JP2005529931A - 膜相互作用の可逆的改質 - Google Patents

Abstract

化合物の膜相互作用の可逆的改質方法に関する。膜相互作用の改質は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏにて、分子の細胞への送達を促進すべく使用されてもよい。膜の活性化合物を可逆的に不活化する本願に述べるモディファイヤーは、クロスリンカー又は分子の電荷を反転すべく使用されてもよい。

Description

発明の詳細な説明

（関連出願の相互参照）
本願は、２００２年５月２４に出願した米国仮出願番号６０／３８３，２９８号に基づく優先権を主張する。

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（背景）
投与に関する種々の方法及びルートは、ペプチド、ホルモン、蛋白、酵素などの医薬品、低分子薬物及び生物学的活性化合物をその作用部位へと送達すべく開発されてきた。非経口的な投与ルートには、血管内（静脈、動脈）、筋内、実質内、経皮、皮下、腫瘍内、腹腔内及びリンパ内を含み、ニードルやカテーテルを使用する。血液循環系は、医薬品の全身的な分布を提供する。ポリエチレングリコールやその他の親水性ポリマーは、血液成分との相互作用を防止し、且つ、細網内皮系によるオプソニン化、ファゴサイトーシス及び取り込み（ｕｐｔａｋｅ）を阻止することにより、医薬品の防御性を提供すべく、且つ、血流へと医薬品の循環時間を増加すべく使用されてきた。例えば、アデノシンデアミナーゼは、アデノシンデアミナーゼの欠損症の患者の処置において、この酵素の循環時間及び持続性を増加すべく、ポリエチレングリコールにて共有的に改質されてきた。投与後の医薬品の制御された放出は、著しく発達している。

生物学的活性化合物及びマクロ分子のための合成送達ビヒクルの合理的なデザインにおいて、エンドソームにおける逸脱を提供する問題は、細胞質及び核の作用部位へと効果的な送達に対する臨界的なバリアとなる可能性がある。このバリアを克服する試みにおいて種々の方法が使用されてきており、バリアには：細胞のエンドソーム膜と仮説的に融合するリポソーム；エンドソーム膜と融合又は破裂するウィルス；及びエンドソーム膜を不安定化又は破壊するポリマーベースの又はその他の非ウィルス系；が含まれる。現在、これらシステムのいずれにおいても、分画の包含された内膜から共にエンドサイトーシスされる材料の有効な逸脱に影響を与えるものはない。エンドソームによる放出及びこれを合成的に促進する理解は、多いに未解決の工程を残存させている。エンドソームによる放出を達成するためのウィルス及び合成の工程のいずれも、膜の融合又は崩壊のいずれかを惹起すべく、エンドソーム及び／又はライソソームの酸性化にしばしば依拠している。ウィルスに関して、細胞内画分の低下されたｐＨは、エンドソームによる逸脱を誘導する今フォメーションの変化を惹起する。細胞質とエンドソームとのｐＨの勾配は、クロロキニンなどのモノアミンがエンドソーム内を濃縮させ、ｐＨ勾配を崩壊させる。ＰＥＩなどのポリアミンに存在するｐＨ感受性アミンは、エンドソームによる放出において役割を担っている可能性があるが、そのプロトン化の役割は不明である。いくつかのリポソームをベースとしたシステムに関して、ｐＨ感受性グループは、プロトン化における位相変化の実行を可能とする脂質に導入されている。最終的に、プロトン化可能なグループを含有するペプチド及び合成ポリマーは、酸性環境化において、より高親媒性で膜活性を向上させるべく、ウィルスシーケンスの後にモデル化されてきた。酸性ベシクルに膜活性を限定することにより、原形質膜に対する効果及びこれによる細胞毒性は、理論的に減弱される。

不幸なことに、膜崩壊に影響を及ぼすプロトン化を使用することは、エンドソームの崩壊は、ｐＨ勾配を崩壊する（つまり、膜のインテグリティーは、ｐＨ勾配の保持に基づいている）という理論的な難問に付きまとわれている。ｐＨ勾配の損失により、ｐＨ依存性エンドソーム分解性薬剤の活性は逆転される。したがって、送達は、マクロ分子が拡散する前の、エンドソーム膜の放出により、潜在的に限定されている。エンドソーム又はリソソーム内で不安定なリンケージの使用は、リポソーム又は、キャリアによる薬物のカップリングに以前使用されてきていた［Ｂｌａｔｔｌｅｒら、１９８５年］。特に、無水シトラコン酸は、ＤＯＰＥ（ジオレオイルフォスファチジルエタノールアミン）の第１級アミンを可逆的に改質すべく使用されてきた［Ｒｅｄｄｙ及びＬｏｗ、２０００年］。しかしながら、この試薬の回復の速度論は、細胞内において有用であるには遅すぎる。さらに、この化合物は、結合しているエンドソーム分解薬物の膜活性を阻害することに関して効果的でないことが発見されている。現在利用可能なエンドソーム分解剤に関連する問題を解決すべく、我々は、生物学的薬剤の活性をマスクしない、化学的結合分解に依拠する急速で不可逆的な活性化の工程を開発した。

エンドサイトーシスに依存した送達システムに加えて、化合物の細胞内部への送達に関してエンドサイトーシスに依拠しない細胞透過性化合物は、現在述べられている。これらキャリアによる送達には、この化合物の高度に陽イオン化されたアルギニンリッチなペプチドに対する結合を含んでいる［Ｌｉｎｄｇｒｅｎら、２０００年］。かかる重要なペプチドの一つは、

（配列番号１）であって、ＨＩＶウィルスのＴＡＴ蛋白に由来している。種々の分子に結合した際、このペプチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏのいずれでも、細胞内送達を促進する［Ｓｃｈｅｗａｒｚｅら、１９９９年；Ｌｅｅ及びＰａｒｄｒｉｄｇｅ、２００１年］。他の重要な分子に含まれるのは、ＶＰ２２、ヘルペスＳＶ蛋白及びＡＮＴ蛋白に由来するペプチドを包含し、（

（配列番号２））であって、ドロソフィラの転写因子であるアンテナペディアのホメオドメインに由来するペプチドである。これらペプチドは、非常に高い陽イオン残基、特にアルギニンを有すること以外には目立ったホモロジーを有していない。事実、アルギニン残基のみで構成されるぺプチド及びペプチドアナログは、輸送特性を有することが示されている［Ｆｕｔａｋｉ、２００２年］。これらペプチドの全てに関して、輸送は、エンドサイトーシスを介して起こっていないようである。なぜなら、エンドサイトーシスが不可能な温度である４℃においても送達が即座に起きているからである。しかしながら、これら陽イオン性輸送ペプチドへのコンジュゲートによる分子の送達は選択的ではない。この特異性の欠除は、ＴＡＴ改質ストレプトアビジンの臓器内分布をもたらし、コンジュゲートされていないストレプトアビジンの分布と同様である［Ｌｅｅ及びＰａｒｄｒｉｄｇｅ、２００１年］。膜活性化合物を用いるため我々が開発したこの化合物及び工程は、細胞透過性化合物の活性を制御するという機能も有している。

（概略）
好適実施例において、アミンを有する分子を置換無水マレイン酸及びこの誘導体で改質する工程に付いて述べており、この改質の分解は、ｐＨ７未満で加速される。この改質の分解において、この分子におけるアミンは、再生される。この分子は、この分子が他の化合物又は送達剤とリンクし、この分子の活性を変化させ、或いは、この分子を不活化すべく、この分子の細胞膜との相互作用を変化すべく改質されてもよい。好適な置換無水マレイン酸は、無水マレイン酸二置換体である。

好適実施例において、アミンを有する分子の改変により分子の膜との相互作用を可逆的に変化させることが可能な化合物が述べられており、これは：図１Ａに示された一般構造を有する置換無水マレイン酸であって、無水結合に対するＲは、炭素−酸素又は炭素−炭素結合であってもよく、Ｒ１又はＲ２のいずれかで、両方でなくてもよく、水素原子であってもよい。好適な置換無水マレイン酸は、無水マレイン酸二置換体であって、Ｒ１及びＲ２はいずれも水素原子ではない。二置換体は、無水物とアミンとの間に形成される共有結合のｐＨ不安定性を増加することを発見した。好適な無水マレイン酸二置換体は、カルボキシジメチル無水マレイン酸（ＣＤＭ）又は、２−プロピオニック−３−メチル無水マレイン酸であって、Ｒ１又はＲ２がメチル基であり、Ｒ２又はＲ１が−（ＣＨ_２）_２ＣＯＯＨである。カルボキシル基の導入により、この無水物の電荷及び水溶性が増加し、且つ、膜の活性化及び細胞透過性化合物の不活化が促進する。他の機能基は、Ｒ１及び／又はＲ２のいずれに導入されてもよい。

好適実施例において、図１Ａに示した一般式を有する二機能性置換無水マレイン酸を備えた可逆的共有的クロスリンカーについて述べており、Ｒ１又はＲ２はチオエステルである。このチオエステル基は、末端のシステイン又は、２又は３つの結合にてアミンから分離されたチオールを有する他の分子への結合を可能とする。好適な二機能性無水マレイン酸二置換体は、カルボキシメチル無水マレイン酸チオエステル（ＣＤＭ−チオエステル）であって、Ｒ１又はＲ２は、メチル基であり、且つ、Ｒ２又はＲ１は、−（ＣＨ_２）_２ＣＯＳＣＨ_２ＣＯＯＨである。このチオエステルを有する無水マレイン酸二置換体は、アミンを有する分子を適切なチオールを有する分子へと共有的に結合すべく使用されてもよい。このチオールの結合は、生の化学的ライゲーションを介して起こる。このチオエステル自体、Ｎ−ヒドロキシサクシニミジルエステルなどの活性化エステルと比較して相対的に安定であるが、即座に且つ選択的にＮ−末端性システイン基に結合する。この反応混合物は、他のアミン又は他のチオールを含んでいてもよいが、チオエステルにて、安定なアミドを形成すべく適切なチオールへと結合する。

好適実施例において、アミンを有する生物学的に活性な分子を可逆的に不活化する工程について述べており、この分子は、置換無水マレイン酸により改質されている。この分子の不活化の効率は、無水マレイン酸のＲ１及びＲ２の位置の置換基により影響される（図１Ａ参照）。この改質の回復は、上記の生物学的に活性な分子におけるアミンを再生し、これにより、この分子の活性は、ｐＨ＜７にて加速される。

好適実施例において、分子の細胞内部への送達工程について述べており：膜活性化合物を可逆的に不活化し、且つ、改質された膜活性化合物及び細胞の分子を関連付けることを有しており、上記の化合物及び上記の分子は、エンドサイトーシスされ、且つ、上記の膜活性化合物の活性は、エンドソーム／リソソームによる膜の崩壊を起こすことにより回復される。上記の膜活性化合物の可逆的な不活化は、上記化合物を置換無水マレイン酸と反応することにより改質することで構成されている。エンドソーム又はライソソームの酸性ｐＨ環境への曝露は、上記無水物の分解による上記膜活性化合物の再活性化を惹き起こす好適な置換無水マレイン酸は、無水マレイン酸二置換体である。好適な無水マレイン酸は、ＣＤＭ又はＣＤＭ−チオエステルである。ＣＤＭに存在する追加のカルボン酸は、特定の膜活性化合物の不活化を促進する。この細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏのいずれに存在していてもよい。

好適実施例において、陽イオン性輸送分子の可逆的な不活化に関する方法を述べており：この分子を、置換無水マレイン酸と反応することにより改質することを有している。この可逆的に不活化された輸送分子は、その後、細胞に関連付けられてもよく、この輸送分子の活性は、回復される。無水物改質の分解による上記の輸送分子の再活性化は、エンドソーム／リソソーム又は腫瘍領域などの酸性環境化において促進される。この輸送分子は、他の機能性置換基又は生物学的活性化合物の結合によりさらに改質されてもよい。他の置換基又は化合物は、この輸送化合物又は上記の無水物に結合されてもよい。この改質された陽イオン性輸送分子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏに存在するいずれの細胞に送達されてもよい。

好適実施例において、可逆的共有結合を介した二つの分子のリンク又は結合方法を述べており、この分子の一つはアミンを有している。このリンケージは、二機能性置換無水マレイン酸（図１Ａ）を有しており、Ｒ１又はＲ２は、反分子と共有又は非共有相互作用を形成してもよい反応性置換基を有している。非共有性相互作用を形成する反応性置換基の例は、ビオチンであって、これは、ストレプトアビジンと安定的な相互作用を形成する。共有性相互作用を形成する反応性置換基の例はチオエステルである。この二機能性置換無水マレイン酸は、分子の、アミンを有する生物学的活性化合物への可逆的な結合を提供してもよい。低下したｐＨに曝露すると、この分子は、分解して、上記の生物学的化合物又は医薬品が再生する。この分子は、上記の化合物の標的化又は送達、この化合物の可逆的な不活化、又は他の目的の機能を促進する。好適なチオエステルを有するリンカーは、ＣＤＭ−チオエステルである。ＣＤＭ−チオエステルにて二つの分子をリンクすべく、ＣＤＭ−チオエステルの無水物は、アミンと反応され、その後、このチオエステルは、他の分子の適切なチオールと反応される。代替的に、この二機能性無水物は、同一の分子にともに存在するアミン及びチオールを架橋すべく使用されてもよい。

好適実施例において、アミンを、置換無水マレイン酸と反応することにより可逆的に改質する工程を述べている。例えば、エンドソーム又はライソソーム又は腫瘍領域など、低いｐＨにてインキュベートすることにより、上記の置換無水マレイン酸の分解及び上記のアミンの再生が加速する。アミンの改質は、アミンを有する分子の化学的及び物理的特性を変更してもよい。好適な置換無水マレイン酸は、無水マレイン酸二置換体である。

好適実施例において、生物学的活性化合物の活性を、ｉｎ ｖｉｖｏにおける腫瘍の近傍の領域へと標的化する工程について述べており：上記化合物を、置換無水マレイン酸にて改質することにより可逆的に不活化し、且つ、改質されたこの化合物を動物へと注入することを有している。酸性の腫瘍の領域において、上記の改質の回復は加速され、上記の活性化合物が再生する。もし、この化合物がアミンを有している場合、この化合物自体は、不活化されてもよい。代替的に、この化合物は、ＴＡＴ−ＣＤＭ−チオエステルなどの、可逆的に不活化された標的分子に結合されてもよい。ＴＡＴは、細胞透過性ペプチドである。他の例において、非腫瘍細胞への関連付けは、ＣＤＭ−ＰＥＧなどの置換無水マレイン酸での改質により阻害される。

好適実施例において、アミンの電荷を可逆的に変更する方法について述べており：このアミンを、置換無水マレイン酸と反応することにより改質することを有している。この置換無水マレイン酸は、限定しないが、ＣＤＭなどの酸性機能性置換基を有していてもよく、この陽イオン電荷を有するアミンを、陰イオンの電荷を有するカルボキシルへと可逆的に変換することを可能としている。このアミンは、ポリアミンに存在していてもよい。この方式において、ポリアミンは、部分的又は完全に改質されてもよく、電荷の中和又は回復の幅広い範囲を可能としている。上記のアミンの、陰イオンの電荷を有する無水物の改質の分解による再生は、ｐＨ＜７にて加速される。

（詳細な記述）
アミンを有する化合物を可逆的に改質するのに有用な無水マレイン酸誘導体について述べている。また、生物学的活性化合物の可逆的不活化、架橋、又はその他の改質する方法についても述べている。上述の分子及び方法は、その他の可逆的改質方法に対して、幾つかの有意な進歩を与えている。第１に、ジスルフィド含有架橋剤などの多くの可逆的試薬とは異なり、この無水マレイン酸誘導体の分解は、改質されていない当初のアミンを再生する。第２に、緩徐に酸性の生理的条件において、上述の無水物は、非常に急速に分解され；分解される他の不安定結合に必要な数時間又は数日などと比べて、数分で分解される。それにもかかわらず、本願の方法を用いると、アミン含有化合物の改質は、直接的で容易である。さらに、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏでのこの改質の回復は、本質的に一方向である。この特徴は、この改質が、膜活性化合物を可逆的に阻害するのに使用される際、特に有用である。一度、この改質が分解されると、上記の膜活性化合物は、局所のｐＨが酸性でない場合であっても、活性を保持している。逆に、陽イオン性脂質などの膜を活性化及び崩壊すべくプロトン化に依拠する多くの化合物は、ｐＨが上昇しても、潜在的に不活化される。

無水物は、無水マレイン酸に関して、図２に示した一級アミンと共有結合を形成している。無水コハク酸（図１Ｂ）に関して、得られる共有結合は、安定であり、生理的条件では可逆的でない。無水マレイン酸（図１Ａ）に関して、得られる共有結合は、生理的条件下で分解され得る。このアミド結合の不安定性は、無水マレイン酸の不飽和の炭素−炭素結合の置換度合いにより直接影響を受ける［Ｋｉｒｂｙ及びＬａｎｃａｓｔｅｒ、１９７２年；Ｎｉｅｔｏ及びＰａｌａｃｉａｎ、１９８３年］。親の無水物、無水マレイン酸は、置換されておらず、最も安定なマレアミック酸（ｍａｌｅａｍｉｃ ａｃｉｄ）を形成している。シトラコン酸及びｃｉｓ−アコニット酸由来マレアミック酸は、それぞれ一つの置換を有しており、ｐＨにより、より不安定性を有している。ジメチル無水マレイン酸二置換体に由来するマレアミック酸は、最もｐＨに不安定である。

上記無水物の反応性置換基に付加的な機能を追加する無水マレイン酸誘導体について述べている。例えば、無水マレイン酸二置換体は、Ｒ１又はＲ２が、チオエステル反応性置換基を有し、これにより、カップリング試薬又は架橋剤として使用されてもよい二機能分子（ＣＤＭ−チオエステル）を形成する。この分子において、Ｒ１又はＲ２のカルボキシル基は、チオエステルとして前活性化される。このチオエステルは、Ｎ末端のシステイン又は、生の化学的ライゲーションと呼ばれる工程においてアミド結合を形成すべく、２つから３つの結合にて、アミンとリンクされる他のチオールと反応してもよい。このチオエステルの安定性は、アミン及びチオエステルと反応することなくマレアミック酸置換基を形成すべく、化合物におけるアミンと、ＣＤＭ−チオエステルの無水物と反応することを可能とする。このチオエステルは、その後、Ｎ末端のシステイン基又は、第二の化合物の適当なその他のチオールと反応することが可能となる。

無水マレイン酸誘導体を用いて、膜活性化合物を生物学的活性化合物とリンクするカップリング技術を開発した。膜活性化合物の生物学的活性化合物へのカップリングは、特定の生物学的活性化合物の細胞、特にｉｎ ｖｉｖｏの細胞への送達に有益である。上記の膜活性化合物の他の分子へのカップリングに加えて、この工程は、上記の膜活性化合物の活性を可逆的に阻害してもよく、従って、毒性が軽減される。同様の様式において、生物学的活性化合物と膜活性化合物との両方を、例えば、ポリマーなどの第３の分子へと結合することも可能である。この両化合物は、ＣＤＭ−チオエステルの酸に不安定なマレアミック基を介して結合される。このチオエステルは、生の化学的ライゲーションを介してシステイン含有ポリマーへとカップルされてもよい。同様の技術は、生物学的活性化合物の標的置換基又はその他の所望する化合物への結合へ適用されてもよい。

その他の機能性置換基は、Ｒ１又はＲ２のいずれかの一つの上記無水物へと結合されてもよいことを想定されていてもよい。上記の無水物のアミンへのカップリングを阻害することなく、他の分子への共有的又は非共有的相互作用を可能とする種々の置換基を使用してもよい。

（定義）
（機能性置換基）
機能性置換基は、細胞標的化シグナル、核局在化シグナル、エンドソーム又はその他の細胞内ベシクルの内容物の放出を促進する化合物（放出シグナル）、細胞透過性化合物及びその他の、化合物又は複合体の挙動又は相互作用を変化させる化合物を含む。機能性置換基は、反応性置換基、他の分子又は種々の他のＲ置換基との非共有性相互作用を提供する分子を含んでもよい。

（細胞標的化シグナル）
細胞標的化シグナルは、生物学的活性化合物の細胞への関連付けを促進する種々のシグナルである。これらシグナルは、薬物や核酸などの生物学的活性化合物を改質可能であり、且つ、これらを細胞の位置（例えば、組織）又は、培養又は個体全体における細胞内の位置（例えば核）などへ方向付けてもよい。このシグナルは、化合物の細胞表面への結合性及び／又は細胞内画分の関連付けを増加してもよい。外来遺伝子の細胞内又は組織配置の改質により、生物学的活性化合物の機能を促進してもよい。細胞標的化シグナルは、限定しないが、タンパク質、ペプチド、脂質、ステロイド、糖、炭化水素、（非発現の）ポリ核酸又は合成化合物であってもよい。リガンドなどの細胞標的化は、受容体への細胞結合性を増加する。種々のリガンドは、薬物及び遺伝子を細胞又は特定の細胞性受容体へと標的化すべく使用されている。このリガンドは、細胞膜内、細胞膜上、又は細胞近傍の標的を検索してもよい。リガンドの受容体への結合は、典型的にエンドサイトーシスにより開始する。リガンドは、アシオログライコプロテイン又はガラクトース残基をもちいることにより、アシアログライコプロテイン受容体に標的化する試薬を含む。インスリン、ＥＧＦ又はトランスフェリンなどの他のタンパク質をこの標的化に用いてもよい。ＲＧＤ配列を有するペプチドは、種々の細胞の標的化に用いられてもよい。細胞上のチオール、スルフヒドリル又はジスルフィド基と反応する化学置換基は、種々のタイプの細胞を標的化すべく使用されてもよい。葉酸又はその他のビタミンは、標的化に使用されてもよい。他の標的化群は、脂質、脂肪酸、コレステロール、ダンシル化合物及びアムフォテリシン誘導体などの膜と相互作用する分子を含む。加えて、細胞を結合すべくウィルス性タンパク質を用いてもよい。

化合物又は複合体の細胞への相互作用の後、その他の標的化群は、生物学的活性化合物の、細胞の特定の部位への送達性を増加すべく使用されてもよい。

（核局在化シグナル）
核局在化シグナルは、細胞周期の中間状態において、医薬品を、核近傍及び／又は核へと移行する標的化を促進する。かかる核移行シグナルは、ＳＶ４０ラージＴ抗原ＮＬＳや、ヌクレオプラスミンＮＬＳなどのタンパク質又はペプチドであってもよい。これらの核局在化シグナルＮＬＳ受容体（カリオフェリンα）などの種々の核移行因子と相互作用し、その後、カリオフェリンβと相互作用する。この核移行タンパク質は、それ自体、ＮＬＳとして機能する。なぜなら、これらは、核孔又は核へと標的化されているからである。例えば、カリオフェリンβ自体は、ＤＮＡを核孔複合体へと標的化可能である。種々のペプチドは、上記のＳＶ４０Ｔ抗原に由来している。その他のＮＬＳペプチドは、ｈｎＲＮＰ Ａ１タンパク質、ヌクレオプラスミン、ｃ−ｍｙｃなどに由来している。多くの生物学的活性化合物、特に、多くの電荷を有する化合物は、生物学的膜と架橋することができない。これら化合物を細胞へと導入すべく、細胞は、エンドサイトーシスにより取り込まなければならず、つまり、エンドソームへと取り込まなければならず、或いは、化合物の架橋を可能とすべく、細胞膜を破壊しなければならない。エンドソームによる導入の場合、エンドソームの膜は、エンドソームの外側へと動き且つ、細胞質へと動くことを可能とすべく崩壊されなければならない。細胞への侵入経路は、細胞膜の破壊を要求する。膜構造の変化を可能とする化合物は、膜活性化合物と称する。構造におけるこの変化は、膜上の一つ以上の効果を誘導する化合物により示されてもよく、この効果は：低分子の透過性、ポアの形成、膜の融合及び／又は分裂を可能とする変更、大分子の透過性、膜の溶解若しくは崩壊又は膜位相の移行を可能とする変更からなる群から選択される。この変更は、赤血球の溶解（溶血）、リポソームの漏出、リポソームの融合、細胞融合、細胞溶解及びエンドソームによる放出からなる群から選択された少なくとも一つのアッセイにおける化合物の活性により機能的に規定されてもよい。膜活性薬剤の例は、膜の活性が赤血球由来のヘムを放出（溶血）する能力により示される、蜂の毒ペプチドであるメリチン（ｍｅｌｌｉｔｉｎ）である。

さらに特に、膜活性化合物は、膜を通過すべく、５０原子の質量ユニット以上の分子量を有する分子の輸送を可能とする。この輸送は、膜構造の全体的な消失、膜構造におけるホール（又は孔）の形成、膜を介した分子の補助された輸送又は、脂質二重構造の際配置若しくは秩序破壊のいずれかにより達成されてもよい。加えて、リボソーム又は細胞膜間の輸送は、これら二つの膜の融合により達成されてもよく、従って、これら二つの膜の内容物が混合される。

これら膜活性化合物又は放出シグナルは、エンドソーム（早期又は後期）、ライソソーム、ファゴソーム、ベシクル、小胞体、ゴルジ体、トランスゴルジ網（ＴＧＮ）及び筋小胞体などの、細胞内小器官からエンドサイトーシスされた物質の放出を促進する。この放出に含まれるのは、細胞内画分から細胞質又は核などの他の小器官への移動である。放出シグナルは、クロロキン、バフィロマイシン又はブレフェルディンＡ１及びＥＲ保持シグナル（ＫＤＥＬ配列、配列番号３）などの化合物、インフルエンザウィルスのヘマグルティニンサブユニットＨＡ−２ペプチドなどのウィルス成分及び他のタイプの両親媒性ペプチドを含む。膜活性化合物が活性化される時及び場所の制御は、効果的な輸送に関して重大である。もし、膜活性薬剤が、特定の時間及び場所において制御的である場合、生物学的活性化合物の生物学的膜への輸送を促進するであろう。膜活性化合物が、誤ったタイミングで活性化しすぎ又は活性化する場合、輸送は起こらず、或いは、輸送は、細胞の破壊又は細胞死に関連づけられる。自然は、膜の融合及び毒性を有することなく活性が輸送を補助するように調節される膜活性化合物の使用を含む生物学的活性化合物の膜輸送を可能にする種々のストラテジーを進化させてきた。多くの脂質ベースの輸送処方は、膜融合に依拠し、幾つかの膜活性ペプチドの活性は、ｐＨにより制御される。特に、ウィルスのコート蛋白は、しばしば、ｐＨ感受性であり、中性又は塩基性ｐＨにて不活性であり、エンドソームに見出される酸性条件下にて活性である。

（膜活性ペプチド）
膜活性ペプチドは、ペプチドの膜活性化合物である。多くの天然由来の膜活性ペプチドがあり、これらには、限定されないが：セクロピン（ｃｅｃｒｏｐｉｎ）（昆虫）、マガイニン（ｍａｇａｉｎｉｎ）（ハチ）、ＣＰＦ１、ＰＧＬａ、ボンビニンＢＬＰ−１（これら全ては、両性類由来である）、セミナルプラスミン（ウシ）、インドリシジン、バクテネシン（これら二つは、ウシ好中球由来）、タキプレシン（カニ）、プロテグリン（ブタ白血球）、及びディフェンシン（ヒト、ウサギ、ウシ、カビ類及び植物由来）、グラミシディンＡ及びフラミシディンＣ（ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｂｉｓ）、ニシン（ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ由来のランティバイオティクス）、アンドロクトニン（サソリ）、カルディオトキシンＩ（コブラ）、サエリン（カエルであるｌｉｔｏｒｉａ ｓｐｌｅｎｄｉｄａ）及びダーマセプティン（カエル）及びこれらに類するペプチドを含む。ウィルス由来ペプチドもまた、膜活性を有することが示されており、限定しないが：ヘマグルティニンサブユニットＨＡ−２（インフルエンザ）、Ｅ１（セムリキ森林熱ウイルス）、Ｆ１（センダイ及びハシカウィルス）、ｇｐ４１（ＨＩＶ）、ｇｐ３２（ＳＩＶ）、ｖｐ１（ライノウィルス、ポリオウィルス及びコクサッキーウィルス）並びにこれらに類するものを含む。メリティンは、高度に細胞毒性を有し、且つ、溶血性膜活性ペプチドである、ハチ毒の２６残基のペプチド成分

（ミツバチペプチド配列、配列番号４）である。天然由来又は合成由来のこの配列の多重的な変異体もまた、膜活性を有している。加えて、合成ペプチドは、合成され、膜活性を有している。ロイシン及びリジンリッチな合成配列（ＫＬ又はＫＬｎモチーフ）は、膜活性を有することを示されている。特に、ＫＬ３と称されるペプチド

は、膜活性を有している。これらは、異なる膜活性ペプチドの全ての間でホモロジー又は構造的類似性を有していない。従って、これらは、それらの膜活性により規定される。

（膜活性ポリマー）
膜活性ポリマーは、膜活性を有するポリマーである。

（膜活性両親媒性物質）
膜活性両親媒性物質は、親水部分及び疎水部分を有する両親媒性の膜活性化合物である。かかる化合物の例は、ドデシルアミン及びドデシルサルフェートなどの界面活性剤又は洗剤が挙げられる。

（両親媒性化合物）
両親媒性化合物は、は、親水性を有しつつ、他方では疎水性を有する分子である。疎水性なる用語は、定性的な意味合いにおいて、その化学残基が水を排除する性質を有していることを示す。炭化水素は、疎水基である。親水性なる用語は、定性的な意味合いにおいて、その化学残基が水になじむ性質を有していることを示す。典型的に、かかる化学的置換基は、水溶性であり、水素結合や水のアクセプターである。親水性置換基の例は、以下の化学残基を有する化合物を含む：炭水化物、ポリオキシエチレン、オリゴヌクレオチド並びにアミン、アミド、アルコキシアミド、カルボン酸、イオウ又は水酸基を有する置換基である。

（細胞透過性化合物）
陽イオン性取り込み（ｉｍｐｏｒｔ）ペプチド（ペプチドトランスロケーションドメイン、メンブレントランスロケーションペプチド、アルギニンリッチモチーフ、細胞透過性ペプチド及びペプトイド分子トランスポーターなどとも称される）細胞透過性化合物は、生物学的膜を通過することが可能な化合物である。加えて、これらは、膜を横切って結合される分子の輸送が可能である。細胞透過性化合物は、膜活性化合物の別の形態である。典型的にアルギニン及びリジンリッチな陽イオン取り込みペプチドの例は、ＴＡＴ（配列番号１）、ＶＰ２２ペプチド及びＡＮＴｐペプチド（配列番号２）を含む。しかしながら、細胞透過性化合物は、厳密にはペプチドではない。アミン又はグラニジウム基がリッチな短く、ペプチドではないポリマーもまた、生物学的膜を移行する分子を運ぶことができる。膜活性ペプチドと同様に、陽イオン性取り込みペプチドは、厳密なアミノ酸配列に関する要求性よりも、その活性により規定される。

他の機能性置換基は、ポリエチレングリコールなどの化合物を有し、分子及びそれ自身並びに他の分子との相互作用を減少する。かかる置換基は、血清因子又は細胞と分子又は送達される複合体との間の相互作用を制限するのに有用である。

他の機能性置換基は、アルカリ鎖及びコレステロールやコレステロール誘導体などのその他の疎水性置換基を有する。これらの疎水性置換基は、膜に結合すべく、膜を破壊すべく、或いは、疎水的相互作用を提供すべく使用されてもよい。

（膜透過性分子）
膜透過性分子は、細胞膜二重層を通過することが可能な分子である。この二重層を介してこれら分子の移動は、さらなるタンパク質、化合物又は化学品を必要としない。事実、電荷を有し或いは高い極性の分子に対する細胞膜の不透過性の特徴ゆえ、細胞質に到達する必要のある多くの低分子薬物は、膜透過性である。薬物設計は、水溶性と膜透過性とで均衡を取る必要がある。しかしながら、特定の薬物、例えば、抗がん剤であるドキソルビシンに関して、特異的でない膜透過性は、標的化されていない細胞において負の非特異的効果をもたらす。係る薬物の膜透過特性を可逆的に不活化する能力は、毒性を軽減しつつ、薬物の効果を向上すべく使用されてもよい。

（反応性置換基）
反応性置換基は、他の置換基と共有結合を形成し得る置換基である。共有結合を形成する反応性得置換基は：イソチオシアネート、イソシアネート、アクリルアジド、酸ハライド、Ｏ−アシル尿素、Ｎ−ヒドロキシコハク酸エステル、サクシイミド、エステル、チオエステル、アミド、尿素、スルフォニルクロライド、アルデヒド、ケトン、エーテル、エポキシド、カーボネート、アルキルハライド、イミドエステル、カルボキシレート、アルキルフォスフェート、アリルハライド（例えば、ジフルオロジニトロベンゼン）及び無水物からなる群から選択されてもよい。

Ｒ置換基は、種々の置換基を有し、一つは、上記の無水マレイン酸に結合することが望ましい。Ｒ置換基は、ペプチド、タンパク質、抗原、ハプテン、ビオチン、核酸、アルキル基などからなる群から選択されてもよい。

（ＣＤＭ（２−プロピオニック−３−メチル無水マレイン酸））
ＣＤＭは、ジメチル無水マレイン酸二置換体のカルボン酸を有する誘導体である。ＣＤＭは、ジメチルオキソフルタレート及びトリエチル−２−フォスフォノプロイオネートとのＨｏｒｎｅｒ−Ｅｍｍｏｎｓ反応の後に、刊行済みの方法（図３）に従って、そのエステル基の鹸化を介して合成される［Ｎａｇａｎａｗａら、１９９４年］。カルボキシレートを有する置換基の添加により、電荷及びこの化合物の水溶性が増加する。ｃｉｓ−無水アコニット酸は、同様のカルボン酸基を有しているが、第二のＲの位置への二置換体を有していない。

（フォスフォロジアミデートモルフォリノオリゴヌクレオチド（ＰＭＯｓ））
ＰＭＯｓは、モルフォリノサブユニットから合成され、そのそれぞれは、６員環のモルフォリノ環に結合された一般的な塩基の一つを有している。このサブユニットは、非イオン性のフォスフォロジアミデート内部サブユニットリンケージにより結合される。ＰＭＯｓは、立体障害機構によりその効果を発揮し、且つ、標的のＲＮＡの翻訳又はスプライシングを阻害すべく使用されてもよい。ＰＥＧ及びデキストランと同様に、オリゴヌクレオチドは、流動相エンドサイトーシスにより吸収され、細胞膜を直接横切って拡散することができない。

（架橋）
架橋は、二機能性試薬（クロスリンカー）にて、二つ以上の分子を結合することを参照している。二機能性試薬は、二つの反応性末端を有する分子である。この反応性末端は、ホモ二機能性分子として同一であってもよく、或いは、ヘテロ二機能性分子として異なっていてもよい。この結合は、共有結合であってもよく、或いは、安定な非共有結合であってもよい。

（不安定結合）
不安定結合は、選択的に破断されることが可能な共有結合である。つまり、この不安定結合は、他の共有結合を切断することなく、他の共有結合の存在により切断されてもよい。例えば、ジスルフィド結合は、例えば、分子ないに存在する可能性のある炭素−炭素、炭素−酸素、炭素−イオウ、炭素−窒素結合など種々の他の結合、の分解なしに、チオールの存在にて切断されることが可能である。不安定性は、また、分解可能性を意味している。

（不安定リンケージ）
不安定リンケージは、不安定結合を有し、二つの他の置換基との間にリンク又はスペーサーを提供する化学的化合物である。リンクされるこの置換基は、生物学的活性化合物、膜活性化合物、膜活性を阻害する化合物、機能性反応性置換基、モノマー及び細胞標的化シグナルなどの化合物から選択されてもよい。上記のスペーサーグループは、化学残基を有していてもよく、この残基は、アルカン、アルケン、エステル、エーテル、グリセロール、アミド、糖類、多糖類及び酸素やイオウや窒素などのヘテロ原子からなる群から選択された残基であってもよい。上記のスペーサーは、電気的に中性であってもよく、正又は負の電荷を露出していてもよく、或いは、全体的に中性、正又は負の電荷を有しつつ、正及び負の電荷を露出していてもよい。

（ｐＨ不安定性）
ｐＨ不安定性は、酸性条件下（ｐＨ＜７）にて、共有結合が選択的に切断されることを参照している。つまり、このｐＨ不安定結合は、他の共有結合を切断することなく、酸性条件下にて切断されてもよい。ｐＨ不安定性なる用語は、ｐＨに不安定、ｐＨに非常に不安定、及びｐＨに極端に不安定なリンケージ及び結合の両方を含んでいる。

ｐＨ不安定結合のサブセットは、非常のｐＨに不安定である。本発明の目的に関して、ｐＨ５での切断に関する半減期が４５分未満である場合、この結合は非常にｐＨに不安定であると考慮される。

ｐＨ不安定結合のサブセットは、極度にｐＨに不安定である。本発明の目的に関して、ｐＨ５での切断に関する半減期が１５分未満である場合、この結合は極端にｐＨに不安定であると考慮される。

改質と呼ばれる工程を介して改質を形成すべく、もし、この二つが、共有結合で結合されている場合、二番目の分子により分子は改質される。つまり、この二つの分子は、一つの分子における原子と二番目の分子における原子との間で共有結合をし、その結果、新しい単一の分子を形成する。化学的共有結合は、電子密度を共有する二つの原子間での相互作用的な結合である。

（生の化学的ライゲーション）
生の化学的ライゲーションは、化合物のチオエステルのカルボキシレートとアミンｔの間でアミド結合を形成することであって、例えば、末端のシステインのように、アミンから２又は３個の原子を隔ててチオールをも有している。

（電荷、極性及びサイン（ｓｉｇｎ））
化合物の電荷、極性及びサインは、化合物が一つ以上の電子を消失しているかどうか（正電荷、正極性、正のサイン）或いは、一つ以上の電子を獲得しているかどうか（負電荷、負極性、負のサイン）を参照している。

（例）
１． ２−カルボキシエチル−３−メチル無水マレイン酸（ＣＤＭ−チオエステル）の合成
ＣＤＭ無水物（１００ｍｇ）を１０ｍＬの塩化メチレンに溶解した。この溶液に２ｍＬの塩化オキサリルを加えた。一昼夜撹拌した後、過剰の塩化オキサリルは、ロータリーエバポレーションにより除去され、澄明な油状物質を得た。ＣＤＭの酸塩化物は、その後、１０ｍＬの塩化メチレンに溶解した。この溶液に、２００ｍｇのメルカプト酢酸及び１００μＬのジイソプロピルエミルアミンを加えた。この溶液を１時間撹拌し、ロータリーエバポレーションにより溶媒を除去した。得た油状物質を、高い真空条件下（０．２ｔｏｒｒ）に３時間載置し、過剰のメルカプト酢酸及びジイソプロピルエチルアミンを除去した。得た産物は、水：アセトニトリル９：１の溶液に溶解し、Ｃ１８逆相カラムにて、水アセトニトリル９：１に０．１％のトリフルオロ酢酸を加えた溶離的にて、アセトニトリル（０．１％トリフルオロ酢酸溶液）にて溶出するＨＰＬＣにより精製した。

２． 無水マレイン酸二置換体の改質によるポリアミンの荷電反転
環状無水物を、ポリアミンポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）にて反応した。２００μｇのＰＬＬ、２ｍｇのＨＥＰＥＰＳ及び０．４ｍｇのＮａＯＨを含有する１００μＬの水に、に０．４ｍｇＣＤＭ含有又はジメチル無水マレイン酸（アルドリッチ社）含有５０μＬエタノールに加え、急速に撹拌した。ｃｉｃ−無水アコニット酸（アルドリッチ社）に関しては、１ｍｇの無水物、５ｍｇのＨＥＰＥＳ及び１ｍｇＮａＯＨを使用した。同様に、ＰＬＬは、二つの無水コハク酸又は無水シトラコン酸の等量に反応した。ＰＬＬと無水物との反応の後、トリニトロベンゼンスルフォン酸（ＴＮＢＳ）アッセイを行ったところ、ＰＬＬのεアミンは、カルボキシレートに完全に変換していた。これらポリアミンの電荷密度は、その後、陽イオン性の蛍光標識のＰＬＬの凝集能力を検討することにより同定された。中性ｐＨにおいて、サクシニル化されたＰＬＬの一つの機能性等量は、ＰＬＬの凝集に必要である。同様に、シトラコニル化されたＰＬＬの１等量及びｃｉｓ−アコニチン化されたＰＬＬの０．５等量（これは、反復単位当たり、二つのカルボン酸基を有している）は、ＰＬＬを凝集に必要である。逆に、ジメチル無水マレイン酸により改質されたＰＬＬは、１０等量を加えた場合であっても、ＰＬＬの凝集することは出来ない。同様に、ＣＤＭ改質ＰＬＬの電荷密度は、二つのカルボン酸当たり一つの電荷である。無水物の離れたカルボン酸は、改質されたポリマーに電荷を加える一方、無水物のカルボン酸は、ポリアニオンに対して電荷的に貢献しないようである。

３． グリシンアラニンジペプチドのアシル化及び分解速度論
マレアメート（ｍａｌｅａｍａｔｅ）の酸触媒分解率は、グリシンアラニンジペプチドを用いた評価した。ＣＤＭ及びジメチルマレアミド改質されたグリシンアラニン（ＧＡ）は、４００μｇＣＤＭ又はジメチル無水マレイン酸含有２０μＬエタノールを、２００μｇＧＡ、２．４ｍｇＨＥＰＥＳ含有４４μＬ溶液に加えることにより合成した。この改質ペプチドをｐＨ５の溶液に加えることにより分解を進行させた。種々の時間において、１０μｇのアリコートを除去し、０．５ｍＬの０．４ｍＭＴＮＢＳ（ｐＨ９）含有１００ｍＭ炭酸水素ナトリウム溶液（ｐＨ９）に加えた。マレアミド酸二置換体は、マレアミド酸一置換体は、よりも急速に分解した。時間の関数として、ｌｎ［１−（Ａｔ／Ａ０）］のプロットは、直線に回帰し、その傾きは、−ｋであり、これは、分解反応の反応定数であって、ここで、Ａｔは、時間ｔにおける吸光度であり、Ａ０は、改質されていないＧＡの吸光度である。ジメチルマレアミド酸及びＣＤＭ改質グリシンアラニンの分解に関する定数は、それぞれ、０．４／分（ｔ_１／２＝１．５分）及び０．３／分（ｔ_１／２＝２分）であった。ｃｉｓ−アコニット酸改質の回復に関する同様の分析で明らかになったのは、およその半減期が３００分（５時間）という非常に緩徐な分解速度であったということである。

４． 無水マレイン酸二置換体の改質による膜活性ペプチドの可逆的不活化
ミツバチ由来のメリチン（配列番号４）を、ｐＨ７．５にて、４つのリジン残基に対して２モル等量のサクシニル酸、ｃｉｓ−アコニット酸、ジメチルマレイン酸、シトラコン酸及びＣＤＭ無水物にてアシル化した。２００μｇメリチン、５００μｇＨＥＰＥＳ及び１００μｇＮａＯＨ含有２０μＬ水の溶液に、０．１μｇＣＤＭ又はジメチル無水マレイン酸含有５０μＬエタノール溶液を加え、急速にボルテックスした。ｃｉｓ−無水アコニチン酸に関しては、２５０μｇの無水物、１．２５ｍｇのＨＥＰＥＳ及び２５０ｍｇのＮａＯＨを使用した。ＴＮＢＳによるアミン含量の測定により明らかになったのは、これら無水物の全てにより、メリチンのアシル化が完全に起きていたということである。

この改質ペプチドの膜活性は、赤血球（ＲＢＣ）溶血アッセイを用いて測定した。ブタの全血をヘパリン含有容器に採取した。ＲＢＣは、２，５００ｒｐｍ、５分遠心分離して分離させ、１００ｍＭのリン酸緩衝液にて３回洗浄した。２０μＬの洗浄されたＲＢＣ懸濁液を、５００μＬのリン酸緩衝液に加えた。この溶に、種々の量のペプチドを加え、このサンプルを３７℃、１．５時間インキュベートした。その後、サンプルを１４，０００ｒｐｍ、１分間遠心分離した。ＲＢＣの溶血は、上清における５４１ｎｍの吸光度を測定することにより同定した。ジメチル無水マレイン酸を除くこれら全ての無水物による改質は、膜活性の完全な消失をもたらした。

ＣＤＭ又はｃｉｓ−無水アコニット酸のいずれかにより改質されたメリチンを、ｐＨ５にてインキュベートした。種々の時間において、ｐＨ７．５の緩衝液を添加することによりｐＨを上昇させ、各サンプルの溶血活性を測定した。ＣＤＭメリチンに関する膜活性は、２５分以内に１００％に回復した。活性の回復に関する速度論（ｌｎ［１−（Ａｔ／Ａ０）］にてプロット）により、０．０７／分（ｔ_１／２＝１０分）の定数を得た。ｃｉｓ−アコニチル化されたメリチンをｐＨ５にて２７時間インキュベートすることにより、３０％のみの活性の回復が見られた。この分解速度論解析により、０．０１５／時間（ｔ_１／２＝４７時間）の定数を得た。これらの結果が示すのは、ＣＤＭは、膜活性ペプチドの活性を阻害可能である、ということである。さらに、この阻害は、生理的なｐＨにより、経時的に回復し、エンドサイトーシスを介した物質の細胞への送達が可能となる。

６． エンドサイトーシス画分からの蛍光ポリエチレングリコールのＣＤＭ−メリチン媒介放出
ガラス製カバーストリップ上にて培養したＨｅＬａ細胞を、３７℃、１０分間、４００μｇ／ｍＬ改質メリチン含有／不含の１ｍＬＤＭＥＭ中で、１ｍｇ／ｍＬのＰＥＧ３０００を用いてインキュベートした。この後、細胞を洗浄し、１０％ウシ血清含有ＤＭＥＭ中にて、３７℃、３５分間インキュベートした。その後、細胞を、ＰＢＳ（シグマ社）にて３回洗浄し、４℃、４％ホルムアルデヒド（シグマ社）含有ＰＢＳにて３０分間固定し、ＰＢＳにて３回洗浄した。その後、カバーストリップを、蛍光顕微鏡のガラススライド上に載置した。このサンプルの画像は、Ｚｅｉｓｓ社製ＬＳＭ５１０共焦点顕微鏡にて取得した（Ｚｅｉｓｓ、ドイツ）。ＣＤＭ−メリチンを有していない場合、蛍光−ＰＥＧは、破裂した様相を呈し、これは、エンドソーム及び／又はライソソームの局在を示す。逆に、ＣＤＭ−メリチンを含有する場合には、蛍光は、細胞全体に観察され、このことは、エンドソーム／ライソソームから蛍光−ＰＥＧが放出されたことを示している。ｃｉｓ−アコニット酸改質メリチンと共インキュベートすると、コントロールとして蛍光−ＰＥＧ単独と比較できない破裂した蛍光が得られた。同様の結果は、蛍光標識１０ｋＤａデキストランをマーカー分子として用いた場合にも観察された。加えて、エンドソームの酸性化の阻害剤であるバフィロマイシンは、蛍光−ＰＥＧの放出を阻害した。

細胞を４００μｇ／ｍＬのＣＤＭ−メリチンにて１０分間インキュベートすると、視覚的に明らかな細胞毒性効果は観察されなかった。逆に、１０μｇ／ｍＬの改質されていないメリチンは、１０分未満で、細胞を完全に破壊した。加えて、細胞毒性をより高感度で指示するべく、プロピオジウムヨーダイド染色を使用した。細胞をＣＤＭ−メリチンにて１０分間曝露すると、〜１％の細胞のみがプロピオジウムヨーダイドにて核染色され、これはコントロールサンプルと同様であった。従って、ＣＤＭ−メリチンは、エンドソームによる放出を可能とする一方、細胞毒性を実質的に軽減した。

７． ＣＤＭ−改質膜活性ペプチドによる、オリゴヌクレオチドの細胞質／核送達
ＨｅＬａ−ＬＵＣ／７０５細胞は、安定に一体化された、スプライシングサイトが欠失した変異ルシフェラーゼ遺伝子を保持している（Ｇｅｎｅ−Ｔｏｏｌｓ、Ｐｈｉｌｏｍａｔｈ、ＯＲ）。この変異スプライシングサイトは、トランケートされた不活性なルシフェラーゼ蛋白をコードするｍＲＮＡを産生する。適切なフォスフォロジアミデートモルフォリノオリゴヌクレオチド（ＰＭＯ、

配列番号６）の存在は、このスプライシングサイトをブロックし、正常なスプライシング及び全長の活性な酵素の発現をもたらす。従って、この細胞株におけるルシフェラーゼ活性は、細胞質／核に存在する（エンドソーム画分から放出された）ＰＭＯの量に直接比例する。

ＨｅＬａ−ＬＵＣ細胞は、２．５μＭのＰＭＯ±ＣＤＭ−メリチン、シトラコン酸−メリチン又はアコニチン酸−メリチンにてインキュベートした。細胞は、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター内で４時間インキュベートした。その後、培地を１０％仔牛血清含有ＤＭＥＭに置換し、さらに４８時間培養した。この細胞を採取し、そのライゼートは、Ｌｕｍａｔ ＬＢ９５０７ルミノメーター（ＥＧ＆Ｇ Ｂｅｒｈｏｌｄ、Ｂａｄ−Ｗｉｌｄｂａｄ、ドイツ）を用いてルシフェラーゼ発現を検討された。ＰＭＯとＣＤＭ−メリチンとの共インキュベートにより、ＰＭＯ単独のインキュベートによるよりも、ルシフェラーゼ発現が５〜１２倍に増加した。ｃｉｓ−アコニチン酸改質メリチン及びシトラコン酸改質メリチンのいずれでも、ルシフェラーゼ活性／ＰＭＯ送達のいずれも増加しなかった。

これらデーターが示すのは、ｃｉｓ−アコニチン酸改質メリチン及びシトラコン酸改質メリチンではなく、ＣＤＭ−メリチンは、オリゴヌクレオチドの細胞への送達を経時的に可能にする、ということである。

８． オリゴヌクレオチドのポリマーへの可逆的結合
ｉｎ ｖｉｖｏにて、生物学的活性物質を細胞へと送達するために、可逆的に改質された膜活性化合物は、送達される分子に複合化されなければならない。ＰＭＯをＣＤＭ改質メリチンにて結合すべく、アミド結合を形成すべくチオエステル及びＮ−末端システイン基を反応する生の化学的ライゲーションに基づくカップリング技術を開発した。この工程の有益性は、アミドへと変換される（ＣＤＭの）酸が、チオエステルとして前活性化されてもよいということである。このチオエステル自体、Ｎ−ヒドロキシサクシニミヂルエステルなどの活性化エステルと比較して相対的に安定であるが、Ｎ−末端システイン基と急速且つ選択的にカップルする。この反応混合物は、他のアミン及び他のチオールを含有していてもよいが、安定なアミドを形成すべく、アミノ末端システインのみがカップルする（アミンの２〜３の結合のうちのチオール）。

このチオエステルの安定性は、アミンとチオエステルとを反応することなく、マレアミド酸基を形成すべく、ＰＭＯにおけるアミンにて、ＣＤＭ−チオエステルの無水物と反応することが可能である。得たチオエステルは、その後、アミノ末端のシステイン基と反応することが可能となり、ポリエチレンイミンなどのポリカチオンに存在する（ＰＥＩ−Ｃｙｓ）。この方式において、酸不安定性マレアミド基を介したＰＭＯのポリカチオンの結合が可能となる。ＰＭＯのＰＥＩ−Ｃｙｓへの結合の後、ＣＤＭ−チオエステル改質メリチンは、ＰＥＩ−Ｃｙｓ、ＰＭＯ及びＣＤＭ改質メリチンを有する単一分子複合体を形成すべく、ＰＥＩ−Ｃｙｓ−ＰＭＯコンジュゲートへと結合される。

システイン改質ポリエチレンイミンを合成するため、Ｎα−Ｆｍｏｃ−Ｓ−ｔｅｒｔ−ブチルチオ−Ｌ−システイン（２０ｍｇ）を５ｍＬのアセトニトリルに溶解した。この溶液にジシクロヘキシルカルボジイミド（１０ｍｇ）及びＮ−ヒドロキシサクフィニイミド（５ｍｇ）を加えた。一昼夜、サクシニミジルエステルを形成させた。その後、反応されたジシクロヘキシルウレアをフィルタリングし、エステルは、ポリエチレンイミン（２０ｍｇ）含有１０ｍＬエタノール溶液に加えられた。１０分後、この誘導体化されたポリマーは、４５ｍＬのジエチルエーテルにて沈殿された。その後、このポリマーは、２ｍＬのピペリジンに溶解され、ＦＭＯＣ基を除去した。このポリマーを再び、ジエチルエーテルにて沈殿させた。改質されたポリマーは、２ｍＬの水に溶解し、塩酸を加えてｐＨ４に調節した。

（オリゴヌクレオチド−ポリカチオン複合体送達アッセイ）
０．５ｍモルのアミン改質ＰＭＯ（配列番号６、Ｇｅｎｅ Ｔｏｏｌｓ、Ｐｈｉｌｏｍａｔｈ、ＯＲ）を、１ｎモルＣＤＭ−チオエステル含有５００ｍｇＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．９）と反応した。改質されたＰＭＯは、その後、１０μｇ／ｍＬＰＥＩ−Ｃｙｓ、１ｍＭジチオスレイトール及び５ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．５含有５０μＬ溶液に加えられた。メリチンは、３重量等量ＨＥＰＥＳ塩基存在下０．５重量等量のＣＤＭチオエステルと反応することにより改質された。１時間のコンジュゲーションの後、ＣＤＭ−チオエステル改質メリチンは、ＰＥＩ−Ｃｙｓ−ＰＭＯ複合体に加え、最終濃度を８０μｇ／ｍＬメリチンとした。同様の条件を、シトラコン酸−メリチン又はアコニチン酸−メリチンのＰＥＩ−Ｃｙｓ−ＰＭＯへの結合に利用した。

ＨｅＬａ Ｌｕｃ／７０５細胞は、ＨｅＬａ細胞に用いた同様の条件にて培養した。細胞を、３×１０^６細胞／ウェルの密度にて、２４穴培養ディッシュに載置し、２４時間インキュベートした。培地を０．５ｍＬＤＭＥＭに変え、ＰＭＯ複合体を加えた。細胞を、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターにて、４時間インキュベートした。その後、培地を１０％仔牛血清含有ＤＭＥＭに変えた。その後、細胞をさらに４８時間インキュベートした。その後、細胞を採取し、そのライゼートに関してルシフェラーゼ発現を測定した。

ＰＥＩ−Ｃｙｓ−ＰＭＯ−ＣＤＭ−メリチン負荷は、ＰＭＯの送達に効果的であったが、ＰＥＩ−シトラコン酸−メリチン及びＰＥＩ−Ｃｙｓ−ＰＭＯ−アコニチン酸−メリチンでは効果的でなかった。

９． 細胞透過性化合物の可逆的阻害
陽イオン性取り込みペプチドであるシステイン−ＴＡＴ（ＣＧＲＫＫＫＲＱＲＲＲ、配列番号７）を、蛍光テキサスレッドにて標識した。この改質は、このペプチドの取り込み特性に影響を与えず、且つ、内在化に関して視覚的アッセイを提供する。１ｍｇシステイン改質ＴＡＴ（配列番号７）（１０ｍｇ／ｍＬ）及び１０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．５の溶液に、０．２ｍｇのテキサスレッドＣ５ブロモアセタミド（モレキュラープローブ）含有５００μＬエタノール溶液に加えた。室温にて一昼夜反応した後、スピードエバポレーションにより、エタノールを除去し、標識ペプチドを得た。

この標識ペプチドは、その後、無水マレイン酸二置換体、ジメチルマレイン酸及びＣＤＭにてアシル化された。ＴＡＴ−テキサスレッド（５０μｇ、１０ｍｇ／ｍＬ）を、１００ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．９の存在下、ジメチルマレイン酸又はＣＤＭ無水物を添加することにより改質した。

ＴＡＴ媒介送達を分析するため、ＨｅＬａ細胞を、ウェル当たり５０，０００〜１００，０００個の密度にて、ガラスカバーストリップを有する６穴プレートに載置した。２４〜２８時間後、細胞が４０〜７５％のコンフレントに達した際、培地を吸引し、１．０ｍＬのＤＭＥＭに置き換え、４℃にて前冷却又は３７℃にて前加熱した。その後、ＴＡＴコンジュゲートを加え、細胞を４℃又は３７℃にてインキュベートした。４℃において、エンドサイトーシスは完全に阻止され、このＴＡＴコンジュゲートは、原形質膜を直接介してのみ細胞に侵入した。３７℃では、エンドサイトーシス内在化も可能である。一定の温度にて１〜２時間インキュベートした後、細胞をＰＢＳにて３回洗浄し、４％ホルムアルデヒド含有ＰＢＳで、４℃、３０分間固定し、再びＰＢＳにて３回洗浄した。その後、カバーストリップをスライド上に載置し、Ｚｅｉｓｓ社ＬＳＭ５１０、共焦点顕微鏡にて観察した。蛍光標識コンジュゲートに関して、励起のために、４８８ｎｍの波長のアルゴンレーザーを使用し、且つ、検出のため、長い通路の５０５フィルターを使用した。ローダミン又はテキサスレッドコンジュゲートに関しては、励起のため、５４３ｎｍのＨｅＮｅレーザーを使用し、検出のため、長い通路の５８５フィルターを使用した。

４℃にて改質ペプチドを細胞に加えることにより、ペプチドの移行は起こらなかった。この改質されていないペプチドは、これらの条件下、極度な細胞内局在化を示した。３７℃にシフトすると、ジメチルマレアマート改質ＴＡＴは、その活性を回復し、その一方、ＣＤＭ改質ペプチドは回復しなかった。推定すると、ジメチルマレアマート改質ＴＡＴは、３７℃において、エンドソームの酸性環境下にて内在化される。一度、酸性環境化に載置されると、無水物は分解され、ＴＡＴペプチドの活性が回復する。逆に、ＣＤＭ改質ＴＡＴは、３７℃において、有意にエンドサイトーシスされず、従って、酸性環境を経験しない。従って、移行活性の回復能力は、酸性環境化へのエンドサイトーシスに依存するようであり、且つ、ジメチルマレアマート基の分解は、この活性ＴＡＴペプチドの再生に依存するようである。

１０． ＣＤＭを用いたＰＥＧの可逆的結合
ＣＤＭ及びＣＤＭ−チオエステルの簡便な合成を示す。ＣＤＭ及びその誘導体の合成に関する簡便性は、他の酸分解性材料を簡便に製造することを可能とする。特に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、ＣＤＭの酸塩化物を介して、ＣＤＭにコンジュゲートされてもよい。２−プロピオニック−３−メチル無水マレイン酸（３０ｍｇ、０．１６ｍモル）含有５ｍＬ塩化メチレン溶液に、塩化オキサリル（２００ｍｇ、１０等量）及びジメチルホルムアミド（１μＬ）を加えた。一昼夜反応させ、過剰量の塩化オキサリル及び塩化メチレンを、ロータリーエバポレーターにより除去し、酸塩化物である澄明な油状物質を得た。この酸塩化物を、１ｍＬの塩化メチレンに溶解した。この溶液に、平均分子量５，０００のポリエチレングリコールモノメチルエーテル（８１５ｍｇ、１等量）及びピリジン（２０μＬ、１．５等量）含有１０ｍＬ塩化メチレン溶液に加えた。その後、この溶液を一昼夜撹拌した。その後、溶媒を除去し、得た固形物を８．１５ｍＬの水に溶解した。一方、Ｇａｒｍａｎ及びＫａｌｉｎｄｊｉａｎは、ＰＥＧ含有無水マレイン酸を、２−ブロモメチル−３−メチル無水マレイン酸を用いて合成した［Ｇａｒｍａｎ及びＫａｌｉｎｄｊｉａｎ、２０００年］。この合成を再現すべく試みたが不成功に終わり、この中間体は、「高収率及び高品質にて調製することは困難である」と報告した［Ｇｒｅｅｎｗａｌｄら、２０００年］。合成における困難性は、酸分解性ＰＥＧ誘導体の合成に対するＣＤＭの貢献度が重要であるものとしている。Ｃｙ３Ｌａｂｅｌ ＩＴ標識プラスミッドＤＮＡは、１．２倍の過剰電荷を有するポリ−Ｌ−リジン（分子量５２，０００）を有する粒子へとコンパクトにされた。その後、この粒子は、非反応性ポリエチレングリコール（分子量５０００）又はアミン反応性ＣＤＭ−ＰＥＧにて、ポリ−Ｌ−リジンのアミンに対して０．５モル等量にて反応された。５０μｇのＤＮＡを含有する粒子は、２０ｇ以下のオスＩＣＲマウスの尾静脈から注射された。１時間後、採血し、Ｃｙ３蛍光物が血液循環中に存在することが確認された。その後、このマウスを屠殺し、肝臓、肺、腎臓及び脾臓を採取し、凍結切片作成のため、凍結し、得たスライスは、Ｃｙ３蛍光物に関して検討された。見出されたのは、ＰＥＧ−ＣＤＭ改質は、非改質ＰＬＬ−ＤＮＡ粒子に対して、循環時間を劇的に増加させたということである。非反応性ポリエチレングリコールにて処置された蛍光粒子にて注射された動物は、１時間目において、血液循環中に蛍光物が見出されず、極小量の蛍光物が、肝臓、腎臓又は脾臓に見出され、大部分の蛍光物が肺に残存していることが見出された。ＣＤＭ−ＰＥＧにて処置された蛍光粒子を注射された動物では、非常に高いレベルの蛍光物が、１時間目において、血液循環中に見出され、肝臓、腎臓及び脾臓に拡散した高レベルの蛍光物が見出されたが、肺にはほとんど見出されなかった。

１１． 抗がん剤であるドキソルビシンの可逆的改質
ドキソルビシン（Ｄｏｘ）含有５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．９の溶液に、３等量のＣＤＭアダクト（例えば、ＣＤＭ又はＰＥＧ−ＣＤＭなどのＣＤＭポリマーコンジュゲート）を加えた。改質されたＤＯＸは、その後、組織培養中の細胞に加えられ、或いは、ｉｎ ｖｉｖｏに注入された。

１２．標的化送達のための、膜透過性ペプチドの可逆的阻害
ストレプトアビジンは、６モル等量のサクシニミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート（Ｐｉｅｒｃｅ社製のＳＭＣＣ）の反応によりマレイミド基にて反応された。肝臓標的化ペプチドである

（配列番号８）は、上記のマレイミド基による反応により、ストレプトアビジンにコンジュゲートされた。１８個のアミノ酸／デキストランを有する分子量７０，０００のアミノデキストラン（モレキュラープローブ）を、５モル等量のＣｙ３ＮＨＳエステル（アマシャム社製）と反応した。このＣｙ３標識デキストランは、その後、５等量のＮＨＳ活性化ビオチンと反応した。その後、Ｃｙ３及びビオチン標識デキストランは、２０モル等量のＳＭＣＣと反応した。Ｃｙ３／ビオチン／ＳＭＣＣ改質デキストランは、セファデックスＧ２５を用いたサイズ排除クロマトグラフィーにより単離した。Ｃｙｓ−ＴＡＴ蛋白（上述にて調製済み）は、その後、マレイミド−チオールカップリングを介して、上記のデキストランとコンジュゲートされ、デキストランは、サイズ排除クロマトグラフィーにより単離された。４５μｇのＣｙ３／ビオチン／ＴＡＴ−デキストランを、４ｍｇＨＥＰＥＳ塩基存在下、８０μｇのＣＤＭと反応した。

非改質及びＣＤＭ改質Ｃｙ３／ビオチン／ＴＡＴ−デキストラン（４５μｇ）を、３６μｇの肝臓標的化ペプチド−ストレプトアビジン含有２５０μＬのＰＢＳに加えた。これらサンプルを、マウスの尾静脈に注射した。注射後１０分で、マウスを屠殺し、肝臓を採取し、顕微鏡観察のため、凍結、切片作成した。ＴＡＴ細胞透過性ペプチドがＣＤＭにて可逆的に改質された際、より広範に分布した標識デキストランが肝臓において観察された。

同様な様式において、ジフテリアトキシンなどの毒物又は、抗がん剤は、ＴＡＴペプチド（配列番号１）などの細胞透過性分子にコンジュゲートされてもよい。ＣＤＭの改質によるＴＡＴペプチドの不活化は、非特異的毒性を阻止するであろう。腫瘍における低下したｐＨ環境下でのＴＡＴの活性化は、毒物の癌細胞への侵入をもたらすであろう。

上述は、本発明の趣旨を示すためだけに考慮されている。さらに、当業者に取って多くの改変及び変更は即座に行うことが可能であるので、示し且つ述べた正確な構造及び制御にのみ本発明を限定することは望ましくない。従って、全ての適切な改変及び等価物は、本発明の範囲内に収まるものである。

Ａは無水マレイン酸誘導体の図であり、Ｂは無水コハク酸誘導体の構造の図である。 無水マレイン酸誘導体及び第１級アミンとで形成される可逆的共有結合に関する図である。 カルボキシジメチル無水マレイン酸の合成に関するステップを示す図である。 Ａ及びＢは、ｉｎ ｖｉｖｏでの、ストレプトアビジンの幹細胞への送達を示している。ストレプトアビジンは、幹細胞標的化ペプチド及びＴＡＴ細胞透過性ペプチドにリンクされる。この細胞透過性ペプチドは、改質されておらず（Ａ）、且つ、ＣＤＭでの改質により可逆的に不活化されている。高度に陽イオン性のＴＡＴペプチドがＣＤＭの改質により可逆的に不活化される場合、より広い範囲のストレプトアビジンの分布が観察された。

Claims (19)

1. 化合物の脂質膜との相互作用を変化させるように、アミン含有化合物を可逆的に改質する方法であって：
   前記化合物の前記アミンに置換無水マレイン酸を共有的に結合することを有する方法。
2. 前記置換無水マレイン酸は、無水マレイン酸二置換体からなることを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. 前記無水マレイン酸二置換体は、負荷電した無水マレイン酸二置換体であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
4. 前記無水マレイン酸二置換体は、２−プロピオニック−３−メチル無水マレイン酸からなることを特徴とする請求項４に記載の方法。
5. 前記置換無水マレイン酸は、二機能性無水マレイン酸からなることを特徴とする請求項１に記載の方法。
6. 前記置換無水マレイン酸は、チオエステル置換無水マレイン酸からなることを特徴とする請求項５に記載の方法。
7. 前記置換無水マレイン酸は、ＣＤＭ−チオエステルからなることを特徴とする請求項６に記載の方法。
8. 前記置換無水マレイン酸は、ＣＤＭ−チオエステルからなることを特徴とする請求項１に記載の方法。
9. 前記化合物は、膜活性化合物からなることを特徴とする請求項１に記載の方法。
10. 前記膜活性化合物の改質は、前記化合物の膜活性を不活化することを特徴とする請求項９に記載の方法。
11. 前記膜活性化合物は、メリチンからなることを特徴とする請求項９に記載の方法。
12. 前記化合物は、細胞透過性化合物からなることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
13. 前記細胞透過性化合物は、アルギニンリッチなペプチドからなることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
14. 前記細胞透過性化合物は、ＴＡＴペプチドからなることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
15. 前記化合物は、細胞透過性薬物からなることを特徴とする請求項１に記載の方法。
16. 前記化合物の改質は、前記化合物の正電荷を減弱することからなることを特徴とする請求項１に記載の方法。
17. 前記化合物の改質は、前記化合物の電荷を反転することからなることを特徴とする請求項１に記載の方法。
18. 前記改質は、前記化合物の毒性を軽減することを特徴とする請求項１に記載の方法。
19. 分子を細胞に送達する方法であって：
    化合物の脂質膜への相互作用を変化させるように、アミン含有膜活性化合物を、該化合物の前記アミンに置換無水マレイン酸を共有的に結合することにより可逆的に改質し、
    前記分子を前記の改質された化合物に関連付け、且つ
    前記化合物を前記細胞に送達する、
    ことからなることを特徴とする方法。

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