAiポリヌクレオチドを研究目的のため、または細胞において治療的である変化を生じるために送達してもよい。RNAiポリヌクレオチドのインビボ送達は、研究試薬のため、ならびに様々な治療、診断、標的確認、ゲノム発見、遺伝子工学、および薬理ゲノミクス適用のために有用である。本発明者らは、肝細胞における内因性遺伝子発現の阻害をもたらすRNAiポリヌクレオチド送達を開示してきた。ポリヌクレオチドの送達後に測定したレポーター(マーカー)遺伝子発現のレベルは、他のポリヌクレオチド送達後の遺伝子発現が同様のレベルであるとの合理的な予想を示している。当業者により有益と考えられる処置のレベルは疾患ごとに異なる。例えば、血友病AおよびBはそれぞれX連鎖第VIIIおよび第IX凝固因子の欠失によって引き起こされる。これらの臨床経過は第VIIIまたは第IX因子の通常の血清レベルのパーセンテージによって大きく影響される:<2%、重度;2〜5%、中等度;および5〜30%軽度。したがって、重度患者における循環因子の通常レベルの1%から2%への上昇は有益であると考えることができる。6%よりも高いレベルは自然出血を防止するが、手術または傷害に続発するものは防止しない。同様に、遺伝子の阻害は治療的利益を提供するために100%である必要はない。遺伝子療法の当業者であれば、マーカー遺伝子の結果の十分なレベルに基づき、疾患に特異的な遺伝子発現の有益なレベルを合理的に予想するであろう。血友病の例において、マーカー遺伝子が発現されて第VIII因子の通常レベルの2体積%に匹敵するレベルでタンパク質を生じる場合、第VIII因子をコードする遺伝子も同様のレベルで発現されるであろうと合理的に予期することができる。したがって、レポーターまたはマーカー遺伝子は一般に細胞内タンパク質の発現の有用な代表例として役立つ。
本明細書に記載のポリ(アクリラート)をインビトロ形質移入試薬として用いてもよい。インビトロでポリヌクレオチドを細胞に送達するプロセスは一般に形質移入または形質移入プロセスと呼ばれている。本明細書において用いられる形質移入なる用語は、ポリヌクレオチドが生物活性を有するような、細胞の外側から細胞の内側へのポリヌクレオチドの導入を意味する。ポリヌクレオチドを研究目的のため、または細胞において治療的でありうる変化を生じるために用いてもよい。ポリヌクレオチドの送達は標的細胞中に存在する遺伝物質の修飾につながりうる。
A. 可逆的付加開裂連鎖移動(RAFT)重合を実施して、一連のランダム(メタ)アクリラートコポリマーを合成した。RAFT重合は、Shipp DA and Malepu V “RAFT Polymerization of Vinyl Acetate, Styrene and Acrylates Using N,N Dithiocarbamates,” In Controlled/Living Radical Polymerization: Progress in RAFT, DT, NMP, and OMRP; Matyjaszewski, K.; ACS Symposium Series 1024; American Chemical Society: Washington, DC, 2009; pp 37-47に記載されている。
モノマーAおよびBからのポリマーP合成のための一般的反応
A=親水性モノマー
B=疎水性モノマー
P=ポリマー
C=連鎖移動剤(CTA)
I=イニシエーター
ポリマーPのためのモノマー平均分子量の計算
%A=ポリマーPにおける親水性モノマーAのパーセント
%B=ポリマーPにおける疎水性モノマーBのパーセント
MWA=親水性モノマーAの分子量
MWB=疎水性モノマーBの分子量
=ポリマーモノマーの平均分子量
所望の(理論)分子量Mn, th(以下の式中のMn)を有するポリマーPにおけるモノマーの数の計算:
nAB=理論分子量Mn, thを有するポリマーPにおけるモノマーの数
理論分子量Mn, thを有するポリマーPのxグラム中のモノマーAおよびBのモル数の計算:
モルA=親水性モノマーAのモル数
モルB=疎水性モノマーBのモル数
理論分子量Mnを有するポリマーPをxグラム合成するための連鎖移動剤(CTA)のモル数の計算:
モルC=連鎖移動剤のモル数
理論分子量Mn, thを有するポリマーPをxグラム合成するためのイニシエーターのモル数の計算:
モルI=イニシエーターのモル数
CTAおよびイニシエーターの溶液を酢酸ブチル中で調製する。親水性モノマー、疎水性モノマー、CTA溶液、イニシエーター溶液、および酢酸ブチルをバイアルに加え、混合物をN2通気により1時間脱気する。バイアルを密封し、80℃で終夜撹拌する。約16時間後、反応容器を熱から取り除き、溶液を室温まで冷却する。得られたポリマーをヘキサン(約8倍容量)の添加により沈澱させる。遠心分離後、溶液をデカンテーションし、ポリマーをヘキサンで洗浄する。洗浄したポリマーをDCMに溶解し、ヘキサン(約8倍容量)で再度沈澱させる。遠心分離後、溶液をデカンテーションし、ポリマーを高減圧下で乾燥する(図2 RAFT重合)。
乾燥し、沈澱したポリマーをDCMに溶解した(約60mg/mL)。ヘキサンを、曇点到達の直後まで加えた。得られた乳状溶液を遠心分離した。下層(所望のポリマーパーセント、30〜60%を示す濃稠液体)を単離し、減圧下で乾燥した。残りの上層を、ヘキサンをさらに加えて完全に沈澱させた。第二の分画を遠心分離し、その後ポリマーを単離し、減圧下で乾燥した。
乾燥したポリマー分画を酢酸中2M HCl(0.400gのポリマーにつき約7ml)で1時間脱保護した。次いで、反応混合物を水で希釈し、10〜15分間撹拌した。次いで、分画を3500 MWの透析チューブで、高濃度の塩、高濃度の塩、および水中でそれぞれ15時間、8時間、および15時間透析した。次いで、分画を3日間または乾燥するまで凍結乾燥した。乾燥試料をさらなる試験のために水中で20mg/mlとした(図3 アミン脱保護)。
A. ポリマーLAU 41648-140-B-fr1
1. アミン保護LAU 41648-140-B-fr1ポリ(アクリラート)ランダムコポリマー合成
2,2'-アゾビス(2-メチルプロピオニトリル)(AIBN、CAS 78-67-1)の溶液を酢酸ブチル中1mg/mlで調製した。4-シアノ-4(フェニルカルボノチオイルチオ)ペンタン酸(CPCPA、CAS 201611-92-9)の別の溶液を酢酸ブチル中10mg/mlで調製した。2-(2-Boc-アミノエトキシ)エチルアクリラート(BAEEA)(1.053g、4.059mmol)、プロピルメタクリラート(CAS 2210-28-8、0.197g、1.54mmol)、CPCPA溶液(0.700mL、0.0250mmol)、AIBN溶液(0.616mL、0.00375mmol)、および酢酸ブチル(4.70mL)を、撹拌子を入れた20mLガラスバイアルに加えた。モノマーのモル仕込み比は72.5:27.5であった。理論Mwは50,000であった。バイアルをゴム栓で密封し、長いシリンジと排出口としての第二のシリンジを用いて溶液に窒素を1時間通気した。シリンジを取り除き、バイアルを油浴を用いて80℃で15時間加熱した。溶液を室温まで冷却し、50mLの遠沈管に移した後、ヘキサン(35mL)を溶液に加えた。溶液を4,400rpmで2分間遠心分離した。上清層を注意深くデカンテーションし、下(固体またはゲル様)層をヘキサンで洗浄した。次いで、下層をDCM(7mL)に再溶解し、ヘキサン(35mL)中で沈澱させ、もう1回遠心分離した。上清をデカンテーションし、下層をヘキサンで洗浄した後、ポリマーを減圧下で数時間乾燥した。収量0.762g。観測Mw 40,000;観測組成N-BOC-エチルエトキシアクリラート:プロピルメタクリラート=66:34。(図5)
乾燥し、沈澱したポリマーをDCMに溶解した(約60mg/mL)。ヘキサンを、曇点到達の直後まで加えた。得られた乳状溶液を遠心分離した。下層(約30%のポリマーを示す濃稠液体)を単離し、減圧下で乾燥した。残りの上層を、ヘキサンをさらに加えて完全に沈澱させた。第二の分画を遠心分離し、その後ポリマーを単離し、減圧下で乾燥した。分画1の収量は0.206g、Mw 50,000であった;分画2の収量は0.412g、Mw 41,000であった。
乾燥したポリマー分画を酢酸中2M HCl(約7ml)で1時間脱保護した。次いで、反応混合物を20mlの水で希釈し、10〜15分間撹拌した。次いで、分画を3500 MWの透析チューブで、高濃度の塩、高濃度の塩、および水中でそれぞれ15時間、8時間、および15時間透析した。次いで、分画を50ml遠沈管に移し、3日間または乾燥するまで凍結乾燥した。乾燥試料をさらなる試験のために水中で20mg/mlとした。
1. アミン保護LAU 42101-23-D-fr1ポリ(アクリラート)ランダムコポリマー合成
2,2'-アゾビス(2-メチルプロピオニトリル)(AIBN、CAS 78-67-1)の溶液を酢酸ブチル中1mg/mlで調製した。4-シアノ-4(フェニルカルボノチオイルチオ)ペンタン酸(CPCPA、CAS 201611-92-9)の別の溶液を酢酸ブチル中10mg/mlで調製した。Boc-アミノプロピルアクリラート(BAPA)(0.947g、4.133mmol)、2-エトキシエチルメタクリラート(CAS 2370-63-0、0.303g、1.918mmol)、CPCPA溶液(0.350mL、0.0125mmol)、AIBN溶液(0.308mL、0.00188mmol)、および酢酸ブチル(5.30mL)を、撹拌子を入れた20mLガラスバイアルに加えた。モノマーのモル仕込み比は68:32であった。バイアルをゴム栓で密封し、長いシリンジと排出口としての第二のシリンジを用いて溶液に窒素を1時間通気した。シリンジを取り除き、バイアルを油浴を用いて80℃で15時間加熱した。溶液を室温まで冷却し、50mLの遠沈管に移した後、ヘキサン(35mL)を溶液に加えた。溶液を4,400rpmで2分間遠心分離した。上清層を注意深くデカンテーションし、下(固体またはゲル様)層をヘキサンで洗浄した。次いで、下層をDCM(7mL)に再溶解し、ヘキサン(35mL)中で沈澱させ、もう1回遠心分離した。上清をデカンテーションし、下層をヘキサンで洗浄した後、ポリマーを減圧下で数時間乾燥した。収量0.851g。(図6)
乾燥し、沈澱したポリマーをDCMに溶解した(約60mg/mL)。ヘキサンを、曇点到達の直後まで加えた。得られた乳状溶液を遠心分離した。下層(約30%のポリマーを示す濃稠液体)を単離し、減圧下で乾燥した。残りの上層を、ヘキサンをさらに加えて完全に沈澱させた。第二の分画を遠心分離し、その後ポリマーを単離し、減圧下で乾燥した。分画1の収量は0.267gであった;分画2の収量は0.308gであった。
乾燥したポリマー分画を酢酸中2M HCl(約7ml)で1時間脱保護した。次いで、反応混合物を20mlの水で希釈し、10〜15分間撹拌した。次いで、分画を3500 MWの透析チューブで、高濃度の塩、高濃度の塩、および水中でそれぞれ15時間、8時間、および15時間透析した。次いで、分画を50ml遠沈管に移し、3日間または乾燥するまで凍結乾燥した。乾燥試料をさらなる試験のために水中で20mg/mlとした。
1. アミン保護NAR 42020-117A-fr1ポリ(アクリラート)ランダムコポリマー合成
2,2'-アゾビス(2-メチルプロピオニトリル)(AIBN、CAS 78-67-1)の溶液を酢酸ブチル中1mg/mlで調製した。4-シアノ-4(フェニルカルボノチオイルチオ)ペンタン酸(CPCPA、CAS 201611-92-9)の別の溶液を酢酸ブチル中10mg/mlで調製した。Boc-アミノプロピルアクリラート(BAPA)(0.947g、4.13mmol)、ブチルメタクリラート(BuMA、0.251g、1.77mmol)、オクタデシルアクリラート(C18A、0.0956g、0.295mmol)、CPCPA溶液(0.180mL、0.00647mmol)、AIBN溶液(0.159mL、0.000971mmol)、および酢酸ブチル(5.66mL)を、撹拌子を入れた20mLガラスバイアルに加えた。モノマーのモル仕込み比は66.5:22.5:5(66.5アミン:27.5疎水性)であった。バイアルをゴム栓で密封し、長いシリンジと排出口としての第二のシリンジを用いて溶液に窒素を1時間通気した。シリンジを取り除き、バイアルを油浴を用いて80℃で15時間加熱した。溶液を室温まで冷却し、50mLの遠沈管に移した後、ヘキサン(35mL)を溶液に加えた。溶液を4,400rpmで2分間遠心分離した。上清層を注意深くデカンテーションし、下(固体またはゲル様)層をヘキサンで洗浄した。次いで、下層をDCM(7mL)に再溶解し、ヘキサン(35mL)中で沈澱させ、もう1回遠心分離した。上清をデカンテーションし、下層をヘキサンで洗浄した後、ポリマーを減圧下で数時間乾燥した。Mw 130,000(PDI 1.34);65%BAPA、30%BuMA、5%C18A;収率65%。(図7)
乾燥し、沈澱したポリマーをDCMに溶解した(約60mg/mL)。ヘキサンを、曇点到達の直後まで加えた。得られた乳状溶液を遠心分離した。下層(約30%のポリマーを示す濃稠液体)を単離し、減圧下で乾燥した。残りの上層を、ヘキサンをさらに加えて完全に沈澱させた。分画1:Mw=149,000;65%BAPA、30%BuMA、5%C18A。収率30%。
乾燥したポリマー分画を酢酸中2M HCl(約7ml)で1時間脱保護した。次いで、反応混合物を20mlの水で希釈し、10〜15分間撹拌した。次いで、分画を3500 MWの透析チューブで、高濃度の塩、高濃度の塩、および水中でそれぞれ15時間、8時間、および15時間透析した。次いで、分画を50ml遠沈管に移し、3日間または乾燥するまで凍結乾燥した。乾燥試料をさらなる試験のために水中で20mg/mlとした。
1. アミン保護NAR 41439-141B-fr1ポリ(アクリラート)ランダムコポリマー合成
2,2'-アゾビス(2-メチルプロピオニトリル)(AIBN、CAS 78-67-1)の溶液を酢酸ブチル中1mg/mlで調製した。4-シアノ-4(フェニルカルボノチオイルチオ)ペンタン酸(CPCPA、CAS 201611-92-9)の別の溶液を酢酸ブチル中10mg/mlで調製した。Boc-アミノブチルアクリラート(BABA)(1.05g、4.34mmol)、エチルメタクリラート(EtMA、0.148g、1.30mmol)、CPCPA溶液(0.335mL、0.0120mmol)、AIBN溶液(0.295mL、0.00180mmol)、および酢酸ブチル(5.37mL)を、撹拌子を入れた20mLガラスバイアルに加えた。モノマーのモル仕込み比は77:23であった。バイアルをゴム栓で密封し、長いシリンジと排出口としての第二のシリンジを用いて溶液に窒素を1時間通気した。シリンジを取り除き、バイアルを油浴を用いて80℃で15時間加熱した。溶液を室温まで冷却し、50mLの遠沈管に移した後、ヘキサン(35mL)を溶液に加えた。溶液を4,400rpmで2分間遠心分離した。上清層を注意深くデカンテーションし、下(固体またはゲル様)層をヘキサンで洗浄した。次いで、下層をDCM(7mL)に再溶解し、ヘキサン(35mL)中で沈澱させ、もう1回遠心分離した。上清をデカンテーションし、下層をヘキサンで洗浄した後、ポリマーを減圧下で数時間乾燥した。Mw 38,000(PDI 1.18);67%BABA、33%EtMA;収率43%。(図8)
乾燥し、沈澱したポリマーをDCMに溶解した(約60mg/mL)。ヘキサンを、曇点到達の直後まで加えた。得られた乳状溶液を遠心分離した。下層(約30%のポリマーを示す濃稠液体)を単離し、減圧下で乾燥した。残りの上層を、ヘキサンをさらに加えて完全に沈澱させた。分画1:Mw=49,000(PDI 1.10);収率45%。
乾燥したポリマー分画を酢酸中2M HCl(約7ml)で1時間脱保護した。次いで、反応混合物を20mlの水で希釈し、10〜15分間撹拌した。次いで、分画を3500 MWの透析チューブで、高濃度の塩、高濃度の塩、および水中でそれぞれ15時間、8時間、および15時間透析した。次いで、分画を50ml遠沈管に移し、3日間または乾燥するまで凍結乾燥した。乾燥試料をさらなる試験のために水中で20mg/mlとした。
1. アミン保護NAR 41439-71B-fr1ポリ(アクリラート)ランダムコポリマー合成
2,2'-アゾビス(2-メチルプロピオニトリル)(AIBN、CAS 78-67-1)の溶液を酢酸ブチル中1mg/mlで調製した。4-シアノ-4(フェニルカルボノチオイルチオ)ペンタン酸(CPCPA、CAS 201611-92-9)の別の溶液を酢酸ブチル中10mg/mlで調製した。2-(2-Boc-アミノエトキシ)エチルアクリラート(BAEEA)(1.09g、4.21mmol)、プロピルメタクリラート(PrMA、CAS 2210-28-8、0.180g、1.41mmol)、CPCPA溶液(0.170mL、0.00610mmol)、AIBN溶液(0.150mL、0.000915mmol)、および酢酸ブチル(5.68mL)を、撹拌子を入れた20mLガラスバイアルに加えた。モノマーのモル仕込み比は76:24であった。バイアルをゴム栓で密封し、長いシリンジと排出口としての第二のシリンジを用いて溶液に窒素を1時間通気した。シリンジを取り除き、バイアルを油浴を用いて80℃で15時間加熱した。溶液を室温まで冷却し、50mLの遠沈管に移した後、ヘキサン(35mL)を溶液に加えた。溶液を4,400rpmで2分間遠心分離した。上清層を注意深くデカンテーションし、下(固体またはゲル様)層をヘキサンで洗浄した。次いで、下層をDCM(7mL)に再溶解し、ヘキサン(35mL)中で沈澱させ、もう1回遠心分離した。上清をデカンテーションし、下層をヘキサンで洗浄した後、ポリマーを減圧下で数時間乾燥した。Mw 68,000(PDI 1.70);69%BAEEA、31%PrMA;収率70%。(図9)
乾燥し、沈澱したポリマーをDCMに溶解した(約60mg/mL)。ヘキサンを、曇点到達の直後まで加えた。得られた乳状溶液を遠心分離した。下層(約30%のポリマーを示す濃稠液体)を単離し、減圧下で乾燥した。残りの上層を、ヘキサンをさらに加えて完全に沈澱させた。第二の分画を遠心分離し、その後ポリマーを単離し、減圧下で乾燥した。分画1:Mw 92,000(PDI 1.42);収率45%。分画2:Mw 52,000(PDI 1.55);収率50%。
乾燥したポリマー分画を酢酸中2M HCl(約7ml)で1時間脱保護した。次いで、反応混合物を20mlの水で希釈し、10〜15分間撹拌した。次いで、分画を3500 MWの透析チューブで、高濃度の塩、高濃度の塩、および水中でそれぞれ15時間、8時間、および15時間透析した。次いで、分画を50ml遠沈管に移し、3日間または乾燥するまで凍結乾燥した。乾燥試料をさらなる試験のために水中で20mg/mlとした。
1. モノマー合成
撹拌子を入れた2L丸底フラスコ中、2-(2-アミノエトキシ)エタノール(21.1g、202.9mmol、Sigma Aldrich)を350mLのジクロロメタンに溶解した。別の1Lフラスコ中、BOC無水物(36.6g、169.1mmol)を660mLのジクロロメタンに溶解した。2L丸底フラスコに滴加漏斗を取り付け、BOC無水物溶液をフラスコに6時間かけて加えた。反応混合物を終夜撹拌した。2Lの分液漏斗中で、生成物を10%クエン酸、10%K2CO3、飽和NaHCO3、および飽和NaCl各300mlで洗浄した。生成物のBOC保護2-(2-アミノエトキシ)エタノールをNa2SO4で乾燥し、重力ろ過し、DCMをロータリーエバポレーションおよび高減圧を用いて蒸発させた。
乾燥し、沈澱した生成物をDCMに溶解した(100mg/mL)。ヘキサンを、曇点到達の直後まで加えた(約20ml)。得られた乳状溶液を遠心分離した。下層(約60%のポリマーを示す濃稠液体)を抽出し、ヘキサン中で完全に沈澱させた。残りの上層も、ヘキサンをさらに加えて完全に沈澱させた。両方の分画を遠心分離し、その後ポリマーを単離し、減圧下で乾燥した。分画1:Mw 87,000(PDI 1.5);分画2:Mw 52,000(PDI 1.5〜1.6)。
約10mgのポリマーを0.5mLの89.8%ジクロロメタン、10%テトラヒドロフラン、0.2%トリエチルアミンに溶解した。分子量および多分散性(PDI)を、Jordi 5μ 7.8×300 Mixed Bed LS DVBカラムを用い、Shimadzu Prominence HPLCに接続したWyatt Helos II多角度光散乱検出器を用いて測定した。粗製ポリマー:MW:73,000(PDI 1.7)、分画1:MW 87,000(PDI:1.5)、分画2:MW 52,000(PDI 1.5〜1.6)
A. ポリマーLAU 41305-38-17-19ランダムポリアクリラート
1. N-Boc-アミノ-プロピル-アクリラート(BAPA)の合成
撹拌子を入れ、アルゴンを流した500ml丸底フラスコ中、3-(BOC-アミノ)1-プロパノール(TCI)(135.8mmol)と、続いて240mL無水ジクロロメタンを加えた。ジイソプロピルエチルアミン(203.7mmol)を加え、系をドライアイス/アセトン浴に入れた。塩化アクリロイル(149.4mmol)を10mlのジクロロメタンを用いて希釈し、アルゴンを流した系に滴加した。系をアルゴン雰囲気下に維持し、室温まで戻し、終夜撹拌した。生成物をdH2O、10%クエン酸、10%K2CO3、飽和NaHCO3、および飽和NaCl各100mLで洗浄した。生成物のBOC-アミノプロピルアクリラート(BAPA)をNa2SO4で乾燥し、重力ろ過し、DCMをロータリーエバポレーションを用いて蒸発させた。生成物を、直径7.5cmのカラムを用い、29cmシリカのカラムクロマトグラフィにより精製した。用いた溶媒系はヘキサン中30%酢酸エチルであった。Rf:0.30。分画を回収し、溶媒をロータリーエバポレーションおよび高減圧を用いて除去した。BAPAを収率74%で得た。BAPAをフリーザーに保存した。
80%BAPA、20%エチルメタクリラート(CAS 97-63-2)、(3%AIBN触媒)モル仕込み比(合計0.0105mol)。BAPA(8.40mmol)およびエチルメタクリラート(2.10mmol)を撹拌子を入れた15ml反応チューブに加えた。アセトニトリル(11.5ml)と、続いてAIBN(0.315mmol)を加えた。2つの反応を並行して実行するために、前述の段階を繰り返した。反応混合物をN2で30分間パージした。次いで、反応チューブに栓をし、油浴に移して、60℃で3時間加熱した。チューブを取り出し、内容物を合わせた。アセトニトリルをロータリーエバポレーションおよび高減圧により蒸発させ、粗製ポリマーを74.8%ジクロロメタン/25%テトラヒドロフラン/0.2%トリエチルアミン溶液に50mg/mlで溶解した。粗製ポリマー溶液(500mg、10ml)の3回の注入分を、Jordiゲルフッ化ジビニルベンゼン104Åカラム(内径:22mm、長さ:500mm)を流速5.0ml/分で用いて精製した。ポリマー溶出をShimadzu RID-10A屈折率コレクターを用いて検出した。17.16分〜19.18分の分画を回収し、混合した。溶媒をロータリーエバポレーションにより蒸発させた。精製したBOC保護ポリマーを氷酢酸中2M HCl(7ml)と1.5時間反応させて、BOC保護基を除去し、アミンを生成した。40mLのdH2Oを反応混合物に加え、溶液を3500 MWカットオフのセルロースチューブに移し、高濃度の塩に対して24時間と、次いでdH2Oに対して18時間透析した。内容物を蒸発乾固し、次いで30mlのdH2Oに溶解し、凍結乾燥することを2回行った。保護ポリマーのMwは100kDaであった。脱保護ポリマーのMw計算値は61kDであった。PDI=1.381。
アミンアクリラート/Cnメタクリラートからなるコポリマーを以下のとおりに合成した。モノマーを秤量し、ジオキサン中で表示の比とした。AIBN(アゾビス-イソブチロニトリル)を加え、窒素を反応混合物に室温で1時間通気した。次いで、反応混合物を60℃の油浴に3時間置いた。次いで、ポリマーを減圧下で乾燥した。ポリマーをGPCで精製した。その後、ポリマー分画を酢酸中2M HCl 7mlにより室温で30分間脱保護した。30分後、水15mlを反応混合物に加え、混合物を3.5kDa MWCO透析チューブに移した。ポリマーをNaClに対して終夜と、次いでdH2Oに対してもう1日透析した。次いで、水を凍結乾燥により除去し、ポリマーをdH2Oに溶解した。
モノマーのモル仕込み比は80 BAEEA:20 プロピルメタクリラート(CAS:2210-28-8)で、モノマーの合計モルに基づき3%AIBN触媒を用いた。BAEEA(6.53g、25.2mmol)(A)、プロピルメタクリラート(0.808g、6.3mmol)(B)、AIBN(0.155g、0.945mmol)、およびジオキサン(34.5ml)を撹拌子を入れた50mlのガラスチューブに加えた。化合物AおよびBを前述のとおりに調製した。反応を三つ組で準備した。各溶液に、長いピペットを用いて窒素を1時間通気した。ピペットを除去し、各チューブに注意深く栓をした。次いで、各溶液を油浴を用いて60℃で3時間加熱した。各溶液を室温まで冷却し、丸底内で混合した。粗製ポリマーを減圧下で乾燥した。MALSによる分子量:55,000(PDI 2.1);H1NMRによるポリマー組成:アミン:アルキル=74:26。
乾燥した粗製ポリマーを75%ジクロロメタン、25%テトラヒドロフラン、および0.2%トリエチルアミン中50mg/mlとした。次いで、ポリマーをJordi Gel DVB 104Å−500mm/22mmカラムで流速5ml/分および10ml注入を用いて分別した。前半の分画を15〜17分で回収し、後半の分画を17〜19分で回収した。分画15〜17:Mw 138,000(PDI 1.1);分画17〜19:Mw 64,000(PDI 1.2)。
約10mgのポリマーを0.5mLの89.8%ジクロロメタン、10%テトラヒドロフラン、0.2%トリエチルアミンに溶解した。分子量および多分散性(PDI)を、Jordi 5μ 7.8×300 Mixed Bed LS DVBカラムを用い、Shimadzu Prominence HPLCに接続したWyatt Helos II多角度光散乱検出器を用いて測定した。粗製ポリマー:MW:55,000(PDI 2.1)、分画15〜17:MW 138,000(PDI:1.1)、分画17〜19:MW 64,000(PDI 1.2)
A. ガラクトース二置換無水マレイン酸マスキング剤
1)化合物10
式中
Yは、下記などであるが、それらに限定されるわけではない、中性リンカーであり:
-(CH2)a-(O-CH2-CH2)b-NH-CO-(CH2)c-、ここでa、bおよびcは独立に1〜6の整数であり、かつ
Rは、下記を含むリストから選択される、アシアロ糖タンパク質受容体に対する親和性を有するガラクトース誘導体である:
OH(ガラクトース)、
NH2(D-ガラクトサミン)、
NH-CO-H(N-ホルミル-D-ガラクトサミン)、
NH-CO-CH3(N-アセチル-D-ガラクトサミン(GalNAc))、
NH-CO-CH2CH3(N-プロピオニル-D-ガラクトサミン)、
NH-CO-CH2CH2CH3(N-n-ブタノイル-D-ガラクトサミン)、および
NH-CO-CH(CH3)2(N-イソ-ブタノイル-D-ガラクトサミン)。
無水マレイン酸のポリマー上のアミン基との反応により、ガラクトースとポリマーアミンとの間のpHに不安定な連結が生成する。
式中
Yは、下記などであるが、それらに限定されるわけではない、中性リンカーであり:
-NH-(CH2-CH2-O)b-(CH2)a-、ここでbおよびcは独立に1〜6の整数であり、かつ
Rは化合物10について上で規定したとおりである。
1)化合物15
式中、Rは中性であり、ポリエチレングリコールを含む。
無水マレイン酸のポリマー上のアミン基との反応により、PEGとポリマーアミンとの間のpHに不安定な連結が生成する。
式中
nは1から500の整数であり、かつ
Rは-H、-CH3、および-CH2-CH3からなる群より選択される。
好ましくは、nは2から100の整数である。より好ましくは、PEGは5から20のエチレン単位を含む(nは5から20の整数である)。より好ましくは、PEGは10〜14のエチレン単位を含む(nは10から14の整数である)。PEGは変動する長さのものであってもよく、5〜20または10〜14エチレン単位の平均長を有する。または、PEGは、例えば、ちょうど11または13エチレン単位を有する、単分散、均一または離散であってもよい。
R1およびR2はアミノ酸のR基であり、
R4は立体安定化部分の標的指向リガンドであり、
Xは-NH-、-O-、または-CH2-であり、
Yは-NH-または-O-であり
R5は2、4、または6位にあって、-CH2-O-C(O)-O-Zであり、ここでZカルボナート、かつ
R6は、R5が占める位置を除く2、3、4、5、または6位のそれぞれで独立に水素、アルキル、またはハロゲン化物である。
A. SATA/SMPT連結
N-スクシンイミジル-S-アセチルチオアセタート(SATA)-修飾ポリヌクレオチドを、5'-アミン修飾siRNAの1重量当量のSATA試薬(Pierce)および0.36重量当量のNaHCO3との水中、4℃で16時間の反応により合成した。保護チオール修飾siRNAを、9倍量のエタノールの添加によって沈澱させ、-78℃で2時間インキュベートした。沈澱を単離し、1×siRNA緩衝液(Dharmacon)に溶解し、260nmの波長で吸光度を測定することにより定量した。
HEPES遊離塩基と、続いてCDM-NAGおよびCDM-PEGの混合物を溶液に加えることにより、siRNA-ポリマー結合体をマスクした。次いで、溶液を室温(RT)で1時間インキュベートした後、注入した。
センス鎖上に5'-アミノ基を有するsiRNAをSATAと、HEPES塩基、pH7.5存在下で反応させる。別に、ポリ(アクリラート)を3-(2-ピリジルジチオ)プロピオン酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(SPDP)と、HEPES、pH7.5存在下で反応させる。次いで、修飾siRNAおよび修飾ポリマーを合わせて、siRNAをポリマーに共有結合させた。
鎖末端アミノ基を有するsiRNAをS-アセチル基と反応させて、siRNA-SAcを得る。ポリマーを5-メチル-2-イミノチオラン(M2IT)と、DTNB存在下で反応させて、活性化ジスルフィドを有するポリマーを得る。
次いで、上の修飾ポリマーをsiRNA-SAcと反応させて、siRNA-ポリマー結合体を生成する。
鎖末端アミノ基を有するsiRNAを、2-プロピオン酸-3-メチル無水マレイン酸またはCDM-チオエステルなどの二置換無水マレイン酸と、アルカリ性緩衝液(例えば、HEPES、pH7.9)存在下で反応させる。siRNA-無水マレイン酸にポリ(アクリラート)を加える。次いで、無水マレイン酸がポリマー上のアミンと反応する。
A. 無水マレイン酸系マスキング剤による修飾
修飾前に、5〜7×mgの二置換無水マレイン酸マスキング剤(例えば、CDM-NAG)を氷酢酸の0.1%水溶液から凍結乾燥した。乾燥した二置換無水マレイン酸マスキング剤に、0.2×mLの等張グルコースおよび10×mgのHEPES遊離塩基中×mgのポリマーの溶液を加えた。無水物が完全に溶解した後、溶液を室温で少なくとも30分間インキュベートし、その後動物に投与した。二置換無水マレイン酸マスキング剤のポリマーとの反応により下記を得た:
式中、Rはポリ(アクリラート)ポリマーであり、かつR1は標的指向リガンドまたは立体安定化部分を含む。無水物とポリマーアミンとの間の反応中に生じた無水物カルボキシルは、予想される電荷の約1/20を示す(Rozema et al. Bioconjugate Chemistry 2003)。したがって、膜活性ポリマーは、高度に負に荷電したポリアニオンに変換されるのではなく、有効に中性化される。
p-アシルアミドベンジルアルコール誘導体の活性化(アミン反応性)カルボナートを、両親媒性膜活性ポリアミンのアミノ基と、H2O中、pH>8で反応させて、p-アシルアミドベンジルカルバマートを得る。
R1は標的指向基リガンド(保護または非保護のいずれか)またはPEGを含み、
R2は両親媒性膜活性ポリ(アクリラート)であり、
AAはジペプチド(保護または非保護のいずれか)であり、かつ
Zはアミン反応性カルボナートである。
A)ポリマーをSMPTで修飾した。1時間後、2重量当量のCDM-NAG(N-アセチルガラクトースアミン)および/またはCDM-PEG(平均11単位)をポリマーに、HEPES塩基存在下で加えた。この溶液に、SATA-siRNAを加えた。終夜インキュベートした後、CDM-NAGおよび/またはCDM-PEGが結合体に付加された。
siRNAは以下の配列を有していた:
第VII因子−齧歯類
小文字=2'-O-CH3置換
s=ホスホロチオアート連結
ヌクレオチドの後のf=2'-F置換
ヌクレオチドの前のd=2'-デオキシ
センス鎖の5'-末端にC-6-アミノリンカーを備えたRNAを、AEKTA Oligopilot 100(GE Healthcare、Freiburg、Germany)および固体支持体として多孔性ガラス(Prime Synthesis、Aston、PA、USA)を用い、固相上で標準のホスホラミダイト化学により1215μmolの規模で生成した。2'-O-メチルヌクレオチドを含むRNAを、対応するホスホラミダイト、2'-O-メチルホスホラミダイト、およびTFA-ヘキシルアミノリンカーアミダイト(Sigma-Aldrich、SAFC、Hamburg、Germany)を用いて生成した。切断および脱保護ならびに精製は、当技術分野において公知の方法によって達成した(Wincott F., et al, NAR 1995, 23, 14, 2677-84)。
RNAiポリヌクレオチド結合体およびマスクしたポリ(アクリラート)ポリマーを前述のとおりに合成した。6から8週齢のマウス(C57BL/6またはICR系統、それぞれ約18〜20g)をHarlan Sprague Dawley(Indianapolis、IN)から入手した。注射前にマウスを少なくとも2日間飼育した。飼料はHarlan Teklad Rodent Diet(Harlan、Madison WI)を自由に与えた。特に記載がないかぎり、マウスに送達ペプチド-siRNA結合体の溶液0.4mLを尾静脈中への点滴により注入した。組成物は生理的条件で可溶性かつ非凝集性であった。他の血管への注射、例えば、眼窩後注射も同等に有効であると推測される。
血清ApoBタンパク質レベルを、標準のサンドイッチELISA法によって定量した。簡単に言うと、ポリクローナルヤギ抗マウスApoB抗体およびウサギ抗マウスApoB抗体(Biodesign International)をそれぞれ捕捉および検出抗体として用いた。その後HRP-結合ヤギ抗ウサギIgG抗体(Sigma)を適用して、ApoB/抗体複合体を結合した。次いで、テトラメチル-ベンジジン(TMB、Sigma)発色の吸光度を、Tecan Safire2(Austria、Europe)マイクロプレート読み取り器により450nmで測定した。
動物からの血漿試料を、標準の手順に従い、0.109mol/Lクエン酸ナトリウム抗凝固剤(1倍量)を含むマイクロ遠沈管中に採血(9倍量)(マウスは顎下出血により、またはラットは頸静脈から)することにより調製した。血漿中のF7活性を、BIOPHEN VIIキット(Hyphen BioMed/Aniara、Mason、OH)を製造者の推奨に従い用いて、色素産生法により測定する。発色の吸光度を、Tecan Safire2マイクロプレート読み取り器を用いて405nmで測定した。
A. 以下のポリマーを前述のとおりRAFT重合により合成した。
1)エチル(boc)アミノアクリラート+ブチルメタクリラート(EAA-BuMA)
2)エトキシエチル(boc)アミノアクリラート+secブチルアクリラートコポリマー(EEAA-SecBuA)
3)エトキシエチル(boc)アミノアクリラート+ブチルアクリラートコポリマー(EEAA-BuA)
A)標的遺伝子ノックダウン測定
以下に示すすべての試験について、Aha1遺伝子転写物、すなわち標的遺伝子に特異的なsiRNAを用いた。高感度緑色蛍光タンパク質(EGFP)に対するsiRNAをオフターゲット対照として用いた。Aha1 siRNAは、ヒトおよびマウス両方の遺伝子において100%相同であるAha1中の配列モチーフに相補的であった。したがって、Aha1 siRNAのヒト異種移植片における宿主細胞または腫瘍細胞のいずれかへの送達により、mRNA切断および分解を引き起こす。マウスおよびヒトAha1遺伝子で異なる配列モチーフを用いて、細胞型の混合集団を含む組織試料中のヒトAha1およびマウスAha1両方のmRNAレベルの定量的測定を可能にするPCRプライマーを設計した。siRNA送達の24、48または72時間後、いくらかの健常マウス肝組織が接着した腫瘍を回収し、全RNA単離のためにTri-Reagent(Invitrogen)中で処理した。次いで、ヒトおよびマウス両方のAha1 mRNAレベルを、内部標準遺伝子としてヒトCyc-Aおよびマウスβ-アクチンを用い、qPCR検定により測定した。模擬注射した動物、またはオフターゲット対照GFP siRNAを投与したマウスからの動物中のAha1 mRNAレベルを100%と考えた。結果を、対照に対するAha1 mRNAレベルのパーセントで表し、以下の表に示す。
HegG2、Hep3B、またはHuH7細胞肝細胞癌を2つの発現ベクター、すなわちヒト胎盤分泌アルカリ性ホスファターゼ(SEAP)ベクターpMIR85およびネオマイシン/カナマイシン耐性遺伝子ベクターpMIR3と同時形質移入して、SEAPを安定に発現する細胞株を得た。細胞を10%FBSおよび300ug/ml G418)を補充したDMEM中で培養し、回収し、計数し、マトリゲル(BD Biosciences)(50体積%)と混合した。無胸腺ヌードマウスまたはScidベージュマウスを約3%のイソフルランで麻酔し、胸骨臥位に置いた。剣状突起のすぐ下に小さい1〜2cmの正中線腹部切開を行った。湿った綿棒を用いて、肝臓の左葉を静かに体外に出した。肝臓の左葉を静かに後退させ、左葉の真ん中にシリンジ針を挿入した。シリンジ針の斜端を肝臓被膜の真下約0.5cmで挿入した。100,000個の細胞を含む細胞/マトリゲル混合物10μlを、シリンジポンプを用いて肝臓に注入した。針をしばらく(15〜20秒間)肝臓に挿入したままにして、確実に注入を完了した。SEAP-HepG2細胞を無胸腺ヌードマウスに注入した。SEAP-Hep3BおよびSEAP-HuH7細胞をScidベージュマウスに注入した。次いで、シリンジを針から肝臓から抜去し、注入部位上に綿棒を置いて、細胞の漏出または出血を防止した。マトリゲル/細胞混合物は目に見える塊を形成し、針の抜去後も消失しなかった。次いで、肝葉を静かに腹腔に戻し、腹壁を閉鎖した。腫瘍移植後、1週間に1回血清を採取し、SEAP検定にかけて、腫瘍の成長をモニターした。ほとんどの試験で、腫瘍マウスを移植の4〜5週間後に用いたが、この時点で腫瘍測定値はSEAP値に基づき約4〜8mmであると予想される。
HT29細胞を10%FBSを補充したマッコイ5a培地中で培養し、回収し、計数し、マトリゲル(BD Biosciences)(50体積%)と混合した。無胸腺ヌードマウスを約3%のイソフルランで麻酔し、胸骨臥位に置いた。剣状突起のすぐ下に小さい1〜2cmの正中線腹部切開を行った。湿った綿棒を用いて、肝臓の左葉を静かに体外に出した。肝臓の左葉を静かに後退させ、左葉の真ん中にシリンジ針を挿入した。シリンジ針の斜端を肝臓被膜の真下約0.5cmで挿入した。約40,000個の細胞を含む細胞/マトリゲル混合物5μlを、シリンジポンプを用いて肝臓に注入した。針をしばらく(15〜20秒間)肝臓に挿入したままにして、確実に注入を完了した。次いで、シリンジを肝臓から抜去し、注入部位上に綿棒を置いて、細胞の漏出または出血を防止した。マトリゲル/細胞混合物は目に見える塊を形成し、針の抜去後も消失しなかった。次いで、肝葉を静かに腹腔に戻し、腹壁を閉鎖した。腫瘍マウスを移植の4〜5週間後に用いた。
Ant-129-1ポリマーDPCを前述のとおり、18×重量過剰のPEG24-Phe-Citマスキング剤(またはPEG24-Val-Citマスキング剤)または7×PEG550-CDMのいずれかで修飾(マスク)した。Aha1-siRNAまたはGFP-siRNA(オフターゲット対照)を前述のとおりにポリマーに連結した(重量比4:1)。DPCは送達前にゲルろ過により精製せず、標的指向リガンドを加えなかった。動物1匹あたり等張グルコース200μl中のDPC結合体320μg(ポリマー重量)を、尾静脈注射により投与した(n=3/群)。24時間後、動物に等張グルコース200μl中のDPC結合体320μg(ポリマー重量)の二回目の注射を行った。二回目の注射の48時間後、血清試料を採取して、肝酵素(ALTおよびAST)および血液尿素窒素(BUN)レベルを測定することにより毒性を評価し、続いて組織を回収し、qPCR分析を行った。
Ant-129-1ポリマーを、前述のとおり5×Dig-PheCit(Dig-FCit)マスキング剤で修飾した。次いで、siRNAを結合体に連結した。最後に、Dig-FCit-Ant-129-1-siRNA結合体を8×(重量)PEG12-FCitでさらに修飾した。Aha1-siRNA(RD-09070)またはGFP siRNA(RD-05814)をポリマー:siRNA=4:1の重量比で連結した。PEG12-FCit DPCをSephadex G50スピンカラムで精製して、結合していない試薬を除去した。
DPCを、a)PEG12-FCitの代わりにPEG24-FCitを用いた、およびb)Digをポリマーに連結するためにDig-PEG12-NHSを用いた以外は、前述のとおりに調製した。PEG24-FCit DPCはPEG12-FCit DPCよりも凝集が少なく、より小さく、より均質であった。非不安定連結であることに加えて、Dig-PEG12-NHSはより長いPEGも含んでいた。DPCはbsAbとの複合体で、前述のとおりに動物に注射した。血清および組織回収を注入の24または48時間後のいずれかに行った。表5に示すとおり、1回用量のDPC(250μgポリマー重量)により、注射の24時間後に46〜56%のヒトAha1ノックダウンが引き起こされた。
Ant-129-1ポリマーを、5×モル過剰のDig-PEG12-NHSおよび8×重量過剰のPEG24-FCitで修飾した。Aha1-siRNAまたはGFP siRNAを修飾ポリマーにポリマー:siRNA=4:1の重量比で連結した。DPCをSephadex G50スピンカラムで精製して、結合していない試薬を除去した。Dig-DPCを、注射の少なくとも30分前に等モル量のIGF1R-Dig bsAbまたはCD33-Dig bsAbまたはbsAbなしで滅菌PBS中で複合体形成した。HT29腫瘍細胞(ヒト結腸直腸腺癌;ATCC番号HTB-38)を含む動物に、DPCを注射した。HT29細胞はインスリン様成長因子-1受容体タンパク質(IGF1R)を過剰発現し、IGF1R-Dig二重特異性抗体と結合し、これを内部に取り込むことができる。動物(n=3)にDPC(320μgポリマー)を投与した。注射を24時間後に繰り返した。血清および組織試料を2回目の投与の48時間後に回収した。腫瘍細胞におけるヒトAha1のノックダウンは26〜38%であった(表6)。CDM-DPCに比べて、FCit-DPCはより低いオフターゲット肝Aha1ノックダウンを示した(24〜36%に比べて78〜83%)。FCit-DPCはCDM-DPCに比べて肝蓄積の低減も示した。
以下の表8〜11に示すポリ(アクリラート)ポリマーを、前述のとおりにマスクし、siRNAに結合した。次いで、結合体をラットに注射し、標的遺伝子発現に対する効果を判定した。
以下の表12〜13に示すポリ(アクリラート)ポリマーを、前述のとおりにマスクした。次いで、マスクしたポリマーをコレステロール-siRNAと共にマウスに同時注射し、標的遺伝子発現に対する効果を判定した。
図14に挙げる組成を有する様々な両親媒性ポリ(アクリラート)ランダムコポリマーを、前述のとおりに合成した。図15に挙げるポリ(アクリラート)ポリマーを、前述のとおりにマスクし、siRNAに結合した。次いで、結合体を示した動物に注射し、標的遺伝子発現に対する効果を判定した(図15)。図16に挙げるポリ(アクリラート)ポリマーを、前述のとおりにマスクした。次いで、マスクしたポリマーをコレステロール-siRNAと共に動物に同時注射し、標的遺伝子発現に対する効果を判定した(図16)。
[本発明1001]
以下の構造を有するポリ(アクリラート)ランダムコポリマー:
式中:
Nは-NH 2 または-N-CO-O-C-(CH 3 ) 3 であり、
Yは-(CH 2 ) a -または-(CH 2 -CH 2 -O) b -(CH 2 ) c -であり、ここでa、b、およびcは独立に1、2、3、4、5、または6であり、
N'は-NR 5 H、-NR 5 R 6 、-NR 5 R 6 R 7 、窒素複素環、アルジミン、ヒドラジド、ヒドラゾン、またはイミダゾールであり、ここでR 5 、R 6 、およびR 7 は独立に-CH 3 および-CH 2 -CH 3 から選択され、
Y'は1〜12個の炭素原子を含む非荷電リンカー基であり、炭素原子の1つまたは複数はヘテロ原子で置換されていてもよく、
Rは2〜6個の炭素原子を有する疎水性基、またはアルコキシエチル基であり、
R'は12〜20個の炭素原子を有する疎水性基であり、
R1、R2、R3、およびR4は独立に水素(-H)およびメチル(-CH 3 )から選択され、
mおよびpは独立にゼロ(0)よりも大きい整数であり、
nおよびqは独立にゼロ(0)以上の整数であり、
比(m+n)/(p+q)は0.67〜5.7であり、
qが1以上の整数であるとき、比(m+n+p)/(q)は19以上であり、かつ
ポリ(アクリラート)ランダムコポリマーの多分散性は1.5未満である。
[本発明1002]
R1が水素である、本発明1001のポリ(アクリラート)ランダムコポリマー。
[本発明1003]
Yが-(CH 2 ) a -であり、ここでaは2、3、または4である、本発明1002のポリ(アクリラート)ランダムコポリマー。
[本発明1004]
Yが-CH 2 -CH 2 -O-(CH 2 ) 2 -である、本発明1002のポリ(アクリラート)ランダムコポリマー。
[本発明1005]
Rが下記からなる群より選択される、本発明1002のポリ(アクリラート)ランダムコポリマー:
-(CH 2 ) k -CH 3 、ここでkは1、2、または3であり、
-CH(CH 3 )-CH 2 -CH 3 、および
-(CH 2 ) l -O-CH 2 -CH 3 、ここでlは2、3、または4である。
[本発明1006]
Rが-CH 2 -CH 2 -O-CH 2 -CH 3 である、本発明1005のポリ(アクリラート)ランダムコポリマー。
[本発明1007]
nがゼロである、本発明1002のポリ(アクリラート)ランダムコポリマー。
[本発明1008]
qがゼロである、本発明1007のポリ(アクリラート)ランダムコポリマー。
[本発明1009]
R3が水素である、本発明1002のポリ(アクリラート)ランダムコポリマー。
[本発明1010]
(m+n)/(p+q)が1〜1.86である、本発明1009のポリ(アクリラート)ランダムコポリマー。
[本発明1011]
R3がメチルである、本発明1002のポリ(アクリラート)ランダムコポリマー。
[本発明1012]
(m+n)/(p+q)が1.86〜3である、本発明1009のポリ(アクリラート)ランダムコポリマー。
[本発明1013]
Yが-(CH 2 -CH 2 -O)-CH 2 -CH 2 -であり、
Rが-CH 2 -CH 2 -CH 3 であり、
R1が水素であり、
R3がメチルであり、
nおよびqが両方ゼロであり、
かつm/pが2.2〜3である、
本発明1001のポリ(アクリラート)ランダムコポリマー。
[本発明1014]
Yが-(CH 2 -CH 2 -O)-CH 2 -CH 2 -であり、
Rが-CH 2 -CH 2 -CH 3 であり、
R1およびR3が両方水素であり、
nおよびqが両方ゼロであり、
かつm/pが1〜1.86である、
本発明1001のポリ(アクリラート)ランダムコポリマー。
[本発明1015]
Yが-(CH 2 -CH 2 -O)-CH 2 -CH 2 -であり、
Rが-CH 2 -CH 2 -CH 2 -CH 3 であり、
R1およびR3が両方水素であり、
nおよびqが両方ゼロであり、
かつm/pが1〜1.86である、
本発明1001のポリ(アクリラート)ランダムコポリマー。
[本発明1016]
RNA干渉ポリヌクレオチドに結合している、本発明1001のポリ(アクリラート)ランダムコポリマー。
[本発明1017]
50%よりも多くのNが、二置換無水マレイン酸マスキング剤、ジペプチド-アミドベンジル-カルボナートマスキング剤、または二置換無水マレイン酸マスキング剤およびジペプチド-アミドベンジル-カルボナートマスキング剤の組み合わせとの反応によって可逆的に修飾されている、本発明1001のポリ(アクリラート)ランダムコポリマー。
[本発明1018]
薬学的に許容される担体中の本発明1017のポリ(アクリラート)ランダムコポリマーおよびRNA干渉ポリヌクレオチドを含む、インビボで遺伝子発現を阻害するための組成物。
[本発明1019]
RNA干渉ポリヌクレオチドがポリ(アクリラート)ランダムコポリマーに共有結合している、本発明1018の組成物。
[本発明1020]
RNA干渉ポリヌクレオチドが、少なくとも20個の炭素原子を含む疎水性基に結合している、本発明1018の組成物。
Claims (20)
- 以下の構造を有するポリ(アクリラート)ランダムコポリマー:
式中:
Nは-NH2または-N-CO-O-C-(CH3)3であり、
Yは-(CH2)a-または-(CH2-CH2-O)b-(CH2)c-であり、ここでa、b、およびcは独立に1、2、3、4、5、または6であり、
N'は-NR5H、-NR5R6、-NR5R6R7、窒素複素環、アルジミン、ヒドラジド、ヒドラゾン、またはイミダゾールであり、ここでR5、R6、およびR7は独立に-CH3および-CH2-CH3から選択され、
Y'は1〜12個の炭素原子を含む非荷電リンカー基であり、炭素原子の1つまたは複数はヘテロ原子で置換されていてもよく、
Rは2〜6個の炭素原子を有する疎水性基、またはアルコキシエチル基であり、
R'は12〜20個の炭素原子を有する疎水性基であり、
R1、R2、R3、およびR4は独立に水素(-H)およびメチル(-CH3)から選択され、
mおよびpは独立にゼロ(0)よりも大きい整数であり、
nおよびqは独立にゼロ(0)以上の整数であり、
比(m+n)/(p+q)は0.67〜5.7であり、
qが1以上の整数であるとき、比(m+n+p)/(q)は19以上であり、かつ
ポリ(アクリラート)ランダムコポリマーの多分散性は1.5未満である。 - R1が水素である、請求項1記載のポリ(アクリラート)ランダムコポリマー。
- Yが-(CH2)a-であり、ここでaは2、3、または4である、請求項2記載のポリ(アクリラート)ランダムコポリマー。
- Yが-CH2-CH2-O-(CH2)2-である、請求項2記載のポリ(アクリラート)ランダムコポリマー。
- Rが下記からなる群より選択される、請求項2記載のポリ(アクリラート)ランダムコポリマー:
-(CH2)k-CH3、ここでkは1、2、または3であり、
-CH(CH3)-CH2-CH3、および
-(CH2)l-O-CH2-CH3、ここでlは2、3、または4である。 - Rが-CH2-CH2-O-CH2-CH3である、請求項5記載のポリ(アクリラート)ランダムコポリマー。
- nがゼロである、請求項2記載のポリ(アクリラート)ランダムコポリマー。
- qがゼロである、請求項7記載のポリ(アクリラート)ランダムコポリマー。
- R3が水素である、請求項2記載のポリ(アクリラート)ランダムコポリマー。
- (m+n)/(p+q)が1〜1.86である、請求項9記載のポリ(アクリラート)ランダムコポリマー。
- R3がメチルである、請求項2記載のポリ(アクリラート)ランダムコポリマー。
- (m+n)/(p+q)が1.86〜3である、請求項9記載のポリ(アクリラート)ランダムコポリマー。
- Yが-(CH2-CH2-O)-CH2-CH2-であり、
Rが-CH2-CH2-CH3であり、
R1が水素であり、
R3がメチルであり、
nおよびqが両方ゼロであり、
かつm/pが2.2〜3である、
請求項1記載のポリ(アクリラート)ランダムコポリマー。 - Yが-(CH2-CH2-O)-CH2-CH2-であり、
Rが-CH2-CH2-CH3であり、
R1およびR3が両方水素であり、
nおよびqが両方ゼロであり、
かつm/pが1〜1.86である、
請求項1記載のポリ(アクリラート)ランダムコポリマー。 - Yが-(CH2-CH2-O)-CH2-CH2-であり、
Rが-CH2-CH2-CH2-CH3であり、
R1およびR3が両方水素であり、
nおよびqが両方ゼロであり、
かつm/pが1〜1.86である、
請求項1記載のポリ(アクリラート)ランダムコポリマー。 - RNA干渉ポリヌクレオチドに結合している、請求項1記載のポリ(アクリラート)ランダムコポリマー。
- 50%よりも多くのNが、二置換無水マレイン酸マスキング剤、ジペプチド-アミドベンジル-カルボナートマスキング剤、または二置換無水マレイン酸マスキング剤およびジペプチド-アミドベンジル-カルボナートマスキング剤の組み合わせとの反応によって可逆的に修飾されている、請求項1記載のポリ(アクリラート)ランダムコポリマー。
- 薬学的に許容される担体中の請求項17記載のポリ(アクリラート)ランダムコポリマーおよびRNA干渉ポリヌクレオチドを含む、インビボで遺伝子発現を阻害するための組成物。
- RNA干渉ポリヌクレオチドがポリ(アクリラート)ランダムコポリマーに共有結合している、請求項18記載の組成物。
- RNA干渉ポリヌクレオチドが、少なくとも20個の炭素原子を含む疎水性基に結合している、請求項18記載の組成物。
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